Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE AMOSTRAS DE
ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE GRANJAS AVÍCOLAS DO RS ATRAVÉS
DO MULTIPLEX-PCR
Silvio Luis da Silveira Rocha
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Orientador: Prof. Dr. Carlos Tadeu Pippi Salle
Porto Alegre, 2008
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE AMOSTRAS DE
ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE GRANJAS AVÍCOLAS DO RS ATRAVÉS
DO MULTIPLEX-PCR
Autor: Silvio Luis da Silveira Rocha
Dissertação apresentada como requisito para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências Veterinárias na área de
Medicina Veterinária Preventiva, especialidade Sanidade
Avícola.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Tadeu Pippi Salle
Porto Alegre, 2008
3
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Nome do Autor: Silvio Luis da Silveira Rocha
TÍTULO DO TRABALHO: DETECÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE
AMOSTRAS DE ESCHERICHIACOLI ISOLADAS DE GRANJAS AVÍCOLAS DO
RS ATRAVÉS DO MULTIPLEX-PCR
APROVADA EM: APROVADO POR: ____________________________________________________ Prof. Dr.Carlos Tadeu Pippi Salle Orientador e Membro da Comissão
___________________________________________________ Prof. Dr.Benito Guimarães de Brito Membro da Banca ___________________________________________________ Prof. Dr.Carlos André da Veiga Lima Rosa Membro da Banca ___________________________________________________ Prof. Dr.Hamilton Luiz de Souza Moraes Membro da Banca
4
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha esposa Ivana, meus filhos Gabriel e Júlia, aos meus irmãos e especialmente aos meus queridos pais Ary e Ondina, que sei, também participaram comigo nessa caminhada.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Carlos Tadeu Pippi Salle pela orientação, confiança, ensinamentos
e a oportunidade proporcionada.
Aos Professores Hamilton Luiz de Souza Moraes, Benito Guimarães de Brito,
Cláudio Wageck Canal, pelo apoio e sugestões.
Aos colegas mestrandos e doutorandos do CDPA, Anderlise, Diana, Felipe,
Flávia, Francielli, Guilherme e Lucas, pela ajuda, incentivo e amizade.
Aos colegas Luiz Henrique (Zico), Omar e D.Dila pelo auxílio nessa realização.
À Ana Cristina Gonçalves Pinto da Rocha pelo apoio científico, dedicação e amizade
na efetivação desse trabalho.
Aos estagiários do CDPA que estiveram prontos a cooperar nas tarefas ao longo
desse período.
E a todos que de uma maneira ou outra contribuíram na realização desse
trabalho.
6
SUMÁRIO
1. RESUMO................................................................................................... 7 2. ABSTRACT............................................................................................... 9 3. INTRODUÇÃO........................................................................................ 11 4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................ 15 4.1 Colibacilose (APEC)............................................................................... 17 4.2 Celulite Aviária....................................................................................... 20 4.3 Fatores de virulência............................................................................... 21 4.4 Fímbrias................................................................................................... 24 4.5 Fímbria P (papC).................................................................................... 25 4.6 felA........................................................................................................... 25 4.7 cvaC.......................................................................................................... 26 4.8 iutA........................................................................................................... 27 4.9 kpsII......................................................................................................... 28 4.10 iss............................................................................................................ 30 4.11 tsh........................................................................................................... 31 4.12 Multiplex – PCR.................................................................................... 32 5. MATERIAL E MÉTODO........................................................................ 38 5.1 Amostras Bacterianas............................................................................. 38 5.2 Fatores de Virulência.............................................................................. 38 5.3 Extração do DNA.................................................................................... 39 5.4 Primers..................................................................................................... 39 5.5 Otimização do PCR – Multiplex............................................................ 40 5.6 Especificidade da PCR........................................................................... 43 5.7 Sensibilidade da PCR............................................................................. 44 6. RESULTADOS......................................................................................... 45 7. DISCUSSÃO............................................................................................. 51 8. CONCLUSÕES......................................................................................... 9. REFERÊNCIAS ........................................................................................
55 56
7
1. RESUMO
A Escherichia coli foi considerada, por muito tempo, um microrganismo não-
patogênico, no entanto com o passar do tempo, alguns sorogrupos começaram a ser associados a diversas patologias no homem e em animais.
E. coli é encontrada na microflora normal do trato intestinal das aves e também amplamente distribuída na natureza, necessitando por isso, fazer-se a diferenciação de amostras patogênicas de não-patogênicas e que venha desenvolver doenças.
Em aves, amostras de E.coli com a presença de alguns fatores de virulência são denominadas APEC (E.coli patogênica para aves). APEC está associada com infecções extra-intestinais principalmente do trato respiratório ou infecções sistêmicas. Lesões por ela causadas, como agente primário e principalmente secundário, geram prejuízos econômicos decorrentes de menor desenvolvimento corpóreo, pior conversão alimentar, mortalidade embrionária, aumento da mortalidade e custos com medicamentos e condenação de carcaças. É um dos principais problemas da avicultura industrial moderna, devido a grandes prejuízos econômicos causados no mundo inteiro. A celulite aviária é uma forma de infecção também causada pela E.coli e tem extrema importância em função da condenação de aves nos abatedouros devido a lesões cutâneas.
A patogenicidade das cepas de E.coli está relacionada com a cumulatividade dos mecanismos de virulência e que podem ser multifatoriais. Seguindo a linha de pesquisa no Programa de Isolamento e Identificação de cepas Patogênicas de Escherichia coli desenvolvida pelo CDPA, este trabalho tem como objetivo otimizar a detecção de genes associados à patogenicidade de amostras de E. coli a partir de isolamento bacteriano através da técnica de Multiplex-PCR (m-PCR), baseado em adaptações do protocolo de PCR para estabelecer o perfil genético de E. coli, associados à classificação de patogenicidade, isoladas de frangos de corte com a utilização de Inteligência Artificial (Redes Neurais Artificiais) desenvolvido por (ROCHA, 2006).
As amostras de E.coli oriundas de empresas avícolas do Rio Grande do Sul foram isoladas de quadros respiratórios, camas aviárias e de lesões de celulite. Os fatores de virulência e os genes responsáveis, identificados nesse trabalho foram: capacidade de adesão pela fímbria P (pap C) e fímbria F11 (fel A), a produção de colicinas (cva C), a presença de aerobactina (iut A), presença dos antígenos capsulares K1 e K5 (kpsll), a resistência sérica (iss), hemaglutinina sensível à temperatura (tsh).
A detecção de fatores de virulência de amostras de E.coli através do m-PCR produziu a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes propostos em tamanho de pares de base esperado para cada multiplex, através de adequações dos protocolos em 100% dos testes.
Os iniciadores foram específicos para amostras que continham os genes elencados já que não houve amplificação nas amostras que serviram como controles negativos.
Os resultados obtidos pelo m-PCR desenvolvido nesse experimento, reproduziram os resultados gerados pelos protocolos de PCR de Rocha em 2006, com a
8
vantagem de obter o mesmo resultado em menor tempo e com a utilização de menor volume de reagentes determinando uma economia nos insumos do ensaio.
Os acréscimos obtidos tornam o método disponível para a avaliação dos atributos de virulência que determinam o potencial de patogenicidade de isolados de E. coli.
9
2. ABSTRACT
The Escherichia coli, was considerate for a long time a non pathogenic microorganism however. As time went by some serogroup started to be associated with several pathologies in humans and animals. E.coli, it is found in the normal bacterial flora of the avian intestinal tract and it is also widely spread in the environment, therefore it is necessary to differentiate the non-pathogenic samples from the pathogenic ones and the ones that can cause diseases. In fowls, E.coli samples with the presence of some virulence factors are called APEC (avian pathogenic Escherichia coli). APEC is associated with extra intestinal infections, mainly in the respiratory tract or systemic infections. Lesions it causes, either as primary or secondary agent, result in economic losses which occur as a consequence of the bird’s poorer growth rate and feed conversion, as well as increased mortality, medication costs and condemnation at the processing plant. It is one of the major problems in the modern aviculture industry, due to the big economic losses in the whole world. The avian cellulitis is a kind of infection also caused by E. coli and has extreme importance in terms of the avian condemnations in the slaughter houses due to the cutaneous lesions. The pathogenicity of the strains of E. coli is related to the cumulativity of the virulence mechanisms and that can be multifactorials. Following the line of research in Isolation Program and Identification of the Pathogenics Strains of the Escherichia coli developed by the CDPA, this work had as aim achieve faster the detection of genes associated with the pathogenicity of the samples of E. coli from on bacterial isolation through the technique of Multiplex – PCR ( m – PCR ), based on the adaptations of the protocol of PCR to restore the genetic profile of the E. coli associated with the classification of the isolated pathogenicity of the chicken flocks with the utilization of Artificial Inteligence (Artificial Neural Nets ) developed by Rocha, (2006). The samples derived from the avian enterprise from the state of RGS were isolated from the respiratory cases, avian beds and from the cellulitis lesions, and the virulence factors and the responsible genes identificated in isolated E. coli samples of the fowls in this work were: adhesion capacity by the fimbriae P (pap C) and fimbriae F 11 (fel A), the colicin production (cva C), the aerobactin presence ( iut A) capsular antigens presence K1 and K5 (kpsll ), the serum resistence (iss), temperature-sensitive hemmaglutin ( tsh ). The detection of the virulence factors of the E. coli samples through the m–PCR produced the simultaneous amplification of the DNA fragments of the genes proposed in the size of the based pairs expected for each multiplex, through protocols adaptations by 100%. The initiators were specified for the samples that contained the chosen genes whereas there was not amplification in the samples that served as negative controllers. The results obtained by the m-PCR developed in that experiment, reproduced the results generated by the PCR protocols developed by Rocha 2006, with the advantage to obtain the same result in less time and with the utilization of lower volume of the reagents determining a saving in the costs of the test.
10
The increases obtained become the method available for the assessment of the virulence attributes that determined the potential of the pathogenecity of the E. coli isolated.
11
3. INTRODUÇÃO
A Escherichia coli faz parte da microbiota entérica da maioria dos animais e foi
considerada, por muito tempo, um microrganismo não patogênico. No entanto, com o
passar do tempo, alguns sorogrupos começaram a ser associados a diversas patologias
no homem e nos animais. Um dos principais agentes de toxinfecções alimentares
relacionado com o consumo de alimentos de origem animal é a E.coli O157: H7,
sobretudo em países desenvolvidos. Já em países em desenvolvimento, a gastroenterite
em crianças recém-nascidas é responsável anualmente por milhares de mortes
(FERREIRA & KNÖBL, 2000).
Nas aves, a infecção causada por E.coli pode ser primária, mas normalmente é
considerada secundária a outros agentes e sua manifestação é extra-intestinal. A
colibacilose é uma das principais doenças da avicultura industrial moderna, devido a
grandes prejuízos econômicos causados no mundo inteiro.
A importância da indústria avícola na economia brasileira se reflete nos
dados do relatório anual da Associação Gaúcha de Avicultura (ASGAV) onde as
exportações de carne de frango de janeiro a agosto de 2007 totalizaram US$ 789,53
milhões, um crescimento de 51,95% em relação ao mesmo período do ano anterior. Em
volume, as vendas externas em oito meses chegaram a 463.337 toneladas, um aumento
de 6,47% na comparação com janeiro-agosto de 2006. A comercialização total de carne
de frango de janeiro a agosto foi de 715.227 toneladas, das quais 148.670 foram
vendidas no Rio Grande do Sul e 103.220 em outros estados.
Segundo a Entidade, o alojamento de pintos de corte alcançou um crescimento de
22,21%, enquanto a produção total de carne de frango no Rio Grande do Sul foi de
694.656 toneladas, representando um aumento de 10,84%. O Estado tem uma
participação de 21,7% no volume exportado pelo Brasil e de 25,83% na receita
nacional com exportações do setor que somaram US$ 3.057,2 bilhões.
A avicultura, sobretudo a gaúcha, por adotar um sistema associativista ou de
terceirização na produção, representa um fator de fixação do homem à terra, ao
12
viabilizar economicamente o minifúndio, assegurando ao pequeno produtor integrado
ao sistema produtivo, capital de giro, tecnologia e garantia de comercialização de sua
produção. No Rio Grande do Sul, existem cerca de 40 mil famílias, na sua maioria
pequenos proprietários de terra, diretamente ligados à avicultura. Esta também
contribui para a recuperação das qualidades físicas e químicas do solo, ao incorporar
quantidades apreciáveis de adubo orgânico às lavouras do minifúndio, incrementando,
assim, as culturas de subsistência. Além disso, através do associativismo o colono tem
acesso a uma tecnologia de primeiro mundo em termos de genética, nutrição, manejo e
sanidade, além da garantia de comercialização de sua produção avícola. Por outro lado,
a avicultura também oferece uma alternativa de alimentação às populações de baixa
renda (ASGAV, 2005).
A patogenicidade das cepas de Escherichia coli está relacionada com a
cumulatividade dos mecanismos de virulência e que podem ser multifatoriais. Assim,
como parte da microbiota normal do trato intestinal e respiratório das aves, a E.coli
resulta em uma variedade de doenças e representa um potencial patógeno para estes
animais (LA RAGIONE et al., 2002).
Dentro desse contexto, desde 1997, o CDPA (Centro de Diagnóstico e Pesquisa
em Patologia Aviária) já desenvolveu várias pesquisas abordando esse assunto, como a
presença de E.coli O157: H7 em amostras de cecos e de carcaças de frangos utilizando
o sistema de separação imunomagnética. Em 1999, foram avaliados os fatores de
virulência de Escherichia coli isoladas de frango de corte com sintomas respiratórios,
quando um total de 63 amostras foi examinado para a presença de: produção de
hemolisinas, motilidade, capacidade de hemaglutinação, presença do operon pap,
produção de colicinas e resistência sérica. Em 2000, foram testadas em desafio três
bacterinas contra a infecção respiratória promovida pelas E. coli em frangos de corte e,
em 2001, uma bacterina, produzida a partir de seis amostras de E. coli selecionadas de
acordo com seu perfil de virulência, foi aplicada a matrizes com o objetivo de avaliar o
grau de proteção que passava à progênie através da gema. Recentemente, em fevereiro
de 2006, foi estabelecida uma nova metodologia para cálculo do índice de
patogenicidade de 299 amostras de E. coli provenientes de celulite aviária, de cama
aviária e de quadros respiratórios através da inoculação em pintos de um dia.
13
Paralelamente, foi traçado o perfil genético de sete genes presentes nessas
amostras, através de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e relacionado ao índice de
patogenicidade quanto à ausência, presença e ou combinações possíveis de
cruzamentos entre elas, com o intuito de predizer o potencial de patogenicidade de cada
amostra.
Para tanto, foi utilizada a metodologia de Inteligência Artificial,
especificamente Redes Neurais Artificiais (RNA) em Avicultura, um tipo de
abordagem que está inserido na filosofia de trabalho do CDPA, o qual já realizou
diversos trabalhos que vem servindo de base para a implantação de modelos
matemáticos os quais servirão para tornar menos empírica a adoção de medidas de
controle e de prevenção de doenças nas empresas avícolas. As RNA permitem a
construção de modelos que aprendem, ou seja, são dinâmicos e sempre atuais,
diferenciando-se, neste ponto, dos obtidos através da estatística convencional. Mais
ainda, permitem realizar simulações de fatos com a obtenção da predição de resultados
esperados. Estas condições são inovadoras na agroindústria e revestem-se de inegável
valor para aqueles que necessitam conhecer, antecipadamente, critérios ou padrões,
para orientar ou dar base às decisões.
