Desenvolvimento de substituto ósseo injectável para ......CANDIDATO Inês da Silva Cunha Código 030508006 Título Desenvolvimento de substituto ósseo injectável para regeneração

Inês da Silva Cunha

Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto

Mestrado Integrado em Engenharia Metalúrgica e de Materiais

Tese de Mestrado Integrado

Desenvolvimento de substituto ósseo injectável para regeneração óssea

Em colaboração com a empresa

Porto, Setembro de 2009

Dissertação realizada sob orientação da Prof.ª Dr.ª Mª Ascensão Lopes (FEUP) e co-orientação da Dr.ª Marta Alexandra Santos (Medmat Innovation, Lda.)

CANDIDATO Inês da Silva Cunha Código 030508006 Título Desenvolvimento de substituto ósseo injectável para regeneração óssea DATA 15 de Setembro de 2009 LOCAL Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto - Sala C603- 15:30h

JÚRI Presidente Professor Doutor José Roberto Tinoco Cavalheiro DEMM/FEUP Arguente Professor Doutor Mª Elisabete Jorge Vieira da Costa DECV/UA Orientador Professor Doutor Maria Ascensão Ferreira da Silva Lopes DEMM/FEUP

Desenvolvimento de substituto ósseo injectável para regeneração óssea FEUP

Inês Cunha – Tese de Mestrado Integrado em Engenharia Metalúrgica e de Materiais I | P á g i n a

Agradecimentos Em primeiro lugar quero agradecer à Professora Doutora Maria Ascensão Lopes, minha orientadora, por todo o apoio e aconselhamento prestados durante a realização de todo este trabalho. Quero, de igual forma, agradecer ao Professor Doutor José Domingos Santos que foi fulcral na colaboração entre a empresa Medmat Innovation Lda. e a Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, permitindo-me o contacto directo com o ambiente empresarial. Em especial, quero agradecer à Doutora Marta Santos, minha co-orientadora, por toda a disponibilidade, amizade, apoio, orientação e bem receber quer na empresa, quer fora desta, que culminaram na realização desta tese e à Mestre Sofia Meireles por todo apoio prestado e pelo carinho e amizade com que me recebeu. Agradeço a todas as pessoas que me apoiaram durante a execução deste trabalho. Na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, à Cecília Silva, por todo o tempo e paciência dedicados ao meu trabalho. Na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Departamentos de Tecnologia Farmacêutica e Bioquímica, os meus sinceros agradecimentos por toda a ajuda e apoio prestados, em especial pelo Doutor Paulo Costa, Doutora Isabel Almeida, Doutora Alice Santos Silva, Henrique Nascimento e João Fernandes. Na Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra – Centro de Estudos Farmacêuticos, ao Doutor João José Sousa, pela pronta ajuda prestada. Ao Professor Francisco Braga e à Tedec-Meiji Farma por me terem gentilmente cedido o sulfato de cálcio hemihidratado e o ácido hialurónico, respectivamente. Ao Doutor Pinto Ribeiro por toda a amabilidade e ajuda prestadas no decorrer do trabalho experimental. À Mestre Marta Silva, Doutora Vanessa Morais, Eng.º Bruno Sá, Mestre João Neves, Doutor António Guimarães, Doutora Ana Paula Barbosa, Doutora Maria João Simões e Mestre Márcia Vieira pelo bom ambiente proporcionado durante todo o meu estágio na empresa. Agradeço a todos os meus amigos, Rui Alves, Elsa Sequeiros, Jorge Santos, Tito Garrido, Sérgio Araújo, Hugo Tavares por todo apoio e amizade dados de livre vontade durante todo o meu percurso académico. Obrigada por mais esta batalha! Agradeço, em especial a duas das pessoas mais importantes da minha vida, Virgínia Fernandes e Eliana Macedo, por sempre me terem guiado e aconselhado. O vosso amor e amizade são, e sempre serão, fundamentais.


Inês Cunha – Tese de Mestrado Integrado em Engenharia Metalúrgica e de Materiais II | P á g i n a

Ao meu amigo de infância, André Macedo, o meu obrigado por me fazeres ter sempre os pés assentes no chão. À Raquel Magalhães, ao António Jorge Miranda, Ricardo Ciríaco Macedo, Eugénia Agonia, Francisco Macedo, por toda a amizade que ao longo dos anos tem sido uma mais-valia para a minha realização pessoal. Agradeço ao meu namorado, João Almeida, por todo amor e carinho que me fizeram, e fazem, querer seguir sempre em frente, pelo seu apoio incondicional e por acreditar em mim. Obrigada por existires e por seres! O agradecimento final vai para os meus pais, irmão, avós, tios e prima, Carlos Manuel Cunha, Mª da Graça Cunha, Pedro Cunha, Laura Lima, Carlos Alberto Cunha, Mª Arminda Cunha, Alberto Carlos Cunha e Ema Mª Cunha, pois sem eles nada seria possível. Obrigada por me proporcionarem um ambiente de amor, carinho e amizade, por me incutirem valores para toda a vida, sem o vosso apoio nada faria sentido. A todos, os meus profundos agradecimentos!


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Resumo A incapacidade associada aos problemas clínicos de índole óssea é considerada um dos maiores problemas sociais das populações envelhecidas na sociedade moderna, sendo que o osso é o segundo material mais transplantado no corpo humano. Como resultado, foi desenvolvido e patenteado um novo substituto ósseo sintético, o Bonelike®, como resposta aos enxertos utilizados habitualmente. O Bonelike® possui um efeito muito positivo na regeneração óssea, dada a sua similaridade com a fase mineral do osso e uma bioactividade acrescida em relação à hidroxiapatite contudo, e à semelhança de outros substitutos ósseos sintéticos sob a forma de grânulos, a sua aplicação ideal deverá compreender um processo que não recorra a técnicas cirúrgicas muito invasivas, com o mínimo de desconforto para o paciente e com custos inerentes acessíveis. Tendo em conta o acima mencionado, esta dissertação pretende abordar técnicas de regeneração óssea que recorrem a substitutos ósseos sintéticos associados a veículos de aplicação que obedeçam a requisitos como a biocompatibilidade, biodegradabilidade e resposta inflamatória mínima. O trabalho experimental desenvolvido durante este estudo visou o desenvolvimento de novas formulações para a aplicação de Bonelike® com um veículo adequado à obtenção de uma pasta ou de uma pasta injectável. Foram explorados dois biomateriais, um de origem inorgânica, sulfato de hemihidratado (CShh) (obtido por desidratação de CS dihidratado), utilizado há vários anos como substituto ósseo, e outro de origem orgânica, ácido hialurónico (HyA), polímero que existe abundantemente na matriz extracelular. Dado tratar-se de dispositivos médicos, foram vários os ensaios realizados para que os produtos finais obtidos desempenhassem a função para o qual foram desenvolvidos. Procederam-se a estudos de caracterização físico-química, que, no caso do CS passou pela análise de micro-Raman, Karl-Fisher e balança de humidade e ensaios de presa com o aparelho de Vicat e, no caso do HyA, pelo estudo da sua injectabilidade recorrendo-se a um texturómetro com uma sonda de extrusão de bisnagas acoplada e estudos de interacção com o sangue, em concreto estudos de hemocompatibilidade (coagulação e hemólise) para validar o comportamento aquando da sua associação o Bonelike®. Em suma, todo o trabalho de laboratorial permitiu chegar à optimização da formulação de uma pasta de CShh e uma pasta injectável de HyA. Estudos subsequentes irão permitir que ambos venham a ser uma mais-valia para o tratamento de defeitos ósseos em humanos.


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Abstract The failure associated to bone clinical problems is considered one of the major social problems of modern society aged populations being bone the second most transplanted material in the human body. Consequently, it was developed and patented a new synthetic bone substitute, Bonelike®, as an answer to the currently used grafts. Bonelike® possesses a strong positive effect in bone regeneration, due to its similarity to the bone’s mineral phase and increased bioactivity relatively to hydroxyapatite. Nevertheless, and in resemblance to other synthetic bone substitutes in granule form, its ideal application should withstand a minimal invasive surgical technical procedure, with reduced patient discomfort and affordable costs. In regard to the abovementioned, the current dissertation intent was to address bone regeneration techniques that resort to synthetic bone substitutes associated with application vehicles that meet requirements such as biocompatibility, biodegradability and minimal inflammatory response. The experimental work developed during this study aimed at development new formulations for the application of Bonelike® with a suitable vehicle to obtain a putty or an injectable putty. Two biomaterials were explored, one with inorganic origin, calcium sulfate hemihydrate (CShh) (attained by dehydration of CS dihydrate) used for several years as bone substitute, and one with organic origin, hyaluronic acid (HyA), a polymer that exists abundantly in the extracellular matrix. Since these application systems are medical devices, several were the tests undertaken in order to guarantee that the final products obtained would performed the function for which they were developed. A physical-chemical characterization was conducted, in the CS case, micro-Raman analysis, Karl-Fisher titration and moisture analyzer to determine crystallization water and setting time with Vicat’s apparatus were performed, and in HyA case, an injectability study involving the use of a texturometer with a coupled tube extrusion probe and an hemocompatibility (coagulation and hemolysis) study were undertaken to validate the behavior upon association with Bonelike®. In short, all the laboratorial work lead to formulation optimization of the CS hemihydrate putty and the HyA injectable putty. Subsequent studies will enable both systems to become an asset to bone defect treatments in humans.


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Objectivo e Estrutura da Tese Esta dissertação teve como objectivo o desenvolvimento de uma pasta e uma pasta injectável para a área de regeneração óssea, tendo como base a associação de Bonelike® com sulfato de cálcio hemihidratado (CShh) ou ácido hialurónico (HyA) para a obtenção de duas novas formulações para aplicação em contexto cirúrgico minimamente invasivo, que garantam a estabilização dos grânulos esféricos de Bonelike® no local do defeito ósseo na presença de fluidos fisiológicos, nomeadamente nas cirurgias ortopédica (500-1000 µm) e maxilofacial (250-500 µm). O capítulo I consiste numa breve revisão bibliográfica, onde são focados os assuntos mais importantes para a interpretação deste trabalho, nomeadamente regeneração óssea, tecido ósseo e substitutos ósseos. No Capítulo II estão descritos os métodos experimentais, no qual constam todos os equipamentos e técnicas utilizados para a caracterização de ambas as putties. No caso da pasta de Bonelike® com CShh, esta foi caracterizada quer química quer fisicamente. Em relação à caracterização química foram realizados ensaios de espectroscopia micro-Raman, recorrendo-se ao equipamento presente na Faculdade de Ciências da Universidade do Porto (FCUP) e ensaios de Karl-fisher, realizados na Faculdade de Farmácia de Coimbra – Centro de estudos Farmacêuticos; em relação à caracterização física, esta foi realizada na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto através de ensaios de presa com aparelho de Vicat. Adicionalmente, procedeu-se à caracterização do CShh obtido por microscopia electrónica de varrimento (SEM), recorrendo-se ao microscópio do CEMUP. No caso da pasta de Bonelike® com HyA, a sua caracterização passou pela análise de injectabilidade através da utilização do texturómetro pertencente à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto (FFUP) - Departamento de Tecnologia Farmacêutica e pela determinação de hemocompatibilidade através de testes de hemólise realizados na FFUP – Departamento de Bioquímica e de testes de coagulação realizados no Hospital Geral de Santo António – Serviço de Hematologia Clínica. No Capítulo III estão descritos os resultados experimentais obtidos, bem como toda a sua discussão e no Capítulo IV encontram-se as conclusões obtidas durante a execução deste trabalho.


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Índice Páginas Agradecimentos I Resumo III Abstract IV Objectivo e Estrutura da Tese V CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO 1 1. Regeneração óssea 1 2. Tecido ósseo 2 3. Substitutos ósseos 4

3.1. Autoenxertos 5 3.2. Aloenxertos 5 3.3. Xenoenxertos 6 3.4. Substitutos ósseos sintéticos 6

3.4.1. Cerâmicos 6 3.4.2. Bonelike® 8 3.4.3. Sistemas de aplicação de substitutos ósseos 9

3.4.3.1. Sulfato de cálcio 10 3.4.3.2. Ácido hialurónico 12

CAPÍTULO II – MÉTODOS EXPERIMENTAIS 15 1. DESENVOLVIMENTO DE PASTA DE BONELIKE® E DE SULFATO DE CÁLCIO

HEMIHIDRATADO 15 1.1. Produção de sulfato de cálcio hemihidratado 15 1.1.1. Caracterização química do ulfato de cálcio 16 1.1.1.1. Espectroscopia de micro-Raman 16 1.1.1.2. Determinação da água de cristalização pelo método

Karl-Fisher 17 1.1.2. Caracterização física do sulfato de cálcio 17 1.1.2.1. Ensaios de presa 17 1.1.2.1.1. Estudo preliminar para a determinação da proporção

massa de sólido/volume de líquido 17 1.1.2.1.2. Ensaios de presa com Aparelho de Vicat 18 1.1.2.2. Caracterização por microscopia electrónica

de varrimento (SEM) 19 1.2. Pasta de Bonelike® e sulfato de cálcio 19

2. DESENVOLVIMENTO DE UMA PASTA INJECTÁVEL DE BONELIKE® E ÁCIDO HIALURÓNICO 20 2.1. Ensaio preliminar para determinação da percentagem

volúmica ideal de veículo 20 2.1.1. Ensaios de injectabilidade 21 2.2. Interacções com o sangue 23 2.2.1. Ensaios de hemólise 23 2.2.2. Ensaios de coagulação 24


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CAPÍTULO III – RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO 26 1. DESENVOLVIMENTO DE PASTA DE BONELIKE® E DE SULFATO DE CÁLCIO

HEMIHIDRATADO 26 1.1. Produção de sulfato de cálcio hemihidratado 27 1.1.1. Caracterização química do sulfato de cálcio 28 1.1.1.1. Espectroscopia de micro-Raman 29 1.1.1.2. Determinação da água de cristalização pelo método

Karl-Fisher 31 1.1.2. Caracterização física do sulfato de cálcio 33 1.1.2.1. Ensaios de presa 33 1.1.2.1.1. Estudo preliminar para a determinação da proporção

massa de sólido/volume de líquido 33 1.1.2.1.2. Ensaios de presa com aparelho de Vicat 34 1.1.2.2. Caracterização por microscopia electrónica

de varrimento (SEM) 35 1.2. Pasta de Bonelike® e sulfato de cálcio 36

2. DESENVOLVIMENTO DE UMA PASTA INJECTÁVEL DE BONELIKE® E ÁCIDO HIALURÓNICO 38 2.1. Ensaio preliminar para determinação da percentagem

volúmica ideal de veículo 38 2.1.1. Ensaios de injectabilidade 40 2.2. Interacções com o sangue 45 2.2.1. Ensaios de hemólise 47 2.2.2. Ensaios de coagulação 50

CAPÍTULO IV – CONCLUSÕES 52 BIBLIOGRAFIA 53


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Capítulo I - Introdução Actualmente a esperança média de vida é duas vezes superior à esperança média de vida no início do séc. XX, o que resulta numa perda de funcionalidade dos tecidos. De realçar a incapacidade de se resolver os problemas clínicos associados à degeneração óssea, que é um dos problemas sociais mais graves das populações envelhecidas na sociedade moderna. O osso é o segundo material mais transplantado no corpo humano logo a seguir ao sangue [1]. Defeitos ósseos resultantes de trauma, de ressecção de tumores, de não-união de fracturas e de malformações congénitas são problemas clínicos comuns [2], que se traduzem numa elevada demanda clínica de substitutos ósseos [3]. 1.Regeneração óssea A engenharia de tecidos, uma abordagem terapêutica inovadora e abrangente, aplica os princípios de engenharia e de ciências da vida para desenvolver substitutos biológicos com o objectivo de restaurar, manter ou melhorar as funções fisiológicas de tecidos ou órgãos. Esta definição abarca uma pesquisa multidisciplinar compreensiva, sendo a integração da biologia, bioquímica e medicina clínica com as disciplinas de ciência dos materiais, física e engenharia imperativa para o seu sucesso em aplicações clínicas [4]. A engenharia do tecido ósseo visa a restauração do osso, através da associação de um substituto ósseo com células precursoras derivadas da medula óssea e/ou factores de crescimento ósseo como é o caso das BMPs (Bone Morphogenic Proteins). Para esta abordagem terapêutica é necessária uma estrutura de suporte temporário, estrutura 3D, geralmente compreendida pelo substituto ósseo. Esta estrutura 3D possui funções de preenchimento do defeito ósseo e suporte preliminar de cargas. Adicionalmente, a estrutura 3D serve como guia para a formação de novo osso, isto é, promove a osteocondução. A bioreabsorção é uma propriedade essencial para a estrutura 3D, a sua degradação com o tempo garante o preenchimento do defeito a tratar com novo tecido ósseo [4]. A supracitada abordagem terapêutica abriu uma área de investigação de vanguarda que visa o desenvolvimento de um substituto ósseo ideal que preencha todos os requisitos associados à reparação e regeneração ósseas. Estes requisitos serão abordados em secções posteriores deste capítulo. Somente um conhecimento profundo da fisiologia do tecido ósseo assegurou o desenvolvimento dos substitutos ósseos actuais.



