UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA ELTRICA E INFORMTICA INDUSTRIAL CPGEI

LUCIANA MARTINS PEREIRA DE ARAJO

Anlise de Deteco de Fluorescncia para Aplicao em Sistemas de Diagnstico em Sade

DISSERTAO

CURITIBA 2010

LUCIANA MARTINS PEREIRA DE ARAJO

Anlise de Deteco de Fluorescncia para Aplicao em Sistemas de Diagnstico em Sade

.

CURITIBA 2010

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Engenharia Eltrica e Informtica

Industrial da Universidade Tecnolgica Federal do

Paran, como requisito parcial para a obteno

do grau de Mestre em Cincias rea de

Concentrao: Engenharia Biomdica.

Orientador: Prof. Dr. Fbio Kurt Schneider

Coorientador: Prof. Dr. Gilberto Branco

Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca da UTFPR Campus Curitiba

A663 Arajo, Luciana Martins Pereira de

Anlise de deteco de fluorescncia para aplicao em sistemas de

diagnstico em sade / Luciana Martins Pereira de Arajo. 2010. 93 f. : il. ; 30 cm

Orientador: Fbio Kurt Schneider

Co-orientador: Gilberto Branco

Dissertao (Mestrado) Universidade Tecnolgica Federal do Paran. Programa de Ps-graduao em Engenharia Eltrica e Informtica Industrial.

rea de concentrao: Engenharia biomdica, Curitiba, 2010.

Bibliografia: f. 82-9

1. Espectroscopia fluorescente. 2. Eurpio. 3. Agentes luminescentes Uso em diagnstico. 4. Corantes fluorescentes Uso em diagnstico. 5. Engenharia eltrica Dissertaes. I. Schneider, Fbio Kurt, orient. II. Branco, Gilberto, co-orient. III. Universidade Tecnolgica Federal do Paran.

Programa de Psgraduao em Engenharia Eltrica e Informtica Industrial.

III. Ttulo.

CDD (22. ed.) 621.3

Dedico esta dissertao a Deus, pois sem Ele, nada seria possvel. minha famlia pelo incentivo e confiana. Ao meu esposo e minha filha, pelo apoio incondicional, compreenso e motivao. Enfim, a todos que de alguma forma tornaram este caminho mais fcil de ser percorrido.

AGRADECIMENTOS

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior - CAPES,

pelo suporte e apoio financeiro a esse projeto.

Ao Professor Dr. Fbio Kurt Schneider, pela orientao e confiana.

Ao Professor Dr. Arandi Ginane Bezerra Junior e o Dr. Gilberto Branco, pela co-

orientao, apoio, dedicao e partilha.

Aos colegas do CPGEI pelo companheirismo, convvio, estmulo e partilha, em

especial, Cladio Marquetto, Joyce Klock, Terezinha Strapasson, Leonardo

Zanin, Neusa Grando e Joaquim de Mira.

Aos alunos de Iniciao Cientfica, Vincius Oliveira e Eduardo Almeida dos

Santos, pelo apoio e aprendizado partilhado.

Ao colega Wellington Celestino dos Santos, pelo apoio e pela partilha de

aprendizado.

Aos professores, pelo conhecimento compartilhado.

Ao meu esposo Walter Duarte e minha filha Lvia Helena que colaboraram em

todos os momentos, pela pacincia, incentivo e amor.

Agradeo a Deus que me deu fora e sempre esteve presente em minha vida.

Aos meus pais Evandro Reis Pereira (in memorian) e Maria da Piedade Martins

que sempre me deram fora para continuar perseverando rumo ao objetivo a

ser alcanado.

RESUMO

ARAJO, Luciana M. P. Anlise de deteco de Fluorescncia para Aplicao em Sistemas de Diagnstico em Sade 2010. Dissertao (Programa de Ps-Graduao em Engenharia Eltrica e Informtica Industrial da Universidade Tecnolgica Federal do Paran). Curitiba, 2010.

A tcnica de espectroscopia de emisso de fluorescncia tem sido

utilizada para caracterizar molculas e compostos moleculares, pois propicia

que fluorforos sejam usados como elementos de marcao de antgenos e/ou

anticorpos, que serviro para a identificao de doenas. Assim, o objetivo

desta dissertao analisar a emisso de fluorescncia a partir de um novo

composto molecular, desenvolvido pelo Laboratrio de Polmeros Paulo Scarpa

(LaPPS/UFPR) em funo do elemento qumico eurpio, denominado

complexo LaPPS34M, por meio de um sistema de deteco em estado slido

resolvido no tempo. As caractersticas pticas como: o espectro de absoro, o

espectro de fluorescncia, o deslocamento de Stokes e os tempos de vida de

luminescncia resultaram nos parmetros importantes do complexo para

potenciais aplicaes em sistemas biomdicos atravs do projeto INDI-

SADE/PR.

Palavras-Chave: Fluorescncia, Fluorforo, Espectroscopia, Diagnstico,

Sade Pblica.

ABSTRACT

ARAJO, Luciana M. P. Fluorescence detection analysis for Application in

Diagnostic Systems in Health. 2010. Graduate Program in Electrical

Engineering and Computer Science Industrial of the Federal Technological

University of Parana). Curitiba. 2010.

The technique of fluorescence emission spectroscopy has been used to

characterize molecules and molecular compounds. Fluorophores can be used

as markup elements of antigens and / or antibodies for identification of disease.

Thus, the objective of this dissertation is to analysis the fluorescence emission

from a new molecular compound, developed by the Laboratory of Polymers

Paulo Scarpa (Lapps / UFPR) according to the chemical element europium,

called complex LaPPS34M, through a solid state detection system resolved

in time. The optical characteristics as: absorption spectrum, fluorescence

spectrum, the Stokes shift and the lifetime of luminescence have resulted in

importants parameters of the complex for potential applications in biomedical

systems by designing INDI-SADE/PR.

Keywords: Fluorescence, Fluorophore, Spectroscopy, Diagnosis, Public Health.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema representativo da marcao do complexo antgeno-

anticorpo por fluorforo. ................................................................................... 25

Figura 2 - Apresentao do diagrama de Jablonski. ........................................ 26

Figura 3 - Ilustrao do deslocamento de Stokes entre o pico de absoro

mxima e o pico de emisso mxima. ............................................................. 32

Figura 4 - Ilustrao da estrutura molecular do fluorforo comercial Cy3. O N+

o smbolo do on nitrognio e o I- o smbolo do on iodo. .............................. 38

Figura 5 - Estrutura molecular do complexo LaPPS34M, com os elementos N

(nitrognio) e O ( oxignio), as cadeias aromticas (representada pelos

hexgonos). ...................................................................................................... 39

Figura 6 - Dimenses, formas e tamanhos das nanopartculas metlicas. ...... 42

Figura 7 - Esquema do processo de FRET entre dois fluorforos, a fluorescena

doadora) e a rodamina (receptora), onde r a distncia de mnima de FRET. 44

Figura 8 - Descrio do processo de FRET pelo de diagrama de Jablonski. ... 45

Figura 9 - Desenho esquemtico do espectrofotmetro de duplo feixe ........... 49

Figura 10 - Espectro de absoro do fluoroforo Cy3 obtido pelo

espectrofotmetro. ........................................................................................... 51

Figura 11 - Espectro de absoro do complexo LaPPS34M obtido pelo

espectrofotmetro ............................................................................................ 51

Figura 12 - Representao esquemtica do sistema de deteco proposto .... 52

Figura 13 - Desenho esquemtico do sistema experimental por vlvula

fotomultiplicadora R928 (de alta sensibilidade) ................................................ 53

Figura 14 - Desenho esquemtico do sistema com o uso da vlvula

fotomultiplicadora miniatura (R5600U-01). ....................................................... 54

Figura 15 - Desenho esquemtico do sistema experimental por fotodiodo ...... 55

Figura 16 - (a) Dispositivo OPT 301 apresenta um fotodiodo integrado com

amplificador conversor corrente-tenso, (b) resposta espectral do OPT 301, (i)

emisso de luminescncia do indicador (LAPPS34M ~ 615 nm) (ii) excitao do

indicador (LAPPS34M ~ 350 nm). .................................................................... 56

Figura 17 Espectro de emisso da lmpada xenon ...................................... 58

Figura 18 - Espectro de emisso de led azul, com comprimento de onda do

pico 440 nm. .................................................................................................. 59

Figura 19 - Espectro de emisso de led ultravioleta, com comprimento de onda

do pico 400 nm. ............................................................................................. 59

Figura 20 - Espectro de transmitncia do filtro de interferncia na regio do

vermelho........................................................................................................... 61

Figura 21 - Diagrama representativo da transmitncia de luz pela amostra na

cubeta .............................................................................................................. 63

Figura 22 - llustrao do espectro de transmitncia da cubeta de quartzo ...... 63

Figura 23 - Representao do processo de gerao e multiplicao de eltrons

em uma vlvula fotomultiplicadora ................................................................... 64

Figura 24 - Circuito de Implementao do Amplificador de Transimpedncia . 65

Figura 25 - Espectro de fluorescncia do fluorforo Cy3 obtido pela FASE I

(vlvula fotomultiplicadora R928) ..................................................................... 68

Figura 26 - Espectro de absoro e emisso de fluorforo Cy3 demonstrando o

deslocamento de Stokes obtido pela FASE I. .................................................. 68

Figura 27 - Espectro de fluorescncia do complexo LaPPS34M obtido pela

FASE I. ............................................................................................................. 69

Figura 28 - Espectro de absoro e emisso de LaPPS34M demonstrando o

deslocamento de Stokes obtido pela FASE I ................................................... 70

Figura 29 - a)Espectro de Fluorescncia do fluorforo Cy3 e b) o espectro de

fluorescncia do Fluorforo Cy3 conjugado com Nanopartcula de Ouro obtido

pela FASE I. ..................................................................................................... 71

Figura 30 - Espectro de fluorescncia (em preto) do complexo LaPPS34M e o

espectro de fluorescncia do LaPPS34M ( em verde) conjugado com

nanopartculas de prata obtido pela FASE I. .................................................... 72

Figura 31 - Decaimento de Fluorescncia do Complexo LaPPS34M com o uso

da vlvula fotomultiplicadora R928 obtido pela FASE I .................................... 74