Seguindo a linha de pesquisa do Programa de Isolamento e Identificação de
cepas Patogênicas de Escherichia coli desenvolvida pelo CDPA, este trabalho teve
como objetivo otimizar a detecção de fatores de virulência de sete genes que
determinam o potencial de patogenicidade de isolados de E. coli, através da técnica de
Multiplex-PCR (m-PCR). Tendo como base o protocolo de PCR desenvolvido por
Rocha (2006), a otimização foi feita com a adequação de parâmetros permitidos pela
PCR, levando em consideração o tamanho do produto de amplificação obtido com cada
par de primers, concentrações semelhantes dos reagentes, temperaturas de anelamento
e tempos envolvidos na reação com cada par de iniciadores. Os genes selecionados por
Rocha (2006), e que fazem parte deste trabalho, codificam fatores de virulência e estão
envolvidos nos mecanismos de patogenicidade de amostras de E. coli quais sejam: iss,
tsh, cvaC, kpsII, felA, iutA e papC.
As amostras são oriundas de empresas avícolas do RS e foram isoladas de aves
com quadro respiratório, camas aviárias e de lesões de celulite.
14
O desenvolvimento de um protocolo de Multiplex PCR além de diminuir os
custos laboratoriais, tornará mais ágil a detecção dos genes associados à patogenicidade
de E. Coli. Com essas informações em mãos, o veterinário de campo poderá obter um
diagnóstico mais rápido e mais acurado usando critérios objetivos de orientação na
conduta mais adequada a ser tomada. Além disso, a inoculação em animais deixa de ser
uma rotina e é substituída por parâmetros que permitem a tomada de decisões por parte
do corpo técnico, baseados em critérios objetivos obtidos cientificamente. As
propriedades de resistência aos antimicrobianos e o perfil bioquímico dessas amostras,
em andamento vão se juntar ao banco de dados existentes e alimentarão os Modelos de
Redes Neurais Artificiais já que uma de suas principais vantagens é a análise de dados
qualitativos e quantitativos multivariados e não-lineares, o que é comum na área
biológica, no mesmo modelo, dando maiores subsídios a este e contribuindo para
efeitos práticos no campo.
15
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A Escherichia coli pertence à família Enterobacteriaceae, que são bacilos
Gram-negativos, isolados ou em pares, não esporogênicos, catalase-positivos, oxidase-
negativos e podem ser móveis pela presença de flagelos peretríqueos. Podem ter
crescimento aeróbico ou anaeróbico e utilizam como fontes o carbono simples e o
nitrogênio (FERREIRA & KNÖBL, 2000).
Foi descrita pela primeira vez por Theodor von Escherich em 1885 como
Bacterium coli comune, mais tarde, em 1958 recebeu a denominação atual em sua
homenagem.
Cooper (2001) caracteriza E. coli como uma bactéria comum que habita o trato
intestinal de humanos e outros animais, sendo um bastonete com aproximadamente
1µm de diâmetro e 2 µm de comprimento, circundada por uma parede celular rígida
composta de polissacarídeos e peptídeos. Dentro da parede celular está a membrana
plasmática que é uma dupla camada de fosfolipídios e proteínas associadas. A parede
celular é porosa e facilmente penetrada por uma variedade de moléculas enquanto que a
membrana plasmática separa o interior da célula do ambiente externo.
A facilidade com que pode ser reproduzida em laboratório torna a E.coli a
bactéria mais largamente estudada, e a preferida para pesquisa dos mecanismos básicos
da genética molecular como replicação celular, código genético, expressão gênica e
síntese protéica.
Uma cultura de E. coli divide-se entre 20 e 60 minutos e uma população clonal
que deriva de uma única célula pode ser isolada em meio semi-sólido. Colônias de
bactérias contendo 108 células podem ser cultivadas em apenas uma noite, o que
possibilita que variantes genéticas mutantes ocorram com rapidez.
O genoma da E. coli possui aproximadamente 4,6 milhões de pares de base e
codificam próximo de 4.000 proteínas diferentes, perto de 90% do DNA serve como
seqüência codificadora de proteína.
Ao contrário do que acontece nos eucariotos, o DNA da E. coli é uma molécula
circular única no nucleóide, não separada por membrana do citoplasma. O citoplasma
16
possui cerca de 30.000 ribossomos, o que lhe confere a aparência granular, e onde
ocorre a síntese protéica.
Segundo Forsythe (2002), as linhagens patogênicas de E. coli são divididas de
acordo com os sintomas clínicos e com mecanismos da patogenicidade em:
E.coli enterotoxigênica (ETEC) causa diarréia aquosa, produz hipotermia,
coloniza as proximidades do intestino delgado. Se parecem com Vibrio cholerae no
fato de aderirem-se à mucosa do intestino delgado e causarem diarréia sem invadir a
mucosa, porém produzindo toxinas que agem nas células da mucosa. Produzem dois
tipos de enterotoxinas uma semelhante a do cólera, denominada toxina termoestável
(LT), e outra do tipo diarréica, chamada de toxina termoestável (ST). Existem dois
tipos de toxinas LT: LT-I e LT-II. A ST é uma família de pequenas toxinas, as quais
podem ser divididas em dois grupos: as solúveis (STa) e as insolúveis em metanol
(STb). Ambas são codificadas por plasmídeos.
E. coli enteropatogênica (EPEC) causa diarréia aquosa contendo muco
acompanhada de vômitos e febre. Coloniza as microvilosidades de todo o intestino,
para produzir a lesão característica de ligação ou desaparecimento nas bordas da
microvilosidade. Não produzem nenhuma enterotoxina ou citotoxina. Os genes para a
virulência estão no lócus de desaparecimento dos enterócitos (LEE), em uma ilha de
patogenicidade, responsáveis pela produção de hemolisinas e fímbrias P. O contato
com as células epiteliais resulta na secreção de diversas proteínas disparando respostas
na célula hospedeira, incluindo a ativação de um sinal de rotas de transdução, a
despolarização da célula e a ligação da proteína intimina da membrana externa. A
intimina é codificada pelo gene eae.
E.coli entero-hemorrágica (EHEC) causa diarréia sanguinolenta, colite
hemorrágica, síndrome urêmica hemolíticae púrpura trombótica trombocitopênica. Este
grupo inclui a E.coli verotoxigênica (VETEC, também conhecida como E.coli
produtora de shigatoxina, ou STEC) e os sorotipos O157, O26 E O111. Ligam-se
fortemente às células dos mamíferos e produzem o mesmo fenômeno de ligação e
desaparecimento que as linhagens de EPEC. Abrigam plasmídeos de vários tamanhos.
São bactérias pertencentes a diversos sorogrupos. O sorotipo O157:H7 é o mais
importante no Reino Unido e nos Estados Unidos.
17
E. coli enteroagregativa (EaggEC) causa diarréia aquosa persistente, durando
mais de 14 dias. Produzem uma toxina termossensível relacionada antigenicamente a
hemolisina, mas que não é hemolítica e uma toxina termoestável codificada por um
plasmídeo (EAST1). Produzem uma toxina do tipo ST e uma do tipo hemolisina.
Algumas linhagens são conhecidas por produzirem uma toxina do tipo shigatoxina
(verotoxina).
E. coli enteroinvasiva (EIEC) causa febre e diarréias profusas contendo muco e
sangue. O microrganismo coloniza o cólon e contém um plasmídeo de 120 a 140 mD
necessário para a invasidade, o qual carrega todos os genes necessários para a
virulência. Causam um distúrbio que é indistinguível dos sintomas da disenteria
causada pelas espécies de Shigella. As linhagens EIEC invadem ativamente as células
do cólon e propagam-se lateralmente para as células adjacentes, virtualmente idênticas
às espécies de Shigella. No entanto, as EIEC não produzem shigatoxinas.
E. coli difusamente adesiva (DAEC) tem sido associada em alguns estudos, de
forma não consistente, com diarréia.
4.1 Colibacilose (APEC)
O termo colibacilose se refere às infecções localizadas ou sistêmicas, causadas
total ou parcialmente pela bactéria E. coli. Em aves, amostras de E. coli com a presença
de alguns fatores de virulência são denominadas APEC (E. coli patogênica para aves)
(BARNES & GROSS, 1997). APEC está associada com infecções extraintestinais
principalmente do trato respiratório ou infecções sistêmicas que resultam em uma
variedade de doenças que causam perdas econômicas severas (DHO-MOULIN &
FAIRBROTHER, 1999).
O primeiro relato de mortalidade em aves e isolamento de E.coli em fígado,
coração e baço, foram feitos por Lignieres em 1894, através de uma inoculação
experimental que se mostrou virulenta para pombos, variável em galinhas dependendo
da dose e da rota de administração, e não virulenta para suínos e coelhos.
18
Subseqüentemente, doenças associadas com um organismo semelhante foram
documentadas em pombos, cisnes, perus codornas e frangos entre 1894 e 1922
(BARNES & GROSS 1997).
Os sorotipos foram classificados por Kauffmann em 1947 de acordo com as
propriedades antigênicas das cadeias de polissacarídeos e lipossacarídeos em antígeno
somático O, antígeno capsular K e antígeno flagelar H.
Os sorotipos associados à colibacilose aviária mais comumente encontrados são
O1, O2, O78, O8 e O35 (GROSS, 1990; MELLATA et al., 2003).
É encontrada na microflora normal do trato intestinal das aves e também
amplamente distribuída na natureza necessitando, por isso, fazer-se a diferenciação de
amostras patogênicas de não-patogênicas e que venham desenvolver doenças (DHO-
MOULIN et al., 1999). Sorotipos patogênicos e não-patogênicos podem ser isolados no
ambiente aviário (LA RAGIONE et al., 2002).
Pode apresentar-se de várias formas, como pneumonia, peritonite,
colisepticemia, celulite, pleropneumonia, periepatite, pericardite, salpingite,
panoftalmia, osteomielite/sinovite, onfalite, coligranuloma, síndrome da cabeça
inchada, doença crônica respiratória (BARNES et al., 2003).
Em mamíferos, a colibacilose é na maioria das vezes uma doença entérica
primária, já em aves é uma doença tipicamente sistêmica ou localizada que se
manifesta secundariamente quando a defesa do hospedeiro está diminuída ou é vencida
por uma amostra de E. coli virulenta (BARNES et al., 1997).
A infecção secundária ocorre quando associada a outros fatores como infecções
por Mycoplasma sp, ou doenças imunodepressoras como a doença de Gumboro, doença
de Newcastle, bronquite infecciosa, responsáveis pela invasão no tecido sangüíneo e
em órgãos internos (GROSS, 1990).
Anemia infecciosa das galinhas e micotoxinas também podem contribuir para o
desenvolvimento da doença (BARNES & GROSS, 1997).
A colibacilose sendo considerada multifatorial depende da combinação de fatores
como manejo, instalações, alimentação e condições gerais do animal.
Infecções causadas por E. coli são responsáveis por perdas econômicas
significativas na indústria avícola, sendo a colibacilose a doença de aves mais
19
freqüentemente associada à condenação de carcaças devido à presença de lesões por
coliseptecemia, mortalidade embrionária, pior conversão alimentar, aumento da
mortalidade menor desenvolvimento corpóreo e custos com medicamentos (BARNES
& GROSS, 1997).
A colisepticemia afeta frangos, perus, patos e aves ornamentais entre quatro e
12 semanas, e o desenvolvimento e crescimento da indústria avícola contribuiu para a
expansão das criações (maior número de aves por galpão, ventilação deficiente), e o
surgimento de infecções virais e bacterianas aumentando a predisposição dessa
infecção (LA RAGIONE et al., 2002).
Pulmões e sacos aéreos são importantes sítios de entrada da E.coli na circulação
sangüínea das aves durante os estágios iniciais da infecção (DHO-MOULIN et al.,
1999).
São observadas infecções no saco da gema no final do período de incubação dos
ovos, usualmente seguido por contaminação fecal da superfície do ovo resultando em
mortalidade embrionária. O conteúdo intestinal das aves contém usualmente de 104 a
107 UFC (unidades formadoras de colônias) por grama (DHO-MOULIN et al., 1999).
A E. coli pode sobreviver em ambientes secos por longos períodos (LA
RAGIONE et al., 2002). Há uma excreção contínua de E.coli portadora de fatores de
virulência através das fezes. A bactéria pode permanecer nas criações por longos
períodos, contaminando o alimento e a água e servir como via de disseminação da
bactéria (FERREIRA & KNÖBL, 2000).
Coloniza o trato respiratório superior e pode ser isolada na pele e nas penas
dependendo do nível de contaminação ambiental. A contaminação horizontal ocorre
pelo contato entre as aves, fezes, água e alimento contaminado. A inalação de
partículas presentes na poeira pode conter aproximadamente 106 UFC por grama
(DHO-MOULIN et al., 1999).
O primeiro relato de isolamento de E.coli em sacos aéreos de aves foi feito por
Fathery em 1955 e a doença crônica respiratória ainda é a forma de colibacilose aviária
mais estudada e de maior prevalência nos plantéis avícolas (GROSS, 1990).
20
A celulite aviária é uma forma de infecção também causada pela E. coli e que
tem extrema importância pelos prejuízos econômicos que vem gerando em função da
condenação de aves nos abatedouros devido a lesões cutâneas (ELFADIL et al., 1996a)
4.2 Celulite Aviária
A celulite é um processo inflamatório agudo, difuso e purulento do tecido
subcutâneo, freqüentemente associado à formação de abscessos e que pode atingir a
musculatura de frangos e perus (NORTON, 1997). Descrita na Grã-Bretanha pela
primeira vez por Randall et al. (1984), sua ocorrência ocasiona a parcial ou completa
condenação de carcaças em matadouros no mundo inteiro (SINGER et al., 1999). Mais
comum e relevante quando ocorre no abdômen e sobrecoxas tendo por essa razão,
recebido a denominação de celulite aviária (PEIGHAMBARI et al.,1995). As lesões
que resultam em condenação das carcaças são observadas muitas vezes somente
durante o processamento de abate (NGELEKA et al., 1996, ELFADIL et al., 1996a).
É a principal causa de condenação em frangos de corte no Canadá
(PEIGHAMBARI et al., 1995). Nos Estados Unidos as perdas são estimadas entre US$
30 e 40 milhões anualmente (MACKLIN et al.,1999). No Brasil a celulite é responsável
por 45,2% da condenação de carcaças por lesões de pele e as perdas econômicas
chegam a US$ 10 milhões por ano (BRITO et al., 2003). Sua causa é multifatorial e
está ligada a fatores ambientais, densidade populacional no galpão com ocorrência de
traumatismos (arranhões) pela competição (restrição alimentar) e seleção genética
(ELFADIL et al., 1996a).
A compactação da cama causa lesões na região do peito e a umidade favorece a
multiplicação bacteriana que encontra facilidades para penetrar e causar a inflamação
(ROCHA et al., 2002). A celulite ocorre em humanos, mamíferos e aves, e a infecção
ocorre quando encontra solução de continuidade causada por lesões na pele
(FALLAVENA et al., 2002). As más condições dos comedouros, bebedouros e as
instalações em geral do galpão podem ocasionar um aumento de lesões cutâneas, outros
21
fatores como a presença de agentes virais e químicos, também pode contribuir
(ELFADIL, et al., 1996b; NORTON et al., 1997).
Algumas outras bactérias podem estar envolvidas no processo da celulite
aviária, mas a E. coli é o principal agente infeccioso isolado em casos de celulite e os
sorogrupos O1, O2, O71 e O78 são os mais prevalentes (NGELEKA et al., 1996). As
lesões muitas vezes são ocasionadas por arranhões cometidos por outras aves seguidas
pela contaminação bacteriana. E.coli lactose-positiva é o organismo
predominantemente isolado nestes tipos de lesões (SINGER et al., 2000).
