CRISTIANE DOS SANTOS GIUBERTI

ESTUDO DA ESTABILIDADE E PRODUO PILOTO DE LIPOSSOMAS pH-SENSVEIS

FURTIVOS DE CISPLATINA

Belo Horizonte Faculdade de Farmcia da UFMG

2007

CRISTIANE DOS SANTOS GIUBERTI

ESTUDO DA ESTABILIDADE E PRODUO PILOTO DE LIPOSSOMAS pH-SENSVEIS

FURTIVOS DE CISPLATINA

Belo Horizonte Faculdade de Farmcia da UFMG

2007

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Cincias Farmacuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Mnica Cristina de Oliveira Co-orientador: Prof. Dr. Gilson Andrade Ramaldes

Dedico este trabalho a minha famlia, as pessoas mais importantes da minha vida:

Aos meus pais, Jonas e Janir s minhas irms, Mrcia e Patrcia

Aos meus irmos, Jonas e Jardel Ao meu cunhado Lucas (in memorian) E s minhas sobrinhas Letcia e Luiza.

AGRADECIMENTOS

A Deus, agradeo pela minha vida e pela realizao deste trabalho.

minha famlia, por me apoiar, me aconselhar, me valorizar e por entender minha ausncia.

s minhas amigas de repblica Danielle, Denise, Paola, Janana Lbe, Janana Scaramussa e Grazielle, pela acolhida, enorme amizade e pela convivncia.

Aos amigos da Faculdade de Farmcia da UFMG, especialmente queles do Laboratrio de Qumica Farmacutica, do Laboratrio de Controle de Qualidade e do Laboratrio de Radioistopos.

Rute, Maria Anglica, Danielle e Paola por me ajudarem no estudo para a seleo do mestrado.

Aos meus amigos do laboratrio lvaro, Elaine, Las, Talita, Svia, Berta, Guilherme Diniz, Soninha, Jos Geraldo, Guilherme Carneiro, Erly, Vanessa, Cristiane Moraes, Dlia, Gisele, Martinha, Isabel, Andra, Daniel, Juliana, Ricardo, Viviane, Laurinha, Diego, Samuel, rica e Helena, por tudo o que vivenciamos juntos.

Ao Eduardo, tcnico responsvel do LTF e Elaine, grande amiga, por toda a colaborao, principalmente pela cumplicidade e pelas horas dispensadas produo piloto.

Ao Gilson, meu co-orientador, pelo carinho e disponibilidade em sanar minhas dvidas.

Aos professores, Vildete e Lucas, agradeo por toda contribuio cientfica.

minha orientadora, Mnica, por eu ter encontrado nela uma profissional em quem me espelhar, por todo o carinho, acolhida e fora doada para a realizao e continuao deste trabalho.

Ao Prof. Marcelo Santoro, pela gentileza de disponibilizar os equipamentos do Laboratrio de Enzimologia e Fsico-qumica de Protenas (ICB/UFMG) e ao Jamil, pela presteza e disposio em me auxiliar na utilizao da ultracentrfuga.

CAPES, pelo financiamento da minha bolsa de estudos.

FAPEMIG, FINEP e ao CNPQ, pelo apoio financeiro.

RESUMO

Cisplatina (CDDP) um frmaco antineoplsico utilizado no tratamento de cncer de ovrio, testculo, cabea, pescoo e pulmo. A encapsulao da CDDP em lipossomas uma alternativa para burlar os efeitos colaterais graves e o desenvolvimento de resistncia ao frmaco, que limitam a sua utilizao. Contudo, a instabilidade fsica (agregao/fuso) e qumica (hidrlise/peroxidao) limitam o uso destes sistemas carreadores como produtos farmacuticos. O preparo de formas farmacuticas liofilizadas uma estratgia empregada para aumentar a estabilidade destas formulaes. Alm disso, faz-se necessrio o desenvolvimento de um processo de produo de lipossomas que seja economicamente vivel e reprodutvel em larga escala. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o estudo de diferentes parmetros relacionados estabilidade qumica e fsico-qumica de uma formulao de lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina (SpHL-CDDP) assim como estabelecer um processo eficiente para a sua produo em escala piloto. SpHL-CDDP foram produzidos em escala piloto com o emprego de trs etapas, a saber: evaporao em fase reversa, homogeneizao sob alta presso e ultrafiltrao (REV/HAP/UF). A otimizao de parmetros relacionados a homogeneizao sob alta presso (presso aplicada e nmero de ciclos) e ultrafiltrao (nmero de ciclos) foram avaliados nesse processo de produo piloto. A presso de 500 Bar e nmero de ciclos igual a 9 foram adotados para a produo de SpHL-CDDP, que apresentaram dimetro igual a 99,0 3,9 nm e teor de encapsulao de 12,9 2,30 %. Duas substncias crioprotetoras, sacarose e trealose, foram avaliadas quanto a eficcia sobre o controle do dimetro das vesculas e reteno do material encapsulado, aps o processo de liofilizao/rehidratao, sendo a trealose mais eficiente do que a sacarose, mostrando menor aumento do dimetro das vesculas. A estabilidade de armazenamento de SpHL-CDDP foi avaliada mediante o acompanhamento da variao do dimetro, potencial zeta e teor de encapsulao. Aps 135 dias de armazenamento, os SpHL-CDDP liofilizados e sob a forma lquida no mostraram alterao do dimetro e potencial zeta das vesculas. Entretanto, os SpHL-CDDP na forma liofilizada mostraram-se mais eficientes quanto a reteno da CDDP encapsulada do que a disperso lipossomal.

