Detecção Sorológicas

DETECÇÃO SOROLÓGICAS: CMV, TOXOPLASMOSE, MONONUCLEOSE INFECCIOSA E DOENÇA DE CHAGAS

Daniela Amaral ToméR2 de Patologia Clínica

CMV- CITOMEGALOVÍRUS

DEFINIÇÃO

É uma infecção comum que pode ser transmitida por via respiratória, por meio do contato com gotículas de espirro, saliva ou tosse de pessoas contaminadas, por transfusão sanguínea ou por relação sexual

A forma congênita ocorre pela transmissão vertical(da mãe para o feto) durante a gestação Costuma ser grave sobretudo se adquirida no

primeiro trimestre de gestação, quando é capaz de acarretar sequelas neurológicas, visuais e auditivas.

ETIOLOGIA O citomegalovírus (CMV), também é conhecido como HHV-5 É um herpesvírus humano (HHV) Pertencente à família Herpesviridae e subfamília β-

Herpesvirida Uma característica peculiar desse vírus é a sua capacidade de

latência: não é eliminado do organismo e como os outros herpesvírus,

permanece ali de forma latente, e sua viremia se mantém em níveis reduzidos.

Pode ser reativado em função de fatores que alterem o sistema imune como: gestação, uso de drogas imunossupressoras, AIDS

Após reativação pode causar diversas doenças como : Pneumonia Esofagite , encefalite, hepatite, pancreatite, Gastrite , enterite, colite e Retinite

INFECÇÃO

A infecção ocorre com o contato íntimo por secreções biológicas como: sêmen secreções vaginais Saliva urina

Transmissão horizontal por transfusão de sangue e transplante de orgãos

Uma última forma de contaminação ocorre por transmissão vertical durante a gestação (via transplacentária)

No momento do parto

No período pós-natal (via leite materno)

CICLO VIRAL Em um paciente imunocompetente a maior parte do

vírus é destruída(por células T citotóxicas específicas para CMV)

A infecção procede de forma assintomática A presença desta infecção assintomática é baseada na

detecção de CMV nos fluidos corporais O período de incubação: é de 4 a 12 semanas Nesse período, há o aparecimento de IgM-CMV ou, mais

tarde, aumento de cerca de 400% no nível de IgG-CMV Em pacientes imunocomprometidos que não receberam

os tratamentos adequados contra CMV, a infecção se torna sintomática

As manifestações clínicas são quase exclusivas de recém-nascidos de mães com infecção primária durante principalmente a primeira metade da gestação

QUADROS CLÍNICOS

INFECÇÃO CONGÊNITA E PERINATAL Retardo do crescimento intra-uterino Prematuridade Icterícia colestática Hepato - esplenomegalia Púrpura Plaquetopenia Pneumonite intersticial Manifestações neurológicas:

Microcefalia Calcificações intracranianas Crises convulsivas no período neonatal Coriorretinite Deficiência de acuidade visual e auditiva

Das 90% assintomáticas ao nascimento: 10%-15% desenvolverão sintomas dentro de alguns meses ou mesmo anos Pneumonite intersticial hepatoesplenomegalia

INFECÇÃO ADQUIRIDA A infecção freqüentemente é assintomática Quando sintomática :

Febre, normalmente é a manifestação mais proeminente,é prolongada e geralmente com mais de 10 dias de duração

Aumento de linfonodos, fígado, pâncreas e amídalas não são comuns, mas podem ocorrer, principalmente em crianças

Podem ocorrer ainda raras complicações tais como: Pneumonia intersticial Hepatite Síndrome de Guillain-Barre Meningoencefalite Miocardite Trombocitopenia e anemia hemolítica

INFECÇÃO NO PACIENTE COM HIV

A retinite responde por aproximadamente 85% das manifestações da doença no paciente

A retinite por CMV (CMV–R) desenvolve-se em cerca de 28-35% de todos os pacientes com AIDS em estádios avançados da doença e, freqüentemente, leva à cegueira

Pacientes com HIV podem apresentar diversas variedades de complicações visuais secundárias à retinite, incluindo : visão embaçada, flashes de luz, escotoma, ou perda da visão

central, dependendo da localização e extensão da lesão na retina A retinitie causada por CMV é um tipo focal necrotizante, com

ou sem hemorragias Há ainda a possibilidade de surgimento de esofagites e colite

(cerca de 20%), pneumonite, hepatite, adrenalite, entre outras As manifestações neurológicas são menos freqüentes, mas

podem se apresentar como uma encefalite micronodular difusa, ou como ventrículo-encefalite, clinicamente indistinguíveis

