Desenvolvimento e validação de métodos analíticos ...repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/337952/1/Camargo_Paula… · Desenvolvimento e validação de métodos analíticos

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

Paula Roberta Caumo de Camargo

Desenvolvimento e validação de métodos analíticos empregando HPLC e UHPSFC para doseamento simultâneo

dos fármacos cloridrato de adifenina, cloridrato de prometazina e dipirona em associações medicamentosas na forma de

comprimido

CAMPINAS

2019

Paula Roberta Caumo de Camargo

Desenvolvimento e validação de métodos analíticos empregando UHPSFC E HPLC para doseamento simultâneo

dos fármacos cloridrato de adifenina, cloridrato de prometazina e dipirona em associações medicamentosas na forma de

comprimido

Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa

CAMPINAS

2019

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA PAULA ROBERTA CAUMO DE CAMARGO E ORIENTADA PELO PROF. DR. PAULO CÉSAR PIRES ROSA.

Campinas, 14 de novembro de 2019.

Comissão examinadora

Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa

Prof. Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues

Prof(a). Dra Carla Beatriz Grespan Bottoli

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos da Unidade Instituto de Biologia.

Agradecimentos

A Deus pela saúde e pelo consolo em todos os momentos vividos nessa caminhada.

Houveram muitas pedras no caminho, mas Ele as tirou e possibilitou a concretização

desse trabalho.

Ao meu amado Rogério pelo incentivo a iniciar o mestrado e por permanecer me

apoiando durante todo o decorrer desse estudo, me encorajando a encontrar soluções

para os desafios que apareceram. Por todo seu conhecimento, paciência e

compreensão.

Aos meus filhos, que mesmo sem saber, me impulsionaram a ampliar meu horizonte

em busca de algo maior.

Aos meus familiares e amigos pelas conversas, paciência e apoio nos momentos

difíceis.

Aos colegas de vida acadêmica pelos companheirismo, risadas, desabafos e

aprendizado.

Ao meu orientador Dr. Paulo Rosa pela oportunidade, sabedoria, tolerância e por

acreditar na importância desse trabalho.

Á professora Dra. Márcia Cristina Breitkreitz pelo conhecimento, paciência, dedicação

e por acreditar na minha capacidade. O domínio e a experiência profissional e

acadêmica da professora foram essenciais para o desenvolvimento do método por

UHPSFC e todo conteúdo referente ao planejamento experimental, assim como o

tratamento estatístico dos resultados.

À professora Dra. Isabel Jardim por conceder o uso do UPC2, pela sabedoria e

gentileza.

À Lucília Melo, minha querida amiga, pelo ensinamento, motivação e carinho.

O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código Financeiro 001.

Epígrafe

”Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”

Madre Teresa de Calcutá

Resumo

As técnicas cromatográficas são amplamente empregadas para análises de

amostras complexas em diferentes áreas, principalmente a farmacêutica, devido as

variadas características dos fármacos e às associações entre os mesmos.

Recentemente uma nova técnica que associa a SFC (Supercritical Fluid

Chromatography) e UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) está se

destacando no quesito de separações analíticas. Trata-se da Cromatografia com

Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (Ultra High Performance Supercritical Fluid

Chromatography (UHPSFC), uma técnica capaz de unir as características da

cromatografia líquida e da gasosa tornando-se muito versátil, que emprega CO2 como

principal constituinte da fase móvel, reduzindo o consumo de solventes tóxicos, sendo

considerada uma técnica verde. Esse trabalho propõe o desenvolvimento e validação

de métodos cromatográficos por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (High

Performance Liquid Chromatography, HPLC) e Cromatografia com Fluído Supercrítico

de Ultra Alta Eficiência (Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography,

UHPSFC) para doseamento simultâneo da associação cloridrato de adifenina,

cloridrato de prometazina e dipirona sódica em comprimido. Para a técnica de HPLC,

realizou-se uma triagem para avaliar qual fase estacionária, fase móvel, diluente e

concentração do trabalho fornecia melhor resultado em relação ao formato de pico.

As condições definidas foram: coluna Phenyl Hexyl, diluente metanol, vazão 1 mL min-

1, fase móvel tampão fosfato de potássio:metanol:acetonitrila, modo de eluição

gradiente, volume de injeção 20 µL, coluna e amostras em temperatura ambiente,

concentração dos ativos 0,5 mg mL-1 dipirona, 0,010 mg mL-1 cloridrato de adifenina

e 0,005 mg mL-1 de cloridrato de prometazina. O método foi validado de acordo com

a resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 da ANVISA e considerado preciso,

exato, seletivo e linear para a faixa de trabalho empregada com tempo de corrida de

20 minutos. Para a técnica de UHPSFC, algumas condições cromatográficas foram

avaliadas, como modificador orgânico e aditivos na fase móvel. Definidas as

condições cromatográficas, realizou-se um planejamento do tipo composto central

para avaliar como a temperatura da coluna, a concentração de modificador e a

pressão influenciavam a retenção e a resolução dos ativos. Verificou-se que os

mesmos afetam as respostas, sendo a concentração do modificador o fator mais

impactante. Através dos resultados foi determinado o Design Space, região

considerada robusta, na qual alterações nas condições de análise não afetam as

respostas de interesse. A partir desse espaço, foi definida a condição empregada na

validação: coluna HSS C18, diluente etanol, vazão 1,5 mL min-1, fase móvel CO2:

metanol com 0,2 % de trietilamina e 5 % de água purificada (A:B), modo de eluição

isocrático 80:20 (A:B), volume de injeção: 0,5 µL, concentração dos ativos: 5 mg mL-1

de dipirona, 0,10 mg mL-1 de cloridrato de adifenina e 0,05 mg mL-1 de cloridrato de

prometazina, pressão 1500 psi e temperatura da coluna de 30 °C. O método foi

validado e considerado preciso, exato, seletivo e linear para a faixa de trabalho

empregada com tempo de corrida de 2 minutos. Ambos métodos foram considerados

aptos para doseamento dos ativos.

Palavras chave: HPLC, UHPSFC, planejamento experimental, cloridrato de

adifenina, cloridrato de prometazina, dipirona sódica, analgésicos, cromatografia

líquida.

Abstrat

Chromatographic techniques are widely used for analysis of complex samples

in different areas, mainly pharmaceutical, due to the varied characteristics of the drugs

and their associations. Recently a new technique that combines SFC (Supercritical

Fluid Chromatography) and UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography)

is emerging in the area of analytical separations. This is Ultra High Performance

Supercritical Fluid Chromatography (UHPSFC), a very versatile technique that

combines the characteristics of liquid and gaseous chromatography with CO2 as the

main constituent of the phase. This technique proposes the development and

validation of chromatographic methods by High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) and Ultra High Efficiency Supercritical Fluid Chromatography (Ultra

Chromatography). High Performance Supercritical Fluid Chromatography (UHPSFC)

for simultaneous dosing of the combination of adiphenine hydrochloride, promethazine

hydrochloride and sodium dipyrone in tablet. work provided better res compared to the

peak format. The defined conditions were: Phenyl Hexyl column, methanol diluent, flow

rate 1 mL min-1, mobile phase potassium phosphate buffer: methanol: acetonitrile,

gradient elution mode, injection volume 20 µL, column and samples at room

temperature, concentration of active ingredients 0.5 mg mL-1 dipyrone, 0.010 mg mL-

1 adiphenine hydrochloride and 0.005 mg mL-1 promethazine hydrochloride. The

method was validated in accordance with ANVISA Resolution No. 899 of May 29, 2003

and considered accurate, accurate, selective and linear for the working range

employed with a running time of 20 minutes. For the UHPSFC technique, some

chromatographic conditions were evaluated, such as organic modifier and mobile

phase additives. Once the chromatographic conditions were defined, a central

composite type planning was performed to evaluate how column temperature, modifier

concentration, and pressure influenced the retention and resolution of the assets. They

were found to affect responses, with modifier concentration being the most impacting

factor. Through the results it was determined the Design Space, a region considered

robust, in which changes in the analysis conditions do not affect the responses of

interest. From this space, the validation condition was defined: HSS C18 column,

ethanol diluent, flow rate 1.5 mL min-1, mobile phase CO2: methanol with 0.2%

triethylamine and 5% purified water (A: B), 80:20 isocratic elution mode (A: B), injection

volume: 0.5 µL, active concentration: 5 mg mL -1 dipyrone, 0.10 mg mL -1 adiphenine

hydrochloride and 0 0.05 mg mL -1 promethazine hydrochloride, pressure 1500 psi

and column temperature 30 ° C. The method was validated and considered accurate,

accurate, selective and linear for the working range employed with a 2-minute running

time. Both methods were considered fit for dosing the assets.

