Detecção de vírus

Profa. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Instituto Biomédico

Universidade Federal Fluminense

[email protected]

VIROLOGIA GERAL

III Curso de Atualização

Microbiologia e Parasitologia no Contexto Atual

Introdução ao estudo dos Vírus

• 1884 Chamberland (filtração)

• 1892 Iwanowski

• 1898 Beijenrinck

“Vírus do mosaico do tabaco”

Filtrabilidade dos vírus: material filtrado

continha um veneno dissolvido de poder

extraordinário ou um agente descohecido tão

pequeno que era capaz de atravessar os poros

de um filtro que retinha bactérias

Vírus = Latim: Veneno

1 micron

Bactéria (Staphyllococcus aureus)

m ↓

cm 10-2m ↓

mm 10-3m ↓

µm 10-6m ↓

nm 10-9m ↓

Ǻ 10-10m

Características dos vírus:

• Pequenos (20 a 250 nm de diâmetro)

Microscópio eletrônico

Coloração negativa: AMOSTRA + corante de alta densidade eletrônica (ácido

fosfotungstico) grade de carbono microscópio o feixe de elétrons não

penetra no corante, mas sim no material orgânico, que aparece claro sobre um

fundo escuro.

Herpevírus

Microscopia eletrônica (ME)

uic.igc.gulbenkian.pt www.sciencedaily.com

http://uic.igc.gulbenkian.pt/micro-em.htm


• Parasitas Intracelulares Obrigatórios

Métodos

de

estudo

dos

vírus

Cultura de células: 1949: Enders et al. propagação de poliovírus em cultura primária de célula humana

1933: isolamento de vírus Influenza suíno em ovo embrionado

www.molvis.org

alittleaboutvirology.blogspot.com

http://alittleaboutvirology.blogspot.com/


• Constituição básica: proteína + ácido nucleico

enzimas

podem ter lipídeos

carboidratos


• Possuem uma única espécie de ácido nucleico: DNA ou RNA

Vírus DNA:

DNA dupla fita linear

Adenovírus

Herpesvíus

Poxvírus

DNA simples fita linear

Parvovírus

DNA dupla fita circular

Papilomavírus

DNA simples fita circular

Circovírus


• Possuem uma única espécie de ácido nucleico: DNA ou RNA

Vírus RNA:

RNA simples fita linear

polaridade (+) polaridade (-) polaridade (+)

Picornavírus Paramixovírus Retrovírus

Coronavírus Rabdovírus

Flavivírus

RNA simples fita segmentado RNA dupla fita segmentado

polaridade (-)

Ortomixovírus Rotavírus

TR

= transcriptase (RNA polimerase )

Icosaedro: 20 faces (cada face 1 triângulo equilátero)

12 vértices (cantos)

Simetria icosaédria (cúbica) Capsídeo:

www.web-books.com

hexons

pentons

cada face 3 unidades idênticas 60 sub-unidades capsômeros

Base do Penton

fibra

Adenovírus www.web-books.com

www.erain.com

Capsídeo: Simetria helicoidal

Capsídeo: Simetria complexa

Poxvírus

http://microbialuniverse.blogspot.com.br/2012/01/virology.html

Bacteriófagos

www.elu.sgul.ac.uk

www.poxvirus.org

www.mansfield.ohio-state.edu

NUCLEOCAPSÍDEO

(todos)

Genoma DNA ou RNA Informação genética

Infectividade

Capsídeo

Proteínas

Proteção do genoma

União a receptores celulares

Determinantes antigênicos

ENVELOPE

(alguns)

Lipídeos

Glicoproteínas virais

União a receptores celulares

Determinantes antigênicos

Estrutura de um virion (partícula viral completa):

Estrutura da partícula viral:

Vírus não envelopado: genoma + capsídeo

Vírus envelopado: genoma + capsídeo + envelope com glicoproteínas

Simetria do Capsídeo:

Icosaédrico (cúbico) Helicoidal (espiral)

nucleocapsídeo

Estabilidade da partícula viral:

• Temperatura

• pH

• Solventes de lipídeos e detergentes vírus envelopados

• Hipoclorito de sódio proteínas

• Formaldeído proteínas

• Luz UV genoma

1966 Comitê Internacional de Taxonomia Viral: Classificação dos vírus em famílias:

Família: - viridae

Sub – família: - virinae

Gênero: - vírus

Ác. Nucleico

Simetria do capsídeo

Envelope Tamanho Tipo Ac. Nucleico

Família Virus

DNA

Icosaédrica Ausente 50nm fita dupla circular

Papilomaviridae Papiloma

Presente 100nm fita dupla linear

Herpesviridae Herpes

RNA Icosaédrica Ausente 20nm fita simples linear (+)

Picornaviridae Poliomielite

80nm fita dupla segmentado

Reoviridae Rotavirus

Presente 40nm fita simples linear (+)

Flaviviridae Dengue Febre amarela

Presente

100nm fita simples (+) linear diplóide

Retroviridae HIV

Helicoidal Presente

100nm fita simples linear (+)

Coronaviridae Coronavírus

150nm

200nm

fita simples linear (-)

Rhabdoviridae

Paramyxoviridae

Raiva

Sarampo

100nm fia simples (-) segmentado

Orthomyxoviridae Influenza

Replicação Viral

http://encarta.msn.com/

1. Adsorção

2. Penetração

3. Desnudamento

4. Replicação

5. Maturação

6. Liberação

Fases da replicação viral:

União do vírus ao receptor celular

Receptores: proteínas, carboidratos ou lipídeos na

membrana celular

Suscetibilidade celular presença de receptor

1. Adsorção

Vírus não envelopado Vírus envelopado

Entrada do vírus na célula

• Translocação: passagem direta da partícula viral através

da membrana celular

• Endocitose mediada por receptor: vírus envelopados

vírus não envelopados

• Fusão: somente para vírus envelopados

2. Penetração

2. Penetração

Endocitose mediada por receptor: vírus envelopados

www.rsc.org

Membrana da célula forma uma vesícula ao redor do vírus

Vesícula funde com endosoma

vírus no endosoma

Fusão do envelope do vírus com membrana do endosoma

Após adsorção

Nucleocapsídeo viral no citoplasma

2. Penetração

Endocitose mediada por receptor: vírus não envelopados

microbiologybytes.wordpress.com

Após adsorção

Membrana da célula forma uma vesícula ao redor do vírus

Vesícula funde com endosoma

vírus no endosoma Desestruturação do capsídeo viral

Genoma viral no citoplasma

2. Penetração

Fusão do envelope do vírus com a membrana celular: somente

para vírus envelopados

pathmicro.med.sc.edu

Após adsorção

Fusão direta do envelope do vírus com a membrana celular

Nucleocapsídeo viral no citoplasma

3. Desnudamento ou Decapsidação

Refere-se a separação física das proteínas do capsídeo e genoma

viral. Após o desnudamento o genoma viral fica livre no citoplasma

ou núcleo da célula para o processo de replicação viral.

http://www-micro.msb.le.ac.uk/109/structure.html

4. Replicação

• Formação de novas cópias do genoma viral

• Síntese das proteínas virais: enzimas associadas ao genoma

proteínas de capsídeo

glicoproteínas de envelope

Adsorção

Penetração Decapsidação Replicação Síntese de prot Montagem

Liberação

Vírus RNA

Adsorção

Penetração Decapsidação Replicação Síntese de prot Montagem

Liberação

Vírus DNA

citoplasma

núcleo

citoplasma

núcleo

4. Replicação

Genoma viral

Transcrição dos genes precoces RNAm early

Proteínas fase precoce (early): proteínas não estruturais

- param a síntese de ácido nucleico e proteínas celulares

- regulam a expressão do genoma viral

- enzimas requeridas para a replicação do genoma viral

Replicação do genoma

Transcrição dos genes tardios RNAm late

Proteínas fase tardia (late) proteínas estruturais

4. Replicação: de acordo com o tipo de ácido nucléico os vírus utilizam

diferentes estratégias para assegurar a replicação do genoma e a síntese de

proteínas virais, confome o esquema abaixo:

varuncnmicro.blogspot.com -

transcrição

atua como fita RNA (-) com

transcriptase associada

A partir da fita RNA (-) com transcriptase

associada formação

do provirus intermediário replicativo

T = transcripase (RNA polimerase RNA dependente) TR = transcriptase reversa (sintetiza DNA a partir de genoma RNA – retrovírus)