Palavras-chave: Cisplatina, Sistema de liberao de frmacos, Lipossomas, Crioprotetores, Escalonamento, Estabilidade

ABSTRACT

Cisplatin (CDDP) is an antineoplasic drug used for the treatment of ovary, testicle, head, neck and lung carcinoma. The CDDP entrapment into liposomes is an alternative to circumvent severe side effects and the appearance of drug resistance which limit its use. However, the physical (aggregation/fusion) and chemical (hydrolysis/peroxidation) instabilities limit the use of these drug carriers as pharmaceutical products. The preparation of freeze-dried pharmaceuticals is a strategy used to improve the stability of these formulations. Moreover, the development of an economically feasible and reproducible process of liposome production on a large scale becomes necessary. Therefore, the aim of this work was the study of different factors related to the chemical and physico-chemical stability of stealth pH-sensitive liposome containing CDDP (SpHL-CDDP) as well as the establishment of an efficient process for its production in a pilot scale. SpHL-CDDP were produced in a pilot scale using three stages, namely: reverse phase evaporation, homogenization under high pressure and ultrafiltration (REV/HAP/UF). The optimization of factors related to the homonogenization under high pressure (pressure and number of cycles) and ultrafiltration (number of cycles) was evaluated in this process of pilot production. The pressure of 500 Bar and number of cycles equal to 9 were adopted for the production of SpHL-CDDP which presented a mean diameter of 99.0 3.9 nm and encapsulation percentage of 12.9 2.30. Two cryoprotectants, sucrose and trehalose, were investigated about their effectiveness to control the vesicles diameter and retention of encapsulated CDDP after the freeze-drying/rehydration step. The trehalose showed a higher ability to the formation of smaller vesicles than the sucrose. The long-term storage of SpHL-CDDP was evaluated by the alterations of the diameter, zeta potential and encapsulation of CDDP. After 135 days of storage, freeze-dried or diluted SpHL-CDDP did not show any alteration of the vesicle diameter and zeta potential. However, the freeze-dried SpHL-CDDP were superior on the CDDP retention than the liposomal dispersion.

Key words: Cisplatin, Drug delivery systems, Liposome, Cryoprotectants, Scale up, Stability

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura qumica dos complexos de platina...........................................................21

Figura 2 Caractersticas estruturais dos lipossomas ..............................................................24

Figura 3 Classificao de lipossomas quanto ao dimetro e nmero de bicamadas .............25

Figura 4 Estruturas qumicas de CHEMS, DOPE e DSPE-PEG 2000..................................27

Figura 5 Fases de agregao dos lpides em meio aquoso. ...................................................28

Figura 6 Comportamento de fases das membranas lipdicas.................................................29

Figura 7 Equao de Henry utilizada no clculo do potencial zeta das partculas................31

Figura 8 Estrutura qumica do lisofosfolpide da DOPE ......................................................33

Figura 9 CDDP e seus produtos de hidrlise.........................................................................34

Figura 10 Representao esquemtica da interao fosfolpide-acar ................................36

Figura 11 Organograma da produo de lipossomas pH-sensveis furtivos .........................46

Figura 12 Homogeneizador de alta presso de estgio nico................................................49

Figura 13 Dispositivo de ultrafiltrao Millipore Pellicon XL acoplado a bomba peristltica.................................................................................................................................49

Figura 14 Curva de calibrao para o doseamento da CDDP obtida pelo mtodo de CLAE................................................................................................................................................. .55

Figura 15 Variao do dimetro das vesculas e do ndice de polidisperso de SpHL-CDDP durante um perodo de 60 dias de armazenamento. .................................................................70

Figura 16 Variao do potencial zeta de SpHL-CDDP durante um peroodo de 60 dias de armazenamento.........................................................................................................................71

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores das reas dos picos atribudos CDDP obtidos pelo emprego de CLAE..56

Tabela 2 - Teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 1a..........58

Tabela 3 - Teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 1b .........59

Tabela 4 - Influncia da presena de crioprotetores sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a aps o processo de liofilizao .......................................60

Tabela 5 - Influncia da presena de crioprotetores, presentes na fase interna e externa, sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a aps o processo de liofilizao ................................................................................................................................60

Tabela 6 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao sob presso a 500 bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL ...................................................61

Tabela 7 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao sob presso a 1000 bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL .................................................62

Tabela 8 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao sob presso a 500 bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP .......................................63

Tabela 9 - Influncia do nmero de ciclos de ultrafiltrao sobre a purificao dos SpHL-CDDP .......................................................................................................................................63

Tabela 10 - Caracterizao fsico-qumica dos SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 2 .............64

Tabela 11 - Influncia da presena de crioprotetores sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 2........................................................................................65

Tabela 12 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP liofilizados na ausncia de crioprotetores.................................................................................67

Tabela 13 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP liofilizados na presena de sacarose .........................................................................................68

Tabela 14 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP liofilizados na presena de trealose ..........................................................................................69

Tabela 15 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP armazenados na forma lquida..................................................................................................70

Tabela 16 - Avaliao do teor de liberao de CDDP a partir de SpHL-CDDP aps 135 dias de armazenamento ....................................................................................................................72

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

AL antes da liofilizao A/O gua em leo CDDP cisplatina CHEMS hemisuccinato de colesterila CHOL colesterol CLAE cromatografia lquida de alta eficincia dp desvio padro DAD detector de arranjo de diodos DL depois da liofilizao DOPE dioleilfosfatidiletanolamina DPPC dipalmitoilfosfatidilcolina DSPE-PEG2000 diestearoilfosfatildiletanolamina-polietilenoglicol2000 EDTA cido etilenodiaminotetraactico fc fator de correo HEPES N-[2-hidroxietil] piperazina N-[2-cido etanosulfnico] i.p. ndice de polidisperso INCA Instituto Nacional do Cncer IV intravenoso kDa quilodltons L.D. limite de deteco Lip-Disperso lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina sob a forma lquida Lip-S/ Criop lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina sem crioprotetores Lip-Sacarose lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina com sacarose Lip-Trealose lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina com trealose LUV lipossomas unilamelares grandes MLV lipossomas multilamelares N.D. no determinado p/p relao peso por peso p/v relao peso por volume PC fosfatidilcolina PCS espectroscopia de correlao de ftons PEG polietilenoglicol REV evaporao em fase reversa SFM sistema fagocitrio mononuclear SpHL lipossomas pH-sensveis furtivos brancos (sem cisplatina) SpHL-CDDP lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina SUV lipossomas unilamelares pequenos Tg Temperatura de transio vtrea Tm Temperatura de transio de fase USP Farmacopia Americana

SUMRIO

RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

INTRODUO.....................................................................................................................

