Detection Technology for Genetically Modified Crops for Human C

Métodos de detecção e Métodos de detecção e quantificação de Organismos quantificação de Organismos

Geneticamente Modificados e seus Geneticamente Modificados e seus produtos.produtos.

Fábio de Oliveira Pedrosa

CEPPA Ministério da EducaçãoUniversidade Federal do ParanáSetor de TecnologiaCentro de Pesquisa e Processamento de Alimentos CEPPA

Métodos baseados noDNA

Métodos baseados na Proteína

Aspectos Importantes da Aspectos Importantes da Quantificação de OGM’sQuantificação de OGM’s

• Amostragem e preparo da amostra– Procedimento determina a “representatividade” do resultado.

– Tamanho da amostra, homogeneidade da amostra e limiar

de detecção.

– Requerimentos estatísticos devem ser satisfeitos.

– Tipo de material define o método analítico.• Materiais não processados (ex. grãos)

• Ingredientes processados

• Alimentos processados

Materiais de ReferênciaMateriais de Referência• Controles positivos e negativos appropriados.

– Base para validação do procedimento analítico – Procedimento independente

• Efeitos da matriz e consistência similar para amostragem.– Grãos,alimentos, etc…– Estabilidade temporal, homogeneidade e conteúdo de OGM

• Métodos baseados no DNA: requerem muitos controles positivos

• Métodos baseados em Proteínas necessitam de um único padrão.

• Institute of Reference Materials and Measurement

– Geel, Belgica - Padrões Fluka. – Por que não desenvolvermos Padrões brasileiros?

Ahmed, 2002

• Os transgenes codificam para proteínas únicas e diferentes daquelas da planta hospedeira (originalmente não transgênica).

• Técnicas de Immunoensaios usam anticorpos. – Ideais para necessidades qualitativas e quantitativas– Detectam proteínas especificas em substratos complexos

• A proteína alvo deve ser conhecida• Interferências devido interações não-específicas com proteínas,

surfactantes (saponinas), fenólicos, ácidos graxos e fosfatases

Anticorpos policlonais Sensíveis mas apresentam reconhecimento menos específico do antigeno. Reação cruzada

Anticorpos monoclonais Altamente específicos, reconhecimento do antígeno ligeiramente menos sensível.

Métodos de análise baseados na Métodos de análise baseados na detecção de Proteínasdetecção de Proteínas

Métodos de análise baseados na Métodos de análise baseados na detecção de Proteínasdetecção de Proteínas

Western Blot = transferência de proteínas para membranas

1. Em placas de micropoços (Microwell Plate)1. Em placas de micropoços (Microwell Plate)

3. Em Tubos recobertos com anticorpos 3. Em Tubos recobertos com anticorpos

2. Imunocromatográfico em tiras (Lateral Flow Strip Assay)2. Imunocromatográfico em tiras (Lateral Flow Strip Assay)

4. Imunomagnético

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):

Western BlotWestern Blot• Teste qualitativo de alta específicidade• Indica se a concentração da proteína OGM está acima ou

abaixo do limiar de concentração requerido• Usado tipicamente para pesquisa• Usa eletroforese desnaturante SDS-PAGE

– Solubiliza e remove agregados de proteínas

Western BlotWestern Blot

As proteínas do gel são transferidas para uma membrana e reveladas com anticorpos específicos

toalha de papelMembranade transferência

toalha de papel

Gel

Extrato celular é aplicado em gel SDS PAGE

Submetido a eletroforese

Western BlotWestern Blot

3. Adicionar anticorpos

monoclonais4. lavar de novo

Anticorpos irão ligar à proteína específica

Revelar o anticorpo ligado para desenvolvimento de cor.

O aparecimento de cor revela a presença da proteína em estudo

• 1. Bloquear os sítios de ligação da membrana com leite desnatado

2. Lavar com ddH2O

5. Adicionar segundo anticorpo (marcado) contra o primeiro anticorpo .

ELISA Placa de micropoçosELISA Placa de micropoços• Micropoços são revestidos com anticorpo

– Quantitativo, altamente sensível, econômico, de alta produtividade, e ideal para análises laboratoriais.

• A proteína não pode estar desnaturada.

– Detecta 0.25% OGM em sementes & 1.4% em alimento tostado (toasted meal)

– Tempo de análise: 90 min

– Necessita leitor óptico de placas para quantificar

ELISA em Placa de micropoçosELISA em Placa de micropoços• Procedimento:• 1. Fixar anticorpo monoclonal específico para a proteína OGM. Eliminar

excesso de anticorpo. Bloquear sitios de ligação com proteínas de leite.• 2. Adicionar extrato total do material em análise. Remover excesso por lavagem.