2. Tecido ósseo O sistema esquelético possui diversas funções: (i) suporte mecânico às articulações, tendões e ligamentos; (ii) protecção dos órgãos vitais; (iii) reservatório de cálcio e fosfato contribuindo para preservação da homeostasia mineral normal. Tal diversidade de funções requer um tecido complexo e dinâmico, sofrendo renovação e reparação ao longo da vida como resultado do processo de remodelação óssea. Neste processo estão envolvidas duas linhagens celulares especializadas, os osteoblastos e os osteoclastos, os quais formam e reabsorvem o tecido mineralizado, respectivamente. A acção destas linhagens celulares no esqueleto maturo resulta numa taxa anual de remodelação óssea que ronda os 10%. Adicionalmente, a maioria das patologias do sistema esquelético resultam de irregularidades na remodelação óssea que comprometem a arquitectura, estrutura e resistência mecânica do osso, originando sintomatologia clínica como a dor, deformidade, fractura e desequilíbrio na hosmeostasia do cálcio e fosfato [5]. Histologicamente, o osso é constituído maioritariamente por tecido conjuntivo (tecido ósseo) que é caracterizado por uma matriz extracelular mineralizada (depósitos de fosfato de cálcio) e pela presença de colagénio. Outros tipos de tecidos que constituem o osso incluem a medula óssea, o endósteo, o periósteo, tecido nervoso, tecido vascular e tecido cartilaginoso [5]. Na matriz extracelular mineralizada do tecido ósseo é onde se encontram as células metabolicamente activas responsáveis pela remodelação deste órgão: células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteoclastos, osteócitos e as células hematopoiéticas da medula óssea [6]. (Figura 1)

Figura 1 – Anatomia e microanatomia do osso [5].



O osso é um tecido mineralizado complexo que exibe tenacidade e resistência mantendo porém algum grau de elasticidade existindo duas formas, o osso primitivo e o osso lamelar [6]. O primeiro é um osso imaturo que se forma durante o desenvolvimento embrionário, cicatrização de fracturas, tumores e doenças metabólicas. A sua organização estrutural é aleatória. O segundo é o osso mais maduro que substitui gradualmente o osso primitivo e constitui a maioria do esqueleto maduro possuindo uma estrutura mais organizada [6]. O desenvolvimento embrionário do tecido ósseo primitivo ocorre por dois processos principais:

(i) Os ossos achatados, tais como a calvária do crânio, a mandíbula e a maxila, desenvolvem-se por ossificação intramembranosa, na qual células estaminais mesenquimais se diferenciam em osteócitos (que mineralizam para originar células ósseas maduras) [5];

(ii) A maioria dos outros ossos, incluindo os ossos longos dos membros, as costelas, a pélvis e as vértebras, desenvolve-se por ossificação endocondral. O tecido cartilaginoso é invadido por tecido vascular contendo células osteoprogenitoras, que sendo posteriormente removidas são substituídas por osso. Este crescimento ósseo estende-se a partir dos centros de ossificação situados no centro e nas extremidades do osso em desenvolvimento. Um vestígio de cartilagem permanece em cada extremidade do osso durante a infância; este é denominado “placa de crescimento” ou “placa epifisária” (Figura 1) [5].

Nos ossos longos, o crescimento esquelético depende da divisão das células cartilaginosas (condrócitos) dentro da placa de crescimento. Tal ocorre na zona proliferativa, zona distal do osso, onde condrócitos acabados de formar migram em direcção ao centro do osso, sofrendo um aumento de tamanho na designada zona hipertrófica. Posteriormente, os condrócitos hipertróficos sofrem morte celular e a matriz circundante calcifica, sendo posteriormente remodelada pela acção concertada de osteoclastos e osteoblastos originando osso maduro [5]. O osso lamelar é constituído por tecido ósseo cortical e tecido ósseo trabecular ou esponjoso. (Figura 1) O tecido ósseo cortical é denso, tem uma área superficial baixa e forma um envelope em torno da cavidade medular. Este tipo de tecido é organizado em sistemas Harvesianos (Figura 1): canais cilíndricos concêntricos (osteões) unidos por uma matriz de tecido duro, essencialmente constituída por



hidroxiapatite, em torno de um canal central contendo a rede vascular [5]. Fibras cilíndricas de colagénio (o principal componente orgânico do osso) preenchem os poros (190-230 µm) deste tipo de tecido ósseo [5]. A matriz inorgânica do tecido ósseo cortical consiste numa estrutura com porosidade interconectiva de aproximadamente 65% [7, 8]. A maior parte do osso (80%) é cortical, sendo a sua distribuição variável. Por exemplo, a porção distal dos ossos longos, os corpos vertebrais e o calcâneo são predominantemente trabeculares, enquanto o osso cortical predomina nas hastes dos ossos longos e colo do fémur [5]. O tecido ósseo trabecular ou esponjoso possui uma densidade menor e uma área de superfície muito elevada. Este tipo de tecido preenche o centro dos ossos longos, ossos achatados e vértebras. Adicionalmente o tecido ósseo trabecular difere do cortical por apresentar mais espaços vazios e poros não-cilíndricos preenchidos por colagénio. Os poros do osso trabecular são maiores que os poros do osso cortical, na gama dos 500-600 µm, sendo preenchidos com medula óssea [5]. Desta forma, torna-se evidente que devido à sua estrutura complexa, o osso é um dos órgãos mais difíceis de mimetizar. 3. Substitutos ósseos Uma das funções base de um substituto ósseo é a da promoção der uma estrutura tridimensional estável, permitindo a formação de novo osso, que deverá possuir a mesma qualidade, resistência e dimensão do osso original que está a substituir [9]. Contudo, a resistência mecânica não é um pré-requisito para um substituto ósseo, dado que nas situações clínicas comuns a carga é suportada pelo osso saudável remanescente ou por um sistema placa-parafuso ou fixação por pinos. Adicionalmente, materiais com elevada resistência podem apresentar desvantagens, nomeadamente, a não bioreabsorção e a inexistência de estímulo biomecânico apropriado ao osso em formação. Actualmente, nenhum substituto ósseo, incluindo o osso humano, pode ser utilizado isoladamente para aplicações de suporte de carga sem um suporte adicional [9]. De realçar que a investigação na área dos substitutos ósseos identificou propriedades chave necessárias a uma regeneração óssea óptima:

(i) Osteogénese: presença de células capazes de formar novo tecido ósseo [10, 11];



(ii) Osteocondução: interacção física entre o osso em crescimento e substituto ósseo para que as células capazes de formar novo tecido ósseo possam aderir, crescer e atravessar todo o material [10, 11];

(iii) Osteoindução: diz respeito à presença de factores que estimulem a diferenciação fenotípica das células acima mencionadas em osteoblastos [10, 11];

Normalmente, os substitutos ósseos não reúnem as três propriedades chave [10, 11]. 3.1 Autoenxertos O enxerto de referência consensual é o enxerto autólogo ou autoenxerto, onde o osso é colhido num local e transplantado para outro local do mesmo indivíduo. Estes enxertos são osteogénicos, osteoindutores, osteocondutores, completamente biocompatíveis e não tóxicos [3]. Dada a origem autóloga do enxerto os riscos de infecção (VIH, vírus da hepatite, Doença de Creutzfeldt-Jakob) e/ou de rejeição imunológica são eliminados [12]. O número limitado de locais onde se pode proceder à colheita de autoenxertos no corpo humano (crista ilíaca, perónio, etc.) restringe a quantidade obtida por procedimento [3]. Adicionalmente, a elevada morbilidade associada ao local da colheita, bem como processo doloroso local associado, são factores que prolongam a hospitalização por períodos superiores ao requisitado para atingir fusão óssea. Procedimentos cirúrgicos com estes enxertos aumentam o tempo de anestesia e custos do tratamento [9], sendo os transplante de derivação biológica uma solução imperfeita [3]. 3.2 Aloenxertos Contrariamente aos autoenxertos, os aloenxertos consistem em tecidos provenientes de outros indivíduos da mesma espécie ou tecido post-mortem [13]. Existem vários tipos de aloenxertos ósseos, tais como, osso ilíaco poroso, aloenxertos ósseos liofilizados e aloenxertos descalcificados e liofilizados. Os aloenxertos da crista ilíaca, esterilizados por radiação e posteriormente congelados, têm sido utilizados em diferentes estudos. A liofilização tem sido apontada como uma significante redutora da antigenicidade dos aloenxertos [14]. O aloenxerto esponjoso mineralizado, obtido por conservação de solvente, é o único aloenxerto que reivindica a preservação da formação de trabécula na estrutura óssea quando comparado com a liofilização, reivindicando um maior potencial osteocondutor [15]. Porém, a aplicação clínica de aloenxertos apresenta problemas de ordem logística e o potencial risco de transmissão de doenças ao receptor constitui actualmente um



problema que preocupa a comunidade médica no que concerne a infecções víricas [16]. Adicionalmente, o resultado clínico da aplicação de aloenxertos ainda está condicionado pela perenidade do seu comportamento biológico e mecânico ao longo do tempo, que por sua vez, estão dependentes de uma miríade de factores, alguns dos quais não se encontram totalmente esclarecidos [9]. 3.3 Xenoenxertos Para o tratamento de defeitos ósseos pode ainda recorrer-se aos xenoenxertos. Estes enxertos são normalmente de origem bovina e submetidos a processos e tratamento de desproteinização de forma a eliminar a imunogenicidade e o potencial risco infeccioso. De facto, estes processos reduzem, mas não eliminam por completo o risco de transmissão de doenças [10]. 3.4 Substitutos ósseos sintéticos Os materiais fabricados por mão humana (aloplásticos ou enxertos ósseos sintéticos) sobressaem como uma opção razoável aos enxertos supracitados, visto encontrarem-se facilmente disponíveis e poderem ser processados e modificados para se adequarem a necessidades específicas de uma dada aplicação. Adicionalmente, não existem preocupações sobre potenciais infecções, incompatibilidade imunológica, esterilidade e morbilidade do local de doação. Por isso, investigações sobre materiais artificiais para reconstituição de tecido ósseo surgem como um dos assuntos chave no campo da pesquisa de biomateriais para aplicações clínicas [3]. Os substitutos ósseos sintéticos são definidos como biomateriais que possuem propriedades químicas e biológicas similares ao osso humano. Com base nas propriedades chave, acima mencionadas, para um substituto ósseo, tem sido desenvolvida uma variedade de materiais sintéticos injectáveis, quer de base cerâmica quer de base polimérica. Os resultados são promissores e preparam caminho para uma nova era de materiais que providenciam uma maior e melhor regeneração do tecido ósseo com menor desconforto para o paciente do que outras técnicas actualmente empregues [17]. 3.4.1.Cerâmicos Os cerâmicos são classificados quanto à resposta dos tecidos ao material como bioinertes, reabsorvíveis ou bioactivos. [13] Exemplos dos materiais mais utilizados como substitutos ósseos são a hidroxiapatite, Ca10(PO4)6(OH)2; fosfatos de tricálcio, Ca3(PO4)2, nas suas formas alotrópicas β e α; e os biovidros (Tabela 1) [10].



Tabela 1 - Substitutos ósseos comerciais mais comuns no mercado [18]. Produto Características Empresa

Hidroxiapatite

Ceros 80 Hidroxiapatite cristalina densa Straumann Ltd, Reino Unido Biocoral Esqueletos minerais de corais Inotebm, França Pro Osteon Hidroxiapatite coralina macroporosa Interpore Int., EUA Bio-Oss Fase mineral de osso bovino Osteohealth, EUA Osteograft Hidroxiapatite cristalina CeraMed, EUA Calcitite Hidroxiapatite cristalina densa Calcitek, EUA

Fosfato de Tricálcio (TCP)

Chronos/Ceros 82 TCP Mathis, Suíça Biosorb TCP SBM S.A., Lourdes Vitoss TCP poroso Orthovita, EUA Cerasorb TCP Curasan AG, Alemanha Actifuse TCP substituído com iões silicato Apatech, Reino Unido

Biovidros Bioglass® Vidro biactivo Novabone, EUA Ceravital Grupos de vidro e vidros cerâmicos com várias composições Alemanha Biogran Vidro biactivo Orthovita, EUA

Os materiais inertes são aqueles que não provocam reacção de corpo estranho no organismo, encontrando-se em ligação directa ao tecido receptor [10]. Os materiais reabsorvíveis são eliminados à medida que se forma o novo tecido ósseo por processos de dissolução ou acção celular [10]. Os materiais bioactivos têm a característica de formarem uma ligação com o tecido ósseo e, em alguns casos, com outros tecidos moles [10]. A ligação com o osso está associada à formação de uma camada de hidroxiapatite carbonatada (HAC) (apatite) na superfície do material bioactivo. A fase HAC formada é próxima, em composição e estrutura, à fase mineral do osso e esta equivalência é responsável pela ligação interfacial. São cerâmicos bioactivos: vidros do sistema SiO2-CaO-P2O5, vitrocerâmicos e fosfatos de cálcio, como a HA [13].



3.4.2.Bonelike® O Bonelike® é um biomaterial sintético, resultante da actividade de investigação de membros da empresa Medmat Innovation-Grupo Biosckin, de centros de I&D do Sistema Científico e Tecnológico Nacional e de algumas universidades estrangeiras, nomeadamente: Queen Mary and Westfield College, Londres (Reino Unido); Cambridge University (Reino Unido); Eastman Dental Institute (Reino Unido), Biomaterials Laboratory, Okayama University (Japão) and Nava Institute of Science and Technology (Japão) [19]. O Bonelike® é um substituto ósseo sintético, cuja composição química é semelhante à da fase mineral do tecido ósseo humano. É um produto trifásico constituído principalmente por hidroxiapatite, ([Ca10(PO4)6(OH)2], (HA)) e percentagens controladas de alfa e beta fosfato tricálcio ([α- e β-Ca3(PO4)2], (α-TCP e β-TCP)) de bioactividade acrescida resultante das modificações com iões que estão presentes na parte mineral do osso humano [20]. Utilizando um processo patenteado [21, 22] é possível: (i) introduzir na composição do Bonelike® iões, tais como fluoreto e sódio, entre outros; (ii) originar grânulos esféricos, com uma geometria considerada ideal para a adaptação do material a defeitos ósseos; (iii) originar grânulos esféricos com estrutura micro e macroporosa altamente controlada. Estas propriedades são responsáveis pela osteocondução e osteointegração acrescidas do substituto ósseo [23, 24]. A existência das fases alfa e beta-TCP, que apresentam uma maior taxa de degradação relativamente à HA comercial, promove a libertação controlada dos iões fluoreto e sódio da superfície do substituto ósseo para o meio circundante, promovendo a deposição de matriz extracelular de tecido conjuntivo do osso e activando especificamente células osteopercursoras, induzindo formação óssea [25, 26]. A microporosidade presente no Bonelike® melhora a adesão celular (ancoramento celular) e a macroporosidade permite o crescimento ósseo pelo interior do substituto ósseo, factores decisivos para o aumento da taxa de formação de novo osso no local da implantação. Uma porosidade caracterizada por poros de diâmetro igual a 100 µm é uma condição absolutamente necessária para que se verifique o crescimento da rede vascular capilar e, se estabeleçam interacções entre células osteoprecursoras–substituto ósseo, fundamentais para o crescimento e reorganização celular no interior do enxerto sintético. A micro e macroporosidade e o grau de



interconectividade dos poros do Bonelike® afectam directamente a difusão de gases e nutrientes presentes nos fluidos fisiológicos, bem como a remoção de resíduos metabólicos. O substituto ósseo actua como uma ponte estrutural para a regeneração do osso, à medida que as células crescem no interior dos canais porosos [27]. Na Figura 2 está representado o mecanismo segundo o qual actua o Bonelike®.

Figura 2 – Mecanismo de regeneração óssea do Bonelike® [19].