15

REVISO DA LITERATURA.............................................................................................

16 1 Cncer................................................................................................................................. 16 2 Tratamento do cncer......................................................................................................... 17 2.1 Cisplatina......................................................................................................................... 17

2.1.1 Vias de administrao da cisplatina......................................................................... 18 2.1.1.1 Administrao intravenosa................................................................................... 18 2.1.1.2 Administrao intraperitoneal.............................................................................. 18 2.1.2 Inconvenientes da utilizao da cisplatina............................................................... 19

2.2 Novas propostas para a quimioterapia dos compostos de platina................................... 20 3 Sistemas nanoestruturados para vetorizao de frmacos.................................................. 21 4 Cisplatina em sistemas nanoestruturados........................................................................... 22 5 Lipossomas......................................................................................................................... 24 5.1 Definio......................................................................................................................... 24 5.2 Classificao.................................................................................................................... 25

5.2.1 Lipossomas unilamelares e multilamelares............................................................. 25 5.2.2 Lipossomas convencionais e furtivos...................................................................... 25 5.2.3 Lipossomas pH-sensveis........................................................................................ 26

6 Propriedades fsicas e fsico-qumicas dos lipossomas...................................................... 28 6.1 Transio de fase dos lpides........................................................................................... 28 6.2 Dimetro das vesculas.................................................................................................... 29 6.3 Potencial zeta................................................................................................................... 30 6.4 Teor e eficincia de encapsulao................................................................................... 31 7 Estabilidade qumica e fsico-qumica dos lipossomas e do frmaco encapsulado........... 32 7.1 Estabilidade fsica............................................................................................................ 32 7.2 Estabilidade qumica....................................................................................................... 33

7.3 Hidrlise da cisplatina..................................................................................................... 33 8 Liofilizao......................................................................................................................... 34 9 Crioproteo....................................................................................................................... 35 10 Produo em escala piloto................................................................................................ 38

11 Proposta de estudo da estabilidade e produo em escala piloto de SpHL-CDDP sob a forma liofilizada....................................................................................................................

41

OBJETIVOS..........................................................................................................................

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MATERIAL E MTODOS..................................................................................................

44 1 Material.............................................................................................................................. 44 2 Mtodos gerais................................................................................................................... 44 3 Obteno da curva de calibrao para doseamento da CDDP........................................... 45 3.1 Linearidade...................................................................................................................... 45 4 Preparao dos lipossomas pH-sensveis furtivos de CDDP............................................. 46 4.1 Mtodo 1 Preparao de SpHL-CDDP em pequena escala pelo mtodo REV............ 46

4.1.1 Obteno de uma emulso A/O............................................................................... 46 4.1.2 Obteno de SpHL-CDDP....................................................................................... 47 4.1.3 Purificao dos SpHL-CDDP por ultracentrifugao............................................. 47

4.1.4 Avaliao da influncia do uso de crioprotetores no processo de liofilizao de SpHL-CDDP.....................................................................................................................

47 5 Mtodo 2 Preparao de SpHL-CDDP em escala piloto pelo mtodo REV................... 48

5.1 Avaliao da influncia do nmero de ciclos de homogeneizao e da presso sobre o dimetro das vesculas dos SpHL........................................................................

48

5.2 Avaliao do nmero de ciclos de ultrafiltrao necessrios para a separao da CDDP no encapsulada.........................................................................................................

49 5.3 Preparao de SpHL-CDDP pelo mtodo de evaporao em fase reversa..................... 50

5.3.1 Obteno de uma emulso A/O............................................................................... 50 5.3.2 Obteno de SpHL-CDDP....................................................................................... 51 5.3.3 Purificao dos SpHL-CDDP por ultrafiltrao...................................................... 51

6 Preparao das solues de crioprotetores......................................................................... 51 7 Determinao do teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP................................. 53 8 Determinao do dimetro e do potencial zeta dos SpHL e SpHL-CDDP........................ 54 9 Liofilizao dos SpHL-CDDP............................................................................................ 54 10 Ressuspenso dos SpHL-CDDP....................................................................................... 54

11 Estudo da estabilidade de armazenamento dos SpHL-CDDP.......................................... 55 12 Anlise estatstica............................................................................................................. 55

RESULTADOS E DISCUSSO..........................................................................................

56 1 Obteno da curva de calibrao para doseamento da CDDP........................................... 56 1.1 Linearidade...................................................................................................................... 56 2 Caracterizao fsico-qumica de SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1...................... 57 2.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta.............................................. 57

2.1.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a..............................................................................................

57

2.1.2 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1b..............................................................................................

57

2.2 Determinao do teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1................................................................................................................................

57

2.2.1 Determinao do teor de encapsulao em SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a........................................................................................................................

57

2.2.2 Determinao do teor de encapsulao e dimetro em SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1b...........................................................................................................

58

3 Influncia da presena de crioprotetores sobre as caractersticas fsico-qumicas dos SpHL-CDDP liofilizados obtidos pelo mtodo 1..................................................................

59 3.1 Influncia dos crioprotetores, presentes somente na fase externa, sobre o dimetro e potencial zeta das vesculas aps a reconstituio do p dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a................................................................................................................