Figura 32 - Decaimento exponencial de emisso de luminescncia do indicador

LaPPS34M pela vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 obtido pela

FASE II. ............................................................................................................ 75

Figura 33 - Sinal eltrico aplicado ao led para excitao do indicador (linha

contnua), sinal de sada do detector na ausncia do fluorforo (linha tracejada)

e sinal de luminescncia na presena do fluorforo (linha contnua) obtido pela

FASE III. ........................................................................................................... 76

Figura 34 - Exponencial de decaimento de emisso de luminescncia do

indicador LaPPS34M pelo uso detectores de fotodiodo obtido pela FASE III .. 77

Figura 35 - A) Tamanho das nanopartculas de ouro por DLS, B) Espectro de

absoro das nanopartculas de ouro e C) Espectro de absoro linear para o

colide de prata ................................................................................................ 95

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Caractersticas dos Fluorforos Comerciais em relao aos

comprimentos de onda de absoro e de emisso de fluorescncia ............... 31

Tabela 2 - Caractersticas pticas relevantes para um fluorforo da famlia Cy-

corante ............................................................................................................. 39

Tabela 3 - Relao entre as fases da pesquisa e os resultados do tempo de

vida de Luminescncia ..................................................................................... 77

LISTA DE FOTOGRAFIAS

Fotografia 1 - Espectrofotmetro de Duplo Feixe UV-Vis. ................................ 50

Fotografia 2 - Montagem do uso das lentes convergentes no experimento de

fluorescncia. ................................................................................................... 60

Fotografia 3 - Monocromador do tipo Czerny-Turner. ...................................... 62

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

INDI-SADE Instituto Nacional de Inovao em Sade Pblica

NAT Teste de cido Nuclico

DNA cido Desoxirribonuclico

HIV Human Immunodeficiency Virus

Intensidade do Campo Eltrico [V/m]

H Intensidade do Campo Magntico [A/m]

RNA cido Ribonuclico

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Cy3 Fluorforo Comercial Cianina (Cyanine)

Cy4 Fluorforo Comercial Cianina (Cyanine)

Cy7 Fluorforo Comercial Cianina (Cyanine)

LaPPS34M Complexo de Eurpio/ Bipiridina/ Dibenzolmetano

PH Pontecial Hidrogeninico

NADH Quinona Oxidorredutase

FAD Dinucleotdeo Flavina Adenina

NP Nanopartculas

DLS Espalhamento Dinmico da Luz

FRET Transferncia de Energia de Ressonncia de

Fluorescncia

Ln Familia dos elementos quimicos dos Lantandeos

Lu Elemento Qumico Lutcio

Y Elemento Qumico trio

Sc Elemento Qumico Escndio

Na Elemento Qumico Sdio

K Elemento Qumico Potssio

Sb Elemento Qumico Antimnio

Cs Elemento Qumico Csio

Eu Elemento Qumico Eurpio

Eu3+ Representao do Elemento Eurpio

Tb3+ Representao do Elemento Trbio

C Elemento Qumico Carbono

H Elemento Qumico Hidrognio

O Elemento Qumico Oxignio

Au Elemento Qumico Ouro

Ag Elemento Qumico Prata

Ni Elemento Qumico Nquel

Cu Elemento Qumico Cobre

La Famlia dos lantandeos

N Elemento Qumico Nitrognio

Z Nmero Atmico dos Elementos Qumicos

RMN Ressonncia Magntica Nuclear

led Light Emitting Diode

Orbital pi Ligante e Antiligante

* Orbital pi Antiligante

Comprimento de Onda

S Estado Singleto

S1

Primeiro Estado Singleto Excitado

S2

Segundo Estado Singleto Excitado

S0 Estado Singleto Fundamental

THF Tetrahidrofurano

UV-Vis Espectroscopia na Regio do Ultravioleta-Visvel

OEM Onda Eletromagntica

PCR Polimerase Chain Reaction

PMT Photo Multiplier Tube

USB Universal Serial Bus

Gap Fosfeto de Glio

DC-DC Conversor de Corrente Contnua

UFPR Universidade Federal do Paran

PR Estado do Paran

CI Converses Internas

CSI Cruzamento Interno

LASER Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

UTFPR Universidade Tecnolgica Federal do Paran

DMSO Dimetilsulfxido

RMSE Quadrado Mdio do Erro

LaPPS Laboratrio de Polmeros Paulo Scarpa

DO Densidade ptica

FITC Isotiocianato de Fluorescena

RITC Rodamina

AT Amplificador de Transimpdancia

a.u Arbitraries Unites (Unidades Arbitrrias)

ZXA Representao do elemento qumico (Z o nmero

atmico e A o nmero de massa)

SUMRIO

1. INTRODUO ........................................................................................... 19

1.1. MOTIVAO ............................................................................................. 19

1.2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 20

1.3. OBJETIVOS ............................................................................................... 21

1.3.1. Objetivo Geral ...................................................................................... 21

1.3.2. Objetivos Especficos .......................................................................... 21

1.4. ESTRUTURA DA DISSERTAO ............................................................ 23

2. FLUORESCNCIA E FLUORFORO ....................................................... 24

2.1. INTRODUO ........................................................................................... 24

2.2. COMPLEXO ANTGENO- ANTICORPO.................................................... 24

2.3. O FENMENO DE FLUORESCNCIA ..................................................... 25

2.4. FLUORFOROS ....................................................................................... 29

2.4.1. Caractersticas pticas dos Fluorforos .............................................. 29

2.4.2. Propriedades dos Fluorforos Comerciais e dos Complexos

Biomarcadores ................................................................................................. 34

2.4.2.1. Fluorforo Comercial Cy3 .................................................................... 37

2.4.2.2. Complexo LaPPS34M ......................................................................... 39

2.5. NANOPARTCULA .................................................................................... 41

2.5.1. Fluorforo na Presena de Nanopartculas ......................................... 43

2.6. RESUMO ................................................................................................... 46

3. SISTEMAS DE AQUISIO DE LUMINESCNCIA.................................. 47

3.1. INTRODUO ........................................................................................... 47

3.2. DETERMINAO DO ESPECTRO DE ABSORO DO CY3 E DO

COMPLEXO LaPPS34M .................................................................................. 47

3.2.1. Espectrofotmetro de Duplo Feixe ...................................................... 48

3.2.1.1. Espectro de Absoro ......................................................................... 50

3.3. SISTEMA DE AQUISIO DE SINAL DE FLUORESCNCIA .................. 52

3.4. SISTEMA DE DETECO DE FLUORESCNCIA ................................... 57

3.4.1. Fonte ptica ........................................................................................ 57

3.4.2. Lentes Convergentes e Filtros ............................................................. 59

3.4.3. Monocromador .................................................................................... 61

3.4.4. Cubeta ................................................................................................. 62

3.4.5. Vlvulas Fotomultiplicadoras ( PMTs) ................................................. 63

3.4.6. Amplificador de Transimpedncia........................................................ 65

3.4.7. Aquisio do Processamento do Sinal ................................................ 66

3.5. RESUMO ................................................................................................... 66

4. RESULTADOS .......................................................................................... 67

4.1. INTRODUO ........................................................................................... 67

4.2. ESPECTROS DE FLUORESCNCIA........................................................ 67

4.3. ESPECTROS DE FLUORESCNCIA COM NANOPARTCULAS

METLICAS ..................................................................................................... 71

4.4. TEMPOS DE VIDA DE LUMINESCNCIA DO FLUORFORO E DO

COMPLEXO LaPPS34M .................................................................................. 73

5. DISCUSSO E CONCLUSO ................................................................... 78

5.1. INTRODUO ........................................................................................... 78

5.2. CARACTERIZAO DE BIOMARCADORES ........................................... 78

5.3. SISTEMAS DE CUSTO REDUZIDO .......................................................... 80

5.4. LIMITAES DO ESTUDO ....................................................................... 81

5.5. TRABALHOS FUTUROS ........................................................................... 81

5.6. PUBLICAES ......................................................................................... 83

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................... 84

7. ANEXOS .................................................................................................... 92

19

1. INTRODUO

1.1. MOTIVAO

Muitas doenas infecciosas, comuns em diversas regioes de pases em

desenvolvimento, so tratveis por meio de medicaes apropriadas. Isto tem

prevenido e diminudo, significativamente, a mortalidade e a morbidade das

populaes infectadas residentes nestas reas de risco (MABEY, 2004). Os

mtodos de diagnsticos mais rpidos certamente auxiliaro para que as

doenas infecciosas, que apresenta significantes consequncias para a sade

pblica, sejam eficientemente controladas se identificadas precocemente

(NICHOL, 2000).

As tcnicas tradicionais de diagnstico laboratorial incluem os mtodos

diretos: como a identificao direta do microrganismo por meio da microscopia

ptica, e mtodos indiretos: como a inoculao de amostras potencialmente

infectadas em animais e meios de cultura. Alm destes, nos ltimos vinte anos,

tambm houve o desenvolvimento de mtodos rpidos de diagnstico, que

proporcionaram um avano importante, pois os resultados podem ser obtidos

em poucas horas ou at mesmo em minutos (PERUSK, 2003).

Atualmente, vrias doenas infecciosas e parasitrias so pesquisadas

pelos mtodos imunolgicos. Graas sua simplicidade, o mtodo ELISA

(Enzyme LinkedImmuno Sorbent Assay) permite reconhecer e quantificar

antgenos atravs de uma reao enzimtica (ENGVALL, 1971). Este mtodo

usado para analisar grande nmero de indivduos com um volume pequeno

de amostra (PERUSK, 2003). Os testes moleculares como o PCR (Polimerase

Chain Reaction) em tempo real e os microarranjos lquidos possibilitaram a

marcao do complexo antgeno-anticorpo por sondas fluorescentes com

diferentes espectros de emisso (YANG, 2004).

Ao aplicar os fluorforos nos estudos diagnsticos, recorre-se a uma

rea que est em franca expanso. Novas tecnologias esto sendo

empregadas procura de diagnsticos mais rpidos e precisos. Neste sentido,

a utilizao conjunta da fluorescncia atravs dos fluorforos levou a criao

20

de outra rea de pesquisa, chamada de imunofluorescncia, que a ligao do

antgeno e anticorpo atravs da marcao do anticorpo marcado com uma

molcula fluorescente (VALEUR, 2002),(LAKOWICZ,1999).

