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SIMONY DAVET MÜLLER "DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE". ITAJAÍ - 2006

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SIMONY DAVET MÜLLER

"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE

EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".

ITAJAÍ - 2006

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE EDUCAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E

FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE EXTRATOS DE Passiflora alata

CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí

como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

SIMONY DAVET MÜLLER

Itajaí, Fevereiro 2006.

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"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE

EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".

Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.

____________________________________ Maique Weber Biavatti, Dra

Orientadora

__________________________________________________________ Tania Mari Bellé Bresolin, Dra

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Banca Examinadora:

______________________________________ Maique Weber Biavatti, Dra

Presidente

______________________________________

Tania Mari Bellé Bresolin, Dra

______________________________________ Cid Aimbiré de Moraes Santos, Dr.

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DEDICATÓRIA

Ao José Luis e ao nosso bebê, pelo amor, incentivo e paciência.

A Deus.

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AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Dra Maique Weber Biavatti pela dedicação e confiança

que depositou em mim ao longo destes anos.

Aos professores Dr. Valdir Cechinel Filho, Dr. Cid A. M. Santos e Dr.

Franco Della Monache pela disponibilidade de alguns padrões.

Ao Prof. MSc Renê Artur Ferreira pela coleta da Passiflora alata no

Campus de Ilhota SC.

Ao Prof. Dr. Armando Cervi pela identificação e registro da planta.

Agradeço as bolsistas Michelly e Sônia do Programa Integrado de Pós

Graduação e Graduação (PIPG) pelo esforço e dedicação.

Ao LAPAM, em especial Luciana e Roberta, pelo incentivo, compreensão,

amizade e auxílio no desenvolvimento deste trabalho.

Ao meu marido José Luis pelo amor e compreensão.

A minha mãe, minha irmã SabrinA minAgm m 0 Td(r)Tuj13.44 0 Td(r)T6.59998 0 Td(o048 Tc(ã )Tj12.24 0 Td(S)Tj7.92096 Tc0 8 0 Td(i)Tj2.63999 0 Td(oTd(g)Tj6)Tj13.O4 0 Td(l)Tj2.63.036 Tc2.94 Tw(da)Tj13.44 024 Tc21.32 Tw(, )Tj8.03999 0 Td 0 Td-0.03n)Tj6.680.16 0 Tdj3.95996 0 Td(a)T(r)Tj3.96001 0 Td Tm(A)Tj8 Td(r)Tj3.959919.2 0 Td(Tj16.56 0 Td0.048 Tc(o.144 Tw99 0 Td(c)Tj6 0 Td(a)Tj6.72 0 Td( Td(t)Tj3.35996 0 Td(a)Tj6.6 0 Td0.026.72 0 Td(. Tm(A)Tj8.03999 0n)Tj 2.52 463.6560 10 m10 7920 l6120e7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 85.12 401.616 Tm(a)Tj6.72 0 Td(m)Tj10.0339 0 Td0.0Tj6 0 Td(e)Tj6.72002 0 Td(n)Tj6.59995 0 Td7998 0 Td(.144 Tw(o de)Tj23.4 0 Td(s)Tj6 0Tj6 0 Td(e)Tj6.7Tj2.63999 0 Td(v)Tj5.87998 0 Tdda)Tj13.4 7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 406.12 380.856 Tm3.024 Tw( )TjET Q139 Tj339 0 Td0.20 l6120 7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 121.12 360.216 Tm0.036 Tc2.148 Tw(A )Tj13680.024 Tw(o )Tj10.08 0 Td(P)Tj8.03998 0 Td(e)Tj6.72 0 Td-0.072 Tc0.096 Tw(u )Tj9.95999 0 Td(m)Tj9.95999 0 Td(q6.72 0 Td-0.07998 0 Tdu.072 Tc0.096 Tw(n)Tj6.72 0 Tdw(A )Tj13.56 0 Td(63999 0 Td(e)pj3.3d(a)Tj6.58 Tc(pe)Tj13.44 0 Td(l)Tj2.630.048 Tc(qu144 Tw99 0 Td(c)Tj5.87998 0 Td(o)Tj6l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 252.04 422.256 Tm-0.024 Tc1.368 Tw(l1999 3680.024 Twjdo )Tj16.8 0 Td(J)Tj6 0 Td(o)Tj6á72 0 Td(l)Tj2.63999 0 Td(e)uTj6.72 0 Td(r)Tj3.83999 0 Td(een)Tj20.16 0 Td(s)Tj5.72 0 Tdw(A )Tj13.56 0 Td(m.084 Tc-0.18 Tw(.024 Tc0 Tw(. )T63999 0 Tdua)Tj6.72 0 Td(r))Tj5.87998 0 Td0.048 Tc-0.144 Tw48 TcTj3.35996 0 TdTjET QQq10 10 (P)Tj8.03999 0 Td(r)Tj6.59998 0 Td(ue de)Tj30.24 0 )Tj7.32 0 Td(F)Tj59998 0 Td(e)Tj6.72 0 Td(l))Tj10.08 0 Td(i)Tj2.633999 0 Td(den)Tj35999 Td(a)TT3.959496001 0 Tdj3.95996 0 Td(a)2 0 Td(n)Tj2.63999 6 0 Td(a)TTj13.2 0 Td(d)Tj7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 420.16 546.456 Tm3.024 Tw( )TjET Q490.03680.024 Tw20 l6120 7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 121.12 360.216 Tm0.036 Tc2.148 Tw(A )Tj1298 0 Td(m)04 Tw(s )Tj12.24 0 Td(p)Tj6.7259460 Td(o)Tj6.9998 0 Td44 0 c-0.18 Tw(m m)Tj23.4 0 Td(Tc0.024 Tw(s )To)Tj6.9998 0 Td2.63999 0 Td(z)Tj5.87998 0 Td0.048 Tc-0.144 Tw(s)Tj5.87998 0 Td Td(p)Tj6.7259340 Td(o)Tj6.99 0 Td(r)(. )Tj6.72 0 Td(ATj6.72 0 Td0.024 Tc(tt)Tj6.72 0(t)Tj3.35999 0 Td(j5.87998 0 Tdda)Tj13.7Tj13.44 0 Td14.44 0 Td(da)Tj13.4R)Tj12.96 0 Td((s )Tj12.48 0 Td(M)Tj9.998 0 Tdda)Tj13.4 0 Td14.44 0 Td 7920 (s )Tj12.24 0 m10 7920 l6120 7920 72 0 Td0.0 0 Td14.44 0 Td 04 Tw(s )Tj12.24 )Tj10.08 0 Td(i)TTj13.44 024 Tc21.32 Tw(,d(c)Tj5.87998 0 Td(o9.35999 0 Td(p)Ta)Tj13.4 0 Td14.44 0 Td Tj2.63999 0 Td(q)Tj6.599-0.144 Tw(a a)Tj16.68 0 Td(do )Tj16.8 0 Td(J)Tj6 07Tj03999 0n)o)Tj63599 0 Td(D04 Tw(s )Tj12.24 Tj2.63999 0 Td-0.036 Tc.63994 0 Td(a a)Tj16.68 0 Td6 07Tj6 Tw(e )Tj139998 0 Td999 0 Td-0.072 Tc0.096 Tw(o a)Tj16.-0.12 Tc3.264 120 7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 85.12 505.056 Tm(C)Tj8.63999 0 Td(a)Tj6277Tj0399m.63999 0 Td(e)Tj6.59998 0 Td)Tj6.72 0 Td0.024 Tw(s )Tj9.359948 Tc-0.144 Tw(do )Tj16.68 0 Td(C)Tj8.27998 0 Td-0.12 T(m)Tj10.08 0 Td0.048 Tc(ã )Tj12.243.35999 0 Td(a)Tj6.59998 0 Td6 Tc0.06 Tw(r )Tj7.328 0 Td(D)Tj8.639994 0 Td-0.144 TwTj5.87998 0 Td(í))Tj5.87998 0 Td0.048 Tc-0.144 Tw(ade e)Tj30.12 0 Td0.024 Tw( )Tj3.35999 0 Td(a)Tj6.598 Tc(pe)Tj13 cj2.6312.48 0 Td(M)Tj9.998 0 Td(n)Tj6.72 0 Tdw(A )Tj13.56 0 Td(m)Tj10.16.68 0 Td(C)Tj8.27ET QQq10 10 m 7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 202.48 505.056 Tm3.144 Tw( )TjET Q8 Td(277Tj0399m.20 l6120 7920 l6120 10 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R47 12 Tf1 0 0 1 121.12 360.216 Tm0.036 Tc2.148 Tw(A )Tj1256998 0 Td(r)Tj3.95999 0 Td Td(p)Tj6.7259340 Td(o)Tj6.99 0 Td(r)2.63999 0 Td(z)Tj5.87998 0 Td0.048 Tc-0.144 Tw(s)Tj5.87998 0 Td Td(p)Tj6.72(o)Tj6.99 0 Td(r(C)Tj8.2dET QQq10 10 m8 TcTj)Tj6.99 0 Td(r)Tj2.63999 0 Td0 87998 0 Tdb.072 Tc0.096 Tw(a )Tj9.95999 0 T)2.63999 0 Td(z(aba)Tj20.16 0 Tdó)Tj9.998 0 Td(n)Tj6.72 0 Tdw(A )Tj13.56 0 Td(mTj5.87998 0 Tdd8 TcTj)Tj6.99 0 Td(r(J)Tj6 07T 0 Td(nde)Tj6.4j6)Tj13.7.92 0 Td(e)TjM)Tj9.998 0 Td(n)Tj6.87998 0 Tde o

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Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE EXTRATOS DE Passiflora

alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".

Simony Davet Müller Fevereiro2006

Orientadora: Maique Weber Biavatti, Dra Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas Palavras-chave: Passiflora, flavonóides, controle de qualidade, alcalóides, CLAE Número de Páginas: 86.

As folhas de Passiflora alata Curtis, (espécie oficial da Farmacopéia Brasileira) são utilizadas como medicamento contra ansiedade, como antiespasmódico e sedativo. O desenvolvimento de metodologias analíticas para análise de flavonóides e alcalóides em espécies de Passiflora é de suma importância, para o controle de qualidade da planta e extratos fitomedicinais derivados. O estudo sobre perfil de flavonóides e alcalóides em folhas e extrato fluido de P. alata contendo isovitexina foi realizado através de CLAE, comparando seus perfis cromatográficos com extrato fluido de P. incarnata comercial e tintura de P. actinia. Adicionalmente, a concentração total de flavonóides em extratos e folhas foi realizada através de doseamentos Farmacopéicos. O extrato de P. alata foi produzido de acordo com a Farmacopéia Helvetica (1987), de P. incarnata foi obtido comercialmente e de P. actinia de acordo com a Farmacopéia Brasileira (1926). Na análise dos flavonóides em CLAE verificou-se presença de isovitexina em P. alata: no extrato farmacopéico coletado em janeiro e agosto/2001 (0,018 e 0,007% m/m) e no extrato sob refluxo coletado em janeiro e agosto/2001 (1,137 e 0,018% m/m); em P. actinia: no extrato farmacopeico (0,028% m/m) e no extrato sob refluxo (0,631% m/m) e no extrato comercial de P. incarnata (1,198% m/m) sendo o flavonóide majoritário. A vitexina foi encontrada em P. alata (traços), P. incarnata (0,312% m/m) e ausência dos outros flavonóides marcadores testados: orientina, swertisina, hirerosídeo e rutina. O método desenvolvido em CLAE demonstrou ser adequado e diferenciou as espécies estudadas podendo ser aplicado à amostras comerciais. As análises espectrofotométricas baseadas em metodologias Farmacopéicas para P. incarnata, mostraram resultados diferentes em relação ao flavonóide quantificado isovitexina. Sendo que a metodologia da Farmacopéia Britânica apresentou melhor resultado. Não foi detectada a presença de alcalóides β-carbolínicos clássicos testados (harmana, harmina, harmol, harmalol e harmalina) nos extratos e folhas de P. alata .

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Abstract of Dissertation (Thesis) presented to UNIVALI as a partial fulfillment of the requirements

for the degree of Master in Pharmaceutical Sciences

LC AND UV DETERMINATION OF ALCALOID AND FLAVONOID Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae

EXTRACTS

Simony Davet Müller Fev/2006

Advisor: Maique Weber Biavatti, Dra. Area of Concentration: Natural Products. Keywords: Passiflora, flavonoids, quality control, alkaloids, HPLC Number of Pages: 86.

Leaves of Passiflora alata Curtis (official species in the Brazilian Pharmacopoeia) are employed for anxiety, as antispasmodic and sedative. The development of new analytical methodologies for the analysis of flavonoids and alkaloids in Passiflora species are needed in order to improve the quality assurance of the plant and derived extract and phytomedicines. A survey on the flavonoids and alkaloids profile and content of isovitexin in leaves and fluid extract of P. alata through LC was made, comparing its chromatographical profiles with a commercial P. incarnata fluidextract and P. actinia tincture. Additionally, the concentration of the total flavonoids of extracts and leaves according to phamarcopoeial photometrical method was determined. The fluidextract of P. alata was produced in accordance with the Pharmacopoeia Helvetica, tincture of P. actinia as produced in accordance to the Brazilian Pharmacopoeia method. The presence of isovitexin in the species (which have distinct chromatographic profiles) was evidenced, which is the major flavonoid compound in the P. incarnata comercial extract (1.198% w/w), but not in P. alata (0.018 summer e 0.007 winter % w/w) fluidextract and leaves (1.137 e 0.018% w/w) P. actinia (0.028 extract and leaves 0.631% w/w). Just traces of vitexin could be observed in the P. alata and P. incarnata (0.312% w/w) and absence of the other tested flavonoids orientin, swertisin, hyperoside and rutin. The LC developed method demonstrated to be adjusted for the qualitative and quantitative analyses and to differentiate species, appropriate to be applied to commercial sample analysis. The flavonoids spectrophotometrical results of three different methods described to P. incarnata were not comparable, the most suitable performance was verified to the British Pharmacopoeia method. None of the classical beta-carbolinic alkaloids tested were found in the P. alata leaves and medicinal extracts: harmane, harmine, harmol, harmalol, harmaline.

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO......................................................................................... 1

2 OBJETIVOS............................................................................................. 5

2.1 Objetivo Geral.......................................................................................... 5

2.2 Objetivos Especificos............................................................................... 5

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................... 6

3.1 Gênero Passiflora..................................................................................... 6

3.1.1 Considerações botânicas......................................................................... 6

3.1.2 Considerações químicas......................................................................... 10

3.2 Controle de Qualidade de Passiflora........................................................ 15

3.3 Considerações Farmacológicas............................................................... 18

4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 23

4.1 Material Botânico...................................................................................... 23

4.2 Padrões e Solventes................................................................................ 23

4.3 Métodos para Obtenção de Extratos........................................................ 24

4.3.1 Pesquisa de alcalóides e flavonóides ................................................... 24

4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides....... 25

4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides......... 26

4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides................................ 26

4.4.