59

3.2 Influncia dos crioprotetores sobre o dimetro e potencial zeta das vesculas aps a reconstituio do p dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a, utilizando crioprotetores na fase interna e externa dos lipossomas........................................................

61

4 Avaliao dos parmetros de produo dos SpHL segundo mtodo 2 (escala piloto)....... 61 4.1 Influncia do nmero de ciclos de homogeneizao e da presso sobre o dimetro das vesculas de SpHL.................................................................................................................

61

4.2 Avaliao do nmero de ciclos de ultrafiltrao necessrios para a separao da CDDP no encapsulada.........................................................................................................

64 5 Caracterizao fsico-qumica de SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 2...................... 65

6 Influncia da presena de crioprotetores sobre as caractersticas fsico-qumicas dos SpHL-CDDP liofilizados obtidos pelo mtodo 2..................................................................

65 7 Estudo da estabilidade de armazenamento dos SpHL-CDDP............................................ 66

7.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta de SpHL-CDDP durante o

armazenamento...................................................................................................................... 66

8 Por que a trealose mais eficiente do que a sacarose no controle do dimetro dos SpHL-CDDP? .......................................................................................................................

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9 CONCLUSO E PERSPECTIVAS..................................................................................

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................................

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INTRODUO

A CDDP um dos frmacos mais efetivos e potentes da terapia antitumoral. Essa utilizada frequentemente como tratamento de primeira escolha contra vrios tipos de tumores slidos (KONDAGUNTA et al., 2005), porm apresenta alguns inconvenientes, tais como: os efeitos adversos graves, o desenvolvimento de resistncia ao frmaco, a rpida inativao, alm de incompatibilidades farmacotcnicas durante sua administrao (MONTI et al., 2005). O desenvolvimento de frmacos anlogos e de novas formulaes so estratgias atualmente utilizadas para aumentar a eficcia e segurana de utilizao da CDDP. Uma forma de reduzir os efeitos colaterais e txicos, assim como aumentar o ndice teraputico da CDDP, a sua encapsulao em lipossomas (VELINOVA et al., 2004).

Lipossomas so sistemas lipdicos dispersos constitudos freqentemente por fosfolpides, os quais em meio aquoso se organizam espontaneamente em bicamadas formando vesculas esfricas (LASIC, 1998). O extenso interesse no uso de lipossomas como carreadores de frmacos exige procedimentos que atendam aos padres farmacuticos quanto preparao e caracterizao das vesculas. Procedimentos tecnolgicos aceitveis devem ser reprodutveis em larga escala e economicamente viveis (VEMURI;RHODES, 1995). Alm disso, para serem empregados como carreadores de frmacos, tambm importante que os lipossomas mantenham-se suficientemente estveis por um perodo de tempo razovel. Esses podem sofrer mudanas tanto fsicas quanto qumicas durante a estocagem. A estabilidade dos lipossomas sob a forma lquida reduzida devido aos fenmenos de agregao e/ou fuso e devido ao fato dos fosfolpides, constituintes das vesculas, sofrerem hidrlise e oxidao em meio aquoso. Esses fenmenos de instabilidade das vesculas podem ocasionar a perda do material encapsulado. A liofilizao na presena de agentes crioprotetores uma alternativa obteno de um sistema de liberao de frmacos mais estvel (CHOW et al., 1995; VEMURI et al., 1995; MOHAMMED et al., 2006).

Assim, nesta dissertao de mestrado, foi realizado o estudo de preparo de SpHL-CDDP sob a forma liofilizada, seguido de avaliao de um processo para a sua produo em escala piloto e do estudo de sua estabilidade qumica e fsico-qumica .

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REVISO DA LITERATURA

1 Cncer

O cncer uma doena que pode acometer diversos rgos e tecidos de diferentes origens histolgicas. Pode se manifestar com diferentes comportamentos biolgicos que tm em comum o crescimento desordenado das clulas do organismo. As caractersticas que diferenciam os diversos tipos de cncer entre si variam de acordo com o tipo de clula acometida, sua velocidade de multiplicao e a capacidade de invadir tecido e rgos distantes, originando as metstases. O surgimento do cncer ocorre atravs da transformao de uma clula normal em clula cancerosa devido a alterao do seu DNA. As causas do cncer so variadas e esto associadas participao de vrus, ao de substncias qumicas do meio ambiente ou da alimentao, ou ainda influncia de agentes fsicos, tal como a radiao. A clula cancerosa prolifera-se desordenadamente, perde a capacidade de aderncia, invade os tecidos vizinhos, penetra nos vasos sangneos e linfticos e espalha-se pelo organismo, estabelecendo-se em locais distantes de sua origem, onde produz os tumores secundrios (JUNQUEIRA;CARNEIRO, 2000).

O cncer a segunda maior causa de morte nos pases industrializados depois das doenas cardiovasculares, onde uma em cada quatro pessoas adquire a doena e uma em cada cinco morre (FONTES et al., 2005). objeto de estudo de vrios centros de pesquisa em todo o mundo, sendo o responsvel por 12% das mortes, cerca de seis milhes de pessoas a cada ano. Tambm no Brasil, as neoplasias constituem a segunda maior causa de morte. Alm disso, cerca de 500.000 novos casos de cncer so diagnosticados por ano (INCA, 2006).