Keywords: HPLC, UHPSFC, experimental design, adiphenine hydrochloride,

promethazine hydrochloride, sodium dipyrone, analgesics, Liquid Chromatography.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama de fases do dióxido de carbono (adaptado Nokáková

2014)............................................................................................................ 34

Figura 2. Spider diagram - Natureza das colunas cromatográficas

empregadas em UHPSFC (adaptado Lesselier e West, 2015)................... 39

Figura 3. Equipamento UPC2 da empresa Waters...................................... 40

Figura 4. Fluxograma para desenvolvimento de métodos utilizando os

conceitos de A-QbD..................................................................................... 44

Figura 5. Fluxograma da parte experimental realizada na técnica

HPLC/DAD................................................................................................... 55

Figura 6. Fluxograma da parte experimental realizada na técnica

UHPSFC/DAD.............................................................................................. 61

Figura 7. Estrutura química das fases estacionárias utilizadas na triagem

cromatográfica A: Phenyl hexyl e B: Zorbax eclipse plus.............................. 69

Figura 8. Sobreposição dos cromatogramas da dipirona (A) solubilizada

em metanol (preto) e em HCl (azul) e a formação do produto de

degradação (B). Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente

metanol, vazão 1 mLmin-1, fase móvel tampão : metanol : acetonitrila

(A:B:C -v/v/v), modo de eluição gradiente (conforme apresentado na

Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração dos ativos 0,5 mg mL-

dipirona, 0,010 mg mL-1 cloridrato de adifenina e 0,005 mg mL-1 de

cloridrato de prometazina comprimento de onda de 254 nm........................

74

Figura 9. Cromatograma obtido no comprimento de onda de 210 nm: (A)

4MAA, (B) dipirona, (C) cloridrato de prometazina e (D) cloridrato de

adifenina. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente



Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração dos ativos 0,5 mg mL-

dipirona, 0,010 mg mL-1 cloridrato de adifenina e 0,005 mg mL-1 de

cloridrato de prometazina.............................................................................

75

Figura 10. Cromatograma obtido no comprimento de onda de 254 nm: (A)

4MAA, (B) dipirona e (C) cloridrato de prometazina. Condições

cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente metanol, vazão 1 mLmin-1,

fase móvel tampão : metanol : acetonitrila (A:B:C -v/v/v), modo de eluição

gradiente (conforme apresentado na Tabela 4), volume de injeção 20 µL,

concentração dos ativos 0,5 mg mL- dipirona, 0,010 mg mL-1 cloridrato de

adifenina e 0,005 mg mL-1 de cloridrato de prometazina...............................

75

Figura 11. Cromatograma ilustrando a seletividade para a dipirona e o 4-

MAA. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente metanol,

vazão 1 mL min-1, fase móvel tampão : metanol : acetonitrila (A:B:C -v/v/v),

modo de eluição gradiente (conforme apresentado Tabela 4), volume de

injeção 20 µL, concentração do ativo 0,5 mg mL- dipirona, 0,010 mg mL-1.. 76

Figura 12. Cromatograma ilustrando a seletividade para o cloridrato de

prometazina. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente



Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração do ativo 0,005 mg mL-1

de cloridrato de prometazina........................................................................ 76


adifenina. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente

metanol, vazão 1 mL min-1, fase móvel tampão : metanol : acetonitrila


Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração do ativo 0,010 mg mL-1

cloridrato de adifenina.................................................................................. 77

Figura 14. Cromatograma ilustrando a seletividade para a fase móvel e o

placebo (excipientes). Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl,

diluente metanol, vazão 1 mL min-1, fase móvel tampão : metanol :

acetonitrila (A:B:C -v/v/v), modo de eluição gradiente (conforme

apresentado na Tabela 4), volume de injeção 20 µL..................................... 77

Figura 15. Curva analítica para cloridrato de adifenina.............................. 78

Figura 16. Gráficos para análise de resíduos do cloridrato de adifenina.... 78

Figura 17. Curva analítica para cloridrato de prometazina........................... 79

Figura 18. Gráficos para análise de resíduos do cloridrato de prometazina. 79

Figura 19. Curva analítica para dipirona sódica.......................................... 80

Figura 20. Gráficos para análise de resíduos da dipirona

sódica........................................................................................................... 80

Figura 21. Estrutura química das fases estacionárias utilizadas na triagem cromatográfica.............................................................................................

86

Figura 22. Cromatograma obtido nas condições: coluna C18, fase móvel

CO2:metanol (90:10), volume de injeção de 1 µL, pressão 1500 psi,

temperatura de 30 ºC, vazão 1,5 mL min-1, concentração dos padrões de

0,5 mg mL-1. Compostos: A: cloridrato de adifenina, B: cloridrato de

prometazina e C: dipirona............................................................................

86

Figura 23. Comparação dos cromatogramas obtidos utilizando metanol

em diferentes proporções com hidróxido de sódio. Compostos: A –

cloridrato de adifenina, B – dipirona e C – cloridrato de prometazina.

Comprimento de onda de 210nm. Condições cromatográficas: coluna

C18, pressão 1500 psi, temperatura da coluna de 30 ºC, vazão 1,5 mLmin-

1, concentração dos ativos cloridrato de adifenina 0,10 mg mL-1, cloridrato

de prometazina 0,05 mg mL-1e dipirona 5 mg mL-1.......................................

88

Figura 24. Cromatograma obtido nas condições de 20% de metanol e

acetato de amônio 5 mmol/L, comprimento de onda de 254nm Condições

cromatográficas: coluna C18, pressão 1500 psi, temperatura da coluna de

30 ºC, vazão 1,5 mLmin-1, concentração dos ativos cloridrato de adifenina

0,10 mg mL-1, cloridrato de prometazina 0,05 mg mL-1e dipirona 5 mg mL-

1....................................................................................................................

89

Figura 25. Cromatogramas obtidos nos comprimentos de onda de 210 nm

e 254 nm utilizando metanol a 10 % com trietilamina. Compostos: A –

cloridrato de adifenina, B – dipirona e C – cloridrato de prometazina254nm.

Condições cromatográficas: coluna C18, pressão 1500 psi, temperatura

da coluna de 30 ºC, vazão 1,5 mLmin-1, concentração dos ativos cloridrato

de adifenina 0,10 mg mL-1, cloridrato de prometazina 0,05 mg mL-1e

dipirona 5 mg mL-1........................................................................................

90

Figura 26. Comparação entre os cromatogramas extraídos a 254nm

variando a concentração de metanol de 15 % (1) para 20 % (2) utilizando

trietilamina como aditivo. Composto: A - cloridrato de prometazina e B-

dipirona. 254nm Condições cromatográficas: coluna C18, pressão 1500

psi, temperatura da coluna de 30 ºC, vazão 1,5 mLmin-1, concentração dos

ativos cloridrato de adifenina 0,10 mg mL-1, cloridrato de prometazina 0,05

mg mL-1e dipirona 5 mg mL-1........................................................................

91

Figura 27. Comparação dos cromatogramas contendo mistura de bases

com pKa baixo (azul), médio (verde) e alto (vermelho) obtidos com

colunas Acquity UPC2 2-EP sem hidróxido de amônio (A) e com 20 mM

do aditivo (B). (Adaptado de Perrenoud e colaboradores)..........................

92

Figura 28. Reação de equilíbrio que ocorre com as partículas de sílica

na presença de metanol formando éter de silil e água............................... 93

Figura 29. Sobreposição das Curvas de retenção dos ativos - Tempo de

retenção vs % modificador orgânico. Condições cromatográficas: coluna

C18, pressão 1500 psi, temperatura da coluna de 30 ºC, vazão 1,5 mLmin-

1, concentração dos ativos cloridrato de adifenina 0,10 mg mL-1, cloridrato

de prometazina 0,05 mg mL-1e dipirona 5 mg mL-1.......................................

94

Figura 30. Cromatogramas apresentando os perfis dos picos obtidos no

planejamento conforme Tabela 9. Condições cromatográficas mantidas

constantes: coluna HSS C18, diluente etanol, vazão 1,5 mLmin-1, fase

móvel CO2: metanol com 0,2 % de trietilamina e 5 % de água purificada

(A:B), volume de injeção: 0,5 µL, concentração dos ativos: 5mg mL-1 de

dipirona, 0,10 mg mL-1 de cloridrato de adifenina e 0,05 mg mL-1 de

cloridrato de prometazina. Cromatogramas obtidos em 210 nm

evidenciando o ativo de interesse cloridrato de adifenina.............................

99

Figura 31. Cromatogramas apresentando os perfis dos picos obtidos no

planejamento conforme Tabela 9. Condições cromatográficas mantidas

constantes: coluna HSS C18, diluente etanol, vazão 1,5 mLmin-1, fase

móvel CO2: metanol com 0,2 % de trietilamina e 5 % de água purificada

(A:B), volume de injeção: 0,5 µL, concentração dos ativos: 5mg mL-1 de

dipirona, 0,10 mg mL-1 de cloridrato de adifenina e 0,05 mg mL-1 de

cloridrato de prometazina. Cromatogramas obtidos em 254 nm

evidenciando os ativos de interesse cloridrato de prometazina e dipirona.

Destaque para os planejamentos 2 e 6.........................................................

99

Figura 32. Superfície de resposta para o K em função da temperatura vs

modificador a pressão de 1500 psi para cloridrato de adifenina................. 101


modificador a pressão de 1900 psi para cloridrato de adifenina.................... 101

Figura 34. Gráfico resultados previstos pelo modelo vs resultados experimentais para cloridrato de adifenina...................................................