Proteína OGM fica ligada ao anticorpo. • 3.Adicionar segundo anticorpo específico para a proteina OGM• 4. Adicionar anticorpo anti-anticorpo específico marcado com enzima

(HRPeroxidase ou fosfatase alcalina). Remover excesso do segundo anticorpo.• 4. Revelar

poço

proteína bloqueadora

Proteína OGMIntensidade da

cor é dependente da

concentração da proteína GMO

AmostraOGM proteína

Anticorpoespecíficomarcado

Segundoanticorpoespecífico

Anticorpoespecíficocapturado por anticorpo

linhateste

linhacontrole

Detecção Imunocromatográfica de OGM

(a) vista lateral do ELISA Resultadonegativo

Resultadopositivo

(b) vista vertical da tira

• Um variante do ELISA com dois anticorpos específicos à proteína expressa sendo um imobilizado e outro livre, que é acoplado a um reagente de cor.

• Rápido, econômico, transferable & good for initial screening

Protocolo de imunocromatografia para folhasProtocolo de imunocromatografia para folhas

• Testes para CryI(Ab) & CP4 EPSPS

• Orgãos vegetais & sementes.

1 2

3

1. Corte disco de folha

2. Adicionar a tubo, e macerar

3. Inserir uma flow tira de teste

Protocolo de imunocromatografia para grãosProtocolo de imunocromatografia para grãos

1. Contar ou pesar grãos equivalentes a 1000 grãos1. Contar ou pesar grãos equivalentes a 1000 grãos2. Colocar no copo do liquidificado 2. Colocar no copo do liquidificado 3. Adicionar 1000 ml de água destilada3. Adicionar 1000 ml de água destilada4. Liquidificar4. Liquidificar5. Deixar decantar 5. Deixar decantar 6. Pipetar 0,5 ml para tubo plástico de 1,5 ml6. Pipetar 0,5 ml para tubo plástico de 1,5 ml7. Inserir tira imunocromatográfica7. Inserir tira imunocromatográfica8. Incubar por 5 min à temperatura ambiente8. Incubar por 5 min à temperatura ambiente9. Ler o resultado9. Ler o resultado

1. Uma banda colorida = Negativo1. Uma banda colorida = Negativo2. Duas bandas coloridas = Positivo2. Duas bandas coloridas = Positivo

Experiência no CEPPAExperiência no CEPPA

Detecção imunocromatográfica - tiras

Kits reagentes da Strategic Diagnostics Inc. USA, soja RR (GR Bulk Soybean test kit) = LOD 0,1%milho (Bt1 Corn Grain test kit) = LOD 1%farelo de soja tostado (RUR Toasted Meal test kit) = LOD 0,9%

Limites de detecção encontrados:Soja - limite de detecção: 0,1% de OGM (ou 1 semente de soja transgênica RR em 1000) . Confiabilidade de 99% (3 sub-amostras)

1 /1000 5 /1000 10 /1000 100 /1/9002 /1000

Controle

Teste

Razão soja GM/soja

Kit de reagentes “GR Bulk Soybean test kit”

0,1 0,2 0,5 1 10% Soja GM

Soja RR


Ensaio Imunocromatográfico (Tiras)

ELISA ImunomagnéticoELISA Imunomagnético• Particulas Magnéticas como superfícies de suporte sólido

• Revestidas com anticorpos de captura e colocadas em tubos. – Separação usando um magneto exclui reagentes não ligados.– Cinética e precisão superiores devido à uniformidade das

partículas.

VS.

Anticorpos Anticorpos livres para mover em solução.

Considerações sobre os ensaios Considerações sobre os ensaios ELISAELISA

• Otimização e validação são importantes aspectos da padronização das técnicas de detecção de OGM’s

• Devido a grande diversidade de tipos de alimentos otimização e validação são imperativos.

• Fatores afetado a otimização são:1. Parâmetros como: • qualidade dos kits reagentes disponíveis comercialmente• métodos para testar proteínas modificadas• tempos de incubação, etc.2. Limites de detecção (positivo/negativo) ou %3. Rigor nos controles 4. Experiência do laboratório, problemas potenciais de

contaminação do ambiente e de pessoas.

