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Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto Diferenciação do Tubo Neural Ana Isabel Pereira de Azevedo

Diferenciação do tubo neural

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Page 2: Diferenciação do tubo neural

Biologia Celular e Molecular

Porto 2005

Índice

Pág.

1. Introdução 3

2. O desenvolvimento embrionário 3

3. Regulação molecular da indução neural 4

4. Neurulação 5

5. Diferenciação do tubo neural 7

5.1 Diferenciação céfalo-caudal 7

5.2 Diferenciação dorso-ventral 7

6. Malformações associadas ao desenvolvimento do tubo neural 9

6.1 Definição 9

6.2 Doenças 9

7. Investigação 10

8. Conclusão 12

9. Bibliografia 12

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1. Introdução

A presente monografia, de carácter opcional, insere-se no âmbito da disciplina de Biologia

Celular e Molecular e, por meio dela, temos como objectivo alargar o nosso conhecimento, bem

como o de outros, acerca de uma etapa específica do desenvolvimento embrionário, a diferenciação

tubo neural e sua importância no desenvolvimento do sistema nervoso.

A nossa escolha recaiu neste tema tanto pela sua importância no contexto das matérias

abordadas em biologia do desenvolvimento, como pela relevância que tem na nossa futura

profissão. De facto, é nossa convicção que compreendendo os mecanismos que estão subjacentes a

uma normal diferenciação do tubo neural consigamos, mais facilmente, perceber o que está alterado

quando surgem malformações fetais associadas ao tubo neural.

Neste sentido, o nosso trabalho organiza-se de forma a darmos umas breves ideias sobre o

que se passa até o embrião chegar a ser tridérmico, focando-se, posteriormente, nos mecanismos

moleculares que regulam a indução neural e de que forma é que esta se processa. Reservaremos um

espaço para apresentação de algumas malformações conhecidas por défices de mecanismos que

explicitaremos. Optaremos, também, pela introdução de um capítulo no qual seleccionaremos

alguns dos trabalhos e avanços em investigações nesta área.

2. O desenvolvimento embrionário

O desenvolvimento embrionário começa após a fecundação, compreendendo todo o

processo desde a formação do zigoto até ao nascimento. Inicia-se com uma série de divisões

mitóticas do zigoto, originando a mórula que, ao ser implantada no útero, se modifica, havendo

diferenciação das células em dois grupos: a mais externa, o trofoblasto, que mais tarde, se diferencia

em citotrofoblasto e sinciotrofoblasto, enquanto que a mais interna, o embrioblasto, se diferencia

em hipoblasto e epiblasto, que originará posteriormente, na gastrulação, os três folhetos

embrionários: endoderme, mesoderme e ectoderme1,2.

Após a gastrulação, caracterizada por movimentos morfogénicos intensos, forma-se o

embrião tridérmico. Os três folhetos embrionários sofrem diferenciação celular, originando-se os

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diferentes tecidos, os quais se inter-relacionam formando órgãos e sistemas de órgãos. Esta fase

denomina-se organogénese; é iniciada com a neurulação, que culmina na formação do tubo neural

(que originará o encéfalo e espinhal medula) e da crista neural (na base dos sistemas nervosos

periférico e autónomo), sendo induzida por um conjunto de interacções celulares. Segue-se a

diferenciação do tubo neural, num processo rápido, em que ocorre diferenciação a diversos níveis,

podendo distinguir-se diferenciação céfalo-caudal de dorso-ventral1,2.

3. Regulação molecular da indução neural

Os organismos são estruturas complexas compostas por diversos tipos de tecidos, os quais,

necessariamente, têm de comunicar entre si para que se possam desenvolver como um todo

estruturado. Também durante o desenvolvimento embrionário as células comunicam entre si e

transmitem sinais através de processos de indução. Por este mecanismo, um determinado tecido

produz um sinal que envia a outro, provocando uma resposta que, de alguma forma, altera o rumo

do seu desenvolvimento. Existem dois tipos principais de interacções entre as células: interacção

parácrina e justácrina. Em relação à primeira, podem agrupar-se os seus factores em quatro famílias:

o Fibroblast Growth Factor (FGF): associados à angiogénese,

desenvolvimento da mesoderme e condução axonal, entre outros;

o Hedgehog Family: sendo o mais conhecido desta família o Sonic Hedgehog,

responsável pela modelação do tubo neural em vertebrados e indução da formação de diversos tipos

de neurónios;

o Wnt Family: importantes no estabelecimento da polaridade nos membros dos

vertebrados;

o TGF-β super Family: que inclui as famílias TGF-β, activina, BMP e Vg1,

entre outras proteínas. As proteínas BMP são capazes de controlar o ciclo celular de outras células,

bem como a sua migração e diferenciação2.