1.2. JUSTIFICATIVA

O esforo do sistema nacional de sade em ampliar o setor de

diagnsticos e conjuntamente integrar a produo acadmica com o setor

produtivo possibilitou a criao do Instituto Nacional de Inovao em Sade

Pblica (INDI-SADE), que se situa no Instituto Carlos Chagas Curitiba/PR

(2008). Assim sendo, o objetivo do INDI-SADE, consiste na implantao de

novas tecnologias para a produo de sistemas de diagnstico centrados em

doenas causadas por microrganismos importantes para a sade pblica no

Brasil. Uma das metas do Instituto a nacionalizao de insumos e sistemas

de diagnstico relevantes para a sade pblica, envolvendo mtodos rpidos

para utilizao no local de tratamento (point of care) (INDI, 2008).

Adicionalmente, pretende-se obter procedimentos de multitestes para o

diagnstico e controle do sangue, ou seja, aqueles capazes de detectar mais

de uma doena simultaneamente.

Os sistemas de diagnsticos desenvolvidos pela Instituto tero seu

alicerce no diagnstico molecular, como os microarranjos lquidos, por ser o

mtodo moderno para deteco e quantificao de doenas por

microrganismos, como por exemplo doena de chagas e dengue (INDI, 2008).

Um dos estudos do Instituto Nacional de Inovao em Sade Pblica

a marcao do complexo antgeno-anticorpo atravs de fluorforos para

detectar doenas por meio de fluorescncia. Essa dissertao representa um

dos projetos a serem desenvolvidos pelo INDI-SADE atravs do complexo

LaPPS34M, desenvolvido pelo laboratrio de polmeros Paulo Scarpa da UFPR

ser realizado um estudo de comparao com um fluorforo comercial Cy3,

amplamente utilizado na tecnologia de microarranjos. Algumas caractersticas

pticas tais como deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescncia

21

so avaliados para o estudo do potencial de aplicao do complexo LaPPS34M

como fluorforo.

1.3. OBJETIVOS

1.3.1. Objetivo Geral

O objetivo principal deste trabalho analisar a deteco de

fluorescncia para aplicao em sistemas de diagnsticos com nfase em um

novo composto molecular - desenvolvido em funo do elemento qumico

eurpio (Eu - grupo dos lantandeos) - denominado complexo LaPPS34M por

meio de um sistema de excitao e deteco em estado slido resolvido no

tempo.

1.3.2. Objetivos Especficos

Os objetivos especficos so:

1. Determinar os espectros de absoro do fluorforo Cy3 e do complexo

LaPPS34M e a relao entre os picos mximos de absoro para as

amostras.

2. Determinar a relao entre os espectros de fluorescncia do fluorforo

Cy3 e do complexo LaPPS34M e os picos mximos de emisso das

amostras

3. Avaliar a relao entre a fluorescncia de Cy3 e de LaPPS34M na

presena de nanopartculas e suas implicaes na intensidade de

fluorescncia.

4. Analisar a deteco de fluorescncia com o uso de fotodetectores

(vlvula fotomultiplicadora R928, vlvula fotomultiplicadora miniatura

22

R5600U-01 e de detector optoeletrnico OPT301) e utilizando uma

instrumentao de baixo custo.

5. Determinar o tempo de vida de luminescncia do complexo LaPPS34M.

23

1.4. ESTRUTURA DA DISSERTAO

O trabalho est dividido em 5 captulos, onde neste captulo 1 so

expressas as motivaes, as justificativas e os objetivos gerais e especficos

desta dissertao. O captulo 2, apresenta uma reviso sobre a luminescncia,

com nfase para a fluorescncia e suas propriedades fsicas. Descreve-se

ainda alguns fluorforos e os fatores que afetam o desempenho dos

fluorforos.

O captulo 3 apresenta o uso do sistema para a identificao de

emisso fluorescente; com fonte ptica composta de diodos emissores de luz

violeta, chaveados (e controlados) para excitar substncias fluorescentes em

soluo aquosas; e deteco com sensor optoeletrnico.

O captulo 4 apresenta os resultados usando a instrumentao

implementada quanto deteco da fluorescncia para atingir os objetivos

especficos previamente listados.

Finalmente, o captulo 5 apresenta uma discusso e as principais

concluses do trabalho.

24

2. FLUORESCNCIA E FLUORFORO

2.1. INTRODUO

O captulo versar sobre a espectroscopia de fluorescncia, os

fluorforos e as propriedades pticas dos fluorforos comerciais e do complexo

LaPPS34M.

2.2. COMPLEXO ANTGENO- ANTICORPO

Na descricao de imunologia, a interao do antgeno com o anticorpo

fundamental. Essa relao denominada de complexo antgeno-anticorpo ou

complexo imune (ALBERTS et al ,1995). A maior parte dos mtodos de

diagnsticos baseia-se na deteco do complexo antgeno-anticorpo, ou seja,

quando um antgeno, que definido como uma substncia estranha que induz

uma resposta imune, causa uma produo de anticorpos e/ou linfcitos

sensibilizados que reagem especificamente com a substncia ingressa num

organismo (VOET, 1995).

O sistema imunolgico do corpo inicia a produo de anticorpos, que

so protenas que reconhecem um antgeno de forma especfica e com alta

afinidade e so produzidos pelos linfcitos B, que se originam na medula ssea.

Os anticorpos so ento distribudos pelo organismo inteiro atravs do sistema

linftico para neutralizar a ao do antgeno (VOET, 1995). Para que haja

deteco do complexo antgeno-anticorpo necessrio que este esteja

conjugado com um indicador, conforme apresentado na Figura 1.

Os fluorforos so compostos que emitem luz em certo comprimento

de onda quando excitados por uma radiao luminosa de outro comprimento

de onda, e podem atuar como biomarcadores, quando conjugados com o

complexo antgeno-anticorpo ou estruturas internas de clulas.

25

A marcao descrita na Figura 1 descreve a ligao entre um anticorpo

especfico, geralmente de uma espcie diferente da clula, e outro anticorpo,

que seja anti o anticorpo utilizado anteriormente, sendo este novo anticorpo

de uma terceira espcie e tendo sido tambm previamente marcado por algum

fluorforo, desta maneira, formam-se complexos antgeno-anticorpo marcados,

de forma que esta estrutura bem mais eficiente na deteco de doenas por

fluorescncia e seu uso em diagnsticos.

Figura 1 - Esquema representativo da marcao do complexo antgeno-anticorpo por

fluorforo.

Fonte: Modificado de FERREIRA, 2001

2.3. O FENMENO DE FLUORESCNCIA

Quando os ftons so absorvidos por uma molcula, a mesma levada

a um estado excitado. Aps um determinado tempo, h o retorno da molcula

ao estado fundamental (ou estado no excitado) com a possvel emisso de

parte da energia absorvida na forma de energia radiante (WILLARD, 1988).

Uma forma mais clara de visualizao dos estados de excitao das

molculas apresentada pelo diagrama de Jablonski (Erro! Fonte de referncia no

26

encontrada.), que relaciona as transies que ocorrem entre os nveis bsicos de

energia e os nveis excitados, bem como as reemisses de energia radiante

(ATVARS, 2002).

Inicialmente, a partir da absoro de radiao, a molcula promovida

para um estado excitado singleto Sn (Erro! Fonte de referncia no encontrada.).

Posteriormente, a molcula se desativa por relaxamento, atravs dos nveis

vibracionais de estados eletrnicos, at atingir o primeiro nvel vibracional do

estado excitado singleto de menor energia S1. Este processo de relaxamento

recebe o nome de converso interna (EISBERG, 1988).

Figura 2 - Apresentao do diagrama de Jablonski.

Fonte: Prpria

A partir do estado singleto S1, existem alguns caminhos possveis para

a molcula retornar ao estado fundamental:

(a) se no h diferena de energia entre o estado excitado e estado

fundamental existi a possibilidade de sobreposio de nveis vibracionais, a

molcula pode ser levada ao mais baixo nvel vibracional do estado excitado

por relaxamento vibracional sem emisso de radiao eletromagntica, ou seja,

ocorre um cruzamento interno.

(b) se, no entanto, a diferena energtica entre o estado excitado e

estado fundamental for relativamente grande, a desativao para o estado

fundamental se d com emisso de radiao na forma de fluorescncia

27

(VALEUR, 2002). Isto quer dizer que o spin1 do estado excitado mantm sua

orientao original e h uma maior probabilidade de acontecer essa

configurao. Corresponde a um fenmeno rpido, na ordem de 10-9 a 10-7

segundos (EISBERG, 1988).

(c) se ocorrer um cruzamento entre sistemas, que a transferncia de

eltrons entre estados de diferentes multiplicidades de spins. Outro fenmeno

de desativao se faz presente a fosforescncia. Esta representa emisso de

ftons aps as transies do estado singleto para o estado tripleto, isto , neste

tipo de fenmeno o spin se mantm de forma contrria da sua posio inicial e

o tempo de durao maior, na ordem de 10-3 s a 10 s (AMANDO,2004).

O uso da fluorescncia um dos mtodos para aplicao em sistemas

de diagnsticos, utilizados pelo Instituto Nacional de Inovao para

Diagnsticos em Sade Pblica do Paran (INDI-SADE/PR), que busca

sondas fluorescentes de baixo custo que possam ser utilizadas em kits

diagnsticos para a deteco de doenas por microorganismos demandas do

sistema de sade pblica nacional.

O complexo LaPPS34M faz parte das sondas fluorescentes compostas

de Eurpio (Eu3 +) ou Trbio (Tb3 +) que esto sendo estudados para

aplicao em sistemas biomdicos (ALBANI, 2007). Os tempos de vida dos

fluorforos destes elementos esto na escala de tempo de milisegundos e

surgem de transies entre os orbitais f dos tomos. Possuem caractersticas

pticas relevantes na marcao de doenas, pois tm grande fotoestabilidade.

a) Fatores que afetam a fluorescncia

H uma grande variedade de fluorforos e, consequentemente, uma

gama de espectros de absoro e emisso, alm de uma diferenciao dos

1 O spin corresponde a um grau de liberdade interno do eltron,e, embora seja descrito como

de forma aproximada com o movimento do eltron em torno do seu prprio eixo, uma

propriedade intrnseca da partcula (CARUSO, 2006).

28

tempos de vida de luminescncia para cada biomarcador. A deteco de

fluorescncia pode ento sofrer modificaes na sua intensidade com as

mudanas de temperatura, pH, a possibilidade de interao com solvente,

viscosidade, polarizao, presso e suas interaes com os solutos

(VALEUR,2002),(LAKOWICZ,1999).

O aumento da temperatura tem como consequncia um aumento na

eficincia dos processos de converses internas (CI) na desativao do estado

excitado (Figura 02). No entanto, por ser um fenmeno de tempo de vida

relativamente curto, esse fator menos crtico no caso da fluorescncia, o que

permite fcil observao do fenmeno na temperatura ambiente (BASSI, 2001).