Considerações sobre os Considerações sobre os ensaios ensaios ELISAELISA

• Fatores afetando a Validação incluem:1. Eficiência do método de extração da proteína OGM2. Acurácia dos resultados3. Precisão e habilidade do operador em distinguir

entre valores muito próximos4. Sensibilidade , limite de detecção5. Especificidade (anticorpo monoclonal)6. Reproducibilidade7. Consistência e confiabilidade de detecção

Conclusões sobre os Conclusões sobre os ensaios ensaios ELISAELISA

– ELISA é o método preferido para análise preliminar, qualitativa, de um OGM particular em material não processado, alimentos semi-processado e ingredientes processados, desde que a proteína expressa não esteja degradada e possa ser detectada.

Como ELISA tem menor poder de detecção que métodos envolvendo DNA, (métodos de PCR), ele é menos sensível para testar alimentos terminados contendo muitos ingredientes, especialmente se o limite de detecção for baixo.

Alguns OGMs não expressam níveis detectáveis de proteína(NÃO É O CASO COM OS OGMs MAIS COMUNS)

Métodos Baseados no DNAMétodos Baseados no DNA• Se baseiam na complementariedade da duas

fitas do DNA, que hibridizam de maneira sequência-específica. (A=T; CG)

• Reação em cadeia da DNA polimerase

• Requer DNA de alta qualidade

35S promoter EPSPS CP4EPSPS CP4 NOS terminator

CaMV Agrobacterium tumefaciensDiagrama representando a sequência RoundupReady®

Preparo da amostra de DNAPreparo da amostra de DNA• Extração e purificação do DNA

– A extração e a purificação do DNA são etapas importantes na obtenção de um DNA de

qualidade.– O DNA obtido apresentar :

• Alto grau pureza A260/A280 nm superior a 1,8• Massa molecular elevada (>>10000 pb) • Baixo grau de dano do DNA é decorrente de:

– Calor, baixo pH (depurinação), nucleases (degradação enzimática)

Preparo da amostra de DNAPreparo da amostra de DNA• Amostra para a extração do DNA

– A amostra laboratorial deve representar a amostra do campo/alimento:

• material de partida: 1 - 2,5 kg de sementes de soja• 100-350mg de amostra finamente moida para purificação.

DNA pode ainda ser afetado por contaminantes presentes nos diferentes tipos de alimentos e quenibem a detecção do rDNA por PCR, entre eles:

– Polisacarídeos, lipídeos, polifenois & reagentes de extração do DNA

Métodos de extração e purificação de DNA

- Inúmeros

Mais utilizados:1. O método do CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio)

- Recomendado pelo Min. Agricultura.2. O método Wizard da Promega usando resina

magnética. 3. O método proprietário PrepMan Ultra da Applied

Biosystems (Real time PCR).


Requerimentos para extração do DNA

• Quebrar as paredes celulares– Gelo seco ou nitrogênio líquido

• Romper as membranas celulares– Detergentes : CTAB or SDS

• Inativar nucleases– EDTA quela Mg2+ inibindo nucleases.

• Separar polissacarídeos inibidores • Separar constituintes celulares hidrofóbicos

– lipideos & polifenois com solvente orgânicos• Separar o DNA precipitando e lavando-o

com alcool.Determinar grau de pureza por espectrometria UV em 230,260 e 280 nm.Calcular a razão 260/280 nm…… superior a 1,8

Princípios da reação em cadeia da Princípios da reação em cadeia da DNA polimerase (PCR)DNA polimerase (PCR)

• Permite amplificar o DNA alvo milhões de vezes. • DNA polimerase faz cópias exatas do DNA alvo • Utiliza oligonucleotideos iniciadores (primers) complementares ao gene

de interesse• Permite a Taq-polymerase gerar sequências complementares à região contida entre os pares de primers.• O número de sequências cresce

exponencialmente

Cycles DNA molecules formed1 - 2 1 3 2 4 4 5 8 6 16 7 32 8 64 9 128

10 256 11 512 12 1,024 13 2,048 14 4,096 15 8,192 16 16,384 17 32,768 18 65,536

Mistura de reação:

Tampão de PCR dNTPsTaq polimerasePrimers F (senso) e R (antisenso)MgCl2DNA (5 µl)

Volume Total (25 ou 50 µl/reação)

Reação em cadeia da DNApolimerase (PCR)

Atividades da Taq polimerase

5’ nuclease5’ nucleasePolimerasePolimerase

• Atividade de DNA polimerase Termoestável

• Atividade 5 nuclease associada à polimerização

• Atividade 5 -3 nuclease. Não atrapalha PCR convencional

5’ 3’