Peighambari et al., (1995), caracterizaram 100 cepas de E.coli isoladas de
celulite aviária e 25 de isolados de fezes, quanto a ocorrência de fatores potenciais de
virulência como sorotipo, suscetibilidade a drogas, perfil de plasmídeos, produção de
aerobactina, colicina, colicinaV e hemolisina. Os resultados demonstraram que as cepas
de E.coli isoladas de celulite foram predominantemente os mesmos grupos O (O78,
O2), similar às cepas associadas com enfermidades aviárias septicêmicas e respiratórias
que geralmente produzem aerobactina e colicina.
Elfadil et al. (1996), compararam os fatores de risco no manejo de granjas no
Canadá com a presença de celulite. Foi feito um estudo retrospectivo em 171 granjas de
frango de corte durante o período de julho-agosto de 1993. O resultado demonstrou
uma prevalência de celulite de 31/10000 aves. A celulite esteve associada
positivamente (P<0,005) com lotes de machos e mistos, cama de palha, algumas
plantas de alimentos e o uso de zinco-bacitracina como promotor de crescimento e
outras enfermidades diagnosticadas no abatedouro. O vazio sanitário esteve associado
negativamente com a celulite.
4.3 Fatores de Virulência
A característica das amostras de E. coli em aves e outros animais
freqüentemente são as mesmas, sendo as cepas aviárias fontes de genes e plasmídeos
que possuem fatores de virulência e resistência antimicrobiana (BARNES & GROSS,
1997).
22
Os isolados de E. coli provenientes de animais e de humanos apresentam uma
grande diversidade de patótipos, com muitos genes comuns, o que sugere a
possibilidade de trocas genéticas entre eles e conseqüentemente à probabilidade do
surgimento de um patógeno emergente (KUHNERT et al., 2000a).
O emprego de E. coli como indicador bacteriano é importante porque mudanças
na resistência ou a aquisição de fatores de virulência associados nesse patógeno podem
servir como um sistema de alerta para o aparecimento de resistência e virulência em
bactérias potencialmente patogênicas (IKUNO et al., 2006).
A água contaminada e o meio ambiente podem ser os responsáveis pela
introdução de sorotipos de E. coli patogênicos em lotes de aves, e os genes de
virulência servem como indicadores de surtos da infecção (BARNES et al., 1997).
A evolução de muitas bactérias por transferência horizontal de genes facilita a
adaptação em novos ambientes, mas contribui também para a capacidade de aquisição
de fatores de virulência envolvidos diretamente em infecções. Virulência adquirida por
transferência horizontal em organismos patogênicos é um mecanismo que começa a ser
estudado geneticamente e sua compreensão facilita o entendimento sobre os fatores que
contribuem para o desenvolvimento de doenças (DAM & DAS, 2006). A composição
do genoma bacteriano pode ser mudada drasticamente por uma variedade de processos
que incluem a transferência horizontal de genes, fundamental para o processo de
evolução bacteriana. A transferência horizontal de genes requer a incorporação de
elementos genéticos de outros organismos diretamente no genoma (HACKER &
KAPER, 2000).
Ilhas de Patogenicidade são elementos genéticos com constituição de genes
diferentes dos cromossomos das bactérias e codificam vários genes de virulência além
de codificar também características do seu aparelho secretor. Ao mesmo tempo que
contribuem para a virulência, permitem que os mesmos sejam excretados pela bactéria
para agir em organismos mais complexos (SCHMIDT & HENSEL, 2004).
A transferência de genes de virulência por plasmídeos ou fagos é considerada a
origem das Ilhas de Patogenicidade (MEL & MEKALANOS, 1996).
Elementos transponíveis como tranposons e integrons, contribuem para a
transmissão de fatores de virulência, bem como a resistência aos antibióticos de uma
23
bactéria para outra. Também chamados de elementos genéticos móveis, os plasmídeos
que possuem capacidade de replicação podem transmitir genes a outras linhagens
bacterianas, mas necessitam da ajuda de outros plasmídeos transmissíveis para a
transferência. Os transposons, que são fragmentos móveis que migram de uma região
do DNA para outra podem carrear genes do cromossomo para um plasmídeo
transmissível presente na mesma célula. Existem também transposons conjugativos que
se movimentam dentro da bactéria, mas podem migrar para o cromossomo de outra
bactéria. Os integrons estão localizados no cromossomo ou dentro de elementos de
transposição e podem se integrar por recombinação em locais específicos do DNA,
através da enzima integrase. Possui também um sítio onde estão localizados os cassetes
gênicos que são estruturas formadas por um gene de resistência a antibiótico e uma
região de recombinação (TORTORA et al., 2000).
A transferência horizontal de genes é fundamental não só para evolução dos
organismos em geral, mas também para a evolução de bactérias patogênicas, nelas
parte dos genes que codificam para fatores de virulência surge por transferência
horizontal.
Patogenicidade em E. coli é um mecanismo multifatorial e complexo que
envolve vários fatores de virulência variando de acordo com o sorotipo. O termo fator
de virulência é impreciso, pois um único componente poderia não ser suficiente para
transformar uma cepa de E. coli patogênica, mas a combinação com outros
determinantes de virulência teria um papel decisivo para sua patogenicidade
(KUHNERT et al., 2000b).
Wassenaar & Gaastra (2001), discutem o conceito de que todo o gene envolvido
na patogenicidade é considerado gene de virulência, pois vai depender da sua função no
complexo processo de virulência. Consideram genes de virulência “verdadeiros”
aqueles que causam diretamente danos ao hospedeiro e que estão ausentes em amostras
apatogênicas; genes “associados à virulência”, que regulam a expressão e excreção e
toda a atividade dos verdadeiros genes de virulência e genes com “estilo de vida
virulenta” que habilitam a colonização e invasão do hospedeiro.
A verdade é que esses fatores devem ser continuadamente pesquisados, a fim de
que a função de cada gene seja esclarecida.
24
Os fatores de virulência e os genes responsáveis identificados em amostras de E.
coli isoladas de aves, comumente encontrados são: capacidade de adesão pela fímbria P
(pap C) e fímbria F11 (fel A), a produção de colicinas (cva C), a presença de
aerobactina (iut A), presença dos antígenos capsulares K1 and K5 (kpsll), a resistência
sérica (iss), hemaglutinina sensível à temperatura (tsh) (LA RAGIONE et al., 2002;
DHO-MOULIN et al., 1999).
4.4 Fímbrias
Toxinas são os fatores de virulência encontrados praticamente em todas E. coli
patogênicas, mas a segunda maior classe de determinantes de virulência são os fatores
de adesão representados pela presença de fímbrias, incluindo a Fímbria Tipo 1 e a
Fímbria P que são responsáveis pela aderência na mucosa em diferentes estágios da
doença (KUHNERT et al., 2000b).
A adesão da bactéria a superfície celular é o primeiro passo para a instalação do
processo infeccioso (DHO-MOULIN & FAIRBROTHER, 1999).
A principal característica das fímbrias como estrutura de importante fator de
virulência é a habilidade de aderir ao epitélio do hospedeiro e a conseqüente
colonização e desenvolvimento das infecções (DHO & LAFONT, 1982; ORSKOV &
ORSKOV, 1983; DHO & LAFONT, 1984; NAVEH et al., 1984; SUWANICHKUL &
PANIGRAHY, 1988).
A aderência com as células da mucosa ocorre através das adesinas bacterianas
que se localizam ao longo ou na ponta das fímbrias e estabelecem ligações
mecanicamente estáveis entre as bactérias e as células do hospedeiro e sua
especificidade permitem às bactérias a superação dos mecanismos fisiológicos de
defesa do hospedeiro, colonizando e multiplicando-se (SMYTH et al., 1994).
A classificação das fímbrias e adesinas são determinadas pela morfologia e
habilidade de promover aglutinação de hemácias de diferentes espécies. Em função
desta característica, são também denominadas hemaglutininas (EISENSTEIN, 1987).
Entre as hemaglutininas, existe uma divisão simples: fímbrias as quais se previne a
aglutinação quando incubadas com D-manose são denominadas D-manose-sensíveis e
25
as demais, D-manose-resistentes (ORSKOV & ORSKOV, 1983; EISENSTEIN et al.,
1987).
4.5 FÍMBRIA P (papC)
As adesinas D-manose-resistentes são um grupo de estruturas bacterianas que se
liga a carboidratos presentes nos receptores celulares, que não a D-manose. A fímbria P
liga-se especificamente ao carboidrato α-D galactose e ß-D galactose do antígeno do
grupo sangüíneo P, presente nas hemácias humanas (HOSCHUTZKY et al., 1989).
O gene papC é uma subunidade integrante do heteropolímero cromossomal que
codificam a Fímbria P, e tem a função de polimerização. Há relato da ocorrência do
gene papC em isolados de celulite por Brito et al., (2003), com 19,6%, Ngeleka et
al.(2002), com 25%, Gomis et al. (2001) com 37,1%, Ngeleka et al. (1996) em 51%.
Em amostras isoladas de aves com septicemia. Ewers et al. (2004) verificaram a
presença em 22,7%, Negeleka et al. (2002) em 25%,e por Rodriguez-Siek et al.
(2005a), 41,2%.
Rocha (2006), registrou a ocorrência do gene papC em 46,9% das amostras de
celulite e em 30,8% das de fezes em um total de 238 amostras de E. coli, isoladas e
24,3% de 61 amostras de E. coli, isoladas de frangos de corte com problemas
respiratórios.
4.6 felA
A fímbria F11 é codificada pelo operon fel A, uma variante sorológica da
fimbria P, que apresenta atividade hemaglutinante com eritrócitos de ovinos e humanos
em presença de D-manose, e está associada com quadros de colissepticemia (DEREE et
al., 1985).
Brito et al. (2003), obtiveram 19% de amostras de celulite positivas para o felA
enquanto em nenhuma das amostras de fezes o gene foi encontrado.
Em amostras de colissepticemia Delicato et al. (2003), obtiveram 12%,
enquanto Rodriguez-Siek et al. (2005a) encontraram 78% de positividade.
26
Em 238 amostras de E. coli, isoladas de cama de aviário e lesões de celulite
estudadas, Rocha (2006), encontrou 3,8% de positividade, enquanto nas amostras de
fezes este percentual foi de 1,3%. Já em 61 amostras de E. coli, isoladas de frangos de
corte com problemas respiratórios, o índice foi de 39,3% para o gene fel A.
4.7 cvaC
Os plasmídios ColV (pColV) são um grupo heterogêneo de grandes plasmídios
que especificam a produção de colicina V. O gene estrutural do plasmídio colV é o
cvaC porém, a liberação e exportação da colicina V é mediada por uma seqüência de
sinais independentes que requer os produtos dos genes cavA e cvaB: aminoácidos e
proteínas. (GILSON et al., 1987; GILSON et al., 1990). Em estudos com quelantes de
ferro e mutantes foi constatado que a síntese da ColV é induzida sob condições de
limitação de ferro (WATERS & CROSA, 1991).
Emery et al., (1992); Wooley et al., (1994), descrevem a competição com a
microbiota normal, presente nos tratos respiratório e gastrintestinal, como fator
determinante na ação de colonização intermediada pela produção das colicinas por
bactérias invasivas.
A colicina V é encontrada principalmente em bactérias virulentas implicadas em
infecções extra-intestinais em humanos e animais (GILSON et al., 1987).
Smith (1974) avaliou que os plasmídios colicina V eram os responsáveis pelo
aumento da invasibilidade, pois quando era eliminada, a patogenicidade era reduzida, e
sua reintrodução restaurava a patogenicidade na bactéria.
Ocorreu correspondência significativa entre a presença de pColV e a habilidade
de E. coli em causar septicemia em galinhas e bezerros (SMITH & HUGGINS, 1976).
A ocorrência de colV pode estar relacionada com outros perfis fenotípicos
como a resistência sérica, Binns et al.(1979), presença de antígeno capsular K1
Montgomerie et al. (1984), produção de aerobactina, alteração na motilidade, mudanças
em hidrofobicidade e de proteínas bacterianas de superfície, que facilitam a aderência
às células do hospedeiro pois é encontrada seguidamente em E. coli isolada de
bacteremias (WILLIAMS & WARNER,1980).
27
As colicinas são classificadas em tipo V, A, B, Ia, Ib, Ic, K, N, E1, E2, E3 e
DF13. A colicina V inibe o crescimento bacteriano, interferindo com a formação do
potencial de membrana (YANG & KONISKY, 1984).
Vidotto et al. (1990); Emery et al. (1992); Wooley et al. (1992); encontraram
respectivamente 56%, 51% e 65% de colicinaV em amostras isoladas de frangos com
colissepticmia. Peighambari et al., (1995); Parreira et al. (1998) relacionaram a
presença de colicinaV em casos de celulite e de síndrome da cabeça inchada.
O gene cvaC foi detectado em 31.3% de amostras de celulite e em 11.5% de
amostras de fezes por Rocha (2006), em 238 amostras de E. coli, isoladas de cama de
aviário e lesões de celulite. Os mesmos autores registraram 23% em 61 amostras de E.
coli, isoladas de frangos de corte com problemas respiratórios.
Rocha et al. (2002), detectaram a produção de colicinas e resistência sérica
como fatores mais freqüentes em amostras isoladas no RS.
4.8 iutA
O gene iut A está relacionado com a captação e transporte de ferro pela bactéria,
uma vez que se trata de um elemento essencial para sua sobrevivência e está pouco
disponível, a E. coli suplanta este obstáculo por possuir sistemas especiais de
assimilação de ferro, através de componentes ligantes de ferro de baixo peso molecular
chamado sideróforos (NEILANDS, 1981a).
A aerobactina é o sistema de captação e transporte de ferro mais utilizado pela
E. coli. É um sideróforo que é excretado ao meio e se liga ao íon férrico formando um
complexo estável, através do qual o ferro é transportado para o citoplasma via
componentes específicos das membranas externa e interna. A E. coli utiliza o ferro no
transporte de oxigênio, síntese de DNA transporte de elétrons e no metabolismo do
peróxido, (NEILANDS, 1981; NEILANDS, 1985). É sintetizada principalmente na
fase exponencial tardia e na fase estacionária de crescimento (STUART et al. 1980). Os
cinco genes da aerobactina estão arranjados em um único operon de 7,5Kb.
28
Os genes da biossintese são denominados iucA, iucB, iucC e iucD. O gene iutA
codifica uma proteína receptora de membrana externa (BINDEREIF & NEILANDS,
1985; NEILANDS, 1985).
O operon aerobactina é geralmente relacionada ao plasmídio ColV no entanto
pode ser cromossomal (JOHNSON, 1991; LINGGOOD et al.,1987).
Segundo Rohrbach et al. (1995), a aerobactina após cumprir sua função é
reciclada continuamente no interior da célula e exportada para carrear outro íon ferro, o
que implica em economia de energia.
A aerobactina vem sendo utilizada como um importante marcador de virulência
uma vez que os genes do pCol V no qual esta propriedade está codificada, também
podem carrear outros fatores de virulência (GÓES et al., 1993; VIDOTTO et al., 1991).
Um grande número de autores vem encontrando associação entre amostras
virulentas de E. coli e a presença de aerobactina.
Em amostras de celulite, Brito et al. (2003) verificaram 92%, Rodriguez-Siek et
al. (2005b), constataram 80,2%, Delicato et al. (2003), de 63% de positividade do gene
iutA. Já Ngeleka et al. (1996) encontraram um índice de 82%.
Peighambari et al. (1995) estudaram amostras isoladas de celulite e de fezes,
obtiveram 83% e 90% respectivamente. Gomis et al. (2001) estudando amostras de
colisepticemia obtiveram positividade de 46,8%. A exceção foi Vandekerchove et al.
(2005,) que apresentaram apenas 23%, em amostras analisadas.