A BMP-4 assume um papel fundamental na indução neural. O seu bloqueio promove a

indução neural enquanto que, na sua presença, a ectoderme origina epiderme e a mesoderme forma

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a mesoderme intermediária e a placa lateral. Quando ausente ou neutralizada a BMP-4, a ectoderme

dá origem ao tecido neural. Dada a importância da inactivação desta proteína, existem moléculas

que são segregadas com esse propósito, nomeadamente a noguina, a cordina e a folistatina,

presentes no nó primitivo, no notocórdio e na mesoderme pré-cordal. Elas induzem a mesoderme a

formar o notocórdio e a mesoderme paraxial (mesoderme desloca-se dorsalmente). Estes indutores

neurais apenas induzem os tecidos do encéfalo anterior e do mesencéfalo. As estruturas caudais da

placa neural (encéfalo posterior e medula espinhal) dependem da secreção de duas proteínas: a Wnt-

3 e FGF. O ácido retinóico também parece tomar parte na organização do eixo céfalo-caudal, uma

vez que pode fazer com que segmentos cefálicos sejam reespecificados para caudais, pela regulação

da expressão de genes homeobox3.

4. Neurulação

Subsequentemente à indução, a placa neural alongada expande-se, gradualmente, em

direcção à linha primitiva. Existem duas formas principais para converter a placa neural em tubo

neural: a neurulação primária e a secundária. Regra geral, a porção anterior do tubo neural provém

de uma neurulação primária, enquanto a posterior é secundária. O tubo neural completo é

constituído pela junção dos dois tubos formados separadamente3.

Na neurulação primária, as células que rodeiam a placa neural induzem-nas a proliferarem e

invaginar para formar uma estrutura tubular. Após a formação da placa neural, os seus bordos ficam

mais finos e ascendem para formar as pregas neurais, enquanto o sulco neural, em forma de U,

surge no centro da placa, dividindo os futuros lados esquerdo e direito do embrião. As pregas

neurais migram em direcção à linha média do embrião, fundindo-se para originar o tubo neural. A

neurulação primária pode ser dividida em quatro etapas distintas espacial e temporalmente:

1. e 2. formação e a modelação da placa neural. A partir da mesoderme dorsal são enviados sinais

para as células da ectoderme se alongarem e constituírem a placa neural. Estas células alongadas

diferenciam-se daquelas da epiderme. Os movimentos intrínsecos da epiderme e da placa neural dão

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Fig. 1: Microscopia electrónica: sulco neural e pregas neurais. Adaptado de 4.

Fig. 2: Microscopia electrónica: tubo neural. Adaptado de 4.

Fig. 3: Microscopia electrónica: células da crista neural. Adaptado de 4.

forma a esta, a qual se alonga ao longo do eixo antero-posterior e se torna mais estreita, para que se

possa dobrar e formar o tubo neural;

3. dobra da placa neural. Esta fase envolve a formação de

regiões onde a placa neural contacta com os tecidos

circundantes. Em mamíferos, as células da linha média da

placa neural são designadas de medial hinge point (MHP) e

tornam-se ancoradas ao notocórdio subjacente, o qual as

induz a tornarem-se cuneiformes. Fica formado um canal na

linha média dorsal. Pouco depois, outros dois canais são formados perto do contacto da placa neural

com a restante ectoderme, em regiões designadas dorsolateral hinge points (DLHPs), ficando

ancorados à superfície da ectoderme das pregas neurais. Também estas células se tornam

cuneiformes. Após a formação destes canais na placa neural, ela acaba por se dobrar à volta deles,

os quais funcionam como pivots. Forças extrínsecas também actuam, puxando a epiderme para o

centro do embrião. Estes eventos levam à constituição das pregas

neurais (fig.1);

4. fecho do tubo neural. À medida que as pregas neurais se

aproximam na linha média, aderem uma à outra e fundem-se.

Esta fusão não ocorre simultaneamente ao longo da ectoderme,

sendo que a neurulação cefálica é mais avançada que a caudal e

que permanecem duas extremidades abertas, uma anterior, o neuroporo anterior e uma posterior, o

neuroporo posterior. Em mamíferos, o fecho do tubo neural (fig. 2) é iniciado em vários locais ao

longo do eixo antero-posterior3.