5’3’

dNTP

Ciclagem térmica da PCR• Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.C)

22.0

0:1595.095.0

4:00

1:0060.0

1x 30-40x

72.0

desnaturaDNA

anela osprimers

estensãodos primers

0:30

desnaturaDNA

Mecanismo da reação em cadeia da DNA polimerase (Ciclagem térmica)

Gen alvo em dupla fita

Desnaturar fitas e anelar primers

Estender Primers com a Taq Polimerase

Desnaturar, Aneal e Estender Primers

Produtos:

Amplicons

primers F e R

5’

Amplificação exponencial = 2n n = número de ciclos

mostrar animação pcr.exe

Ciclagem térmica : Plateau

• Causas do plateau?– Inativação progressiva da Taq

polymerase, – Redução da eficiência da

etapa de desnaturação– Redução da eficiência do

anelamento dos primers devido a competição com o produto (reanelamento do produto)

– Taq polymerase se torna limitante.

Número do Ciclo

Teórico

Real

Log

DN

A a

lvo

• Amplificação é exponencial, mas o aumento exponencial é limitado levando a um plateau.

Confirmação dos Fragmentos de Confirmação dos Fragmentos de DNA amplificados por PCRDNA amplificados por PCR

• Eletroforese em Gel de agarose – tamanho– Verificar se o produto amplificado tem o tamanho

esperado.• Artefatos de mesmo tamanho => falso positivos

• Ensaio “Southern Blot”– Confiável mas demorado

• “Nested PCR” permite discriminação.– 2o. par de primers dentro do amplicon

• Sequenciamento do amplicon– Conveniente e demorado

Tipos de métodos de PCR para detecção de OGMs

1. Qualitativo2. Semi-Quantitativo3. Quantitativo

3.1 Competitivo3.2 Tempo Real -

Sistemas de detecção/quantificação: 3.2.1 Sondas de transferência de energia fluorescente

por ressonância (FRET) - Sistema TaqMan ( 5’ nuclease)

3.2.2 Sistema SybrGreen I (ligante de DNA dupla fita)

PCR Qualitativo

Usa dois pares de primers: F; senso ou 5’ 3’ e R; antisenso ou 3’ 5’

Os fragmentos de DNA amplificados (amplicons) sãoseparados por eletroforese em gel de agarose e visualizados por coloração com Brometo de Etídio.

HPLC e Eletroforese Capilar

Soja, trigo, canola, batata, arroz, milho, tomate, etc.

DNA dupla fita (template ou molde)dNTP’s (dATP, dGTP, dCTP, TTP)Par de oligonucleotídeos iniciadores (primers),

complementares às bordas externas do gene/transgenes de interesse (alvo)

Mg2+

Taq polimerase

Componentes da Reação de PCR:

Legislação da Coordenação de Laboratório Vegetal – CLAV/DDIV/SDA/MAPA

NORMAS PARA CREDENCIAMENTO DE LABORATÓRIO PARA DETECÇÃO DE

MODIFICAÇÃO GENÉTICA EM PRODUTOS E SUBPRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL

DOU Nº163 - Seção 1, sexta-feira, 24 de agosto de 2001INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001

Anexo II -

ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS

ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS (INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)

MÉTODO CTAB MODIFICADO PARA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS.

PROCEDIMENTO:

1. Pesar 1 Kg de grãos;2. Moer os grãos em moedor de café e colher duas sub-amostras

(200mg) de farinha em um tubo de microcentrífuga;3. Acrescentar 750µL de tampão CTAB e 15µL de beta-Mercaptoetanol;4. Agitar em um vortex durante 2 min;5. Incubar a 65°C por 15 min;6. Adicionar 520µL clorofórmio: álcool. isoamílico (24:1);7. Agitar em um Vortex durante 1 min;8. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min.;

CONTINUA

9.Transferir o sobrenadante para um novo tubo e acrescentar igual volume de isopropanol e 1/2v de acetato de amônio 7,5M;10. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;11. Desprezar o sobrenadante e lavar o precipitado com

etanol 70%;12. Centrifugar 13.000 rpm por 5 min.;13. Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado em temperatura ambiente durante 15 min;14. Solubilizar o precipitado em 50µL de água ultra-pura.15. Determinar a concentração e qualidade do DNA em espectrofotômetro;16. Armazenar o DNA a -20°C.