O gene iutA, foi detectado em 51,3% das amostras de celulite e em apenas
19,2% nas isoladas de fezes, e em 45,9% de amostras de E. coli, isoladas de frangos de
corte com problemas respiratórios (ROCHA , 2006).
4.9 kpsII
Após a implantação na microbiota, a E.coli invade os tecidos e se instala no
tecido sangüíneo, e um dos fatores que faz com que a bactéria resista à ação da
atividade lítica do complemento sérico está relacionada com a presença dos antígenos
K1 e K5 (TIMMIS et al, 1981).
29
O gene kps é o responsável pela codificação dos antígenos capsulares K1 e K5
Johnson et al. (2005), pelas superfícies estruturais polissacarídicas (LPS) da cápsula, de
outras membranas protéicas e pela presença de proteínas de membrana externa (Gross,
1994) que estão relacionadas à resistência ao soro.
Leive (1965) estabeleceu uma relação entre a quantidade de LPS e o grau de
resistência sérica encontrada demonstrando que o tratamento de amostras de E. coli
com EDTA, para a remoção parcial do LPS presente na membrana externa, tornava
essas amostras resistentes à ação do soro em amostras sensíveis.
Gross (1994) associou a presença do antígeno K com amostras com septicemia
isoladas de aves.
Delicato et al. (2002), encontraram positividade de 20% em amostras isoladas
de aves com colibacilose, um maior índice foi detectado por Brito et al. (2003), que
relataram 30% em cepas isoladas de celulite.
A presença de polissacarídeos de cápsula tem a capacidade anti-fagocítica e
protege a bactéria contra lise do soro complemento. Joiner et al., (1983), Kuhnert et al.
(2000b); afirmaram que amostras bacterianas resistentes não permitiam uma inserção
estável do complemento de ataque à membrana.
Valvano (1992) relata que grande parte dos sorogrupos de LPS não é suficiente
no bloqueio da ação do sistema complemento, em infecções septicêmicas. Alguns
destes sorogrupos requerem a participação de outros fatores, como a presença de
cápsula, para a expressão da resistência sérica (CROSS et al., 1986).
Stawski (1990) demonstrou que a cápsula K1 é antifagocítica e pode estar
envolvida com a resistência sérica.
Em amostras isoladas de celulite, Ngeleka et al. (1996), encontraram 71% de
cepas que expressaram resistência ao complemento. Gomis et al. (2000), apresentaram
positividade de 88%. Brito et al. (2003), verificou a presença do gene iss obtendo 83%
de positividade nas amostras isoladas de celulite enquanto todas as amostras de fezes
foram negativas para a presença do gene. A presença do gene iss em amostras isoladas
de aves com colisepticemia foi relatada por Mcpeake et al. (2005) em 72,8%, Pfaff-
McDonough et al. (2000) com 77%, Rodriguez-Siek et al. (2005a), 81,5% e Delicato et
al. (2003) com 38,5%.
30
Vidotto et al. (1990); Wooley et al. (1992), associaram 68,8% e 67,5% com
resistência sérica em colissepticemia de origem aviária. Parreira et al. (1998), em
amostras de casos de síndrome da cabeça inchada encontraram 72%.
Rocha (2006) associou para o gene kps uma positividade de 27% das cepas de
celulite e em 7% das isoladas de fezes de 238 amostras de E. coli, isoladas de cama de
aviário e lesões de celulite e em 18% em 61 amostras de E. coli, isoladas de frangos de
corte com problemas respiratórios.
4.10 iss
O gene iss é importante por permitir a bactéria resistência aos efeitos
bactericidas do soro do hospedeiro. Bloqueia o complexo terminal do sistema do
complemento que atua na membrana celular causando a lise da célula (BINNS et al.,
1982).
Está localizado no plasmídio pColV-I-K94, e está relacionado com a inibição do
complexo citotóxico (BINNS et al., 1979).
A resistência ao soro foi definida por Taylor (1983) como sendo a propriedade
de uma amostra bacteriana, no início de sua fase logarítmica de crescimento, de ser
totalmente insensível a uma alta concentração de soro.
Chuba & Palchaudhuri (1984), observou que o gene iss aumentava em 20 vezes
a capacidadede resistência das células bacterianas ao efeito do soro.
Jeffrey et al. (2002), relatam que cepas de E. coli aviárias isolados de celulite
possuem mecanismos de virulência semelhantes das cepas isoladas de colisepticemia.
O gene iss é encontrado frequentemente em casos de colibacilose e com menor
número em aves saudáveis (DELICATO et al., 2003).
O sistema complemento é determinado por um conjunto de proteínas
plasmáticas e de membrana celular do hospedeiro, que atuam na defesa contra
infecções, agindo no sentido de eliminar os microrganismos invasores, liberando sub-
componentes que atuam efetivamente como mediador na resposta inflamatória
provocando assim a morte bacteriana (ROCHA, 2006).
31
A resistência ao soro sangüíneo é um dos fatores freqüentemente associados à
colibacilose (BREE et al., 1989, VIDOTTO et al., 1991; WOOLEY et al., 1992;
WOOLEY et al., 1993; BARNES & GROSS, 1997; PARREIRA et al., 1998).
Roantree & Rantz (1960), afirmaram que resistência sérica, apresentado por
bactérias Gram-negativas estão comumente presentes em amostras septicêmicas e
invasivas em comparação com não invasivas e não septicêmicas.
Em 80,6% das amostras de celulite e 53,8% das de fezes apresentaram o gene
iss de um universo de 238 amostras de E. coli, isoladas de cama de aviário e lesões de
celulite, enquanto que, 73,8% de 61 amostras isoladas de frangos de corte com
problemas respiratórios (ROCHA, 2006).
4.11 tsh
Além das adesinas fimbriais, as adesinas afimbriais tem importante papel na
adesão bacteriana, Provence & Curtiss (1994), relataram a ocorrência de atividade
hemaglutinante em amostras de E. coli que somente é expressa a temperatura entre
26ºC e 30ºC e a chamaram de Hemaglutinina Temperatura Sensível e identificaram o
gene tsh.
A fase não fimbriada favoreceria a sobrevivência da E. coli, particularmente
após alcançar o órgão alvo por esta razão, a bactéria realizaria a inversão de fase, de
fimbriada para não fimbriada. Este fato tem sido verificado em diferentes tipos
fimbriais e provavelmente constitui-se em um fator de virulência (SHEFFER et al.,
1985; POURBAKHSH et al., 1997).
Este gene codifica uma proteína envolvida na proteólise de IgA humana e IgA
de galinha (STATHOPOULOS et al.,1999). Sua participação na patogenicidade de
amostras de origem aviária ainda necessita de mais estudos, entretanto vários autores
relatam a maior ocorrência deste gene em amostras isoladas de aves doentes
(MAURER et al., 1998).
Brito et al. (2003), obtiveram 19% de positividade em amostras de celulite, não
tendo encontrado nenhuma amostra positiva entre as de fezes.
32
Rocha (2006) detectou o gene tsh em 83% e 14% em 238 amostras de E. coli
isoladas de cama de aviário e lesões de celulite, já em 61 amostras de frangos de corte
com problemas respiratórios o índice foi de 55,7%.
O emprego da engenharia genética e das técnicas biomoleculares representou
um avanço na análise genética e uma ferramenta alternativa para um rápido diagnóstico
de microrganismos responsáveis por doenças tanto em saúde humana como em animal.
A rápida determinação dos aspectos genéticos da Escherichia coli, acompanhado de
outros perfis, é fator decisivo para uma resposta terapêutica mais rápida.
4.12 Multiplex-PCR
O surgimento da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), do inglês Polymerase
Chain Reaction, nos meados dos anos 80, mudou completamente o diagnóstico
laboratorial, tornando-o mais ágil, sensível e específico, por se tratar de uma
metodologia in vitro que possibilita a reprodução de milhares de cópias de um
determinado fragmento de DNA.
Desenvolvida por Saiki et al. em 1985, a técnica de PCR foi aperfeiçoada por
Mullis et al. em 1987 o que lhe rendeu o prêmio Nobel em 1993. As melhorias
introduzidas por Mullis foi o conceito de primer de PCR e o uso de uma enzima
termoestável (Taq DNA polimerase) isolada de uma bactéria que vive em fontes
termais, conhecida como Thermus aquaticus. Essa enzima possui a propriedade de se
manter estável em temperaturas altas facilitando a realização da técnica. Em 1989 foi
criado o primeiro termociclador automático e em meados dos anos 90 foi aperfeiçoado
com o emprego de um bloco de aquecimento composto por uma liga metálica que
aquece ou resfria de acordo com a programação do aparelho conhecido como padrão
Peltier (VIEIRA, 2003). m-PCR é uma variante da PCR no qual dois ou mais lócus
são amplificados simultaneamente na mesma reação, mostrando-se um ensaio rápido e
eficiente, tanto clínico como no laboratório de pesquisa. Foi descrita pela primeira vez
por Chamberlain et al. (1988), esse método vem sendo aplicado em inúmeras áreas da
biologia molecular, por vários autores. Pode ser utilizado para testar múltiplos
33
patógenos ou múltiplos fatores de virulência associados a um mesmo patógeno
(PERRY et al., 2007).
Redução do tempo de processamento, amplificação de vários genes de uma só
vez, redução de custos e uma menor quantidade de amostra são as vantagens desse
ensaio, mas para o estabelecimento de m-PCR, deve-se levar em consideração alguns
aspectos que são fundamentais para sua otimização como: equilíbrio entre as
concentrações de MgCl2 (cloreto de magnésio) doador estável de íons Mg2+,
imprescindíveis para ação enzimática e os deoxinucleotídeos (dNTPs),que sintetizam as
fitas filhas, pois são adicionados pela polimerase à fita-mãe, concentração e tamanho
dos primers (18-24 pb ou mais), porcentagem de CG (citocinas e guaninas) entre 35% e
60%, números de ciclos da reação e temperatura de anelamento dos primers (entre
55°C e 58°C) (HENEGARIU et al., 1997).
O mesmo autor descreve passos e cuidados que devem ser seguidos com a
intenção de garantir um desempenho adequado no desenvolvimento de um m-PCR.
O ponto de partida é a extração do DNA molde que deve estar livre de
impurezas como proteínas, lipídeos, outros ácidos nucléicos e reagentes de extração.
A preparação da mistura de reação (mix) deve iniciar pela pipetagem da água,
seguido dos outros reagentes sem ordem definida. Deve-se ter o cuidado de manter os
tubos sobre o gelo a fim de evitar a ação da enzima Taq DNA Polimerase. Tudo isso
deve ser feito em um fluxo laminar de ar estéril. O uso de pipetas com ponteiras que
possuam filtros que evitam a formação de aerossóis contaminando tanto o ambiente
como o equipamento é recomendado.
Como a técnica de PCR utiliza volumes pequenos, torna-se importante uma
perfeita acoplagem da ponteira a pipeta para assegurar uma pipetagem fiel ao volume
desejado.
Comumente o número de ciclos fica em torno de 30 para uma reação de PCR
habitual, um aumento de ciclos não influencia drasticamente no produto final.
Outro fator que deve ser levado em consideração são os termocicladores, pois
esses possuem perfis diferentes e um mesmo protocolo pode sofrer ligeiras mudanças
de temperatura e tempos de ciclos para a adaptação a uma outra máquina.
34
Não há influencia do volume de reação no resultado da PCR, mas volumes
pequenos podem ser benéficos quando a quantidade de DNA é reduzida. Em geral o
rendimento de produto de reação da PCR é mais alto quando o volume é de 25µl
comparado ao de 100 µL.
Quanto a Taq DNA Polimerase, é salientado que a concentração mais eficiente
gira em torno de 0,4 µL ou 2U/25 µL volume de reação. A Taq DNA polimerase, vem
acompanhada de uma solução-tampão específica contendo íons que otimizam as
condições de reação.
Os dNTPs, são suscetíveis ao descongelamento/congelamento constantes e por
isso é melhor manter alíquotas pequenas de 2-5 µL em uma concentração de 25mM.
Os produtos amplificados podem ser corridos em gel de agarose em várias
concentrações e voltagens, dependendo da separação desejada e do tempo disponível.
Produtos de tamanho inferiores a 600 pb são melhores separados entre 3 e 4
horas com uma concentração entre 2 e 2,5%.
No campo de doenças infecciosas, a técnica tem mostrado ser um método
valioso para identificação de vírus, bactérias, fungos e/ou parasitas (ELNIFRO et al.,
2000).
Bugart et al. (1992), afirmam que o emprego do m-PCR determinado pelo uso
de mais de um par de primers na mesma reação diminui o número de tubos do
experimento reduzindo assim a quantidade de reagentes e a possibilidade de
contaminação.
Markoulatos et al. (2002), asseguram ganho de tempo e atenuação de esforço
com a amplificação simultânea de múltiplas seqüências em uma simples reação e
acrescentam que para o desenvolvimento eficiente do m-PCR, são necessários
estratégia e planejamento acompanhado de tentativas de otimização das condições de
reação.
Perry et al. (2007), confirmam que além da economia com reagentes, o m-PCR
reduz o potencial de falsos positivos e falsos negativos na amplificação de dois ou mais
seqüências de DNA associados ao mesmo patógeno.
Uma desvantagem do m-PCR é a redução da sensibilidade do teste comparado
ao Uniplex PCR, o que pode resultar na necessidade de um tempo maior de
35
enriquecimento da bactéria aumentando a concentração da mesma (TSEN et al., 2000;
RAMESH et al., 2002).
Li & Mustapha (2004), sugerem um ajuste nas concentrações dos pares de
primers para compensar as diferenças na eficiência de amplificação entre eles.
Numerosos trabalhos vêm sendo realizados com o uso de m-PCR para a
detecção dos vários genes responsáveis pela virulência de amostras de E.coli
patogênicas.
O estudo de potenciais reservatórios de genes de virulência e o surgimento de
cepas emergentes de E.coli requerem a identificação dessas cepas, particularmente as
patogênicas, através de um grande número de perfis usando testes bioquímicos,
microbiológicos e genéticos (KUHNERT et al., 2000a).
A análise dos diferentes alelos do papG (fímbria tipo P), importante fator de
virulência, em aves com E.coli patogênica para aves (APEC), foi desenvolvido por
Vandekerchove et al. (2005b), através de um m-PCR. O estudo demonstrou a
predominância do alelo papGII de amostras extraídas de aves com sintomas de
infecção por APEC. O PCR provou ser específico para a detecção do gene papG de
cepas aviárias.
Skyberg et al. (2003), caracterizou cepas aviárias de E.coli mediante a técnica
de m-PCR. Os genes eleitos para essa prova foram iss, responsável pela resistência
sérica, tsh hemaglutinina sensível a temperatura, cvi gene da imunidade a colV e o
iucC, gene do operon aerobactina. As amostras eram provenientes de dez cepas de aves
com colibacilose, das quais oito apresentaram três ou mais dos genes estudados e nove
cepas de amostras de fezes de aves aparentemente sadias, que apresentaram somente
um dos genes citados em nove cepas e uma com os quatro genes. Os genes de
virulência descritos não foram encontrados em outras espécies de bactérias usadas
como controles negativos, o que demonstra a especificidade do procedimento para
isolados de E.coli e sugerem que este protocolo pode ser útil para a caracterização e
estudo das cepas dessa bactéria.
Com base em dados de prevalência sobre os fatores associados à virulência em
cepas aviárias de E.coli e seu papel na patogenicidade de colibacilose, Ewers et al.