3.4.3. Sistemas de aplicação de substitutos ósseos Genericamente, os substitutos ósseos são utilizados na clínica nas áreas de cirurgia ortopédica, cirurgia oral, cirurgia maxilofacial e implantologia com o objectivo de regenerar defeitos ósseos de diversas origens. Adicionalmente, são utilizados como revestimento de próteses ortopédicas e implantes dentários. Em medicina regenerativa do osso, a maioria dos cirurgiões reconhece o papel fulcral dos tecidos moles na estabilização do osso durante a fixação da fractura, porém o carácter invasivo dos procedimentos cirúrgicos clássicos compromete os tecidos circundantes. À medida que o conhecimento sobre a biologia e mecânica da reparação e estabilização da fractura aumenta, o interesse em abordagens cirúrgicas menos invasivas para a fixação da fractura é exacerbado. Técnicas de redução indirecta têm sido desenvolvidas numa tentativa de preservar o fornecimento de sangue à fractura óssea, melhorando a taxa de cicatrização da fractura e diminuindo a necessidade de enxertia óssea e concomitante incidência de infecção [28]. A medicina regenerativa do tecido ósseo, aposta actualmente em abordagens cirúrgicas minimamente invasivas. No caso de substitutos ósseos com estruturas 3D pré-formadas adaptadas ao defeito, é necessário um estudo prévio do tamanho e forma do mesmo, e defeitos com forma e tamanho irregulares podem revelar-se problemáticos. Adicionalmente, é necessária uma cirurgia invasiva para a implantação da estrutura. Além disso, métodos de suplementação com células em



abordagens de engenharia do tecido ósseo podem ser ineficientes devido ao pobre transporte de células através da própria matriz e dano celular induzido pela mesma. A utilização de substitutos ósseos injectáveis pode superar estas limitações [29]. Adicionalmente, a utilização de substitutos ósseos injectáveis minimiza o desconforto do paciente, o risco de infecção, a formação de cicatriz e o custo do tratamento. Nestes sistemas injectáveis constituídos por vários componentes, o componente do substituto ósseo encontra-se em suspensão ou solução num segundo componente antes da indução da solidificação in vivo. Desta forma é garantida a distribuição mais homogénea dos componentes, bem como de moléculas bioactivas terapêuticas suplementares. Além do mais, a natureza destes sistemas torna possível de co-injectar uma suspensão celular com os restantes componentes do injectável, resultando numa formulação que preenche qualquer defeito ósseo de tamanho ou forma irregulares através de uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Após injecção e solidificação, a estrutura 3D formada in situ providencia uma matriz temporária, à qual as células podem aderir, proliferar e diferenciar, formando um tecido novo e funcional. Por este motivo, os substitutos ósseos injectáveis são matrizes promissoras para a indução ou regeneração do tecido ósseo [29]. Outra abordagem corrente consiste na aplicação de uma pasta associada ao substituto ósseo, sem sistema injectável, de forma a facilitar o manuseio (a mistura dos materiais é facilitada pelo facto de não estar confinada a uma seringa), garantir a estabilização do material aquando da sua aplicação e melhor adaptação ao defeito ósseo resultando numa diminuição do tempo cirúrgico e de recuperação do paciente. Materiais promissores para estes sistemas são o sulfato de cálcio e o ácido hialurónico. 3.4.3.1. Sulfato de cálcio O sulfato de cálcio (CS) ocupa um lugar de destaque entre os materiais regenerativos. Tem uma longa história de utilização clínica sendo reconhecido por todo o mundo como um material com boa tolerância para aplicações em regeneração óssea. Este material sofre uma reabsorção in vivo praticamente completa [30] sem gerar produtos de dissolução que possam impedir a formação óssea e sem desencadear uma resposta inflamatória significativa [30, 31]. É de salientar que a vantagem mais importante do CS é a sua taxa de absorção natural que corresponde à taxa de crescimento de novo osso, ou seja, à medida que o CS é reabsorvido, o novo osso restaura características anatómicas e propriedades estruturais do local [9]. Encontra-se reportado na literatura que o período de reabsorção do CS ronda as 5



semanas na ausência do periósteo (de notar que nesta situação não se verifica o crescimento ósseo), e de 45-72 dias na presença do periósteo, verificando-se a regeneração completa do defeito em aproximadamente 3 meses [30]. Adicionalmente, o CS pode ser utilizado como dispositivo de entrega de antibióticos, bem como de outros agentes farmacológicos e factores de crescimento [30]. O CS, ou gipso, é um mineral constituído por sulfato de cálcio dihidratado ��. 2��. O material em bruto a partir do qual o CS é produzido é relativamente pouco dispendioso e abundante, uma vez que este é obtido através de vários tipos de operações de exploração mineira. Antes de ser utilizado em aplicações médicas, o CS tem de ser rastreado quanto a impurezas, tais como silicatos, chumbo, estrôncio e outros materiais que ocorrem naturalmente [30]. Quando se procede ao tratamento térmico a 150ºC, o gipso perde água. O produto resultante é o sulfato de cálcio hemihidratado, também conhecido como gesso-de-Paris [30]:

��. 2�� .12�� 3

2�� A forma hemihidratada do CS existe em duas formas, � e β, que diferem entre si no tamanho dos cristais, área de superfície e imperfeições de malha. Embora estes materiais sejam quimicamente idênticos, eles diferem consideravelmente nas propriedades físicas. A forma �-hemihidratada é razoavelmente dura e relativamente insolúvel quando comparada com a forma β-hemihidratada [30]. Relativamente à microestrutura, a forma β-hemihidratada caracteriza-se por um agregado de cristais irregulares com poros capilares intersticiais, enquanto o �-hemihidratado contém fragmentos clivados e cristais em forma de bastonete e prismas [30]. Quando o CS hemihidratado é misturado com água, forma-se o dihidrato em condições de reacção exotérmica moderada [30]:

�� .12�� 3

2�� . 2�� À medida que o hemihidrato se vai hidratando, forma-se uma suspensão bifásica de partículas hemihidratadas numa solução aquosa saturada. Quando a solução se torna supersaturada com dihidratos, os cristais formam núcleos na suspensão e formam um precipitado. A nucleação e crescimento dos cristais continuam até a solução deixar de ser saturada, conduzindo a uma dissolução posterior do hemihidrato. A alternância entre dissolução e precipitação prossegue com o crescimento dos cristais existentes ou nucleação de novos cristais [30].



Devido à sua diferença nas características das partículas, a forma �- necessita de menor quantidade de água para hidratar do que a forma β- (0,3 versus 0,6 g/g de hemihidratado, respectivamente) [30]. Como resultado, a forma � resulta num dihidrato extremamente denso que é mais forte e menos solúvel do que a forma β-. Adicionalmente, o endurecimento do CS hemihidratado é influenciado pelo meio no qual ocorre. É comummente descrito que a adição de sais inorgânicos, tais como cloreto de sódio e sulfato de potássio ao CS aceleram a reacção de endurecimento pelo aumento da densidade dos cristais [30]. Na Tabela 2 figuram alguns exemplos de aplicações de CS.

Tabela 2 – Exemplos de aplicações de CS [30]. Composição Aplicação Pellets de CS Preenchimento ósseo em ortopedia CS na forma de pó/líquido para formar uma pasta que endurece in situ Dentária Formulação de uma pré-medida de CS de grau médico, estéril, e solução aceleradora Material barreira ou extensor de enxerto Formulação de pastas contendo CS e plasticizantes, como CMC (carboximetil celulose)

Utilizadas isoladamente como materiais de enxertia ou misturados com aloenxertos ou xenoenxertos. CS injectável Cirurgia ortopédica 3.4.3.2. Ácido Hialurónico O ácido hialurónico (HyA) é um polissacárido de base natural. Os polissacáridos são estruturas poliméricas de carbohidratos, constituídos por unidades repetitivas (mono- ou dissacáridos) unidas via ligações glicosídicas [32, 33, 34]. As suas estruturas são geralmente lineares, mas poderão conter variadas ramificações [35]. Os polissacáridos são muito heterogéneos, contendo ligeiras modificações na unidade repetitiva. A sua fórmula geral é Cx(H2O)y, onde x é geralmente um número elevado compreendido entre 200 e 2500 monossacáridos. Considerando que as unidades repetitivas, que são o fulcro do polímero, são geralmente monossacáridos de seis carbonos, a fórmula geral também pode ser representada como (C6H10O5)n, onde 40≤n≤3000 [36]. Devido à sua similaridade com a matriz extracelular (ECM), os polímeros naturais não induzem inflamação crónica ou reacções imunológicas e toxicidade frequentemente detectados aquando da utilização de polímeros sintéticos. Materiais de base polimérica natural não invasivos contendo células e agentes bioactivos são abordagens muito atractivas nos contextos de engenharia de tecidos e regeneração [37].



O HyA era anteriormente extraído a partir do humor vítreo de bovinos, de cristas de galos ou de cordões umbilicais. Este HyA apresentava um custo elevado associado aos métodos de produção e encontrava-se associado a algumas proteínas intrínsecas do tecido utilizado para o seu isolamento. O mesmo polissacarídeo é hoje produzido a larga escala recorrendo às bactérias Streptococcus zooepidemicus e Streptococcus equi. Este processo de fermentação bacteriana apresenta um rendimento de produção excelente e produto final de elevada pureza. Por conseguinte, houve um decréscimo de preço, permitindo o desenvolvimento das suas aplicações [35].

A estrutura química do HyA é apresentada na Figura 3.

Figura 3 – Estrutura química da unidade de repetição no HyA [35]. Legenda: GlcA – ácido D-glucorónico; GlcNAc – D-N-acetilglucosamina. O HyA é um glicosaminoglicano não sulfatado, distribuído pelos tecidos conectivos, epiteliais e neuronais [33, 38]. É um dos componentes base da matriz extracelular, contribuindo significativamente para a proliferação e migração celulares, podendo ainda estar envolvido na progressão de alguns tumores malignos [32, 33]. O HyA é um polímero de dissacáridos, constituído por ácido D-glucorónico e D-N-acetilglucosamina ligados através de ligações glicosídicas β-1,4 e β-1,3 alternantes [32, 33]. O HyA pode ter 25 000 dissacáridos repetitivos em comprimento. A gama de pesos moleculares dos polímeros de HyA in vivo pode variar entre 5 000 e 20 000 000 Da. O peso molecular médio do HyA do líquido sinovial é de 3-4 milhões de Da, e o HyA purificado a partir do cordão umbilical humano é de 3 140 000Da [39]. O HyA é sintetizado a nível da membrana celular via a actividade da hialuronato sintetase e secretado directamente para o espaço intracelular, onde vai promover um microambiente altamente hidratado decorrente das suas propriedades higroscópicas [40]. O HyA é degradado pela acção de hialuronidases, até à data foram identificadas quatro [41], sendo posteriormente removido do plasma através do sistema linfático e fígado, bem como pela actividade de receptores endocíticos específicos [42]. Actualmente, pensa-se que o HyA possui três funções [43]:



(i) Expansão do espaço extracelular através da ligação de sal e água - as suas propriedades higroscópicas atraem água, resultando em expansão;

(ii) Interacção com uma panóplia de moléculas extracelulares para formar a matriz extracelular - que é rica em glicosaminoglicanos, onde o HyA providencia estabilidade e elasticidade;

(iii) Activa cascatas de sinalização intracelular através de receptores de superfície, tais como CD44 e RHAMM.

O HyA é rapidamente metabolizado nos humanos, e cerca de um terço da sua quantidade total é substituída por dia [43]. Os níveis de HyA no sangue são relativamente baixos. Pensa-se que isto seja devido às ligações do HyA com colagénio que mantém os níveis de HyA livre baixos [44]. Níveis elevados de HyA na circulação não são benéficos, pois o HyA liga facilmente a fibrina promovendo a formação de um coágulo sanguíneo. Quanto mais elevada for a concentração de HyA livre, mais rápido será o tempo de coagulação [45], e portanto maior a probabilidade da formação de um trombo com implicações patológicas subsequentes [46, 47]. Propriedades como a ausência de imunogeneicidade, o facto de desempenhar um papel importante na reparação tecidual pela promoção da migração e diferenciação das células mesenquimais e epiteliais, melhorando a deposição de colagénio e a angiogénese, tornam o HyA um biomaterial ideal para um sem número de aplicações. A Tabela 3 possui exemplos de alguns produtos à base de HyA e as suas aplicações [34].

Tabela 3 – Produtos à base de HyA e suas aplicações. Produto Composição Aplicação

OSSIGEL® Formulação viscosa de HyA contendo o factor de crescimento de fibroblastos (FGF)

Fase final do ensaio clínico como enxerto ósseo sintético para acelerar a regeneração da fractura óssea

HYAFF® 11 Ésteres benzílicos Veículo transportador de factores de crescimento, morfogénios e células estromais da medula óssea, para cicatrização

AMVISC® e AMVISC® PLUS Soluções viscosas de HyA de elevado peso molecular Substituto do humor vítreo, bem como protector do tecido sensível do olho durante procedimentos cirúrgicos como a extracção das cataratas, transplante de córnea e tratamento de glaucoma

SYNVISC® e ORTHOVISC® Soluções viscosas de HyA Clinicamente utilizado como substituto do fluido sinovial para aliviar a dor e melhorar a mobilidade das articulações em pacientes com osteoartrite



CAPÍTULO II – MÉTODOS EXPERIMENTAIS No âmbito do mestrado integrado em Engenharia Metalúrgica e de Materiais o trabalho experimental, desenvolvido em conjunto com a empresa Medmat Innovation Lda., visou o desenvolvimento de uma pasta e uma pasta injectável para aplicação de Bonelike® em cirurgia minimamente invasiva. Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os normativos vigentes referentes quer à caracterização das matérias-primas, quer à caracterização do dispositivo médico resultante. As matérias-primas utilizadas encontravam-se em conformidade com as especificações da Farmacopeia Europeia. 1. DESENVOLVIMENTO DE UMA PASTA DE BONELIKE® E DE SULFATO DE CÁLCIO HEMIHIDRATADO 1.1. Produção de sulfato de cálcio hemihidratado

A produção de sulfato de cálcio hemihidratado (CShh) foi realizada pelo método que consta na British Pharmacopeia 2008 (Farmacopeia Britânica) [48]. Resumidamente, procedeu-se à secagem controlada a 150ºC de sulfato de cálcio dihidratado (CSdh) (Riedel-de-Haen) durante um período de tempo que assegure a perda da quantidade desejada de água de cristalização. A determinação do tempo óptimo de secagem foi realizada pelo método de tentativa/erro, sendo que o ponto de obtenção de CShh foi confirmado por comparação com CShh comercial (gentilmente cedido pelo Professor Doutor Francisco Braga). A preparação das amostras teste iniciais foi realizada mediante a norma ISO 3052:1974 [49]. Amostras teste de CSdh (duplicados de 50 g) e amostras controlo de CShh (duplicados de 10 g), foram acondicionadas em camada uniforme, não excedendo os 10 mm de altura, em placas de petri. As caixas devidamente fechadas e seladas, permaneceram durante 24h em condições ambiente de temperatura e humidade. As amostras foram submetidas a um tratamento térmico a 40ºC em estufa durante 18 h para remoção da água de superfície. Após esse período de tempo, permitiu-se o arrefecimento das amostras em excicador. De seguida procedeu-se a pesagens das amostras teste iniciais até peso constante. Sinteticamente, realizam-se duas pesagens com intervalos de 1h entre pesagens até peso constante, ou seja, até os valores não diferirem em mais de 0,2 g. A água de cristalização foi determinada em cerca de 2 g de cada amostra teste inicial em balança de humidade (Moister Analyser MX-50, AND), definindo-se a



temperatura de secagem de 200ºC, permitindo o ensaio decorrer automaticamente até variação de massa de 0,05%/minuto. Após a preparação das amostras teste iniciais, foi realizado um estudo preliminar de validação de metodologia com diferentes períodos de secagem a 150ºC e posterior determinação de água de cristalização e comparação com a água de cristalização de amostras controlo. Este estudo preliminar de validação da metodologia, contemplou períodos secagem a 150ºC de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 horas, tendo indicado 3 h de tratamento térmico a 150ºC como tempo mínimo para a desidratação efectiva das amostras teste (dados não mostrados). Por conseguinte, o estudo foi realizado a partir dessa premissa tendo-se procedido a um ensaio inicial com amostras teste de 10 g e os mesmos períodos de tempo de tratamento térmico. Um total de 8 cadinhos foi colocado em estufa a 150ºC. Após o período de tempo de experimentação, foi permitido o arrefecimento dos cadinhos em excicador. Estas amostras foram submetidas novamente ao tratamento de preparação de amostras teste acima mencionado, sendo analisadas através da balança de humidade, pesando-se cerca de 2 g de cada amostra, e comparadas com as amostras controlo. Após o estudo inicial, procedeu-se, à preparação de uma quantidade superior (�50 g) de amostras testes iniciais submetidas ao tratamento térmico acima referido por períodos de tempos de 3, 4, 5 e 6 horas para a realização da caracterização físico-química.

1.1.1. Caracterização química do sulfato de cálcio. A caracterização química do CS recorreu à espectroscopia de micro-Raman e determinação da água de cristalização pelo método Karl-Fisher.