http://varuncnmicro.blogspot.com/2012_04_01_archive.html

http://varuncnmicro.blogspot.com/2012_04_01_archive.html

5. Maturação ou Montagem

Proteínas estruturais se associam espontaneamente

capsômeros capsídeo viral onde o ácido nucleico é inserido

6. Liberação

Vírus não envelopados: Lise da célula

Vírus envelopados: Brotamento envelope da membrana celular

Exocitose envelope de membranas internas

6. Liberação de vírus não envelopados: Lise Celular

Flores, E.F. Virologia Veterinária, 2007

6. Liberação de vírus envelopados: Brotamento

Vírus adquire o

envelope da

membrana

celular com as

glicoproteínas

virais inseridas

Síntese das proteínas

não glicosiladas

ribosomas livres no

citoplasma

Síntese das glicoproteínas

ribosomas associados ao RER

Transporte das

glicoproteínas para a

membrana Golgi

Proteínas se associam ao genoma viral

glicoproteínas

na membrana

Genoma viral Nucleocapsídeo

RNAm

proteínas

Proteínas estruturais

Proteínas não estruturais (enzimas)

Duplicação do genoma

(1)

(2)

glicoproteínas

proteínas

Lise celular

Brotamento

1. Adsorção

2. Penetração

3.Decapsidação 4. Replicação

5. Maturação ou Montagem

6. Liberação

Ação dos antivirais

Vírus Influenza HIV

Patogenia das Viroses

Resposta do Hospedeiro às Infecções Virais

Patogenia das viroses

Penetração Disseminação Replicação Lesão Doença

Características do vírus: Virulência Dose

Características do hospedeiro: Genética

Idade

Estado nutricional

Estado hormonal

Estado imunológico

Patogenia: mecanismos pelos quais os vírus induzem doença no hospedeiro

Portas de entrada: Pele

www.prints-online.com

www.prints-online.com

mordedura de animal raiva

inoculação por seringas retrovírus

picada de artrópode dengue

Portas de entrada: Mucosas

Trato respiratório

www.nursingunlimited.com

Trato gastrointestinal

Adaptado de Monreno-Espinosa et al. Semin Pediatr Infect Dis 2004: 15(4): 37-245.

Portas de entrada: Mucosas

Trato genital

Transmissão vertical: in utero

Vírus pode causar:

Infecção localizada Infecção disseminada

Viremia Neuronal

• Limitada à proximidade do sítio de penetração e replicação primária

• Não faz viremia

Transporte no sangue: vírus livre ou associado à célula

cc

cc

Contágio Aquisição Local de

replicação primário

Local de replicação secundário

Tecido-alvo

Disseminação neuronal

VIREMIA primária

Sistema nervoso central

Replicação no SRE baço, fígado, medula óssea

VIREMIA secundária

Cérebro Pele Pulmões Órgãos Glândulas Etc.

contágio aquisição

Replicação no local primário

Respiratórios Entéricos Herpes Papiloma

Vetor artrópode Arbovírus

HIV

HBV

Reposta do Interferon Anticorpos hospedeiro Defesas locais resposta imune não imunes mediada por células

Período de incubação Sintomas específicos Período prodrômico

(sintomas inespecíficos)

Inespecíficos: barreiras físico-químicas

Interferons

Específicos: Resposta Imune

Mecanismos de resistência do hospedeiro:

Flores, E.F. Virologia Veterinária,

2007

Componentes:

Interferon tipo 1 (IFN-I)

Sistema complemento

Células:

- Células dendríticas (DCs)

- Macrófagos

- Células NK (natural killer)

Resposta imune Inata (natural ou inespecífica)

Mecanismo de ação dos Interferons e

Estado de resistência antiviral: inibição da síntese proteica degradação de mRNA

Sistema Complemento

C5b associado ao vírus pode iniciar uma

nova sequência de reações que resulta na

participação de outros componentes do

complemento e na formação do complexo

de ataque à membrana (MAC) MAC

cria poros no envelope lipídico lise do

vírus ou de células infectadas

- Reconhecem a baixa expressão de MHC I em

células infectadas

- atividade citotóxica: liberam grânulos que

contém perforinas e granzimas, que induzem a

apoptose da célula alvoc

Células Natural Killer (NK):