DIAGNÓSTICO O isolamento viral em cultura de fibroblastos humanos é o método

convencional Urinas incubadas neste meio se tornam positivas em 3 a 5 dias

Para saber se a infecção é congênita ou perinatal: Faz-se um isolamento do vírus de um tecido de biópsia ou fluido corporal,

principalmente urina Se este isolamento somente puder ser feito em quatro a oito semanas após o

nascimento tem-se uma infecção perinatal

Após o isolamento, o CMV pode ser replicado in vitro, incubado com fibroblastos a 36ºC por uma a três semanas, e posteriormente , analisado com o objetivo de se identificar possíveis inclusões do CMV no tecido analisado Este é considerado o padrão-ouro para o diagnóstico de CMVDisease Essa técnica, não e tão viável , pois a necessidade de um longo período de

incubação dificulta o rápido diagnóstico

Já na técnica do shell-vial , muito parecida com a de cima, o tempo de revelação (feito por imunofluorescência indireta - IFI) cai para 24, 48 ou 72h Utilizam-se anticorpos monoclonais contra diferentes antígenos do CMV e uma

centrífuga que facilita o processo de penetração do vírus no fibroblasto

DIAGNÓSTICO A PCR (Polymerase Chain Reaction) é uma técnica

rápida (~6h) e de alta sensibilidade baseada na amplificação seletiva de seqüências específicas de acido nucléico

As detecções de IgM e IgG através dos diversos métodos sorológicos (imunofluorescência indireta, ELISA,radioimunoensaio), são rotineiramente solicitadas para o diagnóstico da infecção congênita por CMV

Para o diagnóstico da infecção materna ainda pode ser utilizado o Western Blotting que permite a mensuração da afinidade ou avidez do anticorpo IgG-CMV pelo antígeno viral

MÉTODO EM NOSSO LABORATÓRIO USADO PARA DIAGNÓSTICO

Realizado no equipamento VIDAS

Detecta-se tanto a IgM quanto a IgG no soro humano

Utilizando-se a técnica ELFA

PRINCÍPIO DO MÉTODO-CMV IGM Associa o método imunoenzimático sandwich em 2 etapas com uma detecção final em

fluorescência (ELFA).

O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte de pipetagem

Os outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e repartidos na barrete

Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente no aparelho

Estas são constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração e dispensação do meio reaccional

Após uma etapa de adsorção das IgG e do FR ,através de uma solução de soro de cabra anti-IgG humana, a amostra é aspirada e dispensada no interior do cone durante um tempo determinado

Os anticorpos IgM anti-CMV presentes na amostra vão fixar-se ao antígeno CMV fixado na parede interna do cone

As etapas de lavagem eliminam componentes que não se ligaram

Um anticorpo monoclonal anti-IgM humano marcado com fosfatase alcalina é aspirado e dispensado no cone e fixa-se às IgM anti-CMV humanas fixadas na parede do cone

Uma última lavagem elimina os elementos não fixados

Durante a etapa final de revelação, o substrato 4- metil- umbeliferil fosfato é aspirado e dispensado no cone, a enzima do conjugado catalisa a reação de hidrólise deste substrato no 4- metil-umbeliferona cuja fluorescência emitida é medida a 450 nm

PRINCÍPIO DO MÉTODO-CMV IGG Associa o método imunoenzimático por sandwich em 2 etapas com uma

detecção final em fluorescência(ELFA) O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte

de pipetagem Os outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados

e pré-repartidos na barrete Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo aparelho São constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração e

dispensação do meio reaccional Após a diluição, a amostra é incubada com o cone. O cone é previamente sensibilizado com o antígeno CMV Assim este cone fixa os anticorpos IgG anti-CMV presentes na amostra Os componentes não ligados a amostra são lavados e retirados O conjugado é acrescentado contendo anti-IgG humana ligada a

fosfatase alcalina Segue-se nova lavagem para retirar o que não está ligado Acrescenta-se o substrato 4 –metil- umbeliferil fosfato que é catalisado

pela enzima por hidrólise e transformado em 4-metil-umbeliferona cuja fluorescência emitida é lida a 450 nm.

COMO DIFERENCIAR INFECÇÃO RECENTE DE INFECÇÃO ANTIGA Os anticorpos IgM são encontrados em 90% dos pacientes durante a

fase aguda da infecção primária e em 40% das reativações.

Podem permanecer presentes, em geral em títulos baixos, por períodos de até um ano e meio após a infecção primária, o que dificulta a distinção entre infecção primária, reativação e reinfecção.

Realizando o teste de AVIDEZ da IgG podemos fazer esta distinção

Este teste também é realizado no equipamento VIDAS

Avidez significa: Quanto mais forte for uma ligação entre um antígeno e seu anticorpo, ou

seja, quanto mais ávido for ao seu anticorpo.