4.3.4

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Tm(4)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 d(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22.08 0 Td(2 0 Td(.)Tj 9.9643993999 0 Td()Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22 710.8191cm 2 Tf....)TjET QQ lhW nq 1Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.7510.8005 lhET QQq5078.8 7920 m5302 7920 l5302 10.8005 l5078. 0 Td209 Td999 0..63)TjET QQ lhW nq 1Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.7510.8005 lhET QQq5078.8 7920 m5302 7920 l5302 10.8005 l5078.8 10.8191cm 2 Tf0 0 0 10 0 0 30.8005 l1207.6 10.8005 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R76 9.96 Tf1 0 0 1 241.36 512.756 Tm(P)Tj6.59998 0 Td(a)Tj5.52 0 Td191cm 2 Tf....)TjET QQ lhW nq 1T/R75 9.96 Tf1 0 0 1 98.92 422.876 Tm2.87112 Tw( )TR75 9.96 Tf1 0 09 0 Td-0.01776 Tc(do)Tj11.04 0 Td0.06 T174.59999 0 Td(f)Tj2.87998 0 Td(l)Tj2.159995(s )Tj7.79998 0 Td-0.01776 Tc(Tj2.75999 0 Td(a)Tj5.63999 0 Td(l)Tj2.15999 0 Td(c)Tj5.03999 0 Td(a)Tj5.63999 0 Td(l)Tj2.15999 0 Td(ó)Tj5.52 0 Td(i174.59999 0....)TjET QQ lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 405.716 Tm(4)Tj52.87998 0 Td(....4d0.10224 T998 3...4d0.10224 T998174.59999 0 T/R75 9.96 Tf1 0 5.12 333.236 Tm..)TjET QQq12078.8 10.8005 l1l1207.6 10 05j5.52 0 Td(.)TjET QQq812.8 7920 m1207.6 7920 l1207.6 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 101.68 333.236 Tm c 516.04 405.716 Tm0 Td(.....)Tj1..)TjET QQq1207.6 7920 m5078.8Qq812.8 7920 m1207.6 7920 l128 7920248 3.W n1..)TjET QQq1207.5078.81207.6 10. 812.8 7920 m1207.6 7920 l1207.6 10.8005 lhW nq 1 e0 0 0 cm BT/R75 .80Td-020 l120112 Tw( )TjET QQq812.8 7920 m1R71 0 0 1 530.d05 lhW nq 10 lhW nq 1 7920 l5078.8 10.8005 l1207.6 10.80m0.8005 lhW nq 1 207.6 10.8005 lhW8.8 10.8005 l12005 l1207.6 10.80mt7920 l5078.8 10.8QQq5078.8 7920 m5302 7920 l530005 l1207.6 10.80m nq 10 0 0 10 .12 371.156 Tm(4)Tj5.52 05 lh48005 lhW T/R75 9)TjET QQq1207.6 7920 m5078.8 7920 l5078.8 10L75 920 m5078.9 0 4/R75 9)(AE cm BT 0 10 0q 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 107.2 388.436 T d(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22.08 0 Td(2 0 Td(.)Tj 9.9643993999 0 Td()Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22 906 T174.59999 0....)TjET QQ lhW nq 1Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.7510.8005 lhET QQq5078.8 7920 m5302 7920 l5302 10.8005 l5078.8 10.8174.59999 00 0 0 10 0 0 32Q lhW nq 1Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.7510.8005 lhET QQq5078.8 7920 m5302 7920 l5302 10.8005 l5078. 0 Td174.59999 0....)TjET QQ lhW nq 1T/R75 9.96 Tf1 0 0 1 98.92 422.876 Tm2.87112 Tw( )TR75 9.96 Tf1 0 09 0 Td-0.01776 Tc(do)Tj11.04 0 Td0.06 T157.3.15999 Td(f)Tj2.87998 0 Td(l)Tj2.159995(s )Tj7.79998 0 Td-0.01776 Tc(5Q lhW nq 1T/R75 9.96 Tf1 0 0 1 98.92 422.876 Tm2.87112 Tw( )TR75 9.96 Tf1 0 09 0 Td-0.01776 Tc(do)Tj11.04 0 Td Td(i157.3.15999....)TjET QQ lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 405.716 Tm(4)Tj52.87998 0 Td(....4d0.10224 T998 3...4d0.10224 T998157.3.15999 T/R75 9.96 Tf1 0 5.12 333.236 Tm..)TjET QQq12078.8 10.8005 l1l1207.6 10 05j5.52 0 Td(.)TjET QQq812.8 7920 m1207.6 7920 l1207.6 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 101.68 333.236 Tm c 516.04 405.716 Tm0 Td(.....)Tj1..)TjET QQq1207.6 7920 m5078.8Qq812.8 7920 m1207.6 7920 l128 7920248 3.W n1..)TjET QQq1207.5078.81207.6 10. 812.8 7920 m1207.6 7920 l1207.6 10.8005 lhW nq 1 e0 0 0 cm BT/R75 .80Td-020 l120112 Tw( )TjET QQq812.8 7920 m1R71 0 0 1 530.d05 lhW nq 10 lhW nq 1 7920 l5078.8 10.8.08 440.156 Tm2.87005 l1207.6 10.80mt7920 l.8 7920 m1207.6 7920 l12070 m5302 7920 l530005 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 405.716 Tm(4)Tj52.87998 0 Td(....4d0.10224 T998 3...4d0.10220 Td(s157.3.15999l1207.6 10 5078.8 10.80na 05 lhW nq 10 lT/R75 9)TjET QQq1207.6 7920 m5078.8 7920 l5078.8 10L75 920 m5078./Aq 10 0 0 10 0 R75 9.96 Tf1 0 0 9 0 Td(3)Tj5.57.6 10.8005 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 107.2 405.71d(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22.08 0 Td(2 0 Td(.)Tj 9.9643993999 0 Td()Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22 710.8157.3.15999....)TjET QQ lhW nq 1Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.7510.8005 lhET QQq5078.8 7920 m5302 7920 l5302 10.8005 l5078.8 10.8157.3.15999l1207.6 10 (3x)Tj5.03999 0 Td(t)Tj2.75999 0 Td(r)Tj3.35999 0 Td(a)Tj5.52 0 Td(t)Tj2.75999 0 Td(o)Tj5.52 0 Td(s)Tj5.03999 0 Td-0157.3.15999....)TjET QQ lhW nq 1T/R75 9.96 Tf1 0 0 1 98.92 422.876 Tm2.87112 Tw( )TR75 9.96 Tf1 0 09 0 Td-0.01776 Tc(do)Tj11.04 0 Td0.06 T140 Td999 0 Td(f)Tj2.87998 0 Td(l)Tj2.159995(s )Tj7.79998 0 Td-0.01776 Tc(6Q lhW nq 1T/R75 9.96 Tf1 0 0 1 98.92 422.876 Tm2.87112 Tw( )TR75 9.96 Tf1 0 09 0 Td-0.01776 Tc(do)Tj11.04 0 Td Td(i140 Td999 0....)TjET QQ lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 405.716 Tm(4)Tj52.87998 0 Td(....4d0.10224 T998 3...4d0.10224 T9981 9069999 0 T/R75 9.96 Tf1 0005 l1207.6 10.8005 lhW nq ( )TjET QQq5078Tf1 0 0 1 124.6 37l5302 10.8005 l5078.8 10.8005 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm 0 10)Tj0 Td(....)TjET QQq1207720 l1207.6 10.80Td-020 l1207.6 10.8000 0 10 0 0 cm B36 720 l1207.6 10 10 0.87998 0 Td(....)TjET QQq1207á.6 10.8000 0 1 7920 l5078.8 10.8005 l1207.6 10.80m BT/R75 9.96 Tf1 8.8 7920 m5302 792005 l812.8 10.8005 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 85.1m BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 438.p )TjET QQq5078.....

15

4 ....4d0.10224 T998 3...4d0.1022080.8001 9069999 0 -Q lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 405.716 Tm(4)Tj52.87998 0 Td(....4d0.10224 T998 3...4d0.102238420 1 9069999 0 05 l5078.8 10.8005 lhW nq 10 0 9.96 Tf1 0 0 1 85W nq 10 0 0 b75 9.96 Tf1 0 080 10 0 33.236 Tm cl812.8 10.3.W n1 nq 10 0 Td-0.017Tf1 0 0 1 62 10.8005 l50740Tf1 0 08720 l19.97207.6 10.8005 lhW nq 1 .d(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22.08 0 Td(2 0 Td(.)Tj 9.9643993999 0 Td()Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22.08001 9069999 0....

do fldo

4 ....4d0.10224 T998 3...4d0.10224 T9981nq 7999 0 V75 9.96 Tf1 0 0 5 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 10.8005 l1207.6 1( )TjET QQq5078.6 7920 m5078.8Qq812.8 7920 m1l1207.6 10 05j5.52 0 Tão05 lhW9m5078./Aq 10 6 Tf1 0 0 1n6 7920 m5078.8q5078.8 7920 m5302 7920 l5302 10.80l812.8 10.8005 lht7920 l5078.8 10.8005 l1207.6 10.80m BT/R75 9.96 Tf1 8.8 7920 m53020 l1207.6 10.8005 l812.8 10.8005 lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 107.2 40d(f)Tj2.87998 0 Td(nq 10 0 0 10 0 0 Qq812.8 7920 m1207.6 7920 l1207.6 5 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 350.516 Tm(4)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(. Tm2.87112 Tw( )TjET QQq1207.6 7920 m5078.8 7920 l5078.8 10.8005 l1207.6 10.8005 lhW nq 10 0 0 10 0 0812.8 10.8005 lh 0 Td(nq 10 0 0 10 0 0 Qq812.8 7920 m1207.6 7920 l1207.6 5 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 350.5166QQq1207.6 7920 m5078.8 7920 l5078.8 10.8005 ld(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22.08 0 Td(2 0 Td(.)Tj 9.9643993999 0 Td()Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.75999 0 T.)Tj22.08001nq 7999 0....)TjET QQ lhW nq 1Tj2.75999 0 Td(3)Tj5.52 0 Td(.)Tj2.7510.8005 lhET QQq5078.8 7920 m5302 7920 l5302 10.8005 l5078.8 10.81nq 7999 0l1207.6 10 (398 0 Td(r)Tj3.35999 0 Td(a)Tj5.52 0 Td(c)Tj5.03999 0 Td(i)Tj2.15999 0 Td-0.01776 Tc(ona)Tj16.56 0 Td(d)Tj5.63999 0 1nq 7999 0....)TjET QQ lhW nq 1T/R75 9.96 Tf1 0 0 1 98.92 422.876 Tm2.87112 Tw( )TR75 9.96 Tf1 0 09 0 Td-0.01776 Tc(do)Tj11.04 0 Td0.06 T104.39999 0 Td(f)Tj2.87998 0 Td(l)Tj2.159996d(f)Tj2.87998 0 Td(l)Tj2.15999(s )Tj10.56 0 Td(.)Tj2.87998 0 Td-0.00888 Tc(......)Tj16.56 0 Td(.)Tj2.87998 0 Td(.....)Tj13.8 0 Td(.)Tj2.87998 0 T104.39999 0....)TjET QQ lhW nq 10 0 0 10 0 0 cm BT/R75 9.96 Tf1 0 0 1 85.12 405.716 Tm(4)Tj52.87998 0 Td(....4d0.10224 T998 3...4d0.10224 T998104.39999 0 L75 920 m5078./005 l1207.6 10.80m nq 10Tf1 0 0 1 0 0 0 cm BT/e0 0 0 cm BT/R75 ..)TjET QQq1207 516.04 405.716 Tm-76 Tm2.87112 Tw( )TjET QQq5075078.8 10.80050 0 0 10 0 0 cm BhW nq 1 7920 l5078.8 10.8005 l1207.6 10.80mn6 7920 m5078.8t7920 l5078.8 10.8QQq5078.8 792..4

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4.6.3 Ensaio de especificidade......................................................................... 36

4.6.4 Limite de quantificação............................................................................. 36

4.7 Doseamento do Teor de Flavonóides Totais em UV............................... 37

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................. 41

5.1 Obtenção dos Extratos Hidroalcoólico e Fracionados para Pesquisa de Flavonóides

e Alcalóides.........................................................................

41

5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)............................................ 41

5.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).................................... 45

5.4 Análise Quantitativa Através de CLAE..................................................... 52

5.5 Análise Quantitativa Através de CLAE (Sistema Isocrático).................... 62

5.6 Validação Analítica................................................................................... 64

5.7 Doseamento Espectrofotométrico do Teor de Flavonóides Totais.......... 66

5.8 Pesquisa de Alcalóides Através de CLAE................................................ 70

6 CONCLUSÕES........................................................................................ 78

7 REREFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 80

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LISTA DE FIGURAS Figura 1: Foto Passiflora alata Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da

planta...........................................................................................

8

Figura 2: Foto Passiflora incarnata Lineau, mostrando a inflorescência e o fruto da

planta..................................................................................

9

Figura 3: Foto Passiflora actinia Hooker; mostrando a inflorescência da

planta................................................................................................

9

Figura 4: Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos.................... 28

Figura 5: Fluxograma do método descrito por PETRY et al. (1998)............... 38

Figura 6: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA BRITÂNICA,

(2000)..........................................................................

39

Figura 7: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA HELVÉTICA

(1987)..........................................................................

40

Figura 8: CCD do extrato hidroalcoólico total de P.

alata.................................................................................................

42

Figura 9: Cromatografias em camada delgada das amostras: A- Extrato hidroalcoólico de

P. alata, B- Tintura Farmacopeica de P. actinia, C- Extrato hidroalcoólico

comercial de P. incarnata e os respectivos padrões 1-vitexina, 2-rutina e 3-

quercetina...................

43

Figura 10: Cromatogramas, da sobreposição do extrato fluido de P. alata coletadas em

Janeiro/2001 com o extrato fluido das folhas coletadas em

Agosto/2001...............................................................

46

Figura 11: Cromatogramas das três espécies de Passiflora: a) P. alata, b) P. actinia e c)

P. incarnata....................................................................

51

Figura 12: Esquema mostrando degradação microbiana de flavonóides......... 54

Figura 13: Cromatogramas de: a) Extrato fluido de P. alata (A)....................... 56

Figura 14: Cromatograma de Extrato fluido de P. alata (A) e espectro de UV de: 1-

isovitexina...............................................................................

57

Figura 15: Cromatograma da co-injeção de padrões 1-isovitexina + 2-vitexina e espectro

de 1-isovitexina.................................................

57

Figura 16: Cromatogramas de: b) Tintura de P. actinia

(T).....................................................................................................

58

Figura 17: Cromatograma de P. actinia (T) e espectro de UV de: 1-

isovitexina.........................................................................................

59

Figura 18: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina+2-vitexina e espectro

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1-isovitexina...................................................... 59

Figura 19: Cromatogramas de: b) Extrato fluido de P. incarnata (C) e

padrões............................................................................................

60

Figura 20: Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 2-

vitexina.............................................................................................

61

Figura 21: Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 1-

isovitexina.........................................................................................

61

Figura 22: Cromatogramas de P. incarnata (C), co-injeção dos padrões e espectro de UV

de: 2- vitexina.........................................................

61

Figura 23: Curva de calibração de isovitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340

nm.................................................................................

65

Figura 24: Curva de calibração de vitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340

nm..................................................................................

65

Figura 25: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos................... 71

Figura 26: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos................... 72

Figura 27: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos................... 72

Figura 28: Espectros de UV dos padrões de alcalóides.................................... 73

Figura 29: Comparação dos cromatogramas do extrato fluido (A) e dos padrões

(B)................................................................................

74

Figura 30: Comparação dos cromatogramas do extrato a quente (A), extrato a frio (B) e

padrões (C).....................................................................

75

Figura 31: Comparação dos cromatogramas do extrato I (A), extrato II (B), padrões

(C)......................................................................................

77

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LISTA DE TABELAS Tabela 1: Sistema gradiente (1): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH= 2,88 e B =

Metanol, fluxo de 0,5 mL/min.......................................

31

Tabela 2: Sistema gradiente (2): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH 2,88, B) =

Metanol e C = Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min...............

31

Tabela 3: Sistema gradiente (3): A = Acetonitrila - água (110:660); B = Acetonitrila -

água (120:180), fluxo de 1 mL/min...........................

32

Tabela 4: Sistema Gradiente (4): A = água - ácido acético 0,5 % (m/v); B = Metanol; C

= Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min................................

32

Tabela 5: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH

8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................

34

Tabela 6: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH

8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................

34

Tabela 7: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH

8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................

34

Tabela 8: Ensaio de Recuperação do método............................................... 36

Tabela 9: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de

flavonóides totais em UV das preparações extrativas de P. alata

..........................................................................................

47

Tabela 10: Tempo de retenção relativo aos flavonóides investigados nos extratos de P.

alata, P. actinia e P. incarnata................................

50

Tabela 11: Tempo de retenção referente aos flavonóides investigados nos extratos de P.

alata, P. actinia e P. incarnata................................

50

Tabela 12: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de

flavonóides totais em UV das preparações extrativas das três espécies de

Passiflora............................................................

55

Tabela 13: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide C-glucosilado

vitexina...........................................................................................

63

Tabela 14: Resultados do Ensaio de Recuperação do método....................... 66

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SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E FÓRMULAS ºC graus Celsius

°GL Gay Lussac

% porcentagem

µg micrograma

µm micrômetro

µL microlitro

Abs absorbância

AlCl3 cloreto de alumínio

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BZD benzodiazepínico

CA campo aberto

CCD cromatografia de camada delgada

CLAE cromatografia líquida de alta eficiência

DL 50 dose letal 50%

g grama

H2O água

HPLC High performance liquid chromatrography

i.p. intra peritonial

k fator de retenção

LC Liquid chromatrography

LCE Labirinto em cruz elevado

L. Lineau

LQ Limite de Quantificação

m massa

mL mililitro

min minuto

nm nanômetro

P. A. pureza analítica

PDA Photo Diode Array

PIPG Programa Integrado de Pós-graduação e Graduação

p/v peso/volume

R reagente

v/v volume/volume

UFPR Universidade Federal do Paraná

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USP United States Pharmacopeia

UV ultravioleta

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1 INTRODUÇÃO O uso das espécies vegetais, com fins de tratamento de doenças e

sintomas, remota ao momento em que o homem despertou para consciência, e

começou um longo percurso de manuseio, adaptação e modificação dos recursos

naturais para seu próprio benefício (DI STASI, 1996; MARTINS; CASTRO;

CASTELLANI, 1994). Esta prática milenar, atividade humana por excelência,

ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo evolutivo e chegou

até os dias atuais, sendo amplamente utilizada por grande parte da população

mundial como fonte de recurso terapêutico eficaz (DI STASI, 1996).