Amplificação do DNA - Método qualitativo de PCR(INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)

Para cada sub-amostra, 4 tubos de reação de PCR são utilizados em uma reação conforme a descrição abaixo:Água 17,8 ulTampão de PCR 10X 2,5 ulMgCl2 1,0 uldesoxiribonucleotídeos (dNTPs) (10 mM) 0,5 ulPrimersTubo 1 Act F (20 uM) 1,0 ul e Act R (20 uM) 1,0 ulTubo 2 35S-1 (20 uM) 1,0 ul e 35S-2 (20 uM) 1,0 ulTubo 3 35S-3 (20 uM) 1,0 ul e 35S-4 (20 uM) 1,0 ulTubo 4 Nos-1 (20 uM) 1,0 ul e Nos-2 (20 uM) 1,0 ulTaq DNA polimerase (5 U/ul) 0,2 ulDNA (200 ng) 1,0 ulTotal 25,0 ul

O tubo 1 é um controle interno para verificar a qualidade do DNA vegetal. Os tubos 2, 3 e 4 são para verificar a presença de transgênico, pois amplificam regiões regulatórias comuns aos transgênicos em uso. Outros três controles são agregados durante a PCR: DNA proveniente de grãos não transgênicos (controle negativo), ausência de DNA (controle negativo para verificar contaminação durante a manipulação da amostra) e DNA grãos contendo 0,1% de transgênicos (controle positivo).

35S promoter EPSPS CP4EPSPS CP4 NOS terminator

CaMV Agrobacterium tumefaciensDiagrama representando a sequência RoundupReady®

Método dirigido para detectarpromotor 35S e terminador NOS

(INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)

Reação de amplificação em termociclador MJR PTC-100

Desnaturação inicial: 96°C 2 minDesnaturação: 94°C 1 minAnelamento: 62°C 45 segExtensão: 72°C 45 segExtensão final: 72°C 45 segNúmero de ciclos: 35A interpretação dos resultados é efetuada através da verificação da presença de fragmentos de DNA nas amostras, observada após a eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TBE, com o mesmo tamanho do fragmento observado no controle positivo e ausente nos controles negativos. Para uma amostra ser considerada positiva, os três pares de primers que detectam OGMs deverão resultar em amplificações semelhantes ao controle positivo.

PCR QuantitativoPCR Quantitativo

Métodos :1. PCR convencional (semi-quantitativo a quantitativos)2. Método de PCR CompetitivoMétodo de PCR Competitivo3. PCR Quantitativo Tempo-Real3. PCR Quantitativo Tempo-Real

• Determina a percentagem de OGM no alimento

Coding region 3’5’ TerminatorPromoter

• ex. determinar a concentração de soja GM (35S-CP4 EPSPS) em grãos.

35SF

R

NOS

PCR convencional

PCR QUANTITATIVO CONVENCIONAL

As concentrações dos produtos presentes no ponto A (PONTO FINAL) determinados por densitometria após eletroforese em gel de agarose e são grafados em função da percentagem de OGMs presentes na amostra inicial.

O resultado demonstra que a proporcionalidade entre a concentração de DNA e os produtos de PCR (faixa dinâmica) é limitada no PCR convencional.

13. Soja RR + controle externo14. Soja RR + controle externo

Exemplo de determinação quantitativa da concentraçãode OGM por PCR convencional

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314

16 1718 19 2021 22 23

1. Padrão de peso molecular2. 5% soja RR3. 2% soja RR4. 1% soja RR5. 0,5% soja RR6. 0,1% soja RR7. Soja não-transgênica8. Soja não-transgênica 9. Controle sem DNA10. Amostra OGM11. Amostra OGM12 . 100% soja RR

Exemplo de determinação quantitativa da concentraçãode OGM por PCR convencional

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314

15 16 17181920 21 22

15. Padrão de peso molecular16. Amostra + controle externo17. soja RR + Controle interno(ubiq) 18. Amostra + Controle interno(ubiq) 19. Amostra + Controle interno(ubiq)20. Soja não-transgênica +

Controle interno(ubiq)

Processamento posterior das bandas coradas

1. Determinar a intensidade das bandas por densitometria2. Utilizar os padrões normalizados contra a referência

interna para construir curva padrão3. Determinar as concentrações das amostras desconhecidas utilizando a curva padrão.

Duração 1-2 dias

Ciclagem TérmicaPCR Semi-quantitativo “ traditional” ou

“Convencional” • Amplificação Quantitativa de genes alvo• Dificuldades:

– Grande esforço para estabelecer condições ótimas de reação (concentrações de DNA alvo e primers)

– Difícil de reproduzir, mas não impossível!!!! – Difícil desenhar um controle interno (escolher gene

conservado ubíquoto tipo pirofosfatase, lectina, zeina, ubiquitina, etc.) mas não impossível!!!!