102

Figura 35. Gráfico resultados dos resíduos vs resultados previstos pelo modelo para cloridrato de adifenina..............................................................

102


modificador a pressão de 1500 psi para dipirona.......................................... 103


modificador a pressão de 1900 psi para dipirona.......................................... 104

Figura 38. Gráfico resultados previstos pelo modelo vs resultados

experimentais para dipirona......................................................................... 104

Figura 39. Gráfico resultados dos resíduos vs resultados previstos pelo

modelo para dipirona.................................................................................... 105

Figura 40. Superfície de resposta para o K em função da temperatura vs modificador a pressão de 1500 psi para cloridrato de prometazina............

106


modificador a pressão de 1900 psi para cloridrato de prometazina.............. 106

Figura 42. Gráfico resultados previstos pelo modelo vs resultados

experimentais para cloridrato de prometazina.............................................. 107


modelo para cloridrato de prometazina........................................................ 108

Figura 44. Superfície de resposta para o par crítico cloridrato de prometazina e dipirona em função da temperatura vs modificador a 1500 psi................................................................................................................

109

Figura 45. Superfície de resposta para o par crítico cloridrato de

prometazina e dipirona em função da temperatura vs modificador a 1900

psi................................................................................................................

109

Figura 46: Gráfico resultados previstos pelo modelo vs resultados experimentais para a resolução do par crítico cloridrato de prometazina e dipirona........................................................................................................

110


modelo para a resolução do par crítico cloridrato de prometazina e

dipirona........................................................................................................

110


adifenina. Condições cromatográficas: coluna C18, diluente etanol, vazão

1,5 mL min-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 % água e 0,2 %

trietilamina, modo de eluição isocrático, volume de injeção 0,5 µL,

concentração do ativo 0,10 mg mL-1 cloridrato de adifenina, temperatura

de 30 % e pressão de 1500 psi...................................................................

112


prometazina. Condições cromatográficas: coluna C18, diluente etanol,

vazão 1,5 mL min-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 % água e 0,2 %

trietilamina, modo de eluição isocrático, volume de injeção 0,5 µL,

concentração do ativo 0,05 mg mL-1 de cloridrato de prometazina,

temperatura de 30 % e pressão de 1500 psi...............................................

112

Figura 50. Cromatograma ilustrando a seletividade para a dipirona.

Condições cromatográficas: coluna C18, diluente etanol, vazão 1,5 mL

min-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 % água e 0,2 % trietilamina,

modo de eluição isocrático, volume de injeção 0,5 µL, concentração do

ativo 5 mg mL-1 dipirona, temperatura de 30 % e pressão de 1500 psi........ 113

Figura 51. Cromatograma ilustrando a seletividade para a fase móvel e o

placebo (excipientes). Condições cromatográficas: coluna C18, diluente

etanol, vazão 1,5 mLmin-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 % água

e 0,2 % trietilamina, modo de eluição isocrático, volume de injeção 0,5 µL,

temperatura de 30 % e pressão de 1500 psi.................................................

113

Figura 52. Curva analítica para o cloridrato de adifenina........................... 114

Figura 53. Gráficos para análise dos resíduos do cloridrato de adifenina.... 115

Figura 54. Curva analítica para o cloridrato de prometazina........................ 115

Figura 55. Gráficos para análise dos resíduos do cloridrato de

prometazina.................................................................................................

116

Figura 56. Curva analítica para a dipirona sódica. ....................................... 116

Figura 57. Gráficos para análise dos resíduos da dipirona sódica............... 117

Figura 58. Sobreposição dos mapas de contorno da K e RS a pressão de

1500 psi. ...................................................................................................... 121

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Propriedades dos IFAs: ação farmacológica, massa molar, pka,

log P e estrutura química..............................................................................

27

Tabela 2. Propriedades físico-químicas de alguns compostos que podem

ser utilizados em cromatografia com fluído supercrítico...............................

34

Tabela 3: Valores de DPR de acordo com a concentração do analito na amostra para fins de avaliação da precisão do método................................

48

Tabela 4. Gradiente empregado para validação do método por

HPLC/DAD................................................................................................... 57

Tabela 5. Concentração teórica dos fármacos para construção da curva

analítica na técnica de HPLC/DAD.............................................................. 58

Tabela 6. Aditivos avaliados e respectivas concentrações......................... 62

Tabela 7. Concentração dos padrões de acordo com a proporção no

produto acabado.......................................................................................... 63

Tabela 8. Limites dos fatores para o planejamento composto central........ 64

Tabela 9. Condições dos experimentos realizados de acordo com o

Planejamento Composto Central................................................................. 65

Tabela 10. Concentração teórica dos padrões para construção da curva

analítica na técnica de UHPSFC/DAD......................................................... 66

Tabela 11. Influência do pH da fase móvel no tempo de retenção dos

cloridratos de adifenina e prometazina........................................................ 73

Tabela 12. Equação da reta das curvas analíticas, faixa linear, coeficiente

de correlação para os ativos usando a técnica de HPLC/DAD e os valores

informativos do limite de detecção (LD) e limite de quantificação

(LQ)..............................................................................................................

81

Tabela 13. Resultados obtidos experimentalmente para precisão

(repetibilidade) na técnica de HPLC/DAD....................................................

82


intermediária na técnica de HPLC/DAD.......................................................

82

Tabela 15. Resultados da exatidão para o cloridrato de adifenina na

técnica de HPLC/DAD.................................................................................

83

Tabela 16. Resultados da exatidão para o cloridrato de prometazina na


83

Tabela 17. Resultados da exatidão para dipirona na técnica de

HPLC/DAD...................................................................................................

84

Tabela 18. Resultados da robustez para cloridrato de adifenina na técnica

de HPLC/DAD..............................................................................................

84

Tabela 19. Resultados da robustez para cloridrato de prometazina na


84

Tabela 20. Resultados da robustez para dipirona sódica na técnica de

HPLC/DAD...................................................................................................

85

Tabela 21. Ilustração do formato dos picos dos ativos em relação ao tipo

de diluente....................................................................................................

96

Tabela 22. Formato do pico cromatográfico para cloridrato de adifenina

em função dos diferentes volumes de injeção.............................................

97

Tabela 23. Equação da reta das curvas analíticas, faixa linear, coeficiente

de correlação para os ativos estudados usando UHPSFC/DAD e os

valores informativos do limite de detecção (LD) e limite de quantificação

(LQ)..............................................................................................................

117


(repetibilidade) na técnica de UHPSFC/DAD..............................................

118


intermediária na técnica de UHPSFC/DAD.................................................

118

Tabela 26. Resultados da exatidão para o cloridrato de adifenina na

técnica de UHPSFC/DAD............................................................................

119

Tabela 27. Resultados da exatidão para o cloridrato de prometazina na

técnica de UHPSFC/DAD............................................................................

119

Tabela 28. Resultados da exatidão para o cloridrato de dipirona na técnica

de UHPSFC/DAD. ..........................................................................

120

Tabela 29. Apresentação das condições cromatográficas dos métodos

desenvolvidos e validados pelas técnicas de HPLC e UHPSFC...................

122

LISTA DE EQUAÇÕES

Equação 1. Curva de van Deemter............................................................. 29

Equação 2. Cálculo para precisão.............................................................. 47

Equação 3. Equação de Horwitz................................................................. 47

Equação 4. Cálculo para limite de detecção............................................... 48

Equação 5. Cálculo para limite de quantificação........................................ 49

Equação 6. Cálculo para exatidão utilizando a concentração.................... 50

Equação 7. Cálculo para exatidão utilizando a recuperação...................... 50

Equação 8. Cálculo para fator de retenção................................................. 64

Equação 9. Cálculo para resolução............................................................ 64

Lista de abreviaturas

AINES – Anti-inflamatórios Não Esteroidais

A-QbD - Analytical Quality by Design

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ABPR – Automated Backpressure Regulator

CMD – Concentração Média Determinada

CO2 – Dióxido de Carbono

COX – Ciclooxigenase

CQA – Critical Quality Atribute

DAD – Detector por Arranjo de Diodos

DoE – Design of Experiments

DP – Desvio Padrão

dp – diâmetro de partícula

DPa – Desvio Padrão Estipulado

DPR – Desvio Padrão Relativo

DS – Design Space

ELSD – Detector Evaporativo por Espalhamento de Luz

FE – Fase Estacionária

FID – Detector por Ionização em Chama

FM – Fase Móvel

GC - Gas Chromatography

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

Ic – Inclinação da curva de inclinação

ICH – International Conference on Harmonisation

IFA – Insumo Farmacêutico Ativo

K – Fator de retenção

LC – Liquid Chromatography

LD – Limite de Detecção

LQ – Limite de Quantificação

MIP – Medicamento Isento de Prescrição

MODR - Method Operable Design Region

MS – Mass Spectrometer

QbD – Quality by Design

r – Coeficiente de correlação

Rs – Resolução

SEF – Silyl Ether Formation

SFC - Supercritical Fluid Chromatography

UHPLC - Ultra High Performance Liquid Chromatography

UHPSFC - Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography

UPC2 - Ultra Performance Convergence Chromatography

UV – Ultravioleta

Sumário

1. Introdução............................................................................................... 23 1.1. Dor e Analgésicos.................................................................................. 23 1.1.1. Dipirona sódica................................................................................... 23 1.1.2. Cloridrato de adifenina....................................................................... 23 1.1.3. Cloridrato de prometazina.................................................................. 26 1.1.4 Métodos analíticos farmacopéicos empregados em análises de dipirona sódica, cloridrato de adifenina e cloridrato de prometazina...........

