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20-09-2009
1
Cândida Elsa Frias MendesOrientador: Manuela Grazina
Instituto de Bioquímica e Centro de Neurociências e Biologia CelularFaculdade de Medicina de Coimbra, Pólo III – Subunidade I de Ensino
doença do CNS mediada pelo
Sistema Imunitário.
Afecta mais de 2 milhões pessoas;
Risco da doença associado à latitude;
Risco menor em crianças e idosos;
Risco maior em mulheres e população caucasiana.
http://sofija.wordpress.com/2007/01
Estudos populacionais apontam para a associação do HLA DR15, DQ6 com a MS, com associações mais fortes entre os descendentes do norte da Europa.
loci candidato: 6p21.3
mtDNA na MS:
Elevada transmissão da doença de mãe para filho.
Associação entre LHON e MS.
Mutações de LHON nos nucleótidos 3460 e 11778 em doentes com MS.
20-09-2009
2
Fase I: Assintomática; inflamação frequente, desmielinização, alterações desecção axonal, plasticidade e remielinização.
Fase II: Continuação da inflamação e desmielinização persistente, RRMSFase III: Inflamação pouco frequente, degenerescência axonal crónica,
gliose, SPMS
fonte: http://www.mult-sclerosis.org/msprognosis.html
RRMS: Relapsing- RemintingSPMS: Secondary Progression
Fase I
Fase II
Fase III
Nature Clinical Practice Neurology (2006) 2, 201-211
Ocorrem lesões axonais agudas desmielinizantes.
Principal candidato a mediador tóxico: NO.
www.anem.org.pt/menu-anem/em.mielina.htm
Características neuropatológicas:
desmielinização;
neurodegenerescência neuronal.
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Ciclo acido cítrico:
NADH
FADH2
Dadores de –es para a CRM
Fosforilação oxidativa mitocondrial:
transferência de –es a partir do
NADH para gerar ATP
Características gerais:
2 membranas fosfolipídicas:
- externa (lisa)
- interna (dobra-se formando vilosidades,
chamadas cristas).
Matriz mitocondrial:
-Proteínas
-Ribossomas
-DNA mitocondrial (forma circular):
37 genes
13 peptídeos da CRM
2 rRNAs
22 tRNAs
Produção mitocondrial de O2- e H2O2
UQH. + O2 —‣ UQ + H+ + O2-
FMNH. + O2 —‣ FMN + H+ + O2-
H+ + O2. + O2
. —‣ H2O2 + O2
O2- + H2O2 —‣ O2 + OH- + OH.
Produção mitocondrial
de NO
NO+ O2- —‣ ONOO-
ONOO- + H+ —‣ ONOOH
ONOOH —‣ OH. +NO2.
Adaptado de Navarro A, Boveris A, Am J Physiol Cell Physiol 292: C670-C686, 2007
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ROS/RNS
Inibição da CRM
Diminuição ATP
Gradiente de Na+ e
diminuição de ΔΨ,
abertura MPT
Libertação
glutamato
Activação
NMDA-R
Morte por
excitotoxicidade
Libertação cit c
Caspases
Apoptose
Necrose
Adaptado de Brown and Borutite, Free Rad Biol Med, 33 (11), 2002
[Esquema adaptado de Mao et al, 2009].
ROS e RNS:
danos oxidativos no mtDNA;
diminuição da actividade enzimática dos complexos da MRC;
peroxidação lipídica;
peroxidação das proteínas constituintes da mielina;
nitrosilação dos resíduos de tirosina.
ROS desestabilizam as bainhas de mielina através da peroxidação dos lípidos das suas membranas.
20-09-2009
5
Possivelmente a morte neuronal pode surgir em resultado da exposição dos axónios a NO., em particular devido à sobrecarga de iões Na+, resultante do impulso nervoso.
Nature Clinical Practice Neurology (2008) 4, 159-169
Aumento de
radicais
livres
Aumento
danos
oxidativos
no mtDNA
Mutações
podem alterar
as funções
mitocondriais
Diminuição
dos níveis
energéticos da
célula
Mitocôndria
disfuncional
Axónios
desmielinizados,
mais susceptíveis
a lesões
Processo
inflamatório na
MS
Analisar o envolvimento funcional da OXPHOS na MS.
Investigar a correlação destes dados com os estudos de genética molecular do mtDNA.
20-09-2009
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Contribuir para o esclarecimento da etiopatogenia da MS;
Encontrar novas ferramentas de diagnóstico.
Doentes e controlos
Doentes: seguidos no serviço de
Neurologia dos HUC; têm MS definitiva.
Controlos: sem doenças neurológicas.