Para o caso do pH, a fluorescncia de compostos aromticos com

funcionalidades cidas ou bsicas apresentam forte dependncia com o pH,

desta forma, importante manter o pH das amostras sempre constante.

A presena de outros grupos qumicos, como o oxignio dissolvido,

pode levar a uma diminuio da fluorescncia pelo aumento do cruzamento

inter sistemas (CSI), conforme Erro! Fonte de referncia no encontrada..

O decrscimo na viscosidade da soluo que possui o fluorforo leva a

diminuio da taxa de colises moleculares levando a uma diminuio da

difuso dos ftons de fluorescncia

Os solventes contendo tomos pesados acarretam na diminuio da

energia relativa do estado excitado. Essa diminuio de energia pode levar a

um aumento da eficincia das converses internas (CI) e em contrapartida a

diminuio da fluorescncia (BASSI, 2001).

Todos os fatores acima mencionados contribuem para que a

fluorescncia seja atenuada. Os testes foram realizados a temperatura

ambiente, com o pH 7 fixo, a viscosidade mantida constante e a diluio foi

realizada para manter a razo entre solvente e soluto sempre a mesma. Nesta

dissertao as condies acima elencadas foram necessrias para manter o

sistema constante ao longo das experincias ora realizadas

29

2.4. FLUORFOROS

Os fluorforos formam um grupo qumico que fluoresce quando

exposto a luz de um determinado comprimento de onda. Cada fluorforo tem

um espectro de emisso e de excitao caracterstico.

Prasad (2003) classifica os fluorforos em duas categorias, os

fluorforos intrnsecos ou naturais, e os fluorforos biomarcadores, no

naturais.

Os fluorforos intrnsecos so aqueles que ocorrem naturalmente. As

protenas como triptofano, tirosina e a fenilalamina, e algumas enzimas NADH,

FAD e Ribofavin encontrados dentro das clulas e dos tecidos so

caracterizados como fluorforos intrnsecos, alguns destes fluorforos

encontram-se ilustrados no anexo A. Eles podem ser usados para estudar as

estruturas dinmicas das clulas e das protenas. Tambm servem como

parmetros para os estudos de autofluorescncia (LAKOWICZ,1999).

Os fluorforos extrnsecos so aqueles que so adicionados a uma

amostra e chamados tambm de biomarcadores. Os fluorforos comerciais

como a famlia das sondas cyanines so representativas desse grupo,

representados no anexo B. As fluorescncias advindas de sondas

fluorescentes apresentam alta intensidade, so estveis durante iluminao

contnua e no perturbam o processo ou a biomolcula onde est sendo

estudada (LAKOWICZ,1999).

O fluorforo comercial Cy3 e o complexo LaPPS34M so sintetizados

em laboratrios e classificam-se como fluorforos extrnsecos, sendo

caracterizados como biomarcadores.

2.4.1. Caractersticas pticas dos Fluorforos

Algumas propriedades, como os espectros de absoro e de emisso, o

deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescncia, fazem com que

os fluorforos tenham grande aplicao na biologia molecular, medicina e

30

engenharia biomdica principalmente relacionada aos diagnsticos e

tratamentos de vrias doenas, tais como doena de chagas, dengue e

hepatite (HAUGLAND,1996).

a) Absoro e Emisso

A intensidade do feixe luminoso diminui ao atravessar qualquer meio

absorvente, de acordo com a seguinte lei exponencial geral.

(Eq.1)

em que e so respectivamente as intensidades do feixe incidente e do

feixe transmitido, o coeficiente de absoro (cm-1), dependente do

comprimento de onda e o comprimento do meio absorvente (cm).

Define-se a transmitncia como:

(Eq. 2)

e absorbncia (Abs) ou densidade ptica (DO) como:

(Eq. 3)

Quando o meio absorvente uma soluo com uma dada concentrao c,

comum relacionar com a concentrao, sendo:

(Eq. 4)

31

Onde se designa por coeficiente de extino molar ou absortividade molar

e c a concentrao da soluo em estudo. Se a concentrao for expressa

em M (mol-1), ser expresso em M-1 cm-1.

Usando as relaes anteriores pode-se ento escrever:

(Eq. 5)

Esta relao representa a forma usual da Lei de Beer, que prev para solues

diludas em apenas uma espcie de absorvente, uma proporcionalidade direta

entre a concentrao e a absorbncia. A constante de proporcionalidade o

coeficiente de extino molar, , que a medida da intensidade da banda de

absoro, ou seja, a intensidade de energia da transio para cada

comprimento de onda.

Na Tabela 1 esto listados os comprimentos de onda de absoro e

emisso de fluorescncia para alguns fluorforos encontrados comercialmente.

Tabela 1 - Caractersticas dos Fluorforos Comerciais em relao aos comprimentos de

onda de absoro e de emisso de fluorescncia

Fluorforos

Acridime Orange 502 526

Alexa Fluor 532 532 553

Cy3 548 562

Cy7 710 805

FITC 490 520

RITC 570 595

FDA 495 520

Fonte: Modificado de HAUGLAND, 1996

b) Deslocamento de Stokes

A natureza do solvente e o ambiente local produzem profundos efeitos

sobre o espectro eletrnico das molculas. Esses efeitos so a origem do

32

deslocamento de Stokes (), que a diferena do comprimento de onda entre

as posies do mximo dos espectros de excitao e emisso, da mesma

transio eletrnica. Esta foi uma das primeiras observaes do fenmeno

conhecido como fluorescncia, descrito pelo fsico irlndes G. G. Stokes, em

1852 (LAKOWICZ, 1999), (ABBYAD et al, 2007). Uma causa comum para o

deslocamento de Stokes a rpida relaxao da estrutura para nveis

vibracionais mais baixos a partir de S1 demonstrado na Figura 2.

A Figura 3 representa um desenho esquemtico de um exemplo dos

espectros tpicos de fluorescncia para molculas, onde podemos ver

representado o deslocamento de Stokes (Stokes Shift). Essa caracterstica

ptica importante para diferenciar os espectros de absoro e emisso para

cada molcula estudada. No caso especfico desta dissertao o complexo

LaPPS34M ser responsvel por um deslocamento de Stokes de

aproximadamente 200 nm.

Figura 3 - Ilustrao do deslocamento de Stokes entre o pico de absoro mxima e o

pico de emisso mxima.

Fonte: Modificado de MGUILBAULT, 1990

Para aplicaes em sistemas biomdicos e biolgicos necessrio que

os espectros de absoro e emisso sejam localizados em comprimentos de

onda distintos no espectro eletromagntico para que haja uma facilidade na

deteco de fluorescncia por parte da instrumentao. No caso do complexo

33

LaPPS34M a absoro se d na regio do azul (350 nm) e a emisso se d na

regio do vermelho (615 nm).

A equao 6 descreve as transies possveis para que ocorra o

deslocamento de Stokes. O comprimento de onda de absoro (ou o espectro

de absoro da molcula) descreve a variao de energia entre dois estados.

(Eq. 6)

Onde:

E1 corresponde ao nvel de energia fundamental [J];

E2 o nvel de energia do estado excitado [J]

a constante de Planck [6,62 x 10-34 J.s]

c a velocidade de propagao da luz [ km/s]

o comprimento de onda de emisso [nm]

c) Tempos de Vida de Luminescncia

A fluorescncia tem sido usada para estudar vrios sistemas qumicos,

fsicos e biolgicos (LAKOWICZ,1991), (JAMESON,1991). Apesar da grande

quantidade de informaes que se consegue com medidas estticas,

interessante examinar tambm a fluorescncia resolvida no tempo, ou seja,

atravs da anlise do tempo de vida possvel verificar se uma amostra

contm vrios fluorforos distintos, pois neste caso o que se espera mais de

um tempo de vida. No caso de um nico tipo de fluorforo, os dados resolvidos

no tempo podem indicar a influncia do meio em que se encontra o fluorforo

uma vez que isto pode alterar o tempo de vida de luminescncia.

H duas tcnicas para se obter dados de fluorescncia resolvidos no

tempo. Na primeira, uma amostra excitada com um pulso de luz e observa-se

a fluorescncia em funo do tempo. Na segunda tcnica, a amostra excitada

34

com luz modulada e a fluorescncia em funo do tempo obtida da resposta

em frequncia da emisso. Nos dois casos o objetivo obter os parmetros

que descrevem a fluorescncia em funo do tempo.

Os tempos de vida de luminescncia dos fluorforos podem variar de

10-12 a centenas de 10-9 s. Este tempo corresponde ao intervalo temporal para

que haja um decaimento exponencial partindo do valor mximo at 36,8%.

(isto , 1/e).

A equao a seguir relaciona os parmetros para a obteno dos

valores do tempo de vida de luminescncia dos fluorforos.

(Eq. 7)

Onde a intensidade de luminescncia inicial no instante de t igual a 0, e

seguido de que o tempo de vida de luminescncia do fluorforo. Esta

varivel pode tambm ser descrita como

+ krn)1.

(Eq. 8)

Onde representa taxa de emisso do fluorforo e krn a taxa de decaimento

no radiativa do estado fundamental.

Geralmente, para os fluorforos comerciais os tempos de vida esto

em torno de 10-9 s. O Cy3 tem o tempo de vida de luminescncia em torno de

0,3 ns e utilizado na marcao de complexos imunes, pois invarivel ao pH

(entre 3 a 7) e a temperatura, mantendo sua estabilidade perante outros

fluorforos, tais como a fluorescena (MUJUMDAR et al, 1996).

2.4.2. Propriedades dos Fluorforos Comerciais e dos Complexos

Biomarcadores

35

A seleo de um marcador ou de um complexo biomarcador,

influenciada por fatores tais como as caractersticas espectrais. As

caractersticas do instrumento de deteco so fundamentais para que haja

preciso na coleta dos dados. Os parmetros dos instrumentos a serem

considerados incluem o tipo de fonte de excitao, os filtros pticos utilizados

para a discriminao do sinal e de sensibilidade, e os detectores, ou seja, a

forma como ser adquirido os dados.

As caractersticas importantes dos marcadores na otimizao so o

espectro de excitao, o deslocamento de Stokes, a emisso espectral e o

tempo de vida de luminescncia. Outros fatores, incluindo o coeficiente de

extino, o rendimento quntico de fluorescncia, fotoestabilidade e a

sensibilidade ambiental, determinam a intensidade de luminescncia de

biomolculas marcadas. Alm disso, os efeitos das caractersticas fsicas do

marcador sobre a rotulagem influenciam na eficincia e estrutura biolgica das

molculas (HAUGLAND,1996).