27

1.2. Evolução das técnicas cromatográficas................................................ 28 1.3. Cromatografia líquida de alta eficiência – HPLC.................................. 31 1.4. Cromatografia com fluído supercrítico de ultra alta eficiência - UHPSFC.......................................................................................................

33

1.5. Quality by Design (QbD) no desenvolvimento de métodos................... 42 1.6. Validação............................................................................................... 45 1.6.1. Seletividade........................................................................................ 45 1.6.2. Linearidade......................................................................................... 46 1.6.3. Faixa de trabalho................................................................................ 46 1.6.4. Precisão.............................................................................................. 47 1.6.5. Limite de detacção.............................................................................. 48 1.6.6. Limite de quantificação....................................................................... 49 1.6.7. Exatidão.............................................................................................. 49 1.6.8. Robustez............................................................................................ 50 2. Objetivos. .............................................................................................. 51 2.1. Principal................................................................................................ 51 2.2. Específicos............................................................................................ 51 3. Justificativa............................................................................................. 52 4. Materiais e Métodos................................................................................ 53 4.1. Materiais............................................................................................... 53 4.1.1. Reagentes e solventes....................................................................... 53 4.1.2. Padrões analíticos e amostras............................................................ 53 4.1.3. Equipamentos..................................................................................... 53 4.1.4. Cromatógrafos, colunas cromatográficas e softwares........................ 53 4.1.4.1.HPLC................................................................................................ 53 4.1.4.1.1 Colunas cromatográficas............................................................... 54 4.1.4.1.2. Software....................................................................................... 54 4.1.4.2. UHPSFC.......................................................................................... 54 4.1.4.2.1. Colunas cromatográficas.............................................................. 54 4.1.4.2.2. Software....................................................................................... 54 4.2. Métodos ............................................................................................... 54 4.2.1. HPLC.................................................................................................. 54 4.2.1.1.Preparo dos padrões e amostras...................................................... 55 4.2.1.2. Triagem cromatográfica................................................................... 56 4.2.1.2.1.Seleção das fases estacionárias................................................... 56 4.2.1.2.2. Seleção da fase móvel.................................................................. 56 4.2.1.2.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho, volume de injeção e comprimento de onda....................................................................

56

4.2.1.3. Validação......................................................................................... 57 4.2.2. UHPSFC............................................................................................. 60 4.2.2.1. Preparo dos padrões e amostras..................................................... 61

4.2.2.2. Triagem cromatográfica................................................................... 61 4.2.2.2.1. Seleção das fases estacionárias.................................................. 61 4.2.2.2.2. Seleção da fase móvel.................................................................. 62 4.2.2.2.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho, volume de injeção e comprimento de onda. ..................................................................

62

4.2.2.2.4. Planejamento experimental.......................................................... 63 4.2.2.2.5. Validação do método.................................................................... 66 5. Resultados e Discussão......................................................................... 68 5.1. HPLC..................................................................................................... 68 5.1.1. Seleção da fase estacionária............................................................. 68 5.1.2. Seleção da fase móvel....................................................................... 69 5.1.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho e volume de injeção 73 5.1.4. Validação .......................................................................................... 75 5.1.4.1. Seletividade..................................................................................... 76 5.1.4.2. Linearidade...................................................................................... 77 5.1.4.3. Precisão........................................................................................... 81 5.1.4.4. Exatidão.......................................................................................... 82 5.1.4.5. Robustez......................................................................................... 84 5.2. UHPSFC............................................................................................... 85 5.2.1. Seleção da fase estacionária.............................................................. 85 5.2.2. Seleção da fase móvel........................................................................ 86 5.2.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho e volume de injeção 95 5.2.4. Planejamento experimental................................................................ 97 5.2.4.1. Resultado para o fator de retenção................................................. 100 5.2.4.2. Resultado para a resolução entre o par crítico cloridrato de prometazina e dipirona................................................................................

108

5.2.5 Validação............................................................................................ 111 5.2.5.1. Seletividade.................................................................................... 111 5.2.5.2. Linearidade.................................................................................... 113 5.2.5.3. Precisão......................................................................................... 118 5.2.5.4. Exatidão......................................................................................... 119 5.2.5.5. Robustez......................................................................................... 120 6. Conclusão............................................................................................... 123 7. Referências bibliográficas.................................................................... 125 8. Anexos..................................................................................................... 8.1. Declaração de bioética e biossegurança................................................ 8.2. Declaração de direitos autorais.............................................................

134 135 136

23

1. Introdução

1.1 Dor e Analgésicos

A dor tem importância clínica fundamental, sendo uma das queixas mais

comuns dos pacientes que procuram atendimento médico. A sensação de dor é um

sintoma subjetivo, que varia de indivíduo para indivíduo em função de vários fatores

pessoais como: idade, raça, sexo, privação de sono, estresse, entre outros (SOUZA,

2005).

De acordo com a international association for the study of pain (IASP), a

dor é uma sensação ou experiência emocional desagradável, associada com dano

tecidual real ou potencial, sendo aguda com duração inferior a 30 dias, ou crônica com

duração superior a 30 dias. É classificada segundo seu mecanismo fisiopatológico em

dor de predomínio nociceptivo, dor de predomínio neuropático e dor mista. A dor de

predomínio nociceptivo, ou simplesmente dor nociceptiva, ocorre por ativação

fisiológica de receptores de dor e está relacionada à lesão de tecidos ósseos,

musculares ou ligamentares (osteoartrose, artrite reumatoide, fratura e rigidez

muscular na dor lombar inespecífica) e geralmente responde bem ao tratamento

sintomático com analgésicos ou anti-inflamatórios não esteroides (AINES). A dor

neuropática é definida como dor iniciada por lesão ou disfunção do sistema nervoso

periférico ou central, com a presença de descritores verbais característicos

(queimação, agulhadas, dormências) e responde pobremente aos analgésicos usuais

(paracetamol, dipirona, aines, opioides fracos). O tipo de dor mais frequente na prática

clínica é o misto, indicando lesão simultânea de nervos e tecidos adjacentes. Um

exemplo de dor mista é a radiculopatia ou a dor devida ao câncer (“oncológica”), casos

em que não há somente compressão de nervos e raízes (dor neuropática), mas

também de ossos, facetas, articulações e ligamentos (dor nociceptiva) (BRASIL,

2012).

Há uma classe de medicamentos denominada analgésicos, responsável

por amenizar ou interromper as vias de transmissão nervosa sendo administrados

para alívio de dores de diversas intensidades. Os analgésicos possuem mecanismos

e propriedades distintas, sendo divididos em algumas subclasses, sendo as principais:

os opióides e os anti-inflamatórios não esterioidais (AINES) (SILVA, 2006). Os

opióides possuem ação central, propriedades analgésicas potentes, efeito

tranquilizante e sedativo, com tendência a produzir tolerância, dependência psíquica

24

e física quando usados cronicamente. Os AINES possuem ação central e periférica,

propriedades analgésica, antipirética e anti-inflamatória e atuam inibindo a ciclo-

oxigenase (COX), enzima que catalisa a conversão do ácido aracdônico em

prostaglandinas e prostaciclinas envolvidas no processo inflamatório e na sensibili-

zação das unidades neuronais centrais e periféricas (MOTTA et al, 2010).

Normalmente são vendidos sem necessidade de prescrição médica facilitando a

automedicação e o consumo abusivo dos mesmos. Entre os AINES mais

comercializados estão os medicamentos contendo dipirona sódica, que pode estar na

forma de monodroga ou associada a outros insumos farmacêuticos ativos (IFA). A

associação dipirona, cloridrato de adifenina e cloridrato de prometazina é classificada

como AINE e indicada para alívio de manifestações dolorosas em geral,

principalmente dores pós-operatórias e cefaleias (SILVA e MOARES 2010) por

promover ação analgésica, antiespasmódica e antipirética referente à dipirona, ação

relaxante da musculatura lisa proveniente da adifenina, que também reforça a ação

antiespasmódica da dipirona, e as ações sedativa, colinérgica, antiemética e anti-

histamínica da prometazina. Esta associação de drogas permite uma potencialização

dos efeitos, observando-se uma rápida resposta terapêutica.