– Problemas de especificidade de primers – Necessário realizar eletroforese dos produtos de

amplificação e todo processamento posterior (densitometria, etc.)

– Difícil de conseguir alta produtividade

PCR QuantitativoPCR Quantitativo• Normaliza um marcador de OGM (ex. 35S) a um gene de

referência específico da planta (ex. Lectina).• Combina 2 reações de quantificação absoluta; mede a

concentração de DNA da amostra e permite– Determinar o número de cópias/genoma de ambos os genes

(transgene e referência)– Determinar = % de OGM’s na amostra.

• PCR Multiplex– Ambos pares de primers na mesma reação– Razão entre número de cópias do genoma GM/número de

cópias total do genoma

Método de PCR CompetitivoMétodo de PCR Competitivo• Co-amplificação da sequência alvo (transgene) e do

padrão interno (ex. lectina para soja; zeina para milho) – Gene alvo específico de concentração desconhecida e molde

controle de concentração conhecida. (1%)• Uso preferencial dos mesmos primers que amplificam

sequências de 2 tamanhos diferentes.

• Duplo QC-PCR usa 2 reações diferentes– GM alvo e gene específico

• ex. gene da lectina (lel) em soja para RRS

– Concentração do gene competidor equivalente a 1% da soja geneticamente modificada (+/-)

QC-PCRQC-PCR

Adapted from Hübner et al., 1999

PCR EM TEMPO REAL

• Detecção em tempo Real dos produtos de amplificação de DNA alvo (gene) pela reação em cadeia da DNA polimerase.

• PCR em tempo Real (Real-Time PCR) usa fluorescência o que permite a medida direta e a quantificação dos produtos da reação amplificação.

• Permite a quantificação precisa e reproduzível dos ácidos nuclêicos.(DNA e RNA)

• Vantagens do PCR em Tempo Real

– Ampla faixa dinâmica de detecção (faixa de sensibilidade)

– Química em tubos fechado• Dispensa electroforese• Dispensa processamento posterior dos produtos

de PCR (gel, coloração, hibridização, densitometria, autoradiografia, etc.)

– Alta produtividade de análises• Utiliza placas de micropoços (microwell plate) de 96

poços

PCR em Tempo RealAplicações: • Determinação de Transgênicos

(OGMs)• Expressão gênica• Quantificação de Cancer• Detecção de dano do DNA • Controle Qualidade• Quantificação de Patógenos• Entre outras.

Etapas do PCR em Tempo Real

Preparo da amostra

TermoCiclagem

Detecção da Fluorescência

Único Instrumento

Detecção de curvas de PCR tempo Real

Análise dos Dados

AnálisesGerais

Análises de AplicaçõesEspecíficas

Preparo da amostra

• Purificar DNA– Purificado

• Vários métodos

– Kit PrepMan Ultra Applied Biosystems

35S promoter EPSPS CP4EPSPS CP4 NOS terminatorCaMV Agrobacterium tumefaciens

DNAdupla fita

Ciclagem Térmica

Preparo da amostra

TermoCiclagem


único instrumento


Análise dos Dados

AnálisesGeral


Ciclagem Térmica

• 2 “Químicas”

– Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease, Sondas Taqman • Vantagem: a especificidade é garantida pela

sonda Taqman

– SYBR ligante de DNA dupla fita

Todos dsDNA produtos são detectados necessário realizar análise de dissociação (Tm)

Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease

• Sonda Fluorescente Taqman– Única para cada gen alvo

– Anela entre os 2 primers a 10°C acima dos primers

• Aumenta a especificidade da reação

• Aplicações:– Quantificação de OGM’s

– Detecção de polimorfismo

– Quantificação de ácidos nuclêicos por PCR Tempo Real

Fluorescent Resonant Energy TransferFluorescent Resonant Energy Transfer

Ciclagem Térmica Taqman usa FRET

Estrutura das sondas Taqman

Sonda(não fluoresce)

Reporter (FAM,VIC)

Quencher (Tamra)

R Q

R

Q

R Q

Clivada

Fluoresce

(5’ Nuclease)

Taq polimerase

Atividade 5 nuclease da Taq polimerase

5’ nuclease5’ nucleasepolimerasepolimerase

• Atividade associada à polimerização

5’ 3’

5’3’

dNTPs


Polimerização

Deslocamento

5’primer

Taq

3’ 5’

QR

5’

5’3’

R

Q

Não fluoresce

Não fluoresce


Clivagem

Polimerização Completada

R

Q

QR

Fluoresce

Fluoresce

SYBR corante para fita dupla de DNA

• SYBR® green 1 DYE– SYBR fluoresce ao se

ligar ao DNA dupla fita– Qualquer DNA dupla fita

NON-specific

– Usado para ensaios de identificação de genes alvo (screening)

– Baixo custo

– Problema: dimeros dos primers ou produtos de PCR não-específicos também fluorescem.