Mecanismos efetores da imunidade inata:

IFN-1

1) Célula infectada por vírus

2) produção de IFN-1

3) IFN-1 atua sobre as células vizinhas estado antiviral

4) IFN-1 estimula células NK

5) IFN-1 estimula células dendríticas

6) IFN-1 estimula Linf Tc

7) IFN-1 estimula atividade fagocítica dos macrófagos

8) Ativação do complemento

9) Complemento ativam Macrófagos

10) e 11) Complemento opsoniza vírus facilitando a fagocitose

12) Complemento Lise de Vírus envelopado

Células dendríticas (DC):

Dcs sao células mononucleares que

estão nos tecidos periféricos (pele,

TGI e Trato respiratorio) onde

capturam, fagocitam antigenos e

dirigem-se a órgãos linfoides

secundários onde apresentam para

linfócitos B e T.

Resposta imune Adaptativa

Componentes:

Células T:

Linfócitos T auxiliares Linfócitos T citotóxicos

(CD4+) Th1 / Th2 (CD8+)

Linfócitos B

plasmócito

Th

Th ativado

Linfócito T citotóxico

Linfócito B

lise de célula infectada

anticorpos

Th = linfócito T auxiliar

Resposta imune Adaptativa

IgG

Resposta Imune humoral no controle das infecções virais

Anticorpos neutralizantes

www.nature.com

Resposta Imune humoral no controle das infecções virais

(c) Lise do vírus pela

ativação do complemento

(c) Fagocitose:

pela ativação do

complemento (b)

(d)

Anticorpos importantes no controle da infecção viral: • IgM: marcador de infecção aguda

diagnóstico de infecção congênita

• IgG: imunidade à reinfecção

resposta vacinal

• IgA: imunidade de mucosa

(trato respiratório, trato gastrointestinal)

www.panbio.com.au

Tipos de Infecção

Tipo de infecção

Replicação do vírus

Transmissão Resposta Imune

Sintomas Manifestação da infecção

Exemplo

Aguda (clinicamente aparente)

sim sim

sim

sim

doença Influenza

(gripe)

Sub-clínica (inaparente)

sim sim sim não assintomática Febre aftosa

Latência

1ª infecção

Latência Latência

Recorrência Recorrência

Tipo de infecção

Replicação do vírus

Transmissão

Resposta Imune

Sintomas

Exemplo

Persistente

sim sim sim sim ou

não

resposta imune não elimina o

vírus do organismo

Retrovírus

Latente não não sim não resposta imune não impede

Herpesvírus

Recorrência sim sim sim sim a latência

Tipos de infecção persistente:

Infecção Latente

Replicação viral transmissão

www.respig.com

Infecção congênita: mãe soronegativa na época da infecção

Depende da época da gestação em que ocorre a infecção

Diagnóstico laboratorial das viroses

(

Confirmação do diagnóstico clínico infecções com sinais clínicos

confundíveis: gastrenterites;

Necessidade de confirmação de uma infecção devido às sérias

implicações que a mesma pode ter para o paciente: AIDS, hepatites,

rubéola gestacional;

Na seleção de doadores de sangue: hepatites B e C, AIDS.

Quando o tratamento é possível: infecções herpéticas, AIDS e

hepatite C;

Durante surtos epidêmicos adoção de medidas profiláticas

adequadas (vacinação, combate a vetores, etc.). Ex: febre amarela,

dengue, sarampo, raiva, entre outras;

Na avaliação da imunidade artificialmente induzida após

vacinação: pesquisa de anticorpos da classe IgG;

Na busca de um agente etiológico de uma dada doença, seja ela

nova ou não. Ex: Coronavírus da SARS, Influenza (gripe).

Por que e quando solicitar o exame laboratorial de uma virose?

Diagnóstico Laboratorial das Viroses

Métodos diretos:

Detecção do vírus na amostra clínica

Métodos indiretos:

Detecção de anticorpos no soro do paciente

Métodos clássicos (isolamento viral)

Métodos rápidos

O que coletar ?

