Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando ...€¦ · 2 Sulfeto de Cádmio/Hidróxido de Cádmio ZnSe/ZnS Seleneto de Zinco/Sulfeto de Zinco Cd(ClO 4) 2 Perclorato

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando pontos quânticos fluorescentes de

semicondutores II-VI

Aluízio Gonçalves Brasil Júnior

Recife-PE, Brasil Fevereiro, 2010

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando pontos quânticos fluorescentes de

semicondutores II-VI

Aluízio Gonçalves Brasil Júnior (Bolsista FACEPE)

Orientadora: Profª. Dra. Beate Saegesser dos Santos

Có-orientadores: Profª. Dra. Adriana Fontes

Profª. Dra. Patrícia M. A. Farias

Recife-PE, Brasil Fevereiro, 2010

Dissertação apresentada ao ProgramaGraduação em Ciências Farmacêuticas como parte dos requisitos necessárioobtenção de título de mestre.

de Pós-da UFPE s para a

Brasil Júnior, Aluízio Gonçalves

Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando pontos quânticos fluorescentes de semicondutores II-VI / Aluízio Gonçalves Brasil Júnior . – Recife: O Autor, 2010.

99 folhas: il., tab., fig.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.

Inclui bibliografia, anexos e apêndices.

1. Pontos quânticos fluorescentes. 2. Fotoativação. 3. Albumina sérica bovina. 4. Carbodiimidas. 5. Glutaraldeído. I. Título.

615 CDU (2.ed.) UFPE

615.1

CDD (20.ed.) CCS2010-162

DEDICO ESTE TRABALHO

À minha noiva e futura esposa, Kilmara Higia Gomes Carvalho, por todo amor, estímulo, parceria e dedicação durante a realização deste trabalho.

À minha mãe, Alda Maria de Lima, pelas constantes demonstrações de amor, companheirismo, compreensão e pelos sábios ensinamentos.

Ao meu pai, Aluízio Gonçalves Brasil, que sempre será um referencial de homem na minha vida. Saudades.

AGRADECIMENTOS À Deus primeiramente, pelas contínuas bênçãos em minha vida. À minha noiva, pelo amor, compreensão e parceria durante o desenvolvimento do trabalho. À minha mãe, por todo carinho, amor e paciência. Ao meu pai, pelos sábios ensinamentos e carinho. À professora Beate pela amizade, confiança, ensinamentos, compreensão e paciência durante estes anos de orientação. Um agradecimento em especial, pois sem o seu apoio e dedicação este trabalho seria apenas uma perspectiva. Às professoras Adriana e Patrícia, pelos ensinamentos e discussões extremamente valiosos. À Juliana, Breno e Thiago, pela parceria e contribuição no trabalho desenvolvido. Aos colegas do laboratório Profº. Ricardo Ferreira: Claudilene, Denise, Rebeca, Thiago, Breno, João Paulo, Clayton, Rayana, Rafael, Cida, Clarissa, Fabrício, Tony, Ana Célia, Aline, Paulo, Cauêh, Diego. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Coordenador, Vice-coordenadora, professores e secretárias Conceição, Margareth e Rosa por toda atenção e dedicação. Ao grupo de Polímeros Não-Convencionais, do Departamento de Física: em especial à Clécio pelos espectros de emissão. À João Carlos do laboratório de Microscopia-DF, pelas análises de DRX. À Marcelo da UECE pela colaboração e ensinamentos. Ao grupo do CETENE: Adriana, Eduardo, Edwin, Lucas e Regivaldo. À FACEPE pelo auxílio financeiro. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a elaboração deste trabalho. Obrigado a todos!

RESUMO

A pouco mais de uma década surgiu uma nova classe de marcadores

fluorescentes baseados em nanocristais de semicondutores do tipo II-VI conhecidos

como pontos quânticos (quantum dots). Neste trabalho, apresentam-se

metodologias de obtenção de pontos quânticos fluorescentes de semicondutores do

tipo core/shell de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 através de técnicas de química coloidal

em meio aquoso. O tamanho médio dos nanocristais (ZnSe = 3 nm e CdS = 6 nm)

foi estimado utilizando-se as técnicas de espectroscopia de absorção na região do

ultravioleta-visível, microscopia eletrônica de transmissão convencional e pela

técnica de difração de Raios-X. A caracterização das propriedades ópticas foi

realizada empregando-se espectroscopia de emissão e excitação eletrônica. Os

sistemas apresentam alta intensidade de luminescência com máximos observados

na região do azul para o ZnSe/ZnS e do verde para o CdS/Cd(OH)2. Para otimização

de sua emissão os pontos quânticos de ZnSe/ZnS foram submetidos a processo de

fotoativação, com radiação ultravioleta. Ambos sistemas foram bioconjugados à

proteína albumina sérica bovina (BSA), empregando-se agentes de comprimento

zero (carbodiimidas) para os pontos quânticos de ZnSe/ZnS e o crosslinker

glutaraldeído para o CdS/Cd(OH)2. Foram desenvolvidos e avaliados protocolos de

bioconjugação para os dois pontos quânticos, a fim de se estabelecer os mais

eficazes. Os bioconjugados foram caracterizados através de técnicas

espectroscópicas e confirmados pela detecção quantitativa da intensidade de

fluorescência, empregando-se microplacas de poliestireno como substrato. Foi

evidenciado por meio da técnica de dicroísmo circular, que a estrutura secundária da

proteína foi preservada. Os espectros de luz polarizada da biomolécula conjugada

aos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2, apresentaram alterações mínimas em

relação ao padrão não conjugado, enquanto que os conjugados aos pontos

quânticos de ZnSe/ZnS exibiram alterações estruturais significativas. Os

bioconjugados obtidos podem ser considerados protótipos na preparação de

imunocomplexos baseados em ligantes bioespecíficos, visando o desenvolvimento

de imunoensaios heterogêneos para o diagnóstico sorológico de doenças.

Palavras-chaves: pontos quânticos fluorescentes, fotoativação, albumina sérica

bovina, carbodiimidas, glutaraldeído, imunoensaios.

ABSTRACT

A few years ago, a new class of fluorescent biolabels based on semiconductor

nanocrystals of type II-VI known as quantum dots (QDs). In this work, methods were

presented for obtaining QDs type core/shell of ZnSe/ZnS and CdS/Cd(OH)2 by colloid

chemistry techniques in aqueous media. The nanocrystals average size (ZnSe = 3

nm and CdS = 6 nm) was estimated using absorption spectroscopy in the ultraviolet-

visible, conventional transmission electronic microscopy and X-Ray diffraction

techniques. The electronic excitation and emission spectroscopy were collected to

investigate the optical properties. The systems showed high intensity of

luminescence with maximum in blue and green regions to ZnSe/ZnS and

CdS/Cd(OH)2, respectively. QDs of ZnSe/ZnS were submitted a photoactivation

process with ultraviolet radiation to optimize their emission. Both systems were

bioconjugated to the protein bovine serum albumin (BSA), using zero-length agent

(carbodiimide) for ZnSe/ZnS and glutaraldehyde crosslinker for CdS/Cd(OH)2.

Bioconjugation protocols were developed and evaluated for these QDs, in order to

establish the most effective. The bioconjugates were characterized by spectroscopic

techniques and confirmed by quantitative detection of fluorescence intensity, using

microplates as substrate. It was shown that the secondary structure of the protein

was preserved by circular dichroism technique. The polarized light spectra of

biomolecule to QDs of CdS/Cd(OH)2 conjugated showed minimal changes compared

to unconjugated reference, while the QDs of ZnSe/ZnS conjugate exhibited

significant structural changes. The bioconjugate obtained can be considered

prototypes in the preparation of immunocomplex based on biospecific ligand, for the

development of heterogeneous immunoassays for serological diagnosis of diseases.

Keywords: Quantum Dots, photoactivation, bovine serum albumin, carbodiimides,

glutaraldehyde, immunoassays.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BV Banda de valência

BC Banda de condução

Eg Band gap

NPs Nanopartículas fluorescentes de materiais semicondutores

DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida

EDC / EDAC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida]

Sulfo-NHS N-hidroxisuccinamida sulfonada

CdS/Cd(OH)2 Sulfeto de Cádmio/Hidróxido de Cádmio

ZnSe/ZnS Seleneto de Zinco/Sulfeto de Zinco

Cd(ClO4)2 Perclorato de cádmio

H2S Gás sulfídrico

(NaPO3) n Polifosfato de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

UV Ultravioleta

DRX Difração de Raios-X

MET Microscopia eletrônica de transmissão

Å Angstrom

λ Comprimento de onda

CdTe Telureto de Cádmio

AMA Ácido mercaptoacético

AMP Ácido 3-mercaptopropiônico

ZnSO4 Sulfato de zinco

Seº Selênio elementar

NaBH4 Borohidreto de sódio

BSA Bovine serum albumin

MES Ácido 4-Morfolino etanossulfônico

PBS Phosphate buffer saline

Tris Tris(hidroximetil)aminometano

PQ Pontos quânticos

D.P. Desvio padrão

C.V. Coeficiente de variação

Sulfo-SMCC Succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato sulfonado

DC Dicroismo circular

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 - Fluoróforo convencional (Alexa 488) marcando filamentos de actina, sofrendo completa fotodegradação em aproximadamente 120s. Diferentemente o núcleo marcado por pontos quânticos, mantém a fluorescência na ordem de algumas horas...........................................................................................................19

Figura 1.2 – Representação esquemática de um éxciton ligado formado num material semicondutor...............................................................................................20

Figura 1.3 - Emissão de suspensões coloidais de CdSe/ZnS com diferentes diâmetros, excitadas em 365 nm..............................................................................21

Figura 1.4 – Esquema representativo de um Croslinker homobifuncional........................................................................................................24

Figura 1.5 – Esquema representativo de uma molécula de glutaraldeído e do seu polímero insaturado...................................................................................................25

Figura 1.6 – Estrutura da DCC (N,N’ -diciclohexilcarbodiimida)...............................27

Figura 1.7– EDC reage com um ácido carboxílico formando o intermediário reativo. Na presença de um nucleófilo a ligação amida é formada, com liberação da isouréia......................................................................................................................28

Figura 1.8 – Estrutura da EDC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida].............................................................................................................28 Figura 1.9 – Estrutura da Sulfo-NHS (N-hydroxisulfosuccinimida)..........................29

Figura 3.1 - Esquema representativo da síntese e passivação das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2.......................................................................................................37

Figura 3.2 - Representação esquemática do processo de passivação de nanopartículas de CdS empregando-se Cd(OH)2 ...................................................40

Figura 3.3 - Espectros de absorção das suspensões coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2............................................................................................................41

Figura 3.4 - Espectros normalizados de emissão (λexc=365 nm) e excitação (λem = 496 nm) de uma suspensão coloidal de CdS/Cd(OH)2 ............................................42

Figura 3.5 – Difratograma do pó de uma amostra de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 e a estrutura cúbica tipo blenda de zinco..........................................43 Figura 3.6 – Imagem representativa de NPs de CdS/Cd(OH)2 (parte mais elétron densa da imagem) obtida através de MET .............................................................44

Figura 4.1 – Coloração característica do selênio reduzido formando um complexo coloridoNa-Te-Te-Na ..............................................................................................49

Figura 4.2 – Alteração da coloração após processo de nucleação das NPs..........................................................................................................................49

Figura 4.3 - Espectro de absorção de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS..................................................................................................................52

Figura 4.4 - Espectro de emissão (λexc=365 nm) representativo de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS...............................................................................................53

Figura 4.5 – Evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação...............................................................................................................54

Figura 4.6 – Gráfico da evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação...............................................................................................................55

Figura 4.7 – Fluorescência de uma amostra fotoativada durante 20 minutos.....................................................................................................................55

Figura 4.8 – Evolução temporal dos espectros de absorção de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação...............................................................................................................57

Figura 4.9 – Difratograma de Raios-X de pó de uma amostra de pontos quânticos ZnSe/ZnS..................................................................................................................58

Figura 4.10 – Microscopia eletrônica de transmissão representativa de NPs de ZnSe/ZnS (regiões mais elétron densas da imagem)...............................................59

Figura 5.1 - Estrutura clássica da albumina sérica...................................................62

Figura 5.2 – Microplaca negra de poliestireno.........................................................64

Figura 5.3 – Equipamento VICTOR 2 WALLAC 1420.............................................67

Figura 5.4 – Esquema reacional do EDC e Sulfo-NHS com os grupamentos carboxilatos presentes nas nanopartículas de ZnSe/ZnS........................................69

Figura 5.5 - Corrida em gel de agarose 2% do padrão de BSA e dos bioconjugados formados entre os pontos quânticos e as moléculas da proteína. Amostras coradas em azul de coumassie..............................................................................................70

Figura 5.6 – Esquema do processo de interação da BSA-ponto quântico e a placa de poliestireno..........................................................................................................71

Figura 5.7 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação. Amostras excitadas em 365 nm.....................................................73

Figura 5.8 – Espectro de dicroísmo circular de uma solução aquosa de BSA na concentração de 1mg/mL........................................................................................75

Figura 5.9 – Espectro de dicroísmo circular de um bioconjugado formado entre as NPs de ZnSe/ZnS e a BSA.......................................................................................75

Figura 5.10 – Espectro de dicroísmo circular de um controle (todos reagentes exceto as NPs) com a BSA na concentração de 1mg/mL........................................76

Figura 5.11 – Esquema reacional do acoplamento entre a BSA e o glutaraldeído..77

Figura 5.12 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação. Amostras excitadas em 365 nm.......................................................78

Figura 5.13 – Espectro de dicroísmo circular de um controle com a BSA na concentração de 1mg/mL e a amostra bioconjugada via crosslinker.......................79

LISTA DE TABELAS Tabela 5.1 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de fluorescência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão F535 nm (± 25 nm)....................................................................72

Tabela 5.2 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de fluorescência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão F420 nm (± 10 nm)....................................................................73

Tabela 5.3 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de fluorescência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão F535 nm (± 25 nm)....................................................................78

SUMÁRIO Capítulo 1: Introdução............................................................................................15

1.1 Introdução...........................................................................................................16

1.2 Semicondutores .................................................................................................17

1.3 Pontos Quânticos................................................................................................18

1.4 Bioconjugação.....................................................................................................22

1.4.1 Crosslinkers......................................................................................................23

1.4.2 Glutaraldeído....................................................................................................25

1.4.3 Agentes de Comprimento Zero........................................................................25

1.4.4 Emprego de Carbodiimidas..............................................................................26

1.5 Apresentação da dissertação..............................................................................29

Capítulo 2: Objetivos..............................................................................................31

2.1 Objetivos gerais..................................................................................................32

2.2 Objetivos específicos..........................................................................................32

Capítulo 3: Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2 ......................................................................................................33

3.1 Introdução...........................................................................................................34