Número de indivíduos 50
Sexo F/M 35F/15M
Idade média (anos) ± SD (mín-máx) 40,6 ± 10,9 (22–61)
EDSS média (anos) ± SD (mín-máx) 4,5 ± 2,3 (1–8)
Idade de início média (anos) ± SD (mín-máx) 29,8 ± 10,5 (15-52)
Duração média da doença (anos) ± SD (mín-máx) 13,4 ± 8,4 (2-34)
Isolam-se linfócitos a partir de sangue total em EDTA.
As actividades espectrofométricas dos complexos da MRC e da CS são medidas de acordo com (Rustin et al, 1994) usando um espectrofotometro de duplo comprimento de onda (Aminco 2000).
Faz-se o estudo dos complexos II, III, IV e do segmento II+III da MRC.
A CS é usada como enzima mitocondrial de referência.
A actividade é considerada deficiente quando ≤ 40% do valor médio de referência corrigido para a CS (Grazina M, Tese Doutoramento, 2004).
20-09-2009
7
30,4
78,1
133,5
26,6
76,8
22,5
105,1
75,9
39,5
100,6
0
20
40
60
80
100
120
140
160
CII CIII CIV CII+III CS
Actividade enzimática específica
Controlo
Doentes MS
0,35
0,93
1,69
0,55
0,23
1,17
0,75
0,4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
CII/CS CIII/CS CIV/CS CII+III/CS
Actividade enzimática corrigida para a CS
Controlo
Doentes MS
**
***
*
**
*
0102030405060
52
40
2 0 2 4
Doentes MS (%)
Número de indivíduos 87
Sexo F/M 61 F/26 M
Idade (anos) ± SD (mín-máx) 43,3 ± 10,8 (22-63)
EDSS (anos) ± SD (mín-máx) 3,7 ± 2,3 (1-8)
Idade de início (anos) ± SD (mín-máx) 31,9 ± 10,7 (15-57)
Duração da doença (anos) ± SD (mín-máx) 11,3 ± 8,7 (1-39)
Teste exacto de Fisher:
- não existem diferenças estatisticamente significativas.
Haplogrupos mtDNA
20-09-2009
8
44%
56%
Doentes MS (n=87)
Ausente
Presente
As mutações patogénicas 3460,11778,14459, 14484, não
foram detectadas em nenhuma amostra. χ2 = 14,10; p** = 0,0070
Variação de sequência do mtDNA Controlos (n=50)
(n) frequência Doentes MS (n=87)
(n) frequência
ausente (43) 86% (38) 43.7%4216T>C (3) 6% (20) 23%4917A>G (2) 4% (10) 11.5%13708G>A (1) 2% (15) 17.2%15257G>A (1) 2% (4) 4.6%
p*** < 0,0001 (teste exacto de Fisher)
86%
14%
Controlos (n=50)
Ausente
Presente
HaplogrupoDoentes MS
(n=87)
Doentes MS
(n=50)
H 27 (31%) 14 (28%)
JT 20 (23%) 11 (22%)
OUTROS 40 (46%) 25 (50%)
χ2 = 0,2197; p = 0,8960
Alterações mtDNADoentes MS
(n=87)
Doentes MS
(n=50)
Sem 38 (43,7%) 26 (52%)
Com 49 (56,3%) 24 (48%)
χ2 = 0,8834; p = 0,3473
χ2 = 4,857; p=0,0881
Teste exacto de Fisher:
não existem diferenças estatisticamente significativas.
8%
20%16%
6%
76% 74%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
MRC com défice MRC normal
Distribuição dos haplogrupos em doentes com
MRC deficiente ou normal
H
JT
OUTROS
Fre
qu
ên
cia
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9
χ2 = 7,898; p**=0,0050
TEF: p** = 0,0074
OR = 8,571
RR = 3,789
Existe associação entre estas duas variáveis.
Distribuição de doentes com ou sem alterações ao nível do mtDNA no grupo de doentes com/ sem défice na MRC
92,3%
58,3%
7,7%
41,7%
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
100,0%
MRC normal MRC com défice
Sem alterações no mtDNA
Com alterações no mtDNA
Os resultados obtidos com o presente trabalho reforçam a hipótese da disfunção mitocondrial como resultado de lesão oxidativa na MS.
As variações do mtDNA estudadas conferem susceptibilidade para a doença (RR 3,8).
Dado o papel central da mitocôndria em tantas funções celulares importantes, incluindo a produção de energia, é razoável que a sua disfunção seja um contributo chave no processo neurodegenerativo que ocorre na doença.
Tratamentos neuroprotectores e dirigidos à mitocôndria, ou a combinação de neuroprotectores e imunomodeladores poderiam representar uma abordagem terapêutica mais racional na MS.