As plantas são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas,

muitas das quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número

de medicamentos. Para obtenção de novos fármacos, dois aspectos distinguem

os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a função

biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela

derivada dos processos de síntese, que apesar dos avanços tecnológicos atuais,

ainda é restrita. Esse fato possibilita que os compostos químicos presentes nas

plantas possam vir a se tornar fármacos em potencial para as mais diferentes

moléstias (NODARI et al., 2000).

O conhecimento da biodiversidade vegetal, além de ser considerado uma

fonte de modelos químicos para a síntese de novas moléculas, também deve ser

incentivado como um recurso natural com possível atividade na forma de

fitoterápico padronizado, eficiente e seguro. Dentre as várias plantas com

atividade farmacológica conhecida, destacam-se algumas espécies do gênero

Passiflora, conhecido popularmente no Brasil como maracujá, cujas partes aéreas

são tradicionalmente empregadas por suas propriedades sedativas,

antiespasmódica e ansiolítica (NODARI et al., 2000).

Das quatrocentas espécies conhecidas de Passiflora, trinta são descritas

por terem frutos comestíveis. Somente poucas espécies alcançaram

desenvolvimento comercial e dentre estas as mais conhecidas são Passiflora

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edulis Sims, de casca roxa e P. edulis f. flavicarpa Degener, com casca amarela

(SCHMIDT et al., 1995). Esta última é conhecida vulgarmente por maracujá

amarelo, e representa a forma mais cultivada em escala comercial no Brasil. São

também difundidas em nosso país, embora não na mesma escala: Passiflora

edulis Sims (maracujá roxo), Passiflora alata Curtis (maracujá doce), Passiflora

quadrangularis L., Passiflora caerulea L. e Passiflora laurifolia L. (FREITAS, 1985;

SOUZA e MELETTI, 1997).

Entre as inúmeras espécies de Passiflora nativas do Brasil, encontra-se no

estado do Paraná Passiflora actinia Hooker, espécie com poucos estudos

químicos e farmacológicos foram realizados até o presente. Reginatto (2000),

comparando por cromatografia em camada delgada, sete extratos de espécies de

Passiflora, identificou manchas com Rf semelhante aos padrões dos flavonóides

de isoorientina e isovitexina em P. actinia. Em 2001, Kurtz demonstrou a presença

de traços do alcalóide harmana na mesma espécie. Santos, (2003) demonstrou

que o extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia administrado em camundongos, em

doses inferiores a 1.800 mg/kg, não resultou em toxicidade aparente e através dos

métodos de labirinto em cruz elevado e campo aberto, foi observado um efeito

sedativo com o extrato hidroalcoólico bruto, extrato metanólico e sub-extrato

metanol-água.

A espécie Passiflora incarnata L. é nativa dos Estados Unidos, onde é

muito cultivada e conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho”

(SOUZA e MELETTI, 1997). Esta espécie cresce preferencialmente em solos

secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al., 1997), não tendo grande

difusão no Brasil em parte devido ao amargor da polpa do fruto (MORAES et al.,

1997). As partes aéreas da planta têm sido usada tradicionalmente para o

tratamento da ansiedade, ataques nervosos e nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).

O uso de Passilfora decorrente de suas propriedades sedantes iniciou-se

no século XVII na Europa, mas os estudos farmacológicos sobre P. incarnata L.

começaram a aparecer a partir do século XIX (HOEHNE, 1939). Graças às

propriedades sedantes e devido à presença de flavonóides C-glicosilados e de

alcalóides do tipo harmana, a P. incarnata L. consta em monografias das

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Farmacopéias Francesas (Pharmacopée Française, 1980), Européia (European

Pharmacopoeia, 1996), DAB 10 (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética

(Pharmacopoeia Helvetica, 1987) e italiana (Farmacopoea Ufficiale Della

Republica Italiana, 1998). Porém esta espécie não se adapta bem ao clima do

Brasil e desta forma a Farmacopéia Brasileira (Farmacopéia Brasileira, 1977)

elegeu como oficial a P. alata Curtis, apesar desta ainda ser pouco estudada. As

flores grandes e de cor carmim intensa e os frutos comestíveis, de sabor muito

doce, fizeram com que esta espécie se disseminasse muito e fosse bastante

apreciada para o consumo natural, sendo reconhecida vulgarmente como

maracujá-doce (SOUZA e MELETTI, 1997).

Oga et al. (1984); Pereira e Vilegas, (2000); relatam a escassez de literatura

e informações científicas relacionadas com P. alata, o que desperta o interesse e

a necessidade de estudar esta espécie brasileira mais detalhadamente para no

futuro, estabelecer parâmetros mais sólidos em relação à atividade farmacológica

e à composição química correspondente assim como a descrição dos caracteres

microscópicos das espécies aqui encontradas com facilidade e com abundância.

Moraes, Vilegas e Lanças (1997) estudaram várias espécies de Passiflora

incluindo a P. alata, através da observação dos perfis cromatográficos das

amostras comerciais destas espécies. Foi possível ter uma idéia preliminar

somente de flavonóides da espécie comercializada, através de Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (CLAE), mas para sua identificação completa é

necessário possuir dados botânicos e identificação dos alcalóides também.

O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma metodologia

validada por CLAE para a determinação qualitativa e quantitativa de flavonóides e

alcalóides em P. alata comparando com os extratos das espécies P. actinia e P.

incarnata. O desenvolvimento desta metodologia poderá ser útil para aplicação no

controle de qualidade, uma vez que a validação de métodos analíticos aplicados

às drogas vegetais ainda é o ponto chave para se obter extratos padronizados.

Este trabalho pretende contribuir ao conhecimento da espécie medicinal brasileira

P. alata (maracujá-doce), carente de informações técnicas sobre sua qualidade,

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que é largamente utilizada para ansiedade, como antiespasmódico e sedativa

(ZUANAZZI, 2001).

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2 OBETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS 2.1 Objetivo Geral

ϖ Avaliar através de CLAE a presença de flavonóides e alcalóides nas folhas

e nas preparações extrativas de Passiflora alata Curtis, Passifloraceae.

2.2 Objetivos Específicos

ϖ Desenvolver métodos cromatográficos (CLAE), qualitativos e quantitativos

para controle de qualidade de extratos de Passiflora sp;

ϖ Avaliar qualitativamente e quantitativamente os extratos medicinais

produzidos no Laboratório de Farmacognosia da UNIVALI, com relação as

folhas coletadas em janeiro e agosto;

ϖ Avaliar quantitativamente o teor de flavonóides totais por espectrofotometria

de ultravioleta (UV), nas folhas e nas preparações extrativas de P. alata .

ϖ Comparar os teores de flavonóides e alcalóides através de UV, CLAE bem

como os perfis cromatográficos de P. alata com P. incarnata e P. actinia.

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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Gênero Passiflora

A família Passifloraceae compreende cerca de vinte gêneros e seissentas

espécies, distribuindo-se principalmente nas Américas e na África (BARROSO,

1978). São plantas escadentes, herbáceas ou lenhosas e possuem gavinhas, as

quais são ramos modificados, podendo ainda ser detectada a presença de

nectários extraflorais (BARROSO, 1978).

O gênero predominante nessa família é Passiflora, representado por

aproximadamente quatrocentas espécies, cujo nome é atribuído ao significado

místico das características físicas de suas flores, nas quais os escritores do século

XVI interpretaram suas diferentes partes como representando os símbolos da

Paixão de Cristo. Por esta razão, esses vegetais são conhecidos na Europa e

América do Norte como flor-da-paixão (BARROSO, 1978; FREITAS, 1985).

Algumas espécies de Passiflora são cultivadas por seus frutos comestíveis,

principalmente na forma de sucos e refrescos. A forma de maracujá comestível, o

maracujá amarelo, cultivada em escala comercial é Passiflora edulis Sims forma

flavicarpa Deg. Também muito difundida no Brasil em menor escala temos a

Passiflora alata (Dryander) Curtis, Passiflora quadrangularis L., Passiflora caerulea

L. e Passiflora caurifolia L. (FREITAS, 1985).

3.1.1 Considerações botânicas

Passiflora alata Curtis

A Passiflora alata (Figura 1) é uma trepadeira com gavinhas, de caule

quadrangular com ângulos levemente alados. Estípulas foliáceas, verdes, com até

2 cm de comprimento. Folhas alternadas, simples, oval ou oblonga, de 10 a 16 cm

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de comprimento por 8 a 11 cm de largura, membranácea, glabérrima, de cor

verde-escura na página superior, mais pálida na inferior, uninérvia e arqueado-

venosa, com as nervuras salientes em ambas as faces, principalmente na inferior;

suas margens são inteiras e hialino-cartilagíneas. O pecíolo mede geralmente

cerca de 3 cm de comprimento e é profundamente caniculado na parte superior,

apresenta 2 a 4 glândulas sésseis nas margens, dispostas aos pares e convexo

na parte inferior, que é carenada. Flores vistosas hermafroditas, actinomorfas,

pentâmeras, solitárias nas axilas das folhas, perfumadas, tendo em média 10 a 12

cm de diâmetro. Sépalas e pétalas camosas, avermelhadas internamente. Corola

bisseriada, a série externa muito mais longa, com filamentos listados de branco e

roxo, série interna muito curta, dentiforme. Fruto ovóide a periforme, com até 10

cm de comprimento e 6 cm de largura, amarelo quando maduro (OLIVEIRA;

AKISUE, 1998; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1977).

A espécie P. alata é aparentemente originária da região leste do Brasil, mas

encontra-se largamente distribuída em várias regiões. Conforme a região

considerada, recebe os mais diversos nomes populares, tais como maracujá-

guaçú, maracujá-guasú, maracujá-de-refresco, maracujá-doce, maracujá-comprido

ou, simplesmente, maracujá. Esta espécie é muito semelhante a Passiflora

quadrangularis L. (maracujá-mamão, maracujá-assú, maracuja-uaçú), que

pertence ao mesmo sub-gênero e série respectivamente, Granadilla e

Quadrangulares; as vezes é difícil distingui-las a primeira vista, mas ambas

apresentam detalhes de organização floral e foliar que as caracterizam. A P. alata

pode ser também confundida com Passiflora macrocarpa (maracujá-melão), mas

novamente, é possível reconhecê-las pela organização foliar e floral. Para alguns

botânicos, P. macrocarpa Mast. é sinonímia de P. quadrangularis L. (FREITAS,

1985; DE OLIVEIRA et al., 1980)

Outros usos farmacêuticos incluem preparações fitoterápicas, como

sedativo no tratamento de nevralgias, insônia, histeria, epilepsia e ataques

nervosos (CORRÊA, 1984). O extrato de maracujá é usado como componente

flavorizante em bebidas alcoólicas e não alcoólicas e em sobremesas frias. Suas

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sementes são doces e acídulas, muito apreciadas para a fabricação de

refrigerantes e sucos (CORRÊA, 1984).

Figura 1: Foto Passiflora alata Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da

planta. Fonte: www.herbmed.org/herbs/passifloraalata.

Passiflora incarnata Lineau

A espécie P. incarnata L. (Figura 2) é nativa dos Estados Unidos, onde é

muito cultivada e conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho”

(SOUZA e MELETTI, 1997). Esta espécie cresce preferencialmente em solos

secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al., 1997) não tendo grande

difusão no Brasil, em parte devido ao amargor da polpa do fruto (MORAES et al.,

1997). As partes mais utilizadas são as folhas, sendo estas trilobadas com

comprimento de 6 a 15 cm e largura de 5 a 12 cm (Souza e Meletti, 1997). As

partes aéreas da planta têm sido usadas tradicionalmente para o tratamento de

ansiedade, ataques nervosos e nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).

A P. incarnata L. consta em monografias das Farmacopéias Francesas

(Pharmacopée Française, 1980), Européia (European Pharmacopoeia, 1996),

DAB 10 (Deutsches Arzneibuch, 1992 ), Helvética (Pharmacopoeia Helvetica,

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1987), e italiana (Farmacopoea Officiale Della Republica Italiana, 1998). Porém

esta espécie não se adapta bem ao clima do Brasil.

Figura 2: Foto Passiflora incarnata L. mostrando a inflorescência e o fruto da

planta. Fonte: www.exot-nutz-zier.de/images/ prod_images/Pass...

Passiflora actinia Hooker

A P. actinia (Figura 3), embora sendo uma espécie nativa da região Sul do

Brasil, encontram-se poucos estudos sobre a mesma. Kurtz et al. (2001) em um

estudo morfoanatômico e investigação de constituintes alcaloídicos da espécie

através de CLAE, relatou que as folhas apresentam um contorno oval, margem

lisa, ápice obtuso, base arredondada e limbo inteiro. Observou também que a face

abaxial da epiderme é papilosa, o mesófilo é dorsiventral, os feixes vasculares são

colaterais e idioblastos contendo drusas estão distribuídos no parênquima foliar.

Na análise de alcalóides encontrou a presença de traços de harmana.

Figura 3: Foto Passiflora actinia Hooker mostrando a inflorescência da planta.

Fonte: www.passionflow.co.uk/ actinia1.htm

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3.1.2 Considerações químicas

Os estudos referentes à composição química de diversas espécies de

Passiflora evidenciam, principalmente, os alcalóides e flavonóides. Entretanto,

outras substâncias como saponinas, glicosídios cianogênicos, esteróides,

lignanas, ácidos graxos, maltol, aminoácidos e taninos, também são citados

freqüentemente na literatura (ALONSO, 1998; REGINATTO, 2000; REGINATTO et

al., 2001).

Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e

diversificados entre os produtos de origem natural (ZUANAZZI, 2001). São

particularmente importantes para o controle de qualidade de fitoterápicos, pois

através deles é possível identificar muitas espécies de Passiflora (QUERCIA et al.,

1978).

Diversas funções são atribuídas aos flavonóides nas plantas. Entre elas

podemos citar: proteção dos vegetais contra incidência de raios ultravioleta e

visível, além de proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias; atraentes de

animais com finalidade de polinização; antioxidantes; controle de ação de

hormônios vegetais; agentes alelopáticos e inibição de enzimas. Podem também

ser usados como marcadores taxonômicos e isto é devido sobretudo a sua

abundância relativa em quase todo o reino vegetal, especificidade em algumas

espécies, relativa estabilidade e seu acúmulo com menor influência do meio

ambiente (ZUANAZZI, 2001).

Os flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente oxigenados

e um grande número ocorre conjugado com açúcares. Essa forma conjugada,

também conhecida por glicosídeos, pode ser formada pela ligação de um ou mais

açúcares aos grupos hidroxilas por ligação hemiacetal facilmente destruída por

hidrólise ácida. Outra forma de conjugação de açúcares ao núcleo flavônico é por

meio de ligação açúcar-genina entre carbonos C-1 (anomérico) do açúcar e um ou

dois carbonos do anel A do flavonóide (C-glicosídeo). Quando o metabólito

encontra-se sem o açúcar, é chamado de aglicona ou genina, sendo também

denominado de forma livre (ZUANAZZI, 2001).

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Na Passiflora os flavonóides encontrados são do tipo C-glicosilados,

possuem atividade biológica e são de interesse quimiotaxonômico e

freqüentemente são utilizados como “marcadores” na análise de medicamentos

fitoterápicos. Esses flavonóides C-glicosilados são menos solúveis em acetato de

etila do que as agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após

hidrólise (PEREIRA; VILEGAS, 2000).

Oga et al. (1984) encontraram os flavonóides orientina (1), isoorientina (2)

vitexina (3), isovitexina (4), e rutina (5) em P. alata através de CCD. Freitas (1985)

realizou um estudo dos flavonóides glicosídeos de P. incarnata, P. edulis, P. alata

e P. quadrangulares, através de CCD e verificou a presença de quatro flavonóides

principais nestas espécies identificados como: vitexina, isovitexina, orientina e

isoorientina.