Uma abordagem utilizada amplamente determinar qual o marcador

ou quais os marcadores que so mais adequados para uma determinada

aplicao. O desempenho de um fluorforo est diretamente relacionado com

as propriedades qumicas e seus conjugados de cidos nuclicos

(HAUGLAND,1996).

O rendimento quntico de fluorescncia uma medida da eficincia

com que a molcula excitada capaz de converter a radiao luminosa

absorvida em emitida. definida como a frao de ftons absorvidos que so

convertidos em emisso de fluorescncia. O rendimento quntico muito

sensvel ao ambiente, ao pH, a temperatura e a estrutura do fluorforo

(PRASAD, 2003).

Fotoestabilidade a capacidade que tem um fluorforo de sofrer

repetidos ciclos de excitao e de emisso sem ser destrudo, enquanto no

estado excitado.

O ambiente tem um forte efeito em alguns fluorforos e mnimos sobre

outros. Os mais fortes fatores ambientais que afetam o rendimento de

fluorescncia so o pH e a escolha do solvente.

36

O coeficiente de extino molar () a capacidade que um mol2 de uma

substncia tem em absorver luz num dado comprimento de onda, ou o quo

fortemente uma substncia absorve radiao a uma determinada frequncia.

Esta capacidade muito importante na determinao da quantidade de

radiao luminosa que pode gerar uma molcula atravs da emisso de

fluorescncia (PRASAD, 2003).

A maioria dos fluorforos de uso comercial ou complexos

biomarcadores tm coeficientes de extino molar em seu comprimento de

onda de absoro mxima variando entre 5.000 e 200.000 L mol1cm1

(HAUGLAND, 1996). Em geral, marcadores, com grandes deslocamentos de

Stokes tendem a ter coeficientes de extino relativamente pequenos,

enquanto que os marcadores com pequenas mudanas no deslocamento de

Stokes tendem a ter coeficientes de extino relativamente grandes.

Algumas caractersticas dos fluorforos para que se possa ter

biomarcadores de qualidade, so:

1) Os marcadores devem produzir sinais luminosos, que so

espectralmente distinguveis da excitao e da emisso;

2) Fluorforos devem ser compatveis com a instrumentao disponvel;

3) Os marcadores e seus conjugados devem ser estveis em relao ao

pH, temperatura e condies de iluminao necessria para a anlise.

Alm disso, alguns dos fatores que influenciam no desempenho dos

fluorforos, so:

1) Os espectros de excitao e emisso de acordo com a fonte de

excitao e filtro de comprimentos de onda de emisso;

2) O rendimento quntico de fluorescncia do marcador;

3) A fotoestabilidade do marcador;

4) O meio onde o marcador se encontra, e

2 O mol definido como sendo a quantidade de matria de um sistema que contm tantas

entidades elementares quantos so os tomos contidos em 0,012 kg de carbono 12

(SOLOMONS, 2009).

37

5) O coeficiente de extino molar.

A banda espectral e a pureza do corante tambm so fatores

importantes que afetam a anlise do fluorforo. A importncia da largura de

banda espectral, especialmente no espectro de emisso, concentra-se na

capacidade dos instrumentos em distinguir um marcador do outro (PRASAD,

2003).

O uso dos fluorforos como biomarcadores abre a possibilidade de

pesquisas de como novos fluorforos podem se enquadrar nas caractersticas

necessrias para aplicao em sistemas biomdicos. Nesta dissertao

analisa-se o complexo LaPPS34M em comparao com o fluorforo Cy3 para

demonstrar as possveis aplicaes deste novo complexo em biomdica e

tambm nos projetos desenvolvidos pelo Instituto Nacional de Inovao em

Sade Pblica (INDI-SADE).

2.4.2.1. Fluorforo Comercial Cy3

H uma grande quantidade de marcadores ou fluorforos. A famlia

Cyanine (Cy) so marcadores fluorescentes. Esta famlia de fluorforos tem

grande intensidade de fluorescncia em relao emisso de cores, possuindo

faixas espectrais distintas e esto disponveis em diferentes composies

qumicas permitindo rotulagem via amina ou grupos tiol. O fluorforo Cyanine

proporciona alta sensibilidade e fotoestvel (ERNST,1989).

O marcador Cy3 tem emisso na regio do verde e pode ser

sintetizado com grupos reativos em cada um dos radicais [R] ou ambas as

cadeias laterais, de modo que o fluorforo pode ser quimicamente ligado a

qualquer cido nuclico ou molculas de protenas (ERNST,1989). Na Figura 4

apresenta-se a estrutura molecular do Cy3. Os Radicais [R] representam os

grupos aminas ou tiol aos quais a molcula pode se ligar. Os nmeros 1, 2 e 3

representam as posies das ramificaes que compem a estrutura molecular

do fluorforo.

38

Figura 4 - Ilustrao da estrutura molecular do fluorforo comercial Cy3. O N+ o

smbolo do on nitrognio e o I- o smbolo do on iodo.

Fonte: Modificado de LAUREN et al,1988

O Cy3 constitui uma famlia molecular com solubilidade em gua, e

tolerncia ao Dimetilsulfxido (DMSO), com comprimento de onda de excitao

da ordem de 550 nm e de emisso da ordem de 570 nm (ambos na faixa de

emisso do verde). A marcao em sistemas mdicos e biolgicos

direcionada para identificao e quantificao do complexo antgeno-anticorpo

ou de estruturas internas da clula. Os Cy3 so usados em uma ampla

variedade de aplicaes. Para rotulagem de protenas e cidos ncleicos tal

como descrito pelos trabalhos de WILTSHIRE, 2000, e para localizao de

DNA e RNA (XIAO, 2007).

Esta classe de marcadores insensvel ao pH na faixa entre 3-10 e

fotoestvel. A fluorescncia advinda desse marcador permanece por mais

tempo, caracterizado pela fotoestabilidade. As caractersticas pticas da famlia

de Cys, que refletem a qualidade de um fluorforo, so apresentadas na

Tabela 2.

39

Tabela 2 - Caractersticas pticas relevantes para um fluorforo da famlia Cy-corante

Cy-

corante

Peso Molecular [u]

ABS [nm]

Em [nm]

Rendimento Quntico

Coeficiente de

extino molar

[M-1

.cm-1

]

Tempo de

vida [ns]

Cy3 765,9 548 562

40

(71Lu), entre os quais se incluem o trio (39Y89) e o escndio (21Sc

45),(LEE,

1999).

Esses elementos so aplicados na investigao das propriedades e

funes de sistemas biomdicos e na identificao de substncias biolgicas.

Eles so usados principalmente como sondas espectroscpicas no estudo de

biomolculas e suas funes, por exemplo em marcadores biolgicos para

acompanhar o caminho percorrido pelos medicamentos no homem e em

animais; tambm como marcadores em imunologia e, como agentes de

contraste em diagnstico no invasivo de patologias em tecidos por imagem de

ressonncia magntica nuclear (MARTINS, 2005).

A semelhana entre as caractersticas fsicas e qumicas dos

elementos lantandeos (S, 2000) faz com que eles sejam mais estveis. LUI

(1997) descreve o estudo de fluorescncia resolvida no tempo onde se

encontrou os tempos de vida de luminescncia dos sistemas contendo eurpio

em torno de microsegundos. A presena do elemento eurpio em alguns

complexos ou polmeros faz com que a luminescncia esteja presente (LIMA,

2005). H uma transferncia de energia intramolecular do on metlico central e

esse efeito chamado de efeito antena3 .

Dentre os lantandeos, os ons Eu(III) e Tb(III), so os mais utilizados

como sondas espectroscpicas, nas quais os elementos considerados

quelatos 4 destes elementos so os mais convenientes como sondas

luminescentes para sistemas biolgicos. Isto se deve ao fato de os mesmos

serem estveis e a transferncia de energia do quelato para o on Ln poder

atingir eficincia de aproximadamente 100% (BNZLI, 1989), fazendo com que

a luminescncia seja intensa, apresentando assim, alto rendimento quntico.

Os tempos de vida de luminescncia destes complexos so longos (100 a

1000 s); a diferena de energia entre a absoro do ligante e a emisso do

on (deslocamento de Stokes) muito grande, acima de 200 nm; possuem alta

3 O processo de converso de luz, chamado de efeito antena, envolve a absoro de radiao

ultravioleta atravs dos ligantes, que atuam como antenas, a transferncia de energia do

estado excitado do ligante para os nveis 4f do on metlico e a emisso de radiao se d no

visvel, caracterstica do on metlico ( LIMA, 2005) 4 Quando, em uma molcula, o tomo de metal possui ligantes coordenados a ele,sendo que, cada um desses ligantes efetua duas ligaes ou mais com este metal, essa molcula considerada um quelato ( SALIBA,2009)

41

sensibilidade de deteco; tm facilidade de se ligarem ao reagente

bioanaltico para marcao de antgenos e/ou anticorpos (BNZLI, 1989).

O complexo LaPPS34M que estudado em relao ao fluorforo

comercial Cy3, apresenta maior tempo de luminescncia, em torno de 110 s a

114,5 s, como est demonstrado nas figuras 30 e 32.

2.5. NANOPARTCULA

A nanotecnologia refere-se tcnica utilizada para manipular

estruturas na ordem de 10-9 m, tornando possvel a criao de estruturas

funcionais em nano escala. Elas podem ser produzidas a partir de diferentes

materiais e formas (LIU, 2006).

As nanopartculas so utilizadas em uma grande variedade de reas,

incluindo materiais avanados, eletrnica, magnetismo, optoeletrnica,

biomedicina, frmacos e cosmticos (ZUO et al, 2007). H vrias

nanopartculas como as de materiais metlicos, por exemplo: ouro (Au), prata

(Ag), nquel (Ni), cobre (Cu), semicondutores e os polmeros.

A Figura 6 apresenta as nanopartculas metlicas em diferentes

dimenses, formas e composies e produzem materiais com distintas

propriedades de disperso da luz. Outra caracterstica visvel na figura a

variao na cor das nanopartculas metlicas (ROSI et al, 2005).

42

Figura 6 - Dimenses, formas e tamanhos das nanopartculas metlicas.