Quanto mais jovem um anticorpo menor a estabilidade de ligação a este antígeno e consequentemente menor a avidez

AVIDEZ ANTÍGENO-ANTICORPO

Quanto menos interligadas as superfícies entre antígeno-anticorpo menor a avidez

PRINCIPIO DO MÉTODO –CMV IGG AVIDITY Associa o método imunoenzimático por sandwich em 2 etapas com uma detecção final em

fluorescência(ELFA) O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte de pipetagem Os outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e pré-repartidos

nas barretes Lembrando que neste teste são utilizadas duas barretes uma com uréia,onde colocamos em

uma barrete comum de CMV IgG 600 microlitros de uréia e outra sem ,para análise comparativa

Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo aparelho São constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração e dispensação do meio reaccional Após a diluição, a amostra é incubada com o cone. O cone é previamente sensibilizado com o antígeno CMV Assim este cone fixa os anticorpos IgG anti-CMV presentes na amostra Em seguida é aspirada Uréia da barrete que ao entrar em contato com as ligações fracas

antigeno-anticorpo irá quebrá-las e apenas as ligações de antígenos ás IgG mais antigas serão mantidas

Enquanto na outra barrete sem uréia apenas é lavada para retirar o que não se ligou Os componentes não ligados a amostra são lavados e retirados O conjugado é acrescentado contendo anti-IgG humana ligada a fosfatase alcalina Segue-se nova lavagem para retirar o que não está ligado Acrescenta-se o substrato 4 –metil- umbeliferil fosfato que é catalisado pela enzima por

hidrólise e transformado em 4-metil-umbeliferona cuja fluorescência emitida é lida a 450 nm.

O próprio aparelho já faz o cáculo correlacionando o valor relativo de fluorescência da barrete com uréia com o valor relativo de fluorescência da barrete sem uréia

TRATAMENTO

O tratamento é baseado na administração de drogas antivirais Ganciclovir Foscarnet

Sabendo das lesões irreversíveis às quais os fetos estão sujeitos antes do nascimento, um grupo de vacinas começou a ser desenvolvida: Dois a quatro meses após a inoculação do vírus

atenuado tem-se quantidades máximas de anticorpos anti-CMV

TOXOPLASMOSE- DOENÇA DO GATO

DESCRIÇÃO

A Toxoplasmose é uma zoonose cosmopolita, causada por protozoário. Apresenta quadro clínico variado, desde infecção assintomatica a manifestações sistêmicas extremamente graves.

TOXOPLASMOSE FEBRIL AGUDA

Na maioria das vezes, a infecção inicial é assintomática

Porém, em muitos casos, pode generalizar-se e ser acompanhada de exantema.

As lesões resultam da proliferação rápida dos organismos nas células hospedeiras e, quando há manifestações clínicas, essas tem evolução benigna.

Há casos em que ocorrem pneumonia difusa, miocardite, miosite , hepatite, encefalite e exantema maculopapular

LINFADENITE TOXOPLÁSMICA

Geralmente, o quadro se caracteriza por linfadenopatia localizada, especialmente em mulheres

Envolvendo os nódulos linfáticos cervicais posteriores ou, mais raramente, linfadenopatia generalizada

Esse quadro é capaz de persistir por 1 semana ou 1 mês e pode assemelhar-se a mononucleose infecciosa, acompanhada por linfócitos atípicos no sangue periférico

A linfadenite regional pode estar relacionada a porta de entrada, durante a síndrome febril aguda

TOXOPLASMOSE OCULAR

A coriorretinite é a lesão mais frequentemente associada à Toxoplasmose

Encontrada em 30 a 60% dos pacientes com esta enfermidade

Dois tipos de lesões de retina podem ser observados: a retinite aguda, com intensa inflamação, a retinite crônica, com perda progressiva de

visão, algumas vezes chegando à cegueira

TOXOPLASMOSE NEONATAL Resulta da infecção intrauterina, variando de assintomatica

a letal, dependendo da idade fetal e de fatores não conhecidos

Os achados comuns são: prematuridade baixo peso Coriorretinite pós-maturidade estrabismo, icterícia hepatomegalia. Quando ocorre no segundo trimestre da gestação, o bebe pode

nascer prematuramente, mostrando sinais de encefalite com convulsões, pleiocitose do líquor e calcificações cerebrais

Pode apresentar a tétrade de Sabin: microcefalia com hidrocefalia, coriorretinite, retardo mental e calcificações intracranianas.

TOXOPLASMOSE NO PACIENTE IMUNODEPRIMIDO

Os cistos do toxoplasma persistem por periodo indefinido e qualquer imunossupressão significativa pode ser seguida por um recrudescimento da Toxoplasmose

As lesões são focais e vistas com maior frequência no cérebro e, menos frequentemente, na retina, miocárdio e pulmões

As condições mais comumente associadas a essa forma são aids, doença de Hodgkin e uso de imunossupressores.

TOXOPLASMOSE E GRAVIDEZ

Haja vista que a infecção da mãe é usualmente assintomática, geralmente não é detectada

Por isso, tem-se sugerido a realização de testes sorológicos na gestação, durante o acompanhamento pré-natal

Quando se realiza o diagnóstico, deve ser instituída a quimioterapia adequada.

DIAGNÓSTICO Baseia-se na associação das manifestações clínicas com a

confirmação por meio de estudos sorológicos Demonstração ou detecção do agente em tecidos ou líquidos

corporais, em lâminas coradas por Wright-Giemsa ou imuno-histoquímica, a partir de biopsia ou necropsia, testes biomoleculares ou pela identificação em ensaios experimentais em animais ou cultivos celulares.

O aumento dos níveis de anticorpos da classe IgG acima de 1:2048 indica a presença de infecção ativa, sendo extremamente importante ser acompanhada da testagem para anticorpos da classe IgM em sorologias pareadas.