Um estudo foi realizado com a associação dipirona, cloridrato de adifenina

e cloridrato de prometazina em pacientes com dor oncológica com objetivo de avaliar

se a administração por via oral da associação seria capaz de proporcionar uma melhor

qualidade da analgesia e a redução da dose empregada de opióide. A morfina é a

droga de escolha para pacientes com dor crônica de origem oncológica, porém o seu

uso crônico e doses crescentes estão relacionados com o surgimento de efeitos

colaterais. O estudo envolveu 20 pacientes com média de uso da morfina de 73,5

mg/dia. Foi administrada a associação de 6 em 6 h durante uma semana. Para avaliar

a intensidade da dor foi utilizada a escala visual analógica (EVA) que varia de 0 (menor

intensidade) a 10 (maior intensidade) no início e no final do tratamento. Após o período

de estudo foi constatado a redução da dose da morfina em 13 pacientes (média de

50,5 mg/dia) e redução no EVA em 18 pacientes. Os resultados evidenciaram a

melhora da eficácia analgésica, com possibilidade de redução da dose de opióide

(LISASOR).

25

1.1.1 Dipirona

A dipirona ou metamizol ou ácido 1-fenil-2,3-dimetil-5-pirazolona-4-

metilaminometanossulfônico (Tabela 1), é um fármaco muito utilizado pela população

brasileira em diversas apresentações farmacêuticas (solução oral, injetável,

comprimidos e supositórios), sendo comercializado principalmente como

medicamento isento de prescrição (MIP) (CAETANO, 2005). A dipirona sódica

monoidratada é encontrada principalmente como um pó cristalino, quase branco e

inodoro. É solúvel em água e em metanol, pouco solúvel em etanol e praticamente

insolúvel em éter etílico, acetona, benzeno e clorofórmio (BRASIL, 2010). Após

administração oral, a dipirona ao entrar em contato com o suco gástrico é rapidamente

hidrolisada originando o metabólito ativo 4-N-metil-aminoantipirina (MAA), que é

prontamente absorvido pelo organismo sofrendo biotransformação hepática. O MAA

é em seguida metabolizado no fígado por desmetilação formando o 4-amino-antipirina

(AA), e por oxidação, originando o 4- formil-amido-antipirina (FAA). O AA sofre

acetilação originando o composto inativo 4-acetilaminoantipirina (AAA). Os

metabólitos MAA e AA são responsáveis pelos efeitos analgésicos da dipirona, por

inibirem a síntese de prostaglandinas. Nenhum desses metabólitos liga-se

extensivamente às proteínas plasmáticas, sendo predominantemente excretados

pelos rins (NASCIMENTO, 2005). Considerada um potente analgésico e antipirético,

a dipirona é indicada para patologias como cefaleias, neuralgias, dores pós-

operatórias, reumáticas, de fibras musculares lisas (por exemplo, cólica renal) e de

outras origens (NASCIMENTO, 2005). Também é administrada para tratamento dos

sintomas da dengue onde a utilização do ácido acetilsalicílico (AAS) não é

recomendada (BRASIL, 2003a). O mecanismo de ação consiste na inibição

irreversível da enzima COX 2. Sua ação ocorre tanto no sistema nervoso central

quanto no sistema nervoso periférico (HARDMAN, LIMBIRD, 2001). Apesar de exercer

grande importância na prática clínica no Brasil, o uso de dipirona não é recomendado

em alguns países como EUA e Reino Unido por estar associada a anemias aplásticas

e agranulocitose (BAR-OZ, et al., 2005).

1.1.2 Adifenina

A adifenina ou 2-(dietilamino) etil 2,2-difenilacetato (Tabela 1) tem como

principais propriedades farmacológicas as ações antiespasmódica e

parassimpatolítica. Apresenta efeitos periféricos fracos similares àqueles da atropina

26

associados a uma ação antiespasmódica direta e uma ação anestésica local, sendo

administrada para o alívio de espasmos viscerais. A ação relaxante da musculatura

lisa se deve a um mecanismo competitivo antagonista não específico da acetilcolina

pelo receptor de atropina e sua ação na musculatura lisa intestinal é explicada por um

efeito anestésico local, o qual interrompe os reflexos locais regulando assim, o tônus

e a motilidade intestinais. Em doses terapêuticas, a ação no tubo digestivo não

compromete os mecanismos secretórios do intestino (BROWN, et al., 1980,

LISADOR).

1.1.3 Prometazina

A prometazina ou N,N, -trimetil-10H fenotiazina-10 etanamina (Tabela

1), encontra-se no mercado sob as formas farmacêuticas de comprimidos, drágeas,

gotas, xarope, elixir, creme e solução injetável, podendo apresentar-se ainda na forma

de base livre ou de sal, e também associado ou não a outros fármacos (BADRA, 1991).

Como base livre, é insolúvel em água e, devido a isso, é utilizada geralmente como

sal, especialmente cloridrato, que se apresenta na forma de pó cristalino branco ou

levemente amarelado, inodoro, não higroscópico e de sabor amargo. Na forma de sal

é altamente solúvel em água, metanol, etanol e clorofórmio e praticamente insolúvel

em acetona, éter e acetato de etila (BRASIL, 2010). Pertencente ao grupo das

fenotiazinas, é considerado um potente anti-histamínico utilizado no tratamento de

distúrbios alérgicos, como anti-emético e como adjuvante à anestesia geral. A ação

anti-alérgica é apenas paliativa, pois mesmo diminuindo ou abolindo os principais

efeitos da histamina no organismo, atuando como inibidor competitivo dos sítios

receptores dessa substância endógena, não possui a capacidade de inativar ou

interferir em sua síntese ou liberação. Os efeitos da histamina são mediados por dois

tipos de receptores, denominados receptores H1 e H2. A prometazina é um fármaco

bloqueador de receptor H1 e por possuir propriedade sedativa promove sonolência

como efeito colateral quando empregada no tratamento sintomático de rinite alérgica

e urticária (DeLUCIA, 2014). Quando associada a dipirona ou outro analgésico auxilia

no controle na dor pelo efeito de sedação no pré e pós-operatório obstétrico

(LISADOR).

27

Tabela 1. Propriedades dos IFAs: ação farmacológica, massa molar, pka, log P e estrutura química.

1.1.4 Métodos analíticos farmacopeicos empregados em análises de dipirona

sódica, cloridrato de adifenina e cloridrato de prometazina

Para o doseamento do ativo dipirona sódica monohidratada (IFA) e nas

formas farmacêuticas solução oral e comprimido, a Farmacopeia Brasileira 5ª edição

recomenda a titulação com iodo em meio acidificado com ácido clorídrico a

temperaturas abaixo de 20º C utilizando-se amido como indicador (BRASIL, 2010). A

Farmacopeia Europeia 39ª indica o mesmo procedimento para o ativo (EUROPEAN

PHARMACOPEIA, 2017).

Para o cloridrato de prometazina (matéria prima) a Farmacopeia Brasileira

5ª edição fornece dois métodos para o doseamento. Pode-se dissolver o ativo em uma

mistura de ácido clorídrico e etanol e realizar titulação potenciométrica com hidróxido

de sódio verificando o volume gasto entre os dois pontos de inflexão; ou dissolver o

ativo em uma mistura de ácido acético glacial e acetato de mercúrio e titular com ácido

perclórico utilizando cristal violeta como indicador (BRASIL, 2010), sendo esse último

método indicado também pela Farmacopeia Americana 39ª edição (UNITED STATES

PHARMACOPEIA, 2016). A Farmacopeia Japonesa na 14ª edição indica o

28

doseamento do ativo dissolvido em uma mistura de ácido acético e anidrido acético

através de titulação potenciométrica com ácido perclórico (JAPANESE

PHARMACOPEIA, 2001). Para a forma farmacêutica comprimido, a Farmacopeia

Brasileira indica a técnica de espectrofotometria de absorção no ultravioleta em meio

acidificado com ácido clorídrico (BRASIL, 2010).

Nas farmacopeias mencionadas não há descrição de metodologia para

doseamento do cloridrato de adifenina, nem informações para a associação em

questão.

Todas as técnicas citadas são validadas, aceitas e indicadas nas

farmacopeias, porém quando se trata de associações medicamentosas, as técnicas

cromatográficas são as mais indicadas, por serem mais sensíveis e estarem

conectadas a detectores capazes de identificar compostos diferentes numa mesma

amostra. Entre as técnicas cromatográficas, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

é a mais utilizada em indústrias e laboratórios.

1.2 Evolução das técnicas cromatográficas

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e a Cromatografia Gasosa são

técnicas já consolidadas que desde a sua descrição estão em constante inovação

tornando as análises mais eficientes e rápidas. A cromatografia é uma técnica de

separação de componentes de uma mistura que envolve uma corrente de fluído em

movimento, chamada fase móvel e uma fase estacionária. Á medida que a fase móvel

transcorre a fase estacionária, os solutos são separados de acordo com a interação

destes com as fases, eluindo primeiro os que têm maior afinidade com a fase móvel e

em seguida, os que têm maior afinidade com a fase estacionária. Na GC, a fase móvel

é um gás transportador, normalmente inerte, que arrasta a amostra sobre a fase

estacionária, não participando do processo de separação. Apresenta instrumentação

fácil de manusear, ótima capacidade analítica devido à alta difusividade e baixa

densidade dos gases, separando diversos componentes de uma amostra com tempo

de análise variando de minutos a pouco mais de uma hora. Sua limitação está no tipo

de amostra a ser analisada, a qual deve ser volátil e termicamente estável. Pode-se

realizar a derivatização do composto, porém nem sempre é viável e as etapas de

preparação podem ser longas e complexas (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006).