Sequência alvo DNA

Desnaturação

SYBRGreenCorante para fita dupla de DNA

SYBRGreenCorante para fita dupla de DNA

Polimerização Completa

Polimerização

Ciclagem térmica• Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.C)

50.0

2:00

0:1595.095.0

15:00

1:0060.0

UNG

ativação daTaq Gold

1x1x

40x

Perfile de Dissociação

entre 60 to 95C°0.5C°/cicle

SYBR GREEN

72

Um único Instrumento

Preparo da amostra

TermoCiclagem


Único instrumento


Análise dos Dados

AnálisesGerais


Único Instrumento

• Mecanismos de detecção e instrumentos diferem dependendo do fabricante.

• Instrumento mais vendido e usado.– Applied Biosystems

• CEPPA

• Outros Fabricantes de Termocicladores Tempo Real– Biorad (similar ao AB)

– Westburg

ABI 7000/7700

Detecção Fluorescente

Preparo daamostra

Ciclagem térmica


Análises deaplicaçõesespecíficas

Único instrumento

Real time detection of PCR curves


Filter Wheel

CCDCamera

Lâmpada

Excitation Filter

96-Well PlatePeltier-based block thermal cycling system

Multi-Element

Lens

DichroicMirrorFresnel Lens

Well Lenses

Fold Mirror

Análise dos Dados

In single instrument

Real time detection of PCR curves

AnáliseGeral

AnálisesEspecíficas

Preparo daamostra

Ciclagem térmica


Análises dosdados

Desenho Experimental

• Mistura de reação:– Universal master mix (taqman or SYBR green)

• Tampão de PCR + dNTPs• Amplitaq Gold polimerase• UNG (evita contaminação, não necessário)• ROX reporter = referência fluorescente interna

• Primers F (senso) e R (antisenso) do gene alvo• Primers F (senso) e R (antisenso) do controle interno

– Sonda Taqman – Volume Total (25 ou 50 µl/reação)

• Pipetar mistura para os micropoços (Amostra em triplicata)

• Adicionar DNA (5 µl)• Centrifugar a placa para eliminar bolhas de ar

Desenho Experimental

Definir distribuição das amostras na placa

• Serão:– 6 concentrações de amostras padrão =18 poços– Controle positivo = 2 poços– Controle negativo = 2 poços– 37 Amostras desconhecidas (2X) = 74 poços

• Custo dos reagentes @ R$ 4000,00

PCR terminado, Análise dos Dados

• ABI prism coleta dados primários em 4 filtros• A Fluorescência dos corantes é calculada usando

um algorítmo multicomponente.• Reporteres são normalizados contra a referencia

interna o fluoróforo ROX• Correções da linha de base• Curva de dissociação (SYBR green 1)

• Resultados dependente da aplicação– Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar (Cycle

Threshold)– Medidas de Ponto Final

Espectros brutos

A B C D

FAM/SYBR VIC/JOE TAMRA/NED ROX

Dados coletados no final de cada ciclo.

• Algoritmo calcula automaticamente a contribuição de cada fluoróforo.

Referência Fluorescente Rox• ROX é uma referênca fluorescente passiva

presente no tampão. Sinais dos Reporteres são normalizados contra ROX para eliminar variações operacionais

• Níveis de Fluorescência são diferentes no meio e laterais da placa– Diferenças ópticas nos plásticos das placas– Erros de pipetagem

Amostra1FAM

ROX

ROX

FAM

Amostra2

FLU

OR

ES

CE

NC

IA

FLU

OR

ES

CE

NC

IA

Gráfico das Fluorescências da Amplificação Normalizado

Sinal do ReporterRn =

ROX

Sinal normalizado do reporter (FAM) contra ROX

Rn

Número do ciclo

Correção da linha de base

Reporter signalnRn =

ROXn

Reporter signal6-16

ROX6-16

Rn

Cycle number

Sinal do reporter normalizado e linha de base corrigida

Linha de baseCicle 3-14

Todos os dados começam no 0

Curva de dissociação• Immediatamente depois do PCR, aumenar a Temperatura de

60 a 95 °C

• Produtos do DNA (amplicons) irão desnaturar.