(2004); Ewers et al. (2005), estabeleceram uma prova de m-PCR a partir de casos
36
clínicos de colibacilose. O ensaio foi desenhado a partir das seqüências dos genes papC
(fímbria P), aerobactina (iucD), proteína para captura de ferro (irp2), hemaglutinina
sensível a temperatura (tsh), toxina de vacuolização autotransportada (vat), toxina
enteroagregativa (astA), resitência sérica (iss) e os genes presentes nos plasmídeos que
codificam a colicina V (cva/cvi). Com o propósito de verificar a utilidade dessa
ferramenta de diagnóstico, foram incluídas cepas de E.coli de amostras de fezes de aves
clinicamente sadias e de aves com E.coli uropatogênicas, necrotoxigênicas e
diarreogênicas. Os resultados obtidos demonstraram que o teste apresentou maior
sensibilidade, quando otimizado a partir de uma só colônia crescida em Agar LB (Agar
Luria Bertani) e que é capaz de identificar fatores associados à virulência em APEC, de
diferentes sorogrupos e de diferentes origens.
Vandekerchove et al. (2005a), desenvolveram um m-PCR para comparar os
fatores de virulência entre isolados de aves com (APEC) e de aves sadias. As
características de APEC associada com a ocorrência de colibacilose mostraram com
maior freqüência a presença dos genes tsh, iss, cvaC, irp2, fyuA, iroC, fimbria do tipo
1, produção de colicina e colicina V, e a contribuição das combinações desses genes em
relação a virulência.
Bottero et al. (2004), estabeleceram um multiplex PCR para detecção
simultânea de genes de patogenicidade de cepas de E.coli enteropatogênicas (EPEC),
enterotoxigênicas (ETEC) e verocitotoxigênicas (VTEC) no leite e em produtos
derivados do leite. Verificou em um primeiro momento a especificidade dos primers
com um uniplex PCR, para depois estabelecer o multiplex repetindo o teste várias
vezes para garantir a reprodutibilidade. Observou também a ausência de reações
cruzadas e a homologia entre os testes atingiu valores entre 97 e 100%.
Van Bost et al. (2003), usando multiplex pesquisaram cepas patogênicas de
E.coli necrotoxigênicas (NTEC) produtoras de diferentes fatores que contribuem para a
virulência como adesinas fimbriais e não fimbriais, aerobactina siderófaro e duas
toxinas. As amostras eram provenientes de bovinos, caninos suínos e humanos. Entre
os genes pesquisados está o papC responsável pelo transporte de proteínas e está
inserido no gene cluster pap/prs que também codifica as subunidades estruturais papA,
papE, papF e papG. O teste correspondeu às expectativas amplificando os fragmentos
37
de DNA de cada gene esperado. Não obstante sugere repetições com um número maior
de amostras a fim de validação do protocolo.
Yamamoto et al. (1995), avaliou a utilidade do m-PCR para rápida detecção de
fatores de virulência de E.coli em pacientes de UTI com cistite, na investigação da
presença dos genes papC (fímbria P), sfa (fímbria S), afaI (adesinas não fimbriais), hly
(hemolisina), bem (aerobactina) e cnf1 (fator citotóxico necrosante). Concluiu a
utilidade do método na detecção simultânea de fatores de virulência e na conseqüente
identificação das causas de cistite dentro da unidade de tratamento intensivo.
O perfil genético das cepas de E.coli, com combinações e interações dos fatores
de virulência seria por si só de suma importância para determinar seu potencial de
patogenicidade. A rápida resposta nesses procedimentos torna o m-PCR, uma
ferramenta à disposição na agilização desse processo.
.
38
5. MATERIAL E MÉTODO
5.1 Amostras Bacterianas
Para o estabelecimento do Multiplex PCR, foram utilizadas 130 amostras de E.
coli de um universo de 299 isoladas e identificadas bioquimicamente no
CDPA/Garibaldi/RS de 60 diferentes propriedades integradas de três empresas avícolas
do RS. Estas amostras foram coletadas no verão e no inverno de 2002. As amostras
foram isoladas de lesões de celulite, quadros respiratórios e de cama aviária e foram
preservadas no meio de cultura BHI (caldo cérebro coração) com glicerol em uma
proporção de 4:1. Elas fazem parte da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em
Patologia Aviária (CDPA).
5.2 Fatores de Virulência
O Multiplex-PCR foi testado para a presença dos seguintes genes: papC e felA
(F11) fímbria P, iss (Resistência Sérica), tsh (hemaglutinina sensível a temperatura),
cvaC (colicinaV), kpsII presença dos antígenos capsulares, iutA (aerobactina). A sua
otimização foi feita a partir do ajuste das concentrações de MgCl2, dNTPs e primers,
das condições de temperatura de anelamento, desnaturação e extensão e número de
ciclos de reação, bem como as unidades de Taq DNA Polimerase. Esta otimização foi
baseada em adaptações do protocolo de PCR para estabelecer o perfil genético de E.
coli associados à classificação de patogenicidade isoladas de frangos de corte com a
utilização de Inteligência Artificial (Redes Neurais Artificiais) desenvolvido por
(ROCHA, 2006).
As amostras foram testadas individualmente para a presença dos 7 genes com o
emprego do protocolo de PCR descrito por Rocha (2006) e foram selecionadas as que
apresentavam concomitantemente os genes eleitos para cada um dos m-PCR propostos
de acordo com as tentativas de otimização e estabelecimento dos mesmos. Sendo
assim, para o duplex iss e tsh, foram testadas 94 amostras; o segundo duplex, para os
39
genes papC e kpsII, foram utilizadas 18 amostras; e para o triplex para os genes felA,
iutA e cvaC foram selecionadas 2 amostras. Como o número de amostras disponíveis
para o estabelecimento do triplex era baixo, foram acrescidas a essas, amostras que
continham dois desses genes e misturadas à outra que continha o terceiro gene. Para
isso, foram combinados as culturas em caldos (BHI) incubados a partir de uma colônia
isolada em Agar EMB (Agar Eosina Azul de Metileno) e realizada a extração, bem
como misturados os DNA´s de cada amostra após a extração com o intuito de testar o
protocolo com um maior número de amostras que tivessem os três genes ao mesmo
tempo. Ao total foram testadas 18 amostras.
5.3 Extração do DNA
O protocolo de extração de DNA foi feito por calor, a partir de uma colônia
isolada em Agar EMB e cultivada em caldo BHI (Brain heart infusion) por 24 horas a
37oC. Um mL desta cultura foi centrifugado a 8000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante
foi desprezado, o sedimento foi acrescido de 800 µL de água ultra pura, ressuspendido
e centrifugado nas mesmas condições citadas anteriormente. O sobrenadante foi
desprezado novamente e o sedimento acrescido de 80 µL de água ultra pura. As
amostras foram então submetidas à temperatura de 96ºC por 10 minutos em banho-
maria com agitação. O sobrenadante contendo o DNA foi retirado e conservado a -20ºC
até o momento da análise.
5.4 Primers
Os primers ou iniciadores utilizados (Tabela 1) foram sintetizados pela
Invitrogen, e foram utilizados no trabalho de Rocha (2006). A reação de amplificação
foi realizada em Termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer
Instruments, USA) e a eletroforese dos produtos amplificados foi feita em gel de
40
agarose, corado com brometo de etídio e visualizada em transluminador Ultra-Violeta
(UV) Pharmacia LKB MacroVue.
Como indicador de massa molecular foi utilizado, em cada eletroforese, um
marcador de 100 pb (CENBIOT – UFRGS). Todos os equipamentos são pertencentes
ao CDPA.
Tabela 1 – Seqüência dos primers, tamanho de fragmentos de amplificação e referência bibliográfica dos genes associados à virulência de E. coli.
Genes Tamanho do fragmento (pb)
Seqüência dos primers 5´- 3´
Acesso ao Genbank
felA 270 ggc agt ggt gtc ttt tgg tg ggc cca gta aaa gat aat tga acc
Johnson et al. (2000)
iutA 300 ggc tgg aca tca tgg gaa ctg g cgt cgg gaa cgg gta gaa tcg
X05874
cvaC 680 cac aca caa acg gga gct gtt ctt ccc gca gca tag ttc cat
X57525
kpsII 272 gcg cat ttg ctg ata ctg ttg cat cca gac gat aag cat gag ca
X53819
papC 328 gac ggc tgt act gca ggg tgt ggc g ata tcc ttt ctg cag gga tgc aat a
X61239
iss 760 gtg gcg aaa act agt aaa aca gc cgc ctc ggg gtg gat aa
AF042279
tsh 620 ggt ggt gca ctg gag tgg agt cca gcg tga tag tgg
L27423
5.5 Otimização do PCR Multiplex
Para a determinação da viabilidade de detecção simultânea do DNA de
mais de um gene em uma única etapa de reação, foi definido um ensaio de um triplex-
PCR para os genes felA com 270 pb, iutA 300pb e cvaC 680 pb, um duplex-PCR para
os genes kpsII com 272pb e papC 328 pb e outro duplex-PCR para os genes iss com
760 pb e tsh 620 pb. Para isso foram levadas em consideração as semelhanças entre os
protocolos.
As modificações testadas para o triplex (felA, iutA e papC), foram na
concentração de MgCl2 para o gene felA, que passou de 2,5 mM para 4,0 mM,
41
igualando nesta condição aos outros dois genes; no número de ciclos para o gene papC,
que passou de 30 para 35 ciclos, permanecendo o gene iutA sem alterações. Como os
genes felA e iutA possuem número de pares de bases semelhantes, o que inicialmente
inviabilizaria o triplex, pois dificultaria a visualizarão da diferença de tamanhos de
pares de base, a solução encontrada foi aumentar a concentração do gel de agarose.
Foram testadas concentrações progressivas a partir de 1,2% até 4,0%, obtendo-se
melhor separação no gel em 3,5%, acompanhada de uma velocidade (volts) de
migração do DNA mais lenta (60 V) por três horas, para uma melhor separação dos
produtos de amplificação, possibilitando uma diferenciação nos tamanhos das bandas
dos fragmentos amplificados.
Não foi feita nenhuma alteração nas condições da PCR para o estabelecimento
do duplex para os genes kpsII e papC, pois os dois protocolos possuíam parâmetros
idênticos.
No duplex estabelecido para os genes iss e tsh, a modificação introduzida foi
quanto à temperatura de anelamento dos primers. No uniplex a temperatura de
anelamento era de 610C e 550C, respectivamente. Foram testadas temperaturas
intermediárias entre os dois protocolos iniciais, chegando a uma temperatura ideal para
os dois genes de 580C. (Tabela 2).
Tabela 2 – Alterações do m-PCR em relação ao PCR de Rocha, (2006).
Genes toC anel.PCR
toC anel. m-PCR
MgCl2
PCR MgCl2
m-PCR no ciclos
PCR no ciclos m-PCR
iutA 630C 630C 4 mM 4 mM 35X 35X cvaC 630C 630C 4 mM 4 mM 30X* 35X* felA 630C 630C 2,5 mM* 4 mM* 35X 35X kpsII 630C 630C 2,5 mM 2,5 mM 30X 30X papC 630C 630C 2,5 mM 2,5 mM 30X 30X tsh 550C* 580C* 2,5 mM 2,5 mM 30X 30X iss 610C* 580C* 2,5 mM 2,5 mM 30X 30X
Alterações realizadas.
Os controles positivos utilizados para o desenvolvimento do multiplex-PCR,
bem como para validar sua especificidade e sensibilidade foram gentilmente cedidos
42
pelo Prof. Dr. Benito Guimarães Brito do Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério
Finamor (IPVDF) e foram os seguintes: BK324 para os genes iss e tsh, IAPAR 1315
para os genes iutA, felA e cvaC e ATCC 35278 para os genes kpsII e papC. Foram
utilizadas como controles negativos amostras que não continha nenhum dos sete genes
escolhidos para desenvolvimento do experimento e que foram utilizados no ensaio
desenvolvido por (Rocha, 2006). (Tabela 3).
Tabela 3 – Controles utilizados para a otimização da PCR.
Genes Controles Positivos Controles Negativos
iutA IAPAR 1315 EC/CDPA 115
cvaC IAPAR 1315 EC/CDPA 115
felA IAPAR 1315 EC/CDPA 115
kpsII ATCC 35278 EC/CDPA 206
papC ATCC 35278 EC/CDPA 206
tsh BK324 EC/CDPA 223
iss BK324 EC/CDPA 223
A preparação da mistura de reação (mix) foi feita, adaptando procedimentos
previamente descritos:
Para os genes felA, iutA e cavC 11,2µL de água ultra pura; 2,5µL de tampão
10X Lab Trad ; 2µL de dNTP mix Invitrogen, contendo 2,5 mM de cada nucleotídeo;
2µl de MgCl 2 50mM Lab Trad; 1µL de cada um dos primers (20pMol); 0,3µL de Taq
DNA Polimerase (5U) Lab Trad, seguidos de um ciclo inicial de desnaturação a 94ºC
por 5 min, 35 ciclos repetidos de 1 min a 94ºC, 1 min a 63ºC, 2 min a 72ºC finalizando
com um ciclo final de extensão a 72ºC por 10min.,e o produto amplificado visualizado
em gel de agarose a 3,5%.
Para os genes kpsII e papC, 11,95µL de água ultra pura; 2,5µL de tampão 10X
Lab Trad; 2µL de dNTP mix contendo 2,5 mM de cada nucleotídeo; 1,25µL de MgCl2
50mM Lab Trad; 1µL de cada um dos primers (20pMol); 0,3µL de Taq DNA
polimerase (5U) Lab Trad, seguidos de um ciclo inicial de desnaturação a 94ºC por 5
43
min, 30 ciclos repetidos de 1 min a 94ºC, 1 min a 63ºC, 2 min a 72ºC finalizando com
um ciclo final de extensão a 72ºc por 10min, e o produto amplificado visualizado em
gel de agarose a 1,2%.
Para os genes iss e tsh, 11,95µL de água ultra pura; 2,5µL de tampão 10X Lab
Trad; 2µL de dNTP mix contendo 2,5mM de cada nucleotídeo; 1,25µL de MgCl2
50mM Lab Trad; 1µL de cada um dos primers (20pM); 0,3µL de Taq DNA polimerase
(5U) Lab Trad, seguidos de um ciclo inicial de desnaturação a 94ºC por 5 min, 30
ciclos repetidos de 1 min a 94ºC, 1 min a 58ºC, 2 min a 72ºC finalizando com um ciclo
final de extensão a 72ºc por 10min.,e o produto amplificado visualizado em gel de
agarose a 1,2%.
A amplificação foi realizada com volume final de 25µl contendo 20µl do Mix e
5µl de DNA bacteriano.
5.6 Especificidade da PCR
O teste de especificidade da PCR evita resultados falso-positivos e está
diretamente ligado a uma perfeita hibridização dos primers ou iniciadores com o DNA
alvo. A escolha das seqüências que flanqueiam os segmentos de DNA escolhidos para
amplificação é ponto fundamental na técnica da PCR, pois não pode apresentar
homologia com qualquer outro microrganismo.
Como esse protocolo foi desenvolvido a partir de colônias isoladas de E. coli já
identificadas anteriormente e que fazem parte da coleção do CDPA para determinar o
perfil genético dessas amostras e não como ferramenta de diagnóstico, o teste de
especificidade ficou restrito a presença dos sete genes marcadores de fatores de
virulência escolhidos para o desenvolvimento desse trabalho.
44
5.7 Sensibilidade da PCR
O teste de sensibilidade fornece os limites de detecção da PCR através de diluições
seriadas de colônias do microrganismo desejado, comparando o número de unidades
formadoras de colônias (UFC) de cada diluição com a capacidade do ensaio de
determinar a concentração mínima de DNA necessária para gerar um produto de
amplificação detectável.