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma das modalidades da

Cromatografia Líquida que consiste em separar amostras que estão distribuídas entre

https://pt.wikipedia.org/wiki/G%C3%A1shttps://pt.wikipedia.org/wiki/Inerte

29

as FE e FM, sendo essa última líquida. O aperfeiçoamento das FE com a diminuição

do tamanho das partículas permitiu um aumento significativo na eficiência da técnica

medida em número de pratos teóricos. Quanto maior o número de pratos teóricos/cm,

maior o número de etapas de equilíbrio entre as FE e FM e, portanto, melhor a

eficiência e separação. Seu emprego foi iniciado em meados de 1960 com intenção

de suprir as análises inviáveis pela GC (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006).

Em 1950, as colunas de HPLC continham o recheio de partículas

irregulares de 100 a 200 µm com eficiência de 200 pratos/15 cm. Em 1960, foram

incorporadas partículas peliculares rígidas de 40-50 µm resistentes à pressão, porém

com reduzida capacidade de amostra. Em 1970, surgiram as partículas com 10 µm,

aumentando significativamente a eficiência, entretanto por serem irregulares

comprometiam a reprodutibilidade (MALDANER, JARDIM, 2009). Entre as décadas

de 1980 e 1990 a eficiência alcançou 30000 pratos/15 cm com a introdução de

partículas esféricas não porosas de 1,5 µm e 1,7 µm para as porosas, elevando o

desempenho cromatográfico e permitindo melhores resoluções. A combinação entre

o uso de partículas menores e sistemas com alta pressão originou a Cromatografia

Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC - Ultra High Performance Liquid

Chromatography) (MALDANER, JARDIM, 2009).

O aprimoramento das partículas permitiu aumentar a eficiência, gerar picos

mais simétricos e reduzir o tempo de análise. A curva de van Deemter, representada

pela Equação 1, avalia a eficiência do sistema cromatográfico, e em particular, da

coluna cromatográfica, através de uma curva que relaciona a altura equivalente a um

prato teórico (H) e a velocidade linear da fase móvel (μ):

𝐻 = 𝐴 +𝐵

µ+ 𝐶µ Equação 1

Onde o termo A representa os caminhos distintos realizados pelo analito,

sendo menor com uso de partículas reduzidas e uniformes; o termo B refere se ao

tempo de permanência do analito na coluna e à velocidade linear da FM, sendo que

em velocidades maiores há diminuição na permanência do analito, aumentando a

eficiência e o termo C relaciona a transferência de massa do analito entre as FE e FM

(MALDANER, JARDIM, 2009).

Apesar da ampla aplicabilidade da Cromatografia Liquida é incorreto

afirmar que a mesma substitui a Cromatografia Gasosa. Ambas são complementares,

30

pois apresentam vantagens e limitações distintas, permitindo a análise de diferentes

tipos de amostras.

Com intuito de unificar o melhor das técnicas mencionadas (GC e HPLC) a

utilização de um fluído supercrítico como FM despertou interesse, gerando a técnica

denominada Cromatografia com Fluído Supercrítico (Supercritical Fluid

Chromatography, SFC). O estado supercrítico ocorre quando um composto é

aquecido e pressurizado a condições superiores ao seu ponto crítico, o qual determina

os limites em que as fases líquida/gasosa estão em equilíbrio. Um novo aquecimento

eliminará essa interface, originando o estado denominado supercrítico (NOVAKOVÁ,

et al, 2014). Os primeiros trabalhos com essa técnica utilizaram dióxido de carbono

(CO2) como fluído supercrítico. Klesper e colaboradores, em 1962, apresentaram bons

resultados através da separação de uma mistura de porfirinas (KLESPER, CORWIN,

TURNER, 1962), Sie e Rijnders, em 1967, avaliaram os efeitos da pressão sobre o

coeficiente de partição, permeabilidade e eficiência na separação em sistemas

cromatográficos (SIE, RIJNDERS, 1967a, 1967b). Em 1981, Novotny e colaboradores

introduziram colunas capilares em equipamentos semelhantes a um cromatógrafo a

gás. Essa inovação possibilitou o uso de gradiente de pressão, porém a vazão

modificava com a alteração da pressão (NOVOTNY, et al, 1981, NOVOTNY,

SPRINGTON, 1981).

Até 1982 o único constituinte da FM em SFC era o CO2 que devido à baixa

polaridade limitava a técnica a análise de compostos apolares, apresentando os

resultados mais satisfatórios na separação de enantiômeros. Em 1982, Gere e

colaboradores adicionaram um regulador de contrapressão em um HPLC que

viabilizou o controle individual da pressão e da vazão da FM. Esse fato possibilitou o

uso de modificadores orgânicos e aditivos, aumentando a seletividade da técnica e

permitindo a análise de compostos com polaridades diferenciadas (GERE, BOARD,

McMANIGILL, 1982). Alguns trabalhos como os de Cui e Olesik (CUI, OLESIK, 1995)

e os de Lee e Olesik (LEE, OLESIK, 1995) evidenciaram resultados positivos

referentes ao uso de misturas de solventes e CO2 na FM.

Os bons resultados desses estudos incentivaram o aprimoramento nos

equipamentos e nas FE possibilitando o surgimento da Cromatografia com Fluído

Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (UHPSFC – Ultra High Performance Supercritical

Fluid Chromatography) que associa o potencial da UHPLC com a SFC, permitindo

análises eficientes, rápidas e ecológicas, sendo uma alternativa promissora em

31

diferentes segmentos industriais e acadêmicos. Saito (2013), através de um

levantamento de publicações entre 1962 e 2012, evidenciou como o aprimoramento

na instrumentação incentivou o uso da técnica. De 1962 a 1982 o número de trabalhos

envolvendo SFC não ultrapassava os 100. A partir de 1984 houve um crescimento

expressivo de publicações alcançando mais de 800 em 2008 (SAITO, 2013).

Entre as técnicas cromatográficas mencionadas, a HPLC e a UHPSFC

foram as selecionadas para o desenvolvimento de métodos para doseamento dos

IFAs dipirona, cloridrato da adifenina e cloridrato de prometazina. A primeira por ser

uma técnica consolidada e amplamente utilizada para esse fim, e a segunda com

intuito de demonstrar a aplicabilidade para análise destes fármacos.

1.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – HPLC

O aprimoramento ao longo dos anos possibilitou o uso do HPLC em

diversas áreas, para análise de variados compostos. Nessa técnica a FM exerce papel

fundamental, pois além de arrastar os compostos pela FE, também participa do

processo de separação.

Fase móvel

A escolha da FM é importante para o sucesso da análise e alguns critérios

devem ser atendidos. O solvente deve possuir alto grau de pureza favorecendo a

detecção de compostos em baixas concentrações, solubilizar a amostra sem

decompô-la, apresentar baixa viscosidade aumentando a transferência de massas

entre as fases melhorando a eficiência, ser compatível com o detector escolhido e não

possuir absorção no mesmo comprimento de onda do analito em estudo (COLLINS,

BRAGA, BONATO, 2006).

A FM interage com os analitos através de ligações dipolo-dipolo, ligação

de hidrogênio, forças de Van der Waals ou forças dielétricas. Uma interação muito

forte diminui o fator de retenção (k) comprometendo a eficiência da separação, pois o

analito não interage com a FE.

Uma característica importante da FM é a força cromatográfica do solvente

que está relacionada com a polaridade da FE, pois quanto mais similar elas forem,

mais forte será a força. Quando a FE é mais polar que a FM a técnica é denominada

cromatografia líquida de fase normal, quando ocorre o contrário, ou seja, a FE é

menos polar que a FM, a técnica é conhecida como cromatografia líquida de fase

32

reversa. Quando há sobreposição de picos ou proximidade entre os mesmos pode-se

alterar a seletividade da FM, substituindo o solvente por outro de polaridade

semelhante para auxiliar a separação. Os solventes mais utilizados em cromatografia

em fase normal são éter metil terc-butílico, clorofórmio e cloreto de metileno. Os mais

frequentes em fase reversa são metanol, acetonitrila e tetraidrofurano (COLLINS,

BRAGA, BONATO, 2006).

Algumas análises precisam ser executadas em pH controlado, nessas

situações empregam-se solução tampão, onde o pH é determinado em função do pKa

do composto a ser separado, variando normalmente ± 1 unidade. Assim para

compostos ácidos, a solução tampão de pH menor que o pKa gera compostos

moleculares, e em pH maiores, compostos ionizados (ânions). O contrário acontece

com compostos básicos, se o pH for maior que o pKa formam-se espécies

moleculares, se for menor, espécies ionizadas (cátions). A solução tampão passa por

filtração eliminando possíveis partículas que possam entupir as conexões. Após a

análise, deve ser realizado um eficiente processo de limpeza no sistema

cromatográfico evitando a cristalização do componente do tampão. Independente das

características do solvente, todos devem ser desgaseificados antes do uso impedindo

a formação de bolhas (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006).