1.1.1.1. Espectroscopia de micro-Raman A realização desta análise requereu o fabrico prévio de pastilhas das amostras teste de CS, para que fosse mais fácil a determinação das moléculas presentes em cada uma das amostras. Cerca de 1g de cada uma das amostras controlo (CSdh e CShh comercial) e das amostras tratadas termicamente (CSdh_3h, CSdh_4h, CSdh_5h e CSdh_6h) foi colocada num molde, no qual foi exercida uma força de compressão utilizando uma prensa uniaxial, obtendo-se, deste modo pastilhas para cada uma das amostras. A caracterização química pela espectroscopia de micro-Raman para cada amostra foi realizada da mesma forma. As amostras foram analisadas no espectrómetro Jobin Yvon T64000 com um laser de Argon 514,5 nm de potência 100 mW e com um



microscópio Olympus incorporado. Utilizou-se uma lente de ampliação de 50x, e um tempo de aquisição equivalente a 2 ciclos de 30s cada. Procedeu-se à definição da gama de radiação do ensaio tendo em conta a bibliografia consultada [50], definindo-se um intervalo de análise dos 300 – 3600 cm-1. O ensaio foi restringido às seguintes zonas de interesse: (z1) 300-1300cm-1; (z2) 3200-3700 cm-1. As caracterizações químicas de todas as amostras foram realizadas através de dois ensaios por amostra em diferentes locais da pastilha.

1.1.1.2. Determinação da água de cristalização pelo método de Karl-Fisher

Optou-se pelo método de Karl Fisher, um método mais sensível de determinação da água de cristalização e consagrado na Farmacopeia Europeia [51], para validar os resultados obtidos laboratorialmente em balança de humidade. Esta determinação foi realizada em triplicado para cada amostra (CShh comercial e CSHH_4h) seguindo o protocolo de titulação Karl-Fisher definido bibliograficamente [52]. Resumidamente, inicialmente, fez-se uma calibração (com di-sódio tartarato dihidratado p.a., Merck) do equipamento (Titulador Metrohm, modelo 787 KF Titrino), realizando-se a titulação do reagente de Karl Fisher (KF) (Reagente KF, Riedel-de-Haen) no início do ensaio e esta foi válida para todo o conjunto de amostras a avaliar. A massa a analisar foi colocada num recipiente com metanol (Metanol Fluka pa) a priori da análise, para que não caísse em ambiente “seco”. Iniciou-se a titulação da amostra com o reagente de KF, sendo que o próprio equipamento fez as adições (e posterior remoção) de reagentes, tendo todo o processo ocorrido sob agitação (Metrohm, modelo 703 Ti Stand). Cada análise demorou entre o início e a remoção de excessos de reagentes.

1.1.2. Caracterização física do sulfato de cálcio A caracterização física do CS consistiu em ensaios de presa e caracterização por microscopia electrónica de varrimento (SEM).

1.1.2.1. Ensaios de presa 1.1.2.1.1. Estudo preliminar para a determinação da proporção

massa de sólido/volume de líquido A proporção massa de sólido/volume de líquido influencia drasticamente a presa de CS [31, 53, 54]. Após a realização de uma pesquisa bibliográfica a proporção de 0,6 g soro fisiológico/1g CShh surge como necessária para induzir a hidratação completa do



CShh [30]. Seguidamente, procedeu-se a um estudo preliminar para validação desta proporção para o material preparado. A meia grama de cada amostra (CShh comercial, CSdh_3h, CSdh_4h, CSdh_5h e CSdh_6h) foram adicionados 833 µL de soro fisiológico. O tempo de presa foi determinado por cronometragem tendo sido as amostras submetidas aos mesmos testes para verificação do mesmo: rápida agitação, resistência à inversão e avaliação com ponta de pipeta para determinar a consistência da mistura.

1.1.2.1.2. Aparelho de Vicat Os ensaios de presa foram realizados de acordo com a norma ASTM C472-2004 [55], recorrendo ao aparelho de Vicat (Figura 4). Porém uma ligeira modificação na configuração do anel cónico rígido foi necessária. Para uma melhor compreensão, o aparelho e o ensaio serão descritos de seguida, de forma resumida.

Figura 4 – Aparelho de Vicat. a) Vista frontal; b) Vista lateral.

Segundo a norma ASTM C472-2004, o aparelho de Vicat deverá possuir: uma estrutura A, com uma vara móvel B, com uma ponta de êmbolo C com não menos de 50 mm, tendo a outra ponta D uma agulha amovível com 1 mm diâmetro e 50 mm comprimento. A vara B poderá ser colocada em qualquer posição pelo parafuso E e terá um indicador ajustável que se move numa escala (em mm) anexado à estrutura A. A pasta deverá ser colocada num anel cónico rígido G (com diâmetro interno de 70 mm na base, 60 mm no topo e 40 mm de altura) apoiado num prato de vidro quadrado com 100mm2 H. O anel G foi adaptado de forma a minimizar a quantidade de material por ensaio (20 mm de altura e 25 mm de diâmetro). O volume do anel foi calculado pela fórmula do volume do cilindro.



O ensaio foi realizado como consta na norma. Resumidamente, no anel adaptado, colocado sobre o prato de vidro na estrutura (A), foi colocada a amostra misturada com soro fisiológico de modo a ficar ao nível da extremidade superior do anel (volume de 9400 µL). O tempo de ensaio foi iniciado no momento em que o CS entrou em contacto com o soro fisiológico. A agulha (D) foi posicionada na superfície do material e presa com o parafuso (E). Seguidamente, soltando-se o parafuso permite-se que a agulha caia livremente sobre o material. Recorre-se à escala graduada para determinar variação de distância percorrida pela agulha até à solidificação do material. Repetiram-se as medições em pontos diferentes da superfície do material (Figura 5).

Figura 5 - Exemplo representativo de uma amostra solidificada dentro do anel cónico G adaptado. Para todas as amostras foi realizado um n=3 para verificação da reprodutibilidade dos resultados, tendo-se constatado que na altura da mistura todas as amostras analisadas demonstraram ser exotérmicas.

1.1.2.2. Caracterização por microscopia electronica de varrimento (SEM) A análise por microscopia electrónica de varrimento (SEM) foi efectuada no aparelho FEI QUANTA 4000 FEG ESEM, no Centro de Materiais da Universidade do Porto (CEMUP). A preparação de amostras de CSdh e CSdh_4h foi realizada num suporte de alumínio com fita de carbono para adesão das partículas da amostra e posterior revestimento a ouro. Esta análise tem em vista a aquisição de imagens microscópicas da microestrutura de ambas as amostras analisadas, tendo sido adquiridas por electrões secundários a uma intensidade de feixe de 10,00 kV.

1.2. Pasta de Bonelike® e sulfato de cálcio Para a preparação de uma pasta de Bonelike® e CShh foram realizados ensaios para determinar % (v/v) de Bonelike® e de CShh ideais. Misturas de Bonelike® com o CShh



(na presença de soro fisiológico na proporção de 0.6g/mL) foram ensaiadas nas percentagens volúmicas de 50 % (v/v) e 75 % (v/v) de substituto ósseo (Tabela 4), genericamente recomendadas para outros substitutos ósseos [56, 57, 58]. As granulometrias de 250-500µm e 500-1000µm de Bonelike® foram testadas e o tempo de presa determinado. Tabela 4 – Cálculos para determinação da percentagem volúmica de Bonelike® na preparação da pasta com CS, de acordo com as densidades de empacotamento do Bonelike®.

% (v/v) Bonelike®

v Bonelike® (µL) v ��.

�� + soro fisiológico (µL)

m Bonelike® (g) 250-500 µm m Bonelike® (g) 500-1000 µm

50 250 250 0,368 0,278 75 375 125 0,551 0,416 Para cada percentagem volúmica de Bonelike® com os diferentes CS foi realizado um n=2. Os CS utilizados foram CShh comercial (controlo) e CSdh_4h. Resumidamente, foram pesadas as massas de Bonelike® 250-500 µm e 500-1000 µm correspondentes para eppendorfs, de seguida foram preparadas as misturas de CShh e soro fisiológico na razão de 0,6g/mL. Aquando da adição do soro fisiológico era iniciada a cronometragem, sendo posteriomente adicionados os volumes da mistura ao Bonelike® de acordo com a Tabela 4. Foi resgistado o comportamento e o tempo de presa das pastas obtidas. 2. DESENVOLVIMENTO DE UMA PASTA INJECTÁVEL DE BONELIKE® E ÁCIDO HIALURÓNICO

2.1. Ensaio preliminar para determinação da percentagem volúmica ideal de veículo

Realizaram-se ensaios preliminares de prova de conceito para a associação de Bonelike®, nas granulometrias 250-500 µm e 500-1000 µm, com HyA (10mg/mL em solução salina, gentilmente cedido pela Tedec-Meiji Farma) para o desenvolvimento de uma pasta injectável. O intervalo das percentagens volúmicas de HyA ensaiado foi de 5-45 % (v/v) (Tabela 5). O ensaio foi realizado num volume total de 250 µL, considerando a densidade de empacotamento do Bonelike® de diferentes granulometrias (determinação por porosimetria de mercúrio) para aferir a quantidade de Bonelike® a utilizar (Tabela 5). As percentagens volúmicas ensaiadas



foram seleccionadas com base na coesão e homogeneidade da mistura, sendo que as percentagens mais baixas (5 e 10 % (v/v)) não obtiveram resultados macroscopicamente aceitáveis, pelo que se passou para as percentagens de 30, 35, 40 e 45 % (v/v). Tabela 5 – Determinação da percentagem volúmica ideal de HyA, de acordo com densidade de empacotamento do Bonelike®. % (v/v) HyA v HyA (µL) v Bonelike® (µL) m Bonelike® (g)

250-500 µm m Bonelike® (g) 500-1000 µm

5 12,5 237,5 0,349 0,264 10 25,0 225,0 0,331 0,250 30 75,0 175,0 0,257 0,194 35 87,5 162,5 0,239 0,180 40 100,0 150,0 0,221 0,167 45 112,5 137,5 0,202 0,153

O ensaio preliminar de determinação da percentagem volúmica ideal de veículo comportou um ensaio de comportamento na presença de sangue. Este ensaio foi realizado com as percentagens de HyA de 30, 35 e 45 % (v/v). As amostras de sangue foram colhidas na presença e ausência de anti-coagulante (EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético). Para cada percentagem testada consideraram-se os seguintes grupos experimentais: Grupo 1: Pasta Bonelike®/HyA + sangue não anti-coagulado; Grupo 2: Pasta Bonelike®/HyA + sangue anti-coagulado; Grupo 3: Bonelike®+ sangue não anti-coagulado. O ensaio foi realizado para um volume final de 250 µL, em que as amostras de sangue foram adicionadas numa percentagem de 50 % (v/v) em relação à pasta de Bonelike®

e HyA. 2.1.1. Ensaios de injectabilidade

Para a realização dos ensaios de injectabilidade foram seleccionadas as seringas apresentadas na Tabela 6. As seringas A e B destinam-se a aplicação em cirurgia ortopédica de Bonelike® 500-1000 µm e as seringas C e D para aplicação em cirurgia maxilofacial de Bonelike 250-500 µm.



Tabela 6 – Seringas testadas para o sistema injectável Componente Fabricante/Referência Designação Seringa Qosina/ 11607 A Seringa 5mL Qosina/ C5004 modificada B Seringa 2,5mL Qosina/ C5003 modificada C Seringa 1mL Ace / 003-4096 D

As percentagens volúmicas de HyA ensaiadas foram de 35 e 40 % (v/v). Testaram-se as pastas com as granulometrias de Bonelike® 250-500 µm e 500-1000 µm, procedendo-se simultaneamente à comparação do comportamento de injectabilidade de Bonelike® grânulos esféricos versus Bonelike® grânulos obtidos por fragmentação. Este ensaio requereu a produção de Bonelike® grânulos esféricos de 250-500 µm de acordo com a patente [22]. Procedeu-se à sinterização de Bonelike® 250-500 µm, que se encontrava em verde no laboratório da Medmat Innovation, Lda. O ciclo de sinterização utilizado para o fabrico de Bonelike® encontra-se sumariado na Figura 6.

Figura 6 – Gráfico do ciclo de sinterização de Bonelike®.

Os ensaios de injectabilidade foram realizados num Texture Analyser TA-XT2iHR da Stable microSystems (Figura 7 A), acoplado a uma sonda para extrusão de bisnagas (Figura 7 B). A recolha e processamento dos dados foi realizada através do software Texture Expert Exceed 2.64. As condições de ensaio foram as seguintes: célula de carga de 5Kg calibrada com 2Kg, a força de compressão com uma velocidade de 1mm/s, uma extrusão de 10 mm de pasta e recolha de dados de 200 pontos por segundo. Cada condição ensaiada contou com n≥3.



Figura 7 – A) Texture Analyser TA-XT2iHR da Stable microSystems (Texturómetro); B) Sonda para extrusão de bisnagas.

2.2. Interacções com o sangue A avaliação de interacções com o sangue foi realizada segundo a norma NP EN ISO 10993-4: 2002 [59]. Os ensaios hemocompatibilidade realizados compreenderam ensaios de hemólise e de coagulação.

2.2.1. Ensaios de hemólise Os ensaios foram realizados em conformidade com a norma ASTM F 756-00 [60]. Contudo, foram necessárias algumas adaptações no protocolo para testar a pasta Bonelike®/HyA. Os ensaios contaram com 4 amostras independentes de sangue de forma a minimizar efeitos inerentes à variabilidade genética entre indivíduos que influencia o grau de hemólise. Para cada amostra de sangue foram realizados duplicados. Assim sendo, foram pesadas 150 mg de cada amostra. O controlo negativo utilizado foi o polietileno com a mesma configuração da amostra teste. A amostra testada foi a pasta de 35% HyA com os grânulos esféricos de Bonelike® 250-500 µm. Os ensaios de hemólise foram realizados por contacto directo com a amostra teste. Adicionalmente, realizaram-se extractos em tampão fosfato (PBS) sem cálcio e potássio da pasta de 35% (v/v) HyA e Bonelike® para determinação de hemólise indirecta. Os protocolos utilizados na realização dos ensaios de hemólise compreenderam determinação de hemólise clássica, determinação de hemólise pelo método da cianometahemoglobina e observação da morfologia dos eritrócitos em microscópio óptico de campo claro.



As amostras de sangue foram colhidas em tubo de citrato, procedendo-se à quantificação da hemoglobina através do método da cianometahemoglobina (Hemograma em Coulter). Procedeu-se à preparação de amostras dos sangues diluídas em PBS sem cálcio e potássio pH 7,4 de forma a obter a amostras com concentração de hemoglobina de 1g/dL. No caso do ensaio de contacto directo, às amostras de 150 mg foram adicionados 700 µL de PBS sem cálcio e sem potássio pH 7,4 e 100 µL da amostra sangue diluído, seguido de incubação em banho-maria a 37ºC durante 3h com agitação suave. Os ensaios de hemólise indirecta requereram a preparação de extractos da pasta de 35% (v/v) HyA/Bonelike® em PBS sem cálcio e sem potássio pH 7,4. A 150 mg da pasta foram adicionados 1000 µL do tampão fosfato seguido de um período de 2h de incubação banho-maria a 37ºC com agitação suave. Estas amostras foram seguidamente centrifugadas 800 G durante 5 minutos, recuperando-se o sobrenadante. Deste, pipetaram-se 700 µL para um tubo e adicionaram-se 100 µL da amostra de sangue diluído, procedendo-se à incubação de 3h em banho-maria a 37ºC. Após o período de incubação, os tubos foram vortexados, uma aliquota de 50 µL colhida e preparada numa lâmina para observação em microscópio óptico de campo claro. Para determinação de hemólise clássica, 150 µL de cada tubo de incubação foram adicionados a 950 µL de água (hemólise total) num eppendorf e a 950 µL de soro fisiológico (hemólise parcial) noutro eppendorf seguido de centrifugação a 4000 rpm durante 6 minutos. Numa placa de 96 poços foram colocados 400 µL de cada eppendorf determinando-se a absorvância a 540 nm num leitor de placas. A hemólise foi calculada de acordo com a equação 1: ��ó�� ó��

�� ó�� 100 (eq. 1) O grau de hemólise foi posteriormente corrigido para a hemólise registada para o controlo negativo. Para a determinação da hemólise pelo método da cianometahemoglobina, os tubos foram centrifugados a 2000 rpm durante 5 min. Do sobrenadante foram pipetados 100 µL para um eppendorf e determinou-se a hemoglobinemia através de Coulter.