3.2 Procedimentos experimentais.............................................................................35

3.2.1 Reagentes empregados...................................................................................35

3.2.2 Metodologia de síntese das NPs de CdS/Cd(OH)2..........................................35

3.2.3 Caracterização óptica e estrutural....................................................................37

3.3 Resultados e discussão......................................................................................39

3.3.1 Síntese e passivação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2........................39

3.3.2 Caracterização óptica dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2........................40

3.3.3 Caracterização estrutural dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2..................43

Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS.................................................................................................................45

4.1 Introdução.......................................................................................................... 46

4.2 Procedimentos experimentais.............................................................................47

4.2.1 Reagentes empregados...................................................................................47

4.2.2 Metodologia de síntese das NPs de ZnSe/ZnS...............................................48

4.2.3 Experimento de fotoativação............................................................................50

4.2.4 Caracterização óptica e estrutural....................................................................50

4.3 Resultados e discussão......................................................................................51

4.3.1 Síntese, passivação e funcionalização dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS...51

4.3.2 Caracterização óptica dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS.............................52

4.3.3 Caracterização estrutural dos pontos quânticos deZnSe/ZnS.........................58

Capítulo 5: Bioconjugação dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com albumina sérica bovina (BSA).......................................................................60

5.1 Introdução...........................................................................................................61

5.2 Bioconjugação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2......................................62

5.2.1 Emprego de reagentes de comprimento zero..................................................62

5.2.2 Procedimentos experimentais..........................................................................62

5.2.2.1 Reagentes empregados................................................................................62

5.2.2.2 Protocolo desenvolvido.................................................................................63

5.2.3 Emprego do crosslinker homobifuncional glutaraldeído..................................64




5.3 Bioconjugação dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS............................................66

5.3.1 Emprego de agentes de comprimento zero.....................................................66




5.4 Caracterização dos bioconjugados de CdS/Cd(OH)2-BSA e ZnSe/ZnS-BSA....67

5.5 Resultados e Discussão......................................................................................68

5.5.2 Bioconjugação via agentes de comprimento zero............................................68

5.5.3 Bioconjugação via crosslinker homobifuncional...............................................77

Capítulo 6: Conclusões e perspectivas................................................................81

6.1 Conclusões..........................................................................................................82

6.2 Perspectivas........................................................................................................83

Referências..............................................................................................................84

Anexos......................................................................................................................87

Anexo A Mapa de intensidade da câmara de Fotoestabilidade................................88

Apêndice..................................................................................................................89

Apêndice A - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2.............................................................................................................90

Apêndice B - Estimativa da quantidade de NPs/mL da Suspensão de CdS/Cd(OH)2 ..................................................................................................................................92

Apêndice C - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de ZnSe/ZnS ............................................................................................................95

Apêndice D - Estimativa da quantidade de NPs/mL ................................................97

Capítulo 1

Introdução

Capítulo 1 - Introdução

16

1.1 – Introdução

Atualmente, diversos grupos de pesquisa tem empreendido esforços

voltados para o desenvolvimento e aprimoramento de tecnologias biomédicas,

em especial métodos diagnósticos. Neste contexto, materiais

nanoestruturados, entre eles os pontos quânticos (PQ), apresentam

perspectivas promissoras para esta finalidade.

Comparados aos fluoróforos orgânicos convencionais, os PQs possuem

algumas características vantajosas. Além disso, estes materiais inorgânicos

fluorescentes podem ser empregados para detecção de sinais, geração de

imagens, dentre outras aplicações. Contudo, faz-se necessário a inserção de

grupamentos químicos que os tornem compatíveis com moléculas de origem

biológica. Esta compatibilidade possibilita o acoplamento entre as

nanopartículas inorgânicas (NPs) e o biomaterial, por meio do emprego de

metodologias de bioconjugação.

Neste sentido, o presente trabalho apresenta os PQs de CdS/Cd(OH)2 e

ZnSe/ZnS dispersos em meio aquoso visando aplicações biológicas, como

alternativas simples, eficazes e de baixo custo. Para tanto, protocolos de

bioconjugação foram estabelecidos, empregando-se a albumina sérica bovina

(BSA) como sistema modelo.

Como perspectiva, a utilização destes PQs em futuros ensaios com

imunoglobulinas, permitirão a aplicação destes bioconjugados em diagnósticos

sorológicos, em especial para doenças tropicais e negligenciadas. Desta

maneira, os nanomarcadores desenvolvidos possibilitarão ao Brasil sua auto-

suficiência na produção de kits de diagnóstico.


17

1.2 – Semicondutores

Bandas de energia, originadas da natureza ondulatória dos elétrons (e-)

nos cristais, representam os estados eletrônicos dos materiais sólidos

cristalinos. O efeito do potencial periódico sobre a distribuição energética dos

elétrons livres promove a separação dos estados energéticos em bandas

permitidas e proibidas.

A diferença de energia que separa a banda de valência (BV) da banda

de condução (BC) é denominada de band gap (Eg). Quando os elétrons

passam da BV para a BC, deixam estados denominados de buracos na BV que

se comportam como portadores de carga elétrica positiva. A corrente elétrica é

produzida quando os e- da BC e os buracos na BV são submetidos a ação de

um campo externo que possibilita a mudança dos estados dos e-.

Existem várias bandas cheias com e- em um material cristalino no

estado fundamental (T = 0K), cujas propriedades de condução do cristal são

refletidas diretamente pelo preenchimento ou não da última banda. Assim,

quando a última banda está preenchida por completo, o material é isolante (Eg

>4 eV) e quando está parcialmente preenchida, o material é condutor. Contudo,

os materiais semicondutores apresentam condutividade significativa

intermediária entre a dos isolantes e dos condutores, devido os sólidos

cristalinos a T = 0 K, quando à temperatura ambiente, serem caracterizados

por uma Eg relativamente pequena de aproximadamente 3 eV ou inferior com

uma BV cheia e uma BC vazia 38.

Dentre os materiais semicondutores com propriedades elétricas e

ópticas de interesse, como compostos binários (IV-IV, III-V, II-VI), terciários e

quaternários, destaca-se os compostos binários do tipo II-VI que abrange os

pontos quânticos empregados no presente trabalho. Estes são constituídos

pelos elementos da família VIA (calcogênios) e IIB (metais de transição) da

tabela periódica 39.


18

1.3 – Pontos Quânticos

Pontos quânticos ou quantum dots são nanopartículas semicondutoras

tridimensionais, que possuem dimensões na faixa de 1 a 10 nm. Estes

materiais podem ser preparados por meio de técnicas de crescimento

controlado dos nanocristais (bottom up) em meio coloidal ou por redução das

dimensões (ablação) de um cristal pré-existente (top down). As dimensões

reduzidas conferem alterações significativas nas propriedades físico-químicas,

em comparação com o mesmo material em escala macroscópica. Alterações

das propriedades ópticas destes sistemas nanoestruturados são realizadas por

meio da manipulação do tamanho, estrutura e composição química1. A habilidade de alterar as propriedades ópticas destes materiais por

meio da manipulação de tamanho, se apresenta como fator decisivo em alguns

campos de aplicação. Basicamente, por esta razão, pontos quânticos vem

sendo empregados na produção de células solares, diodos e lasers,

detectores, em dispositivos de telecomunicação e mais recentemente como

biomarcadores fluorescentes1.

Desde que o uso de ligantes conjugados com estes biomarcadores foi

relatado nos trabalhos desenvolvidos por Alivisatos e Nie2,3, muitas aplicações

em ensaios bioanalíticos vem sendo realizadas. Esta nova classe de

marcadores apresenta uma série de vantagens frente ao fluoróforos

convencionais empregados em métodos de marcação celular e diagnóstico.

Dentre elas podemos destacar: (i) emissão em diversos comprimentos de onda

para um mesmo material, (ii) elevada fotoestabilidade; (iii) baixa citotoxidade;

(iv) alto deslocamento Stokes possibilitando que praticamente não se

empregue filtros para eliminar interferências da radiação de excitação (v)

marcação múltipla simultânea de diversos componentes e estruturas celulares

em células vivas ou fixadas, além do fato de que (vi) os resultados podem ser

obtidos com tempo de incubação da ordem de alguns minutos2.

Na Figura 1.1 é exiba a elevada fotoestabilidade dos pontos quânticos

em comparação com fluoróforos orgânicos convencionais, os quais possuem

rápida fotodegradação.

Capítulo 1 - Introdução 19

Figura 1.1 - Fluoróforo convencional (Alexa 488) marcando filamentos de actina, sofrendo

completa fotodegradação em aproximadamente 120s. Diferentemente o núcleo marcado por

pontos quânticos, mantém a fluorescência na ordem de algumas horas [Chan et al., 2002,

adaptado].

A elevada fluorescência na região visível do espectro eletromagnético,

possibilita a aplicação destes materiais em metodologias diagnosticas e

processos de marcação celular. Esta fluorescência é originada do processo de

recombinação excitônica, que ocorre devido o elevado confinamento quântico

destes cristais em dimensões nanométricas5.

Uma nanopartícula de semicondutor encontra-se em regime de

confinamento quântico , quando suas dimensões são reduzidas a ponto de a

diferença entre os valores de energia entre a BV e a BC, sejam próximos ou

menores do que as dimensões do raio de Bohr do seu éxciton6.

A BV que apresenta menor energia equivale aos orbitais ligantes,

enquanto que a BC equivale aos orbitais antiligantes, apresentando nível

energético superior. Em um sistema nanocristalino ideal, com poucos defeitos

em sua rede, as bandas são separadas energeticamente pela região proibida

(Eg), onde nenhum elétron de valência pode transitar. Esta região refere-se ao

valor mínimo de energia que se deve fornecer para que um elétron situado na

BV seja promovido a BC6,7.

Esta energia pode ser fornecida por processos que envolvam o aumento

da temperatura do sistema, ou por meio de uma radiação incidente. Quando os

processos anteriormente citados possuem uma quantidade de energia

suficiente para ultrapassar a barreira energética (Eg), os elétrons presentes nos

últimos níveis energéticos da BV são promovidos para a BC. O processo possibilita a formação de pares elétron-buraco (vacância),

gerando uma carga virtual (h+) na BV. Este buraco virtual (h+) possui carga

idêntica a do elétron, entretanto apresenta sinal oposto. O conjunto elétron-


20

buraco é chamado de éxciton, que possui existência vinculada as forças

coulômbianas fracas, formando um estado ligado8,9 (Figura 1.2).

Figura 1.2 Representação esquemática de um éxciton ligado formado num material

semicondutor.

O éxciton formado possui um tempo de vida muito curto, cerca de alguns

nanosegundos, acarretando em um processo de decaimento energético para a

BV (recombinação excitônica). O excesso de energia pode ser dissipado de

dois modos: pela vibração da rede cristalina, por meio da emissão de fônons

(decaimento não radiativo) e/ou pela emissão de fótons com energia inferior

aos da radiação incidente (decaimento radiativo). Este último processo

possibilita que as nanopartículas fluorescentes de materiais semicondutores

em regime de confinamento quântico apresentem fluorescência7,9.

A alteração das dimensões dos pontos quânticos formado por um

mesmo material permite que os sistemas nanoestruturados emitam

fluorescência em diferentes comprimentos de onda do espectro

eletromagnético visível10. Isto ocorre devido ao fato que as diferenças entre os

estados energéticos (Eg) presentes nas duas bandas, variam de acordo com o

tamanho da nanopartícula. Deste modo, quanto menor o tamanho da

nanopartícula, maior será a diferença de energia entre as bandas (Eg). Por isso

partículas menores tendem a fluorescer em regiões mais energéticas (próximas

ao azul), enquanto que as de dimensões maiores em geral exibem

fluorescência nas regiões menos energéticas, próximas ao vermelho (Figura

1.3).


21

quâ

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des

Den

utili

inso

sist

sint

prin

aqu

que

seg

Figura 1.3 - Emissão de suspensões coloidais de CdSe/ZnS com diferentes diâmetros,

excitadas em 365 nm. (FORTINA et. al., 2005).

As primeiras metodologias empregadas na obtenção de pontos

nticos em meio coloidal, referem-se a processos de síntese em meio

anometálico. Entretanto, estas rotas sintéticas apresentam uma série de

vantagens frente as metodologia baseadas em química coloidal aquosa.

tre as desvantagens dos sistemas organometálicos, podemos citar:

zação de compostos pirofóricos, emprego de solventes orgânicos,

lubilidade em meio aquoso, custo elevado e incompatibilidade com

emas biológicos. Diante do que foi mencionado, o desenvolvimento de rotas

éticas em meio aquoso, surgiram como alternativas promissoras,

cipalmente em aplicações biológicas10,11.

Uma das etapas mais importante durante a obtenção das NPs em meio

oso, é o emprego de agentes funcionalizantes, pois os mesmos permitirão

o sistema inorgânico seja acoplado a uma biomolécula. Nas Seções a

uir serão detalhados o processo de bioconjugação dos pontos quânticos a


22

biomoléculas, bem como os agentes empregados durante as etapas de

bioacoplamento.

1.4 – Bioconjugação

Biomoléculas conjugadas ou modificadas têm sido empregadas com

êxito em processos de purificação, detecção ultra-sensível, localização de

componentes celulares específicos e no desenvolvimento de metodologias

diagnósticas12.

A bioconjugação envolve a ligação de duas ou mais moléculas,

formando um novo complexo que possui a combinação das propriedades de

seus componentes individuais. Moléculas de origem biológica podem ser

quimicamente ligadas a compostos de origem sintética, por diferentes

mecanismos de reação 4. Estas técnicas de bioconjugação podem ser empregadas não apenas

visando a formação de complexos, mas podem exercer a atividade de agentes

modificadores da estrutura nativa e das funções de peptídeos, proteínas,

açúcares, polissacarídeos, ácidos nucléicos, oligonucleotídeos, entre outros

3,4,12.

A associação química entre duas moléculas é intermediada por um

agente de ligação chamado comumente de crosslinker. O processo de

bioconjugação depende da capacidade do crosslinker empregado em interagir

com dois sistemas distintos, devendo apresentar afinidade química com os

grupamentos presentes no sistema de origem inorgânica ou orgânica e os

radicais da biomolécula12. Como exemplo, podemos citar o emprego de

carbodiimidas no processo de interação entre os grupamentos carboxilatos

presentes na superfície do ponto quântico e as aminas primárias oriundas de

uma molécula protéica.

É importante que durante o processo de bioconjugação, todas as etapas

sejam cuidadosamente planejadas e desenvolvidas para que não ocorram

desnaturações, modificações estruturais irreversíveis ou alterações químicas na

biomolécula empregada. Outro fator de extrema importância é a escolha do


23

crosslinker mais adequado para as condições reacionais e aplicação desejada,

bem como a definição da estequiometria reacional ideal 3,30.