As amostras que serviram como controles positivos foram incubadas em 10 mL
de caldo BHI por 24 h (fase estacionária) e realizadas diluições seriadas até a
diluição10-9 em tubos contendo 9 mL de solução salina 0,85%, que por sua vez foram
semeadas em Agar VRB (Agar cristal-violeta vermelho bile) em triplicatas para fazer a
contagem de UFC de cada diluição e processar a PCR para definir o limite de detecção.
45
6. RESULTADOS
A detecção de fatores de virulência de amostras de E.coli através do m-PCR
produziu a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes propostos em
tamanho de pares de base esperado para cada multiplex, através de adequações dos
protocolos em 100%.
Os iniciadores foram específicos para amostras que continham os genes
elencados já que não houve amplificação nas amostras que serviram como controles
negativos.
Os resultados obtidos pelo m-PCR foram capazes de reproduzir os resultados
gerados pelos protocolos de PCR desenvolvidos por (ROCHA, 2006).
A relação das amostras de E.coli e os genes que codificam fatores de virulência,
amplificados pelo m-PCR estão expostos na Tabela 4.
Tabela 4 – Relação das amostras de E.coli e os genes que codificam fatores de virulência, amplificados pelo m-PCR.
Amostras Genes Amostras Genes Amostras Genes 1 tsh, iss 1 kpsII, papC 2 felA,kpsII,cvaC
2 tsh, iss 2 kpsII, papC 39R felA,kpsII,cvaC 6 tsh, iss 6 kpsII, papC 1, 6 felA,kpsII,cvaC 7 tsh, iss 23 kpsII, papC 2, 27 felA,kpsII,cvaC 8 tsh, iss 25 kpsII, papC 9, 28 felA,kpsII,cvaC
9 tsh, iss 70 kpsII, papC 18, 136 felA,kpsII,cvaC 13 tsh, iss 74 kpsII, papC 22, 183 felA,kpsII,cvaC 14 tsh, iss 76 kpsII, papC 23, 192 felA,kpsII,cvaC 15 tsh, iss 149 kpsII, papC 25, 4R felA,kpsII,cvaC
16 tsh, iss 207 kpsII, papC 32, 5R felA,kpsII,cvaC 17 tsh, iss 212 kpsII, papC 33, 23R felA,kpsII,cvaC 18 tsh, iss 218 kpsII, papC 34, 27R felA,kpsII,cvaC 21 tsh, iss 223 kpsII, papC 38, 40R felA,kpsII,cvaC
22 tsh, iss 225 kpsII, papC 39, 50R felA,kpsII,cvaC 23 tsh, iss 245 kpsII, papC 40, 52R felA,kpsII,cvaC 25 tsh, iss 281 kpsII, papC 42, 59R felA,kpsII,cvaC 26 tsh, iss 39R kpsII, papC 43, 61R felA,kpsII,cvaC 33 tsh, iss - - 45, 62R felA,kpsII,cvaC 34 tsh, iss - - - - 35 tsh, iss - - - - 36 tsh, iss - - - - 37 tsh, iss - - - - 38 tsh, iss - - - -
46
Tabela 4 – Relação das amostras de E.coli e os genes que codificam fatores de virulência, amplificados pelo m-PCR.
Amostras Genes Amostras Genes Amostras Genes 39 tsh, iss - - - - 40 tsh, iss - - - - 42 tsh, iss - - - - 51 tsh, iss - - - - 52 tsh, iss - - - - 53 tsh, iss - - - - 54 tsh, iss - - - - 56 tsh, iss - - - - 69 tsh, iss - - - - 70 tsh, iss - - - - 73 tsh, iss - - - - 74 tsh, iss - - - - 75 tsh, iss - - - - 76 tsh, iss - - - - 86 tsh, iss - - - - 88 tsh, iss - - - -
108 tsh, iss - - - - 110 tsh, iss - - - - 112 tsh, iss - - - - 123 tsh, iss - - - - 125 tsh, iss - - - - 126 tsh, iss - - - - 127 tsh, iss - - - - 130 tsh, iss - - - - 134 tsh, iss - - - - 136 tsh, iss - - - - 141 tsh, iss - - - - 144 tsh, iss - - - - 149 tsh, iss - - - - 157 tsh, iss - - - - 163 tsh, iss - - - - 169 tsh, iss - - - - 170 tsh, iss - - - - 173 tsh, iss - - - - 180 tsh, iss - - - - 185 tsh, iss - - - - 186 tsh, iss - - - - 187 tsh, iss - - - - 196 tsh, iss - - - - 218 tsh, iss - - - - 223 tsh, iss - - - - 225 tsh, iss - - - -
47
Tabela 4 – Relação das amostras de E.coli e os genes que codificam fatores de virulência, amplificados pelo m-PCR.
Amostras Genes Amostras Genes Amostras Genes 227 230 239 240 241
tsh, iss
tsh, iss
tsh, iss
tsh, iss
tsh, iss
- - - - -
- - - - -
- - - - -
- - - - -
256 tsh, iss - - - - 263 tsh, iss - - - - 268 tsh, iss - - - - 272 tsh, iss - - - - 282 tsh, iss - - - - 283 tsh, iss - - - - 284 tsh, iss - - - - 287 tsh, iss - - - - 2R tsh, iss - - - - 3R tsh, iss - - - - 4R tsh, iss - - - - 5R tsh, iss - - - - 9R tsh, iss - - - -
10R tsh, iss - - - - 12R tsh, iss - - - - 13R tsh, iss - - - - 15R tsh, iss - - - - 19R tsh, iss - - - - 20R tsh, iss - - - - 34R tsh, iss - - - - 37R tsh, iss - - - - 38R tsh, iss - - - - 45R tsh, iss - - - - 50R tsh, iss - - - - 51R tsh, iss - - - - 58R tsh, iss - - - - 63R tsh, iss - - - -
Exemplos de amplificação do DNA de amostras de E. coli realizada por cada
protocolo de m-PCR estão expostos nas Figuras 1,2 e 3.
48
Figura 1 – Gel de Agarose 1,2% corado com brometo de etídio com produtos de amplificação de DNA de E.coli do duplex para os genes tsh (620 pb) e iss (760 pb). 1. Marcador de peso molecular (100pb); 3. Controle negativo; 2, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 amostras.
1 2 3 4 5 6 7
Figura 2 – Gel de Agarose 1,2% corado com brometo de etídio com produtos de amplificação de DNA de E.coli do duplex para os genes kpsII (272 pb) e papC (328 pb). 1, 2, 3, 4, 5 amostras; 6. Controle negativo; 7. Marcador de peso molecular (100pb) amostras.
49
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 3 – Gel de Agarose 3,5% corado com brometo de etídio com produtos de amplificação de DNA de E.coli do triplex para os genes felA (270 pb), iutA (300 pb) e cvaC (680 pb). 1. Marcador de peso molecular (100pb); 10. Controle negativo; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 11 amostras.
O teste de sensibilidade revelou um limite de detecção de 3 x 104 UFC/mL, para
o duplex tsh / iss; de 3 x 105 UFC /mL para o duplex kpsII / papC e de 2,7 x 105 UFC
/mL para o triplex felA / iutA / cvaC.
Os limites de detecção de cada m-PCR estão expostos nas figuras 4, 5 e 6.
Figura 4 – Teste de sensibilidade em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etídio com produtos de amplificação de DNA de E.coli do duplex para os genes tsh (620 pb) e iss (760 pb). 1. Marcador de peso molecular (100pb); 2. Inóculo original; 3 até 6, diluições seriadas de 10-1 até 10-5.
50
Figura 5 – Teste de sensibilidade em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etídio com produtos de amplificação de DNA de E.coli do duplex para os genes kpsII (272 pb) e papC (328 pb). 1. Marcador de peso molecular (100pb); 2. Inóculo original; 3 até 7, diluições seriadas de 10-1 até a diluição10-5.
Figura 6 – Teste de sensibilidade em gel de agarose 3,5% corado com brometo de etídio com produtos de amplificação de DNA de E.coli do triplex para os genes felA (270 pb), iutA (300 pb) e cvaC (680 pb). 1. Marcador de peso molecular (100pb); 2. Inóculo original; 3 até 6, diluições seriadas de 10-1 até a diluição10-4.
51
7. DISCUSSÃO
A utilização de ferramentas da engenharia genética é hoje amplamente utilizada
e representam um avanço substancial em pesquisas biológicas.
Vários pesquisadores empregam a técnica denominada Multiplex-PCR (m-
PCR), para a detecção simultânea de diferentes alvos moleculares de organismos como
a Escherichia coli, patógeno responsável por infecções causadoras de perdas
econômicas significativas na indústria avícola.
Multiplex-PCR, uma variação derivada da PCR, é um ensaio rápido e eficiente,
tanto clínico como no laboratório de pesquisa.
Traz vantagens por propiciar a possibilidade de em uma só reação analisar
múltiplos patógenos ou múltiplos fatores de virulência associados a um mesmo
patógeno (PERRY et al., 2007).
Inserido na linha de pesquisa desenvolvida pelo CDPA, com o Programa de
Isolamento e Identificação de Cepas Patogênicas de Escherichia coli, Rocha (2006),
estabeleceu protocolos de PCR para sete genes responsáveis por fatores de virulência
em amostras de E.coli com o objetivo de melhorar o entendimento dos mecanismos de
patogenicidade desse microrganismo. Usando as mesmas amostras, Souza (2006),
estabeleceu uma nova metodologia para cálculo do índice de patogenicidade através da
inoculação em pintos de um dia. O resultado desses dois trabalhos foi relacionado
utilizando-se Redes Neurais Artificiais (RNA) em Avicultura, um tipo de abordagem
que está inserido na filosofia de trabalho do CDPA.
O modelo de redes criado pela metodologia de Inteligência Artificial,
relacionou o índice de patogenicidade à caracterização genética através da PCR com a
finalidade de predizer o potencial de patogenicidade de cada amostra. Os modelos
matemáticos servirão para tornar menos empírica a adoção de medidas de controle e de
prevenção de doenças nas empresas avícolas.
O presente trabalho propõe a agilização da detecção de fatores de virulência de
amostras de E.coli de origem avícola utilizando o m-PCR, desenhado para detectar
múltiplas seqüências-alvo numa mesma reação diminuindo o tempo e os custos com
reagentes, acelerando a caracterização de genes associados à patogenicidade.
52
Os resultados obtidos pelo m-PCR foram capazes de reproduzir os resultados
gerados pelos protocolos de PCR desenvolvidos por Rocha (2006).
A detecção de fatores de virulência de amostras de E.coli através do m-PCR
produziu a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes propostos em
tamanho de pares de base esperado para cada multiplex, através de adequações dos
protocolos em 100%.
Bottero et al. (2004), ao desenvolver um m-PCR para detectar EPEC, ETEC e
VTEC no leite obtiveram de 97 a 100% de compatibilidade dos resultados comparados
ao monoplex.
Osek et al. (2003), usando um m-PCR para STEC conseguiram reproduzir em
100% os resultados da PCR.
Os iniciadores foram específicos para amostras que continham os genes
elencados já que não houve amplificação nas amostras que serviram como controles
negativos.
Para detectar a possibilidade de reação cruzada entre os primers e a formação
de dímeros, Bottero et al. (2004), testaram primeiramente os iniciadores com ausência
de DNA.
Pass et al. (2000), ao desenhar um m-PCR de 11 genes de virulência de E.coli
constataram a presença de produtos não específicos que interferiram em seus
resultados. Isso provavelmente deve-se ao fato de haver ocorrido interações entre os
jogos de primers.
O tempo de extensão tem um papel significante no resultado do ensaio uma vez
que no m-PCR são amplificados simultaneamente mais lugares, a quantidade de enzima
e nucleotídeos se torna por vezes um fator limitante, um maior tempo é necessário para
que as moléculas de polimerase completem a síntese de todos os produtos
(HENEGARIU et al., 1997).
Outro fator que influencia o aparecimento de bandas inespecíficas é a presença
de inibidores na reação, em vista disso a extração deve ser realizada a partir de colônias
isoladas e multiplicadas em caldos nutrientes o que garante um número suficiente de
células puras para a realização do ensaio.
53
Segundo Markoulatos et al. (2002), a otimização do m-PCR passa também pelo
acerto das concentrações finais dos reagentes, eliminando aparecimento de produtos
não específicos.
Os pares de primers devem iniciar se possível, com 1-2 pares de CG para
manter a estabilidade de anelamento, já que existem pontes de hidrogênio triplas entre
esses elementos, e as concentrações dos pares de primers devem ser equimolares em
um protocolo de m-PCR. Concentrações altas podem inibir a reação de multiplex
enquanto que as baixas podem não ser suficientes.
O intuito da PCR é realizar uma ótima reação e amplificar um lugar específico
sem qualquer subproduto inespecífico. Para tanto a temperatura de anelamento é
ingrediente fundamental para a perfeita hibridização do primer ao DNA alvo. A
temperatura de anelamento deve levar em consideração a Temperatura média dos
primers, se os produtos secundários persistirem, ou a amplificação do DNA alvo não
ocorrer, a temperatura entre os primers deve ser alterada aumentando o que possui um
valor menor de Tm, já que existe uma flexibilidade deste parâmetro permitindo a
otimização da reação (HENEGARIU et al., 1997).
O teste de sensibilidade do presente experimento revelou a capacidade do ensaio
de detectar a concentração mínima de DNA necessária para gerar um produto de
amplificação detectável a partir da cultura de 24h do caldo BHI de uma colônia isolada
em ágar EMB.
Limites de detecção encontrados na literatura apontam sensibilidade de 5 x 104
UFC/mL por Bottero et al., (2004) no leite e derivados e 5 x 103 UFC/mL por
Yamamoto et al., (1995), em urina de pacientes da UTI com cistite, suficientes,
segundo os autores para considerar o m-PCR um método eficiente e rápido para a
detecção de fatores de virulência identificados em E.coli.
Foi observada no desenrolar dos testes, uma redução significativa de tempo
entre os dois ensaios, já que Rocha (2006), para todos os protocolos consumia
aproximadamente 21 horas para obter os resultados, e no m-PCR o tempo foi abreviado
em 12 horas. Esses avanços são de grande valia, pois além de reduzir os custos com
reagentes, que diminuem de quantidade em cada reação, especialmente a Taq DNA
54
Polimerase que possui um custo em torno de R$ 400,00 cada alíquota com 5U/µl,
também há a redução no tempo de resposta do ensaio.
Esta condição para a indústria avícola reveste-se de inegável valor, pois com as
inúmeras doenças que acometem a avicultura comercial e que necessitam de constante
monitoramento, uma rápida resposta do laboratório ao veterinário no campo, quanto ao
perfil patogênico do microrganismo causador do problema contribuirá na conduta mais
adequada que deverá ser tomada em menor tempo.
O ideal seria o desenvolvimento de um heptaplex, ou seja, um ensaio que
contemplaria os sete genes em uma só reação. Essa idéia teve de ser descartada devido
ao fato que a diferença entre o tamanho dos fragmentos gerados era muito próxima,
(270, 272, 300, 328, 620, 680 e 760 pb) o que dificultaria a visualização no gel de
agarose. Outro fator é que o tempo de anelamento dos protocolos dos genes iss e tsh
eram muito diferentes dos demais (550C e 610C) respectivamente, indicando que o mais
racional seria a criação de um duplex desses dois genes com uma temperatura de
anelamento de 58 0C para ambos. Bottero et al. (2004) e Henegariu et al. (1994),
afirmam que para a implantação de um m-PCR, o tamanho dos amplicons devem
diferenciar em pelo menos 50 pb.
Apesar desse fato, na otimização do triplex (fel A 270pb, iutA 300pb e papC
680pb) , foi reunido dois protocolos que continham fragmentos semelhantes. Isso foi
feito para não deixar apenas um protocolo fora do m-PCR e porque com apenas dois
fragmentos semelhantes em tamanho e com uma voltagem mais lenta durante a
migração do DNA em um gel mais concentrado a diferença pode ser evidenciada.