Os genes que participam na formao de tumores so principalmente os que, nas clulas normais, esto envolvidos com o controle do ciclo celular, o reparo do DNA danificado ou a apoptose. O ciclo celular o processo bsico de gnese de novas clulas e compreende os fenmenos que ocorrem desde a formao de uma clula at sua prpria diviso em duas clulas-filhas. A intrfase representa o perodo compreendido entre duas divises e ocorre em trs fases consecutivas denominadas G1, S e G2: (i) em G1 as clulas apresentam intensa atividade de sntese de RNA e de protenas, com marcante aumento do citoplasma; (ii) no perodo S a clula duplica o seu contedo de DNA e (iii) em G2 ocorre discreta sntese de RNA e de protenas que so essenciais para mitose. Tendo passado pelas fases da intrfase, o ncleo entra em processo de diviso ou mitose. O perodo onde no ocorre a proliferao das clulas denominado G0. No se conhece o mecanismo de ao de

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todos os genes supressores de tumores, porm alguns codificam protenas que mantm as clulas em G0, portanto fora do ciclo mittico. Um gene supressor muito estudado o p53, e aproximadamente 50% de todos os tumores malignos humanos apresentam mutao ou deleo deste gene. O gene p53 normal suprime a formao do cncer atravs de diversos mecanismos, impedindo que as clulas com DNA danificado entrem na fase S do ciclo mittico, at que o DNA seja reparado, ou desencadeado o mecanismo de apoptose da clula danificada (JUNQUEIRA;CARNEIRO, 2000).

Uma caracterstica marcante dos tecidos tumorais o fato do pH extracelular (pHe) ser mais cido que o pH dos tecidos normais. O pH intracelular (pHi) de ambos os tecidos relativamente similar devido necessidade de se manter um ambiente favorvel para as vrias atividades citoplasmticas. Portanto, o pHe substancialmente reduzido no tumor quando comparado com o tecido normal, promove um gradiente de pH celular diferente nestes dois tecidos. Uma das hipteses mais aceitas para explicar o baixo pHe nos tecidos tumorais o clearance ineficiente dos metablitos cidos produzidos durante a gliclise aerbica intensa da clula cancerosa (STUBBS et al., 1999).

2 Tratamento do cncer

Existem trs principais tipos de tratamento para o cncer: cirurgia, radioterapia e quimioterapia. A tcnica cirrgica pode levar remoo de tumores com eficcia, nos casos em que no apresentam metstase. A radioterapia (geralmente raios gama, radioistopos como cobalto-60, raios X e at prtons e msons pi negativos) usada comumente em conjunto com a cirurgia, com incremento da eficcia do tratamento. Entretanto, na ocorrncia de metstase, faz-se necessria uma abordagem sistmica, que pode ser efetuada, em cerca de 60-70 % dos casos, com a quimioterapia (ALMEIDA et al., 2005).

2.1 Cisplatina

A cis-diaminodicloroplatina (II) (CDDP) um complexo inorgnico divalente hidrossolvel que contm platina. CDDP e outros frmacos relacionados, como a carboplatina, formam fortes intermedirios eletroflicos que atuam via substituio nucleoflica na formao de ligaes cruzadas no DNA (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003). O mecanismo de ao da CDDP envolve a entrada na clula, onde o on cloreto se dissocia e

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gera um complexo que reage com a gua. A substituio do cloreto por gua fornece uma molcula carregada positivamente, a espcie ativada da droga, a qual, a seguir, reage com cidos nucleicos, formando ligaes cruzadas intrafilamentares, provavelmente entre N7 e O6 das molculas de guaninas adjacentes, o que resulta em uma desnaturao local da cadeia do DNA (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003).

Considerado um dos frmacos mais efetivos e potentes na terapia antitumoral, a CDDP freqentemente utilizada como tratamento de primeira escolha contra vrios tipos de tumores slidos, incluindo cncer testicular, carcinoma de ovrio, cncer de cabea e pescoo e cncer de pulmo (KONDAGUNTA et al., 2005; MUGGIA;FOJO, 2004; SHIRAZI et al., 1996; LE CHEVALIER et al., 1994; GUILLOT et al., 1992).

2.1.1 Vias de administrao da CDDP

2.1.1.1 Administrao intravenosa

A CDDP geralmente administrada por via intravenosa (IV) e disponibilizada comercialmente como soluo injetvel na concentrao de 1 mg/mL. Os esquemas tpicos de administrao intravenosa de CDDP, como agente nico a adultos ou crianas, so: 50-100 mg/m2 como infuso IV a cada 3 ou 4 semanas; ou infuso IV de 15-20 mg/m2 por dia durante 5 dias consecutivos, a ser repetido a cada 3 ou 4 semanas (MARTINDALE, 2005).

2.1.1.2 Administrao intraperitoneal

A CDDP tambm tem sido administrada por via intraperitoneal com a finalidade de se atingir nveis tumoricidas do frmaco localmente, ao mesmo tempo em que os efeitos colaterais sistmicos so minimizados (TAMURA et al., 2002). Grande parte dos estudos da eficcia da administrao intraperitoneal tm administrado agentes quimioterpicos para o tratamento da carcinomatose peritoneal e do cncer ovariano. Como 50 % dos pacientes com doenas malignas gastrointestinais e ginecolgicas, apresentam carcinomatose peritoneal logo aps cirurgia local, h um grande interesse em utilizar essa nova via de administrao (PHILLIPS et al., 2002). A razo para a terapia intraperitoneal em cncer ovariano porque o peritnio recebe exposio sustentada a altas concentraes dos agentes antitumorais enquanto tecidos sadios, como a medula ssea, so relativamente poupados (ARMSTRONG

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et al., 2006). Hrinbaschek e colaboradores (2001) relataram que a administrao intraperitoneal de

CDDP e mitomicina evitou a carcinomatose peritoneal em modelo animal (ratos). Armstrong e colaboradores (2006) conduziram um estudo no qual foi realizada a administrao loco-regional de CDDP na cavidade abdominal de pacientes com carcinoma ovariano estgio III ou carcinomatose peritoneal primria, que levou a uma reduo de 25% de mortalidade se comparada administrao intravenosa. Embora grande parte dos frmacos administrados por essa via sejam rapidamente depurados do fluido peritoneal, essa forma de administrao pode atingir picos de concentraes mais elevadas nesse fluido quando comparadas com o mesmo frmaco administrado por via intravenosa (PHILLIPS et al., 2002). Goel e colaboradores (1989) demonstraram que a administrao de CDDP por via intraperitoneal resultou em uma concentrao de 12 a 15 vezes maior na cavidade peritoneal que a concentrao plasmtica.