O número de grupos-alvo (aminas, carboxilatos, tióis) presentes na

superfície da molécula biológica é essencial para que o processo ocorra de

modo eficaz. Quando os grupos-alvo estão prontamente disponíveis para a

conjugação, o processo reacional é otimizado. A quantidade de crosslinker

empregado (estequiometria reacional) está diretamente relacionada ao número

de grupamentos encontrados na superfície da biomolécula 12,30.

1.4.1 – Crosslinkers

Crosslinkers ou agentes de ligação cruzada possuem pelos menos dois

grupos reativos, os quais possibilitam a interação com uma grande diversidade

de grupamentos químicos presentes em biomoléculas ou nos mais variados

compostos sintéticos13. Estes reagentes promovem a formação de ligações

covalentes entre duas ou mais moléculas. Em geral, os crosslinkers se ligam

covalentemente a grupos funcionais como aminas primárias, carboxilatos e

sulfidrilas.

A grande maioria das moléculas de origem biológica possui ao menos

um destes grupos funcionais, o que acaba viabilizando a conjugação via

croslinkers. Esses reagentes são amplamente empregados no estudo da

estrutura e função protéica, na ancoragem de proteínas em fase sólida, na

preparação de imunógenos, imunotoxinas e na conjugação de biomoléculas a

sistemas inorgânicos como quantum dots 4,27,30.

Agentes de ligação cruzada podem ser divididos em dois grupos de

acordo com a similaridade dos seus grupos reativos:

• Homobifuncionais possuem dois grupamentos terminais idênticos;

• Heterobifuncionais possuem dois grupamentos terminais distintos.

Os homobifuncionais são utilizados em reações de conjugação que

possuem apenas uma ou duas etapas, enquanto que os heterofuncionais são

utilizados em reações de duas ou mais etapas.


24

O primeiro agente crosslinker empregado na modificação e conjugação

de macromoléculas consistia em um composto que apresentava dois

grupamentos terminais idênticos12. Como observado na Figura 1.4, os

reagentes homobifuncionais possuem uma cadeia carbônica simétrica que liga

os dois grupos terminais. Estes podem interagir covalentemente com os

radicais oriundos de moléculas biológicas ou compostos de origem

inorgânica/orgânica.

Figura 1.4 – Esquema representativo de um Croslinker homobifuncional.

Uma grande variedade de reagentes homobifuncionais surgiu durante os

últimos trinta anos. Atualmente, existem dezenas de crosslinkers disponíveis

comercialmente, os quais possuem os mais variados comprimentos de cadeia

carbônica e grupos reativos. Dentre eles podemos destacar: os ésteres da N-

hidroxisuccinamida, os imidoésteres, os derivados do difluorobenzeno e os

aldeídos 12.

A grande maioria das reações é realizada em condições de pH

fisiológico. Entretanto alguns crosslinkers só apresentam rendimento ideal em

meio levemente ácido ou alcalino. Para tanto são empregados tampões

específicos, visando a manutenção das condições ideais do processo reacional,

bem como a integridade da biomolécula. O agente homobifuncional glutaraldeído

é um bom exemplo11. Ele apresenta rendimento ideal apenas em meio

levemente alcalino (pH 8,0-8,5), sendo empregado como tampão o carbonato de

sódio.

Cadeia Carbônica

Grupo Reativo 1

Grupo Reativo 2

Grupos Reativos Idênticos


25

1.4.2 – Glutaraldeído

O glutaraldeído é o reagente homobifuncional mais empregado na

atualidade12. Apesar da sua simplicidade estrutural, este composto apresenta

uma série de possíveis mecanismos reacionais. Ele promove a formação de

bases de Schiff em reações com proteínas ou outros compostos aminados. O

glutaraldeído em soluções aquosas pode formar polímeros com pontos de

insaturação. Os polímeros insaturados α e β são extremamente reativos na

presença de agentes nucleófilos, especialmente aminas primárias 6,11,12,13,

Figura 1.5.

Figura 1.5 –insaturado.

A r

aminados

mecanism

elevada e

molecular,

Est

homobifun

de anticorp

1.4.3 – A

Os

reagentes

Esquema representativo de uma molécula de glutaraldeído e do seu polímero

eação com uma proteína resulta em alquilação dos grupamentos

disponíveis, promovendo a formação de ligações amida. Este

o reacional resulta em conjugados, proteína-glutaraldeído, de

stabilidade. Para minimizar a formação de polímeros de alto peso

em geral são adotados protocolos de duas etapas 12.

e aldeído tem sido amplamente utilizado como crosslinker

cional em aplicações biomédicas, especialmente para conjugações

os-enzimas e proteínas-quantum dots11.

gentes de Comprimento Zero

agentes de comprimento zero (zero-length crosslinkers) são

que promovem a ligação entre duas moléculas, sem formar um


26

composto adicional entre os dois sistemas12. Possibilitando que os

grupamentos químicos das duas moléculas sejam covalentemente ligados, sem

a formação de um ligante adicional ou espaçamento. Dentre eles, os mais

empregados em processos de bioconjugação são as carbodiimidas, as

hidroxisuccinimidas e as maleidoimidas.

Em algumas aplicações, é indesejável a presença de um composto

adicional entre as duas estruturas. Um exemplo é durante a preparação de

carreadores conjugados a haptenos, tendo como principal objetivo o

desenvolvimento de resposta imune à biomolécula ligada. Ocasionalmente, um

percentual dos anticorpos produzidos pode apresentar resposta imune ao

ligante (crosslinker) utilizado no procedimento de conjugação. Os agentes de

comprimento zero podem ser considerados uma alternativa frente aos ligantes

convencionais, pois eliminam consideravelmente este tipo de reatividade

cruzada, mediando uma ligação direta entre os dois compostos12,14.

Esses reagentes podem promover a formação de três tipos de ligações:

• Ligação amida via condensação de uma amina primária com um ácido

carboxílico;

• Obtenção de uma ligação fosforamidato intermediada pela reação entre um

grupo fosfato e uma amina primária;

• Aminação redutiva de uma amina primária ou secundária ligada a aldeído.

Portanto, o uso destes reagentes, possibilita que biomoléculas aminadas

sejam conjugadas a compostos que contenham grupamentos fosfatos ou

carboxilatos. Todas estas reações apresentam um bom rendimento,

dependendo exclusivamente do reagente empregado e da aplicação desejada,

podendo ser realizadas em meio aquoso ou orgânico 12,15,30.

1.4.4 Emprego de Carbodiimidas

As Carbodiimidas pertencem a uma classe de reagentes que são

capazes de promover a ativação de grupamentos carboxilatos ou fosfatos, os

quais podem interagir com aminas primárias presentes em inúmeros


27

compostos de origem biológica. Sem dúvida, elas são os agentes de

comprimento zero mais empregados em processos biotecnológicos, devido a

habilidade em formar conjugados entre duas proteínas, entre peptídeos e

proteínas, e entre uma biomolécula e um sistema inorgânico biocompatível12.

A utilização de carbodiimidas como mediadores em reações biológicas

de condensação é de considerável importância. John Sheehan recebeu o

prêmio Nobel por ser o primeiro pesquisador a conseguir a síntese total da

fenoximetil penicilina, empregando DCC (N,N’-diciclohexilcarbodiimida) no

fechamento do anel β-lactâmico14, Figura 1.6.

Figura 1.6 – Estrutura da DCC (N,N’-diciclohexilcarbodiimida).

Existem dois tipos básicos de carbodiimidas: as solúveis em meio

aquoso e as solúveis em meio orgânico. As hidrossolúveis são as mais

empregadas em conjugações de proteínas e demais macromoléculas de

origem biológica. Os subprodutos das reações que empregam as

carbodiimidas, principalmente as isouréias, apresentam boa solubilidade no

meio reacional, o que facilita o processo de purificação dos conjugados.

Carbodiimidas organossolúveis, são freqüentemente utilizadas em síntese

peptídica e na obtenção de conjugados envolvendo moléculas solúveis em

meio orgânico12,14.

As carbodiimidas são empregadas para mediar à formação de ligações

amida ou fosforamidato, por meio da interação de grupamentos carboxilatos ou

fosfatos com uma amina. Independentemente do tipo de carbodiimida utilizada,

a reação resulta na formação do intermediário reativo o-acilisouréia. Como

pode ser observado na Figura 1.7, este composto que apresenta elevada

reatividade, promove o ataque da amina nucleófila no grupamento carbonila do

éster formado, resultando na formação da ligação amida.

http://en.wikipedia.org/wiki/File:DCC_Structure.png


28

Figura 1.7presença (HERMANS

ED

o reagen

possuem

Figura

Atu

são os a

bioconjug

quantum

aumento

reação, F

– EDC reage com um ácido carboxílico formando o intermediário reativo. Na de um nucleófilo a ligação amida é formada, com liberação da isouréia ON, 2008, adaptada).

C ou EDAC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida] é

te mais comumente utilizado na conjugação de compostos que

grupos carboxílicos e/ou aminas, Figura 1.8.

1.8 – Estrutura da EDC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida].

almente, EDC e Sulfo-NHS (N-hydroxisulfosuccinimida) em conjunto,

gentes de comprimento zero mais empregados em processos de

ação que envolvem compostos inorgânicos biocompatíveis, tais como

dots e complexos de íons terras raras14. O Sulfo-NHS promove o

da solubilidade e estabilidade do intermediário reativo durante a

igura 1.9.

http://en.wikipedia.org/wiki/File:EDC_Structure.png


29

Figura 1.9 – Estrutura da

Estes agentes de acopla

meio aquoso, o que permite qu

solventes orgânicos. O bioconjug

removidos facilmente empregando

Ficou comprovado através

que a ativação dos grupamentos

faixa de pH 3,5-4,515, enquanto q

rendimento mais elevado na faixa

que quando proteínas e peptíde

amida mediada por EDC, apresen

no intervalo de 4,5 a 7,5. Quando

faixa preconizada, o processo de

rendimento12,14,15.

1.5 Apresentação da disser

Neste trabalho pretende-s

bioconjugação de materiais semic

os pontos quânticos de CdS/

bioacoplamento foram desenvolvid

sistema modelo.

No capítulo 2 serão desc

trabalho desenvolvido.

Sulfo-NHS (N-hydroxisulfosuccinimida)

mento apresentam elevada solubilidade em

e a reação se processe na ausência de

ado e os subprodutos formados podem ser

-se diálise ou filtração em gel.

dos estudos realizados por Nakajima e Ikada,

carboxilatos ocorre de modo mais efetivo na

ue a formação da ligação amida apresenta

de pH 4,0-6,0. Dados da literatura indicam

os são empregados, a formação da ligação

ta rendimento satisfatório com o pH do meio

o pH do meio reacional se encontra fora da

acoplamento ocorre lentamente e com baixo

tação

e enfatizar a síntese, caracterização e a

ondutores fluorescentes, mais precisamente

Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS. Os processos de

os utilizando a albumina sérica bovina como

ritos os objetivos gerais e específicos do


30

No capítulo 3 serão apresentados a metodologia de síntese e

passivação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2, a caracterização óptica e

estrutural, sendo finalizado pelos resultados e a discussão .

O capítulo 4 trata da síntese e caracterização estrutural e óptica das

suspensões coloidais de ZnSe/ZnS. É apresentado um estudo de fotoativação

destes pontos quânticos, visando o incremento da fluorescência do material.

Os processos de bioconjugação e a caracterização dos conjugados

formados entre os dois pontos quânticos estudados e a albumina sérica bovina,

são descritos no capítulo 5.

Por último, são apresentadas as conclusões do trabalho desenvolvido e

as perspectivas de melhorias do mesmo.

Capítulo 2

Objetivos

Capítulo 2: Objetivos

32

2.1 – Objetivos gerais

Este trabalho tem por objetivo desenvolver protocolos de bioconjugação

entre o sistema modelo empregado, a proteína albumina sérica bovina, e

nanopartículas fluorescentes de semicondutores do tipo II-VI de Sulfeto de

Cádmio/Hidróxido de Cádmio [CdS/Cd(OH)2] e Seleneto de Zinco/Sulfeto de

Zinco [ZnSe/ZnS], via agentes de comprimento zero e o crosslinker

glutaraldeído.

2.2 – Objetivos específicos

• Preparar as suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS, em meio

aquoso, empregando diferentes agentes estabilizantes e funcionalizantes.

• Realizar caracterização óptica e estrutural dos pontos quânticos

sintetizados;

• Avaliar o processo de fotoativação das nanopartículas de ZnSe/ZnS;

• Conjugar as nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS à albumina

sérica bovina, por meio do desenvolvimento de protocolos de

bioconjugação empregando agentes de comprimento zero e o crosslinker

homobifuncional glutaraldeído;

• Avaliar e caracterizar os bioconjugados obtidos pelo acoplamento dos

pontos quânticos a albumina sérica bovina.

Capítulo 3

Síntese, funcionalização e caracterização de

suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2

Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2

34


O sulfeto de cádmio (CdS) é um semicondutor binário do tipo II-VI, que

apresenta Eg= 2,5 eV. O processo de obtenção de nanopartículas deste

semicondutor em meio aquoso é realizado de modo simples, sendo

previamente estabelecido na literatura e implantado no nosso grupo de

pesquisa. Estas nanopartículas, sob condições ideais de síntese, apresentam

fluorescência na região visível do espectro eletromagnético, possibilitando o

seu emprego como marcadores biológicos fluorescentes16. Neste capítulo é descrita a metodologia de obtenção de NPs de

CdS/Cd(OH)2 dispersas em meio aquoso. Os pontos quânticos foram

preparados por meio de técnicas coloidais, conhecidas como bottom-up, com

utilização de precursores hidrossolúveis.

O composto polifosfato de sódio foi escolhido como agente estabilizante

das NPs dispersas em meio aquoso. Este polímero inorgânico é constituído

pela repetição de vários ânions PO3- ligados em cadeia. Estas cadeias se ligam

eletrostaticamente aos cátions de cádmio presentes na superfície do quantum

dot, resultando na formação de uma camada de carga residual negativa11,16.

Durante o processo de preparação das NPs de CdS/Cd(OH)2 devem ser

observados vários fatores que contribuem diretamente na obtenção de

sistemas coloidais estáveis. Dentre eles podemos citar: o grau de pureza e a

concentração inicial dos precursores empregados durante o processo

reacional, o tipo e a proporção do agente estabilizante utilizado, a duração do

processo de síntese, a temperatura, o pH e a força iônica do meio reacional.

Estes fatores influenciam consideravelmente no tamanho médio, morfologia,

cristalinidade e dispersão de tamanho dos pontos quânticos obtidos.