Fonte: Modificado de ROSI et al, (2005)

A utilizao de nanopartculas possibilita que ao conjug-las

conjuntamente com fluorforos, h um aumento da intensidade de

fluorescncia (LAKOWICZ, 2001). A intensificao do sinal permite que a

deteco de fluorescncia seja ampliada por causa da transferncia de energia

de ressonncia.

As aplicaes dessa tecnologia so a caracterizao e o

aprimoramento de novos biomarcadores, como por exemplo, para o

diagnstico de cncer e a deteco de doenas infecciosas por micro-

organismos (SOKOLOV, 1998) e (SIWACH, 2009).

O aumento da intensidade de fluorescncia do fluorforo Cy3 e do

complexo LaPPS34M foi realizado com o uso de nanopartculas de ouro e

prata e serviro de parmetros para a otimizao do sistema de

instrumentao desenvolvido com a finalidade de obter as caractersticas

pticas das amostras. As nanopartculas utilizadas foram produzidas pela

UFPR e sua produo e caracterizao esto apresentadas no anexo C.

43

2.5.1. Fluorforo na Presena de Nanopartculas

A transferncia de energia de ressonncia de fluorescncia

(Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET) uma tcnica para a

caracterizao de interaes distncia. uma das poucas ferramentas

disponveis que capaz de medir as interaes intermoleculares e a distncia

intramolecular tanto in vivo quanto in vitro (SELVIN, 2000). um processo pelo

qual um doador no radiativo do estado excitado (e.g., um fluorforo) transfere

energia para um estado receptor atravs de interaes de longo alcance

dipolo-dipolo (LAKOWICZ, 1999).

A FRET envolve a excitao de um fluorforo doador por incidncia de

luz dentro do seu espectro de absoro. Essa absoro de radiao eleva o

fluorforo a uma maior energia, estado excitado, que normalmente decai

(retorno ao estado fundamental) com um espectro de emisso caracterstico.

Se, no entanto, outro fluorforo ou nanopartculas (o receptor) existe nas

proximidades do doador h uma sobreposio do espectro de absoro do

receptor ao espectro de emisso do doador e, em seguida a possibilidade de

transferncia de energia no-radiativa entre o doador e o receptor (PRASAD,

2003).

A Figura 7 mostra a sobreposio do espectro de absoro da protena

fluorescente fluorescena e do espectro de emisso da protena fluorescente

rodamina possibilitando uma forte interao FRET.

44

Figura 7 - Esquema do processo de FRET entre dois fluorforos, a fluorescena doadora)

e a rodamina (receptora), onde r a distncia de mnima de FRET.

Fonte: Modificado de SAPSFORD et al, 2006.

Em geral, o doador e o receptor so diferentes. O FRET detectado

pelo aparecimento de fluorescncia do receptor ou por extino de

fluorescncia do doador.

Em uma molcula os eltrons migram do estado fundamental (So) para

um nvel de vibrao mais elevada, de forma rpida com tempos da ordem de

pico segundos. Estes eltrons decaem para o nvel mais baixo de vibrao (S1)

e, eventualmente, dentro de nanosegundos, voltam para o estado (So) e um

fton de luz emitido (LAKOWICZ et al, 2008).

Na transferncia de energia de ressonncia o fton no emitido, mas

a energia transferida para a molcula receptora, cujos eltrons por sua vez,

tornam-se excitados. Isto est apresentado na Figura 6, por meio de um

diagrama de Jablonski para o processo de FRET.

45

Figura 8 - Descrio do processo de FRET pelo de diagrama de Jablonski.

Fonte: Prpria

O FRET pode resultar em uma diminuio da fluorescncia da

molcula doadora como em um aumento da fluorescncia do receptor. O

mtodo estabelece a medida da interao entre o fluorforo e a superfcie das

nanopartculas A taxa de transferncia de energia dependente de muitos

fatores, tais como o grau de sobreposio espectral entre o doador e o

receptor, a orientao relativa dos dipolos de transio, e mais importante, a

distncia entre o doador e receptor nas molculas. Geralmente o FRET ocorre

nos sistemas biomdicos em dimenses (r) em torno de 2 a 10 nm (CHEN,

2007).

Quando se conjuga as nanoparticulas com fluorforos ou complexos

h um aumento da intensidade de fluorescncia. A Figura 30 representa o

resultado do fenmeno de FRET para o caso de nanopartculas de prata

conjugadas com o bioindicador LaPPS34M.

46

2.6. RESUMO

Neste captulo, apresentou-se que a medio de fluorescncia apresenta

potencialidade para sistemas de diagnsticos rpidos utilizando um

biomarcador fluorescente.

Para a caracterizao ptica deste indicador fluorescente utilizou-se os

espectros de absoro e emisso da substncia ou complexo, o deslocamento

de Stokes entre a absoro e emisso e o tempo de vida do emisso de

luminescncia.

Normalmente, o Cy3 o indicador mais utlizado para a marcao do

complexo antgeno-anticorpo, entretanto, este trabalho utililizar o novo

complexo LaPPS34M (Lapps/UFPR) para a emisso de fluorescncia devido

ao maior tempo de emisso (na ordem de 100s) e deslocamento de Stokes

(em torno de 200 nm).

Adicionalmente, o uso de nanopartculas possibilitar a intensificao

do sinal de fluorescncia quando houver a conjugao de fluorforos com as

nanopartculas.

No captulo a seguir, apresenta-se uma descrio dos elementos

utilizados na implementao de um sistema de aquisio de fluorescncia.

47

3. SISTEMAS DE AQUISIO DE LUMINESCNCIA

3.1. INTRODUO

Neste captulo apresentado o sistema implementado para a deteco

da emisso de fluorescncia dos fluorforos Cy3 e LaPPS34M. Dentro deste

sistema, utilizou-se para a deteco de fluorescncia, a vlvula

fotomultiplicadora R928 e a vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 e,

posteriormente, por um componente optoeletrnico OPT 301.

3.2. DETERMINAO DO ESPECTRO DE ABSORO DO CY3 E DO

COMPLEXO LaPPS34M

A anlise de elementos qumicos, as estruturas internas dos compostos

e o levantamento de dados fsico-qumicos da absoro, emisso e disperso

da interao da luz com as amostras so essenciais para descrever o

comportamento e natureza dos compostos orgnicos (LEE, 1999).

A absoro de radiao eletromagntica que acontece na regio do

ultravioleta e tambm do visvel, estudada atravs da espectroscopia de

absoro. Se o objeto de interesse a emisso, obtm-se tal espectro pela

espectroscopia de emisso. H outros tipos de espectroscopia como de

infravermelho, de microondas, Raman, de fluorescncia, de raios x, de plasma,

fotoacstica e de ressonncia magntica (OKUNO, 1982).

Para que haja interao entre a luz incidente e a amostra deve haver

ressonncia. A radiao eletromagntica e as partculas da amostra devem ter

a mesma frequncia, e isto s possvel se a energia de excitao for maior

que a fundamental levando s transies eletrnicas entre os nveis de energia

(EISBERG, 1988).

A absoro molecular se d atravs da soma das contribuies de

vrios nveis de energia, a rotacional, vibracional e eletrnica. O movimento de

translao da molcula como um todo no modifica as posies relativas das

48

partculas que a constituem, entretanto as ligaes intermoleculares e os

ngulos entre as ligaes vibram, enquanto que a estrutura nuclear gira como

um todo. Podemos desprezar os movimentos de rotao e vibrao das

molculas, pois as velocidades eletrnicas so pelo menos mil vezes maiores

que as nucleares (BASSI, 2001).

3.2.1. Espectrofotmetro de Duplo Feixe

Para a determinao o espectro de absoro e emissao dos fluorforos

Cy3 e LaPPS34M, utilizou-se um espectrofotmetro para as regies do

ultravioleta, do visvel e do infravermelho.

O espectrofotmetro apresenta uma fonte de radiao eletromagntica

de espectro contnuo, um porta amostra, um monocromador e um detector

(Figura 9). Nos espectrofotmetros de feixe simples a radiao s atravessa a

amostra e nos espectrofotmetros de feixe duplo mede-se simultaneamente a

intensidade transmitida pela amostra e a transmitida por um padro de

referncia, a diferena das duas intensidades aquela absorvida pela amostra.

49

Figura 9 - Desenho esquemtico do espectrofotmetro de duplo feixe

Fonte: Prpria

O equipamento disponvel no laboratrio de ptica da UTFPR consiste

em um espectrofotmetro de duplo feixe UV-VIS, modelo DB 1880S,

composto de duas fontes ticas, uma lmpada de tungstnio halognio ( para

a regio do visvel) e outra de deutrio (para a regio do ultravioleta). Tem-se

internamente dois monocromadores que permitem a passagem de uma faixa

estreita do espectro da energia incidente com um comprimento de onda

especfico, que varia de 190 nm a 1100 nm. A cubeta onde se coloca a amostra

de quartzo com volume de 3,5 ml e o comprimento do caminho ptico, pelo

qual se dar a interao da radiao e a substncia da amostra, definido pelo

dimetro interno da cubeta na ordem de 10 mm. A fotografia 1 representa o

equipamento disponvel no laboratrio de ptica da UTFPR.

50

Fotografia 1 - Espectrofotmetro de Duplo Feixe UV-Vis.

Fonte: Prpria

O sistema descrito foi utilizado para se obter os espectros de absoro

do fluorforo comercial Cy3, o espectro de absoro do complexo LaPPS34M,

e a resposta espectral dos filtros utilizados no experimento.

3.2.1.1. Espectro de Absoro

Os espectros de absoro do fluorforo comercial Cy3 e o do complexo

LaPPS34M foram obtidos pelo espectrofotmetro descrito no item 3.2.1. O

fluorforo Cy3 foi diludo em uma soluo tampo na proporo 1:1, isto , 1 ml

de soluto em 1 ml de solvente e colocado na cubeta de quartzo e transportada

ao espectrofotmetro. Observa-se que a absoro do fluorforo Cy3 acontece

na regio compreendida entre 530nm e 560nm, com um pico mximo em

550 nm, conforme vizualiza-se na Figura 6. O espectro de absoro do

complexo LaPPS34M foi obtido diluindo a amostra em soluo de

tetrahidrofurano (THF), seguindo o mesmo procedimento no qual foi obtido o

espectro de absoro do fluorforo Cy3. A Figura 6 representa o grfico do

complexo LaPPS34M com um pico mximo (principal) em 400nm e outro

secundrio em 300nm.

51

Figura 10 - Espectro de absoro do fluoroforo Cy3 obtido pelo espectrofotmetro.