Deve-se lembrar também que o conjunto de primers utilizados nesse
experimento, por razões econômicas, é os mesmos utilizados por Rocha (2006), e que
não foram desenhados com o intuito de desenvolver um m-PCR, por esse motivo uma
opção viável para o futuro seria redesenhar os primers, com tamanhos de fragmentos
diferenciados entre si e, talvez, com acréscimo de outros genes que fazem parte do
intrincado mecanismo que envolve a expressão dos fatores de virulência de E. coli.
55
8. CONCLUSÕES
1. O Multiplex-PCR desenvolvido nesse experimento revelou-se eficiente, pois
foi capaz de produzir a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes
propostos em tamanho de pares de base esperado para cada multiplex através de
adequações dos protocolos.
2. Os resultados obtidos pelo m-PCR reproduziram os resultados gerados pelos
protocolos de PCR desenvolvido por ROCHA (2006), com a vantagem de obter o
mesmo resultado em menor tempo (de 21h para 9h em média), e com a utilização de
menor volume de reagentes determinando uma economia nos insumos do ensaio.
3. Os acréscimos obtidos tornam o método disponível para a avaliação dos
atributos de virulência que determinam o potencial de patogenicidade de isolados de E.
coli.
56
9. REFERÊNCIAS
ASGAV, Associação Gaúcha de Avicultura, Dados estatísitcos 2005/2006. Disponível em http://www.asgav.com.br. Acesso em: 27 agosto 2007.
BARNES, H.J.; GROSS, W.B. Diseases of Poultry. 10a edição, ed. B.W. Calnek,
Iowa State University Press, Ames, Iowa USA, p. 131-141, 1997. BARNES H.J., VAILLANCOURT J.P., GROSS W.B.,Colibacillosis, in: Saif Y.M. (Ed.), Diseases in poultry, Iowa State University Press, Ames,2003, pp. 631–652.
BINDEREIF, A.; NEILANDS, J. B. Aerobactin Genes in Clinical Isolates of Escherichia-Coli. Journal of Bacteriology, v. 161, n. 2, p. 727-735, 1985.
BINNS, M. M.; DAVIES, D. L.;HARDY, K. G. Cloned Fragments of the Plasmid Colv,I-K94 Specifying Virulence and Serum Resistance. Nature, v. 279, n. 5716, p. 778-781, 1979.
BINNS, M. M.; MAYDEN, J.;LEVINE, R. P. Further Characterization of Complement Resistance Conferred on Escherichia-Coli by the Plasmid Genes Trat of R100 and iss of Colv,I-K94. Infection and Immunity, v. 35, n. 2, p. 654-659, 1982.
BOTTERO, M. T.; DALMASSO, A.; SOGLIA, D.; ROSATI, S.; DECASTELLI, L.;CIVERA, T. Development of a multiplex PCR assay for the identification of pathogenic genes of Escherichia coli in milk and milk products. Molecular and Cellular Probes, v. 18, n. 4, p. 283-288, 2004.
BURGART L.J.; ROBINSON R.A.; HELLER M.J.; WILKE W.W.; IAKOUBOVA O.K. Multiplex polymerase chain reaction. Mod. Pathol., 1992.
57
BREE, A.; DHO, M.; LAFONT, J. P. Comparative Infectivity for Axenic and Specific-Pathogen-Free Chickens of O2 Escherichia-Coli Strains with Or Without Virulence Factors. Avian Diseases, v. 33, n. 1, p. 134-139, 1989.
BRITO, B. G.; GAZIRI, L. C. J.;VIDOTTO, M. C. Virulence factors and clonal relationships among Escherichia coli strains isolated from broiler chickens with cellulitis. Infection and Immunity, v. 71, n. 7, p. 4175-4177, 2003.
CHAMBERLAIN, J. S.; GIBBS, R. A.; RANIER, J. E.; NGUYEN, P. N.;CASKEY, C. T. Deletion Screening of the Duchenne Muscular-Dystrophy Locus Via Multiplex Dna Amplification. Nucleic Acids Research, v. 16, n. 23, p. 11141-11156, 1988.
CHUBA, P. J.; PALCHAUDHURI, S. Outer-Membrane Proteins of Escherichia-Coli Carrying Serum Resistance Plasmid Colv,I-K94. Plasmid, v. 11, n. 2, p. 191-191, 1984.
COOPER, G. M. A célula. 2. ed. Poa: Artmed, 2001. CROSS, A.S.; KIM, K.S.; WRIGHT, C.; SADOFF, J.C.; GEMSKI, P. Role of lipopolysacharide and capsule in the serum resistance of bacteremic strains of Escherichia coli. J. Infect. Diseases, v. 54, p.497-503, 1986.
DAM, T.; DAS, P. Plasmids - potential tool for the investigation of gene transfer in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Medical Microbiology, v. 55, n. 4, p. 479-480, 2006.
DELICATO, E. R.; DE BRITO, B. G.; GAZIRI, L. C. J.;VIDOTTO, M. C. Virulence-associated genes in Escherichia coli isolates from poultry with colibacillosis. Veterinary Microbiology, v. 94, n. 2, p. 97-103, 2003.
DELICATO, E. R.; DE BRITO, B. G.; KONOPATZKI, A. P.; GAZIRI, L. C. J.;VIDOTTO, M. C. Occurrence of the temperature-sensitive hemagglutinin among avian Escherichia coli. Avian Diseases, v. 46, n. 3, p. 713-716, 2002.
DEREE, J. M.; SCHWILLENS, P.;VANDENBOSCH, J. F. Monoclonal-Antibodies That Recognize the P-Fimbriae F71, F72, F9, and F11 from Uropathogenic Escherichia-Coli. Infection and Immunity, v. 50, n. 3, p. 900-904, 1985.
58
DHO, M.; LAFONT, J. P. Escherichia-Coli Colonization of the Trachea in Poultry - Comparison of Virulent and Avirulent Strains in Gnotoxenic Chickens. Avian Diseases, v. 26, n. 4, p. 787-797, 1982.
DHO, M.; LAFONT, J. P. Adhesive Properties and Iron Uptake Ability in Escherichia-Coli Lethal and Nonlethal for Chicks. Avian Diseases, v. 28, n. 4, p. 1016-1025, 1984.
DHO-MOULIN, M.; FAIRBROTHER, J. M. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Veterinary Research, v. 30, n. 2-3, p. 299-316, 1999.
EISENSTEIN, B. I.; SWEET, D. S.; VAUGHN, V.; FRIEDMAN, D. I. Integration Host Factor Is Required for the Dna Inversion That Controls Phase Variation in Escherichia-Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 84, n. 18, p. 6506-6510, 1987.
ELFADIL, A. A.; VAILLANCOURT, J. P.;MEEK, A. H. Farm management risk factors associated with cellulitis in broiler chickens in southern Ontario. Avian Diseases, v. 40, n. 3, p. 699-706, 1996b.
ELFADIL, A. A.; VAILLANCOURT, J. P.; MEEK, A. H.; JULIAN, R. J.;GYLES, C. L. Description of cellulitis lesions and associations between cellulitis and other categories of condemnation. Avian Diseases, v. 40, n. 3, p. 690-698, 1996a.
ELNIFRO, E. M.; ASHSHI, A. M.; COOPER, R. J.;KLAPPER, P. E. Multiplex PCR: Optimization and application in diagnostic virology. Clinical Microbiology Reviews, v. 13, n. 4, p. 559-+, 2000.
EMERY, D. A.; NAGARAJA, K. V.; SHAW, D. P.; NEWMAN, J. A.;WHITE, D. G. Virulence Factors of Escherichia-Coli Associated with Colisepticemia in Chickens and Turkeys. Avian Diseases, v. 36, n. 3, p. 504-511, 1992.
EWERS, C.; JANSSEN, T.; KIESSLING, S.; PHILIPP, H. C.;WIELER, L. H. Molecular epidemiology of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolated from colisepticemia in poultry. Veterinary Microbiology, v. 104, n. 1-2, p. 91-101, 2004.
EWERS, C.; JANSSEN, T.; KIESSLING, S.; PHILIPP, H. C.; WIELER, L. H. Rapid detection of virulence-associated genes in avian pathogenic Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction. Avian Dis., v. 49, n. 2, p. 269-273, 2005.
59
FALLAVENA, L. C. B.; CANAL, C. W.; SALLE, C. T. P.; MORAES, H. L. S.; ROCHA, S. L. S.; PEREIRA, R. A. et al. Presence of avipoxvirus DNA in avian dermal squamous cell carcinoma. Avian Pathology, v. 31, n. 3, p. 241-246, 2002.
FERREIRA, A.P.J.; KNÖBL, T. Doença das aves. Campinas: Facta, 2000. p. 197- 198, Cap: COLIBACILOSE AVIÁRIA.
FOSYTHE, S. J. MICROBIOLOGIA DA SEGURANÇA ALIMENTAR. Porto Alegre: Artmed, 2002. 424 p.
GILSON, L.; MAHANTY, H. K.;KOLTER, R. 4-Plasmid Genes Are Required for Colicin-V Synthesis, Export, and Immunity. Journal of Bacteriology, v. 169, n. 6, p. 2466-2470, 1987.
GILSON, L.; MAHANTY, H. K.;KOLTER, R. Genetic-Analysis of An Mdr-Like Export System - the Secretion of Colicin-V. Embo Journal, v. 9, n. 12, p. 3875-3884, 1990.
GOES, C. R.; GAZIRI, L. C. J.;VIDOTTO, M. C. Cloned Genes of the Aerobactin System of Virulent Avian Escherichia-Coli do Not Confer Virulence to Recombinant Strains. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 26, n. 3, p. 261-275, 1993.
GOMIS, S. M.; GOMIS, A. I. U.; HORADAGODA, N. U.; WIJEWARDENE, T. G.; ALLAN, B. J.;POTTER, A. A. Studies on cellulitis and other disease syndromes caused by Escherichia coli in broilers in Sri Lanka. Tropical Animal Health and Production, v. 32, n. 6, p. 341-351, 2000.
GOMIS, S. M.; RIDDELL, C.; POTTER, A. A.;ALLAN, B. J. Phenotypic and genotypic characterization of virulence factors of Escherichia coli isolated from broiler chickens with simultaneous occurrence of cellulitis and other colibacillosis lesions. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire, v. 65, n. 1, p. 1-6, 2001.
GROSS, W.G. Factors Affecting the Development of Respiratory Diseases Complex in Chickens. Avian Diseases, v. 34, p. 607-610, 1990. GROSS, W.G. Disease duo to Escherichia coli in poultry. In: Escherichia coli in
60
Domestic Animals and Humans. Ed: Gyles, C.L. UK, CAB Irternacional, p. 237- 259, 1994.
HACKER, J.; KAPER, J. B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annual Review of Microbiology, v. 54, p. 641-679, 2000.
HENEGARIU, O.; HEEREMA, N. A.; DLOUHY, S. R.; VANCE, G. H.;VOGT, P. H. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques, v. 23, n. 3, p. 504-511, 1997.
HOSCHUTZKY, H.; NIMMICH, W.; LOTTSPEICH, F.;JANN, K. Isolation and Characterization of the Non-Fimbrial Adhesin Nfa-4 from Uropathogenic Escherichia-Coli O7-K98-H6. Microbial Pathogenesis, v. 6, n. 5, p. 351-359, 1989.
IKUNO, A.A. et al. Genes de virulência associados em Escherichia coli (APEC) isoladas de poedeiras comerciais, do meio ambiente e de água de dessentação de granjas de postura de ovos. O Biológico, São Paulo, v.68, 2006. Suplemento 2. Trabalho apresentado na REUNIÃO ANUAL DO INSTITUTO BIOLÓGICO, 9., 2006, São Paulo. Resumo 132/026. Disponível em: http://www.biologico.sp.gov.br/biologico/v68_supl_raib/132.PDF Acesso em: 04 set. 2007.
JEFFREY, J. S.; NOLAN, L. K.; TONOOKA, K. H.; WOLFE, S.; GIDDINGS, C. W.; HORNE, S. M. et al. Virulence factors of Escherichia coli from cellulitis or colisepticemia lesions in chickens. Avian Diseases, v. 46, n. 1, p. 48-52, 2002.
JOHNSON, J. R. Virulence Factors in Escherichia-Coli Urinary-Tract Infection. Clinical Microbiology Reviews, v. 4, n. 1, p. 80-128, 1991.
JOHNSON, T. J.; SIEK, K. E.; JOHNSON, S. J.;NOLAN, L. K. DNA sequence and comparative genomics of pAPEC-O2-R, an avian pathogenic Escherichia coli transmissible R plasmid. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 49, n. 11, p. 4681-4688, 2005.
JOINER, K. A.; GOLDMAN, R. C.; HAMMER, C. H.; LEIVE, L.;FRANK, M. M. Studies of the Mechanism of Bacterial-Resistance to Complement-Mediated Killing .5. Igg and F(Ab')2 Mediate Killing of Escherichia-Coli 0111B4 by the Alternative Complement Pathway Without Increasing C5B-9 Deposition. Journal of Immunology, v. 131, n. 5, p. 2563-2569, 1983.
61
KUHNERT, P.; BOERLIN, P.;FREY, J. Target genes for virulence assessment of Escherichia coli isolates from water, food and the environment. Fems Microbiology Reviews, v. 24, n. 1, p. 107-117, 2000b.
KUHNERT, P.; FREY, J.; BOERLIN, P.;BURNENS, A. P. Gene marker diagnostics in bacteriology. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde, v. 142, n. 5, p. 218-220, 2000a.
LA RAGIONE, R. M.; WOODWARD, M. J. Virulence factors of Escherichia coli serotypes associated with avian colisepticaemia. Research in Veterinary Science, v. 73, n. 1, p. 27-35, 2002.
LEIVE, L. Release of Lipopolysaccharide by Edta Treatment of e Coli. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 21, n. 4, p. 290-&, 1965.
LI, Y.; MUSTAPHA, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157 : H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. Journal of Food Protection, v. 67, n. 1, p. 27-33, 2004.
LINGGOOD, M. A.; ROBERTS, M.; FORD, S.; PARRY, S. H.;WILLIAMS, P. H. Incidence of the Aerobactin Iron Uptake System Among Escherichia-Coli Isolates from Infections of Farm-Animals. Journal of General Microbiology, v. 133, p. 835-842, 1987.
MACKLIN, K. S.; NORTON, R. A.;MCMURTREY, B. L. Scratches as a component in the pathogenesis of avian cellulitis in broiler chickens exposed to cellulitis origin Escherichia coli isolates collected from different regions of the US. Avian Pathology, v. 28, n. 6, p. 573-578, 1999.
MARKOULATOS, P.; SIAFAKAS, N.; MONCANY, M. Multiplex polymerase chain reaction: A practical approach. Journal of Clinical Laboratory Analysis, v. 16, n. 1, p. 47-51, 2002.
MAURER, J. J.; BROWN, T. P.; STEFFENS, W. L.; THAYER, S. G. The occurrence of ambient temperature-regulated adhesins, curli, and the temperature-sensitive hemagglutinin tsh among avian Escherichia coli. Avian Diseases, v. 42, n. 1, p. 106-118, 1998.
MCPEAKE, S. J. M.; SMYTH, J. A.;BALL, H. J. Characterisation of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) associated with colisepticaemia compared to faecal isolates from healthy birds. Veterinary Microbiology, v. 110, n. 3-4, p. 245-253, 2005.
62
MEL, S. F.; MEKALANOS, J. J. Modulation of horizontal gene transfer in pathogenic bacteria by in vivo signals. Cell, v. 87, n. 5, p. 795-798, 1996.