35

3.2 – Procedimentos experimentais:

3.2.1 – Reagentes empregados: Foram utilizados durante o processo de obtenção das nanopartículas de

CdS/Cd(OH)2, os seguintes reagentes:

• Perclorato de cádmio [Cd(ClO4)2] – 99% -Sigma-Aldrich;

• Gás sulfídrico (H2S) - 98% - White Martins;

• Polifosfato de sódio [(NaPO3) n]- Puro 65+% - Riedel de Haën;

• Hidróxido de sódio (NaOH) – Min. 98% - Vetec;

• Água ultra-pura deionizada.

3.2.2 – Metodologia de síntese das NPs de CdS/Cd(OH)2

A metodologia de obtenção das NPs de CdS/Cd(OH)2 empregada neste

trabalho, é uma adaptação do processo original desenvolvido por Weller e

colaboradores17,18. Santos (2002) realizou algumas modificações do processo

original durante o desenvolvimento do seu trabalho de tese, viabilizando a

aplicação destas nanopartículas em marcação de sistemas biológicos16.

Empregou-se como precursores das NPs o perclorato de cádmio

[Cd(ClO4)2] e o gás sulfídrico (H2S), o polifosfato de sódio [(NaPO3)n] como

agente estabilizante do colóide e a água ultra-pura deionizada como fase

dispersante.

Realizou-se a síntese das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 a partir de

uma solução contendo 96 mL de água ultra-pura deionizada, 2,5mL (2,5 x 10-5

mol) da solução de Cd(ClO4)2 0,01M - fonte precursora do íon Cd2+ - e 2,0 mL

(1,0 x 10-3 mol) de uma solução do agente estabilizante polifosfato de sódio na

concentração de 0,0051g/mL. O pH da solução obtida foi elevado para

aproximadamente 8,5, empregando-se solução de NaOH 0,01M. Este valor de

pH foi previamente estabelecido por Santos em seus estudos, com a finalidade

que as NPs apresentem fluorescência na região do verde do espectro visível

(~500 nm) após passivação. Posteriormente, o sistema foi fechado com


36

emprego de um septum de borracha e a ele adicionada uma alíquota de 750 µL

de gás sulfídrico (H2S), equivalente a 2,5 x 10-5 mol de S2-, com auxilio de uma

seringa especial para gases. Agitou-se vigorosamente o balão por cerca de 10

minutos à temperatura ambiente. Durante a agitação, visualizou-se a mudança

da coloração da suspensão de incolor para amarelo, indicativa da formação

das nanopartículas de sulfeto de cádmio. A proporção entre os íons Cd2+ e S2-

presentes no meio foi de 1:1. Finalizada a etapa, a suspensão é armazenada

em refrigerador.

Ao final da síntese das NPs de CdS é necessário a formação de

algumas monocamadas de hidróxido de cádmio Cd(OH)2. Pretende-se com

este artifício minimizar a quantidade de defeitos na superfície da nanopartícula.

Esta etapa de passivação foi realizada após 24 h da obtenção da suspensão

inicial.

Como pode ser observado na Figura 3.1, durante o processo ajustou-se

o pH da suspensão coloidal para aproximadamente 10,5, empregando-se

NaOH 0,1M. Em seguida, acrescentou-se sob gotejamento constante 6mL (6,0

x 10-5 mol) da solução de Cd(ClO4)2 0,01M sob agitação constante.

A adição lenta do precursor de cádmio é de fundamental importância,

pois evita a formação de aglomerados de hidróxido de cádmio, que

conseqüentemente provocariam a desestabilização do sistema coloidal.

Os grupamentos fosfatos e as hidroxilas, presentes na superfície dos

pontos quânticos, desempenham a função de agentes funcionalizantes no

processo de conjugação entre as nanopartículas e moléculas de origem

biológica11.


37

Figura 3.1 - Esquema representativoCdS/Cd(OH)2.

3.2.3 – Caracterização óptic

Após o processo de obte

sistemas foram caracterizados po

estrutural.

Realizou-se caracterização

no UV/Visível, com intuito de se

CdS/Cd(OH)2 bem como ter uma

Podemos também verificar a qua

sua homogeneidade, bem como

superior a 1µm que ocasionam

utilizou-se um espectrofotômetro

região analisada foi de 200 a 700n

Os espectros de emissão

dos pontos quânticos dispersos

espectrofluorímetro ISS K2 com u

de excitação. Durante a varredur

Cd2+ / (NaPO3)n

O

CdS

H2S

CdS

H - Agitação

da síntese e passivação das nanopartículas de

a e estrutural

nção e passivação das nanopartículas, os

r meio de técnicas de caracterização óptica e

por espectroscopia de absorção eletrônica

confirmar a formação das nanopartículas de

estimativa do tamanho médio das mesmas.

lidade da suspensão coloidal com relação à

a presença de contaminantes com diâmetro

espalhamento de luz. Neste procedimento,

da marca Beckman modelo DU 7500. A

m.

e excitação (caracterização espectroscópica)

em meio aquoso, foram realizadas em um

ma lâmpada de xenônio de 300W como fonte

a foi aplicado passo de 1 nm e empregadas

OH -

pH = 10,5

CdS/Cd(OH)2

24 horas


38

fendas de excitação e emissão de 1.0 mm. Pretende-se por meio dos espectros

de emissão, observar em que região do espectro eletromagnético os pontos

quânticos apresentam o máximo de emissão (fluorescência). Os espectros de

excitação nos fornecem informações relativas às transições excitônicas,

exibindo as regiões espectrais nas quais se devem excitar as nanopartículas

para se ter um máximo de emissão.

A caracterização estrutural dos pontos quânticos obtidos foi realizada

por meio das técnicas de difração de Raios-X (DRX) e microscopia eletrônica

de transmissão (MET).

A difratometria de Raios-X nos fornece informações relativas ao arranjo

estrutural do material e perfil de cristalinidade. As amostras de CdS/Cd(OH)2

preparadas para análise de DRX foram submetidas a um processo de

precipitação seletiva por tamanho. Para se obter o precipitado, empregou-se

álcool isopropílico absoluto como agente desestabilizante do meio coloidal,

seguido de centrifugação.

O equipamento empregado para obtenção dos difratogramas das NPs

de CdS/Cd(OH)2, foi um difratômeto da marca Siemens Nixford modelo D5000

digital, possuindo biblioteca cristalográfica e radiação incidente Kα(Cu)= 1,542 Å.

Por meio dos difratogramas obtidos estimou-se o tamanho médio das NPs,

utilizando a equação de Scherrer:

0,9× λλλλ = d × β ×cos θ θ θ θ (3.1)(3.1)(3.1)(3.1)

onde:

d = diâmetro médio das nanopartículas (em nm);

λ = comprimento de onda dos Raios-X incidentes (λ = 0,1542 nm);

β = largura da meia banda do máximo de intensidade em radianos;

θ = centro angular do pico mais intenso.

Utilizou-se a microscopia eletrônica de transmissão com intuito de se

obter informações relativas à morfologia, tamanho médio e dispersão de

tamanho das NPs de CdS/Cd(OH)2. O material a ser analisado foi depositado


39

em uma pequena grade de cobre, que possuía um revestimento com um filme

fino de parlódio.

O equipamento utilizado foi um microscópio fabricado pela FEI, modelo

Tecnai20, com tensão entre 20 e 200 kV e resolução de ponto 0,2 nm. Foram

obtidas imagens de campo claro (bright field).

3.3 – Resultados e discussão: 3.3.1 – Síntese e passivação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2

As nanopartículas de CdS recém sintetizadas apresentam uma grande

quantidade de defeitos na superfície. Este defeitos são oriundos de átomos

superficiais que não apresentam todas as suas ligações balanceadas,

proporcionando descontinuidade da rede cristalina11,17,18. Tendo em vista as

dimensões reduzidas deste sistema, os átomos da superfície contribuem

significativamente nas propriedades ópticas do material.

Os defeitos na estrutura cristalina do semicondutor resultam na

formação de níveis eletrônicos intermediários entre a banda de valência e a de

condução. Estes níveis proporcionam o surgimento de vias não radiativas no

processo de recombinação elétron-buraco, o que acarreta a diminuição ou

perda da fluorescência dos quantum dots11.

Portanto se faz necessário o processo de passivação da superfície dos

pontos quânticos de CdS, por meio da formação e deposição de algumas

monocamadas de Cd(OH)2. Este recobrimento da superfície dos quantum dots,

promove a diminuição dos defeitos, devido a formação de ligações Cd-OH na

superfície da nanopartícula. Conseqüentemente ocorre uma diminuição dos

níveis eletrônicos intermediários, desencadeando na formação de processos

radiativos (emissão de luz).

Este processo de passivação mostrou-se eficiente no sentido de

aumentar significativamente a fluorescência dos pontos quânticos. A Figura 3.2

ilustra de forma simples o processo de passivação.

Capítulo 3 – Síntese, funcionalização e caracterização deCdS/Cd(OH)2

Foram realizados cálculos para estima

nanopartículas/mL na suspensão. Empregou-se dura

cristalino blenda de zinco (cúbico) como referencia

cálculos, a lattice constant do sistema cristalino juntam

volume médio de um único ponto quântico e a q

empregados.

Por fim, obteve-se uma concentração estima

NPs/mL. Os cálculos estão descritos de modo

Apêndices.

3.3.2 – Caracterização óptica dos pontos quân

A Figura 3.3 mostra espectros de absorção re

CdS e CdS/Cd(OH)2, sintetizados de acordo com a

Seção 3.2.2.

CdS Passivação

BV

BC

Cd(OH)2 Cd(

band gap

Figura 3.2 - Representação esquemática do p

empregando-se Cd(OH)2.

CdS

h+

e-

suspensões coloidais de 40

Cd(OH)2

CdS

OH)2

rocesso de passivação de nanopartículas de CdS

r a

nte a

l. For

ente

uant

da n

deta

tico

pres

me

concentração de

estimativa o sistema

am empregados nos

com a estimativa do

idade dos reagentes

a ordem de 6,5x1013

lhado na Seção de

s de CdS/Cd(OH)2

entativos das NPs de

todologia descrita na


41

Comparando os espectros mostrad

de absorção juntamente com o valor do

praticamente iguais para a amostra antes

o tamanho das partículas não foi afetado p

O alargamento observado nas ban

Figura 3.3, constatado pela ausência de um

na região entre 400 e 500 nm indica que

de nanopartículas com diferentes diâmetr

uma dispersão de tamanho considerável.

uma dispersão de tamanho característic

aceitável, tendo em vista que não comprom

Isto se deve à cinética rápida de formação

externo durante o processo de formação da

Figura 3.3 - Espectros de absorção das sus
pensões coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2.
300 400 500 600

0

1

Abs

orbâ

ncia

(u.

a.)

CdS/Cd(OH)2 CdS

Comprimento de Onda (nm)

os acima, verificamos que o padrão

primeiro máximo de absorção são

e após a passivação, sugerindo que

elo processo de passivação.

das de absorção dos espectros da

máximo de absorção bem definido

os sistemas apresentam populações

os e valores de band gap, ou seja,

Esta metodologia de fato apresenta

a de 15%, percentual este que é

ete a aplicabilidade do material11, 22.

e a algumas limitações de controle

s nanopartículas16,18.


42

A Figura 3.4 exibe os espectros de emissão e excitação de uma

suspensão de NPs de CdS/Cd(OH)2.

300 350 400 450 500 550 600 650 7000,0

0,5

1,0

Inte

nsid

ade

norm

aliz

ada


Emissao Excitaçao

O espectro de emissão se const

emissão sob determinado comprimen

suspensões coloidais de CdS/Cd(OH

excitando-se a amostra em um comprim

A Figura 3.4 mostra um espec

emissão de pontos quântico com má

encontra na região do verde no espectro

A intensidade do pico de emissã

recombinação radiativa e não-radiativ

evidencia a presença de diferentes po

de tamanho do sistema)16,19,22. Pode se

relativamente estreita (largura de banda

se estende desde o azul ao UV. O esp

no intervalo de 300 a 470 nm, po

Figura 3.4 - Espectros normalizados de emisde uma suspensão coloidal de CdS/Cd(OH)2.

são (λexc=365 nm) e excitação (λem = 496 nm)

itui em um registro das intensidades de

to de onda de excitação. Para as

)2 o espectro de emissão foi obtido

ento de onda de 365 nm.

tro representativo de um espectro de

ximo em λ= 496 nm. Este valor se

eletromagnético visível.

o revela a possível competição entre a

a, enquanto que a largura da banda

pulações de nanopartículas (dispersão

r observado que a banda de emissão é

= 40 nm) e que a banda de excitação

ectro de excitação exibe três máximos

ssibilitando que os pontos quânticos


43

apresentem boa intensidade de fluorescência quando excitados em diferentes

comprimentos de onda. Cada máximo de excitação está correlacionado a

processos de recombinação elétron-buraco ocorrendo de diferentes bandas

energéticas para o estado fundamental. O primeiro máximo de excitação, bem

como o de absorção estão relacionados com a população de nanopartículas

responsáveis pela emissão observada16,22. Mais diretamente ainda, o tamanho

médio das partículas pode ser estimado utilizando-se a relação de

Vossmeyer20. Neste caso, para o máximo de emissão observado em 496 nm

observa-se que o primeiro máximo de excitação ocorre em 468 nm o que

corresponde a um diâmetro médio de 6 nm.

3.3.3 – Caracterização estrutural dos pontos quânticos de

CdS/Cd(OH)2

A Figura 3.5 exibe um difratograma de raios-X de pó característico das

nanopartículas de CdS/Cd(OH)2.

Figura 3.5 – Difratograma do pó de uma amostra de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 e a estrutura cúbica tipo blenda de zinco.

10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

2θθθθ

(111)

(200)

(220) (311)


44

Analisando o difratograma da Figura 3.5 podemos observar a presença

de picos alargados, algo que é bastante característico de materiais que estão

sob regime de dimensões nanométricas. Materiais nanoestruturados

apresentam uma quantidade reduzida de planos cristalinos detectáveis, o que

reduz substancialmente o fenômeno de difração dos Raios-X incidentes21. Utilizando cartões de identificação da biblioteca cristalográfica JCPDS,

confirmamos que os picos mais intensos correspondem ao sistema cristalino

cúbico, do tipo blenda de zinco. Empregando a equação de Scherrer (Seção

3.2.3), estimou-se que as NPs analisadas apresentam um diâmetro médio de

3,7 nm.

A Figura 3.6 exibe uma micrografia representativa das NPs de

CdS/Cd(OH)2, apresentando uma considerável dispersão de tamanho.

Figura 3.6 – Imagem representativa de NPs de CdS/Cd(OH)2 (parte mais elétron densa da

imagem) obtida através de MET. Barra = 40 nm.