A eluição da FM pode ser isocrática ou gradiente. Na isocrática a força

cromatográfica permanece constante durante toda a corrida, é mais comum,

apresenta menor ruído na linha de base e é indicada em separações simples. Na

eluição por gradiente ocorre alteração da composição da FM no decorrer da

separação, é mais usual para misturas com compostos de diferentes polaridades e

estruturas químicas a fim de otimizar o tempo de corrida, com redução no fator de

retenção dos analitos (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006).

Fase estacionária (coluna)

A coluna é constituída por material inerte, usualmente aço inoxidável, de

diâmetro interno uniforme e capaz de resistir às pressões em que será usada. Sua

capacidade é determinada de acordo com o comprimento, diâmetro e material de

recheio. Apresenta nas extremidades um disco de teflon ou metal poroso, conhecido

como fritz, para evitar a perda do recheio ou mudanças na sua compactação.

A sílica é o recheio mais usual por apresentar algumas vantagens como

partículas pequenas e esféricas de diferentes diâmetros e tamanhos de poro,

33

partículas porosas com grande área superficial, elevada rigidez que permite o

emprego de altas pressões e a possibilidade de modificações na sua superfície devido

à presença de grupos silanóis reativos (TONHI et al, 2002). Quanto mais homogêneo

for o recheio melhor a eficiência da separação. O tamanho da partícula controla o

processo de difusão das moléculas da amostra ao penetrar e sair dos poros da

partícula. Quanto menor for o tamanho, menor será o tempo gasto pelo analito,

resultando em análises mais rápidas sem comprometer a eficiência (CEFET, 2017).

Instrumentação para HPLC

Um sistema de HPLC é constituído normalmente por reservatório, bombas

e programadores de fase móvel, sistemas de injeção de amostra, detector e

registrador de dados (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006; CEFET, 2017). Entre esses

componentes a bomba, injetor e detector devem ser destacados, principalmente em

separações de compostos complexos que envolvem a identificação de analitos

distintos. As bombas com programadores são responsáveis pelo envio da FM à FE e

permitem o uso de eluição por gradiente, geralmente aplicada aos compostos com

polaridades diferentes. O injetor introduz a amostra na coluna através de válvulas

manuais para amostragem ou a partir de sistemas de injeção automáticos. As válvulas

manuais são feitas de material inerte como aço inoxidável ou PTFE

(politetrafluoretileno). Os auto injetores são operados eletricamente ou com ar

comprimido, são precisos na injeção de volumes reduzidos e possibilitam a

programação de várias injeções sem necessidade do analista em tempo integral

(COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006). O detector é responsável por medir alguma

propriedade física ou físico-química da amostra. Quando o efluente sai da coluna e

chega ao detector, é gerado um sinal que normalmente é proporcional à concentração

do analito na amostra. O detector universal é normalmente empregado, pois identifica

diferentes tipos de analitos. O detector seletivo é restrito a uma determinada classe

de substâncias, sendo seu uso mais limitado (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006).

Diversos tipos de detectores são utilizados no HPLC como ultravioleta (UV), arranjo

de diodos (DAD), espectrometria de massas (MS - mass spectrometry), fluorescência,

índice de refração e ELSD (detector evaporativo por espalhamento de luz).

1.4 Cromatografia com Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência – UHPSFC

34

O fluido supercrítico é considerado uma fase contínua com propriedades

dos estados líquido e gasoso sendo obtido quando a interface que separa esses dois

estados deixa de existir, fato que ocorre em condições superiores ao ponto crítico

(equilíbrio), conforme demonstrado na Figura 1 (NOVAKOVÁ et al, 2014)

Figura 1: Diagrama de fases do dióxido de carbono (Adaptado Nováková et al, 2014).

A Tabela 2 apresenta alguns compostos que podem ser utilizados como

fluído e suas propriedades críticas (CARRILHO, TAVARES, LANÇAS, 2001).

Tabela 2. Propriedades físico-químicas de alguns compostos que podem ser utilizados em

cromatografia com fluído supercrítico (CARRILHO, TAVARES, LANÇAS, 2001).

Fluído Formula

molecular Temperatura crítica (°C)

Pressão crítica (atm)

Densidade crítica (dc)

Dióxido de Carbono CO2 31,3 72,9 0,47

Óxido Nitroso N2O 36,5 71,7 0,45

n-Pentano C5H12 196,6 33,3 0,23

Hexafluoreto de Enxofre

SF6 45,5 37,1 0,74

Xenônio Xe 16,6 58,4 1,10

Metanol CH3OH 240,5 78,9 0,27

Isopropanol C3H7OH 235,3 47,0 0,27

35

Um fluído supercrítico apresenta propriedades inerentes aos gases,

como a elevada difusividade e baixa viscosidade, e a dos líquidos, como alto poder

de solvatação e densidade. A baixa viscosidade (10- 3 poise) e o elevado coeficiente

de difusão do soluto permitem vazões elevadas e análises rápidas e eficientes. A

densidade e o poder de solvatação promovem boa solubilidade e transferência de

analitos, favorecendo detecção de uma gama maior de compostos (CARRILHO,

TAVARES, LANÇAS, 2001). A retenção dos compostos é complexa e influenciada

por uma série de fatores como temperatura, pressão, FE, propriedade do analito,

densidade e composição da FM, sendo difícil avaliar separadamente cada um deles.

A temperatura afeta a pressão de vapor, a densidade e a solubilidade do

soluto promovendo alterações na afinidade do mesmo pela FE. À pressão constante,

temperaturas elevadas aumentam a pressão de vapor e a solubilidade, diminuindo a

retenção, pois há maior concentração do analito na FM do que na FE. À temperatura

constante, o aumento da pressão promove elevação na densidade e poder de

solvatação diminuindo a retenção. Dentre os fatores citados, a relação

pressão/densidade é empregada para ajuste fino, pois acarreta pequenas alterações

na retenção, principalmente em misturas com CO2 e solventes orgânicos, devido à

baixa compressibilidade da FM (NOVÁKOVÁ et al, 2014; CARRILHO, TAVARES,

LANÇAS, 2001).

O uso do modificador orgânico promove alteração na temperatura e

pressão crítica, ocasionando alteração na solubilidade dos analitos, modificação na

retenção e formato de picos e pode causar separação de fases, o que é caracterizado

pela elevação de ruído na linha de base pela passagem da mistura gás-líquido no

detector (BERGER, 1991). Na região denominada subcrítica, onde a temperatura é

menor que a temperatura crítica, mas a pressão é mantida acima daquela considera

crítica não há relatos dessa possível separação de fases, sendo normalmente a região

mais empregada para o desenvolvimento analítico (NOVÁKOVÁ et al, 2014;

CARRILHO, TAVARES, LANÇAS, 2001).

A vazão escolhida também afeta a resolução dos analitos. Em SFC a

pressão é controlada e a vazão varia proporcionalmente afetando a separação de

diferentes maneiras. Pressão e vazão elevadas diminuem a resolução, pois podem

causar queda de pressão através da coluna (CARRILHO, TAVARES, LANÇAS, 2001).

Em 1986, Hirata e Nakata propuseram um sistema composto por 2 bombas de

pressurização, uma antes e outra depois do sistema injetor, coluna, detector. Esse

36

sistema possibilitou uma programação de pressão sem aumento de fluxo ou queda de

pressão (HIRATA, NAKATA, 1986). Atualmente esse desempenho é alcançado pelo

regulador de contra pressão (ABPR – Automated Backpressure Regulator).

Fase móvel e aditivos

A FM é constituída principalmente por CO2, um gás com condições críticas

brandas (pressão 74 bar e temperatura de 31 °C), considerado como um solvente

verde (LENARDÃO, et al, 2003) favorecendo análise de compostos termicamente

instáveis, é atóxico, inerte, de fácil aquisição e descarte, apresenta baixa absorção no

UV, é miscível com vários solventes orgânicos e possui custo relativamente menor

comparado a outros compostos (ALEXANDER, HOOKET, TOMASELLA, 2012). A

polaridade do CO2 é muito baixa, próxima ao do n-hexano, sendo utilizado puro

apenas nas separações de compostos apolares.