• Fluorescência do SYBR green cairá durante a desnaturação

SYBR® fluorescência

SYBR® dissociados dsDNA

Temperatura

Flu

ore

scên

cia

Curva de Dissociação

• Primeira derivada dos dados brutos

• Pico = Tm do amplicon

• Segundo pico observado na temperatura menos indica:

• Dimeros dos primers

• Amplificação não específica.

PCR completado, Análise dos Dados

• ABI prism coleta dados primários em 4 filtros

• A Fluorescencia dos corantes é calculada usando um algorítmo multicomponente.

• Reporteres são normalizados contra a referência interna o fluoróforo ROX

• Correções da linha de base

• Curva de dissociação (SYBR green 1)

• Resultados dependente da aplicação– Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar

(Cycle Threshold)– Medidas de Ponto Final

Ciclo limiar (Cycle Threshold)

• Ciclo limiar Ct– Número de ciclos de

amplificação necessário para a fluorescência ultrapassar o limiar (fluorescência mínima)

– O Liminar (Threshold) é determinado na fase exponencial: o meio da parte linear quando a fluorescência é grafada logaritmicamente

–

threshold

threshold

exponential

exponential

Faixa Dinâmica e curva padrão

Amplificação de diluiçõesseriadas de amostra padrão

Curva padrão mostrando unidades 8 logs da faixa dinâmica linear

Quantificação absoluta

• Resultados de amplificação do DNA de amostras de concentrações conhecidas como curva padrão: Ct versus concentração

• Calcular a concentração da amostra desconhecida com a curva padrão.

• A inclinação da curva padrão dá informação sobre a eficiência do PCR. 100% eficiência inclinação (tg) = -3.33

• Correlação R da indicação da reproducibilidade da pipetagem e deve ser 0.99≥

Inclinação= -3.33R 0.99≥

PCR em tempo real

A concentração dos produtos é determinadacontinuamente por medidas de fluorescência.

Na reação de PCR em tempo real (RT-PCR) a amplificação é proporcional ao número do ciclo durante a fase exponencial do PCR. Em contraste com o PCR convencional existe uma relação linear entre a concentração dos produtos de PCR e a concentração de DNA durante a fase exponencial do RT-PCR.

Determinar ponto de amostra conhecida que é o mesmo e referencia-lo a fragmento GM desconhecido.

Resumo dos métodos de detecção de Resumo dos métodos de detecção de produtos de OGMsprodutos de OGMs

Ahmed, 2002

Teste em CampoLaboratórios de análisede rotinaCEPPA

PesquisaEmpregado principalmente em:

SimSimNãoApropriado para teste de campo?

Não SimNão Fornece resultadosQuantitativos?

2,005,00150,00Custo/amostra (US$)

10 min30-90 min2 dias Duração

AltaAltaAlta Sensibilidade

nãoSimSim Necessita equipamentospecial

Simples Moderada DificilFacilidade de uso

Imunocromatográfico (tiras)

ELISAWestern blot

Baseados na ProteinaParâmetro

Resumo dos métodos de detecção de Resumo dos métodos de detecção de produtos de OGMsprodutos de OGMs

Ahmed, 2002

Laboratórios de análisede rotinaCEPPA

Laboratórios de análisede rotina

Laboratórios de análisede rotinaCEPPA

PesquisaEmpregado principalmente em:

NãoNãoNãoNãoApropriado para teste de campo?

simSimNãoNãoFornece resultadosQuantitativos?

450,00350,00250,00150,00Custo/amostra (US$)

1 dia2 dias1,5 dias6 horasDuração

AltaAltaMuito AltaModeradaSensibilidade

SimSimSimSimNecessita equipamentospecial

DificilDificilDificilDificilFacilidade de uso

PCR emTempo Real

-PCR Competitivo

PCRQualitativoSouthern blot

Baseados no DNAParametro

Outros métodos em desenvolvimento

1. Espectrometria de infra vermelho próximo (NIR)2. Microarranjos de DNA - DNA chips

Agradecimentos

CEPPA:Ariene Costa Prado Yoshiyasu Fabiana Nicol Barbieri Arion Zandoná Filhos

Mundo:Darcy PawlikFarid E. AhmedB. Leyman

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Detection Technology for Genetically Modified Crops for Human C