A maioria dos frmacos antitumorais so molculas hidrossolveis pequenas, como a CDDP, que so absorvidas rapidamente atravs dos capilares e atingem a circulao sangunea. Isto dificulta a manuteno de uma concentrao adequada do frmaco na cavidade intraperitoneal por longos perodos. Como as partculas corpusculares so absorvidas lentamente pelo sistema linftico sem serem absorvidas pelos capilares, ficando retidas na cavidade peritoneal, a profilaxia da carcinomatose peritoneal uma aplicao potencial dos lipossomas contendo agentes antitumorais (KUMAGAI et al., 1996).

2.1.2 Inconvenientes da utilizao da CDDP

A CDDP apresenta como inconvenientes da sua utilizao: os efeitos adversos graves, o desenvolvimento de resistncia ao frmaco e sua rpida inativao devido a complexao com o plasma e protenas teciduais, alm de incompatibilidades farmacotcnicas durante sua administrao. Os efeitos txicos deste frmaco, em animais e humanos, incluem nefrotoxicidade, ototoxicidade, neurotoxicidade e mielosupresso. Contudo seu principal efeito adverso dose-limitante a nefrotoxicidade (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003). Os efeitos nefrotxicos da CDDP so cumulativos e aumentam com a dose e durao do tratamento (MARTINDALE, 2005).

A resistncia CDDP parece envolver uma combinao de mecanismos incluindo diminuio do transporte do frmaco, aumento da detoxificao celular devido a glutationa e metalotionenas, e aumento na capacidade de reparo celular, bem como alteraes nas vias de

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apoptose celular (MONTI et al., 2005). Como exemplos de incompatibilidades da CDDP com outros frmacos ou constituintes da formulao podemos citar: (i) sua precipitao em presena de etoposdeo dissolvido em soluo de cloreto de sdio 0,9 %; (ii) precipitao em presena de tiotepa dissolvida em soluo de glicose a 5 % e (iii) degradao da CDDP decorrente de sua interao com trometamol, um excipiente utilizado na formulao de 5-Fluouracila (TRISSEL et al., 1996; FOURNIER et al,1992).

Existem duas estratgias para aumentar a segurana da utilizao deste frmaco: 1) o desenvolvimento de frmacos anlogos, como a carboplatina e a oxaliplatina e 2) o desenvolvimento de formulaes alvo-especficas.

2.2 Novas propostas para a quimioterapia dos compostos de platina

Aps a introduo da CDDP e demonstrao de sua importncia no tratamento de cncer ovariano e testicular, houve a necessidade do desenvolvimento de anlogos menos txicos. CDDP se tornou o prottipo de uma classe de agentes antineoplsicos, muitos dos quais foram abandonados em estudos pr-clnicos ou em estgios clnicos de desenvolvimento, enquanto poucos foram inseridos na rotina clnica (JAKUPEC et al., 2003). Estudos anteriores levaram ao desenvolvimentos dos anlogos, carboplatina, oxaliplatina e satraplatina, o primeiro complexo de coordenao da platina administrado por via oral, representados na Figura 1. Nos estudos mais recentes, o principal foco o desenvolvimento de complexos que superem os principais mecanismos de resistncia do tumor CDDP, denominados cis-aminodicloro(2-metilpiridina)platina(II) (ZD0473) e trans-amino(diclorociclohexilamina)dihidroxiplatina (IV) (JM335).

A carboplatina [cis-diamino(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platina II] menos txica aos rins e sistema nervoso, e causa menos nusea e mese do que a CDDP. Entretanto, efeitos adversos hematolgicos so mais frequentes com a utilizao da carboplatina (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003). Outro frmaco de segunda gerao, a nedaplatina (cis-diaminoglicolatoplatina II), desenvolvida e utilizada no Japo, apresenta propriedades toxicolgicas melhores que a CDDP. A mielosupresso dose-limitante e toxicidades no-hematolgicas so geralmente leves (JAKUPEC et al., 2003).

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Oxaliplatina

NH2

PtNH2

O

O O

OPt

NH3Cl

NH3Cl

Cisplatina

OPt

OO

O

NH3

NH3

Carboplatina

NPt

H3N

CH3

Cl

Cl

ZDM0473

PtNH2

Cl

ClH3NO

O

CH3

O

O

CH3

SatraplatinaO

PtO NH2

NH2

O

Nedaplatina

PtNH2

Cl

NH3

OH

OH

Cl

JM335

Figura 1 Estrutura qumica dos complexos de platina.

A ocorrncia de resistncia cruzada entre a CDDP, carboplatina e nedaplatina torna os dois ltimos frmacos inefetivos no tratamento de pacientes que no responderam ao tratamento prvio com CDDP.

Oxaliplatina apresenta como efeitos colaterais a neurotoxicidade, toxicidade hematolgica e gastrointestinal. Possui vasto efeito antitumoricida, tanto in vitro quanto in vivo, melhor perfil de segurana que a CDDP e ausncia de resistncia cruzada CDDP e carboplatina. Sua ao antineoplsica otimizada quando administrada em combinao com outros agentes como o 5-fluorouracil e gencitabina (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003).