Vários estudos relatam a presença dos seguintes flavonóides em P. incarnata:

C-glicosil schaftosídio, isoschaftosídio, isovitexina-2´-O-glucopiranosídeo,

orientina, isoorientina, isoorientina-2´-O-glucopiranosídio, swertisina (6),

isoscoparin-2”-O-glicosídio quercetina e kaempferol (PROLIAC et al., 1988; LI et

al., 1991; RAHMAN et al., 1997).

Em folhas de P. sexflora, McCormick e Mabry (1992) encontraram seis di-C-

glicosilflavonas: lucenina-2, carlinosídeo, isoviolantina, schaftosídeo, vicenina-1 e

isochaftosídeo e seis mono-C-glicosilflavonas: orientina, isoorientina,

isoswertiajaponina e isoswertisina. Em adição, luteolina-7-O-glucosídeo, luteolina

e uma aurona (sufulrentina), também foram identificadas.

Ulubelen et al. (1982) pesquisaram três espécies de Passiflora e relataram a

presença dos seguintes compostos: C-glucosídeo isovitexina, 2”-xilosilvitexina,

luteolina-7-O-glucosídeo e uma mistura de vicenina-2, schaftosídio e

isochaftosídeo em folhas de P. pittieri. A partir de P. alata, os autores obtiveram

2”-xilosilvitexina, vitexina, isovitexina e orientina. Saponarina foi encontrado

somente em P. ambigua.

Os estudos em relação aos flavonóides de Passiflora relatam que os mesmos

são derivados da luteolina (7) e apigenina (8) (GEIGER et al., 1986). Alguns

flavonóides detectados com maior freqüência no gênero Passiflora são os

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seguintes: orientina, homoorientina, isovitexina, vitexina, schaftosídeo e swertisina

(6) (PEREIRA et al., 2000).

Souza, Schapoval e Bassani (2002) realizaram um trabalho utilizando

CLAE, fase isocrática, para quantificar flavonóides isolados ou compostos em

matrizes biológicas complexas, sendo que o mesmo demonstrou um excelente

desempenho em separar os flavonóides quercetina, luteolina e 3-O-

metilquercetina em extratos de Achyrocline satureioides.

Moraes (1995) estudou a diferenciação entre P. edulis, P. alata e P.

incarnata com base nos flavonóides, tendo constatado que o perfil cromatográfico

destas três espécies permite diferenciá-las através da CLAE.

Dhawan et al. (2001) consideraram os flavonóides como o maior grupo de

constituintes já pesquisados no gênero Passiflora.

O

O

OH

OH

OH

Glu

VITEXINA

O

O

OH

OH

OH

Glu

ISOVITEXINA

(2) (3)

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O

O

OH

OH

OH

OH

O Glu Rha

RUTINA

O

O

OH

OH

O

Glu

CH3

SWERTISINA

O

O

OH

OH

OH

APIGENINA (5)

Os alcalóides já encontrados no gênero Passiflora são do tipo indólico

simples, derivados do sistema ß-carbolina, conhecidos como ß-carbolinas ou

alcalóides ß-carbolínicos (CORDELL, 1981; DEWICK, 1997). Vários alcalóides

indólicos possuem atividade biológica comprovada, sendo que muitos têm valor na

medicina como tranqüilizante e no tratamento da hipertensão (Cordell, 1981;

O

O

OH

OH

OHOH

LUTEOLINA(7)

(6)

(4)

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Harbone, Baxter, 1995), geralmente essa ação é mediada pela sua interação com

um ou mais receptores específicos.

Muitos dos alcalóides ß-carbolínicos são substituídos em C-1 por um grupo

metila, como por exemplo harmana (8) (CORDELL, 1981).

Fellows et al. (1938) foram os primeiros autores a pesquisarem alcalóides em

P. incarnata, porém o extrato clorofórmico da mesma, frente aos reativos gerais

para alcalóides (Mayer e Wagner), não apresentou reação positiva.

Entre 1954-1956, Neu, citado por Souza (1997), isolou o alcalóide harmana a

partir de partes aéreas de P. incarnata e posteriormente detectou a mesma

substância em P. edulis e P. quadrangularis.

Estudos realizados com P. incarnata durante a década de 1960 detectaram,

através de análises cromatográficas e espectroscópicas, os alcalóides harmana

(8), harmol (9), harmalol (10), harmalina (11) e harmina (12) (LUTOMSKI, 1959;

LUTOMSKI, 1960; LUTOMSKI, 1967; BENNATI et al., 1968; LUTOMSKI et al.,

1968; BENNATI, 1971).

Rehwald et al. (1985) desenvolveram uma metodologia analítica para a

detecção de alcalóides em P. incarnata que consistia na extração, purificação,

concentração e posterior análise em CLAE da fração alcaloídica. Essa técnica foi

sensível à detecção de harmana, harmina, harmalina, harmol e harmalol, porém

em quinze amostras comerciais analisadas, somente uma apresentou traços de

harmana.

Segundo Bennati (1967), harmana, harmina e harmalina são alcalóides

presentes no extrato fluido de P. incarnata sendo que o isolamento e separação

foram possíveis mediante extração etérea. O comportamento cromatográfico com

padrões de alcalóide foi característico e permitiu reconhecimento comparando-se

com extrato fluido de Passiflora em preparação farmacêutica complexa.

Estudos com P. incarnata detectaram os alcalóides: harmana, harmina,

harmalina, harmol, harmana e harmalol, sendo que foi utilizado o método de

Cromatografia de Camada Delgada (BENNATI, 1971).

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Oga et al. (1984) relatam apenas o teor de alcalóides expresso em

harmana de P. alata, sendo que encontrou 0,217 mg % de alcalóides, no extrato

seco das folhas.

Pereira e Vilegas (2000) relatam que contradições e variações dos

valores de teor de alcalóides encontrados na literatura devem-se em parte as

diferentes metodologias aplicadas, e também pode-se considerar os órgãos

empregados, a época e o local de colheita.

3.2 Controle de Qualidade de Passiflora

O nome vulgar “maracujá”, de origem tupi-guarani, é empregado para designar

uma série de espécies vegetais pertencentes ao gênero Passiflora. As diversas

empresas que comercializam drogas vegetais obtidas a partir destas espécies

freqüentemente enfrentam dificuldade na identificação destes materiais.

NN

CH3H

harmana

NN

CH3H

OH

harmalol

NN

CH3H

OCH3

harmalina

NN

CH3H

OCH3

harmina

(8) (9)

(11) (12) (10)

NN

CH3H

OH

harmol

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Com freqüência, tais empresas adquirem-nas de coletores preocupados única

e exclusivamente com a atividade extrativa, sem interesse no cultivo da espécie

medicinal, bem como, indiferentes à época da colheita e ao processo de

transformação adequada das partes vegetais em droga. Por isso, muitas vezes, a

droga comercializada no Brasil é de baixa qualidade e não raro apresenta-se

fraudada. Com referência a este último fato é conveniente acrescentar que o

problema é bem mais amplo e diz respeito de uma maneira geral á maior parte

das drogas aqui comercializadas (FREITAS, 1985).

Recentemente, as Resoluções - RDC n° 48 e 89 de 16 de março de 2004, da

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), incorporaram a P. incarnata L.

na lista de plantas para registro simplificado, para as quais não são necessários

estudos complementares toxicológicos, pré-clínicos e clínicos para a obtenção de

registro de medicamentos, em função do acesso aos estudos sobre esta espécie

(BRASIL ANVISA, 2004), embora até hoje não existam resultados conclusivos que

indiquem qual (is) do(s) constituinte(s) químicos(s) presente(s) nas folhas de

maracujá promovam ação sobre o sistema nervoso central (DHAWAN et al.,

2001b). Entretanto, a referida não preconiza os teores de flavonóides totais

(isovitexina/vitexina).

A diferenciação de P. alata de outras espécies comerciais do gênero

Passiflora é relativamente fácil, visto estes materiais apresentarem folhas lobadas,

como P. incarnata L. e P. edulis Sims ou folhas digitadas/palmatilobadas como P.

caerulea L. Outra diferenciação preocupante é aquela que diz respeito a P.

incarnata L. e P. edulis Sims: a margem da folha de P. edulis Sims é mais

nitidamente serrilhada do que a de P. incarnata L. a folha de P. edulis Sims é

também um tanto irregular, não se conseguindo aplainá-la totalmente quando

prensada entre folhas de papel absorvente. Por outro lado, a face dorsal da folha

de P. incarnata L. é pubescente, o que pode ser observado com auxílio de lupa,

fato este não observado em P. edulis Sims (FREITAS, 1985).

Como a droga comercializada na maioria das vezes é representada pelas

partes aéreas, a dificuldade de diferenciação macroscópica destas drogas

aumenta com o grau de fragmentação. Sendo assim, a diferenciação entre as

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espécies para propósitos de controle de qualidade deve ser baseada em

constituintes químicos como os flavonóides e farmacognósticas. Normalmente os

parâmetros de avaliação da qualidade da matéria-prima vegetal são

caracterizados por critérios de identidade, pureza e teores descritos nas

Farmacopéias (FARIAS, 2001).

A determinação dos flavonóides em plantas medicinais, como proposto

pelas Farmacopéias Alemã (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética

(Pharmacopoeia Helvetica, 1987), e Italiana (Farmacopoea Ufficiale Della

Republica Italiana, 1998) consiste na análise espectrofotométrica do complexo

quelato de alumínio após hidrólise e extração com acetato de etila. Este é um

método geral e é preconizado para P. incarnata e outras espécies ricas em

flavonóides tais como Camomila recutita, Crataegus spp e Betula alba. Muitos

autores (Glasl e Becker, 1984; Schmidt e Ortega, 1993; Pereira, 2002) têm

atribuído a metodologia muitas fontes de erro analítico, uma vez que o método foi

desenvolvido especificamente para analisar flavonóides O-glicosilados e não para

flavonóides C-glicosilados, que resistem à hidrólise ácida. Os C-glicosilados são

menos solúveis em acetato de etila (solvente utilizado para extração) do que as

agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após hidrólise, fase

esta que é descartada. Durante a hidrólise ácida, podem sofrer isomerização,

denominada rearranjo de Wessely-Moser, formando misturas de 8-C-glicosídeo e

6-C-glicosídeo (MARKHAM, 1982).

Até 1978 haviam sido publicados poucos trabalhos detalhando a análise de

flavonóides por CLAE. Na década de 70, a separação de misturas complexas de

flavonóides glicosídeos ainda era difícil, e eram utilizadas com sucesso fases

estacionárias do tipo C8, C18 e NH2, e como fase móvel, misturas de água e

metanol, ou misturas acetonitrila-água, fracamente acidificadas com ácido acético.

A utilização da CLAE começou a crescer como ferramenta de análise de

flavonóides em Passiflora principalmente a partir da década de 80.

Num estudo realizado por Quércia et al. (1978) através de CLAE em

amostras de P. incarnata, foi utilizada coluna Zorbax ODS (25 x 2,0 mm I. D.),

temperatura 45 °C, sistema gradiente composto por metanol-água e fluxo de 0,5

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mL/min e foi encontrado um teor de vitexina de 0,226% em extrato pilular e 2,24%

em amostras de extratos pulverizados. Ulubelen e Oksu (1982), analisando teores

de flavonóides através de CLAE utilizaram coluna RP 18 (30 X 0,5 cm I. D.),

sistema isocrático composto por metanol-água-ácido acético (25:70:5) e fluxo 1,5

mL/min em amostras de P. pittieri, P. alata e P. ambigua verificaram que a P. alata

possuía o menor teor de vitexina dentre as três espécies.

Em um outro estudo, Pietta et al. (1986), analisando simultaneamente

flavonóides em amostras que continham extratos de P. incarnata e Crataegus

monogyna, utilizaram coluna C18 (30 cm x 3,9 mm I. D.), sistema isocrático

composto por 2-propanol-tetrahidrofurano-água (5:15:85) e fluxo 1,5 mL/min

verificando a presença de vitexina-4’-O-ramnoside, isovitevina, vitexina e

hiperosídeo.

Também flavonóides C-glicosilados foram pesquisados em extratos de P.

incarnata pelos autores Qimin et al. (1991) em CLAE, onde foi utilizada coluna RP

18 (250 X 4 mm I. D.), sistema gradiente composto por metanol-ácido fórmico 5%-

água e um fluxo de 1,8 mL/min. Foram identificados nestes extratos os flavonóides

schaftosídeo, isochaftosídeo e isovitexina-2”-O-glucopiranosil e isoorientina-2”-

glucopiranosil.

Grice et al., 2001 desenvolveram um novo método em HPLC para análise

simultânea de alcalóides e flavonóides característicos de P. incarnata,

identificando e quantificando harmane, harmine, harmol, isovitexina e vitexina

onde foi utilizado coluna C18 (150 X 4 mm) e um sistema gradiente composto por

metanol-água-ácido acético e fluxo de 1 mL/min.

Os estudos demonstram que a CLAE vem se tornando um dos

procedimentos cromatográficos de análise mais utilizados na área de produtos

naturais, visto a alta eficiência de separação e sensibilidade que são alcançadas,

além da possibilidade de utilização com vários tipos de detectores (MERKEN et

al., 2000).

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3.3 Considerações Farmacológicas

O gênero Passiflora é mundialmente conhecido por suas propriedades

terapêuticas sobre o Sistema Nervoso Central, fato que vem sendo cientificamente

comprovado desde meados do séc. XX (RUGGY et al., 1940; LUTOMSKI et al.,

1975; LOGGIA et al., 1981).

Na medicina tradicional, a classe de fármacos mais utilizadas como

ansiolíticas e sedativas são os compostos benzodiazepínicos (BZD). Entretanto,

além dessas ações, também promovem uma série de efeitos indesejados, como

hipnose, relaxamento muscular, amnésia anterógrada, prejuízo no desempenho

psicomotor, dependência, incompatibilidade com álcool e tolerância (GRAEFF,

1999). Devido a esses fatores, faz-se necessária pesquisa e o desenvolvimento de

novas drogas, capazes de produzir uma ação ansiolítica e/ou sedativa desprovida

desses efeitos.

Inúmeras drogas vegetais, como Melissa officinalis L., Tília europaea L.,

Hypericum perforatum

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monoamonoxidase B (MAO-B). Experimentalmente o mesmo alcalóide induziu

sedação e relaxamento da musculatura lisa.

Em 1974, foi relatado que os derivados da pirona (maltol e etil maltol),

isolados a partir de P. incarnata L., causavam efeitos depressores em

camundongos como: potencialização do sono induzido por hexobarbital, ação

anticonvulsivante em altas doses e diminuição da atividade locomotora em doses

relativamente baixas (1/10 da DL50) (AOYAGI et al., 1974).

Contraditoriamente, Soulimani et al. (1997) demonstraram que o maltol

isolado, misturas de maltol e harmana e misturas de compostos flavonoídicos e

maltol não apresentavam variação nos parâmetros comportamentais e diminuição

da atividade locomotora mesmo em doses elevadas. Porém esses mesmos

autores confirmaram a atividade ansiolítica de P. incarnata L. no extrato

hidroalcoólico (400 mg/kg, i.p.) e a atividade sedativa da mesma a partir do extrato

aquoso (400 e 800 mg/kg, i.p.) em camundongos, caracterizando as atividades

observadas dependentes do solvente utilizado na produção do extrato.

Em estudo químico farmacológico, Lutomski et al. (1960) alertaram para a

importância da presença do complexo alcalóide-flavonóide em P. incarnata, para a

obtenção de um melhor efeito farmacológico. Os mesmos autores ainda observam

que este complexo está presente no extrato etanólico.

Trabalhando com extrato fluido e evaporado obtido a partir de folhas de P.

alata, contendo princípios flavonoídicos e alcaloídicos, Oga et al. (1984) relataram

que o mesmo promoveu redução da atividade locomotora, prolongamento do

tempo de sono induzido por pentobarbital sódico e aumento do tempo de latência

das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (doses de 75 e 159 mg/kg, via i.p.).

Utilizando o modelo experimental de ansiedade, labirinto em cruz elevado

(LCE), Wolfman et al. (1994) testaram a atividade do flavonóide crisina (1 mg/kg,

via i.p.) isolado de P. coerulea e concluíram que esse composto é um agonista

parcial dos receptores BZD, pois apresentou um decréscimo da ansiedade sem

manifestações de atividade sedativa.

Ao contrário dessa observação, Zanoli et al. (2000), ao administrar os

flavonóides crisina a apigenina obtidos respectivamente a partir de P. incarnata e

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Matricaria chamomilla, verificaram que ambos produziram uma redução da

atividade locomotora espontânea em ratos (sedação) na dose de 25 mg/kg (via

i.p.). Na dosagem de 1 mg/kg (via i.p.), somente a crisina produziu atividade

ansiolítica no modelo de ansiedade claro-escuro. Entretanto, o efeito observado

não foi atribuído aos receptores BZD, visto que estes se encontravam bloqueados

por injeção do antagonista benzodiazepínico flumazenil.