Níveis de anticorpos IgG baixos e estáveis (1:2 a 1:500) podem representar infecções crônicas, passadas ou persistentes.

Um teste negativo praticamente descarta uma condição clínica suspeita, fazendo-se necessária nova sorologia para descarte, com 8 a 10 dias após a primeira.

MÉTODO DIAGNÓSTICO EM NOSSO LABORATÓRIO

IFI para detecção de IgG contra toxoplasma usado como teste de triagem em líquor

Detecta-se tanto a IgM quanto a IgG no soro humano Realizado no

equipamento VIDAS


IFI-TOXOPLASMOSE IGG (TRIAGEM) Primeiro passo retirar as lâminas marcadas com o Toxoplasma gondii da

embalagem metalizada Iniciamos como título de triagem 1/16 e 1/32 Colocamos as amostras de líquor já diluídas nos respectivos poços, assim

como os controles Incubamos por 30 minutos em temperatura ambiente usando câmara

úmida Lavar com um jato único retirando o que não se ligou e por mais 3 vezes

durante 5 min. cada Adicionar o conjugado : anti-IgG humana marcada com isotiocianato de

fluoresceína e incubar por mais 30 minutos no escuro em câmara úmida Prosseguir com as lavagens Em seguida, adicionar 5 gotas de azul de evans e incubar por mais 5

minutos em câmara úmida escura Lavar as lâminas e prosseguir com a colocação da glicerina e das

lâmínulas Após observar a fluorescência ao microscópio da membrana do taquizoíta.

PRINCÍPIO DO MÉTODO-TOXO IGM Associa o método imunoenzimático de imunocaptura com uma

detecção final em fluorescência(ELFA) O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte

de pipetagem Os outros reagentes da reação imunológica estão prontos a ser usados

e pré-repartidos na barrete Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo aparelho Após a etapa de diluição do soro, as IgM são capturadas pelo anticorpo

policlonal presente na parede do cone As IgM anti-toxoplasma são detectadas especificamente pelo antigeno

toxoplásmico inativado revelado por um anticorpo monoclonal de murino anti-toxoplasma, conjugado a fosfatase alcalina

Durante a etapa final de revelação o substrato 4-metil-umbeliferil fosfato é aspirado e catalisado em 4-metil-umbeliferona por uma reação de hidrólise pela fosfatase alcalina

A fluorescência emitida pelo 4-metil-umbeliferona é medida a 450 nm e o índice é calculado automaticamente pela máquina.

PRINCÍPIO DO MÉTODO- TOXO IGG Associa o método imunoenzimático por sandwich em 2 etapas com uma

detecção final em fluorescência(ELFA) O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte de

pipetagem Os outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e pré-

repartidos na barrete Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo aparelho São constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração e dispensação do

meio reaccional Após a diluição, a amostra é incubada com o cone. O cone é previamente sensibilizado com o antígeno T. gondii Assim este cone fixa os anticorpos IgG anti-T.gondii presentes na amostra Os componentes não ligados a amostra são lavados e retirados O conjugado é acrescentado contendo anti-IgG humana ligada a fosfatase

alcalina Segue-se nova lavagem para retirar o que não está ligado Acrescenta-se o substrato 4 –metil- umbeliferil fosfato que é catalisado pela

enzima por hidrólise e transformado em 4-metil-umbeliferona cuja fluorescência emitida é lida a 450 nm.

Os resultados são calculados automaticamente pelo aparelho

PRINCÍPIO DO MÉTODO-TOXO IGG AVIDITY Associa o método imunoenzimático por sandwich em 2 etapas com uma detecção

final em fluorescência(ELFA) O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte de

pipetagem Utilizamos duas barretes de Toxo IgG: em uma delas contendo uréia e a outra

não. Os outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e pré-

repartidos nas barretes Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo aparelho São constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração e dispensação do meio

reaccional Após a diluição, a amostra é incubada com o cone. O cone é previamente sensibilizado com o antígeno T.gondii Assim este cone fixa os anticorpos IgG anti-T.gondii presentes na amostra Em seguida é aspirada Uréia da barrete que a contem e ao entrar em contato

com as ligações fracas antigeno-anticorpo irá quebrá-las e apenas as ligações de antígenos ás IgG mais antigas serão mantidas

Os componentes não ligados a amostra são lavados e retirados O conjugado é acrescentado contendo anti-IgG humana ligada a fosfatase



O aparelho realiza o cáculo do índice de avidez automaticamente.

Agente Etiológico Toxoplasma gondii, um protozoário coccídio intracelular,

pertencente à familia Sarcocystidae, na classe Sporozoa.

Reservatório Os hospedeiros definitivos de T. gondii são os gatos e outros

felídeos. Os hospedeiros intermediários são os homens, outros mamíferos não felinos e as aves.

MODO DE TRANSMISSÃO O homem adquire a infecção por três vias:

Ingestão de oocistos provenientes do solo, areia, latas de lixo contaminado com fezes de gatos infectados;

Ingestão de carne crua ou mal cozida infectada com cistos, especialmente carne de porco e carneiro;

Infecção transplacentária, ocorrendo em 40% dos fetos de mães que adquiriram a infecção durante a gravidez.