O processo da neurulação primária parece ser similar em

anfíbios, répteis, aves e mamíferos e divide a ectoderme em três

tipos de células: o tubo neural, posicionado internamente, que

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dará origem ao encéfalo e espinhal medula, a epiderme, localizada externamente e as células da

crista neural (fig. 3)3.

A crista neural constitui a região que põe em contacto o tubo neural e a epiderme. Forma-se

no local de elevação das pregas neurais, quando existem elevados níveis de BMP’s em contacto

com altos níveis de Wnt 6 da epiderme. As células da crista neural expressam os factores Fox D3 e

Slug. Este último inactiva moléculas adesivas entre as células da crista neural (N-caderinas),

permitindo que migrem ao longo do organismo. Esta estrutura irá, futuramente, originar os sistemas

nervosos periférico e autónomo3.

Na neurulação secundária, o tubo neural ascende a partir da coalescência das células

mesenquimatosas para formar uma estrutura sólida que, posteriormente, cavita e se converte em

tubular. O conhecimento da neurulação secundária é importante em medicina devido à prevalência

das malformações da medula espinhal posterior3.

5. Diferenciação do tubo neural

A diferenciação do tubo neural nas

diversas regiões do sistema nervoso central

(SNC) ocorre rapidamente e a vários níveis

simultaneamente:

o diferenciação anatómica das diferentes estruturas do SNC;

o diferenciação a nível tecidual para formar diferentes camadas quer na medula

espinhal quer no cérebro;

o diferenciação a nível celular, com a formação de diferentes tipos de células

nervosas (neurónios) e de suporte (glia)2,3.

5.1 Diferenciação céfalo-caudal

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Fig. 4: O tubo neural. Adaptado de 5.

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A região cefálica do tubo neural experimenta um desenvolvimento muito acentuado,

ocorrendo formação das diferentes partes do cérebro e de estruturas cefálicas do SNC. Este

desenvolvimento é controlado por uma série de genes, incluindo os genes Hox2,3.

5.2 Diferenciação dorso-ventral

O tubo neural sofre uma polarização e diferenciação dorso-ventral, o que leva a que as

células de diferentes camadas ao longo deste eixo adquiram diferentes características e assumam

diferentes funções, como é o caso dos neurónios sensitivos e motores, os quais são formados nas

regiões dorsal e ventral do tubo, respectivamente. Os interneurónios formam-se nas regiões

intermédias3.

A polaridade é estabelecida por influência de tecidos vizinhos, nomeadamente o notocórdio,

ventralmente, e a epiderme, dorsalmente. A especificação do eixo dorso-ventral do tubo neural é

iniciada por dois grandes factores parácrinos. O notocórdio liberta Sonic Hedghog (shh) que vai

induzir a formação da placa ventral do tubo (floor plate); as células ventrais da placa passam,

também, a libertar shh. A epiderme (ectoderme dorsal) liberta proteínas da família TGF-β,

especialmente BMP 4, BMP 7, dorsalina e activina, as quais vão induzir a formação da placa dorsal

(roof plate), que passa, também, a libertar estas proteínas. Tais factores promovem um gradiente ao

longo das células vizinhas, difundindo-se a BMP 4 ventralmente e o shh dorsalmente3.

Os factores parácrinos interactuam para instruir a síntese de diferentes factores de

transcrição ao longo do eixo dorso-ventral do tubo neural. As células do tubo neural irão exprimir a

sua identidade de acordo com a influência que recebem das células vizinhas, uma vez que os

diferentes tipos de factores parácrinos activam ou inibem determinados factores de transcrição

celular, conduzindo a uma expressão genética diferencial ao longo das diversas camadas de células

do tubo neural. Assim, as células sujeitas a maior concentração de shh sintetizam os factores de

transcrição Nkx6.1 e Nkx2.2, tornando-se neurónios ventrais (V3). Os grupos celulares mais

dorsais, sujeitos a cada vez mais factores TGF-β e a menos shh produzem os factores de transcrição

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Nkx6.1 e Pax6 e tornam-se neurónios motores. Os dois grupos celulares seguintes, que recebem

progressivamente menos shh, tornam-se os interneurónios V2 e V12,3.