Um estudo comparativo sobre atividade ansiolítica no LCE dos extratos

hidroalcoólicos das espécies de P. alata e P.edulis foi realizado por Petry et al.

(2001). Ambos extratos, pela via intraperitonial em ratos (100 e 150 mg/kg),

demonstraram atividade, apesar do extrato de P. edulis ser mais efetivo em doses

menores (50 mg/kg). Trabalhando com o extrato aquoso dessas mesmas

espécies, De-Paris et al. (2002) recentemente obtiveram resultados semelhantes,

além de demonstrar que a composição flavonoídica de P. edulis é mais complexa

do que a P. alata.

A partir de 2001, Dhawan et al. começaram a publicar uma série de

experimentos em relação ao gênero Passiflora, dentre os quais um estudo

comparativo da atividade biológica de extratos metanólicos igualmente obtidos de

P. incarnata e P. edulis. A dose de 125 mg/kg (via oral) do extrato metanólico das

partes aéreas de P. incarnata apresentou significante atividade ansiolítica em

camundongos no modelo LCE, enquanto que P. edulis não apresentou atividade

significativa em nenhuma das doses testadas (DHAWAN et al., 2001c). O posterior

fracionamento do extrato metanólico de P. incarnata, possibilitou o isolamento de

uma substância benzoflavônica (BZF), o qual apresentou uma atividade ansiolítica

expressiva (10 mg/kg, p.o.) similar ao efeito exibido pelo diazepam (2 mg/kg, v.o)

em camundongos submetidos ao LCE (DHAWAN et al., 2001a).

Esses mesmos autores analisaram extratos obtidos de diferentes órgãos

vegetais de P. incarnata e observaram que o extrato metanólico das raízes dessa

espécie não apresenta significativa atividade ansiolítica em relação aos demais

órgãos vegetais (DHAWAN et al., 2001b). O extrato metanólico das folhas de P.

incarnata apresentou atividade ansiolítica, propriedades anti-tussígenas (Dhawan

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et al., 2002b) contra tosse induzida por SO2 e propriedades afrodisíacas na dose

de 100 mg/kg em animais de laboratório (DHAWAN et al., 2002c).

Santos (2003) realizou um estudo farmacológico através da administração do

extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia em camundongos, em doses inferiores a

1.800 mg/kg não resultando em toxicidade aparente. Através dos métodos LCE e

campo aberto, observou um efeito sedativo com o extrato hidroalcoólico bruto,

extrato metanólico e sub-extrato metanol-água, sendo que apenas este último

apresentou atividade ansiolítica na dose de 30 mg/kg. Ainda no mesmo estudo

verificou-se que todos os extratos e frações com atividade sedativa, apresentaram

atividade de catalepsia em camundongos.

Apesar dos experimentos laboratoriais desenvolvidos com o intuito de avaliar

a atividade farmacológica de Passiflora, ainda não se pode afirmar à qual classe

de compostos se deve tal atividade sedativa, se a um composto isolado ou a

grupos de compostos químicos (PEREIRA e VILEGAS, 2000).

O extrato fluido de P. alata que foi produzido e analisado quimicamente neste

trabalho, foi também investigado por (Salomão, 2003) farmacologicamente quanto

aos seus efeitos psicotrópicos. Efeito ansiolítico foi observado em camundongos

tratados com o extrato (100 mg/kg) e submetidos ao LCE. Todas as doses

utilizadas do extrato (30, 100 e 300 mg/kg) produziram sedação, confirmada pela

diminuição do número de cruzamentos e levantamentos realizados pelos animais,

no campo aberto. Finalmente, extrato 100 mg/kg aumentou o tempo de sono

induzido pelo pentobarbital sódico e induziu catalepsia em camundongos

produzindo atividade ansiolítica e sedativa nas doses empregadas neste estudo.

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4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Material Botânico A P. alata foi coletada no horto botânico do Campus da UNIVALI em Ilhota

SC, nos meses de janeiro e agosto de 2001 e identificada botanicamente como P.

alata Curtis pelo Professor Armando Cervi, Curador do Herbário da UFPR e estl

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harmana, harmol, harmina, harmalina e harmalol, (Fluka) foram cedidos pelo

professor Dr. Cid ª Santos do Departamento de Farmácia da UFPR.

Padrões e solventes foram filtrados por membrana de celulose regenerada

(Schleicher e Schuell) com poros de abertura 0,45 µm.

4.3 Métodos para Obtenção de Extratos

Os diferentes métodos de obtenç

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Extrato de P. actinia (T)

O extrato de P. actinia foi obtido do Laboratório de Farmacognosia da

UFPR, produzido por Kely Cristina Santos, segundo metodologia proposta pela

Farmacopéia Brasileira I para o preparo de tintura de P. alata (DA-SILVA, 1926).

Extrato de P. incarnata ©

O extrato fluido de P. incarnata foi obtido comercialmente (“Chemische

Fabrik Dr. Hetterich”) Fürth, Alemanha.

4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides

Extrato de P. alata (A1) Após elaborado o extrato hidroalcoólico de acordo com a metodologia

adaptada da Pharmacopoeia Helvética VII (1987) e armazenado em refrigerador a

8°C, por 3 dias, o precipitado (20 g) foi diluído em 200 mL de metanol:água (2:1) e

extraído três vezes em funil de separação, com porções de 100 mL com os

solventes: hexano, diclorometano e acetato de etila. O líquido restante foi

denominado fração aquosa que foi concentrado até secura. Em cada uma dessas

extrações foi aguardado o tempo suficiente até obter a nítida visualização das

linhas de separação das duas fases. As fases orgânicas de cada extração, foram

reunidas e também concentradas até a secura em evaporador rotatório.

4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides

Extrato de P. alata e P. actinia (B)

Para obtenção dos extratos das folhas sob refluxo, foram utilizados 0,400 g

da planta, seca e padronizada de acordo com o item 3.3.1 para extrato de P. alata.

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Colocada em balão de fundo redondo de 50 mL, acrescentado 25 mL de etanol

40% e aquecido em banho-maria, sob refluxo por 15 minutos. Após, a mistura foi

filtrada por algodão para balão volumétrico de 50 mL. O resíduo da droga e o

algodão foram lavados em balão de fundo redondo com 10 mL de etanol 40% e

aquecido a fervura sob refluxo por 10 minutos. Filtrado novamente a mistura por

algodão, lavado o resíduo e o algodão e mais 10 mL de solvente em balão de 50

mL e aquecido em banho-maria sob refluxo por mais 10 minutos. Após o resfriamento em

temperatura ambiente, o extrato foi filtrado para balão volumétrico completando o volume com

etanol 40%.

4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides

A preparação de extratos para pesquisa de alcalóides foi realizada somente

com P. alata.

Extrato I

Pó padronizado das folhas (5 g), umedecidas com hidróxido de amônio 5%,

deixado em repouso por 10 minutos, adicionado aproximadamente 30 mL de

clorofórmio suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 15

minutos. Após, o extrato foi filtrado e concentrado em banho maria, o resíduo foi

ressuspendido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).

Extrato II

Utilizando 15 g de pó padronizado das folhas, umedecido com hidróxido de

amônio 5%, deixado em repouso por 10 minutos, foi adicionado clorofórmio o

suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 20 minutos. Após, o

extrato foi filtrado, concentrado em banho maria, redissolvido o resíduo com 10

mL de acido clorídrico 1% e colocado no ultrassom por 10 minutos. Filtrado

novamente, alcalinizado com hidróxido de amônia 10% até pH 9-12, foi procedido

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a extração em funil de separação com 5 mL de diclorometano. A extração foi

repetida por 3 vezes. Após este processo, a fase orgânica foi concentrada em

banho maria, e o resíduo redissolvido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).

Extratos III e IV

De modo a reproduzir a metodologia clássica para extração de alcalóides,

segundo método descrito por Benatti (1967), uma parte do extrato hidroalcoólico

foi concentrado em rota-vapor, sendo feita a extração durante 7 horas com éter

sob aquecimento usando o aparelho Soxhlet. Após finalizado este prr etan

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Figura 4: Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos 4.4.Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

4.4.1 Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)

Preparou-se uma tintura alcoólica das folhas de P. alata, a 1/5 por

maceração em álcool a 60°C à temperatura ambiente. Evaporou-se 3 mL dessa

tintura a banho-maria e o resíduo foi retomado com 5 mL de metanol sendo filtrado

sobre sulfato de sódio anidro ® (cerca de 0,5 g). Evaporou-se o filtrado a seco,

retomando-o com 5 gotas de metanol. Foi depositado 5 µL desta última solução

Extrato (A) (Phram. Helvética VII )

Extrato (T) (Farm.

Brasielira II)

Folhas padronizadas P. actinia

Folhas padronizadas P. alata

Extrato (C) P. incarnata (obtido comercialmente)

Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV,

CCD)

Extrato (B) sob refluxo

Pesquisa Flavonóides e

alcalóides (CLAE, UV, CCD)

Extrato (A1) fracionado

Pesquisa Flavonóides

(CCD)

Pesquisa Flavonóides e

alcalóides (CLAE, UV, CCD)

Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV)

Extrato (B) Sob refluxo

Pesquisa Flavonóides (UV, CLAE)

Extrato I, II, III e IV

Pesquisa alcalóides

(CLAE)

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sobre uma camada fina de sílica e usando como fase móvel: acetato de etila,

metiletilcetona, água, ácido fórmico (5:3:2:1, v/v). A visualização foi feita sob luz

UV (366 nm ) após nebulização de reativo citrobórico (ácido bórico, ácido cítrico,

metanol 5:5:100, p/v) e solução alcoólica de tricloreto de alumínio a 1%),

FARMACOPÉIA BRASILEIRA (1977).

Realizou-se ainda a seguinte pesquisa para flavonóides: 1 mL do extrato

hidroalcoólico foi evaporado e solubilizado com um mínimo de metanol sendo

aplicado em placas de alumínio cobertas com uma fina camada (0,2 mm) de sílica

gel 60 F 254 Merck, ativada a 110°C por 2 horas. Alternadamente, foi preparada a

seguinte fase móvel: acetato de etila, água, ácido fórmico na proporção 80:15:5 e

a visualização foi feita sob luz UV 366 nm seguido pela revelação com ácido 2-

aminoetil ester difenilbórico a 1% em metanol e Polietilenoglicol 4000 a 5% em

metanol, sendo a placa aquecida a 120°C por 5 minutos. Para os extratos

fracionados seguiu-se este mesmo procedimento.

4.4.2 Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)

Utilizando o extrato hidroalcoólico de P. alata, foram feitas extrações com

clorofórmio, adicionando o agente secante sulfato de sódio anidro, filtrou-se,

evaporou-se o filtrado a seco, retomando-o com algumas gotas de clorofórmio.

Foi depositado 5 µL desta última solução sobre uma camada fina de sílica e

usando como fase móvel clorofórmio–metanol-hidróxido de amônia (9,7:0,3:0,025

v/v). A visualização foi feita sob luz UV (254 e 365 mm) após nebulização do

reativo Dragendorf (WAGNER e BLADT, 1995).

4.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

4.5.1 Instrumentação As análises dos extratos foram realizadas utilizando o cromatógrafo líquido

do LAPAM (Laboratório de Produção e Análise de Medicamentos – UNIVALI) da

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marca SHIMADZU LC-10; coluna C18 (Phenomenex), Luna 5µm C18 (Dimensão

250 x 4,60 mm), usando detector SPD – M10A VP, um “loop” de injeção de 20 µL,

uma Bomba LC 10 VP e um software Class VP.

4.5.2 Preparo das amostras para pesquisa de flavonóides C-glicosilados e

alcalóides

Os extratos foram filtrados em presença de carvão ativo e diluída em metanol

50% na proporção 1:10, sendo novamente filtrada por membrana de celulose

regenerada (Schleicher e Schuell) com poros de abertura 0,45 µm. Todas as

análises foram realizadas em triplicata, a temperatura da coluna de 30 °C.

4.5.3 Condições cromatográficas para pesquisa de flavonóides C-

glicosilados

Foram testadas sete condições cromatográficas para as análises dos extratos (T, B, A

e C) em CLAE.

A detecção em UV foi efetuada a 340 nm, 270 nm e 260 nm. Conforme Quadro 1 e

Tabelas 1, 2, 3 e 4:

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Quadro 1: Sistemas de solventes utilizados nas corridas isocráticas

SISTEMA

SOLVENTES

FLUXO

(mL/min) 1 acetonitrila – água – ácido acético (18:82:0,5)

1

2 A = agua – ácido ortofosfórico (100:0,1), pH= 2,6 e B = tetrahidrofurano – isopropanol – acetonitrila,

(10:2:3) (0-60 min de 12% de A em B)

1,2

3 A = agua – ácido ortofosfórico (100:0,1), pH= 2,6 e B = tetrahidrofurano – isopropanol – acetonitrila,

(10:2:3) (0-80 min de 10% de A em B)

1,2

4 isopropanol – tetrahidrofurano – água (5:15:85),

1,5

Tabela 1: Sistema gradiente (1): A = água – ácido acético (100:0,5) pH= 2,88 e B

= Metanol, utilizando um fluxo de 0,5 mL/min.

TEMPO (min) A (%) B (%)

1 80 20

45 - 100

60 80 20

Tabela 2: Sistema gradiente (2): A = água – ácido acético (100:0,5) pH 2,88, B) =

Metanol e C = Acetonitrila, utilizando um fluxo de 1 mL/min.

TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)

1 80 10 10

20 70 15 15

30 60 20 20

35 50 25 25

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Tabela 3: Sistema gradiente (3): A = Acetonitrila – água (110:660); B = Acetonitrila

– água (120:180), utilizando um fluxo de 1 mL/min.

TEMPO (min) A (%) B (%)

0,01 88 12

5 95 20

10 90 30

17 83 40

25 75 50

35 65 10

Tabela 4: Sistema Gradiente (4): A = água – ácido acético 0,5% (m/v); B =

Metanol; C = acetonitrila, utilizando um fluxo de 1 mL/min.

TEMPO (min) A (%) B (%) C (%) 1 75 15 10

20 62 20 15

25 55 25 20

30 75 15 10

4.5.4 Curva de calibração para doseamento de isovitexina em CLAE

O teor de isovitexina foi realizado utilizando o sistema gradiente descrito na

Tabela 4. As injeções foram realizadas em triplicata e o resultado foi expresso pela

média das determinações em gramas de isovitexina por 100 g da droga (%, m/m).

Foram pesados 2 mg da substância de referência isovitexina e dissolvido em uma

solução de metanol e água na proporção de 1:1. A solução foi transferida para balão

volumétrico de 100 mL completando-se o volume com solução de metanol na

proporção de 1:1 (solução-mãe). Alíquotas da solução-mãe foram diluídas com uma

mistura metanol e água na proporção de 1:1 obtendo-se soluções contendo

isovitexina, nas seguintes proporções: 4,0; 8,0; 12,0; 16,0; 20,0 µg/mL. As soluções

foram filtradas através de filtro de membrana de celulose regenerada (0,45 µm de

diâmetro nominal de poro) e injetadas no cromatógrafo.

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4.5.5 Curva de calibração para doseamento de vitexina em CLAE

O teor de vitexina foi realizado de acordo com o sistema isocrático 4 do

Quadro 1. As injeções foram realizadas em triplicata e o resultado foi expresso

pela média das determinações em gramas de vitexina por 100 g da droga (%,

m/m).

Foi pesado 1 mg da substância referência, vitexina e dissolvida em uma

solução de metanol e água na proporção de 1:1. A solução foi transferida para

balão volumétrico de 100 mL completando-se o volume com solução de metanol

na proporção de 1:1 (solução-mãe). Alíquotas da solução-mãe foram diluídas com

uma mistura metanol e água na proporção de 1:1 obtendo-se soluções contendo

vitexina, nas seguintes proporções: 2,0; 4,0; 8,0; 12,0; 16,0 µg/mL. As soluções

foram filtradas através de filtro de membrana de celulose regenerada (0,45 µm de

diâmetro nominal de poro) e injetadas no cromatógrafo.

4.5.6 Condições cromatográficas para pesquisa de alcalóides ββ-carbolínicos

Para desenvolver método utilizando a CLAE e melhor separar cada

padrão (harmana, harmina, harmol, harmalina, harmalol), foram usados os

gradientes de concentração da fase móvel (acetonitrila 22%, metanol 22%),

segundo método descrito por Rehwald et al. (1995), conforme as Tabelas 5, 6 e 7.