Período de Incubação De 10 a 23 dias, quando a fonte for a ingestão de carne; De 5 a 20 dias, após ingestão de oocistos de fezes de gatos.

Período de Transmissibilidade Os oocistos expulsos por felídeos esporulam e se tornam

infectantes depois de 1 a 5 dias, podendo conservar essa condição por 1 ano.

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Citomegalovírus Malformações congênitas Sífilis Rubéola Herpes Aids Kernicterus Neurocisticercose

TRATAMENTO

O tratamento específico nem sempre é indicado nos casos em que o hospedeiro é imunocompetente

Exceto em infecção inicial durante a gestação ou na vigência de comprometimento de outros órgãos como: coriorretinite e miocardite.

Recomenda-se o tratamento em gestantes, recém-nascidos e pacientes imunodeprimidos.

ESQUEMA USADO PARA TRATAMENTO

Nos 3 primeiros dias de tratamentoDo 4º dia em diante

Tempo de tratamento

AdultosPirimetamina Sulfadiazina

75 a 100mg 500 a 1.000mg, 2 a 4 x/dia

25-50mg 500-1.000mg, 2 a 4 x/dia 4 a 6 semanas

Ácido folínico

5-10 mg/dia 5-10 mg/dia

CriançasPirimetamina Sulfadiazina

2 mg/kg 25 mg/kg/dia 4 x/dia

1 mg/dia 25 mg/kg/dia 4 x/dia 4 semanas

Ácido folínico

1mg 1mg

Gestante - Utilizar Espiramicina, 750 a 1.000mg, VO, a cada 8 horas, ou Clindamicina, VO, na dose de 600mg a cada 6 horas. Na forma ocular, para reduzir a necrose e a inflamação e minimizar a cicatriz, utiliza-se 40mg/dia de Prednisona, por uma semana, e 20mg/dia, por outras 7 semanas. Está contraindicado o uso de Pirimetamina no 1o trimestre de gravidez, pois é teratogênica, e de Sulfadiazina, no 3o trimestre, pelo risco de desenvolver kernicterus.

MONONUCLEOSE INFECCIOSA

DESCRIÇÃO É uma síndrome infecciosa que acomete, principalmente, indivíduos entre 15 e

25 anos de idade Essa infecção pode ser assintomatica

Quando sintomática pode apresentar-se com:

Febre alta Odinofagia Tosse Artralgias Adenopatia cervical posterior simétrica (que pode se generalizar) Esplenomegalia Hepatomegalia discreta (raramente com icterícia) Erupção cutânea Comprometimento da orofaringe – sob a forma de faringoamigdalite exsudativa

O paciente pode restabelecer-se em poucas semanas, mas pequena proporção de doentes necessita de meses para recuperar seus níveis de energia anteriores à enfermidade.

Há controvérsias sobre a cronicidade da infecção. Recentemente, tem estado associada à etiopatogenia de várias neoplasias Sua importância tem aumentado apos o aparecimento da Aids

Sinonímia Angina monocítica, doença do beijo.

Agente Etiológico Vírus Epstein-Barr (VEB), da família Herpesviridae.

Reservatório O homem.

Modo de Transmissão Inter-humano, pelo contato intimo de secreções orais (saliva) É rara a transmissão através de transfusão sanguínea ou

contato sexual Período de Incubação

De 30 a 45 dias. Período de Transmissibilidade

Pode durar 1 ano ou mais.

COMPLICAÇÕES

Anemia hemolítica Trombocitopenia Granulocitopenia Meningite Encefalite Neurite óptica e retrobulbar Neuropatia do plexo braquial Mononeurite multiplex Mielite transversa Síndrome de Guillain-Barre Ruptura esplênica Infecção crônica pelo VEB.

DIAGNÓSTICO

Clínico, associado ao leucograma, que revela: leucocitose com elevada linfocitose atípica

Para confirmação laboratorial, pode-se usar: testes rápidos para a detecção de anticorpos

heterofilos ,que aparecem em 60-80% dos casos Testes para detecção de anticorpos específicos

para o vírus Epstein-Barr Demonstração do Vírus, Antígenos Virais ou

DNA Viral: Cultura, hibridização com sondas de acido

nucleico, PCR

ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA O VÍRUS EPSTEIN-BARR

Anticorpos produzidos pelo hospedeiro em resposta aos diferentes antígenos produzidos durante o ciclo viral

Durante a fase lítica: Os primeiros antígenos são os Early antigen(EA) Seguidos dos antigenos do capsídeo viral(VCA) que são

expressos juntos com o genoma viral Durante o ciclo latente:

Antígenos nucleares do Epstein-Barr(EBNA) são sintetizados Os anti-EA aparecem em 70-80% dos casos Os anti-VCA IgM em 100% dos casos Os anti-VCA IgG em quase 100% dos casos Durante a fase de convalescência os anti-VCA IgG

persistem e 95% dos indivíduos apresentam anti-EBNA IgG

MÉTODO DIAGNÓSTICO EM NOSSO LABORATÓRIO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS

Realizado no equipamento VIDAS

Os testes VIDAS permitem a detecção de anticorpos anti-EA IgG e anti VCA-IgG, anti-VCA IgM e anti-EBNA IgG