Amostras clínicas do paciente: depende do tropismo do vírus

suspeito e da fase da doença

- Doença localizada no trato respiratório

- Doença localizada no trato genital

- Doença localizada no trato gastrointestinal

- Doença localizada na pele

Amostras ambientais

Alimentos

Detecção do vírus na amostra clínica

Infecção respiratória: aspirado de nasofaringe

Amostra clínica para detecção do vírus

http://ptxiv.blogspot.com/2009/10/should-

color-of-nasal-discharge-dictate.html

Infecção entérica: Fezes

Infecção no trato genital

- Suabes genitais

- Tecidos, placenta, fetos abortados

Herpes genital

www.colegiosaofrancisco.com.br www.stanford.edu


Herpes labial

http://www.dermatologia.net/novo/base/

doencas/herpeslabial.shtml

Infecção na pele:

- Suabe (Líquido das vesículas)

- Papilomas (verrugas)

www.dermatologia.net

Verruga vulgar


Infecção no SNC:

Raiva: morcego cérebro

Doença sistêmica: tecidos afetados

(depende dos sinais clínicos, fase da doença)

Morte do paciente: qualquer tecido

Coleta e envio do material para o laboratório

Todo material deve ser acompanhado de uma FICHA contendo:

• Identificação do paciente:

nome

idade

dados clínicos: dias de doença, sinais clínicos

histórico de vacinas (nome da vacina, data de vacinação)

• Data da coleta da amostra clínica

Matrizes ambientais: Água de consumo humano (Mineral),

Água de reuso (águas residuárias),

Água de recreação (lagoas, rios, piscinas, praias)

Água de lastro;

Águas subterrâneas;

Lodo e sedimentos;

Superfícies

Virologia Ambiental

Vírus em alimentos

Diagnóstico Laboratorial das Viroses

Métodos diretos:

Detecção do vírus:

Métodos clássicos: Isolamento do vírus

Métodos rápidos

INOCULAÇÃO EM OVOS EMBRIONADOS

Embrião em desenvolvimento: ideal para multiplicação de vírus

Requisitos

- Livres de contaminação

- Viabilidade

- Idade ideal

Utilizados para: Isolamento de vírus Diagnóstico

Produção de vacinas

Vantagem: Obtenção do agente viável (vírus infeccioso)

classes.midlandstech.edu

Membrana corioalantoide: Herpesvírus, Poxvírus

Cavidade alantoide: Influenza Vírus da Doença de Newcastle

Saco da gema

Cavidade amniótica

Vias de inoculação em ovos embrionados

Isolamento vírus aviários:

Influenza

Vírus da Doença de Newcastle

Propagação de vírus Influenza humano

Preparação de vacinas

Inoculação na cavidade alantoide

OVOS EMBRIONADOS

Reação de hemaglutinação (HA):

HA

Vírus Influenza

http://www.springerlink.com/content/4786735395530u38/fulltext.pdf

OVOS EMBRIONADOS

Inoculação na cavidade alantoide

Reação de inibição da hemaglutinação (HI): Identificação do vírus isolado

Inoculação na membrana corioalantoide

Isolamento e propagação de vírus

que produzem lesões – pocks - nesta

membrana (poxvírus e herpesvírus)

www.anicon.eu

Focos esbranquiçados pocks

OVOS EMBRIONADOS

Produção de vacinas

http://www.rnceus.com/flu/vaccine.html www.vaccinews.net

OVOS EMBRIONADOS

Cultura de células é o termo utilizado para se referir às células

quando estas estão sendo cultivadas in vitro .

As cultura de células podem ser utilizadas para :

isolamento e identificação do agente confirmação do

diagnóstico clínico

preparo de massa viral vacinas

Cultura de células (CC)

Vantagem: Obtenção do agente viável (vírus infeccioso)

CULTIVO CELULAR

Cultura de células primárias

- estabelecidas diretamente a partir do tecido fresco

- baixa resistência a repiques morrem após 2 ou 3 passagens

Estufa 37°C

MEM

+

Soro

Linhagem de células

Diploide

Contínua

Passagem das células

Linhagem diploide Linhagem contínua

Origem Células de cultura primária que resistiram ao repique

Tumores ou tecido normal (diplóide) transformado in vitro.