A detecção em PDA foi efetuada a 340 nm, 240 nm e 260 nm.

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Tabela 5: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato

(pH 8,0), utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.

TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)

0-5

5-18

18-30

32

40

32

12

20

12

56

60

56

Tabela 6: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato

(pH 8,0), utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.

TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)

0-5

5-18

18-30

35

45

35

10

20

10

55

35

55

Tabela 7: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato

(pH 8,0), utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.

TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)

0-5

5-18

18-30

31

38

31

11

18

11

58

44

58

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4.6 Validação Analítica

A validação do método (sistema gradiente 4 – Tabela 04) foi baseada na

United States Pharmacopeia (2000). A amostra para os ensaios de validação foi o

extrato hidroalcoólico de P. alata conforme procedimento da Farmacopéia

Helvética (1987). A isovitexina, em três níveis diferentes de concentração (5, 7 e

10 µg/mL), foi adicionada ao extrato para avaliação da recuperação do método.

4.6.1 Linearidade e intervalo

A linearidade foi determinada com a construção da curva padrão, obtida

através das injeções no cromatógrafo, de diferentes concentrações da substância

de referência (isovitexina).

Foi realizada análise de regressão linear e calculado a equação da reta e o

coeficiente de correlação linear o qual deve ser R2 ≥ 0,999 usando o software

CLASS VP-503.

4.6.2 Ensaio de exatidão

A exatidão do método foi determinada após o estabelecimento da

linearidade, sendo verificada através do ensaio de recuperação, “contaminando”

diluições apropriadas de amostra, com diferentes concentrações conhecidas de

solução padrão (isovitexina). A concentração em cada balão ficou compreendida

no intervalo de linearidade do método.

A solução-padrão foi preparada pesando-se 8 mg de isovitexina e diluído

com metanol 50% para balão volumétrico de 100 mL, tendo como concentração

final: 80 µg/mL.

No preparo da solução-amostra, foi utilizado 5 mL de extrato fluido de P.

alata, diluído com metanol 50% para balão volumétrico de 50 mL e sonicado

durante 5 minutos, tendo como concentração final: 18 µg/mL.

Filtrou-se a solução amostra em papel filtro com carvão ativo e preparou-se

alíquotas seguindo as concentrações demonstradas na Tabela 8. Após realizou-se

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as injeções no cromatógrafo utilizando-se como fase móvel o sistema gradiente

(4), demonstrado na Tabela 4.

Tabela 8: Ensaio de Recuperação calculado para o extrato fluido de P. alata (A)

fortificado com isovitexina.

Balão (10 mL) Volume (mL) Amostra

(18 µg/mL)

Volume (µL) Padrão

(18 µg/mL)

Conc. Teórica total

(µg/mL)

Conc. Teórica adicionada

(µg/mL) 1 3 625 10 5

2 3 750 12 7

3 3 1,12 15 10

4 (amostra) 3 - 5 -

5 (padrão) - 625 5 5

4.6.3 Ensaio de especificidade

Este estudo foi realizado durante o teste de recuperação acima (citado no

ensaio de exatidão), tendo como base os dados relativos ao balão no qual foi

realizada a adição de iguais volumes de amostra e padrão comparando com

aquele que foi colocado apenas padrão.

Cálculo:

Resultado do balão apenas com padrão -------------100%

Resultado do balão com amostra e padrão ---------- X%

Inteferência do extrato fluido = 100 – X%

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4.6.4 Limite de quantificação

O limite de quantificação (LQ) corresponde ao menor nível de concentração

que pode ser quantificado com precisão e exatidão aceitáveis. Este foi

determinado através da equação 1, utilizando o coeficiente angular da curva de

calibração e o desvio padrão da curva de regressão linear (S) (USP, 1995).

Equação 1:

LQ = 10 x S

A

4.7 Doseamento do Teor de Flavonóides Totais em UV Nas Figuras 5, 6 e 7 estão descritos os procedimentos operacionais

realizados para análise do teor de flavonóides totais.

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*Valor de referência para P. alata: 0,55% C= A*FD m*E1%

C= concentração de Apigenina em % (m/m); A= absorbância; FD= fator de diluição; m= massa da planta seca em g; E = Coeficiente de abs específica da apigenina (336,5) Figura 5: Fluxograma do método descrito por PETRY et al. (1998).

Partes aéreas de P. alata (0,2 g droga

seca)

Extração sob refluxo etanol 40% (v/v), 30

min

Solução extrativa

Diluição da solução extrativa (1:20)

Amostra: solução extrativa + 2 mL

Solução AlCl3 0,5% (m/v)

Solução de compensação: sem

adição de AlCl3 0,5% (m/m)

Leitura em espectrofotômetro (397

nm) após 30 min.

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*Valor de referência para P. incarnata: 1,5% do total de flavonóides expressos em Vitexina. Equação: A x 0,8 m Sol 1*: metanol 10% em ác. acético glacial; Sol oxálico -bórica*: 25 g/l ác. bórico + 20 g/l ác. oxálico em ác. fórmico. Figura 6: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000).

Partes aéreas de P. alata (0,2 g droga

seca)

Extração sob refluxo 40 mL etanol 60% (V/V), 30

min (2 x)

Completar vol 100 mL

Evaporar 5 mL sol acima, adicionar 10 mL sol 1* e 10

mL sol oxálico bórica* e completar 25 mL ác. acético.

Solução de

compensação: sem adição da sol oxálico

bórica.

Leitura em espectrofotômetro (401 nm) após 30 min.

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*Valor de referência para P. incarnata: 0,3% expressos em Hiperosídeo. A x 1.25 m Sol 1*: hexametilenotetramina 0,5% m/v Sol 2*: ác. clorídrico R1: 25% m/v Sol 3*: ác. acético 5% em metanol. Figura 7: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA HELVÉTICA (1987).

Partes aéreas de P. alata (0,6 g droga seca)

Extração sob refluxo +1mL sol 1*+20 mL acetona +2 mL sol

2* 30 min (2 X)

Amostra: 10 mL sol acima +1 mL AlCL3 e

completar vol com sol 3*.

Solução de compensação: sem

adição de AlCl3

20 mL sol acima+20 mL H2O+15 mL acetado etila partição da fase

aquosa (3 x). Reunir extratos orgânicos e lavar com 50 mL

H2O.Completar vol 50 mL

Leitura em espectrofotômetro (422

nm) após 30 min.

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5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Obtenção dos Extratos Fluidos e Fracionados para Pesquisa de

Flavonóides e Alcalóides

O extrato hidroalcoólico (A) (1:1, 360 mL), foi obtido por percolação, com

álcool bidestilado diluído, das folhas de P. alata. Durante o armazenamento

observou-se a formação de um precipitado ocasionado possivelmente devido à

evaporação do álcool, conseqüentemente diminuindo o teor alcoólico do extrato e

tornando insolúveis substâncias menos polares.

O precipitado desse extrato (A1) (1,5 g) foi particionado com diclorometano,

hexano e acetato de etila com objetivo de purificá-lo e separar as substâncias nele

contidas, por ordem de polaridade, para posteriormente submetê-las a

cromatografia em camada delgada (CCD).

A fração diclorometano apresentou coloração verde escura intenso, teve

rendimento de 0,2148 g equivalente a 14,32% do precipitado do extrato

hidroalcoólico. A fração hexano obteve um peso de 0,6983 g equivalente a

46,55% do precipitado do extrato hidroalcoólico e a fração acetato de etila de

coloração verde escura, teve rendimento de 0,3 g equivalente a 20% do

precipitado do extrato hidroalcoólico total. A fase aquosa, de coloração castanho

avermelhada, resultou em 0,2870 g de matéria seca, equivalente a 19,13% do

precipitado do extrato hidroalcoólico.

5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)

A caracterização de flavonóides de P. alata realizada segundo Farmacopéia

Brasileira (1977), não apresentou resultado satisfatório. A metodologia descreve

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que deve aparecer quatro manchas apresentando coloração amarelo esverdeada

sob luz ultravioleta após nebulização do revelador. Observou-se mancha alongada

no centro da placa de alumínio, não apresentando separação para uma possível

caracterização dos flavonóides.

Utilizando a fase móvel, constituída de acetato de etila-água-ácido fórmico

na proporção 80:15:5 houve separação dos flavonóides. Nas frações aquosa,

diclorometano e acetado de etila após a eluição cromatográfica e revelação,

constatou-se a presença de flavonóides e na fração hexânica não houve extração

de flavonóides. Como pode ser observado na Figura 8, a maioria dos flavonóides,

concentram-se na fase acetato e aquosa devido serem os solventes com maior

polaridade que os demais utilizados. Segundo Markhan (1982), os flavonóides são

compostos polares ou moderadamente polares.

Figura 8: CCD do extrato fluido fracionado (A1) de P. alata, a-fração diclometano,

b-fração hexano, c-fração acetato de etila e d-fração aquosa. Fase móvel: acetato

de etila – água - ácido fórmico (80:15:5).

Na CCD do extrato hidroalcoólico de P. alata (A) (Figura 9), comparando-se

com os perfis dos padrões observa-se possível ausência do flavonóide O-

glicosilado rutina, presença de flavonóide C-glucosilado vitexina e/ou isovitexina e

possível ausência do flavonóide quercetina. O mesmo foi observado para o extrato

comercial de P. incarnata e para a tintura farmacopeica de P. actinia na Figura 9.

a b c d

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Figura 9: Cromatografias de camada delgada das amostras: A- (Extrato

hidroalcoólico de P. alata ), T- (Tintura Farmacopeica de P. actinia), C- (Extrato

hidroalcoólico comercial de P.incarnata) e os respectivos padrões 1-Vitexina, 2-

Rutina e 3-Quercetina. Fase móvel: acetato de etila-água-ácido fórmico

( 80:15:5).

Comparando-se os perfis cromatográficos das três espécies de Passiflora,

observa-se que as espécies que mais assemelham-se são P. incarnata e P.

actinia. Após efetuarmos as análises em CLAE, onde também comparamos os

perfis cromatográficos das três espécies, confirmamos este mesmo resultado,

podendo assim verificar que as análises preliminares efetuadas através de CCD

foram satisfatórias.

Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)

Na caracterização de alcalóides de P. alata segundo método da

Farmacopéia Brasileira (1977), utilizando o extrato fluido (A), não foi obtido

resultado satisfatório. A metodologia descreve três manchas apresentando

1 2 3 1 2 3 1 2 3 A T C

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coloração castanho-avermelhada, após nebulização do revelador. No entanto,

não foi observado nenhuma mancha característica para alcalóides.

A CCD realizada com o extrato I, também não apresentou nenhum

resultado positivo para alcalóides. Já com o extrato II, houve o aparecimento de

uma mancha alaranjada, que depois desapareceu, sendo provavelmente um

resultado falso-positivo para alcalóides, já que o revelador Dragendorff utilizado se

complexa com outras substâncias gerando a mesma coloração característica

(WAGNER e BLADT, 1995)

Segundo Reginatto (2000) há um acúmulo de saponinas em P. alata

verificada por CCD com revelador anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento.

A presença de saponinas em P. alata pode ser considerada explicação para o

aparecimento das manchas CCD quando reveladas por Dragendorff, sendo que

este reativo dá falso positivo para compostos terpênicos como limonóides e

saponinas (Biavatti com. pessoal).

5.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Sistemas utilizados na pesquisa de flavonóides C-glicosilados em CLAE

Foram realizadas várias análises em CLAE, utilizando vários sistemas

isocráticos (Quadro 1) e vários sistemas gradientes (Tabelas 1, 2, 3 e 4), com o

objetivo de obter uma separação dos flavonóides e um perfil cromatográfico

satisfatório das preparações extrativas para assim podermos comparar, qualificar

e quantificar os flavonóides possíveis das três espécies de Passiflora.

De todas as fases testadas para pesquisa de flavonóides verificou-se que a

maior dificuldade foi a separação dos flavonóides C-glucosilados isovitexina e

vitexina, devido à semelhança estrutural, por serem isômeros, mudando apenas a

posição da glucose no anel aromático.

Foi observado uma separação satisfatória destes flavonóides utilizando o

sistema isocrático 4 (Quadro 1) e o sistema gradiente (4) (Tabela 4). Sendo que o

sistema isocrático permitiu quantificar o flavonóide C-glucosilado vitexina na

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espécie P. incarnata e o sistema gradiente permitiu quantificar o flavonóide C-

glucosilado isovitexina nas preparações extrativas das três espécies de Passiflora.

O sistema escolhido para ser validado foi o sistema gradiente (4) (Tabela 4).

Comparação entre extrato fluido (A) (Farmacopoea Helvética, VII) de P. alata

coletada no mês de Janeiro e Agosto/2001

Figura 10: Cromatogramas da sobreposição do extrato fluido de P. alata (A) (em

preto) coletadas em Janeiro/2001 com o extrato fluido das folhas coletadas em

Agosto/2001 (em vermelho). Pico 1 – isovitexina. (Sistema gradiente (4) Tabela 4).

A avaliação quantitativa de isovitexina por CLAE e UV entre os extratos

(refluxo e fluido) da planta coletada em janeiro e agosto/2001 em Ilhota SC,

mostra uma diferença significativa entre os diferentes tipos de extratos e entre as

estações do ano da coleta comprovando a influência sazonal na obtenção de

fitoterápicos (Tabela 9).

Um dos fatores que deve ser levado em conta na escolha de um processo

de extração é se o mesmo não altera a composição dos analitos de interesse.

Neste trabalho, tanto a extração por percolação quanto a extração sob refluxo e

aquecimento não alteraram a composição dos flavonóides principais de maracujá

1

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que foram encontrados em quase todas as amostras, variando quantitativamente

de acordo com as condições de extração.

Qimin et al. (1991) afirmam que os dados sobre quantificação de

flavonóides de P. incarnata encontrados na literatura são contraditórios, isto

porque a fração flavonoídica também está sujeita a variações no seu conteúdo: a

época de colheita, parte da planta que constitui a droga, o local de cultivo e a

metodologia de análise empregada são responsáveis por estas variações.

Menguini e Mancini (1988) estudando diversos estágios de desenvolvimento de P.

incarnata, verificaram que o teor de flavonóides é maior nas folhas. A maior

concentração do flavonóide isovitexina ocorre no período que antecede a floração

até o período de floração do vegetal (setembro a março).

Em termos qualitativos o perfil cromatográfico não sofreu alterações com as

estações do ano analisadas (Figura 10).

Tabela 9: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de

flavonóides totais em UV das preparações extrativas de P. alata.

(1) Metodologia segundo FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000) λ=401 nm

(2) Metodologia segundo PETRY et al. (1998) λ=397 nm

(3) Metodologia segundo FARMACOPÉIA HELVÉTICA, (1987) λ=422 nm

Amostra P. alata

CLAE* Isovitexina %

m/m

UV1 Vitexina % m/m

UV 2 Apigenina %

m/m

UV3

Hiperosídeo % m/m

Extrato B (Janeiro)

1,137 (±0,002) 0,470 (±0,001) 0,087(±0,0005

)

0,775 (±0,001)

Extrato A (Janeiro)

0,018 (±0,001) 0,256 (±0,069) 0,054 (±0,001)

0,116 (± 0,0005)

Extrato B (Agosto)

0,018 (±0,006) 0,395(±0,0005) 0,061 (±0,007) 0,405 (± 0,001)

Extrato A (Agosto)

0,007(±0,0007) 0,204 (±0,001) 0,033 (±0,005) 0,084 (±0,0005)

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* Sistema gradiente (4) (Tabela 4), os valores expressam a média de triplicata (± desvio padrão)

Extrato A= fluido P. alata

Extrato B= refluxo

Comparação dos perfis cromatográficos de P. alata, P. incarnata e P. actinia

Foi observada separação razoável dos diferentes compostos através da

CLAE, sendo possível diferenciar os extratos das espécies de Passiflora nos dois

sistemas cromatográficos desenvolvidos (Figura 11).

Os flavonóides são considerados por alguns autores como sendo o maior

grupo de constituintes ativos presentes no gênero Passiflora (Dhawan et al.,

2001), sendo em grande parte C-glicosilados e com polaridade elevada. Essa

característica possibilita uma eficiente separação e análise por meio de CLAE em

coluna de fase reversa (MORAES, 1995).