3 Sistemas nanoestruturados para vetorizao de frmacos

A associao de frmacos j em uso a um sistema transportador, visando direcionar o frmaco para a clula alvo e evitar os locais indesejveis onde o frmaco exerce toxicidade, oferece um ganho de tempo na fase de desenvolvimento de um produto porque usa um frmaco j caracterizado do ponto de vista farmacolgico (FRZARD et al., 2005). O direcionamento de frmacos por meio de sistemas carreadores tem sido amplamente estudado. A nanotecnologia, uma rea do conhecimento cientfico de carter multidisciplinar, que envolve a criao e utilizao de materiais, instrumentos e sistemas em uma escala

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nanomtrica, est associada tecnologia farmacutica no desenvolvimento de sistemas transportadores de frmacos.

4 CDDP em sistemas nanoestruturados

Inmeras pesquisas cientficas tm utilizado nanossistemas para a veiculao da CDDP, entre as quais so destacadas as nanopartculas (XU et al., 2006); microesferas (KUMAGAI et al., 1996), nanocpsulas (VELINOVA et al., 2004, BURGER et al., 2002), micelas polimricas (NISHIYAMA et al., 2003) e lipossomas (STATHOPOULOS et al., 2006; RAMACHANDRAN, 2006; JNIOR et al., 2007a,b).

Microesferas constitudas de copolmeros de cido ltico-cido gliclico foram desenvolvidas para a encapsulao de CDDP (CDDP-PLGA), apresentando dimetro de aproximadamente 100 m e teor de encapsulao de 5 % (KUMAGAI et al., 1996). CDDP-PLGA foram administradas por via intraperitoneal em ratas com carcinomatose peritoneal e monstraram ser mais efetivas quanto a sobrevida dos animais do que a soluo de CDDP. Alm disso, a preparao liberou o frmaco lentamente por um longo perodo na cavidade peritoneal.

Xu e colaboradores (2006) desenvolveram nanopartculas de CDDP constitudas de caprolactona/polietilenoglicol ou caprolactona/polimetacrilato, com eficincia de encapsulao de aproximadamente 90 %. Estas nanopartculas foram testadas em clulas de adenocarcinoma de ovrio SKOV-3, as quais so clulas resistentes CDDP, dentre outros frmacos. As nanopartculas de CDDP foram capazes de ser internalizadas pelas clulas e mostraram uma elevada eficcia antitumoral.

Burger e colaboradores (2002) desenvolveram um sistema lipossomal de CDDP, constitudo por razes equimolares de dioleilfosfatidilserina e dioleilfosfatidilcolina, e produzido por hidratao do filme lipdico seguida de congelamento-descongelamento. A citotoxicidade dos lipossomas de CDDP foi aproximadamente 1000 vezes maior do que a CDDP livre e nesta formulao, o frmaco apresenta-se sob a forma de agregados.

Micelas polimricas constitudas por polietilenoglicol-cido poliglutmico e CDDP foram investigadas quanto a capacidade de constiturem um sistema de liberao de frmacos tumor-especfico. A concentrao de CDDP nas micelas foi de 39 %. As micelas contendo CDDP apresentaram elevada estabilidade em gua, mesmo em solues muito diludas. Entretanto, em solues ricas em ons cloreto, estas se dissociam acompanhadas de liberao da CDDP (NISHIYAMA et al., 2003).

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Uma formulao de lipossomas de CDDP, Lipoplatin, foi desenvolvida com a finalidade de reduzir a toxicidade sistmica da CDDP e direcion-la aos stios tumorais. Essa formulao constituda por dipalmitoilfosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, colesterol e diestearoilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol 2000, com dimetro vesicular mdio de 110 nm. Lipoplatin menos txica que a CDDP livre em ratos. Lipoplatin 3 mg/mL (concentrao referente CDDP) deve ser armazenada ao abrigo da luz, devido a fotossensibilidade (BOULIKAS, 2004). Estudos clnicos de fase I-II, associaram gencitabina com CDDP lipossomal, para avaliao de eficcia e toxicidade, em pacientes refratrios a tratamentos anteriores utilizando somente gencitabina. O avano detectado foi a menor toxicidade observada, atribuda ao uso de Lipoplatin (STATHOPOULOS et al., 2006).

Outra formulao de CDDP lipossomal, denominada SPI-077, foi delineada a fim direcionar a CDDP s clulas tumorais atravs do retardo da excreo renal e aumento do tempo de circulao, para reduzir a toxicidade ocasionada pela CDDP na sua forma livre (no-encapsulada) e evitar os procedimentos profilticos como hidratao e utilizao de anti-emticos. Entretanto, reaes graves de hipersensibilidade aos componentes da formulao fizeram necessria a profilaxia com corticosterides e anti-histamnicos. (JAKUPEC et al., 2003). Resultados dos estudos pr-clnicos so conflitantes j que enquanto um estudo indica que SPI-077 exibiu atividade superior CDDP livre em modelos tumorais de camundongos (NEWMAN et al., 1999), outro sugere que a CDDP no liberada a partir dos lipossomas de maneira suficiente (ZAMBONI et al., 2000 apud JAKUPEC et al., 2003).

Estudos realizados por Jnior e colaboradores (2007a) demonstraram que os SpHL-CDDP apresentam uma maior atividade citotxica sobre a linhagem celular A549 (clulas cancerosas de pulmo humano) do que a CDDP livre. Alm disso, essa formulao exibiu a mesma eficincia em clulas sensveis e em clulas resistentes CDDP, o que sugere que essa pode burlar os mecanismos de resistncia oferecidos pelas clulas penetrao do frmaco.

Estudos de difrao de raios-X foram efetuados em amostras de lipossomas de CDDP estericamente estabilizados SPI-077 sob as formas lquida, congelada e liofilizada. As molculas de CDDP encapsuladas mantiveram-se quimicamente estveis e no sofreram hidrlise. Os dados obtidos mostraram ainda que a CDDP formou uma soluo supersaturada. As amostras congeladas e/ou liofilizadas foram similares s amostras no estado lquido, demonstrando que nem o congelamento nem a liofilizao induzem cristalizao do frmaco (ARCON et al., 2004).