PRINCÍPIO DO MÉTODO-EBV VCA-IGM Associa o método imunoenzimático de imunocaptura com uma

detecção final em fluorescência (ELFA) O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de

suporte de pipetagem Os outros reagentes da reação imunológica estão prontos a ser

usados e pré-repartidos na barrete Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo

aparelho Após a etapa de diluição do soro, as IgM são capturadas pelo Ac

monoclonal presente na parede do cone As IgM anti-EBV VCA são detectadas especificamente pelo

antigeno VCA p18 conjugado com fosfatase alcalina Durante a etapa final de revelação o substrato 4-metil-

umbeliferil fosfato é aspirado e catalisado em 4-metil-umbeliferona por uma reação de hidrólise pela fosfatase alcalina

A fluorescência emitida pelo 4-metil-umbeliferona é medida a 450 nm e o índice é calculado automaticamente pela máquina.

PRINCÍPIO DO MÉTODO- EBV VCA/EA-IGG

Associa o método imunoenzimático por sandwich em 2 etapas com uma detecção final em fluorescência(ELFA)

O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte de pipetagem

Os outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e pré-repartidos na barrete

Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo aparelho São constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração e dispensação do meio

reaccional Após a diluição, a amostra é incubada com o cone. O cone é previamente sensibilizado com os antígenos VCA P18 e EA P54 Assim este cone fixa os anticorpos IgG anti-VCA e anti-EA presentes na amostra Os componentes não ligados a amostra são lavados e retirados O conjugado é acrescentado contendo anti-IgG humana ligada a fosfatase




PRINCÍPIO DO MÉTODO- EBV EBNA-IGG Associa o método imunoenzimático por sandwich em 2 etapas com uma

detecção final em fluorescência(ELFA) O cone de utilização única serve tanto de fase sólida como de suporte de

pipetagem Os outros reagentes da reacção imunológica estão prontos a ser usados e pré-

repartidos na barrete Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo aparelho São constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração e dispensação do meio

reaccional Após a diluição, a amostra é incubada com o cone. O cone é previamente sensibilizado com os antígenos EBNA 72 Assim este cone fixa os anticorpos IgG anti-EBNA presentes na amostra Os componentes não ligados a amostra são lavados e retirados O conjugado é acrescentado contendo anti-IgG humana ligada a fosfatase




MÉTODO DIAGNÓSTICO EM NOSSO LABORATÓRIO DE ANTICORPOS HETERÓFILOS

Paul e Brunnel descobrem que o soro de pacientes com MI apresentam anticorpos heterófilos

Aglutinam eritrócitos de carneiro e cavalo São absorvidos apenas por eritrócitos bovinos, sendo essa a

base do teste introduzido por Davidsohn Na lâmina de reação limpa, seca e desengordurada colocar:

Uma gota de cada amostra Controle positivo Controle negativo

Em seguida colocar uma gota de látex que é revestido com glicoproteínas de eritrócitos de boi

Homogeneizar com bastões apropriados Agitar por 3 minutos entre 20-30 rotações/min manualmente Se positivo aglutinação ocorre a olho nu

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Infecção pelo citomegalovírus Toxoplasmose Leptospirose Infecção aguda pelo vírus da

imunodeficiência Hepatite viral Rubéola Linfoma e leucemia aguda Reações de hipersensibilidade a drogas

(difenil-hidantoína, ácido para-aminossalicílico, isoniazida).

TRATAMENTO

Sintomático - O uso de corticoterapia pode ser útil no caso de complicação com obstrução de vias aéreas por hipertrofia tonsilar, na trombocitopenia grave e na anemia hemolítica.

DOENÇA DE CHAGAS/TRIPANOSSOMÍASE AMERICANADoença parasitária com curso clínico bifásico (fases aguda e crônica), podendo se manifestar sob várias formas.

FASE AGUDA Caracterizada por miocardite difusa, com vários graus de severidade, às vezes só

identificada por eletrocardiograma ou ecocardiograma. Pode ocorrer pericardite, derrame pericárdico, tamponamento cardíaco,

cardiomegalia, insuficiência cardíaca congestiva, derrame pleural. As manifestações clínicas mais comuns são:

febre prolongada e recorrente cefaleia mialgias astenia edema de face ou membros inferiores rash cutâneo hipertrofia de linfonodos hepatoesplenomegalia, ascite manifestações digestivas (diarreia, vômito e epigastralgia intensa) são comuns em casos

por transmissão oral; há relatos de icterícia e manifestações digestivas hemorrágicas. em casos de transmissão vetorial, podem ocorrer sinais de porta de entrada: sinal de

Romana (edema bipalpebral unilateral) ou chagoma de inoculação (lesão a furúnculo que não supura).