2.2.2. Ensaios de coagulação Os ensaios de coagulação baseiam-se no uso de sangue nativo (fresco e não anti-coagulado), sangue anti-coagulado (normalmente com citrato), plasma rico em



plaquetas (PRP) e plasma pobre em plaquetas (PPP). Dado que a maioria dos ensaios padrão de coagulação são desenhados de forma a detectar casos clínicos de doenças de coagulação que resultam num défice de coagulação e hemorragia excessiva, os ensaios para determinação de interacções sangue/dispositivo médico foram devidamente modificados para detecção de coagulação acelerada induzida pelos materiais. Alterações na quantidade de D-Dímeros (DD), determinada pelo método imunológico com partículas de látex por turbidimetria, e na quantidade de Fibrinogénio (F), determinada através do método de Clauss por determinação colorimétrica, permitiram reportar o comportamento da pasta a nível de activação da cascata de coagulação. Foram testadas pastas de HyA e Bonelike® 500-1000 µm (35, 40 e 45 % (v/v) de HyA) e HyA e Bonelike® isoladamente como controlos. Para os ensaios foram pesadas entre 100 e 160 mg de cada amostra às quais se adicionaram 1000 µL de plasma (pool de várias amostras). Seguiu-se incubação a 37ºC durante 1, 2, e 4h. Após cada tempo de incubação, foi retirado o plasma sobrenadante, ao qual foram realizados os testes de DD e F, para determinação da hipercoaguabilidade do material.



CAPÍTULO III – RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO A medicina regenerativa do tecido ósseo, aposta actualmente em abordagens cirúrgicas minimamente invasivas. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese teve por objectivo avaliar a associação do Bonelike®, um substituto ósseo sintético aplicado com sucesso comprovado em cirurgia ortopédica e maxilofacial [24, 27, 61, 62, 63], com CS hemihidratado e HyA, de forma a obter uma pasta e uma pasta injectável. Estas associações originam sistemas de aplicação em contexto cirúrgico minimamente invasivo garantindo fácil manuseamento e estabilização dos grânulos esféricos de Bonelike® no local do defeito ósseo na presença de fluidos fisiológicos. As novas concepções requereram preparação de matéria-prima, ensaios preliminares de prova de conceito, determinação das formulações ideais, caracterização físico-química e determinação de interacções com o sangue. No caso mais específico da pasta de Bonelike® e CShh, foi necessário optimizar as condições para o tratamento térmico de CSdh a 150ºC de forma a obter CShh. Através da caracterização por espectroscopia de micro-Raman, análise de Karl-Fisher e determinação de tempo de presa, foi possível concluir que o CShh obtido se encontrava dentro das especificações pretendidas. Adicionalmente, as percentagens volúmicas de cada componente determinadas para esta pasta, resultaram num material com óptimo manuseamento, que garante uma distribuição homogénea do substituo ósseo e sua estabilização no defeito ósseo que culmina numa excelente resposta biológica e rápida regeneração óssea. No caso da associação de Bonelike® com HyA, a prova de conceito da sinergia entre este polímero, utilizado em viscossuplementação, e um substituto ósseo permitiu a obtenção de num sistema injectável com propriedades inovadoras, características excelentes de injectabilidade e melhor comportamento biológico. A caracterização física e de comportamento na presença de sangue da percentagem volúmica ideal de cada componente da pasta injectável fundamentaram as conclusões obtidas. 1. DESENVOLVIMENTO DE UMA PASTA DE BONELIKE® E DE SULFATO DE CÁLCIO HEMIHIDRATADO

A aplicação de CS em medicina regenerativa do tecido ósseo conta com uma longa história, sendo reconhecido por todo o mundo como um material com boa tolerância para aplicações em regeneração óssea. O CS é uma substância inorgânica e osteocondutora que tem sido utilizado desde 1892 para preencher defeitos ósseos funcionando como enxerto ósseo [64]. Em 1892, Dreesman recorre a CS na clínica e



tendo observado uma completa cicatrização em 67% (6 de 9) das lesões cavitárias tratadas com CS [64]. Em 1980, Coetzee reportou 110 pacientes tratados com CS, em defeitos ósseos no crânio e ossos faciais [64]. As suas conclusões apontavam o CS como um enxerto ósseo excepcional assegurando a formação de novo osso e produzindo resultados equiparáveis aos obtidos com enxerto autólogo [64]. Recentemente, têm-se assistido a progressos na extracção de CS dihidratado permitindo a introdução de um produto de grau cirúrgico e concomitantemente recuperar a utilização de sulfato de cálcio como substituto ósseo. O novo processo de extracção garante presença mínima de oligoelementos, uma estrutura cristalina extremamente uniforme e com uma taxa de reabsorção in vivo previsível [64]. Adicionalmente, encontra-se definido que um tratamento térmico acima de 250ºC resulta numa perda de massa de 19,0% a 23,0% para o CS dihidratado, enquanto no caso de CS anidro a perda de massa é inferior a 1,5 % [48].

1.1. Produção de sulfato de cálcio hemihidratado Os ensaios preliminares de determinação da água de cristalização de CSdh e de CShh comercial, recorrendo a uma balança de humidade, com temperatura de secagem de 200ºC até variação de massa de 0,05%/minuto, foram concordantes com a literatura [48] (Tabela 7). Valores de água de cristalização obtidos foram de CSdh de 20,52% ± 0,05% e de CShh comercial de 5,05%± 0,42%. Tabela 7 – Água de cristalização de CSdh e CShh comercial. Ensaios realizados em balança de humidade Moisture Analyzer.

CSdh CShh comercial Ensaio Água de Cristalização (%) Água de Cristalização (%) 1 20,48 5,21 2 20,50 5,80 3 20,58 6,21

Média 20,52 5,74 Desvio padrão 0,05 0,42

Um ensaio preliminar, a baixa escala, de tratamento térmico de CSdh indicou como tempo mínimo de tratamento térmico a 150ºC as 3 horas (dados não mostrados). Seguidamente, procedeu-se a um ensaio que contemplava períodos de tratamento



térmico de 3 a 10 horas. Os valores obtidos para as águas de cristalização das amostras encontram-se sumariados na Tabela 8. Tabela 8 - Água de cristalização das amostras de CSdh submetidas a um tratamento térmico de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10h, respectivamente, a 150ºC.

Tempo (h) Água de Cristalização (%) 3 4,80 4 5,04 5 4,51 6 4,55 7 4,60 8 4,16 9 4,35 10 3,89

Os valores obtidos de água de cristalização para as diferentes amostras encontram-se dentro dos valores mencionados acima. Desta forma concluiu-se que o tratamento térmico a 150ºC por um mínimo de 3 h era suficiente para produzir CShh. Seguidamente, procedeu-se à desidratação de uma quantidade superior (cerca de 50g), para a realização da caracterização físico-química. Neste ensaio os períodos de tratamento térmico do CSdh foram restringidos a 3, 4, 5 e 6h de acordo com os resultados prévios. O motivo da caracterização físico-química do CShh obtido por tratamento térmico a 150ºC durante períodos de tempo crescentes prendeu-se com questões de estabilidade a temperatura e humidade normais do material obtido. Os valores obtidos para água de cristalização encontram-se na Tabela 9. Tabela 9 - Água de cristalização das amostras de CSdh submetidas a um tratamento térmico de 3, 4, 5 e 6, respectivamente a 150ºC.

1.1.1. Caracterização química do sulfato de cálcio. A caracterização química do CShh obtido, foi realizada por espectroscopia micro-Raman e análise de Karl-Fisher.

Tempo (h) Água de Cristalização (%) 3 3,22 4 2,75 5 2,29 6 3,02



1.1.1.1. Espectroscopia de micro-Raman O espectro de micro-Raman reportado da literatura [50] para as diferentes formas de CS serviu de base para esta caracterização. O espectro de micro-Raman do CSdh encontra-se amplamente estudado, sendo que as zonas onde se esperariam encontrar diferenças encontram-se a 1008 cm-1, correspondente ao pico mais forte referente ao modo não degenerado de extensão simétrica ��; a 415 e 439 cm-1 correspondentes ao modo duplamente degenerado de torção �� dos sulfatos; a 1135 cm-1 para o modo triplamente degenerado de extensão assimétrica ��; e a 620 e 670 cm-1 para o modo triplamente degenerado de flexão assimétrica ��. Para os modos vibracionais da água, as diferenças encontram-se em picos por volta dos 3500 cm-1 provocados por modos extensão da água � e �, sendo o espectro caraterizado pela ausência de modos de torção � [50]. O espectro de micro-Raman obtido para a amostra controlo de CSdh (Figura 8) permitiu a delimitação das zonas de interesse para aquisição dos espectros das amostras a caracterizar. Para cada amostra foram adquiridos dois espectros.

Figura 8 – Espectro completo do CSdh (controlo) com respectivas zonas de interesse identificadas; Z1:300 – 1300 cm-1, Z2: 3200 – 3700 cm-1. De seguida realizou-se a análise de CShh comercial.



Figura 9 – Espectro de CSdh (controlo). A: Detalhes da Z1; B: Detalhes da Z2.

Na Figura 9 é possível observar os espectros obtidos e verificar o desvio de Raman, característicos do CShh, na zona 2 concordante com o descrito na literatura [50]. De igual modo, as amostras de CSdh submetidas a tratamento térmico a 150ºC por diferentes períodos de tempo foram analisadas, e os respectivos espectros de micro-Raman eram concordantes com o espectro obtido para CShh comercial (Figura 10 A e 10 B).

Figura 10 - Espectro de micro-Raman de CSdh_3h. A: Detalhes da Z1; B: Detalhes da Z2. Espectro representativo do obtido para as restantes amostras. A reprodutibilidade da análise foi verificada por observação das zonas 1 e 2 dos espectros replicados das amostras controlo e das amostras submetidas a tratamento térmico a 150ºC. A análise de micro-Raman (Figura 11) confirmou a presença de material hemihidratado nas amostras submetidas a tratamento térmico (CSdh_3h, CSdh_4h, CSdh_5h e CSdh_6h). Adicionalmente, por comparação do espectro do



controlo CSdh foi possível identificar o efeito de Raman na zona das moléculas de água.

Figura 11 – Espectros de micro-Raman de todas as amostras analisadas. A: Detalhes da Z1; B: Detalhes da Z2. De notar que, ao comparar a Figura 11 com o espectro de micro-Raman presente na literatura [50] verificou-se que os picos das zonas vibracionais, apesar de não serem 100% transponíveis devido a variações que ocorrem na intensidade do feixe laser ao longo do ensaio, são concordantes com os definidos pela bibliografia como os referentes a CSdh e a CShh. Desta forma concluiu-se que o tratamento térmico a 150ºC de CSdh permite obter CShh, sendo que o menor período de tempo ensaiado (3h) era suficiente para promover a perda de uma molécula e meia de água do CSdh. Adicionalmente, os resultados obtidos apontavam para uma equivalência química dos produtos obtidos através do tratamento térmico a 150ºC, independentemente do período de secagem.

1.1.1.2. Determinação da água de cristalização pelo método de Karl-Fisher

O método de Karl-Fisher foi também utilizado para validar os resultados previamente obtidos (água de cristalização determinada através de análise gravimétrica em balança de humidade e espectros de micro-Raman). A titulação de Karl-Fisher é um método utilizado em todo o mundo para determinar o conteúdo de água de uma grande variedade de substâncias numa variedade de concentrações. A sua importância é realçada pela sua inclusão em farmacopeias e outras exigências oficiais, como ASTM. O método é rápido, seguro e confiável, independente do estado de agregação, tipo de amostra e presença de componentes voláteis [65]. Dado que as



amostras tratadas termicamente a 150ºC durante 3, 4, 5 e 6h foram consideradas equivalentes, somente as amostras de CShh comercial e CSdh_4h foram analisadas. Os resultados obtidos para a água de cristalização encontram-se descritos na Tabela 10.

Tabela 10 – Água de cristalização das amostras de CSdh_4h e CShh comercial.

Amostras Água de cristalização (%) Média Desvio Padrão 1º Ensaio 2º Ensaio 3º Ensaio CSdh_4h 4,957 5,297 4,910 5,055 0,210

CShh Comercial 6,786 6,972 7,150 6,969 0,180 Os valores obtidos de água de cristalização por este método (Tabela 10) não foram idênticos aos obtidos pela análise gravimétrica com balança de humidade (Tabelas 8 e 9). Este resultado é facilmente explicado com as diferenças de sensibilidade entre os métodos. A análise gravimétrica baseia-se na variação de massa do material quando este é sujeito a uma mudança de temperatura. Tendo em conta que o CS dihidratado é constituído por camadas de átomos de cálcio e grupos sulfato, separadas por uma camada de moléculas de água. Estas moléculas de água ocupam posições importantes na rede, sendo virtualmente impossível removê-las sem destruir essa rede. A desidratação do CSdh em CShh leva a um decréscimo de massa de 15,7% e o aquecimento posterior em anidro a uma perda total de água de cristalização de 20,9%. Estes valores sofrem variações quando as espécies de CSdh contêm impurezas ou CShh por reagir. [66] Uma vez que a temperatura atingida pela balança de humidade era de 200ºC e o recomendado na norma [48] era de 250º, esta diferença de temperatura pode ter influenciado a perda da molécula e meia de água por todas as partículas de CSdh, ou seja, algumas partículas de CSdh não perderam a totalidade da molécula e meia de água. A titulação por Karl-Fisher é basicamente específica para a água, este é um método fiável e expedito para a determinação da água de cristalização de uma forma extremamente sensível em vários compostos, uma vez que é um método químico e não térmico. Apesar da diferença registada nos valores de água de cristalização estes são concordantes com o reportado na literatura [48]. Desta forma concluiu-se que a análise Karl-Fisher corrobora os resultados obtidos em ensaios realizados anteriormente, pelo que podemos inferir que o CS produzido por tratamentos a 150ºC se encontra na forma hemihidratada.



É de salientar que, segundo a literatura consultada [66], é praticamente impossível produzir um sulfato de cálcio hemihidratado puro apenas pelo seu tratamento térmico. É necessário um importante tratamento posterior denominado “envelhecimento”; o produto é amadurecido pela exposição ao ar ambiente, tempo durante o qual a forma anidra é convertida em hemihidratada pela absorção de humidade da atmosfera.

1.1.2. Caracterização física do sulfato de cálcio A caracterização física do sulfato de cálcio foi realizada pela determinação do tempo de presa, que neste estudo teve duas etapas (a primeira compreendeu um estudo preliminar e a segunda um estudo realizado com o aparelho de Vicat), e pela análise da microestrutura em SEM.

1.1.2.1. Ensaios de presa 1.1.2.1.1. Estudo preliminar para a determinação da proporção massa

de sólido/volume de líquido Estudos preliminares de presa foram realizados de forma a validar a proporção 0,6 g de CS/mL soro fisiológico. Para estes ensaios o tempo de presa foi previamente definido como o tempo, iniciado imediatamente após mistura de CS com o soro fisiológico, necessário à solidificação da mistura. O momento de solidificação era avaliado via determinação da consistência da mistura reportada pela resistência demonstrada a rápida agitação, inversão e perfuração através de toque com a ponta de uma pipeta. Os resultados dos ensaios preliminares do tempo de presa estão descritos na Tabela 11 e Figura 12.

Tabela 11 – Tempos de presa para ensaios de validação da proporção 0,6 g/mL. Amostra Tempo de presa (s) CShh comercial 360 CSdh_3h 360 CSdh_4h 360 CSdh_5h 360 CSdh_6h 360

Durante todo o ensaio, todas as amostras se comportaram de forma bastante concordante à medida que iam ganhando presa. Inicialmente, tornavam-se pastosas



por volta dos 300 segundos de ensaio e aos 360 segundos estavam completamente sólidas. Estes resultados preliminares indicavam como apropriada a proporção CShh/soro fisiológico de 0,6g/mL.

Figura 12 – Imagem dos ensaios prelininares de presa A) CShh comercial, B) CSdh_3h, C) CSdh_4h, D) CSdh_5h e E) CSdh_6h.

1.1.2.1.2. Ensaios de presa com aparelho de Vicat Depois da realização do ensaio tempo de presa preliminar e consequente validação da proproção 0,6 g de CShh por mL de soro fisiológico, realizaram-se ensaios de presa recorrendo ao aparelho de Vicat (Tabela 12), como consta da norma referida no Capítulo II. No caso do aparelho de Vicat, o tempo de presa é definido pela observação da penetração de uma agulha numa pasta de cimento de consistência normal até ao momento em que atinge um determinado valor. Como neste caso não se tratava de um cimento de aplicação na construção civil houve a necessidade de adaptar o ensaio. As adaptações passaram pelo inicio da cronometragem ser definido no preciso momento em que se misturava o CS com o soro fisiológico, sendo esta mistura posteriormente colocada no anel cónico ainda numa forma “líquida” e a adaptação do anel cónico de forma a comportar menor volume de material.

Tabela 12 – Tempos de presa obtidos por ensaio com Aparelho de Vicat

Amostras Tempos dos ensaios (s) Média Desvio Padrão 1º 2º 3º

CShh comercial 555 555 480 530 43

CSdh_3h 540 480 480 500 35 CSdh_4h 540 510 435 495 54 CSdh_5h 465 500 480 482 18 CSdh_6h 600 495 510 535 57



Neste ensaio também se observou um comportamento similar entre as amostras testadas. Todas as amostras apresentavam uma consitencia pastosa entre os 360-480 segundos e ficavam completamente sólidas entre os 450 e os 600 segundos (Figura 13) .