A diferenciação dorso-ventral até aqui referida corresponde ao que se passa na metade

ventral da medula espinhal, da qual se originam os neurónios motores. Porém, da metade dorsal

originar-se-ão neurónios que terão por função a integração de informações sensoriais da periferia. A

organização da parte dorsal da medula espinhal definitiva resulta da migração e rearranjos

controlados das células, durante o desenvolvimento neural inicial. Todos os neurónios que farão

parte da medula espinhal dorsal originam-se no tubo neural dorsal. São quatro os domínios de

expressão de genes pró-neurais, que codificam para factores de transcrição da Basic Helix-Loop-

Helix (bHLH), os que definem as células progenitoras no tubo neural dorsal. Estes diferenciam-se,

originando seis tipos de interneurónios dorsais (dI1-dI6), os quais podem ser distinguidos através do

tipo de factores de transcrição que expressam. Os dados disponíveis até hoje indicam que os genes

pró-neurais são necessários para iniciar o desenvolvimento das diferentes classes de neurónios.

Alguns dos factores expressos são o Math1 (expresso pelas células localizadas dorsalmente,

adjacentes ao roof plate), neurogenina 1 (Ngn1) e Ngn2 (expressas em células localizadas mais

ventralmente) e Mash1 (expresso por precursores dos interneurónios dI3 e dI5). Claramente, muito

há ainda a investigar acerca das células do tubo neural, factores expressos e correlações entre

caracterização anatómica e funcionalidade, mas trata-se de uma área em franca evolução de

conhecimentos, actualmente 6.

6. Malformações associadas ao desenvolvimento do tubo neural

6.1 Definição

“Malformações congénitas do sistema nervoso central e estruturas adjacentes relacionadas

com uma formação anormal do tubo neural durante o primeiro trimestre de gravidez que

geralmente acontece entre dias 18 e 29 de gestação. Malformações da ectoderme e da mesoderme

(envolvendo o crânio e vértebras principalmente) podem acontecer como resultado de defeitos no

fecho do tubo neural. 7”

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6.2 Doenças

A anencefalia é um defeito do tubo neural que acontece quando a extremidade cefálica do

tubo neural não fecha, normalmente entre o 23º e 26º dias de gravidez, resultando na ausência de

uma porção principal do encéfalo, crânio e couro cabeludo. Crianças com esta anomalia nascem

sem um encéfalo frontal. O tecido restante do encéfalo está, frequentemente, exposto 8, 9, 10.

A lisencefalia, que literalmente significa “cérebro liso”, é uma malformação de encéfalo rara

caracterizada por microcefalia e falta das circunvoluções normais do cérebro. É causado por uma

migração neuronal defeituosa 9.

A megalencefalia é uma condição na qual há um encéfalo anormalmente grande, pesado e

com mau funcionamento. Pensa-se que a megalencefalia está relacionada com uma perturbação na

regulação de reprodução de células ou com a sua proliferação 9.

A Malformação de Chiari é uma condição na qual há protrusão do cerebelo no canal

espinhal. Pode ser ou não aparente ao nascimento 9, 10.

A encéfaloceles é um conjunto de defeitos raros no tubo neural caracterizado por protrusões

do encéfalo e suas membranas nas aberturas no crânio. Estes defeitos são causados pelo insucesso

do tubo neural em se fechar completamente durante o desenvolvimento fetal 9, 10.

A espinha bífida é uma gama de malformações que são o resultado de fecho anormal ou

incompleto da porção caudal do tubo neural. É um defeito do tubo neural (uma desordem que

envolve desenvolvimento incompleto do encéfalo, espinha dorsal, e/ou as suas estruturas

protectoras) causado pela incapacidade da coluna do feto em se fechar correctamente durante o

primeiro mês de gravidez 8, 9.

7. Investigação

O conhecimento sobre como o sistema nervoso se desenvolve e qual o papel dos genes no

desenvolvimento fetal são as metas principais dos investigadores que estudam as doenças

neurológicas congénitas. Estão-se a concentrar esforços no sentido de entender os processos

complexos responsáveis no desenvolvimento normal do cérebro e sistema nervoso e como o seu

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impedimento leva a doenças cefálicas. Entender como, por um lado, os genes controlam a migração

das células do cérebro, sua proliferação, diferenciação e morte e, por outro, como a radiação,

drogas, toxinas, infecções e outros factores influenciam estes processos, será um passo em frente na

prevenção10.

A existência de um gene variante, C677T, do gene da enzima 5,10-metilenotetrahidro-folato

redúctase, gene envolvido no processamento do folato, é suficiente para aumentar o risco de se

nascer com uma malformação associada ao tubo neural. Em homozigóticos para o alelo T, do gene

variante C677T, e os heterozigóticos CT estão associados a uma concentração baixa de folato,

concentrações altas de homocisteína e actividade enzimática mais baixa do que os homozigóticos

CC, sendo estes efeitos mais evidenciados para os homozigóticos. Estes são factores de risco para

as malformações do tubo neural. Tanto as concentrações baixas de folato como as altas de

homocisteína associadas aos genótipos do tipo CT e TT, podem ser corrigidos através de ácido

fólico. Realça-se a importância da entrada do ácido fólico nos programas de saúde social para todas

as mulheres em idade de engravidar para, assim, evitar as malformações associadas ao tubo neural.