Para escolha do melhor comprimento de onda (340 nm) foram levados em

consideração os espectros UV de padrões, das agliconas e principalmente dos

flavonóides presentes nas diferentes espécies aqui estudadas. Através do

Detector de Arranjo de Fotodiodos (PDA) obteve-se os espectros UV dos

diferentes componentes dos extratos de P. alata, P. actinia e P. incarnata os quais

foram identificados como flavonóides, devido aos espectros característicos, com

dois máximos de absorção determinados pelo núcleo da benzopirona: um entre

240-285 nm (banda II) e outro entre 300-400 nm (banda I). Em geral a banda II é

atribuída á absorção do anel A e a banda I devido ao anel B. Em flavonas a banda

I aparece entre 304-350 nm e em flavonóis entre 352-385 nm (Zuanazzi, 2001)

(Figuras 15 e 22). Porém não foi possível a identificação dos flavonóides

majoritários da espécie P. alata devido à indisponibilidade dos padrões.

Quando os cromatogramas dos extratos foram comparados e co-injetados

com amostras autênticas de flavonóides, observou-se a presença de vitexina (pico

2) somente nos extratos de P. alata (Figura 11) e P. incarnata (Figuras 11, 19 e

20). O flavonóide isovitexina (pico 1) foi identificado nos extratos das três espécies

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(Figuras 13, 16 e 19). Rehwald et al. (1994) observaram que a isovitexina é um

dos flavonóides majoritários em amostras de P. incarnata. A identificação da

isovitexina feita por meio da comparação dos tempos de retenção de picos e dos

espectros UV foi considerada pelos autores, uma forma segura de identificação de

compostos quando são usados padrões adequados.

No Sistema Gradiente (4), (Tabela 4) foram detectados a presença de 5

picos correspondentes a flavonóides no extrato de P. alata (Figura 13), 6 picos na

tintura farmacopéica de P. actinia (Figura 16) e 11 picos no extrato comercial de

P. incarnata (Figura 19). Neste sistema cromatográfico, nenhuma das espécies

apresentou pico característico de flavonóide com tempo de retenção superior a 25

minutos (Tabela 10).

No sistema isocrático 4 (Quadro 1), foram detectados a presença de

aproximadamente 5 picos correspondentes a flavonóides no extrato de P. alata, 6

picos na tintura farmacopeica de P. actinia e 9 picos no extrato comercial de P.

incarnata. A vitexina foi identificada em maior quantidade em P. incarnata e está

presente na quantidade de traços em P. alata. Já na espécie de P. actinia pode-

se observar a ausência total de vitexina (Figura 11). Neste sistema, a maior

concentração dos picos de flavonóides sai em até 10 minutos e nenhuma das

espécies apresenta pico de flavonóide com tempo de retenção superior a 15

minutos (Tabela 11).

Dessa forma, os dois sistemas permitiram identificar cada espécie e

também permitiram constatar ausência dos demais padrões de flavonóides

(orientina, swertisina e rutina) testados nas preparações extrativas das três

espécies. Há mais semelhança entre as espécies P. incarnata com P. actinia

quando comparados entre si com P. alata, conforme observado através de CCD

(Figura 9).

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Tabela 10: Tempo de retenção referente aos flavonóides investigados nos

extratos de P. alata, P. actinia e P. incarnata. (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).

* (n=3).

tR (min)

Flavonóide Padrão P. alata* P. actinia* P. incarnata*

Isovitexina 17,020 17,109 17,230 17,122

Orientina 11,851 - - -

Swertisina 26,069 - - -

Rutina 22,475 - - -

Tabela 11: Tempo de retenção relativo aos flavonóides investigados nos extratos

de P. alata, P. actinia e P. incarnata. Sistema isocrático 4 (Quadro 1). * (n=3).

tR (min)

n acti

c t

633.68 Tj13.44 246216 7920 0 m4f*Q920 l421f*.8005 l3326.act22* . ct22n acti

37TjET QQq2466Td(n)Tj0 T246216 7920 l246216 0.8005 l2466acti22ct

77TjET QQq2466Td(n)Tj0 T246216 7920 l246216 0.8005 l2466acti22c t

1

6

T

j

E

T

Q

Q

q

2

4

6

6

T

d

(

n

)

T

j

0

T

2

4

6

2

1

6

7

9

2

0

l

2

4

6

2

1

6

0

.

8

0

0

5

l

2

4

6

6

a

c

t

i

2

2

c t

T b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

te

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

e

l

a

1

i

b

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Figura 11: Cromatogramas das três espécies de Passiflora: a) P. alata, b) P.

actinia e c) P. incarnata. Pico 1-Isovitexina, sistema gradiente 4 (Tabela 4) e Pico

2-Vitexina. À esquerda Sistema Gradiente (4) (Tabela 4) e a direita sistema

isocrático 4 (Quadro 1).

1

tR=17,1

1 tR=17,2

1 tR=17,1

2

tR2=13,8

2

tR2=14,08

a

b

c

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5.4 Análise Quantitativa Através de CLAE

Quando se trabalha com amostras complexas, como extratos de plantas, a

separação isocrática geralmente exibe baixa resolução das substâncias eluidas

com menor tempo de retenção e difícil detecção das substâncias eluidas com

maior tempo de retenção, além da demora para sua eluição. Neste caso a eluição

por gradiente permite melhores condições de separação, otimizando os valores de

k de cada pico cromatográfico (PEREIRA, 2002).

Visto serem a maioria dos estudos sobre teor de flavonóides direcionados

para P. incarnata, não foram encontrados dados sobre os flavonóides majoritários

em P. alata. Os métodos em CLAE utilizam flavonas C-glicosiladas como padrões

ou então as amostras são submetidas à hidrólise ácida antes da análise por CLAE

(SCHMIDT e ORTEGA, 1993; QUERCIA et al., 1978; QIMIN et al., 1991). Vários

autores relatam que os flavonóide C-glicosilados resistem a hidrólise ácida

(SCHMIDT e ORTEGA, 1993; PETRY et al., 1998; PEREIRA, 2002). Na análise

quantitativa das três espécies, utilizando o sistema gradiente, observou-se que o

flavonóide C-glucosilado isovitexina foi identificado em maior quantidade no

extrato fluido comercial de P. incarnata (C), seguido da tintura Farmacopéica de P.

actinia (T) e em menor quantidade no extrato fluido da espécie oficial da

Farmacopéia Brasileira P. alata (A) (Tabela 12). Sendo identificado como o

composto majoritário nas espécies P. actinia e P. incarnata (Figuras 16 e 19).

Vários autores relatam a presença majoritária de isovitexina ou vitexina em

amostras de P. incarnata. Rehwald et al. (1994) analisando 4 amostras de P.

incarnata através de CLAE, verificou que os teores de isovitexina diferem entre as

amostras, apesar de constatar que é o flavonóide majoritário na espécie. Após

analisar extrato metanólico em 09 amostras de P. incarnata através de CLAE,

Grice et al. (2001) demonstraram não ser a isovitexina o flavonóide majoritário nas

amostras e sim a vitexina. Já Abourashed et al. (2002), analisando extratos

metanólicos através de CLAE em 115 amostras de diferentes espécies de

Passiflora, entre elas as espécies P.alata, P. actinia e P. incarnata, encontrou

ausência de isovitexina em amostras de P. alata, 0,16% de isovitexina em P.

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actinia, 0,42 e 0,11% em amostras de P. incarnata de diferentes locais. A literatura

demonstra dados coerentes com este trabalho, evidenciando também que os

teores diferem de acordo com a época e o local onde são coletadas as espécies.

Nas comparações do teor de isovitexina nas preparações extrativas sob refluxo e

aquecimento (B) das espécies P. alata e P. actinia, a P. alata demonstrou maior

teor deste composto. A metodologia de extração sob refluxo e aquecimento

demonstrou que extraiu maior teor de flavonóide do que a metodologia através da

percolação (Tabela 12). Também deve-se considerar que as amostras de P. alata

e P. actinia foram coletadas em épocas e locais diferentes.

Outro fator muito importante na quantificação de flavonóides que deve ser

levado em consideração, é a degradação destas substâncias por fungos e

bactérias (Fiura 12). Em um estudo realizado por Schoefer et al. (2003), o fungo

anaeróbio Clostridium orbiscidens demonstrou ser capaz de converter os

flavonóides quercetina, luteolina, apigenina, entre outros em ácido 3,4-

dihidrofenilacético, ácido 3-(3,4-dihidróxifenil) propiônico e ácido 3-(4-hidroxifenil)

propiônico. Em outro estudo realizado por Mamma et al. (2004) foi investigado um

sistema multienzimático produzido por Penicillium decunbens degrada rutina

quebrando seu anel heterocíclico transformando-a em quercetina.

O baixo teor de flavonóide nos extratos fluidos Farmacopéicos de P. alata

(A) e P. actinia (T), visto que estes extratos foram concentrados, em conseqüência

diminuindo seu teor alcoólico e armazenados por mais de 6 meses em geladeira,

pode ser explicado por uma possível degradação por fungos e bactérias,

diminuindo o teor de flavonóides. Possivelmente o extrato fluido comercial de P.

incarnata possua conservantes ou pode ter sido submetido a uma etapa de

esterilização.

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Figura 12: Esquema mostrando degradação microbiana de flavonóides.

quercetinaa

taxifolina alfitonina

floroglucinol

Ác. 3, 4-dihidroxifen

ilacético

R= H apigenina R= OH luteolina

R= H naringenina R= OH eriodictiol

dihidrochalconas R= OH floretina

R= H 3-(4-ácido hidroxifenilpropiônico) R= OH 3-(3,4- ácido dihidroxifenilpropiônico)

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Tabela 12: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide Isovitexina e teor de

flavonóides totais em UV das preparações extrativas das três espécies de

Passiflora (n=3).

(1) Metodologia segundo FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000) λ=401 nm

(2) Metodologia segundo PETRY et al. (1998) λ=397 nm

(3) Metodologia segundo FARMACOPÉIA HELVÉTICA, (1987) λ=422 nm

Amostra

CLAE*

Isovitexina % m/m

UV1

Vitexina % m/m

UV 2

Apigenina % m/m

UV3

Hiperosídeo % m/m

Extrato B P. alata

1,137 (±0,002) 0,470 (±0,001) 0,087(±0,0005) 0,775 (±0,001)

Extrato A 0,018 (±0,001) 0,256 (±0,069) 0,054 (±0,001)

0,116 (±0,0005)

Extrato T 0,028 (±0,002) 0,083 (±0,00) 0,022 (±0,0005) 0,025 (±0,00)

Extrato B P. actinia

0,631 (±0,001) 0,348 (±0,001) 0,079 (±0,00) 0,668 (±0,012)

Extrato C 1,198 (±0,009) 0,164 (±0,00) 0,023 (± 0,003)

0,032 (±0,0009)

* Sistema gradiente (4) (Tabela 4), os valores expressam a média de triplicata (± desvio padrão)

Extrato A= fluido P. alata Extrato B= refluxo Extrato T= tintura P. actinia Extrato C= fluido comercial P. incarnata

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Figura 13: Cromatogramas de: a) Extrato fluido de P. alata (A) e Padrões: picos 1-

isovitexina, 2-vitexina, 3-orientina, 4-rutina e 5-swertisina (sistema gradiente (4),

Tabela 4)

1

tR=17,1

tR=17,0

1

2

tR=11,8

4 tR=22,4 5 tR=26,0

3

a

OOH

OH O

OH

Glu

isovitexina

O

Glu

OH

OH O

OH

OH

orientina

OOH

OH O

OH

OH

O glu-rha

rutina

O

OH O

OH

Glu

OCH3

swertisina

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Figura 14: Cromatograma do extrato fluido de P. alata (A) e ao lado pode ser

visto o espectro de UV de: 1- Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).

Figura 15: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina + 2-vitexina e

ao lado pode ser visto o espectro: 1-Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).

1

1

2

OOH

OH O

OH

Glu

isovitexina

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Figura 16: Cromatogramas de: b) Tintura de P. actinia (T). Padrões: picos 1-

isovitexina, 2- vitexina, 3- orientina, 4- rutina e 5- swertisina (Sistema Gradiente

(4), Tabela 4)

tR=17,23

tR=17,02

1

1 tR=11,8

2

3 tR=22,4

tR=26,0

b

4 5

O

O

O

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Figura 17: Cromatograma da tintura de P. actinia (T) e ao lado pode ser visto o

espectro de UV de: 1- Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).

Figura 18: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina+2-vitexina e

ao lado pode ser visto o espectro: 1-Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).

1

1

2

OOH

OH O

OH

Glu

isovitexina

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Figura 19: Cromatogramas de: b) Extrato fluido de P. incarnata (C). Padrões: pico

1-isovitexina, 2- vitexina, 3- orientina, 4- rutina e 5- swertisina (Sistema Gradiente

4, Tabela 4)

1

tR= 17,12

3 tR=11,8

tR=17,0

1

2

5 tR=26,0

c

4 tR=22,4

2

O

Glu

OH

OH O

OH

OH

orientina

O

OH O

OH

Glu

OCH3

swertisina

OOH

OH O

OH

OH

O glu-rha

rutina

OOH

OH O

OH

Glu

isovitexina

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Figura 20: Cromatograma do extrato fluido de P. incarnata (C) e ao lado pode ser

visto o espectro de UV de: 2- vitexina (Quadro 1,Sistema isocrático 4).

Figura 21: Cromatograma do extrato fluido P.incarnata (C) e ao lado pode ser

visto o espectro de UV de: 1- isovitexina (Sistema Gradiente (4), tabela 4).

5.5 Análise Quantitativa Através de CLAE (Sistema Isocrático 4, Quadro 1)

As análises realizadas através do sistema isocrático, apresentaram uma

separação satisfatória dos flavonóides vitexina e isovitexina (Figura 22),

possibilitando a quantificação da vitexina nas amostras de P. alata e P. incarnata.

1

2

tR=14,081

OH

OH

Glu

OH

O

O

Vitexina

2

1

Figura 22: Cromatograma da co-injeção dos padrões (1-isovitexina e 2-vitexina).

Ao lado espectros de UV de: 2- Vitexina (Quadro 1, Sistema isocrático 4).

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Foi verificado ausência de vitexina em P. actinia e também ausência dos demais

padrões testados. Tanto nos extratos sob refluxo (B) como nos extratos sob

percolação de P. alata (A), a vitexina apareceu em baixa quantidade (traços),

ficando abaixo da menor concentração da curva utilizada para o doseamento,

sendo possível quantificá-la apenas no extrato fluido comercial de P. incarnata

(Tabela 13 e Figura 24).

Ainda existem poucos estudos sobre teores de flavonóides em P. alata

através de CLAE, sendo a maioria direcionados para P. incarnata. Tais estudos

relatam a presença de teores baixos ou ausência de vitexina em amostras de P.

alata e teores maiores em amostras de P. incarnata.

Ulubelen e Oksu (1982), analisando teores de flavonóides através de CLAE

em amostras de P. pittieri, P. alata e P. ambigua verificaram que a P. alata

possuía o menor teor de vitexina entre as três espécies. Abourashed et al. (2002),

analisaram extratos metanólicos através de CLAE em 115 amostras de diferentes

espécies de Passiflora, entre elas as espécies P.alata, P. actinia e P. incarnata.

Estes autores encontraram ausência de vitexina em amostras de P. alata e P.

actinia e 0,06% deste composto para amostras de P. incarnata.

Quercia et al. (1978) através de um estudo em CLAE em amostras de P.

incarnata encontraram um teor de vitexina de 0,226% em extrato pilular e 2,24%

em amostras de extratos pulverizados. Grice et al. (2001) após analisarem 9

amostras de P. incarnata (extratos metanólicos) encontraram teores que variam de

16,3 a 2.301,5 µg/g de vitexina.

Segundo a Resolução número 89, de 16 de março de 2004 da ANVISA na

“Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos” a vitexina ou isovitexina são os

flavonóides marcadores da espécie P. incarnata apontada como forma de uso a

tintura ou extrato das folhas, indicando como dose diária 15 a 100 mg de

vitexina/isovitexina.

Os estudos sugerem um teor menor ou ausência de vitexina em P. alata e

P. actinia comparando-se com P. incarnata. Sendo que os teores podem variar de

acordo com o método de extração, local, época de colheita da planta e possível

degradação de flavonóide por fungos e bactérias.