A meningoencefalite, que é rara, tende a ser letal, e ocorre geralmente em casos de reativação (imunodeprimidos) ou em lactentes.

Alterações laboratoriais incluem anemia, leucocitose, linfocitose, elevação de enzimas hepáticas, alteração nos marcadores de atividade inflamatória (velocidade de hemossedimentação, proteína C-reativa, etc.)

FASE CRÔNICA

Indeterminada: forma crônica mais frequente O individuo apresenta exame sorológico positivo

sem nenhuma outra alteração identificável por exames específicos (cardiológicos, digestivos, etc.).

Esta fase pode durar toda a vida ou, após cerca de 10 anos, pode evoluir para outras formas (ex.: cardíaca, digestiva).

FASE CRÔNICA Cardíaca:

Importante causa de limitação do chagásico crônico e a principal causa de morte.

Pode apresentar-se sem sintomatologia, apenas com alterações eletrocardiográficas, ou com insuficiência cardíaca de diversos graus, progressiva ou fulminante, arritmias graves, acidentes tromboembólicos, aneurisma de ponta do coração e morte súbita.

As principais manifestações são palpitações, edemas, dor precordial, dispneia, dispneia paroxística noturna, tosse, tonturas, desmaios, desdobramento ou hipofonese de segunda bulha, sopro sistólico.

Alterações eletrocardiográficas mais comuns: bloqueio completo do ramo direito (BCRD), hemibloqueio anterior esquerdo (HBAE), bloqueio atrioventricular (BAV) de 1o, 2o e 3o graus, extrassístoles ventriculares, sobrecarga de cavidades cardíacas, alterações da repolarização ventricular.

A radiografia de tórax pode revelar cardiomegalia.

FASE CRÔNICA Digestiva:

Alterações ao longo do trato digestivo, ocasionadas por lesões dos plexos nervosos (destruição neuronal simpática), com consequentes alterações da motilidade e morfologia, sendo o megaesôfago e o megacólon as formas mais comuns.

Manifestações que sugerem megaesôfago: disfagia (sintoma mais frequente), regurgitação, epigastralgia, dor retroesternal a passagem do alimento, odinofagia (dor a deglutição), soluços, ptialismo (excesso de salivação), hipertrofia de parótidas; em casos mais graves pode ocorrer esofagite, fístulas esofágicas, alterações pulmonares decorrentes de refluxo gastroesofágico.

No megacólon, geralmente ocorre constipação intestinal de instalação insidiosa, meteorismo, distensão abdominal; volvos e torções de intestino e fecalomas podem complicar o quadro.

Exames radiológicos contrastados são importantes no diagnostico da forma digestiva.

FASE CRÔNICA

Forma associada (cardiodigestiva): Quando no mesmo paciente são identificadas pelo

as duas formas da doença.

Forma congênita: Ocorre em crianças nascidas de mães com exame

positivo para T. cruzi. Pode passar despercebida em mais de 60% dos

casos Em sintomáticos, pode ocorrer prematuridade,

baixo peso, hepatoesplenomegalia e febre; há relatos de icterícia, equimoses e convulsões devidas à hipoglicemia. Meningoencefalite costuma ser letal.

Agente Etiológico: Trypanosoma cruzi, protozoário flagelado da família

Trypanosomatidae, caracterizado pela presença de um flagelo e uma única mitocôndria.

No sangue dos vertebrados, apresenta-se sob a forma de tripomastigota e, nos tecidos, como amastigota.

Vetores: Triatomíneos hematófagos que, dependendo da espécie,

podem viver em meio silvestre, no peridomicílio ou no intradomicílio.

São também conhecidos como “barbeiros” ou “chupões”.

Reservatórios: Além do homem, diversos mamíferos domésticos e silvestres

têm sido encontrados naturalmente infectados pelo T. cruzi. Epidemiologicamente, os mais importantes são aqueles que

coabitam ou estão próximos do homem (gatos, cães, porcos, ratos).

MODO DE TRANSMISSÃO A forma vetorial ocorre pela passagem do protozoário das excretas dos

triatomíneos através da pele lesada ou de mucosas do ser humano, durante ou logo apos o repasto sanguíneo.

A transmissão oral ocorre a partir da ingestão de alimentos contaminados com T. cruzi. Esta forma, frequente na região Amazônica, tem sido implicada em surtos intrafamiliares em diversos estados brasileiros e tem apresentado letalidade elevada.

A transmissão transfusional ocorre por meio de hemoderivados ou transplante de órgãos ou tecidos provenientes de doadores contaminados com o T. cruzi.

A transmissão por transplante de órgãos tem adquirido relevância nos últimos anos devido ao aumento desse tipo de procedimento, com quadros clínicos, pois receptores estão imunocomprometidos.

A transmissão vertical ocorre em função da passagem do T. cruzi de mulheres infectadas para seus bebes, durante a gestação ou o parto.

A transmissão acidental ocorre a partir do contato de material contaminado (sangue de doentes, excretas de triatomíneos) com a pele lesada ou com mucosas, geralmente durante manipulação em laboratório sem equipamento de biossegurança.