Fonte: Prpria

Figura 11 - Espectro de absoro do complexo LaPPS34M obtido pelo espectrofotmetro

Fonte: Prpria

Os resultados indicam que no caso do fluorforo Cy3, os dados

coletados no laboratrio da UTFPR correspondem ao disponvel na literatura,

pois o pico mximo de absoro se encontra em 550 nm, conforme

apresentado na Erro! Fonte de referncia no encontrada.. Para o estudo do

complexo LaPPS34M percebe-se a presena de dois picos, sendo que a maior

52

absorbncia se encontra em 400 nm, como demonstrado na Erro! Fonte de

referncia no encontrada..

3.3. SISTEMA DE AQUISIO DE SINAL DE FLUORESCNCIA

Para a deteco da luminescncia, foi implementado um sistema de

deteco de acordo com a Figura 12. O sistema composto por (a) uma fonte

ptica acoplada a um gerador de sinais utilizado para a excitao do fluorforo,

(b) um fluorforo em uma cubeta posicionada de forma que o caminho ptico

de excitao e de deteco formem um ngulo de 90 graus para minimizar a

energia de excitao que incide no sensor de luminescncia, (c) lente

convergente para orientar o feixe incidente d) Monocromador ou filtro ptico

para emisso, (e) um fotodetector de estado slido, (f) um amplificador de

transimpedncia, (g) e (h) representam o sistema de aquisio e

processamento de sinais atravs do osciloscpio e computador padro.

Figura 12 - Representao esquemtica do sistema de deteco proposto

Fonte: Prpria

O mtodo proposto ser dividido em trs fases devido a utilizao de

trs distintos optodetectores (vlvula fotomultiplicadora R928, vlvula

fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 e detector optoletrnico OPT301):

53

A fase I constituda da coleta de dados a partir da instrumentao

com o uso da vlvula fotomultiplicadora R928, conforme pode ser visto na

Figura 13

Figura 13 - Desenho esquemtico do sistema experimental por vlvula fotomultiplicadora

R928 (de alta sensibilidade)

Fonte: Prpria

A instrumentao descrita na Figura 13 possibilita a obteno do

espectro de fluorescncia e o tempo de vida de luminescncia da amostra

LaPPS34M na fase 1, bem como o espectro de fluorescncia do fluorforo

comercial Cy3, cujo sistema de deteco baseia-se na utilizao da vlvula

fotomultiplicadora grande. O sistema composto por (a) uma fonte ptica

acoplada a um gerador de sinais utilizado, neste caso leds ultravioleta e azul

(b) uma cubeta de quartzo contendo a amostra, (c) uma lente convergente d)

um monocromador para selecionar o comprimento de onda de emisso modelo

SpectraPro 275 (Acton Research Co., U.S.A) com distncia focal de 275 mm,

sistema ptico do tipo Czerny-Turner, (d) uma vlvula fotomultiplicadora grande

tipo janela lateral R928 (Hamamatsu Co.,U.S.A), (e) um amplificador de

transimpedncia, (f) e (g) um sistema de aquisio e processamento de sinais.

A fase II constituda de (a) uma fonte ptica composta de um diodo

emissor de luz ultravioleta,(b) uma cmara de amostra que contm sada que

direcionam o feixe de luz do diodo emissor de luz para o filtro, (c) um filtro que

54

serve para selecionar o comprimento de onda de emisso de fluorescncia, (d)

uma vlvula fotomultiplicadora miniatura em modelo R5600U-01 ultra compacto

com 10 mm de comprimento, 15 mm de dimetro e janela ptica (fotocatodo)

de 8 mm de dimetro. So ainda componentes da fase II, (e) um amplificador

de transimpedncia usado para converte o sinal luminoso em tenso eltrica (f)

um osciloscpio que permite a captao dos sinais e (g) um computador

padro para realizar o tratamento dos dados.

O tamanho reduzido da vlvula e do filtro de interferncia permitiu a

acomodao deste conjunto em uma das sadas da cmara de amostras,

configurando um sistema compacto conforme o esquema apresentado na

Figura 14.

Figura 14 - Desenho esquemtico do sistema com o uso da vlvula fotomultiplicadora

miniatura (R5600U-01).

Fonte: Prpria

No caso especfico do sistema com o uso da vlvula fotomultiplicadora

miniatura (R5600U-01), a cmara de amostra adaptada para que a amostra

seja utilizada em um tubo de ensaio, tamanho de 2 cm de dimetro e 10 cm de

altura. O complexo LaPPS34M foi diludo em tetrahidrofurano (THF) colocado

no tubo de ensaio e posteriormente na cmara de amostra. Atravs da

configurao descrita na Figura 14, permite-se obter o tempo de vida de

luminescncia.

55

A fase III corresponder pelo uso da mesma instrumentao com

detector optoleletrnico, a ilustrao do desenho esquemtico do sistema

apresentada na Erro! Fonte de referncia no encontrada..

Figura 15 - Desenho esquemtico do sistema experimental por fotodiodo

Fonte: Prpria

A instrumentao descrita na Erro! Fonte de referncia no encontrada.

possibilita a obteno do tempo de vida de luminescncia da amostra

LaPPS34M na fase 3, cujo sistema de deteco baseia-se na utilizao do

fotodiodo OPT301. O sistema composto por (a) uma fonte ptica acoplada a

um gerador de sinais utilizado para a excitao do indicador, (b) um indicador

em uma cubeta posicionada de forma que o caminho ptico de excitao e de

deteco formam um ngulo de 90 graus, (c) filtro ptico para permitir a

emisso, (d) um fotodetector de estado slido, (e) amplificador de

transimpedncia utilizado para converter o sinal luminoso em sinal eltrico (f)

um sistema de aquisio e processamento de sinais.

A fonte ptica corresponde ao diodo emissor de luz na faixa do violeta

com comprimento de onda para o pico de emisso em 400 nm. Aplica-se um

sinal com frequncia de 100Hz (periodo de 10 ms) e duty cicle de

aproximadamente 15%, isto , pulso de 1.5 ms. Esse sinal foi aplicado

utilizando-se o gerador de sinais AFG3000 da Tektronix.

A amostra LaPPS34M. foi diluda em uma soluo de tetrahidrofurano

(THF) na proporo 1:1, isto , 10 ml de soluto em 10 ml de solvente e

colocada num tubo de ensaio de 2 mm de dimetro.

56

No caminho ptico da emisso foi acrescido um filtro de interferncia

com o espectro de transmitncia apresentado na Figura 20. Observa-se que a

resposta desse filtro apresenta elevada transmitncia na regio de emisso do

complexo LAPPS34M. O filtro foi adicionado ao sistema com a inteno de

minimizar qualquer interferncia da energia de excitao no fotodetector

permitindo a passagem da energia emitida pelo indicador.

A deteco do sinal de fluorescncia foi obtida por um fotodiodo

OPT301, com janela fotosensvel de 2,29 mm x 2,29 mm (OPT301, 1994). O

fotodetector tem um amplificador conversor corrente-tenso integrado no

mesmo encapsulamento. A Erro! Fonte de referncia no encontrada.a

apresenta o circuito interno do OPT301 e a Erro! Fonte de referncia no

encontrada.b a resposta espectral do sensor.

Figura 16 - (a) Dispositivo OPT 301 apresenta um fotodiodo integrado com amplificador

conversor corrente-tenso, (b) resposta espectral do OPT 301, (i) emisso de

luminescncia do indicador (LAPPS34M ~ 615 nm) (ii) excitao do indicador (LAPPS34M

~ 350 nm).

Fonte: Burr-Brown Corporation, 1994

Da figura 16(b), a resposta espectral do detector optoreletrnico

apresenta: (a) uma boa resposta para a emisso de luminescncia do indicador

(LAPPS34M ~ 615 nm) e (b) uma resposta inferior para a excitao do

indicador (LAPPS34M ~ 350 nm).

Os sinais foram adquiridos com um osciloscpio digital modelo

TDS2002B (Tektronix, Beaverton, OR, U.S.A.). Os sinais so digitalizados e

(i)

(ii)

57

armazenados em um dispositivo via interface serial USB. Aps transferidos

para um computador os dados so processados utilizando uma funo

Dynamic Fit Wizard do programa Sigmaplot 11.0 para determinao dos

parmetros de uma ou mais exponenciais. O parmetro de tempo de

decaimento da exponencial corresponde ao tempo de vida de luminescncia do

indicador LaPPS34M.

Na fase I, II e III com a utilizao dos sistemas descritos nas figuras 13,

14 e 15 foram coletadas as caractersticas pticas necessrias para

caracterizar o fluorforo estudado, ou seja, o complexo LaPPS34M.

O levantamento dos espectros de absoro, de emisso de

fluorescncia e os tempos de vida de luminescncia so os parmetros

relevantes para a consolidao das caractersticas pticas de um fluorforo. A

descrio do uso de nanopartculas de ouro e prata serviro para demonstrar a

possibilidade de intensificar o sinal de intensidade de fluorescncia nos

sistemas utilizados.

3.4. SISTEMA DE DETECO DE FLUORESCNCIA

Em um sistema de deteco de luminescncia tpico, um feixe de luz

de alta intensidade passa atravs de lentes convergentes para orientar o feixe

a passar pela cubeta. O feixe de luz de excitao passa atravs de uma cubeta

contendo a amostra (Figura 12). Para evitar a deteco do feixe incidente,

pode-se fazer a observao da fluorescncia em ngulo reto com o feixe

incidente, pois a amostra ir emitir em todas as direes. A luz emitida

(luminescncia) passa atravs de um monocromador para a anlise do

comprimento de onda e depois vai para um detector fotossensvel (vlvula

fotomultiplicadora). Os comprimentos de onda so detectados e apresentam a

intensidade de emisso como uma funo do comprimento de onda da luz

emitida (WILLARD, 1988).

e: Prpria

3.4.1. Fonte ptica

58

A fonte ptica deve ceder energia radiante para a faixa de comprimento

de onda de absoro do estudo. H vrios tipos de fontes pticas que podem

ser utilizadas para obter a fluorescncia como: diodos emissores de luz Light-

Emitting Diodes (led) e os dispositivos de Light Amplification by Stimulated

Emission of Radiation (LASER).

A excitao advinda dos marcadores fluorescentes gera pulsos na faixa

de nano segundos. A fonte ptica deve ser capaz de fornecer um espectro de

energia abrangente. Os diodos representam a fonte ptica escolhida por

apresentarem um baixo custo e grande diversidade de comprimentos de onda.

