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ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas; PRINCIPAIS TIPOS:
INDIRETO: Detecta principalmente Ac
SANDUÍCHE: Detecta principalmente Ag
COMPETIÇÃO: Detecta Ag com baixo peso
molecular
(monovalentes)
CAPTURA: Detecção de Acs (principalmente IgM,
evitando a ação do fator reumatóide).
Ac conjungado
com biotina
Amostra contendo
Ag
Avidia +
peroxidase
Substrato
Kit ELISA IL-1
Placa 96 poços revestido com Ac
Padrão liofilizado + diluente
Reagente de detecção A + diluente
Reagente de detecção B + diluente
Substrato TMB
Tampão de lavagem
Solução Stop
A placa do kit foi pré-revestido com um anticorpo monoclonal específico para IL1;
Amostras são então adicionados aos poços;
Depois o anticorpo policlonal conjugado com biotina, anticorpo específico para a preparação IL1;
Em seguida, avidina conjugada com peroxidase (HRP) é adicionado a cada microplaca e incubadas.
Pra finalizar, uma solução de substrato TMB é adicionada a cada poço.
Apenas os poços que contêm IL1, anticorpo conjugado com biotina e avidina conjugado com enzima irá apresentar uma mudança de cor.
A reação enzima-substrato é terminada pela adição de uma solução de ácido sulfúrico e a mudança de cor é medida espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 450 nm ± 10 nm.
A concentração de IL1 nas amostras é em seguida, determinada por comparação do OD das amostras para a curva padrão.
Materiais necessários
Leitor
Pipetas de precisão
Ponteiras descartáveis
Eppendorf para amostras de diluição
água destilada
Papel absorvente
Recipiente para solução de lavagem
Preparação das amostras Reconstituir a solução padrão com 1mL
do diluente e agitar suavemente;
A concentração dessa solução é 1000pg/mL. Colocar 0,5mL de diluente nos 8 tubos.
Procedimento
Preparar sete poços para o padrão e um para
o branco.
Adicionar 100µL de cada solução padrão, do
branco e das amostras nos poços. Cubrir com
o vedante de placa. Incubar durante 2 horas
a 37oC.
Preparação das amostras
Preparar o diluente A e B: 6mL do diluente
(2x) com 6mL de agua destilada:
Solução de diluição A: 12mL
Solução de diluição B: 12mL
Preparar os reagente A e B na diluição
1:100
Reagente A Sol. Diluição A (diluente + agua)
1 100
1:100
Solução de lavagem:
20mL da solução de lavagem + 580mL de
água destilada
Procedimento
Preparar sete poços para o padrão e um para
o branco.
Adicionar 100µL de cada solução padrão, do
branco e das amostras nos poços. Cubrir com
o vedante de placa. Incubar durante 2 horas
a 37oC.
Retirar o líquido de cada poço, não lavar.
Adicionar 100µL da solução de detecção A
em cada poço e incubar durante 1 hora a
37oC depois de cobrir com o vedante de
placa
Aspirar e lavar com 350µL com solução de lavagem;
Adicionar 100µL da solução de detecção B em cada poço. Incubar durante 30 minutos a 37oC e depois cobrir com o vedante de placa.
Repetir a aspiração e lavagem
Adicionar 90μL de Substrato e Incubar por 15 - 25 minutos a 37oC.
Adicionar 50μL de solução de paragem em cada poço. O líquido ficará amarelo com a adição de solução de paragem.
Em seguida, execute o leitor de microplacas e medição a 450 nm imediatamente
Procedimento
Observações
Adicionar cuidadosamente amostras aos poços
e misturar suavemente para evitar a formação
de espuma.
O tempo total para a adição de distribuição de
reagentes ou amostras para a placa de ensaio
não deve exceder 10 minutos.
Para evitar a contaminação cruzada, mudar as
ponteiras entre as adições de cada nível
padrão, entre as adições de amostra e de
reagente
O tempo de incubação e a temperatura
devem ser observados.
O procedimento de lavagem é crítico. A
remoção completa do líquido em cada
passo é essencial para a boa desempenho.
Após a última lavagem, remover qualquer
solução de lavagem remanescente, remover
qualquer gota de água e de impressões
digitais na parte inferior da placa.
Lavagem insuficiente resultará em má
precisão e leitura de absorbância
falsamente elevado
Observações
Cálculo dos resultados
Média das leituras em duplicata para cada
padrão, controle e amostras;
Criar uma curva padrão em log, gráfico com
concentração IL1 sobre o eixo y e
absorbância no eixo x.
Desenhar a melhor reta através dos pontos
padrão e pode ser determinada por análise
de regressão.
Se as amostras foi diluída, a concentração lida
a partir da curva padrão deve ser
multiplicada pelo fator de diluição.
Sensibilidade e especificidade
SENSIBILIDADE
A dose mínima detectável de IL1 canino é menor
do que 7.3pg/mL
ESPECIFICIDADE
Este ensaio tem uma alta sensibilidade e
especificidade excelentes para a detecção de IL1
canino. Não significativa reatividade cruzada ou
interferência entre IL1 caninos e análogos foi observada.
Nota:
Limitada por habilidades e conhecimentos atuais,
é impossível para nós completar a detecção de
reatividade cruzada entre IL1 canino e todos os
análogos, portanto, reação cruzada, podem ainda existir