Figura 13 – Imagem representativa de uma amostra após desmolde.

Os tempos de presa obtidos foram de aproximadamente 8 minutos. Este tempo de presa é bastante satisfatório, pois permitirá ao cirurgião preparar, manusear e reaplicar a pasta de Bonelike® e CShh.

1.1.2.2. Caracterização por microscopia electronica de varrimento (SEM) As diferenças a nível estrutural entre as forma di e hemihidratadas do CS encontram-se vastamente descritas na literatura [30, 50, 67]. Procedeu-se à caracterização por SEM da matéria-prima CSdh e do material produzido por tratamento térmico a 150ºC visando validação adicional do material obtido. O CSdh apresenta uma microestrutura de cristais aglomerados (Figura 14 A), enquanto que o CShh apresenta cristais devidamente individualizados (Figura 14 B). As diferenças encontradas são explicadas pela presença de maior quantidade de água de cristalização (2 moleculas vs. 0,5 moleculas), que se traduz em dois tipos distintos de água cristalográfica, uma molécula de água se liga aos iões sulfato e a outra molécula aos iões cálcio, ambas por pontes de hidrogénio [50]. Como o tratamento térmico realizado permitiu desidratar o CSdh, retirando-lhe molécula e meia de água (comprovado quer por micro-Raman quer pelo método de Karl-Fisher), esta forma hemihidratada fez com que os cristais de CS ficassem mais individualizados. Adicionalmente, e como anteriormente mencionado, as formas � e β do CS hemihidratado, apesar de serem quimicamente idênticas apresentam diferenças quanto às características físicas, nomeadamente a nível microestrutural [30]. Estas diferenças advêm dos seus métodos de produção. A forma β é produzida por tratamento térmico dando origem a cristais de forma irregular e mais porosos, sem facetas cristalográficas discerníveis. A forma � é produzida por autoclavagem sob



pressão na presença de vapor [68], que se traduz na uniformidade de forma das partículas obtidas, caracterizadas por maior densidade, e na formação de cristais únicos com características idiomorfas [69].

Figura 14 – Microestruturas de CSdh (A) e CSdh_4h (B)

Em suma, a caracterização físico-química do CSdh e do CShh produzido permite concluir que o objectivo de produção de um CShh a partir de CSdh de grau farmacêutico submetido a tratamento térmico a 150ºC foi alcançado.

1.2. Pasta de Bonelike® e sulfato de cálcio Finalmente, foi realizado um estudo de validação da proporção volúmica de Bonelike® 250-500 µm e Bonelike® 500-1000 µm com CShh e soro fisiológico. As proporções indicadas na literatura [55, 56, 57] para mistura com outros fosfatos de cálcio eram de 1:2 (50 % (v/v)) e 1:4 (75% (v/v)). As percentagens volúmicas ensaiadas foram de 50 e 75 % (v/v) de Bonelike® e de 50 e 25 % (v/v) de CShh hidratado com soro na razão 0,6g/mL, respectivamente. Recorreu-se ao CShh comercial como controlo. Este ensaio indicou que quer para o CShh comercial quer para o CSdh_4h, 75 % (v/v) não era adequado para as granulometrias de Bonelike® ensaiadas. Nestes casos a mistura de CS e soro fisiológico não embebia e envolvia todas as partículas esféricas de Bonelike® não proporcionando uma boa coesão, tornando a mistura final agregada frágil (Figura 15).



Figura 15 – Imagens da proporção 75 % de a) CSdh_4h + Bonelike® 250-500 µm; b) CSdh_4h + Bonelike® 500-1000 µm; c) CShh comercial + Bonelike® 250-500 µm; d) CShh comercial + Bonelike® 500-1000 µm A proporção volúmica de 50 % (v/v) resultou numa boa coesão entre os grânulos esféricos do substituto ósseo e a mistura CS e soro fisiológico. Quer a pasta de Bonelike® 250-500 µm, quer a de Bonelike® 500-1000 µm obtidas, por associação ao CS produzido ou ao comercial, apresentavam uma coesão satisfatória garantindo uma estabilização e distribuição homogénea do substituto ósseo (Figura 16). Adicionalmente, verificou-se que os tempos de presa do CS nesta pasta eram bastante similares (360 s. para CSdh_4h e 420 s. para CShh comercial) e eram concordantes com os resultados de presa obtidos com pasta de 100 % de CS (Tabela 11).

Figura 16 – Imagem das misturas na percentagem volúmica de 50% (v/v) de: a) CSdh_4h + Bonelike® 250-500 µm; b) CShh comercial + Bonelike® 250-500 µm; c) CSdh_4h + Bonelike® 500-1000 µm; d) CShh comercial + Bonelike® 500-1000 µm. As pastas obtidas com a percentagem volúmica de 50 % (v/v) possuem tempo de presa satisfatório permitindo ao cirurgião a sua preparação e aplicação de forma célere e minimamente invasiva.



O objectivo inicial de aliar Bonelike® a CS hemihidratado de forma a obter uma pasta com fácil manuseio foi alcançado sendo definida a percentagem de 50 % (v/v) como ideal. Estudos do comportamento biológico desta pasta são necessários, embora estudos do comportamento biológico da associação de Bonelike® 500-1000 µm de grânulos fragmentados com sulfato de cálcio hemihidratado (NewOsteo, GM Reis) em defeitos cirurgicamente criados (padronizados) em fémures de ovelhas, estejam já a ser realizados pela Medmat Innovation Lda. à razão volúmica de 50% e demonstrem resultados promissores. De realçar, que grânulos fragmentados consistiam na apresentação inicial do Bonelike®, sendo que este é actualmente produzido por processo patenteado [21, 22] que origina grânulos esféricos com características de adaptação ao defeito superiores. Em suma, os testes de produção de CShh e consequente validação através de caracterização físico-química permitiram concluir que um tratamento térmico a 150ºC durante 3 a 4 h permite a obtenção de CShh partindo de CSdh. Adicionalmente, o CShh obtido forma uma pasta na presença de soro fisiológico na proporção de 0,6 g/mL que adquire presa entre os 360 e os 480 segundos. Esta mistura de CShh e soro fisiológico permite obter uma pasta de Bonelike® de percentagem volúmica de 50 % (v/v). A pasta obtida garante fácil manuseamento, distribuição homogénea dos grânulos de Bonelike® no defeito ósseo e estabilização do mesmo durante o processo de regeneração óssea in vivo. A junção do CShh com o soro ao Bonelike® apresenta-se como uma mais-valia, dada a longa história associada à utilização do CShh como promotor da cicatrização óssea e ao facto do Bonelike® possuir características bastante similares às do osso e excelentes resultados em aplicações clínicas de medicina osteoregenerativa. Ou seja, a pasta desenvolvida possui potencial para se tornar numa “ferramenta” bastante útil a nível cirúrgico, dada a sua capacidade de endurecer in situ, resposta inflamatória mínima ou inexistente e óbvia regeneração óssea já comprovada. 2. DESENVOLVIMENTO DE UMA PASTA INJECTÁVEL DE BONELIKE® E ÁCIDO

HIALURÓNICO

2.1. Ensaio preliminar para determinação da percentagem volúmica ideal de veículo

O desenvolvimento de uma pasta injectável para medicina osteoregenerativa constou na associação de Bonelike® com HyA. Os requisitos, a priori, do material que constituísse o veículo de aplicação do Bonelike® no sistema injectável compreendiam



propriedades como ser biodegradável e biocompatível. No seguimento desta premissa, o HyA tornou-se facilmente o veículo eleito dada a sua natureza (polímero natural), às suas propriedades e ao facto de ser um polímero presente no corpo humano. A associação de HyA ao Bonelike® seria meramente estrutural, garantindo a estabilização do Bonelike® no local do defeito ósseo prevenindo a deslocação precoce do substituto ósseo até que os mecanismos de regeneração óssea fossem accionados. Como foi referido, a associação do HyA ao Bonelike® seria meramente estrutural, existindo a necessidade de comprovar a ausência de interacções pejorativas com o substituto ósseo. Desta forma procederam-se a ensaios de prova de conceito. Realizou-se um ensaio preliminar para determinação da percentagem volúmica ideal de HyA a utilizar em pasta de Bonelike® de granulometria 500-1000 µm. O intervalo das percentagens volúmicas de HyA ensaiado foi de 5-45 % (v/v), tendo sido seleccionado com base na coesão e homogeneidade da mistura. As percentagens mais baixas de 5 e 10 % (v/v) de HyA não permitiam o envolvimento de todos os grânulos do substituto ósseo com veículo polimérico e, portanto, não originavam pastas. Desta forma, realizaram-se ensaios recorrendo a maior quantidade de HyA, passando para as percentagens volúmicas de 30, 35 e 45 % (v/v). As pastas resultantes com melhores propriedades encontram-se representadas na Figura 17.

Figura 17 – Pastas que apresentavam as melhores propriedades.

Adicionalmente, o estudo preliminar de prova de conceito incluiu um ensaio de avaliação da integridade da pasta na presença de fluidos fisiológicos. Este ensaio consistiu na avaliação da interacção das pastas de 30, 35 e 45 % (v/v) de HyA com Bonelike® 500-1000 µm na presença de sangue. O ensaio foi realizado para um volume final de 250 µL, em que as amostras de sangue foram utilizadas numa percentagem de 50 % (v/v) em relação ao material. Os grupos experimentais considerados consistiam em: pasta na presença de sangue não anti-coagulado (Grupo 1), pasta na presença de sangue anti-coagulado (Grupo 2) e Bonelike® (volume correspondente ao utilizado na pasta) na presença de sangue não anti-coagulado (Grupo 3). A integridade da pasta na presença de sangue era avaliada pela resistência



demonstrada aquando da sua inversão. Não se registaram diferenças no comportamento das diferentes pastas na presença de sangue não anti-coagulado e anti-coagulado (Grupo 1 vs. Grupo 2). O Grupo 3 não apresentava agregação nem resistência a inversão. A pasta de 30% (v/v) de HyA apresentava desagregação na presença de sangue (Figura 18). As pastas 35 e 45 % (v/v) de HyA garantiam a coesão dos grânulos de Bonelike® na presença de sangue (Figura 18). Desta forma, concluiu-se que o intervalo mais promissor de percentagens volúmicas de HyA, para o desenvolvimento de uma pasta injectável de Bonelike® e HyA, seria de 35-45 % (v/v).

Figura 18 – Imagem da interacção das pastas com o sangue.

2.1.1. Ensaios de injectabilidade Os ensaios de injectabilidade recorreram a um texturómetro ao qual estava acoplada uma sonda para extrusão de bisnagas. Para estes ensaios várias seringas foram seleccionadas a priori de acordo com a aplicação ou em cirurgia ortopédica (pastas com Bonelike® 500-1000 µm) ou em cirurgia maxilofacial (pastas com Bonelike® 250-500 µm (Tabela 6). As pastas testadas foram de 35 e 40 % (v/v) HyA e Bonelike®. Adicionalmente, procedeu-se à comparação do comportamento de injectabilidade de Bonelike® grânulos esféricos versus Bonelike® grânulos obtidos por fragmentação. Para a seringa A, de aplicação em cirurgia ortopédica, rapidamente se verificou a sua não adequabilidade. A pasta de 35 % (v/v) de HyA e grânulos esféricos de Bonelike® 500-1000 µm deslocava-se na seringa por acção da gravidade imediatamente após a extracção da tampa de apoio da seringa (Figura 19). Desta forma, não se efectuaram mais ensaios de injectabilidade com esta seringa.



Figura 19 – Imagem dos ensaios som a seringa A.

A Figura 20 apresenta exemplos representativos dos ensaios de injectabilidade realizados.

Figura 20 – Imagem dos ensaios com a seringa B (A); seringa C (B) e com a seringa D (C). A Figura 21 é um exemplo ilustrativo de um gráfico do obtido durante o ensaio de injectabilidade, e subsequente análise com o software Texture Expert Exceed 2.64, traduzindo o comportamento da mistura ao longo da extrusão.



Figura 21 - Exemplo de uma análise dos dados de injectabilidade com software Texture Expert Exceed 2.64. Os ensaios decorreram com uma quantidade de pasta correspondente à que seria comercializada, sendo que a distância de extrusão do ensaio foi definida como 10 mm. A análise dos dados foi elaborada no intervalo entre os 2 e os 8 mm de extrusão, uma região considerada mais representativa do ensaio uma vez que oscilações iniciais e finais neste tipo determinações são comuns. Os parâmetros de injectabilidade determinados foram: (i) Força máxima inicial necessária à extrusão da primeira porção da pasta; (ii) Força média realizada durante a extrusão entre os 2 e 8 mm; (iii) Trabalho realizado durante a extrusão entre os 2 e 8 mm. As Tabelas 13 e 14 sumarizam os resultados obtidos. Tabela 13 - Resultados dos ensaios de injectabilidade para a seringa B com pastas de 35 e 40 % (v/v) HyA com grânulos de Bonelike® 500-1000 µm, de acordo com as densidades de empacotamento do Bonelike®.

Seringa B n = 3 Grânulos esféricos 500-1000µm Grânulos fragmentados 500-1000µm

% (v/v) HyA 35 40 35 40 Força Máxima Inicial (N) 11,61�6,68 8,14�6,84 25,57�25,57 22,24�26,68

Força Média (N) 15,43�4,96 24,85�7,97 n/a n/a Trabalho (N.mm) 92,57�29,78 149,09�47,79 n/a n/a

n/a – ensaio não finalizado devido à não extrusão da pasta.



Tabela 14 - Resultados dos ensaios de injectabilidade para as seringa C e D com pastas de 35 % (v/v) HyA com grânulos de Bonelike® 250-500 µm, de acordo com as densidades de empacotamento do Bonelike®.

Seringa C Seringa D

n = 3 Grânulos esféricos 250-500µm Grânulos fragmentados 250-500µm

Grânulos esféricos 250-500µm Grânulos fragmentados 250-500µm

% (v/v) HyA 35 35

Força Máxima Inicial (N) 0,127�0,09 14,48�1,58 3,24�1,47 12,10�1,83

Força Média (N) 1,05�0,74 23,2�2,33 0,95�0,39 18,60�5,03

Trabalho (N.mm) 6,29�4,45 139,2�0,045 5,67�2,35 111,59�30,16

No caso da seringa B, de aplicação em cirurgia ortopédica, as pastas de HyA e grânulos fragmentados de Bonelike® 500-1000 µm testadas não eram extrudidas, ou seja, a força necessária para extrudir o material excedia a realizada pela célula de carga de 5 Kg. Contudo, as pastas de HyA e grânulos esféricos de Bonelike 500-1000 µm testadas foram facilmente extrudidas. Estes resultados podem ser explicados pelas menores áreas de contacto entre a superfície dos grânulos esféricos com a parede da seringa e mesmo entre si relativamente às dos grânulos fragmentados, aumentando a sua capacidade de fluidez, ou seja, serão mais fáceis de extrudir. Adicionalmente, a forma irregular dos grânulos fragmentados contribui para um maior atrito entre grânulos e superfícies, resultando numa pasta de difícil extrusão. No caso das pastas de HyA com grânulos esféricos de Bonelike® 500-1000 µm verificou-se que a pasta de 35 % (v/v) HyA possuía valores de força média e trabalho inferiores aos verificados com a pasta de 40 % (v/v) HyA (Tabela 13). Estes resultados poderiam sugerir que a pasta de 35 % (v/v) de HyA apresentava melhores parâmetros de extrusão. Contudo, como se pode verificar na Figura 22, o perfil de extrusão desta pasta era muito mais irregular do que no caso da pasta de 40 % (v/v) HyA. Curiosamente, este comportamento já se encontrava reportado nos valores de força



máxima inicial, necessária à extrusão da primeira porção da pasta, menores para a pasta de 40 % (v/v) HyA (Tabela 13).

Figura 22 - Perfil de extrusão de pastas de HyA e Bonelike® 500-1000 µm. (A) 35 % (v/v) HyA; (B) 40 % (v/v) HyA. Para as seringas C e D, de aplicação em cirurgia maxilofacial, o comportamento de injectabilidade das pastas testadas foi semelhante. Adicionalmente, a primeira pasta testada, de 35 % (v/v) de HyA, apresentava injectabilidade adequada para aplicação em cirurgia minimamente invasiva (Figura 23).