Cariótipo Diploide Aneuploide (n, 3n, 4n, etc)

Vantagens Isolamento e propagação de vírus

Preparo de vacinas

Propagam indefinidamente in vitro perderam a inibição de contato

Muito utilizadas no isolamento de vírus para diagnóstico, pois podem ser mantidas no laboratório através de repiques sucessivos

Desvantagens Resistem 50 passagens

Contaminação com vírus adventícios

Contaminação com vírus adventícios

Microscópio invertido

fibroblastos Células epitelióides

Processamento do material para inoculação em Cultura de células (CC)

Amostra clínica

tratamento com antibiótico

+ antimicótico

Maceração,

homogeneização,

centrifugação

inoculação em CC

Replicação viral em cultura de células

Monitoramento

Observação da CC ao microscópio observar efeito citopático(CPE)

Efeito citopático: alterações morfológicas que ocorrem na célula devido a replicação viral

picnose nuclear: células pequenas, arredondadas e soltas do tapete

Ex. picornavírus

formação de sincícios: células gigantes, multinucleadas

Ex. Vírus respiratório sincicial, herpesvírus

Formação de Corpúsculos de Inclusão: Corpúsculo de Negri (raiva)

Efeito citopático ???

Vírus Influenza em CC

Detecção e identificação de vírus em CC: técnicas imunológicas

Reação de Imunofluorescência (IF)

Métodos diretos de diagnóstico: Detecção do vírus

Amostra clínica

Métodos rápidos

Métodos clássicos

Inoculação

Ovos embrionados Cultura de células

Detecção de vírus

Microscopia eletrônica (ME) Reações Imunológicas:

Imunofluorescência (IF)

Ensaio Imunoenzimático (EIE)

Imunoperoxidase (IP)

Detecção do genoma viral:

Reação de hibridização

Reação em cadeia pela polimerase (PCR)

Métodos rápidos

Métodos rápidos: Observação da partícula viral


Observa a morfologia do vírus

Alta concentração de vírus : 106 – 108 partículas virais/ml

Amostras para diagnóstico:

- cutâneas: líquido vesicular (herpesvírus)

verrugas (papilomavírus)

- material fecal (rotavírus )

Imunomicroscopia:

amostra clínica + soro imune coloração negativa

www.Virology.net/Big-Virology/BVRNAreo.html

Detecção de Ag virais no interior das células:

- aspirado de nasofaringe

- Corpúsculos de Negri Raiva

Marcador da reação Ag – Ac é um corante fluorescente

(isotiocianato de fluoresceína , rodamina).

Reação de Imunofluorescência (IF): detecção de vírus

Anticorpo marcado

Célula infectada por vírus respiratório

Teste positivo para vírus da raiva

Vantagens: alta sensibilidade, reagentes estáveis, manual ou

automatizada

Detecção de Ag virais: rotavírus, astrovírus

Princípio básico: imobilização de um dos reagentes em uma fase

sólida (p.ex. poliestireno), enquanto que o outro reagente é ligado

a uma enzima

Marcador da reação Ag-Ac é uma enzima (peroxidase, fosfatase

alcalina).

Leitura se baseia no desenvolvimento de cor: A degradação do

substrato cromogênico pela enzima dá origem a produtos solúveis

coloridos (leitura da D.O. em espectrofotômetro)

Pode testar um grande número de amostras


Ac de

captura

Ag viral

Ac de

captura

Ac de

captura

Ac de

captura

Amostra clínica Amostra clínica

Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de vírus

Anticorpo marcado com enzima conjugado Anticorpo marcado com enzima conjugado

Substrato Substrato

Desenvolvimento

de cor positivo

Ausência de cor

negativo

Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de vírus

Leitor de microplaca: ELISA quantitativo

cut – off = Média das D.O. dos controles negativos X 2.1

Amostras com DO > cut-off positivas

Amostras com DO < cut-off negativas

Imunoperoxidase (IP): detecção de vírus

Detecção de Ag virais em tecidos ou células

Ac específico marcado com uma enzima (peroxidase)

desenvolvimento de cor

Preparações permanentes observa ao microscópio ótico.