Capítulo 4

Síntese e Caracterização de

Suspensões Coloidais de ZnSe/ZnS

Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS

46


Recentemente o desenvolvimento de metodologias para obtenção de

nanopartículas de ZnSe/ZnS em meio aquoso tem despertado um interesse em

especial, devido características que não são observadas em outros materiais

semicondutores do tipo II-VI (e.g. CdS, CdSe, CdTe)23. Diante da necessidade

de se buscar sistemas que apresentem uma menor toxicidade e maior

segurança nas aplicações in vivo e em ensaios in vitro, há atualmente uma

busca natural por precursores que causem alterações mínimas nos mais

variados sistemas biológicos e biomoléculas. Neste contexto, busca-se a

substituição dos íons de cádmio presentes em alguns sistemas, por

precursores a base de zinco. Esse elemento é naturalmente presente nos mais

variados sistemas biológicos, estando envolvido em processos bioquímicos

relacionados à imunidade, à formação óssea, à atividade enzimática e à

cicatrização.

As NPs de ZnSe/ZnS em regime de confinamento quântico se apresentam

como uma possível ferramenta para processos diagnósticos seguros e

otimizados. Esse material apresenta intensa luminescência na região do azul e

ultravioleta próximo, com comprimento de onda de emissão na faixa de 410 a

460 nm e band gap de 2.7 eV23. A sua emissão no azul é oriunda do processo

de recombinação elétron-buraco, podendo também apresentar emissões que

variam do verde ao vermelho provenientes de defeitos da superfície ou

dopagem com íons Mn2+. Devido às características supracitadas, ao seu índice

de refração e sua transparência à radiação visível, esse material vem sendo

utilizado com freqüência nos mais diversos dispositivos fotônicos, incluindo

equipamentos de eletroluminescência de baixa voltagem e lasers de diodo

azul23,24.

Outra característica interessante deste material nanoestruturado é o

fenômeno de fotoativação, observado quando as suspensões coloidais são

expostas a radiação UV na ordem de alguns minutos25. Essa exposição em um

curto intervalo de tempo, em torno de 5-40 min, proporciona modificações na

superfície do nanocristal que direcionam a um ganho na intensidade de


47

fluorescência. Essas modificações estão relacionadas a reações de foto-

oxidação dos grupamentos tiois presentes na superfície do material25.

Os compostos orgânicos tiolados, ácido mercaptoacético (AMA) e ácido

mercaptopropiônico (AMP), foram empregados como estabilizantes e

funcionalizantes das NPs dispersas em meio aquoso26,32. As sulfidrilas de

ambos os compostos, apresentam alta afinidade pelos átomos de zinco

presentes na superfície, garantindo a formação de uma camada de passivação

com baixo índice de dissociação. Estes ácidos orgânicos tiolados, também

desempenham a função de funcionalizantes durante a etapa de

bioconjugação23.

Neste capítulo é descrita a metodologia de obtenção de NPs de

ZnSe/ZnS dispersas em meio aquoso. Os pontos quânticos foram preparados

por meio de técnicas coloidais, conhecidas como bottom-up, com utilização de

precursores hidrossolúveis.

4.2 – Procedimentos experimentais:

4.2.1 – Reagentes empregados: Foram utilizados durante o processo de obtenção das nanopartículas de

ZnSe/ZnS, os seguintes reagentes:

• Sulfato de zinco hepta-hidratado (ZnSO4 . 7H2O) – 99+% - Dinâmica;

• Selênio elementar (Seº) - 100 mesh, 99,9% - Aldrich;

• Borohidreto de sódio (NaBH4) – Venpure AF grânulos, 98+% - Sigma-

Aldrich;

• Ácido mercaptoacético (AMA) – 98% - Acros Organics;

• Ácido mercaptopropiônico (AMP) – 99+% - Sigma-Aldrich;

• Hidróxido de sódio (NaOH) – Min. 98% - Vetec;



48

4.2.2 – Metodologia de síntese das NPs de ZnSe/ZnS

A metodologia de obtenção dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS

empregada neste trabalho, é baseada no processo original desenvolvido por

Andrade e colaboradores23.

Para a síntese de nanocristais de ZnSe/ZnS, utilizou-se o íon Zn2+ em

solução juntamente com o agente estabilizante, um ácido orgânico tiolado

como AMA ou AMP. Inicialmente empregou-se 7,837 mL (8,36 mmol) de uma

solução do estabilizante a 4,9 %. O pH da solução foi elevado para

aproximadamente 11, empregando-se uma solução de NaOH 0,5M.

Posteriormente, foi adicionada uma alíquota de 55 mL (2,2 mmol) da solução

de ZnSO4 0,04M, mantendo-se sob agitação, à temperatura ambiente, por

cerca de 30 minutos.

Vale salientar que nessa primeira etapa ocorre a desprotonação dos

grupamentos sulfidrilas e carboxilatos do estabilizante, pois o pH encontra-se

acima do valor do pKa de ambos, garantindo uma maior concentração da forma

ionizada no meio. A solução contendo Zn2+ e o agente estabilizante é então

aquecida lentamente até a temperatura de aproximadamente 70°C para ser

empregada na próxima etapa.

Para preparar a fonte de íons seleneto (Se2-), que serviu como precursor

na formação dos nanocristais, adicionou-se 0,0788g (1 mmol) de Selênio

elementar (Se0) em um balão e em seguida 0,08 g (2,1 mmol) do agente

redutor borohidreto de sódio (NaBH4). Os pós foram misturados até formar uma

massa homogênea de cor acinzentada. Em seguida, acrescentou-se de forma

lenta aproximadamente 8 mL (4 mmol) de uma solução de NaOH 0,5 M,

mantendo-se o sistema sob constante agitação e temperatura ambiente.

O processo de redução do selênio durou cerca de 30 minutos, e

evidenciou-se a reação pelo aparecimento de um tom acastanhado,

característico do selênio reduzido (Figura 4.1).

Após a redução, injetou-se os íons seleneto obtidos na etapa anterior na

solução Zn2+/agente estabilizante, observando-se a formação das NPs devido à

modificação da coloração de incolor para um tom amarelado. A reação


49

prossegue sob constante agitação e aquecimento (70°C) durante 90 minutos.

Após esse período, a suspensão modifica a sua coloração, tornando-se

praticamente incolor (Figura 4.2). Em seguida, armazenou-se a suspensão sob

refrigeração (2-8ºC).

Figura 4.1 –forman

Figura 4.2 – Altera

Coloração característica do selênio reduzido do um complexo colorido Na-Se-Se-Na.

70ºC

90 min

ção da coloração após processo de nucleação das NPs.


50

4.2.3 – Experimento de fotoativação

As NPs de ZnSe/ZnS foram submetidas ao processo de fotoativação,

empregando uma câmara de fotoestabilidade farmacêutica, desenvolvida e

validada por Azevedo33. O equipamento possui uma lâmpada com emissão na

região do ultravioleta próximo, sendo a dose de irradiação mensurada por

técnicas radiométricas.

Empregaram-se durante os experimentos sínteses recém preparadas de

suspensões coloidais de ZnSe/ZnS, estabilizadas e funcionalizadas com AMA.

As amostras do experimento foram separadas em alíquotas de 5 mL e

acondicionadas em frascos de penicilina. Duas alíquotas foram cobertas com

papel alumínio e utilizadas como controles (interno e externo), e outras cinco

foram colocadas na câmara de fotoestabilidade.

Iniciada a etapa de irradiação UV, a cada intervalo de 5 minutos retirou-

se uma alíquota, sendo rapidamente envolvida em papel alumínio e

armazenada no refrigerador (2-8ºC). Foram preparadas alíquotas com 5,10, 20,

30 e 40 minutos. Ao final desta etapa, todas as amostras foram caracterizadas

por meio de espectroscopia de absorção eletrônica e de emissão.

4.2.4 – Caracterização óptica e estrutural

Após o processo de obtenção das nanopartículas de ZnSe/ZnS, os

sistemas foram caracterizados por meio de técnicas de caracterização óptica e

estrutural. As técnicas empregadas são as mesmas que foram descritas na

Seção 3.2.3.


51

4.3 – Resultados e discussão: 4.3.1 – Síntese, passivação e funcionalização dos pontos quânticos

de ZnSe/ZnS

Assim como os pontos quânticos de CdS, as NPs de ZnSe recém

sintetizadas apresentam uma grande quantidade de defeitos na

superfície23,24,32. Estes defeitos são oriundos de átomos superficiais que não

apresentam todas as suas ligações balanceadas, proporcionando

descontinuidade da rede cristalina. O processo de passivação do ZnSe,

acontece por meio da formação de algumas monocamadas de ZnS, resultantes

da desprotonação dos grupamentos sulfidrilas do estabilizante.

Na primeira etapa do processo de síntese ocorre a desprotonação dos

grupamentos carboxilatos (pKCOOH= 3,6) e sulfidrilas (pKSH= 10,55) do

estabilizante, devido o pH se encontrar acima do valor do pKa de ambos,

garantindo uma maior concentração sob a forma ionizada no meio32.

No final da etapa de nucleação das nanopartículas, os grupamentos

resultantes da desprotonação das sulfidrilas, radicais estes que possuem alta

afinidade por íons Zn2+, interagem com os átomos de zinco da superfície.

Durante este processo, ocorre a formação de algumas monocamadas do

passivante ZnS, que é um semicondutor de band gap maior (EgZnS= 3,54 eV e

EgZnSe = 2,70 eV). Esta elevada afinidade pelos os íons garante uma baixa taxa

de dissociação da camada de estabilizante formada nas superfícies dos NPs.

Este processo de passivação mostrou-se eficiente no sentido de

aumentar significativamente a fluorescência dos pontos quânticos, pois ocorre

uma diminuição dos níveis eletrônicos intermediários, desencadeando na

formação de processos radiativos (emissão de luz).

Os grupamentos carboxilatos conferem aos pontos quânticos uma carga

residual negativa, garantindo uma repulsão eletrostática entre as NPs

dispersas no meio. A diminuição da freqüência de choques entre as NPs

confere uma maior estabilidade ao sistema coloidal (metaestável), postergando

o processo de coalescência. Os grupamentos carboxilatos também atuam

como funcionalizantes no processo de bioconjugação, possibilitando a

Capítulo 4: Síntese e caracterização de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS 52

interação do composto inorgânico com uma biomolécula. O processo de

bioconjugação envolvendo os pontos quânticos de ZnSe/ZnS, está descrito de

modo detalhado no Capítulo 5.

Pelo fato de atuarem simultaneamente como estabilizantes e

funcionalizantes, os ácidos mercaptocarboxílicos (tanto os de cadeia carbônica

curta ou longa), são amplamente empregados na síntese de nanoparticulas de

semicondutores do tipo II-VI23,24,26,28,32.

4.3.2 – Caracterização óptica dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS

As caracterizações descritas nesta Seção estão relacionadas às NPs de

ZnSe/ZnS, que possuem o AMA como estabilizante e funcionalizante.

A Figura 4.3 mostra um espectro de absorção representativo das NPs de

ZnSe/ZnS sintetizados de acordo com a metodologia descrita na Seção 4.2.2.

250 300 350 400 450 5000

1

2


Abs

orbâ

ncia

(u.

a.)

ZnSe/ZnS-AMA

Figura 4.3 - Espectro de absorção de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS.

O alargamento observado na banda de absorção do espectro da Figura

4.3, constatado por um máximo de absorção pouco definido na região entre

300 e 380 nm (Eg = 4,14 a 3,26 eV ) indica que o sistema apresenta uma

considerável dispersão de tamanho (>10%), entretanto, não compromete a


aplicabilidade do material 23,24,26 . O valor estimado para o primeiro máximo

encontra-se bem acima do valor do band gap do ZnSe (Eg = 2,7 eV) indicando

que as partículas encontram-se em forte regime de confinamento quântico.

A Figura 4.4 exibe o espectro de emissão de uma suspensão de NPs de

ZnSe/ZnS.

Figura 4.4 - Espectro de emissão (λexc=365 nm) representativo de uma suspensão coloidal de ZnSe/ZnS.

365 n

Pode

apres

obser

dos p

350 400 450 500 550 600 650 7000

20000

40000

60000

80000

100000


Inte

nsid

ade

(u.a

.)

ZnSe/ZnS-AMA

O espectro de emissão destas nanopartículas, obtido com excitação em

m, exibe emissão na região do azul (λmax= 406 nm) do espectro visível.

-se observar que a banda de emissão é relativamente estreita,

entando uma largura de pico a meia altura de 32 nm. O alargamento

vado na base do espectro se deve possivelmente a defeitos na superfície

ontos quânticos23,24,26.


Os espectros de emissão exibidos na Figura 4.5, correspondem às

amostras que foram submetidas ao processo de fotoativação.

Figura 4.5 – Evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma suspensão

coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação.

fa

m

d

s

d

d

F

350 400 450 500 550 6000

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Inte

nsid

ade

(u.a

.)


ZnSe/ZnS - Controle ZnSe/ZnS - 5 min ZnSe/ZnS - 10 min ZnSe/ZnS - 20min ZnSe/ZnS - 30 min ZnSe/ZnS - 40 min

Sugere-se que o processo de fotoativação das NPs de ZnSe/ZnS,

voreça a passivação dos pontos quânticos por meio da formação de algumas

onocamadas de ZnS. Estas monocamadas são formadas através da hidrólise

os grupamentos tióis presentes nas moléculas do ácido mercaptoacético,

endo o processo otimizado pela radiação incidente no meio. À medida que os

efeitos superficiais são reduzidos, promove-se um incremento na intensidade

e fluorescência dos pontos quânticos, como observado no gráfico exibido na

igura 4.6 23,24.


55

quân

Figura

suspen

4.6 – Gráfico da evolução temporal dos espectros de emissão (λexc=365 nm) de uma

são coloidal de ZnSe/ZnS empregada no experimento de fotoativação.

Na Figura 4.7 é exibida a fluo

ticos fotoativados durante um perí

420

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Intensidade (u.a.)

1 2 3 5 6

Tempo (min)

Evolução Temporal do Processo de Fotoativação de uma Suspensão Coloidal de ZnSe/ZnS

Cont. 5 10 30 40

rescência de uma amostra de pontos

odo de 20 minutos.

Figura 4.7 – Fluorescência de uma amostra fotoativada durante 20 minutos.

UV – 365nm


56

Entretanto foi observado que em intervalos superiores a 40 minutos, que

os pontos quânticos perdem progressivamente a capacidade de emissão e sua

estabilidade coloidal. Acredita-se que os processos de foto-oxidação e a

hidrólise do estabilizante, promovam este fenômeno.

No processo de foto-oxidação, elétrons presentes nos átomos

superficiais das NPs são transferidos para as moléculas de oxigênio presentes

no meio. Durante este processo, são formadas espécies altamente reativas,

tais como o oxigênio singleto. Esta espécie reativa pode promover a foto-

corrosão da camada de passivação dos pontos quânticos, acarretando em

perda de fluorescência, devido à prevalência de processos de decaimento não

radiativos25.