Para a obteno do tempo de vida de luminescncia da molcula

LaPPS34M utilizou-se uma lmpada xnon de arco curto (1,5 mm) para

excitao pulsada tipo FX-249 (EG&G ELETRO-OPTICS, U.S.A). A Figura 17

representa o espectro de emisso. Esta lmpada possibilita excitaes na faixa

de 7J e potncia mdia de 20 W e trabalha com tenses de at 1500 V com

taxas de repeties de at 500 Hz. A faixa espectral est entre 310 a 1100 nm.

Figura 17 Espectro de emisso da lmpada xenon

Fonte: Prpria

Utilizou-se conjuntamente uma fonte de disparo da lmpada tipo PS-

302 (EG&G ELETRO-OPTICS, U.S.A), a tenso de sada pode ser regulada

entre 400 e 1500 V, com pulsos com tenso de 3V com durao de 1 a 100 s.

300 400 500 600 700 800

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Em

iss

o R

ela

tiva

[a

.u]

Comprimento de Onda [nm]

59

As figuras 18 e 19 representam os espectros de emisso dos dois leds

utilizados no experimento, os espectros de emisso do led azul e do ultravioleta

foram obtidos utilizando o sistema descrito pela Figura 12.

Figura 18 - Espectro de emisso de led azul, com comprimento de onda do pico 440 nm.

Fonte: Prpria

Figura 19 - Espectro de emisso de led ultravioleta, com comprimento de onda do pico

400 nm.

Fonte: Prpria

3.4.2. Lentes Convergentes e Filtros

60

A lente convergente utilizada no experimento de fluorescncia serviu

para redirecionar a luz que vem da fonte ptica, neste caso do diodo emissor

de luz (led) para o foco. A amostra era colocada na posio focal em relao

lente. Foram utilizadas duas lentes convergentes de 15 cm e 5 cm de distncia

focal respectivamente, como mostra o esquema de montagem do sistema de

deteco representado na Fotografia 2.

Fotografia 2 - Montagem do uso das lentes convergentes no experimento de

fluorescncia.

Fonte: Prpria

Os filtros em geral selecionam os comprimentos de onda que so

transmitidos atravs de absoro, pela interao da energia radiante incidente

com o material do filtro. Eles possibilitam a passagem de comprimentos de

onda acima ou abaixo de um valor especfico; caracterizam-se por no serem

sensveis ao ngulo de incidncia da radiao e so muito utilizados em

sistemas ticos para selecionar as faixas de frequncia desejveis.

No experimento de fluorescncia, para a obteno do tempo de vida do

complexo LaPPS34M foram utilizado filtros de 614 nm e 640 nm. A Figura 20

61

representa o espectro de transmisso de um filtro de interferncia na regio do

vermelho.

Figura 20 - Espectro de transmitncia do filtro de interferncia na regio do vermelho

Fonte: Prpria

3.4.3. Monocromador

A funo de um monocromador permitir a passagem de uma faixa

estreita do espectro da energia radiante centrada em um comprimento de onda

especfico. O monocromador utilizado no experimento de deteco de

fluorescncia foi o SpectraPro 275 (Acton Research Co., U.S.A) com distncia

focal de 275 mm, sistema ptico do tipo Czerny-Turner, conforme mostra a

Fotografia 3. O equipamento permite o controle local ou remoto da velocidade

de varredura, comprimentos de onda inicial e final, avano passo a passo, para

uma das duas grades possveis de serem acopladas.

A 1 Grade possui 1200 ranhuras/mm, comprimento de onda de

transmisso de 300nm, e a 2 Grade possui 1200 ranhuras/mm, comprimento

de onda de 500 nm (Acton Research Co., 1992). As fendas foram fixadas em

3,0 mm, tanto na entrada com na sada, possibilitando um controle da faixa de

passagem do comprimento de onda e da resoluo. A resoluo mxima est

em torno de 0,1 nm medido para um comprimento de onda a 435,8 nm com

uma grade difratora de 1200 ranhuras/mm.

600 700 800 900 1000 1100

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Tra

nsm

it

ncia

[%

]

Comprimento de Onda [nm]

62

Para o experimento foi escolhida a grade 1 por estar de acordo com a

regio do espectro do de fluorescncia desejado com a largura da fenda

mantida constante em 3 mm.

Fotografia 3 - Monocromador do tipo Czerny-Turner.

Fonte: Prpria

3.4.4. Cubeta

A cubeta do tipo 111OS (Hellmasulamericana Ltda) para os estudos

de fluorescncia possui todas as laterais polidas de quartzo, possibilitando que

a transmitncia seja alta para a faixa de comprimento de onda de excitao e

emisso, permitindo que a luz de excitao entre em uma direo e possa ser

detectada em outra direo, perpendicular a da excitao, diminuindo assim a

incidncia de radiao de excitao no detector. A cmara de amostra utilizada

possui um caminho ptico de 10 mm, conforme ilustrado na Figura 21.

Na Figura 22 representado o espectro de transmitncia da cubeta de

quartzo. Na faixa correspondente a absoro da amostra LaPPS34M, a cubeta

de quartzo apropriada, pois tem pouca absoro no ultravioleta.

63

Figura 22 - llustrao do espectro de transmitncia da cubeta de quartzo

Fonte: BRANCO, 1997

3.4.5. Vlvulas Fotomultiplicadoras ( PMTs)

Figura 21 - Diagrama representativo da transmitncia de luz pela amostra na cubeta

Fonte: Modificado de BRANCO, 1997

64

A deteco realizada atravs da transformao dos sinais pticos em

sinais eltricos com o uso de sensores opto-eletrnicos. Um dos sensores

utilizados foi uma vlvula fotomultiplicadora tipo janela lateral R928

(Hamamatsu Co.,U.S.A) com sensibilidade do catodo de 352 A/lmen, com

corrente de anodo na ausncia de energia radiante incidente de 4,5 nA. O

tempo de subida do sinal de 2,2 ns e a resposta espectral ptica varia de 190

a 900 nm. Utilizou-se uma fonte de alta tenso para a polarizao da vlvula,

conversor DC-DC tipo C1309-04 ( Hamamatsu Co., U.S.A) com tenso de

entrada de 13 a 24 V e corrente de 160 mA. A tenso de sada regulada foi de

190 a 1100 V.

As vlvulas fotomultiplicadoras (PMT - photo multiplier tube) combinam

uma camada fotosensvel de metais alcalinos (multialkali: Na-K-Sb-Cs)

denominada de fotocatodo, e um multiplicador de eltrons que consiste em

uma srie de dinodos cobertos com um material de alta emisso secundria

(metal channel dynode). O fotocatodo converte ftons incidentes em

fotoeltrons e estes so multiplicados de dinodo para dinodo atingir o anodo,

conforme a Figura 23.

Figura 23 - Representao do processo de gerao e multiplicao de eltrons em uma

vlvula fotomultiplicadora

Fonte: BRANCO,1997

Um conjunto de resistores divide a tenso de polarizao para os

diversos dinodos. O ganho total (G) da vlvula corresponde ao nmero de

estgios n multiplicado pelo fator de emisso secundria por estgio f , sendo

dado por:

65

G f n (Eq.12)

Os valores assumidos por f apresentam-se na faixa de 3 a 10, sendo

que para dinodos recobertos com GaP (Fosfeto de Glio), o fator de emisso

secundria pode alcanar 50. Esta larga capacidade de amplificao interna,

permite a utilizao das PMTs na medio de sinais luminosos com baixos

nveis de intensidade, na faixa de 10-14 a 10-4 lmens, sendo que 1 lmen

corresponde a 1,47 mW (BRANCO, 1997).

3.4.6. Amplificador de Transimpedncia

Para converter a corrente do sensor optoeletrnico em um nvel de

tenso, utiliza-se um amplificador de transimpedncia.

O circuito apresentado na Figura 24 foi montado em circuito impresso e

introduzido numa caixa metlica. O circuito possui capacitores para estabilizar

a tenso de alimentao, diodos (1N4148) de proteo na entrada e diodo para

alimentao da tenso de sada. O amplificador operacional foi o OP 627 com

baixa corrente de fuga e offset e alta impedncia de entrada com baixo valor

capacitivo, alto ganho de malha aberta, ampla largura de banda de 16 MHz

assim como variao da tenso de sada.

Figura 24 - Circuito de Implementao do Amplificador de Transimpedncia

Fonte: SCHNEIDER, 1995

66

3.4.7. Aquisio do Processamento do Sinal

Os sinais foram adquiridos com um osciloscpio digital modelo

TDS2002B (Tektronix, Beaverton, OR, U.S.A.). Os sinais so digitalizados e

armazenados em um dispositivo via interface serial USB. Depois de

transferidos para um computador os dados so processados. Utilizou-se uma

funo Dynamic Fit Wizard do programa Sigmaplot 11.0 para determinao dos

parmetros de uma exponencial

3.5. RESUMO

Implementou-se um sistema de deteco de fluorescncia com 3

distintos detectores pticos, denominados de fases I (vlvula fotomultiplicadora

R928), II (vlvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01) e III (detector

optoeletrnico OPT301). De acordo com os detectores e as suas medidas dos

tempo de emisso de fluorescncia, estes serviro de referncia para a

construo de equipamentos de baixo custo e maior resistncia mecnica.

O captulo 4 a seguir apresenta os ensaios realizados para a

determinao dos tempos de vida da fluorescncia com a instrumentao

implementada e o marcador LaPPS34M.

67

4. RESULTADOS

4.1. INTRODUO

No sistema desenvolvido, a deteco de fluorescncia foi feita por

meio de (a) vlvulas fotomultiplicadoras e (b) um detector optoeletrnico. Os

resultados deste trabalho so apresentados neste captulo na seguinte

sequncia:

a) Os espectros de emisso de Fluorescncia do Cy3 e do complexo

LaPPS34M;

b) Os espectros de emisso de fluorescncia conjugados com

nanopartculas do Cy3 e do complexo LaPPS34M;

c) O tempos de vida de luminescncia do complexo LaPPS34M.

4.2. ESPECTROS DE FLUORESCNCIA

a) Fluorforo Cy3

Os espectros de fluorescncia de Cy3 foram obtidos atravs da fase I

descrita no item 3.3. A amostra de fluorforo comercial Cy3 foi diluda em

soluo tampo na proporo de 1:1 e colocada na cubeta de quartzo. A Figura

25 representa o grfico da regio do espectro de emisso.

O fluorforo Cy3 apresenta excitao na regio do azul e regio