Detecção de vírus

Detecção do genoma viral:

Métodos rápidos

Reação em cadeia pela polimerase (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Método para produzir cópias de um segmento de DNA específico

PCR amplifica uma

seqüência alvo

Reação da Polimerase em Cadeia: detecção de vírus

Polimerização é feita por uma DNA polimerase termoestável

(Taq polimerase)

São utilizados dois “primers” (iniciadores), que delimitam o

segmento amplificado

Triagem X Tipagem

Sensibilidade : 10 cópias de genoma

DNA polimerase

Reagentes da PCR

Primer Sense

Primer Antisense

DNA molde

Extração prévia do DNA

Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus

Reação no Termociclador:

PCR: ciclos

1º ciclo 2º ciclo

3 passos na reação que são repetidos de 30 a 40 vezes CICLOS

1o passo desnaturação: 94oC por 30 seg


Primer sense: se liga a fita antisense

Primer Antisense: se liga a fita sense

2o passo anelamento dos primers 55oC


3o passo extensão a 72oC: temperatura ótima para Taq polimerase

Incorporação de 35 a 100 nucleotídeos por segundo

Como ambas as fitas são copiadas durante a PCR, há um aumento exponencial do

número de cópias do gene. Por exemplo: se há 1 cópia do gene antes da reação

iniciar, após o 1o cliclo serão 2 cópias, após 2 ciclos serão 4 cópias, 3 ciclos serão 8

cópias e assim por diante.


http://palmer-dna-technology-wikis.wikispaces.com/Leah+Vander+Vorst


? ?

? ?

?


http://www.clker.com/clipart-11526.html

Eletroforese em gel de agarose: visualização do produto da PCR


Visualização das bandas no gel Coloração com brometo de etídio O brometo de etídio é um intercalante de DNA


Marcador de PM

Produtos da reação

PCR precedida pela transcrição reversa (RT-PCR)

Para vírus de genoma RNA:


Realização da reação de

transcrição reversa:

Transcriptase Reversa

http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_07.htm

PCR em tempo real (PCR quantitativo - qPCR)

Detecção viral Diagnóstico

Quantificação viral

Monitoramento da resposta anti-viral Prognóstico


Permite o sequenciamento genético

da amostra amplificada

Necessita de técnicas de revelação:

eletroforese

Detecção e quantificação (no. de

cópias) da amostra

PCR convencional PCR em tempo real

sim não

sim não

não sim

Comparação

PCR em tempo real (qPCR) – TaqMan

www.iba-lifesciences.com

Sonda complementar ao segmento do produto da PCR, localizada entre os iniciadores da reação

Avalia o momento de aparecimento do sinal, e não quanto sinal é gerado após um dado número de ciclos.

A fluorescência é proporcional à quantidade do produto da PCR

PCR em tempo real (qPCR) – TaqMan

SEQÜENCIAMENTO DE DNA

Definição: processo que determina a ordem dos nucleotídeos (A, C, T e G) na seqüência do DNA utilizado como molde.

Molécula de DNA

Informação Seqüência

nucleotídica

blog.cca.ufscar.br

As sequencias são comparadas entre si e com protótipos de

acordo com as modificações entre os nucleotídeos

(substituições, deleções e inserções)

Análise filogenética

GenBank www.ncbi.nlm.nih.gov BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) www.blast.ncbi.nlm.nih.gov Análise dos dados e Construção da árvore Programa MEGA 5.1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/

Métodos diretos de diagnóstico: Detecção do vírus

Amostra clínica

Métodos rápidos

Métodos clássicos

Partícula viral:


Antígeno viral:

- Ensaio Imunoenzimático (EIE)

-Imunofluorescência (IFA)

- Imunoperoxidase (IPX)

Genoma viral:

- PCR convencional

- PCR em tempo real (qPCR)

Detecção do (a)

Inoculação

Ovos embrionados Cultura de células

Métodos indiretos

Detecção de Anticorpos no soro do paciente

Utilização freqüente porque muitas vezes o isolamento viral é

difícil

Confirmar laboratorialmente uma enfermidade causada por vírus

Estudar epidemiologicamente o comportamento de uma virose na

comunidade

Determinação de imunidade (p.ex. resposta vacinal)