Quando o processo de hidrólise do funcionalizante é realizado de modo

excessivo, as NPs acabam perdendo a estabilidade em meio coloidal. Isto

ocorre devido ao desacoplamento dos terminais carboxilatos, que

anteriormente estavam ligados à superfície dos pontos quânticos, resultando

na perda da carga residual negativa, que anteriormente possibilitava a repulsão

eletrostática entre as NPs dispersas no meio23,25.

Acredita-se que este segundo mecanismo reacional é predominante nos

experimentos em que as amostras são irradiadas excessivamente, pois,

durante os ensaios realizados, verificou-se a formação de precipitados em

exposições superiores a 40 minutos.


57

padrã

para

partíc

Figura

ZnSe/Z

4.8 – Evolução temporal dos espectros de absorção de uma suspensão coloidal de

nS empregada no experimento de fotoativação.

300 4000

1

2

Absorbância (u.a.)

ZnSe/ZnS - Controle ZnSe/ZnS - 5 min ZnSe/ZnS - 10 min ZnSe/ZnS - 20 min ZnSe/ZnS - 30 min ZnSe/ZnS - 40 min


Comparando os espectros mostrados na Figura 4.8, verificou-se que o

o de absorção juntamente com o valor do primeiro máximo são similares

a amostras fotoativadas e o controle. Sugerindo que o tamanho das

ulas não foi afetado pelo processo de fotoativação.


58

4.3.3 – Caracterização estrutural dos pontos quânticos de

ZnSe/ZnS

A Figura 4.9 exibe um difratograma de raios-X de pó característico das

nanopartículas de ZnSe/ZnS.

ap

re

co

cú

3.

in

10 20 30 40 50 60

0

2

4

6

8

10

12

14

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

2θ

ZnSe/ZnS

(111) (120)

(311)

Figura 4.9 – Difratograma de Raios-X de pó de uma amostra de pontos quânticos ZnSe/ZnS.

Assim como as NPs de CdS/Cd(OH)2, os pontos quânticos de ZnSe/ZnS

resentam uma quantidade reduzida de planos cristalinos detectáveis, o que

duz substancialmente o fenômeno de difração dos Raios-X incidentes.

Utilizando cartões de identificação da biblioteca cristalográfica JCPDS,

nfirmamos que os picos mais intensos correspondem ao sistema cristalino

bico, do tipo blenda de zinco. Empregando a equação de Scherrer (Seção

2.3), estimou-se que as NPs analisadas apresentam diâmetro médio no

tervalo de d = 1,5-3 nm.


59

A Figura 4.10 exibe uma micrografia representativa das NPs de

ZnSe/ZnS, apresentando uma região com pequena dispersão de tamanho.

Figura 4.10 –

(regiões mais e

Como

dispersão d

tamanho do

concordânci

Microscopia eletrônica de transmissão representativa de NPs de ZnSe/ZnS

létron densas da imagem). Barra = 5 nm.

não se conseguiu ainda fazer uma boa estatística de resultados a

e tamanho não pode ser estimada, entretanto, a dimensão de

s campos observados para as suspensões de ZnSe demonstram

a com o estimado pela análise dos difratogramas de Raios-X.

Capítulo 5

Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com Albumina Sérica Bovina (BSA)

Capítulo 5 – Bioconjugação dos Pontos Quânticos de ZnSe/ZnS e CdS/Cd(OH)2 com BSA

61


Neste capítulo são descritas duas metodologias de bioconjugação, que

promovem a interação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS com

a proteína albumina sérica bovina.

No primeiro protocolo foram empregados agentes de comprimento zero

como mediadores do processo de conjugação entre as NPs de CdS/Cd(OH)2

ou ZnSe/ZnS e a proteína. Um segundo processo de bioacoplamento foi

desenvolvido apenas para os pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2, empregando

o glutaraldeído como crosslinker homobifuncional.

A albumina sérica bovina apresenta características que viabilizam o seu

emprego como sistema modelo no desenvolvimento de metodologias de

acoplamento com sistemas inorgânicos. Dentre elas podemos destacar: a

ampla citação na literatura, estrutura secundária/terciária e composição bem

definida, presença e disponibilidade de resíduos aminados, mudança

conformacional reversível e robustez em diferentes condições do meio

(osmolaridade, pH, força iônica e temperatura).

Trata-se de uma proteína com cadeia polipeptídica simples constituída

por cerca de 583 resíduos de aminoácidos e nenhum carboidrato, que ocorre

abundantemente no fluido e tecido, compreendendo 55-62% das proteínas

totais. A estrutura da albumina sérica aproxima-se de um elipsóide de 140 x 40

Å com três domínios homólogos, apresentando-se sob a forma de um charuto

(Figura 5.1). Comparado a globulinas, possui baixo peso molecular de 67 kDa.

A BSA possui apenas um resíduo de cisteína livre, Cis34, sendo este o grupo

alvo para os processos de bioconjugação desenvolvidos, enquanto os outros

formam 17 pontes dissulfeto que ajudam a manter a sua estrutura terciária.

Entre as suas propriedades mais importantes, podemos destacar a

hidrosolubilidade e a sua capacidade de ligar-se reversivelmente a uma grande

variedade de compostos, constituindo-se em uma proteína transportadora

multifuncional 36,37.


62

Figura 5.1 - Estrutura clássica da albumina sérica (Peters, 1985).

5.2 – Bioconjugação dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2

5.2.1 – Emprego de agentes de comprimento zero

5.2.2 – Procedimentos experimentais:

5.2.2.1 – Reagentes empregados: Foram utilizados durante o processo de bioconjugação das

nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 com a albumina, os seguintes reagentes:

• Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida (EDC) - pureza

>99% – Fluka;

• N-hidroxisuccinamida sulfonada (Sulfo-NHS) - pureza >98,5% (HPLC) -

Aldrich;

• Albumina sérica bovina (BSA) liofilizada – pureza > 96% - Sigma Aldrich;

• Mercaptoetanol – pureza >98%, Sigma;

• Ácido 4-Morfolino etanossulfônico (MES 0,1M – Tampão de Ativação

pH= 5,5-6,0) – pureza >98% – Sigma Aldrich;

• Álcool etílico absoluto – 99,8% PA ACS – Cinética;

• Tampão PBS – pH=7,2;

• Solução de Tampão Tris 1M;

• Suspensão de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2;



63

5.2.2.2 – Protocolo desenvolvido

A metodologia de obtenção dos bioconjugados empregada neste ensaio,

é uma adaptação dos vários processos descritos na literatura que utilizam

agentes de comprimento zero27,29,31. Os bioconjugados foram confirmados por

uma técnica de detecção quantitativa da intensidade de fluorescência,

empregando microplacas de poliestireno como fase sólida.

Etapa 1

Em um balão de fundo redondo de 100mL e sob constante agitação,

adicionou-se 1,25mL da suspensão coloidal de CdS/Cd(OH)2 e completou-se o

volume para 5mL com o tampão de ativação MES 0,1M. Aguardou-se 15

minutos e em seguida foi adicionado 0,4mg/mL (2mmol) de EDC e 1,1mg/mL

(5mmol) de sulfo-NHS, previamente solubilizados em água ultra-pura. Foi

efetuado um segundo intervalo de 15 minutos, para que os grupamentos

fosfatos presentes na superfície das NPs de de CdS/Cd(OH)2 fossem ativados

pela carbodiimida. Em seguida adicionou-se 14µL de mercaptoetanol 2mM

para inativar o excesso de EDC presente no meio.

Após estes processos, foi adicionado 1mg (15nmol) da albumina sérica

bovina, previamente solubilizada em 1mL de solução hidroalcoólica (80:20).

Todos os processos foram realizados sob atmosfera inerte (argônio), deixando-

se o sistema reagir por 15 horas à temperatura ambiente. Ao término do

processo reacional, foi realizado o bloqueio com 170µL de tampão Tris 1M.

Dois controles foram preparados para serem empregados no ensaio. O

primeiro foi composto por todos os reagentes utilizados no processo reacional,

excetuando-se o ponto quântico. No segundo controle foi empregado apenas o

quantum dot na mesma concentração utilizada no processo de bioconjugação.


64

Etapa 2

Foi utilizada uma microplaca negra de poliestireno (fluorescência por

cima), especifica para ensaios fluorescentes (Figura 5.2) durante a etapa de

incubação. Adicionou-se em cada poço 200µL da amostra (em triplicata),

realizando-se em seguida a incubação no equipamento de banho-maria por 2

horas a 37°C. Após a etapa de incubação, retiraram-se as amostras, lavando-

se cada poço por três vezes com tampão PBS. Realizou-se a leitura da placa,

empregando-se os filtros de excitação e emissão adequados para o quantum

dot utilizado.

Ao final das etapas de acoplamento e incubação, o bioconjugado, os

controles e a microplaca empregada no ensaio, foram armazenados em

refrigerador.

5.2.3 – Emp

5.2.4 – Proc

5.2.4.1 – Re Foram

nanopartícula

FIGURA 5.1 (Microplaca)

rego do crosslinker homobifuncional glutaraldeído

edimentos experimentais:

agentes empregados:

utilizados durante o processo de bioconjugação das

s de CdS/Cd(OH)2 com a albumina, os seguintes reagentes:

Figura 5.2 – Microplaca negra de poliestireno.


65

• Albumina sérica bovina (BSA) liofilizada – pureza > 96% - Sigma Aldrich;

• Glutaraldeído 25% em água – J T Baker ;

• Tampão PBS – pH=7,2;

• Solução de Tampão Tris 1mM;

• Suspensão de pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2;


5.2.4.2 – Protocolo desenvolvido

Neste ensaio empregou-se um agente homobifuncional amplamente

utilizado em processos de bioconjugação, apresentado de maneira mais

pormenorizada na Seção 1.2.2. A metodologia de obtenção dos bioconjugados

empregada neste ensaio foi adaptada dos processos descritos na

literatura11,12,30. Os bioconjugados foram confirmados empregando-se a técnica

descrita na seção 5.2.2.2.

Etapa 1

Em um balão de fundo redondo com capacidade para 100 mL e sob

constante agitação, adicionou-se 4,5 mL da suspensão coloidal de

CdS/Cd(OH)2 em pH=8,5. Em seguida, adicionou-se 480 µL (0,6 mmol) da

solução de glutaraldeído 0,125%.

Deixou-se a reação sob agitação e temperatura ambiente por 2 horas.

Durante este período, são formadas interações eletrostáticas entre os

grupamentos aldeídicos e a superfície dos quantum dots11. Após o processo de interação entre os grupamento químicos presentes

nos dois sistemas, adicionou-se 1mg/mL (15 nmol) da albumina sérica bovina,

previamente solubilizada em água ultra-pura. O processo reacional foi mantido

por 12 horas à temperatura ambiente sem emprego de atmosfera inerte. Ao

término do processo, foi realizado o bloqueio com 1mL de tampão Tris 1mM.

Dois controles foram preparados para serem empregados no ensaio. O

primeiro foi composto por todos os reagentes utilizados no processo reacional,


66

excetuando-se o ponto quântico. No segundo controle foi empregado apenas o

quantum dot na mesma concentração utilizada no processo de bioconjugação

Etapa 2

A etapa de incubação foi idêntica a que foi previamente descrita na

Etapa 2 da seção 5.2.2.2.

5.3 – Bioconjugação dos pontos quânticos de ZnSe/ZnS

5.3.1 – Emprego de agentes de comprimento zero

5.3.2 – Procedimentos experimentais:

5.3.2.1 – Reagentes empregados: Todos os regentes empregados foram idênticos aos que foram

detalhados na Seção 5.2.2.1, excetuando-se o ponto quântico utilizado na

reação.

5.3.2.2 – Protocolo desenvolvido O processo desenvolvido para os quantum dots de ZnSe/ZnS foi similar

ao descrito na Seção 5.2.2.2 (Etapas 1 e 2). A única alteração efetuada foi a

quantidade utilizada da suspensão de pontos quânticos. Empregou-se 1,25mL

do colóide de ZnSe/ZnS. Diferentemente do que ocorre com o CdS/Cd(OH)2,

durante o processo reacional que emprega as NPs de ZnSe/ZnS, acontece a

ativação dos grupamentos carboxilatos presentes na superfície das

nanopartículas.


67

5.4 – Caracterização dos bioconjugados de CdS/Cd(OH)2-BSA e ZnSe/ZnS-BSA

Após o processo de acoplamento, os bioconjugados juntamente com os

controles e os pontos quânticos empregados nos ensaios, foram caracterizados

por meio de técnicas espectroscópicas.

Em testes iniciais tentou-se confirmar a formação dos bioconjugados

empregando-se técnicas de eletroforese em gel. Foram utilizadas duas

diferentes metodologias. A primeira consistiu na preparação de gel de agarose

e corrida em cuba horizontal, e a segunda foi composta por gel de

poliacrilamida e corrida em cuba vertical. Ambas as metodologias se

mostraram ineficazes, pois por meio destas não foi possível confirmar a

formação dos bioconjugados.

Empregou-se uma técnica de detecção quantitativa da intensidade de

fluorescência para confirmar a formação dos bioconjugados. Microplacas

negras de poliestireno foram utilizadas como fase sólida durante os ensaios.

Nestas microplacas são formadas interações eletrostáticas entre o polímero

que as recobre e os resíduos hidrofóbicos da proteína. Diferentes filtros de

excitação de emissão foram empregados nos ensaios, tendo em vista que os

dois pontos quânticos apresentam fluorescência em comprimentos de onda

distintos. Neste procedimento, utilizou-se o equipamento VICTOR 2 WALLAC

1420 com detector de fluorescência, fabricado pela Perkin Elmer (Figura 5.3).

Figura 5.3

– Equipamento VICTOR 2 WALLAC 1420.


68

A integridade da estrutura secundária da proteína foi demonstrada por

meio da espectroscopia de dicroísmo circular. Esta técnica permitiu investigar

as diferentes conformações estruturais que a albumina adotou após as etapas

de bioconjugação. As análises foram realizadas em um espectropolarímetro de

dicroísmo circular JASCO J-815.

As amostras bioconjugadas e as suspensões coloidais empregadas,

foram caracterizadas por espectroscopia de absorção eletrônica no UV/Visível.

Avaliou-se a presença de uma possível alteração na curva de absorção dos

pontos quânticos, após a etapa de acoplamento. Nesta análise, utilizou-se um

espectrofotômetro da marca Beckman modelo DU 7500. A região analisada foi

de 200 a 700nm.

Os espectros de emissão dos bioconjugados e dos pontos quânticos

dispersos em meio aquoso, foram realizados em um espectrofluorímetro ISS

K2 com uma lâmpada de xenônio de 300 W como fonte de excitação. Durante

a varredura foi aplicado passo de 1 nm e empregadas fendas de 1.0. Esta

caracterização teve como objetivo, comparar o perfil de emissão dos

bioconjugados com o perfil das nanopartículas não ligadas.