Período de Incubação varia de acordo com a forma de transmissão: Vetorial: 4 a 15 dias Transfusional: 30 a 40 dias Vertical: pode ocorrer em qualquer período da

gestação ou durante o parto Oral: 3 a 22 dias Transmissão acidental: ate aproximadamente 20 dias.

Período de Transmissibilidade O paciente chagásico pode albergar o T. cruzi no

sangue e/ou tecidos por toda a vida, sendo assim reservatório para os vetores com os quais tiver contato

DIAGNÓSTICO Fase Aguda

Determinada pela presença de parasitos circulantes em exames parasitológicos diretos de sangue periférico (exame a fresco, esfregaço, gota espessa).

Quando houver presença de sintomas por mais de 30 dias, são recomendados métodos de concentração devido ao declínio da parasitemia (teste de Strout, micro-hematócrito)

Presença de anticorpos IgM anti-T. cruzi no sangue indica doença aguda quando associada a fatores clínicos e epidemiológicos compatíveis.

Fase Crônica Individuo que apresenta anticorpos IgG anti-T. cruzi detectados

por dois testes sorológicos de princípios distintos, sendo a Imunofluorescência Indireta (IFI), a Hemoaglutinação (HE) e o ELISA os métodos recomendados.

Testes de xenodiagnóstico, hemocultivo ou PCR positivos podem indicar a doença crônica.

MÉTODOS DIAGNÓSTICOS UTILIZADOS EM NOSSO LABORATÓRIO

ELISA DE CHAGAS - TESTE DE TRIAGEM Em uma placa de ELISA contendo o T.cruzi colocamos 200

microlitros da solução diluída em cada poço Deixar por 30 min incubando em temperatura de 37°C Após retirar o conteúdo e lavar por 6 vezes durante 1 min cada Adicionar o conjugado , anti-IgG humana ligada a peroxidase Incubar por mais 30 min em temperatura de 37°C Proceder com mais 6 lavagens de 1 min. cada Acrescentar o substrato, peróxido de hidrogênio, e o

cromógeno TMB e incubar por mais 30 min em temperatura ambiente e no escuro

Após colocar a solução de Stop com Ácido sulfúrico e ler no espectofotômetro

E correlaciono se positivo ou negativo de acordo com o comprimento de onda

Se positivo encaminho para IFI para obter a titulação

IFI-CHAGAS Primeiro aplicamos o antígeno liofilizado de T.cruzi sob a forma de

epimastigota sobre as lâminas a serem utilizadas, deixando-as secar em estufa por 40 min

Em seguida adicionar as soluções das amostras diluídas Diluições de triagem: 1/20 ou se título conhecido usar até duas

titulações a mais Incubar em câmara úmida a 37°C por 30 min. Lavar 2 vezes com tampão PBS Secar as lâminas Acrescentar em cada poço o conjugado, anti-IgG humana marcada com

isotiocianato de fluoresceína Incubar em câmara úmida por mais 30 min a 37°C Proceder com as lavagens Montar as lâminas colocando a glicerina sobre elas e a lamínula

evitando bolhas Fazer a leitura em microscopia determinando a positividade e a

titulação

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Na fase aguda - leishmaniose visceral, hantavirose,

toxoplasmose, febre tifoide, mononucleose infecciosa, esquistossomose mansônica aguda, leptospirose, miocardites virais.

As formas congênitas devem ser diferenciadas daquelas causadas pelas infecções STORCH (sífilis, Toxoplasmose, citomegalovirose, Rubéola, herpes, outras).

A meningoencefalite chagásica diferencia-se da toxoplásmica pela sua localização fora do núcleo da base e pela abundancia do T. cruzi no líquor.

A miocardite crônica e os megas devem ser diferenciados de formas causadas por outras etiologias.

TRATAMENTO O tratamento específico deve ser realizado o mais

precocemente possível quando forem identificadas a forma aguda ou congênita da doença, ou a forma crônica recente (crianças menores de 12 anos) A droga disponível no Brasil é o Benznidazol (comp. 100mg),

que deve ser utilizado na dose de 5mg/kg/dia (adultos) e 5-10mg/kg/dia (crianças), divididos em 2 ou 3 tomadas diárias, durante 60 dias. O Benznidazol é contraindicado em gestantes.

O tratamento sintomático depende das manifestações clinicas: Para alterações cardiológicas são recomendadas as mesmas

drogas que para outras cardiopatias (cardiotônicos, diuréticos, antiarrítmicos, vasodilatadores, etc.)

Nas formas digestivas, pode ser indicado tratamento conservador (dietas, laxativos, lavagens) ou cirúrgico, dependendo do estagio da doença.

REFERÊNCIAS

Junqueira,J.J.M; Sancho,T.M.; Santos,V.A.. Citomegalovírus: Revisão dos Aspectos Epidemiológicos, Clínicos, Diagnósticos e de Tratamento. NewsLab - edição 86 – 2008.

DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS – GUIA DE BOLSO – 8ª edição revista MINISTÉRIO DA SAÚDE.BRASÍLIA / DF – 2010

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Detecção Sorológicas