MELLATA, M.; DHO-MOULIN, M.; DOZOIS, C. M.; CURTISS, R.; BROWN, P. K.; ARNE, P. et al. Role of virulence factors in resistance of avian pathogenic Escherichia coli to serum and in pathogenicity. Infection and Immunity, v. 71, n. 1, p. 536-540, 2003.
MONTGOMERIE, J. Z.; BINDEREIF, A.; NEILANDS, J. B.; KALMANSON, G. M.;GUZE, L. B. Association of Hydroxamate Siderophore (Aerobactin) with Escherichia-Coli Isolated from Patients with Bacteremia. Infection and Immunity, v. 46, n. 3, p. 835-838, 1984.
NAVEH, M. W.; ZUSMAN, T.; SKUTELSKY, E.;RON, E. Z. Adherence Pili in Avian Strains of Escherichia-Coli - Effect on Pathogenicity. Avian Diseases, v. 28, n. 3, p. 651-661, 1984.
NEILANDS, J. B. Iron-Absorption and Transport in Microorganisms. Annual Review of Nutrition, v. 1, p. 27-46, 1981a.
NEILANDS, J. B, BINDEREIF A., MONTGOMERIE J.Z. Genetic-Basis of Iron Assimilation in Pathogenic Escherichia-Coli. Current Topics in Microbiology and Immunology, v. 118, p. 179-195, 1985.
NGELEKA, M.; BRERETON, L.; BROWN, G.;FAIRBROTHER, J. M. Pathotypes of avian Escherichia coli as related to tsh-, pap-, pil-, and iuc-DNA sequences, and antibiotic sensitivity of isolates from internal tissues and the cloacae of broilers. Avian Diseases, v. 46, n. 1, p. 143-152, 2002.
NGELEKA, M.; KWAGA, J. K. P.; WHITE, D. G.; WHITTAM, T. S.; RIDDELL, C.; GOODHOPE, R. et al. Escherichia coli cellulitis in broiler chickens: Clonal relationships among strains and analysis of virulence-associated factors of isolates from diseased birds. Infection and Immunity, v. 64, n. 8, p. 3118-3126, 1996.
NORTON, R. A. Avian cellulitis. Worlds Poultry Science Journal, v. 53, n. 4, p. 337-349, 1997.
ORSKOV, I.; ORSKOV, F. Serology of Escherichia-Coli Fimbriae. Progress in Allergy, v. 33, p. 80-105, 1983.
63
PARREIRA, V. R.; ARNS, C. W.;YANO, T. Virulence factors of avian Escherichia coli associated with swollen head syndrome. Avian Pathology, v. 27, n. 2, p. 148-154, 1998.
PASS, M. A.; ODEDRA, R.;BATT, R. M. Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence genes. Journal of Clinical Microbiology, v. 38, n. 5, p. 2001-2004, 2000.
PEIGHAMBARI, S. M.; JULIAN, R. J.; VAILLANCOURT, J. P.;GYLES, C. L. Escherichia-Coli Cellulitis - Experimental Infections in Broiler-Chickens. Avian Diseases, v. 39, n. 1, p. 125-134, 1995.
PEIGHAMBARI, S. M.; VAILLANCOURT, J. P.; WILSON, R. A.;GYLES, C. L. Characteristics of Escherichia-Coli Isolates from Avian Cellulitis. Avian Diseases, v. 39, n. 1, p. 116-124, 1995.
PERRY, L.; HEARD, P.; KANE, M.; KIM, H.; SAVIKHIN, S.; DOMINGUEZ, W. et al. Application of multiplex polymerase chain reaction to the detection of pathogens in food. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, v. 15, n. 2, p. 176-198, 2007.
PFAFF-MCDONOUGH, S. J.; HORNE, S. M.; GIDDINGS, C. W.; EBERT, J. O.; DOETKOTT, C.; SMITH, M. H. et al. Complement resistance-related traits among Escherichia coli isolates from apparently healthy birds and birds with colibacillosis. Avian Diseases, v. 44, n. 1, p. 23-33, 2000.
POURBAKHSH, S. A.; BOULIANNE, M.; MARTINEAU-DOIZE, B.; FAIRBROTHER, J. M. Virulence mechanisms of avian fimbriated Escherichia coli in experimentally inoculated chickens. Veterinary Microbiology, v. 58, n. 2-4, p. 195-213, 1997.
PROVENCE, D. L.; CURTISS, R. Isolation and Characterization of A Gene Involved in Hemagglutination by an Avian Pathogenic Escherichia-Coli Strain. Infection and Immunity, v. 62, n. 4, p. 1369-1380, 1994.
RAMESH, A.; PADMAPRIYA, B. P.; CHANDRASHEKAR, A.;VARADARAJ, M. C. Application of a convenient DNA extraction method and multiplex PCR for the direct detection of Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica in milk samples. Molecular and Cellular Probes, v. 16, n. 4, p. 307-314, 2002.
64
RANDALL, C. J.; MEAKINS, P. A.; HARRIS, M. P.;WATT, D. J. A New Skin-Disease in Broilers. Veterinary Record, v. 114, n. 10, p. 246-246, 1984.
ROANTREE, R. J.; RANTZ, L. A. Study of the Relationship of the Normal Bactericidal Activity of Human Serum to Bacterial Infection. Journal of Clinical Investigation, v. 39, n. 1, p. 72-81, 1960.
ROCHA, A. C. G. P. Utilização de Inteligência Artificial (Redes Neurais Artificiais) para a Classificação de Patogenicidade de Amostras de Escherichia Coli Isoladas de Frangos de Corte. 2006. 1 v. Tese De Doutorado (A) - Curso de Medicina Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal do Rio rande do Sul, Porto Alegre, 2006.
ROCHA, A. C.; DA SILVA, A. B. BRITO A. B.; MORAES, H. L.; PONTES, A. P.; CE, M. C.; DO, NASCIMENTO, V; SALLE, C. T. Virulence factors of avian pathogenic Escherichia coli isolated from broilers from the south of Brazil. Avian Dis. v.46, n.3, p.749-753, 2002.
RODRIGUEZ-SIEK, K. E.; GIDDINGS, C. W.; DOETKOTT, C.; JOHNSON, T. J.; FAKHR, M. K.;NOLAN, L. K. Comparison of Escherichia coli isolates implicated in human urinary tract infection and avian colibacillosis. Microbiology-Sgm, v. 151, p. 2097-2110, 2005b.
RODRIGUEZ-SIEK, K. E.; GIDDINGS, C. W.; DOETKOTT, C.; JOHNSON, T. J.;NOLAN, L. K. Characterizing the APEC pathotype. Veterinary Research, v. 36, n. 2, p. 241-256, 2005a.
ROHRBACH, M. R.; BRAUN, V.; KOSTER, W. Ferrichrome Transport in Escherichia-Coli K-12 - Altered Substrate-Specificity of Mutated Periplasmic Fhud and Interaction of Fhud with the Integral Membrane-Protein Fhub. Journal of Bacteriology, v. 177, n. 24, p. 7186-7193, 1995.
SCHMIDT, H.; HENSEL, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews, v. 17, n. 1, p. 14-+, 2004.
SINGER, R. S.; JEFFREY, J. S.; CARPENTER, T. E.; COOKE, C. L.; ATWILL, E. R.; JOHNSON, W. O. et al. Persistence of cellulitis-associated Escherichia coli DNA fingerprints in successive broiler chicken flocks. Veterinary Microbiology, v. 75, n. 1, p. 59-71, 2000.
65
SINGER, R. S.; JEFFREY, J. S.; CARPENTER, T. E.; COOKE, C. L.; CHIN, R. P.; ATWILL, E. R. et al. Spatial heterogeneity of Escherichia coli DNA fingerprints isolated from cellulitis lesions in chickens. Avian Diseases, v. 43, n. 4, p. 756-762, 1999.
SHEFFER, J.; KONING, W.; KACKER, J.; GOEBEL, W. Bacterial adherence and hemolysin production from Escherichia coli induce histamine and leucotriene release from various cells. Infect. Immun., v. 50, p. 271-278, 1985.
SKYBERG, J. A.; HORNE, S. M.; GIDDINGS, C. W.; WOOLEY, R. E.; GIBBS, P. S.;NOLAN, L. K. Characterizing avian Escherichia coli isolates with multiplex polymerase chain reaction. Avian Diseases, v. 47, n. 4, p. 1441-1447, 2003.
SMITH, H. W. Search for Transmissible Pathogenic Characters in Invasive Strains of Escherichia-Coli - Discovery of A Plasmid-Controlled Toxin and A Plasmid-Controlled Lethal Character Closely Associated, Or Identical, with Colicine-V. Journal of General Microbiology, v. 83, n. JUL, p. 95-111, 1974.
SMITH, H. W.; HUGGINS, M. B. Further Observations on Association of Colicine V Plasmid of Escherichia-Coli with Pathogenicity and with Survival in Alimentary-Tract. Journal of General Microbiology, v. 92, n. FEB, p. 335-350, 1976.
SMYTH, C.J.; MARRON, M.; SMITH, S.G.J. Fimbriae of Escherichia coli in Domestic Animals and Humans, ed. Gyles, C.L., Cab International, UK, p. 399-435, 1994.
SOUZA, G. F. Estabelecimento de uma nova metodologia para o cálculo de patogenicidade em amostras de Escherichia coli provenientes da produção de frango de corte. 2006. 1 v. Dissertação De Mestrado (A) - Curso de Medicina Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2006.
STATHOPOULOS, C.; PROVENCE, D. L.;CURTISS, R. Characterization of the avian pathogenic Escherichia coli hemagglutinin tsh, a member of the immunoglobulin a protease type family of autotransporters. Infection and Immunity, v. 67, n. 2, p. 772-781, 1999.
STAWSKI G., NIELSEN L., ORSKOV F., ORSKOV I. Serum sensitivity of a
66
diversity of Escherichia antigenic reference strains. Correlation with an LPS variation phenomenom. Acta Pathologica Microbiologica et Immunologica Scandinavica 98, p. 828-838.1990.
STUART, S. J.; GREENWOOD, K. T.; LUKE, R. K. J. Hydroxamate-Mediated Transport of Iron Controlled by Colv Plasmids. Journal of Bacteriology, v. 143, n. 1, p. 35-42, 1980.
SUWANICHKUL, A.; PANIGRAHY, B. Diversity of Pilus Subunits of Escherichia-Coli Isolated from Avian Species. Avian Diseases, v. 32, n. 4, p. 822-825, 1988.
TAYLOR, P.W. Bactericidal and Bacteriolytic Activity of Serum Against Gram- negative Bacteria. Microbiological Reviews, v. 47, n. 1, p. 46-83, 1983.
TIMMIS, K.N.; MANNING, P.A.; ECHARTI, C. Serum resistance in E. coli. Molecular biology, pathogenicity and ecology of bacterial plasmid. New York:
Plenum, 1981. p. 133-144.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. 827 p.
TSEN, H. Y.; CHEN, M. L.; HSIEH, Y. M.; SHEU, S. J.;CHEN, Y. L. Bacillus cereus group strains, their hemolysin BL activity, and their detection in foods using a 16S RNA and hemolysin BL gene-targeted multiplex polymerase chain reaction system. Journal of Food Protection, v. 63, n. 11, p. 1496-1502, 2000.
VALVANO, M. A. Pathogenicity and Molecular-Genetics of O-Specific Side-Chain Lipopolysaccharides of Escherichia-Coli. Canadian Journal of Microbiology, v. 38, n. 7, p. 711-719, 1992.
VAN BOST, S.; JACQUEMIN, E.; OSWALD, E.; MAINIL, J. Multiplex PCRs for identification of necrotoxigenic Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology, v. 41, n. 9, p. 4480-4482, 2003.
VANDEKERCHOVE, D.; VANDEMAELE, F.; ADRIAENSEN, C.; ZALESKA, A.; HERNALSTEENS, J. P.; DE BAETS, L. et al. Virulence-associated traits in avian
67
Escherichia coli: Comparison between isolates from colibacillosis-affected and clinically healthy layer flocks. Veterinary Microbiology, v. 108, n. 1-2, p. 75-87, 2005b.
VANDEKERCHOVE, D.; VANDEMAELE, F.; ADRIAENSEN, C.; ZALESKA, M.; HERNALSTEENS, J. P.; DE BAETS, L.; BUTAYE, P.; VAN IMMERSEEL, F.; WATTIAU, P.; LAEVENS, H.; MAST, J.; GODDEERIS, B.; PASMANS, F. Virulence-associated traits in avian Escherichia coli: Comparison between isolates from colibacillosis-affected and clinically healthy layer flocks. Veterinary Microbiology, v. 108, n. 1-2, p. 75-87, 2005a.
VIDOTTO, M. C.; CACAO, J. M. C.; GOES, C. R.;SANTOS, D. S. Plasmid Coding for Aerobactin Production and Drug-Resistance Is Involved in Virulence of Escherichia-Coli Avian Strains. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 24, n. 7, p. 677-685, 1991.
VIDOTTO, M. C.; MULLER, E. E.; DEFREITAS, J. C.; ALFIERI, A. A.; GUIMARAES, I. G.;SANTOS, D. S. Virulence Factors of Avian Escherichia-Coli. Avian Diseases, v. 34, n. 3, p. 531-538, 1990.
VIEIRA, D. P. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. Disponível em: <http://www.imtsp.fm.usp.br/Proto/protocol.html>. Acesso em: 09 out. 2007.
WASSENAAR, T. M.; GAASTRA, W. Bacterial virulence: can we draw the line? Fems Microbiology Letters, v. 201, n. 1, p. 1-7, 2001.
WATERS, V. L.; CROSA, J. H. Colicin-V Virulence Plasmids. Microbiological Reviews, v. 55, n. 3, p. 437-450, 1991.
WILLIAMS, P. H.; WARNER, P. J. Colv Plasmid-Mediated, Colicin V-Independent Iron Uptake System of Invasive Strains of Escherichia-Coli. Infection and Immunity, v. 29, n. 2, p. 411-416, 1980.
WOOLEY, R. E.; BROWN, J.; GIBBS, P. S.; NOLAN, L. K.;TURNER, K. R. Effect of Normal Intestinal Flora of Chickens on Colonization by Virulent Colicin V-Producing, Avirulent, and Mutant Colicin V-Producing Avian Escherichia-Coli. Avian Diseases, v. 38, n. 1, p. 141-145, 1994.
WOOLEY, R. E.; NOLAN, L. K.; BROWN, J.; GIBBS, P. S.; GIDDINGS, C. W.;TURNER, K. S. Association of K-1 Capsule, Smooth Lipopolysaccharides, Trat
68
Gene, and Colicin-V Production with Complement Resistance and Virulence of Avian Escherichia-Coli. Avian Diseases, v. 37, n. 4, p. 1092-1096, 1993.
WOOLEY, R. E.; SPEARS, K. R.; BROWN, J.; NOLAN, L. K.;FLETCHER, O. J. Relationship of Complement Resistance and Selected Virulence Factors in Pathogenic Avian Escherichia-Coli. Avian Diseases, v. 36, n. 3, p. 679-684, 1992.
YAMAMOTO, S.; TERAI, A.; YURI, K.; KURAZONO, H.; TAKEDA, Y.;YOSHIDA, O. Detection of Urovirulence Factors in Escherichia-Coli by Multiplex Polymerase Chain-Reaction. Fems Immunology and Medical Microbiology, v. 12, n. 2, p. 85-90, 1995.
YANG, C. C.; KONISKY, J. Colicin V Treated Escherichia-Coli Does Not Generate Membrane-Potential. Journal of Bacteriology, v. 158, n. 2, p. 757-759, 1984.