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Tabela 13: Teor encontrado do flavonóide C-glucosilado vitexina,

Amostra tR (min)* g de flavonóide/ %

± SD

Extrato A 13,833 Traços

Extrato B (P. alata) - Traços

Extrato T - -

Extrato B (P. actinia) - -

Extrato C 14,081 0,312 ± 0,0009

(Sistema Isocrático 4, quadro 1, n*=3). Extrato A= fluido P. alata Extrato B= refluxo Extrato T= tintura P. actinia Extrao C= fluido comercial de P. incarnata

5.6 Validação Analítica

O padrão analítico utilizado no procedimento de validação apresentou

resposta linear, cuja curva apresentou valores de R2 ≥ 0,999 com intercepto em y

próximo a zero para isovitexina (Figura 23).

Os dados de recuperação são úteis para avaliar a eficiência do método

analítico proposto, sendo desta forma importante avaliá-la em di ão rt ur

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adicionada, resultou em uma média de 98,67% de recuperação, mostrando que há

uma pequena variação de 1,33%. O coeficiente de variação ficou relativamente

baixo, em torno de 0,01. Com isto tornamos este método válido, pois o valor

encontrado está dentro do limite que é de 2% de variação (GREEN, 1996).

O limite de Quantificação (LQ) corresponde ao menor nível de concentração

que pode ser quantificado com precisão e exatidão aceitáveis. O valor encontrado

foi de 1,29 µg/ml apresentando uma sensibilidade satisfatória (Tabela 14).

A Figura 24 contém a curva de calibração realizada para o flavonóide

vitexina o qual não foi validado devido estar presente em P. alata na forma de

traços.

Figura 23: Curva de calibração de Isovitexina (padrão secundário) em MeOH 50%

a 340 nm (y= 2.11816e-008x-0.000543441)

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Figura 24: Curva de calibração de vitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a

340 nm (R2= 0,999619). (y=2,29831 e-008x+0,000350931).

Tabela 14: Ensaio de Recuperação do método, calculada para o extrato fluido de

P. alata (A) fortificado com isovitexina

5.7 Doseamento Espectrofotométrico do Teor de Flavonóides Totais A maneira mais precisa e exata de se identificar e quantificar flavonóides

em produtos naturais é a análise por HPLC. Entretanto, quando se pensa em

controle de qualidade, é conveniente a introdução de alternativas mais simples e

baratas, pois nesses casos requerem-se procedimentos que permitem a análise

rápida de numerosas amostras, em laboratórios geralmente modestos no que se

refere ao instrumental instalado e utilizado por analistas na maioria das vezes

sem formação superior. Uma das técnicas que se enquadram bem nesse contexto

é a determinação de flavonóides totais por espectrometria no UV (MARCUCCI,

1995).

O uso do cloreto de alumínio para a determinação da quantidade de

flavonóides totais não é, no entanto, um procedimento isento de limitações. O

método é preciso, isto é, ele é reproduzível, fornecendo desvios pequenos entre

um ensaio e outro com a mesma amostra. No entanto ele pode ser pouco exato,

BalãoVolumeAmostra

(mL)

VolumePadrão

(µL)

Conc.Teóricoadicion.(µg/mL)

Conc.TeóricoTotal

(µg/mL)

Conc.PráticoTotal

(µg/mL)

Conc.Práticoadicion.(µg/mL)

Coef. de

variação

Desviopadrãorelativo

%

1 3 625 5 10 10,34 4,96 0,020 0,4 99,20

2 3 750 7 12 12,31 6,93 0,0133 0,2 99,0

3 3 1,12 10 15 15,16 9,78 0,0156 0,15 97,80

4 3 - - 5 5,38 - 0,0155 - -

5 - 625 5 5 5,21 5,21 0,0133 - -

Média 98,67

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ou seja, o valor que ele fornece pode ser diferente (geralmente inferior) em relação

à quantidade de flavonóides totais realmente presente na amostra analisada

(MARCUCCI, 1995).

Neste trabalho foram realizadas análises do teor d

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A metodologia da Farmacopéia Helvética (1987) que doseia os flavonóides

totais (λ = 422 nm) em termos de hiperosídeo (O-glicosilado) (ver Figura 7, pág 40

e Tabela 12, pág 55) é um dos métodos de quantificação do teor de flavonóides

totais mais freqüentemente utilizado (DEUTSCHES, 1992). O método é geral e

preconizado para P. incarnata e outras espécies vegetais ricas em flavonóides.

Contudo, diversos autores assinalam para o mesmo diversas fontes de erro

analítico, decorrentes do método ter sido desenvolvido, de forma específica, para

análise de flavonóides O-glicosilados, mas não para flavonóides C-glicosilados,

que resistem a hidrólise ácida (SCHMIDT e ORTEGA, 1993). Além de tudo, o

método apresenta uma metodologia complexa, a amostra é extraída sob refluxo e

aquecimento utilizando como líquido extrator acetona e ácido, na seqüência é

ainda submetida a uma extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila e a

fração aquosa, onde estão presente os flavonóides encontrados freqüentemente

em Passiflora, é desprezada utilizando-se como solução exame a fração acetato

de etila complexada com cloreto de alumínio.

Nesta metodologia, envolvendo diversas etapas, os resultados obtidos das

folhas das espécies de P. alata e P. actinia foram coerentes com o referenciado

pelo método (mínimo 0,3% de flavonóide em termos de hiperosídeo para P.

incarnata). As folhas e o extrato fluido de P. alata (janeiro/2001) possuem maior

teor de flavonóides totais analisadas de acordo com esta metodologia.

Segundo a metodologia da Farmacopéia Britânica, (2000); onde o líquido

extrator é etanol 60%, a amostra não é submetida a hidrólise ácida. A metodologia

propõe o uso do reagente oxalo-bórico no lugar do cloreto de alumínio para a

formação do complexo a ser analisado por espectrofotometria. De acordo com a

literatura (Glasl, 1985), este tipo de complexação é mais específica para flavonas,

sendo portanto sujeito a menos erros analíticos. Os resultados obtidos foram

inferiores ao referenciado pelo método (1,5% de flavonóides totais em termos de

vitexina para P. incarnata). Comparando-se com as outras duas metodologias

testadas, a metodologia da Farmacopéia Britânica (2000) foi a que apresentou

teores maiores para os extratos de P. alata (A), P. incarnata (C) e P. actinia (T)

(Tabela 12).

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As três metodologias analisadas para teor de Flavonóides totais em

espectrofotométricos de UV apresentam em comum: a) teores maiores para

amostras de P. alata coletadas em janeiro do que as coletadas em agosto; b)

teores maiores para amostras de extratos sob refluxo e aquecimento do que

extratos fluidos e c) teor maior para o extrato fluido de P. alata do que para extrato

fluido de P. incarnata e tintura de P. actinia (Tabela 12).

Na comparação dos métodos farmacopéicos com a metodologia

desenvolvida em CLAE observa-se divergências nos resultados. A quantificação

por CLAE apresenta vantagem da separação prévia dos compostos e

possibilidade de quantificação isolada de alguma substância de interesse frente

aos métodos espectrofotométricos. Rehwald et al. (1994) em seu estudo também

desenvolveram método em CLAE para qualificar e quantificar flavonóides em P.

incarnata e compararam os resultados com teor de flavonóides totais segundo a

metodologia espectrofotométrica da FARMACOPÉIA HELVETICA (1987). Neste

último a maioria dos resultados apresentou teores totais inferiores ao teor de um

único flavonóide analisado em CLAE. As quatro edições da Farmacopéia

Brasileira incluem monografias das folhas de P. alata sem no entanto, preconizar

um método analítico quantitativo para avaliação fidedigna da qualidade da droga.

Estes dados demonstram que há uma necessidade de reavaliação nos

métodos farmacopéicos para doseamentos de flavonóides totais.

5.8 Pesquisa de Alcalóides Através de CLAE Sistemas utilizados na pesquisa de alcalóides β-carbolínicos em CLAE Para desenvolver o cm BTá/R722 12 Tfá1 0 0 1 332.56 233.04 Tmá(b)TjáET.024 Tdá(o)á(a)Tjá6.72 0 72 0 Tdá0 TcTwá( )Tjá13.r mo76 Tmá1.344 Twá( )0 Tdá0.024 T 1 332.56 233.04 Tmá(b)TjáE 0 Tdá(oTjá13.44 0 Tdá(t)20.04 0 Tdá(x)Tjá5.87998 0 Tdá(t)Tjáá5.87998 0 Tdá(o)Tjd2.63999 Twá(r )Tjá10 Tdá(u)Tjá6.72 0 Tdá(i)Tjá2.63999 0 Tdá(dá(e)Tjá6.0 Tdá(u)Tjá6.72 0 Ta )Tjá10Tdá(de)Tjá13.44 0 Tdá0 Tcá1.344 0 Tdá(F)Tjá7.32 0 Tdá(l)Tjá2.63997 á(o)Tjá6.72 0 Tdá0 má10 79200Tdá(n)Tjá6.10 10 má10 7920 lá6120 7920 lá6120 10 láháW náq 10 0 0 10 0 0 cm BTá/R721 12 Tfá1 0 0 1 85.12 219.36 Tm17.096 Twá(.52 0 Tdá(a)Tjá6.72 0 Tdá0 Tcá0.9846.59998 0 Tdá(n)Tjá6.72 0 Tdá(v)Tjá5.87998 0 0 0 cm BTá/R719 já2.63999 0 Tdá(t)Tjá3.2399 0 Tdá0 Tcá(s )Tjá9.35999 0 Tdá0.049995 0 Tdá(e )Tjá13.32 0 Tdá(r)9 0 Tdá(a)Tjá6.72 0 Tdá0.024 T Tdá0 Tcá2.304 Twá(s á3.23999 0 Tdá0.936 Twá(ou )e)Tjá26.76 0 Tdá(s)8.03999 0 Tdá(a).35999 0 Tdá(o)Tjá6.72 0 Tdá(t)Tjá3.35920 lá6120 10 láhs)Tjá6 0 Tdá(u)Tjá6.72 0 Tdn999 0 Tdá(í)Tjá3á(g)Tjá6.59998 0 Tdá(i)Tjá2.63999 0 Tdá(a)Tj )TjáET QáQáqá10 10 má10 7920 ljá17.52 0 Tdá(n)Tjá6.71997 0 Tdá(t)cá(ado)Tjá20.16 (t)Tjá3.35999 0 Tdá(e)Tjá6.72 0 Tdá(m)Tjá9.95999 0 Tdá(a)Tjá6.72 0 Tdá0.02Tjá6.72 0 T Tdá(a)Tjá6o

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aparecem apenas no comprimento de onda de 240 nm, que foi o de maior

absorção.

Na Figura 25, percebe-se quatro picos característicos de alcalóides, pico 1

do alcalóide harmalol, pico 2 do harmol, pico 3 do harmalina e pico 4 uma mistura

de harmana e harmina. A fase utilizada nesta análise foi baseada na metodologia

descrita por Rehwald, Sticher e Meyer (1995), que utililizou como fase móvel

tampão fosfato em pH 8,0 e metanol-acetonitrila, na proporção 1:1, no

desenvolvimento das suas análises.

A estrutura básica dos padrões harmana (8) e harmina (12) são iguais,

diferenciando-se apenas por uma ligação de um radical –OCH3, na estrutura do

padrão harmina. Provavelmente esta semelhança leva a retenção dos padrões

no mesmo tempo.

(8) (12)

Na tentativa de separação dos alcalóides harmana e harmina, foram feitas

alterações nos gradientes de concentração da fase móvel utilizada anteriormente,

aumentando a concentração de metanol e diminuindo a de acetonitrila. Como

pode-se perceber na Figura 26, houve um adiantamento nos tempos de retenção

dos padrões, não havendo a separação dos padrões harmana e harmina.

A separação dos padrões harmana e harmina foi realizada após uma

pequena modificação nas concentrações de metanol e acetonitrila (metanol 32% e

acetonitrila 12%), (Tabela 5) como pode ser observado na Figura 27, que

apresenta os tempos de retenções para cada padrão, sendo o do harmolol 6,6

NN

CH3H

harmana

NN

CH3H

OCH3

harmina

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min, harmol 11,4 min, harmalina 16,5 min, harmana 18,4 min e harmina 19,1min. A

Figura 28 apresenta os espectros em UV de cada padrão.

Figura 25: Cromatograma desenvolvido em CLAE, da mistura dos padrões ß-

carbolínicos, pico 1= harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina e pico 4=

harmana + harmina. Fase móvel metanol 22% , acetonitrila 22% e tampão fosfato

56% pH 8,0.

Figura 26: Cromatograma, da mistura dos padrões ß-carbolínicos, pico 1=

harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina e pico 4= harmana + harmina. Fase

móvel (Tabela 6)

1 2 3

4

1 2

3

4

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Figura 27: Cromatograma, da mistura dos padrões ß-carbolínicos, pico 1=

harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina, pico 4= harmana e pico 5= harmina.

Fase móvel (Tabela 5).

1 2

3 4

5

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A B

C D

E

NN

CH3H

OH

harmalol

NN

CH3H

OH

harmol

NN

CH3H

OCH3

harmalina

NN

CH3H

harmana

NN

CH3H

OCH3

harmina

Figura 28: Espectros em UV dos padrões de alcalóides. A= harmalol, B= harmol, C=

harmalina, D= harmana e E= harmina.

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O extrato fluido de P. alata (A), foi analisado segundo metodologia descrita

na Tabela 5. Comparando-se o cromatograma do extrato com o cromatograma

dos padrões, percebe-se que não há picos caracteristícos de alcalóides, não

coincidindo os tempos de retenção. O cromatograma demonstra apenas um pico,

sendo que este apresenta retenção antes de 6 min, e os padrões começam a

serem detectados a partir deste tempo (Figura 29).

Figura 29: Comparação do cromatograma do extrato P. alata (A) e dos padrões

(B), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5= harmina. Fase móvel

metanol 32%, acetonitrila 12% e tampão fosfato (pH 8,0) 56%.

A

B

1 2

4 3

5

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Os extratos a quente (III) e a frio (IV) segundo item 4.3.4, pág 27, também

foram analisados segundo método descrito na Tabela 5. Observando os

cromatogramas dos extratos com o dos padrões, percebe-se que não há picos

definidos, além da linha de base estar alterada e quando observado o perfil dos

espectros dos extratos comparado com o dos padrões nota-se que não há

semelhança (Figura 30).

Figura 30: Comparação do cromatograma extrato a quente (III) (A), extrato a frio

(IV) (B) e padrões (C), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5=

harmina. Fase móvel (Tabela 5)

C

A B

1 2

3 4

5

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Visto que as análises dos extratos anteriores não apresentaram

resultados positivos para presença de alcalóides, foram desenvolvidos novos

extratos, segundo o método de extração clássica para alcalóides ácido/base,

denominamos extrato I e extrato II (descritos nos itens 4.3.4, pág 26 e 27), o último

é mais purificado. As análises foram realizadas em sistema gradiente, com fase

móvel descrita na Tabela 5. Comparando os cromatogramas do extrato I, extrato II

e dos padrões, percebe-se que os cromatogramas dos extratos são semelhantes,

apresentando picos mais definidos, se comparado ao dos cromatogramas

anteriores. Quando comparados com o cromatograma dos padrões, verifica-se

que não há semelhança nos tempos de retenções e o perfil dos espectros não é

caracteristico. (Figura 31).

A literatura relata que, o gênero Passiflora é composto principalmente por

alcalóides e flavonóides. A investigação dos compostos alcaloídicos presentes na

planta, é em função de que esses alcalóides foram associados à atividade

farmacológica de muitas plantas medicinais que atuam sobre o sistema nervoso

central (PEREIRA; VILEGAS, 2000; REHWALD; STICHER; MEIER, 1995).

Atualmente Dharwan, Kumar e Sharma (2001), relatam que ainda não está

claramente descrito qual constituinte, ou grupo de constituintes, é responsável

elos efeitos sedativos e traquilizantes do gênero.

Os primeiros estudos relatados na literatura (Bennati, 1971) que detectaram

alcalóides no gênero Passiflora utilizaram métodos mais antigos (CCD) e não

muito precisos. Grice et al. (2001) desenvolveram um único método em CLAE

para análise simultânea de flavonóides C-glicosilados e alcalóides β-carbolínicos

(harmano, harmina e harmol) em 9 amostras de P. incarnata. Os resultados

obtidos mostraram ausência de harmol em todas as amostras, traços de harmana

em 6 amostras, ausência de harmine em 2 amostras e presença nas demais em

pequenas quantidades. As contradições de informações levam a crer que os

alcalóides não são de fato os compostos predominantes no gênero Passiflora e

provavelmente não estão envolvidos com a atividade farmacológica observada.

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Figura 31: Comparação do cromatograma do extrato I (A), extrato II (B), padrões

(C), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5= harmina. Fase móvel

(Tabela 5)

C

A B

1 2

3 4

5

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