Para além disso, o ácido fólico, previne, também, as doenças cardiovasculares 11.

Resultados obtidos em ensaios clínicos randomizados recolhidos mostraram que, pelo menos

metade dos casos de malformações associadas ao tubo neural podiam ter sido prevenidos se as mães

tivessem ingerido ácido fólico. Aconselha-se a ingestão de 0,4mg de ácido fólico no mês anterior à

concepção e nos três primeiros meses de gravidez. A título de prevenção e, para além da ingestão de

ácido fólico, podem referir-se as ultra-sonografias pré natais e o teste de risco fetal 12, 13.

Foram realizadas análises (SSCA) aos genes de 179 pacientes com espinha bífida com o

objectivo de analisar a BMP4 e o seu inibidor, NOG. A análise revelou quatro mutações para a

BMP4 e apenas uma para o NOG. Os investigadores acreditam que estas mutações, actuando com

outras variantes de genes, podem estar na base do aparecimento da espinha bífida. Em adição, um

estudo de casos e controlos trouxe evidências para um desequilíbrio no genótipo da BMP4 – a

existência da forma variante 455TC (V152A), no exão 5. A frequência de heterozigóticos 455TC é

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mais baixa nos casos do que nos controlos, apesar da frequência dos alelos ser semelhante em

ambos os grupos. Uma explicação possível é que ser-se heterozigótico para o 455TC neste local é

um factor de protecção na população normal, apesar de até hoje ainda não ter sido provado 14.

Foi revelada a importância da FGF-1 e da FGF-2 para a proliferação e diferenciação das

células neuronais. Foi demonstrado que as células da zona sub-ventricular do cérebro adulto têm

características de percursores neuronais: elas podem responder à proliferação pela FGF-2 e à

indução da diferenciação pela FGF-1. Aparentemente, a exposição do embrião ao álcool diminui a

proliferação da camada ventricular e, consequentemente, reduz o número de neurónios formados, o

que sugere que o álcool é um inibidor da acção das FGF 15.

Neste momento está a ser levado a cabo nos EUA um estudo que tem como objectivo

descrever as condições genéticas que estão na origem da espinha bífida. Encontra-se ainda na fase

de recrutamento de pacientes 16.

8. Conclusão

O desenvolvimento do nosso trabalho permitiu-nos alcançar os objectivos a que nos

propusemos no início. Para nós, foi estimulante toda a abordagem de um tema tão interessante e

actual, particularmente no que se refere à pesquisa e selecção de artigos científicos subordinados a

novas descobertas nesta área.

As principais dificuldades com que nos debatemos foram, por um lado, o facto de sermos de

diferentes turmas e ser complexo conciliar os diferentes horários; por outro, conseguir reunir e

condensar tanta informação escrita e gráfica que existe disponível acerca desta temática num tão

curto limite de páginas.

Apesar de tudo, estamos satisfeitas com a tarefa que levámos a cabo e incentivámos a

continuação da realização deste tipo de trabalhos, uma excelente forma de interiorizar a matéria e de

procurar saber um pouco mais.

9. Agradecimentos

12

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Por último, queremos deixar o nosso especial agradecimento à Drª Sandra Rebelo pela sua

disponibilidade e sugestões para melhorar este trabalho.

9. Bibliografia

1. Williams, P. L., Warwick, R., Dyson, M., Bannister; L. H. (1995) Gray Anatomia. 37ª Edição.

Londres. Editora Guanabra Koogan.

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4. http://escuela.med.puc.d/.../atlas/cap3/priat3.html

5. http://www.forp.usp.br/mef/embriologia/geral.html

6. Anderson, T. C. (2003) Patterning cell types in the dorsal spinal cord: what the mouse mutants

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7. Joynt. (1992) Clinical Neurology. 55, pp. 31-41.

8. http://www.wrongdiagnosis.com/n/neural_tube_defect/intro.htm

9. http://www.ninds.nih.gov/disorders/disorder_index.htm

10. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/neuraltubedefects.htm

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14. Felder B., et al. (2002) Evaluation of BMP4 and its specific inhibitor NOG as candidates in

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15. Bartlett P. F., et al. (1994) Regulation of neurogenesis in the embryonic and adult brain by

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16. http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00031122?order=5

13