Figura 23 – Perfis de extrusão para a seringa C: a) Bonelike® 250-500 µm grânulos esféricos, b) Bonelike® 250-500 µm grânulos fragmentados; e para a seringa D: c) Bonelike® 250-500 µm grânulos esféricos, d) Bonelike® 250-500 µm grânulos fragmentados



Desta forma, a pasta de 40 % (v/v) não foi testada. Quer para a seringa C, quer para a seringa D, as pastas de HyA com grânulos fragmentados de Bonelike® 250-500 µm requeriam maior força máxima inicial necessária à extrusão da primeira porção da pasta, apresentavam maior força média e trabalho realizados durante a extrusão entre os 2 e 8 mm. Adicionalmente, um teste t-student indicou que os valores dos parâmetros de injectabilidade da pasta com grânulos esféricos de Bonelike® eram significativamente diferentes dos obtidos para a pasta de grânulos fragmentados (p<0,05). Estes resultados são concordantes com os obtidos para a pasta de HyA e Bonelike® 500-1000 µm. As diferenças na geometria global dos grânulos (esférica vs. irregular) traduzem-se em comportamentos de injectabilidade opostos. De realçar, que os valores dos parâmetros de injectabilidade obtidos não diferem significativamente entre seringas. Em conclusão, a pasta injectável de Bonelike® e HyA com melhores propriedades de injectabilidade foi a obtida com a nova apresentação do substituto ósseo, ou seja, grânulos esféricos. Para Bonelike® 250-500 µm, a percentagem volúmica de HyA ideal para a obtenção de uma pasta foi de 35 % (v/v), enquanto para Bonelike® 500-1000 µm a pasta com melhor comportamento é a de 40 % (v/v) HyA. Esta diferença de percentagem volúmica de HyA para o desenvolvimento de pastas de Bonelike® de diferentes granulometrias era esperada dadas as diferenças entre as respectivas densidades de empacotamento obtidas por porosimetria de mercúrio. Grânulos esféricos de Bonelike® da granulometria mais baixa possuem melhor empacotamento necessitando de menor quantidade de polímero para a obtenção de uma pasta com as propriedades de injectabilidade desejadas. 2.2. Interacções com o sangue

Os ensaios de hemocompatibilidade avaliam os efeitos no sangue e/ou componentes sanguíneos por contacto do sangue com dispositivos ou materiais médicos. Os testes de hemocompatibilidade in vivo são, normalmente, concebidos para estimularem a geometria, condições de contacto e dinâmica de fluidos do dispositivo ou material na sua aplicação clínica. Da norma ISO 10993-4 [59] destacam-se 5 categorias de ensaios para a avaliação da hemocompatibilidade: trombose, coagulação, plaquetas, hematologia e imunologia (sistema de complemento e leucócitos) [59, 70]. Independentemente da duração ou tempo de contacto, o teste de hemocompatibilidade é indicado para dispositivos de contacto externo: contacto indirecto com o sangue; dispositivos de contacto externo com sangue circulatório; e dispositivos contacto directo com o sangue. Para a selecção dos ensaios de



hemocompatibilidade a realizar para determinado dispositivo médico ou biomaterial, vários são os requisitos a ter em conta, como por exemplo o tempo de contacto com o sangue durante a sua aplicação. Embora os testes in vivo em animais possam ser uma mais-valia, é necessário ter em conta as diferentes reactividades do sangue entre diferentes espécies podendo estas diferenças limitar a previsibilidade de qualquer teste numa situação clínica em humanos. A utilização de sangue humano na avaliação da hemocompatibilidade implica testes in vitro, que, normalmente, requerem a utilização de anti-coagulantes, os quais usualmente não estão em contacto com o dispositivo em situação clínica, excepto, possivelmente, no primeiro período da implantação [70]. Assim sendo, devido à natureza do dispositivo médico em causa (um injectável de Bonelike® e HyA), destinado a ser implantado num defeito ósseo, apresentando um contacto temporário com o sangue, foram elaborados testes de hemocompatibilidade. Tendo como base a norma supracitada [59], dos testes recomendados, o de hemólise permitia ter uma ideia imediata do comportamento biológico do dispositivo. Os eritrócitos, hemácias ou glóbulos vermelhos são células únicas que executam funções vitais no organismo. O objectivo primário desta célula é o transporte de hemoglobina (Hb), visto que esta proteína está associada a outras funções como o transporte de oxigénio (O2) e transporte de dióxido de carbono (CO2) [71]. Para realizar estas funções, um eritrócito tem de manter a flexibilidade da membrana, um processo que requer energia sob a forma de ATP (adenina trifosfato). Os eritrócitos empobrecidos em ATP tornam-se equinócitos, vazam catiões, acumulam cálcio sendo, eventualmente, destruídos na microcirculação. Por outro lado, se os eritrócitos estão repletos de ATP, a perda de deformabilidade é reversível desde que a acumulação de cálcio seja mínima (a deformabilidade torna-se irreversível a concentrações de cálcio perto de1 mM) [72]. A hémolise compreende vários processos que resultam na destruição dos eritrócitos e libertação de hemoglobina no sangue circulante (hemólise intravascular) ou num tecido (hemólise extravascular) [60]. Adicionalmente, os testes de coagulação apresentavam elevada relevância dada a libertação de cálcio pelo Bonelike® em associação às propriedades de activação da coagulação do HyA. Dependendo dos níveis verificados, quer o cálcio quer o HyA, factores de activação da coagulação através das suas acções sobre a fibrina, podem promover a formação de um coágulo sanguíneo (Figura 24).



Figura 24 – Activação da cascata de coagulação [73]. A hemostasia requer um equilíbrio interessante entre a coagulação e a fibrinólise. Durante a formação de um trombo o fibrinogénio é responsável pela formação de coágulos sanguíneos. O fibrinogénio é uma glicoproteína sintetizada nos hepatócitos e nos megacariócitos (células da medula óssea responsáveis pela produção de plaquetas sanguíneas), solúvel em água e que existe numa forma precursora da fibrina (insolúvel) que por ligação à trombina é convertida pela mesma em fibrina (Figura 24) [73, 74]. Por sua vez, os polímeros de fibrina são degradados pela plasmina e passam a dar origem a produtos de degradação de diferentes pesos moleculares. O menor e melhor caracterizado destes produtos é o D-dímero. Embora baixos níveis de D-dímero possam ser detectados na circulação de indivíduos saudáveis, seus níveis aumentam significativamente nos pacientes com trombose venosa profunda (TVP), embolia pulmonar (EP), coagulação intravascular disseminada, enfarto do miocárdio, cancro, sepsis, entre outros. O D-dímero é reconhecido actualmente como o mais específico indicador de activação da coagulação e de fibrinólise. Os ensaios para a detecção do D-dímero são utilizados em muitos laboratórios na investigação de distúrbios hemostáticos associados com a activação do sistema fibrinolítico, incluindo os eventos tromboembólicos. A sua principal aplicação clínica diz respeito à possibilidade de exclusão diagnóstica de distúrbios tromboembólicos quando os seus níveis estão normais [75].

2.2.1. Ensaios de hemólise O ensaio de hemólise é vital para o rastreio das interacções sangue/dispositivo médico, pois um elevado nível de hemoglobina plasmática indica hemólise e reflecte a fragilidade da membrana dos eritrócitos em contacto com materiais ou dispositivos médicos [59]. A Tabela 15 reporta os resultados obtidos pelo ensaio de hemólise



clássica de contacto directo e indirecto com pasta de 35 % (v/v) HyA e Bonelike® 250-500 µm.

Tabela 15 – Resultados obtidos para o ensaio de hemólise clássica.

Amostra de Sangue Pasta 35 % (v/v) HyA e Bonelike® 250-500 µm

Contacto Directo Contacto Indirecto 1 4,55 -2,38 2 2,20 -2,14 3 6,40 -1,69 4 2,07 -2,58

Média 3,81 -2,20 Desvio Padrão 2,07 0,38

O grau hemolítico é uma escala arbitrária, que ainda não foi validada e tem por base resultados anteriores com procedimentos experimentais ligeiramente diferentes. Para o seu cálculo a média do índice hemolítico do controlo negativo é subtraída ao índice hemolítico das amostras, sendo que o resultante é subdividido nas categorias descritas na Tabela 16.

Tabela 16 – Categorização do índice hemolítico. Índice hemolítico acima do controlo negativo Grau hemolítico

0-2 Não hemolítico 2-5 Ligeiramente hemolítico >5 Hemolítico

Os resultados obtidos para hemólise clássica da pasta de 35 % (v/v) HyA e Bonelike® 250-500 µm de um grau de hemólise de contacto directo de 3,81±2,07 (%) e grau de hemólise indirecta de -2,20 ± 0,38 (%) não são conclusivos. De realçar, que os ensaios de hemólise segundo o método da cianometahemoglobina não originaram resultados, pois a hemólise observada se encontrava abaixo do limite de detecção do Coulter. Estas observações sugerem que ambos os métodos carecem de optimização. Contudo, convém realçar que a realização destes ensaios partiu de um compromisso entre a norma e os procedimentos padrão realizados na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto – Departamento de Bioquímica. Estes ensaios carecem de



optimização dos procedimentos adoptados nomeadamente no que diz respeito ao tempo e método de incubação. O processo de incubação da amostra a ser testada num ensaio de hemólise é o passo vital e deve ser o mais aproximado ao tipo de contacto previsto para o material a testar. A pasta desenvolvida destina-se a implantação num defeito ósseo onde as paredes do defeito são submetidas a reavivamento de sangramento para que seja possível a colonização do material com células osteoprecursoras. Contudo, este contacto com o sangue é temporário pois o organismo possui mecanismos de hemostasia que garantem o controlo de hemorragias. Desta forma, uma incubação de 3h com agitação constante e ligeira não se apresenta adequada, sendo que estes ensaios necessitam de ser repetidos com um tempo de incubação mais curto e agitação ligeira ocasional. De facto, por observação em microscópio óptico de campo claro (Figura 25 A e B) é possível observar a formação de células equinócitas no ensaio de contacto directo e mesmo no caso do controlo negativo. Curiosamente, no caso do ensaio de contacto indirecto a formação destas células verifica-se em menor proporção (Figura 25 C). Tal sugere que os resultados de hemólise estão a ser francamente induzidos por acção mecânica, que poderá estar na origem da variabilidade entre ensaios registada, sendo que o grau de hemólise obtido estará aumentado. Portanto, torna-se importante a repetição destes ensaios em diferentes condições de incubação de forma a realizar o ensaio em condições mais próximas das fisiológicas aquando da implantação do material.

Figura 25 – Imagens ao microscópio óptico de a) Controlo negativo, b) pasta de 35 % (v/v) HyA e Bonelike® 250-500 µm em contacto directo e c) pasta de 35 % (v/v) HyA e Bonelike® 250-500 µm em contacto indirecto. (Ampliação: 1000x) Contudo, apesar de todas as limitações encontradas nas determinações de hemólise e da necessidade de optimizar o ensaio, os resultados encontram-se dentro das especificações da norma [60], revelando um óptimo potencial para aplicação em cirurgia osteoregenerativa não invasiva.



2.2.2. Ensaios de coagulação Adicionalmente, foram realizados ensaios de determinação de hipercoagulabilidade da pasta de Bonelike® e HyA. Estes ensaios foram elaborados de uma forma preliminar de forma a determinar se o HyA se ligaria à fibrina, tal como reportado na literatura [45], promovendo a formação de um coágulo sanguíneo com possíveis implicações patológicas subsequentes e indesejáveis para uma pasta injectável de aplicação em medicina osteoregenerativa. Estes ensaios consistiram numa abordagem preliminar, pois a maioria dos ensaios padrão de coagulação são desenhados de forma a detectar casos clínicos de doenças de coagulação que resultam num défice de coagulação e hemorragia excessiva. Portanto, os ensaios para determinação de interacções sangue/dispositivo médico sofreram algumas modificações para detecção de coagulação acelerada induzida pelos materiais. Esta nova metodologia carece de validação. Contudo, este trabalho não contemplou esse passo de validação e apenas reporta o ensaio preliminar elaborado com n=1. Foram testadas pastas de HyA e Bonelike® 500-1000 µm (35, 40 e 45 % (v/v) de HyA) e HyA e Bonelike® isoladamente como controlos. Procederam-se a incubações a 37ºC durante 1, 2 e 4 h, sendo que ao fim de cada período de incubação os níveis de D-Dímeros e de Fibrinogénio foram determinados. Os resultados obtidos para estes testes estão descritos nas Tabelas 17 e 18. Tabela 17 – Resultados obtidos para o teste dos D-Dímeros (ng/mL); LEGENDA – Pool: mistura de vários plasmas; BL: Bonelike® 500-1000 µm; BL + 35 % HyA: Bonelike® 500-1000 µm + 35 % (v/v) ácido hialurónico; BL + 40 % HyA: Bonelike® 500-1000 µm + 40 % (v/v) ácido hialurónico; BL + 45 % HyA: Bonelike® 500-1000 µm + 45 % (v/v) ácido hialurónico

Amostra Tempo (h) T0 T0+1 T0+2 T0+4

Pool 171 186 158 150 BL+pool - 114 93 146 HyA - 202 232 169

BL+35%HyA+pool - 109 124 203 BL+40%HyA+pool - 176 151 152 BL+45%HyA+pool - 300 165 122



Tabela 18 - Resultados obtidos para o teste do Fibrinogénio (g/L); LEGENDA – Pool: mistura de vários plasmas; BL: Bonelike® 500-1000 µm; BL + 35 % HyA: Bonelike® 500-1000 µm + 35 % (v/v) ácido hialurónico; BL + 40 % HyA: Bonelike® 500-1000 µm + 40 % (v/v) ácido hialurónico; BL + 45 % HyA: Bonelike®

500-1000 µm + 45 % (v/v) ácido hialurónico Amostra Tempo (h)

T0 T0+1 T0+2 T0+4 Pool 3,01 2,95 3,24 3,31

BL+pool - 2,71 2,98 3,01 HyA - 2,63 2,68 2,84

BL+35%HyA+pool - 2,81 3,01 3,08 BL+40%HyA+pool - 2,61 2,92 2,73 BL+45%HyA+pool - 2,84 3,08 2,98

Tendo em conta que os valores de referência para o teste dos D-Dímeros variam entre 68-494 ng/mL e os do Fibrinogénio 1,95-3,65 g/L, podemos verificar que ambos os testes para qualquer uma das amostras demonstram não haver activação da coagulação. Como mencionado anteriormente, esta metodologia carece de validação e de repetição de uma nova série de amostras. Contudo, os resultados obtidos parecem promissores e indicativos que as pastas testadas não induzem activação da coagulação mesmo após períodos superiores aos necessários para se verificar o pico activação da cascata de coagulação (T0+2 eT0+4 Tabelas 17 e 18) [76, 77]. Em suma, a associação de HyA com Bonelike® de diferentes granulometrias resulta numa pasta injectável de aplicação em cirurgia minimamente invasiva na área de ortopedia e maxilofacial. As percentagens volúmicas de HyA diferem segundo a granulometria de Bonelike® utilizada, sendo dependentes da densidade de empacotamento do substituto ósseo. Desta forma, para aplicação em cirurgia ortopédica desenvolveu-se uma pasta de composição 40 % (v/v) HyA e Bonelike® 500-1000 µm, enquanto que para cirurgia maxilofacial desenvolveu-se uma pasta de 35 % (v/v) HyA e Bonelike® 250-500 µm. Estas pastas apresentam injectabilidades adequadas às seringas seleccionadas para estas aplicações. Os ensaios de hemocompatibilidade realizados carecem de optimização e validação, porém os seus resultados surgem como promissores.



CAPÍTULO IV – CONCLUSÕES As associações de Bonelike® grânulos esféricos de 250-500 µm e de 500-1000µm quer ao CS hemihidratado para a formação de uma pasta, quer ao HyA para a formação de uma pasta injectável, demonstraram resultados promissores, que, embora necessitem de optimização e de posterior validação in vivo, podem representar uma mais-valia em cirurgia minimamente invasiva na área da regeneração óssea. Em relação à associação do Bonelike® com o CS, primeiramente, o objectivo de produção de CS hemihidratado através do seu tratamento térmico foi alcançado, tal é corroborado pela análise físico-química realizada ao produto obtido (micro-Raman, teor de água de cristalização pelo método gravimétrico e Titulação de Karl-Fisher, ensaio de presa com aparelho de Vicat). Posteriormente, a junção do CS hemihidratado com soro fisiológico ao Bonelike® na percentagem volúmica de 50 % (v/v), demonstrou resultados bastante promissores, sendo que, actualmente, está em curso um estudo sobre o comportamento biológico desta pasta, estudo esse que se tem demonstrando a adequabilidade da proporção apontada como a ideal. Quanto à associação do Bonelike® com HyA, podemos inferir que as percentagens volúmicas de associação apontadas para as granulometrias 250-500 µm (35 % (v/v) HyA) e de 500-1000µm (40 % (v/v) HyA), para uma melhor injectabilidade, demonstram potencial para a sua aplicação em cirurgia maxilofacial e ortopédica, respectivamente, sendo que os ensaios de hemocompatibilidade demonstraram que a pasta injectável desenvolvida não demonstra activar a hemólise nem a cascata de coagulação. De salientar que todo este trabalho permitiu o contacto com novas técnicas que foram fundamentais para todo o estudo de caracterização realizado, embora estudos futuros sejam necessários para uma caracterização mais optimizada dos produtos desenvolvidos.