O aprimoramento dos equipamentos com o desenvolvimento de bombas

binárias possibilitou o uso de outros solventes na FM em porcentagens típicas de 1 a

40 %, com capacidade para alterar a densidade e a polaridade da FM, aumentando a

seletividade e solubilidade de compostos polares, diminuindo a precipitação dos

mesmos na coluna (LESSELIER, WEST, 2015). Essas alterações na FM melhoram o

formato dos picos reduzindo interações indesejáveis que ocorrem entre os analitos e

os grupos silanóis residuais da FE. Os silanóis residuais são receptores de hidrogênio

e normalmente interagem mais com os analitos do que com a FM. Porém, quando há

modificador doador de hidrogênio, como o metanol, etanol ou 2-propanol, a interação

deixa de ser com o analito e passa a ser com a FM, melhorando a simetria do pico. A

escolha do modificador é fundamental, pois características como constante dielétrica,

capacidade de ligações de hidrogênio, transferência de massa e viscosidade do

solvente são modificadas, influenciando na seletividade, ordem de eluição dos

compostos e resolução dos picos. A acetonitrila quando usada como constituinte da

FM promove aumento na retenção e gera picos assimétricos devido à pouca interação

com os silanóis, por não ser doadora de hidrogênio. Seu uso é raro, porém em

algumas situações para melhorar a seletividade, pode ser associada a um álcool

(NOVÁKOVÁ et al, 2014; BRUNELLI et al, 2008).

Em alguns casos, o modificador é insuficiente para promover picos

adequados, sendo necessário o uso de um aditivo. Aditivos são compostos ácidos,

básicos ou iônicos, escolhidos de acordo com o analito a ser analisado, que em

37

pequenas concentrações (tipicamente 1 %), podem melhorar a retenção, separação

e simetria por mecanismos sugeridos como alteração da polaridade da FE através da

ação sobre os sítios ativos, mudança na polaridade da FM aumentando seu poder de

solvatação e alteração no nível de ionização dos compostos levando à formação de

pares iônicos com os analitos. Para compostos ácidos normalmente se utiliza ácido

fórmico ou ácido cítrico e para os básicos, o emprego de dietilamina e trietilamina é

usual. Sais como acetato e formato de amônio são usados para compostos básicos e

possuem a vantagem de serem compatíveis com a espectrometria de massas (Mass

Spectrometry, MS). A água quando adicionada a um modificador orgânico aumenta a

capacidade de ligações de hidrogênio, melhorando o poder de solvatação, sendo

também compatível com a MS (NOVÁKOVÁ et al, 2014).

Alguns trabalhos evidenciam como o uso de modificador e aditivos

impactam no perfil cromatográfico. Em 2010, Ashraf-Khorassani e Taylor compararam

a separação de 4 nucleotídeos em uma coluna de piridina usando etanol como

modificador e os aditivos: água (5 %) e acetato de amônio (5 mM e 25 mM) isolados

e associados e demonstrou como os mesmos influenciam no tempo de retenção e o

formato dos picos. Os quatro compostos foram separados em todas as condições

testadas, com o melhor formato dos picos na condição etanol + 5 % água + 5mM

acetato de amônio (ASHRAF-KHORASSANI, TAYLOR, 2010). Em 2012, Perrenoud e

colaboradores realizaram um estudo com 92 compostos farmacêuticos de caráter

básico envolvendo diferentes FE e FM com e sem aditivo. Concluíram que o uso de

metanol e aditivos básicos como hidróxido de amônio foram necessários para eluição

dos compostos melhorando o perfil cromatográfico (PERRENOUD et al, 2012a).

Apesar dos benefícios, o uso de aditivos deve ser criterioso, pois alguns

podem eluir no decorrer da análise influenciando no ruído da linha de base (BERGER,

DEYE, 1991) ou interagir fortemente com a FE necessitando de processos de limpeza

mais demorados para sua remoção.

Fases estacionárias

A vasta faixa de polaridade dos solventes da FM permite o emprego de

fases estacionárias de distintas seletividades, desde as mais polares como as de

sílica, até as menos polares, como as de octadecil (C18). A escolha adequada da FE

é essencial, pois está relacionada aos diversos tipos de interações com o analito,

assim como a retenção dos mesmos ao longo da corrida cromatográfica. Para garantir

38

maior ortogonalidade são necessários alguns tipos de FE com diferentes seletividades

para através de um screening verificar quais as mais indicadas (LESSELIER, WEST,

2015).

Para elucidar a classificação das propriedades químicas das FE há um

diagrama “tipo aranha” (Spider diagram) criado a partir do modelo de parâmetro de

solvatação ou relação de energia linear de solvatação, que descreve as interações

soluto-solvente em termos dos parâmetros de acidez (A), basicidade (B), polaridade

(S), refração molar em excesso (E), volume de McGowan (V) e coeficiente de partição

gás-hexadecano (L). O diagrama apresentado na Figura 2 relaciona o tipo de

interação existente entre o analito e a FE e são representados pelos coeficientes e

(transferência de carga), s (dipolo-dipolo), a (ligação aceptora de hidrogênio), v

(dispersão) e b (ligação doadora de hidrogênio) (CARRILHO, TAVARES, LANÇAS,

2001; LESSELIER E WEST, 2015).

As colunas para SFC e UHPSFC possuem tamanho reduzido de

partícula (≤ 2 µm), possibilitam altas velocidades lineares da FM, melhoram o tempo

de análise, a resolução e a simetria dos picos.

39

Figura 2: Spider diagram - Natureza das colunas cromatográficas empregadas na UHPSFC

(adaptado Lesselier e West, 2015).

Instrumentação para UHPSFC

Um sistema de UHPSFC é constituído normalmente por reservatório,

sistemas de bombeamento e pressurização, regulador automático de contra pressão

(Automated Backpressure regulator - ABPR), sistema de injeção de amostra, sistema

de convergência, detector e registrador de dados (CARRILHO, TAVARES, LANÇAS,

2003; BERGER, 2015). Os componentes bomba, injetor, sistema de convergência e

detector devem ser destacados. Devido ao emprego de pressões elevadas é

necessário um maior controle no bombeamento e pressurização. Esses sistemas

devem ser resistentes à alta pressão, responder rapidamente a alteração da pressão

e manter o bombeamento da FM constante. O sistema de bombeamento é binário,

uma bomba para o solvente orgânico e outra para o CO2 que possui um resfriador

responsável por mantê-lo no estado líquido. O sistema de convergência ¨converge¨ o

CO2 gasoso e o solvente orgânico líquido em uma só fase, a qual percorre o sistema.

Os reguladores automáticos de contra pressão são responsáveis por controlar a

pressão em todo o sistema cromatográfico e estão localizados após a cela de

detecção, garantindo que a FM não chegue ruidosa (BERGER, 2015).

O equipamento de UHPSFC utilizado nesse trabalho foi fabricado pela

40

empresa Waters Corporation, patenteado em 2012 como UPC2 (Ultra Performance

Convergence Chromatography) e está representado na Figura 3. O termo

cromatografia de convergência indica a tendência em unificar a cromatografia gasosa

com a cromatografia liquida. O UPC2 foi lançando no mercado junto com FE de

partículas sub 2µm, eficiente sistema de resfriamento da cabeça das bombas de CO2

e um novo design de ABPR. Este equipamento apresenta vazão máxima de 4 mL

min-1 quando se usa apenas CO2 na fase móvel, pressão máxima de 6000 psi, forno

para colunas de 150 mm e quatro canais disponíveis para FM. O ABPR de dupla fase

consiste em uma fase estática que fornece uma contra pressão fixa, e uma dinâmica,

responsável pela pressão adicional, sendo a pressão total formada pela soma das

duas. Esse mecanismo confere maior estabilidade da pressão quando trabalhado no

modo gradiente. Possui detector DAD que inclui uma célula de UV de alta pressão,

mas também permite o acoplamento dos detectores ELSD e MS (NOVÁKOVÁ et al,

2014; WATERS).

Figura 3: Equipamento UPC2 da empresa Waters

Aplicações da técnica

Na literatura se encontram diversos trabalhos empregando o uso da técnica

de UHPSFC demonstrando a aplicabilidade da mesma (PERRENOUD et al, 2012b; LI

41

et al, 2013; TAGUCHI, FUKUSAKI, BAMBA, 2013; SAMIMI et al, 2014; NOVÁKOVÁ,

CHOCHOLOUS, SOLICH, 2014; DIPAS et al, 2014; LI et al, 2015; CAMACHO,

KASPRZYK-HORDERN, THOMAS, 2016). Perrenoud e colaboradores avaliaram 57

compostos hidrofílicos em três técnicas diferentes, LC-RP, HILIC (Hydrophilic

Interaction Liquid Chromatography), UHPSFC, e compararam os resultados. O estudo

demonstrou que as técnicas são complementares e que a UHPSFC apresenta grande

potencial para análise desse tipo de composto apresentando boa seletividade e

retenção (PERRENOUD et al, 2012b). Li e colaboradores aplicaram a técnica de

UHPSFC acoplada a um ELDS com emprego de coluna de tamanho de partícula

reduzido na separação e quantificação de vários triterpenos presentes em uma

complexa matriz vegetal de Rosa sericea (LI et al, 2013). Taguchi e colaboradores

empregando UHPSFC-MS/MS separaram e quantificaram 25 ácidos biliares em ratos

demonstrando que a técnica é satisfatória para separação de compostos polares e

apolares (TAGUCHI, FUKUSAKI, BAMBA, 2013).

Em 2014 Samimi e colaboradores avaliaram através da UHPSFC acoplada

ao ELSD a separação de 6 compostos presentes no extrato de Ginseng empregando

os aditivos ácido trifluoracético

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