Identificar o vírus isolado em cultura

Sorologia:

Diagnóstico de infecção recente:

Detecção de IgM específica

Conversão sorológica: soro de fase aguda

soro de fase convalescente

Observar um aumento, de pelo menos 4 vezes, no título de

anticorpos do soro de fase convalescente em relação ao soro de

fase aguda

Métodos indiretos: Detecção de Ac no soro

Coleta de sangue soro

Detecção de anticorpos no soro do paciente

http://www.sciencephoto.com/media/274242/view

http://www.topnews.in/blood-samples-yield-clues-help-

fight-cancers-2239442

http://www.sciencephoto.com/media/274242/enlarge

Reações Imunológicas:



Imunodifusão em gel de agarose (AGID)

Western Blot

Métodos indiretos: Detecção de Ac no soro

Reações de precipitação (meio gelatinoso)

Imunodifusão (ID)

Diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina

Agar Gel Immunodiffusion (AGID) ou Teste de Coggins

(detecção de Ac no soro do animal)

Ag

Soro em

teste

Linha de precipitação tamanho dos agregados é maior que diâmetro dos poros

Reação de Imunofluorescência (IF): detecção de Ac

Antígeno

Soro do paciente

Conjugado

Soro (+) Soro (-)

Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de Ac

Amostra clínica: soro

Sensibilização da placa: Ag

conjugado: anti-Ig marcada com enzima

Lisado de proteínas

Eletroforese em gel de

poliacrilamida

Western Blot : pesquisa de Ac

Transferência

para membrana

Antígenos imobilizados

em membranas

detectados por

anticorpos específicos

Santos et al. Introdução a virologia humana, 2008

Amostra clínica depende dos sinais clínicos

Métodos diretos: Detecção do vírus Métodos indiretos

Rápidos Clássicos

Partícula viral:


Antígeno viral:

- Ensaio Imunoenzimático (EIE)

-Imunofluorescência (IFA)

- Imunoperoxidase (IPX)

Genoma viral:

- PCR

Cultura de células

Ovos embrionados

Isolamento viral

Diagnóstico laboratorial das viroses

Amostra clínica

soro


Ensaio Imunoenzimático

(EIE)

Imunodifusão em gel de

agarose (AGID)

Western Blot

Reações imunológicas

Controle e Prevenção das Viroses

Controle e Prevenção das Viroses

Medidas higiênicas e sanitárias: Hepatite A

Controle de Vetores: Febre Amarela, Dengue

Mudança de estilo de vida: HIV, HBV, HCV Quarentena Vacinas

1798: Edward Jenner

virus vivo atenuado derivado do cowpox virus vaccinia

VACINA latim VACCA

1885: Pasteur

virus rábico “vírus fixo” inoculado em medula espinhal de

coelho medula dessecadas menino ferido por um cão

raivoso

1950s: Culturas de células desenvolvimento de

vacinas atenuadas e inativadas

Atualmente: tecnologia de DNA recombinante

Tipos de vacinas virais

Vacinas não replicativas: não contêm o agente viável

- vírus inteiro (inativadas)

- sub-unidades

- proteínas recombinantes

Vacinas replicativas: contêm o vírus viável

- vírus heterólogos

- Atenuadas

Vírus inteiro inativado: Agentes químicos ou físicos para

destruir a infectividade, mas não a imunogenicidade.

Inativantes mais comuns : formaldeído 37%

-propiolactona raiva

etileno-iminas febre aftosa

Vacinas não replicativas:

Sub – unidades (Ex. Influenza)

Vacina

HBsAg Vetor de expressão

+

DNA recombinante

Transfecção e cultivo celular

Purificação protéica

Inoculação

Vacina recombinante

Vacinas de vírus heterólogo:

- vacina de Jenner

Vacinas de vírus atenuados:

- atenuação do vírus por adaptação a um hospedeiro diferente

do habitual Cultura de células e/ou Ovos embrionados

- atenuação do vírus por seleção de mutantes sensíveis à

temperatura (ts) vírus respiratórios

- manipulação genética

Vacinas replicativas:

Replicação do vírus vacinal no organismo Sim Não

Flores, E. Virologia Veterinária, 2ª. Ed, 2012

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Detecção de vírus