5.5 – Resultados e Discussão 5.5.2 – Bioconjugação via agentes de comprimento zero

A carbodiimida empregada, em meio ácido, reage com os grupamentos

fosfatos ou carboxilatos presentes na superfície dos pontos quânticos de

CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS respectivamente. Resultando na formação de um

éster intermediário reativo. Este composto promove o ataque nucleofílico das

aminas primárias, presentes nos terminais lisina da albumina, aos grupamentos

carboxilatos ou fosfatos. Este processo origina ligações do tipo amida ou

fosforamidato, respectivamente12,14,15,26,27.

A maior dificuldade durante o processo reacional é a presença de outros

nucleófilos no sistema. A hidrólise da água juntamente com a presença de

moléculas de oxigênio no meio, resulta na desestabilização e clivagem do éster

intermediário. Este processo promove a formação de uma isouréia e a

regeneração dos grupamentos carboxilatos ou fosfatos; algo que é


69

extremamente indesejável durante a etapa de bioconjugação12,14,15. A

atmosfera inerte foi empregada para minimizar a quantidade de oxigênio no

meio reacional, conferindo maior estabilidade ao intermediário reativo.

A adição de outro agente de comprimento zero (Sulfo-NHS), combinado

com solventes que promovam a diminuição da constante dielétrica do meio,

possibilita um acréscimo no rendimento reacional. O processo mais indesejado

durante a etapa de ativação dos grupamentos carboxilatos, envolve a

racemização do intermediário reativo O-acilisouréia para uma N-aciluréia

estável12,14,15. Por este motivo, foi utilizado na preparação da albumina, uma

solução hidroalcoólica com 80% de água e 20% de etanol absoluto. A presença

de etanol na reação, promoveu otimização no desempenho do EDC e do Sulfo-

NHS, devido à diminuição da constante dielétrica.

Como pode ser visualizado na Figura 5.4, o Sulfo-NHS converte os

grupamentos carboxilatos das NPs em ésteres amino-reativos, contribuindo

ativamente na formação de uma ligação acilamida mais estável.

PQ

SO

OH

Ácido Carboxílico

H CH3N+NNH3C

O O

S

CH3H

O-Acilisouréia (Intermediário Ativo)

NSO3Na

O

O

Sulfo-NHSN

SO3Na

O

O

O

OS

H

BSAN

O

S

NSO3Na

O

O

HO

Sulfo-NHSÉster IntermediárioSulfo-NHS

Ligação AmidaEDC

HC

Cl-

H3C N

N N+CH3

CH3

Amina Primária

HO

H2N ASB

PQ

PQ

PQ

Figura 5.4 – Esquema reacional do EDC e Sulfo-NHS com os grupamentos carboxilatos presentes

nas nanopartículas de ZnSe/ZnS.

Como descrito na Seção 5.4, em testes iniciais tentou-se confirmar a

formação dos bioconjugados empregando-se técnicas de eletroforese em gel.

Dois trabalhos relatam a caracterização da conjugação PQ-proteína utilizando

eletroforese horizontal em gel de agarose30. Buscou-se, então, a caracterização


70

da ligação PQ-BSA fazendo uma adaptação do protocolo descrito na literatura,

para visualização da eventual formação

Foi proposto nos estudos realizados por Mamedova e colaboradores,

que bioconjugados de pontos quânticos e BSA apresentam menor migração

nas corridas eletroforéticas que as visualizadas para o padrão de BSA30.

Sugere-se que o conjugado formado, apresenta um menor deslocamento

durante a corrida devido o somatório das massas da proteína e do composto

inorgânico.

Na Figura 5.5, as bandas claramente definidas no gel correspondem à

albumina (bandas no fronte da placa). Entretanto, não foi possível distinguir a

formação de uma nova banda na corrida de eletroforese, a qual seria indicativa

do processo de acoplamento PQ-BSA. Por este motivo, empregou-se apenas a

técnica de detecção quantitativa da intensidade de fluorescência na

confirmação dos bioconjugados formados.

Nos ensaios que empregam as placas de poliestireno, ocorrem

interações químicas entre a proteína e o material que compõe a fase sólida. As

porções hidrofóbicas da proteína se ligam eletrostaticamente ao polímero que

reveste os poços da placa. Entretanto, os pontos quânticos não possuem a

capacidade de interagir com o revestimento polimérico presente no substrato.

Isto foi evidenciado por meio de ensaios, nos quais foram incubados apenas os

BSA (Padrão) PQ -BSA PQ -BSA PQ -BSA

Figura 5.5 - Corrida em gel de agarose 2% do padrão de BSA e dos bioconjugados formados entre os pontos quânticos e as moléculas da proteína. Amostras coradas em azul de coumassie.


71

quantum dots nas placas. Após o processo de lavagem por três vezes com

PBS, a placa foi submetida a leitura no equipamento com detector de

fluorescência. Para os dois pontos quânticos, o resultado de intensidade da

fluorescência em unidades arbitrárias, foi inferior ao das amostras

bioconjugadas. Comprovando que os quantum dots não possuem afinidade

química ou eletrostática pelo material que reveste os poços.

Os outros dois controles, um composto apenas pelos pontos quânticos e

outro formado por todos os reagentes exceto as NPs, também apresentaram

intensidades de fluorescência bem inferiores, em relação às detectadas para os

bioconjugados. A BSA apresenta emissão na faixa de 310 a 340 nm,

fluorescência que é oriunda de aminoácidos aromáticos que compõe a cadeia,

tais como, fenilalanina, tirosina e triptófano30. A emissão da proteína não pode

ser detectada no equipamento, tendo em vista que os filtros de excitação e

emissão não são apropriados para esta região espectral. Tudo isto corrobora

na comprovação da formação dos bioconjugados. Apenas as moléculas de

BSA que estão ligadas ao revestimento polimérico dos poços e acopladas aos

pontos quânticos, apresentam fluorescência com intensidade significativa na

região visível do espectro eletromagnético.

A Figura 5.6, exibe um esquema representativo do processo de

interação do bioconjugado com a placa de poliestireno.

PQ

Figura 5.6 – Esquema do processo de interação da BSA-ponto quântico e a placa de

poliestireno.


72

Foi estabelecido durante os ensaios, que intensidades de fluorescência

com valores em dobro em comparação aos verificados para os controles,

serviriam como indicativos da formação do bioconjugado.

O processo de bioconjugação com as NPs de CdS/Cd(OH)2 via agentes

de comprimento zero mostrou-se ineficaz. Isto se explica pelo fato da reação se

processar em meio ácido, o que acarreta a desestabilização do compósito.

O pH ácido do meio promove a degradação da camada de passivação

de Cd(OH)2, ocasionando a perda da fluorescência do ponto quântico. Por este

motivo não se evidenciou a formação do bioconjugado com o emprego da

técnica de detecção quantitativa da intensidade de fluorescência, como pode

ser observado na Tabela 5.1.

empre

moléc

empre

biocon

via c

apres

foram

apres

os co

dois c

C

Tabela

fluores

F535 n

5.1 – Resultados da análise de bioconjugação por detecção quantitativa de

cência, empregando-se o filtro de excitação F355 nm (± 40 nm) e o filtro de emissão

m (± 25 nm). D.P. = desvio padrão e C.V. = variância.

Por este motivo, os agentes de comprimento zero não foram mais

gados no processo de acoplamento entre as NPs de CdS/Cd(OH)2 e as

ulas da proteína. Não se realizou a caracterização da proteína

gando-se a técnica de dicroísmo circular, devido a não formação do

jugados. Como alternativa, foi desenvolvido um método de conjugação

rosslinker. Os resultados obtidos e a discussão detalhada serão

entados na Seção 5.5.3.

Os pontos quânticos de ZnSe/ZnS funcionalizados com AMA ou AMP,

conjugados com êxito às moléculas da BSA. Os bioconjugados

entaram intensidades bem superiores em comparação às verificadas para

ntroles. Na Tabela 5.2, são apresentados os valores de intensidade dos

ontroles e do bioconjugado ZnSe/ZnS – BSA. Neste experimento foram

Amostras

Média da Intensidade (u.a.)

D.P.

C.V. (%)

Controle TRIS 358,50 3,53 0,98

CdS/Cd(OH)2 281,66 11,37 4,03

dS/Cd(OH)2 - BSA 366,50 12,02 3,27


73

empregados pontos quânticos funcionalizados com AMA, com fluorescência na

faixa de 400 nm do espectro eletromagnético.

Na Figura 5.7 são exibidos os espectros de emissão das NPs de

ZnSe/ZnS e o do bioconjugado formado.

Amostras


D.P.

C.V. (%)

Controle TRIS 457,33 12,01 2,63

ZnSe/ZnS 507,33 5,03 0,99

ZnSe/ZnS - BSA 1.032,67 16,50 1,60

Tabela

fluores

F420 n

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

Figura

Amostr

5.7 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação.

as excitadas em 365 nm.

400 450 500 550 600

0

20000

40000

60000

80000


ZnSe/ZnS/AMA BSA - ZnSe/ZnS/AMA





74

O espectro de emissão do bioconjugado apresentou um pequeno

deslocamento do pico de emissão para 405 nm e perdeu aproximadamente 3,5

vezes a intensidade de fluorescência.

Acredita-se que o decréscimo da intensidade de fluorescência das NPs

de ZnSe/ZnS é atribuído as mudanças de pH efetuadas no decorrer do

experimento de bioconjugação, requeridas para a reação de acoplamento via

EDC/Sulfo-NHS. Outro fator decisivo é a presença de álcool no meio reacional,

pois o mesmo proporciona desestabilização do sistema coloidal, tendo em vista

que os alcoóis são amplamente empregados em processos de precipitação

seletiva de pontos quânticos e outros sistemas coloidais aquosos.

As moléculas protéicas possuem a capacidade de absorver a luz

circularmente polarizada no sentido horário e anti-horário em diferentes

amplitudes. Este fenômeno que é denominado dicroísmo circular, permite

investigar as conformações estruturais que as proteínas adotam em diferentes

condições do meio34.

Durante os ensaios de bioconjugação foi empregada a técnica de

dicroísmo circular, com objetivo de avaliar as possíveis alterações estruturais e

conformacionais da proteína empregada.

Como pode ser visualizado na Figura 5.8, o espectro de dicroísmo

circular da BSA exibe duas bandas negativas na região do UV próximo entre

208 e 222 nm, sendo bem característico da estrutura α-hélice. De acordo com

os trabalhos realizados por Greenfield, a albumina sérica bovina possui cerca

de 52% da sua estrutura secundária sob a forma de α-hélice35.


75

Como pode ser observado na Figura 5.9, o processo de bioconjugação

promoveu modificações estruturais significativas na proteína.

0 30 60 90

-160

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

DC

[mde

g]


BSA

200 230 260 290

Figura

de 1mg

229.0000 259.0000 289.0000 319.0000

-40

-20

0

20

40

DC

[mde

g]


ZnSe/ZnS-BSA

230 260 290 320

Figura

ZnSe/Z

5.9 – Espectro de dicroísmo circular de um bioconjugado formado entre as NPs de

nS e a BSA.

5.8 – Espectro de dicroísmo circular de uma solução aquosa de BSA na concentração

/mL.


76

A mudança no espectro de DC demonstra que ocorreu um possível

processo de desnaturação ou uma completa transição de α-hélice para β-folha.

O controle que possui todos reagentes, exceto os pontos quânticos, também

apresentou sinais de modificação da estrutura protéica (Figura 5.10). Isto

demonstra que principalmente a variação de pH, os reagentes empregados e

em menor proporção os pontos quânticos ligados aos resíduos de aminoácidos

presentes na cadeia polipeptídica da proteína, promoveram alterações nas

ligações intramoleculares (pontes de hidrogênio) da estrutura α-hélice.

C

bioconj

secund

maleido

7,0.

5.5.3 –

Figura

com a

229.0000 259.0000 289.0000 319.0000

-40

-30

-20

-10

0

10

20


DC

[mde

g]

Controle

230 260 290 320

5.10 – Espectro de dicroísmo circular de um controle (todos reagentes exceto as NPs)

BSA na concentração de 1mg/mL.

omo alternativa para otimizar os resultados durante a etapa de

ugação, preservando a estabilidade dos pontos quânticos e a estrutura

ária da proteína, pretende-se em ensaios futuros empregar a

imida Sulfo-SMCC, que apresenta bom rendimento reacional em pH

Bioconjugação via crosslinker homobifuncional


77

O crosslinker homobifuncional glutaraldeído promoveu o acoplamento

dos pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 a BSA. O glutaraldeído em soluções

aquosas alcalinas sofre rearranjo estrutural formando polímeros com pontos de

insaturação. Os polímeros insaturados são extremamente reativos na presença

de agentes nucleófilos, especialmente aminas primárias11,12,13,30.

Como descrito na Seção 1.2.2, a reação resulta em alquilação dos

grupamentos aminas da proteína, proporcionando a formação de ligações do

tipo amida.

As reações de bioconjugação que empregam este aldeído envolvem

uma série de mecanismos possíveis. Dentre eles podemos destacar a

formação de bases de Schiff e a reação de adição do tipo Michael, que ocorre

devido à formação dos pontos de insaturação das moléculas polimerizadas em

meio alcalino12.

Sugere-se que durante o processo de conjugação entre as NPs e a

albumina, aconteçam principalmente reações de adição do tipo Michael, devido

o pH alcalino do meio (Figura 5.11).

Figura 5.11 – Esquema reacional do acoplamento entre a BSA e o glutaraldeído.


78

Os pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2 funcionalizados com

glutaraldeído, foram conjugados com sucesso as moléculas da proteína. Os

bioconjugados apresentaram intensidades bem superiores em comparação as

verificadas para os controles. Na Tabela 5.3, são apresentados os valores de

intensidade dos dois controles e do bioconjugado CdS/Cd(OH)2 – BSA.

Neste experimento foram empregados pontos quânticos com máximo de

emissão na região do verde (503 nm) do espectro eletromagnético visível.

Na Figura 5.12, são exibidos os espectros de emissão das NPs de

CdS/Cd(OH)2 e o do bioconjugado formado.

Amostras


D.P.

C.V. (%)

Controle TRIS 410,66 1,52 0,37

CdS/Cd(OH)2 294,33 7,63 2,59

CdS/Cd(OH)2 - BSA 1019,50 94,04 9,22

Tabela

fluores

F535 n

Figura 5.12 – Comparativo entre as emissões, antes e após o processo de bioconjugação.

Amostras excitadas em 365 nm.




400 450 500 550 600 650 700

0,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

1,0x105

CdS/Cd(OH)2- BSA

CdS/Cd(OH)2

Inte

nsid

ade

(u.a

.)


79

A banda de emissão do bioconjugado se apresentou estreita (43 nm),

sem mudança de perfil e sem deslocamento do pico de emissão. Os espectros

de emissão do ponto quântico não conjugado e do bioacoplado, apresentam

valores de intensidade bastante próximos.