BIBLIOGRAFIA [1] - Lewandrowski, K.U.; Gresser, J. D.; Wise, D. L.; Trantolo, D. J.;“Bioresorbable bone graft substitutes of different osteoconductivities: a histological evaluation of osteointegration of poly(propyleneglycol-co-fumaric acid)-based cement implants in rats.”; Biomaterials; 2000; 21: 757-764. [2] - bjdonline – “Bone and Joint Decade's Musculoskeletal Portal.”; citado 2007; Available from: http://www.boneandjointdecade.org/default.aspx?contId=229, em 23-07-09.

[3] – Dorozhkin, Sergey V.; “Calcium orthophosphate-based biocomposites and hybrid biomaterials”; Journal of Materials Science; 2009; 44: 2343–2387 [4] – Sanz-Herrera, J.A.; García-Aznar, J.M.; Doblare, M.; “On scaffold designing for bone regeneration: A computational multiscale approach”; Acta Biomaterialia; 2009; 5: 219–229 [5] – Ralston, Stuart H.; “Structure and metabolism of bone”; The Medicine Publishing Company Ltd; 2005 [6] – Yang, Yi Jun; Damron, Timothy A.; “Histology of bone”; 2005, Available from: http://emedicine.medscape.com/article/1254517-overview, em 23-07-09 [7] – Hench, Larry L.; Wilson, June; “An Introduction to Bioceramics”; Advanced Series in Ceramics – Vol.1; World Scientific [8] – Klawitter, J. J.; Hulbert, S. F.; “Application of porous ceramics for the attachment of load bearing internal orthopedic applications”; Journal of Biomedical Materials Research; 2004M; Volume 5 Issue 6: 161-167 [9] – “Medical grade calcium sulfate – Bone Grafts and bone grafts substitutes”, Technical monograph; Wright Medical Technology, Inc.; 1996; Rev.8 [10] – Gutierres, M.; Lopes, M.A.; Hussain, N.S.; Cabral, A.T.; Almeida, L.; Santos, J.D.; “Substitutos Ósseos – Conceitos Gerais e Estado Actual”; Arquivos de Medicina; 2006; 19:153 – 162. [11] – Moore, William R.; Graves, Stephen E.; Bain, Gregory I.; “Synthetic Bone Graft Substitutes”; ANZ Journal of Surgery; 2001; Volume 71; Issue 6: 354-361 [12] – Zabeu, J.L.A.; Mercadante, M.T.; “Substitutos ósseos comparados ao enxerto ósseo autólogo em cirurgia ortopédica – Revisão sistemática da literatura”; Revista Brasileira de Ortopedia; 2008; 43 (3): 59-68



[13] – Oréfice, R.L.; Pereira, M. de Magalhães; Mansur, H.S.; “Biomateriais – Fundamentos e aplicações”, Cultura Médica; Rio de Janeiro; 2006 [14] – Haghighati, F.; Saaveh, G.; “Essentials in Periodontal Regeneration”; Journal of Dentistry; Tehran University of Medical Sciences; 2007; Vol: 4, No. 2 [15] – Wang, Hom-Lay; Tsao, Yi-Pin; “Mineralized Bone Allograft-Plug Socket Augmentation: Ratonale and Technique”; Implant Dentistry; 2007; Volume 16, No. 1 [16] – Vangsness Jr.,C. Thomas; Garcia, Ivan A.; Mills, C. Randal; Kainer, Marion A.; Roberts, Michael R.; Moore, Tillman M.; “Allograft Transplantation in the Knee: Tissue Regulation, Procurement, Processing, and Sterilization”; The American Journal of Sports Medicine; 2003; Vol. 31, No. 3 [17] – Temeno, Johnna S.; Mikos, Antonios G.; “Injectable biodegradable materials for orthopedic tissue engineering”; Biomaterials; 2000; 21; 2405-2412 [18] – Jackson, Mark J.; Ahmed, Waqar; “Surface Engineered Surgical Tools and Medical Devices”; Springer; 2007; “Bonelike® graft for regenerative bone applications”; 477-509 [19] - Informação cedida pela empresa. [20] – Lobato, J.V.; Hussain, N.S.; Botelho, C.M.; Maurício, A.C.; Afonso, A.; Ali, N.; Santos, J.D.; “Assessment of Bonelike® graft with a resorbable matrix using an animal model”; Thin Solid Films; 2006; 515; 362 – 367 [21] - Santos J.D.; Hastings, G.W.; Knowles, J.C.; “Sintered hydroxyapatite compositions and method for the preparation thereof”; WO 0068164, 2000. [22] – Santos, J.D.; Lopes,M.A.; “Hydroxyapatite and bioglass pellets, production process and applications of thereof”, Worldwide Application (PCT), PCT/PT2008/000032; 2008 [23] – Costa, M. A.; Gutierres, M.; Almeida, L.; Lopes, M. A. Lopes; Santos, J. D.; Fernandes, M.H.; “In Vitro Mineralisation of Human Bone Marrow Cells Cultured on Bonelike®”; Key Engineering Materials; 2004; Vols. 254-256; pp. 821-824 [24] – Gutierres, M.; Hussain, N.S.; Afonso, A.; Almeida, L.; Cabral, T.; Lopes, M.A.; Santos, J.D.; “Biological Behaviour of Bonelike® Graft Implanted in the Tibia of Humans”; Key Engineering Materials; 2005; Vols. 284-286; pp. 1041-1044 [25] – Lopes, M.A. Lopes; Knowles, J.C.; Santos, J.D; Monteiro, F.J.; Olsen, I.; “Direct and indirect e!ects of P2O5 glass reinforced-hydroxyapatite composites on the growth and function of osteoblast-like cells”; Biomaterials; 2000; 21; 1165-1172



[26] – Gomes, P.S.; Santos, J.D.; Fernandes, M.H.; “Cell-induced response by tetracyclines on human bone marrow colonized hydroxyapatite and Bonelike®”; Acta Biomaterialia;2008; 4; 630–637 [27] – Gutierres, M.; Lopes, M.A.; Hussain, N.S.; Lemos, A.F.; Ferreira, J.M.F.; Afonso, A.; Cabral, A.T.; Almeida; L.; Santos, J.D.; “Bone ingrowth in macroporous Bonelike® for orthopaedic applications”, Acta Biomaterialia 2008; 4; 370–377 [28] – Wiss, Donald A.; “What’s New in Orthopaedic Trauma”; The Journal of Bone & Joint Surgery; 2001; Volume 83-A; 1762-1772 [29] – Hou, Qingpu; De Bank, Paul A.; Shakesheff, Kevin M.; “Injectable scaffolds for tissue regeneration”; Journal of Materials Chemistry; 2004; 14;1915–1923 [30] – Thomas, Mark V.; Puleo, David A.; “Calcium Sulfate - Properties and Clinical Applications”; Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials; 2009; 88B; 597–610 [31] – Cabañas, M.V.; Rodríguez-Lorenzo, L.M.; Vallet-Regí, M.; “Setting Behavior and in Vitro Bioactivity of Hydroxyapatite/Calcium Sulfate Cements”; Chemistry of Materials; 2002; 14,3550-3555 [32] – Necas, J.; Bartosikova, L.; Brauner, P.; Kolar, J.; “Hyaluronic acid (hyaluronan): a review”; Veterinarni Medicina; 2008; 53 (8); 397–411 [33] – Leach, Jennie Baier; Schmidt, Christine E.; “Hyaluronan”; Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering; 2004; 779-789 [34] – Nair, Lakshmi S.; Laurencin, Cato T.; “Biodegradable polymers as biomaterials”; Progress in Polymer Science; 2007; 32; 762-798 [35] – Rinaudo, Marguerite; “Main properties and current applications of some polysaccharides as biomaterials”; Society of Chemical Industry. Polymer International; 2007 [36] - Vandamme, E. J.; De Baets, S.; Steinbuchel, A.; “Polysaccharides from Microorganisms, Plants and Animals”; Biopolymers; 2002; Volume 5; Polysaccharides I: Polysaccharides from Prokaryotes, pp. 1-19 [37] – Mano, J.F.; Silva, G.A.; Azevedo, H.S.; Malafaya, P.B.; Sousa, R.A.; Silva, S.S.; Boesel, L.F.; Oliveira, J.M.; Santos, T.C.; Marques, A.P.; Neves, N.M.; Reis, R.L.; “Natural origin biodegradable systems in tissue engineering and regenerative



medicine - present status and some moving trends”; Journal Of The Royal Society Interface; 2007; 4, 999-1030 [38] – Kim, Jiseok; Park, Kitae; Hahn, Sei K.; “Effect of hyaluronic acid molecular weight on the morphology of quantum dot–hyaluronic acid conjugates”; International Journal of Biological Macromolecules; 2008; 42; 41-45 [39] - Saari, H.; Konttinen, Yrjo T.; Friman, Claes; Sorsa, T; “Differential Effects Of Reactive Oxygen Species On Native Synovial Fluid And Purified Human Umbilical Cord Hyaluronate”; Inflammation; 1993; Vol. 17, No. 4; 403-415 [40] - Prehm, P.; “Synthesis of hyaluronate in differentiated teratocarcinoma cells; mechanism of chain growth.”; Biochem J; 1983; 211: 191-198 [41] - Camenisch, T.D.; McDonald, J.A.; “Hyaluronan: is bigger better?”; Am J Respir Cell Mol Biol; 2000; 23: 4, 431-433 [42] - Banerji, S.; Ni, J., Wang; S. et al.; “LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.”; J Cell Biol; 1999; 144: 4, 789-801 [43] - Fraser, J.R.E.; Laurent, T.C.; Laurent, U.B.G.; “Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover.”; J Internal Med; 1997; 242: 27-33 [44] - King, S.R.; Hickerson, W.L.; Proctor, K.G., Newsome; A.M.; “Beneficial actions of exogenous hyaluronic acid on wound healing.”; Surgery; 1991; 109: 1, 76-84. [45] - Weigel, P.H., Frost, S.J., McGary, C.T., LeBoeuf, R.D. The role of hyaluronic acid in inflammation and wound healing. Int J Tissue React 1988; 10: 6, 355-365 [46] - Gerdin, B.; Hallgren, R.; “Dynamic role of hyaluronan (HYA) in connective tissue activation and inflammation.”; J Intern Med; 1997; 242: 1, 49-55 [47] - Weigel, P.H.; Fuller, G.M.; LeBoeuf, R.D.; “A model for the role of hyaluronic acid and fibrin in the early events during the inflammatory response and wound healing.”; J Theor Biol; 1986; 119: 2, 219-234 [48] – Farmacopeia Britânica; 2008; Monografia 372 [49] - ISO 3052:1974 – “Gypsum Plasters – Determination of water of crystallization content”



[50] – Liu, Yang; Wang, Alian; Freeman, John J.; “RAMAN, MIR, And NIR Spectroscopy Study of Calcium Sulfates: Gypsum, Bassanite, and Anhydrite.”; 40th Lunar and Planetary Science Conference; 2009 [51] – European Pharmacopeia 6.2; 2.5.12. Water: semi-micro determination, pp. 141 [52] – Bruttel, Peter A.; Schlink, Regina; “Monografia – Water determination by Karl Fischer Titration”; Metrohm AG [53] – Ramsdell, L.S.; Partridge, E.P.; “The Crystal Forms of Calcium Sulphate”; Journal Mineralogical Society of America; 59-74 [54] – Khodir, Wan K.W.; Shamsudin, Roslinda; Daud, Abdul R.; Abdullah, Yusof; “Injectable Hydroxyapatite - β-Tricalcium Phosphate – Calcium Sulphate Biocement”; Sains Malaysiana; 2005; 34 (2); 77-80 [55] - Norma ASTM C472-2004 - “Standard Test Methods for Physical Testing of Gypsum, Gypsum Plasters and Gypsum Concrete” [56] – New Osteo, GMReis; http://www.gmreis.com/produtos.html?FhIdProduto=33aca4efc3a23de5cc32c38f041ebc81&FhIdCategoria=aedd61efa27782ca3f48dac558dd42a3, em 18/8/09 [57] – CalMatrix, LifeCore Biomed Inc.; http://www.lifecore.com/Portals/0/PDFs/catalogpdfs/CalMatrix%20Mixing%20Table.pdf, em 18/8/09 [58] – Calcigen, Biomet 3i; http://www.osseonews.com/drosseo/content/78587-calcigen-oral-bone-graft-stabilizer-strength-you-need-stability-you-want, em18/8/09 [59] - Norma NP EN ISO 10993-4: 2002 – “Avaliação Biológica dos Dispositivos Médicos, Parte 4: Selecção de testes para interacções com o sangue” [60] - Norma ASTM F 756-00; ”Assessment of Hemolytic Properties of Materials” [61] – Duarte, F.; Santos, J.D.; Afonso, A.; “Medical applications of Bonelike® in Maxillofacial Surgery”; Materials Science Forum; 2004; Vols. 455-456, pp. 370-373 [62] – Gutierres, M.; Hussain, N.S.; Lopes, M.A.; Afonso, A.; Cabral, A.T.; Almeida, L.; Santos, J.D.; “Histological and Scanning Electron Microscopy Analyses of Bone/Implant Interface Using the Novel Bonelike® Synthetic Bone Graft”; Journal of Orthopedic Research; 2006; 953-958 [63] – Sousa, R.C.; Lobato, J.V.; Maurício, A.C.; Hussain, N.S.; Botelho, C.M.; Lopes, M.A.; Santos, J.D.; “A Clinical Report of Bone Regeneration in Maxillofacial Surgery



using Bonelike® Synthetic Bone Graft”; Journal of Biomaterials Applications; 2008; Volume 22, 373-385 [64] – Kelly, Cynthia M.; Wilkins, Ross M.; Gitelis, Steven; Hartjen, Charles; Watson, J. Tracy; Kim, Poong T.; “The Use of a Surgical Grade Calcium Sulfate as a Bone Graft Substitute”; Clinical Orthopaedics and Related Research; 2001; Number 382, pp. 42-50 [65] - http://www.merck-chemicals.com.br/titulacao-de-karl-fischer-determinacao-de-agua/c_pNKb.s1LoKIAAAEW.uAfVhTl, em 18/8/09 [66] – Aghajani, F.; “Additional thermal expansion of gypsum-bonded investment by rapid heating”; Tese de Mestrado de Ciências em Medicina Dentária; 1998 [67] – Singh, N.B.; Middendorf, B.; “Calcium sulphate hemihydrate hydration leading to gypsum crystallization”; Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials; 2007; 53; 57-77 [68] - Bodziak, William J.; “Footwear Impression Evidence – Detection, Recovery, and Examination”; Second Edition; CRC Press LLC; Estados Unidos da América, Florida; 2000; 59-96 [69] – “Lewry, A.J.; “The setting of gypsum plaster – Part I; The hydration of calcium sulphate hemihydrate”; Journal of Material Science; 1994; 29; 5279-5284 [70] – “Biological Responses to Materials”; Annu. Rev. Mater. Res.; 2001; 31:81–110 [71] – “O Metabolismo do Eritrócito”; Seminário apresentado pela aluna Luciana de Almeida Lacerda na disciplina Bioquímica do Tecido Animal; Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; Universidade Federal do Rio Grande do Sul; 2005 [72] – Anderson, Darrel R.;Davis, J. Lawrence; Carraway, Kermit L.;“Calcium-promoted Changes of the Human Erythrocyte Membrane - Involvement of Spectrin, Transglutaminase, and a Membrane-bound Protease”; The Journal of Biological Chemistry; 1977; Vol.252; No. 19: 6617-6623 [73] - Guyton, Arthur C.; Hall, John E.; “Tratado de Fisiologia Médica” ; 1997; 9ª Edição; Capítulo 36, pág.340; Guanabara Koogan [74] – “Metabolismo e Endocrinologia - Resumo de Vias Metabólicas”; por Joana Nunes aluna do Instituto Superior Técnico da Universidade Técnica de Lisboa; 2008



[75] – Moresco, R.N.; Silla, L.M. da Rocha; “Aplicação do D-dímero na investigação de distúrbios tromboembólicos”; RBAC; 2005; Vol. 37(1): 19-21 [76] http://boasaude.uol.com.br/exam/index.cfm?lookup=F&ExamID=52&View=View, em 18-8-09 [77] - http://boasaude.uol.com.br/exam/index.cfm?lookup=D&ExamID=121&View=View, em 18-08-09

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Desenvolvimento de substituto ósseo injectável para ......CANDIDATO Inês da Silva Cunha Código 030508006 Título Desenvolvimento de substituto ósseo injectável para regeneração