Sugere-se com isto, que o processo de acoplamento via crosslinker,

praticamente não interferiu nas propriedades ópticas do material e na

estabilidade coloidal.

Na Figura 5.13, são exibidos os espectros de dicroísmo circular de um

padrão de BSA na concentração de 1mg/mL e da amostra bioconjugada via

glutaraldeído 0,125%.

229.0000 259.0000 289.0000

-160

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

DC

[mde

g]

λ (nm)

CdS/Cd(OH)2-BSA BSA

200 230 260 290

Figura 5.13 – Espectro de dicroísmo circular de um controle com a BSA na concentração de

1mg/mL e a amostra bioconjugada via crosslinker.

O espectro de dicroísmo circular do bioconjugado apresentou

modificações pouco significativas, apresentando perfil similar ao padrão de

BSA. O resultado apresenta indícios que aconteceu uma pequena transição de


80

α-hélice para β-folha. Entretanto, observa-se que praticamente não ocorreu

processo de desnaturação protéica.

Em trabalhos anteriores encontrados na literatura, resultados similares a

estes foram considerados indicativos de que a estrutura terciária da proteína se

manteve praticamente intacta30.

Os resultados obtidos com o processo de conjugação via crosslinker, se

apresentaram de modo satisfatório. Observa-se que, tanto a eficiência de

fluorescência do ponto quântico, quanto a estrutura secundária da proteína

sofreram alterações mínimas durante o processo de acoplamento. Sugere-se

com isto, que a metodologia que emprega o glutaraldeído apresenta viabilidade

nos ensaios de bioconjugação.

Capítulo 6

Conclusões e perspectivas

Capítulo 6: Conclusões e perspectivas

82

6.1 – Conclusões

Durante o desenvolvimento deste trabalho, as seguintes conclusões

foram obtidas:

• Os processos de obtenção e funcionalização dos pontos quânticos de

CdS/Cd(OH)2 e ZnSe/ZnS mostraram-se satisfatórios, viabilizando o

emprego destes sistemas inorgânicos em processos de bioconjugação;

• Há necessidade de otimizar os pontos quânticos sintetizados, com o

objetivo deles apresentarem uma melhor estabilidade em meio coloidal e

incremento na fluorescência;

• Após o processo de fotoativação, as NPs de ZnSe/ZnS apresentaram

aumento na intensidade de fluorescência, devido a formação da camada

de passivação proporcionada pela hidrólise dos grupamentos tióis do

estabilizante;

• Os protocolos de bioconjugação desenvolvidos se mostraram eficazes,

excetuando-se o processo de acoplamento via agentes de comprimento

zero para os pontos quânticos de CdS/Cd(OH)2.

• Os bioconjugados formados foram confirmados pelo método de detecção

quantitativa da intensidade de fluorescência em fase sólida, demonstrando

que esta metodologia de caracterização é inovadora, simples, rápida e de

baixo custo;

• Os espectros de DC demonstraram que a estrutura secundária da BSA

praticamente não sofreu alteração, durante os ensaios de bioconjugação

que empregaram o glutaraldeído como agente de acoplamento;

• Os espectros de emissão dos conjugados de CdS/Cd(OH)2-BSA não

apresentaram alterações em relação ao pontos quânticos não acoplados.

Capítulo 6: Conclusões e perspectivas

83

Sugerindo que o processo de conjugação via glutaraldeído não altera as

propriedades ópticas do material;

• Os bioconjugados obtidos podem ser considerados protótipos na

preparação de imunocomplexos baseados em ligantes bioespecíficos,

visando o desenvolvimento de imunoensaios heterogêneos para o

diagnóstico sorológico de doenças.

6.2 – Perspectivas

Têm-se como perspectivas de aprimoramento deste trabalho:

• Melhorias nas reações de acoplamento durante o processo de

bioconjugação, empregando condições reacionais menos desfavoráveis

(pH e força iônica) para os sistemas inorgânicos e biomolécula;

• Utilização de maleidoimidas durante os processos de bioconjugação que

empregam agentes de comprimento zero. Este composto apresenta

reatividade ótima na faixa de pH=7-8, não interferindo na estabilidade e

funcionalidade das NPs e moléculas da proteína;

• Emprego das metodologias de bioacoplamento desenvolvidas na

formação de conjugados entre pontos quânticos e imunoglobulinas.

Visando o desenvolvimento de imunoensaios heterogêneos para o

diagnóstico sorológico de doenças.

Referências

84

REFERÊNCIAS

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ANEXO

88

Anexo A - Especificações técnicas da câmara de fotoestabilidade desenvolvida pelo Núcleo de Pesquisas em Nutrição Parenteral/UFPE. (AZEVEDO, 2008).

APÊNDICE

90

APÊNDICE A - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2

10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

2θθθθ

Figura A. Difratograma representativo de uma amostra de CdS/Cd(OH)2 .

Realizou-se o cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das

partículas por meio da equação de Scherrer:

d (Å) = (0,9 × λ) / (β × cosθ) (SANTOS, 2002).

Onde:

d – é o diâmetro médio das partículas em Å;

λ – Comprimento de onda da radiação incidente (Kα=1,5406 Å);

β – é a largura do pico de difração mais intenso a meia altura, em radianos;

θ – é o ângulo do pico mais intenso.

91

Cálculos: - Para a largura do pico de difração mais intenso a meia altura (β), foi

encontrado um valor de 2,21°. Para ser empregado na equação, o valor

encontrado deve ser convertido em Radianos.

1 Rad ----------- 57°

X ----------- 2,21°

X= 0,0387 Rad

- O ângulo do pico mais intenso, apresentou um valor de 2θ=26,74°. Portanto o

valor de θ, corresponde a 26,40°/2= 13,20°. Em seguida calculou-se o

Cosseno do valor de θ encontrado (13,30º), tendo como resultado

Cosθ=0,9731.

- Por fim, os valores obtidos foram inseridos na equação de Scherrer:

d(Å) = (0,9 x 1,5406) / (0,0387 x 0,9731)

d(Å) = 36,82 Å

Convertendo o valor encontrado em nanômetros, temos um diâmetro médio de

3,7 nm.

Observando as micrografias e o resultado do calculo teórico de

estimativa do diâmetro médio, podemos inferir que as suspensões coloidais de

CdS/Cd(OH)2 apresentam NPs de diâmetro médio no intervalo de 3,7- 8nm.

92

APÊNDICE B - Estimativa da quantidade de NPs/mL da Suspensão de CdS/Cd(OH)2 Realizou-se a estimativa da quantidade de NPs/mL, empregando como

referência o valor de diâmetro médio igual a 6 nm.

Para o sistema cristalino cúbico (blenda de zinco) a 300K, o

semicondutor sulfeto de cádmio apresenta distância entre as células unitárias

(Lattice Constant) = 0,583 nm.

Cálculos:

Assumiu-se as NPs de suspensões coloidais de CdS/Cd(OH)2 como

sistemas esféricos, com intuito de obter uma concentração estimada das

mesmas na suspensão.

- Inicialmente calculou-se o volume de uma nanopartícula de CdS/Cd(OH)2

com diâmetro médio de 6 nm,. Portanto, o valor do raio da NP, corresponde

3 nm..Em seguida, empregou-se a equação do volume da esfera.

V= 4/3 πr3

VNP= 4/3 x 3,14 x (3,0)3

VNP= 113,04 nm3

- Calculou-se o volume da célula unitária empregando a Lattice constant do

CdS/Cd(OH)2 cúbico a 300K.

VCEL= (0,583)3

VCEL= 0,198 nm3

93

- Em seguida, foi estimada a quantidade de células unitárias contidas em um

nanocristal de diâmetro médio= 6 nm.

VNP / VCEL= 113,04 nm3 / 0,198 nm3 = 570

Conclui-se que uma NP de diâmetro= 6 nm é formada por 570 células

unitárias. Foi possível estimar a quantidade de átomos de cádmio e enxofre em

uma NP de CdS/Cd(OH)2, pois sabe-se que cada célula unitária no formato

cúbico é constituída por 4 átomos de cádmio e 4 átomos de enxofre.

Cd – 570 células unitárias x 4 = 2280 átomos

S - 570 células unitárias x 4 = 2280 átomos

Uma nanopartícula de 6 nm de diâmetro, apresenta 2280 duplas Cd-S

em sua rede cristalina.

- Na etapa seguinte foi calculada a quantidade de átomos empregados durante

o processo de síntese.

Sabe-se que durante o processo de síntese (Seção 3.2.2), foi utilizado

2,5 x 10-5 mol de S2-, para um volume final de 100mL. Partindo-se deste valor

podemos calcular o número de átomos de S presentes na síntese, por meio do

número de Avogadro.

1mol de S----------- 6,02 x 1023 átomos

2,5 x 10-5 mol ----------- X

X= 1,5 x 1019 átomos de S na síntese.

94

- Por meio da razão entre a quantidade de átomos de S na síntese (QtdeSINT) e

a quantidade de átomos de S em uma nanopartícula (QtdeNP), estimou-se o

número de NPs (N°NPs) de CdS/Cd(OH)2 em 100mL da suspensão.

N°NPs = QtdeSINT / QtdeNP = 1,5 x 1019 / 2280

N°NPs = 6,5 x 1015 - Por fim, estimou-se o número de NPs de CdS/Cd(OH)2em 1ml da suspe

6,5 x 1015 NPs ---------- 100mL

Y ---------- 1mL

Y = 6,5 x 1013 NPs

Por meio dos cálculos realizados, pode-se concluir que a concentração fi

sistema é de 6,5 x 1013 NPs/mL.

~

nsão.

nal do

95

APÊNDICE C - Cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das nanopartículas de ZnSe/ZnS

10 20 30 40 50 60

0

2

4

6

8

10

12

14

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

2θ

ZnSe/ZnS

Figura B. Difratograma representativo de uma amostra de ZnSe/ZnS .

Realizou-se o cálculo teórico da estimativa do diâmetro médio das

partículas por meio da equação de Scherrer:

d (Å) = (0,9 × λ) / (β × cosθ) (SANTOS, 2002).

Onde:

d – é o diâmetro médio das partículas em Å;

λ – Comprimento de onda da radiação incidente (Kα=1,5406 Å);

β – é a largura do pico de difração mais intenso a meia altura, em radianos;

θ – é o ângulo do pico mais intenso.

96

Cálculos: - Para a largura do pico de difração mais intenso a meia altura (β), foi

encontrado um valor de 4,65°. Para ser empregado na equação, o valor

encontrado deve ser convertido em Radianos.

1 Rad ----------- 57°

X ----------- 4,65°

X= 0,0815 Rad

- O ângulo do pico mais intenso, apresentou um valor de 2θ=27,6°. Portanto o

valor de θ, corresponde a 27,6°/2= 13,8°. Em seguida calculou-se o Cosseno

do valor de θ encontrado (13,8º), tendo como resultado Cosθ=0,9711.

- Por fim, os valores obtidos foram inseridos na equação de Scherrer.

d(Å) = (0,9 x 1,5406) / (0,0815 x 0,9711)

d(Å) = 17,52 Å

Convertendo o valor encontrado em nanômetros, temos um diâmetro médio de

1,75 nm.

Observando as micrografias e o resultado do calculo teórico de

estimativa do diâmetro médio, podemos inferir que as suspensões coloidais de

ZnSe/ZnS apresentam NPs de diâmetro médio no intervalo de 1,7- 3nm.

97

APÊNDICE D - Estimativa da quantidade de NPs/mL Realizou-se a estimativa da quantidade de NPs/mL, empregando como

referência o valor de diâmetro médio igual a 2 nm.

Para o sistema cristalino cúbico (blenda de zinco) a 300K, o

semicondutor seleneto de zinco apresenta distância entre as células unitárias

(Lattice Constant) = 0,566 nm.

Cálculos:

Assumiu-se as NPs de suspensões coloidais de ZnSe/ZnS como

sistemas esféricos, com intuito de obter uma concentração estimada das

mesmas na suspensão.

- Inicialmente calculou-se o volume de uma nanopartícula de ZnSe/ZnS com

diâmetro médio de 2 nm,. Portanto, o valor do raio da NP, corresponde

1 nm..Em seguida, empregou-se a equação do volume da esfera.

V= 4/3 πr3

VNP= 4/3 x 3,14 x (1,0)3

VNP= 4,18 nm3

- Calculou-se o volume da célula unitária empregando a Lattice constant do

ZnSe/ZnS cúbico a 300K.

VCEL= (0,566)3

VCEL= 0,181 nm3

98

- Em seguida, foi estimada a quantidade de células unitárias contidas em um

nanocristal de diâmetro médio= 2 nm.

VNP / VCEL= 4,18 nm3 / 0,181 nm3 = 23

Conclui-se que uma NP de diâmetro= 2 nm é formada por 23 células

unitárias. Foi possível estimar a quantidade de átomos de zinco e selênio em

uma NP de ZnSe/ZnS, pois sabe-se que cada célula unitária no formato cúbico

é constituída por 4 átomos de zinco e 4 átomos de selênio.

Zn – 23 células unitárias x 4 = 92 átomos

Se - 23 células unitárias x 4 = 92 átomos

Uma nanopartícula de 2 nm de diâmetro, apresenta 92 duplas Zn-Se em

sua rede cristalina.

- Na etapa seguinte foi calculada a quantidade de átomos empregados durante

o processo de síntese.

Sabe-se que durante o processo de síntese (Seção 3.2.2), foi utilizado

1 x 10-3 mol de Se, para um volume final de aproximadamente 71mL. Partindo-

se deste valor podemos calcular o número de átomos de Se presentes na

síntese, por meio do número de Avogadro.

1mol de Se ----------- 6,02 x 1023 átomos

1 x 10-3 mol ----------- X

X= 6,02 x 1020 átomos de Se na síntese.

99

- Por meio da razão entre a quantidade de átomos de Se na síntese (QtdeSINT)

e a quantidade de átomos de Se em uma nanopartícula (QtdeNP), estimou-se o

número de NPs (N°NPs) de ZnSe/ZnS em 71mL da suspensão.

N°NPs = QtdeSINT / QtdeNP = 6,02 x 1020 / 92

N°NPs = 6,54 x 1018 - Por fim, estimou-se o número de NPs de ZnSe/ZnS em 1ml da suspensão

6,54 x 1018 NPs ---------- 71mL

Y ---------- 1mL

Y = 9,21 x 1016 NPs

Por meio dos cálculos realizados, pode-se concluir que a concentração fina

sistema é de 9,21 x 1016 NPs/mL.

~

.

l do

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Desenvolvimento de processos de bioconjugação empregando ...€¦ · 2 Sulfeto de Cádmio/Hidróxido de Cádmio ZnSe/ZnS Seleneto de Zinco/Sulfeto de Zinco Cd(ClO 4) 2 Perclorato