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5 Lipossomas

5.1 Definio

Lipossomas so sistemas lipdicos dispersos constitudos freqentemente por fosfolpides, os quais em meio aquoso se organizam espontaneamente em bicamadas formando vesculas esfricas. Essas bicamadas circundam uma cavidade aquosa interna e se encontram envolvidas por um meio aquoso (Figura 2). Considerando que os lipossomas so constitudos por molculas anfiflicas, os mesmos so capazes de encapsular substncias hidroflicas, lipoflicas e anfiflicas. Molculas hidroflicas so encapsuladas na sua cavidade interna, onde esto presentes os grupos polares dos fosfolpides. As substncias lipoflicas so acomodadas na regio apolar da bicamada e as anfiflicas ao longo de toda sua extenso, interagindo com a regio apolar e polar. Esses sistemas lipdicos foram descritos, na dcada de 60, por Bangham e colaboradores (1965) como modelos de membranas biolgicas. A utilizao dos lipossomas como sistemas de liberao de frmacos foi proposta na dcada de 70. Entretanto, as primeiras formulaes de lipossomas estudadas no produziram os resultados esperados, devido instabilidade das vesculas, baixa taxa de encapsulao dos frmacos e escolha inadequada da via de administrao (LASIC, 1998).

Figura 2 Caractersticas estruturais dos lipossomas (Adaptado de FRZARD et al, 2005).

25

5.2 Classificao

As propriedades qumicas e fsico-qumicas dos lipossomas variam de acordo com sua composio lipdica, dimetro vesicular, lamelaridade, carga superficial e mtodo de preparao.

5.2.1 Lipossomas unilamelares e multilamelares

Os lipossomas so classificados de acordo com o dimetro e nmero de bicamadas em (i) vesculas unilamelares pequenas (SUV), (ii) vesculas unilamelares grandes (LUV) e (iii) vesculas multilamelares (MLV). As vesculas unilamelares, formadas por uma bicamada nica, so denominadas SUV quando possuem dimetro compreendido entre 25-50 nm e em LUV, quando so maiores que 100 nm (Figura 3). Os lipossomas multilamelares so formados por bicamadas sucessivas, separadas por compartimentos aquosos, com dimetro compreendido entre 100-1000 nm (NEW, 1990; SAHOO, 2003).

Figura 3 Classificao de lipossomas quanto ao dimetro e nmero de bicamadas (Adaptado de LASIC, 1998).

5.2.2 Lipossomas convencionais e furtivos

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Os lipossomas convencionais, quando administrados por via endovenosa, sofrem adsoro de protenas sricas (opsoninas), ocasionando sua captura pelas clulas do sistema fagocitrio mononuclear (SFM), sobretudo no fgado, bao e medula ssea. Foi observado que a incorporao, na membrana dos lipossomas, de lipdeos acoplados a polmeros de etilenoglicol (PEGs), altera sua interao com o ambiente, sendo o efeito mais importante o impedimento da captura pelos macrfagos e a prolongao de sua presena na corrente sangunea. Esses lipossomas, denominados lipossomas furtivos, permitem uma distribuio do frmaco para outros rgos alm daquele do SFM (FONTES et al., 2005). Concentraes de 5-10 % de fosfatidiletanolamina acoplado a PEG (PE-PEG) de massa molecular 1000-2000 Da conferem excelente estabilidade s formulaes (ULRICH, 2002).

Antes do advento das formulaes com polmeros hidroflicos acoplados aos fosfolpides, foram utilizados lipossomas pequenos, com membrana rgida e neutros, como tentativas de reduo da ao do SFM sobre os lipossomas. Entretanto, esse tipo de lipossoma tm srias desvantagens como sistema de liberao de frmacos, que incluem: pequeno volume interno de encapsulao, aumento do dimetro das vesculas durante armazenamento, poucas substncias disponveis para esse tipo de formulao e perfil farmacocintico dose-dependente (PAPAHADJOPOULOS;GABIZON, 1995).

5.2.3 Lipossomas pH-sensveis

O uso de lipossomas pH-sensveis como sistemas de liberao de frmacos foi sugerido a partir da observao de que tecidos enfermos (tumores, metstases, inflamaes e infeces) apresentam um pH menor do que os tecidos normais (GULINO et al., 1967), alm do fato de que alguns tipos de vrus desenvolveram estratgias para aproveitar-se da acidificao do meio do lmen endossomal para infectar clulas (SIMES et al., 2004). Esses lipossomas exibem transies de fases, caractersticas dos seus constituintes fosfolipdicos, que so responsveis pela desestabilizao das vesculas em meio cido e so estveis em pH fisiolgico (pH 7,4).

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P

O

OO-O

NH3+O

O

O H

O

CH3

CH3H3C

CH3

CH3

O

O

O

HO

P

O

OO-O

HNO

O

O H O

OOCH3

O

( )45

A

B

C

Figura 4 Estruturas qumicas de CHEMS (A), DOPE (B) e DSPE-PEG2000 (C).

Os lipossomas pH-sensveis so constitudos por fosfolpides derivados da fosfatidiletanolamina (PE), como por exemplo, a dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE). Estes derivados organizam-se em meio aquoso, a temperatura ambiente, sob a forma hexagonal, no sendo capazes de se apresentar na forma de vesculas (SIEGEL, 1986). A formao de lipossomas com estes fosfolpides requer a adio de agentes estabilizantes, normalmente lpides carboxilados, como o hemisuccinato de colesterila (CHEMS), que em pH fisiolgico se encontram sob a forma ionizada (Figura 4). Esses estabilizantes so capazes de se inserirem entre as molculas de fosfolpides, e o aparecimento de repulses eletrostticas entre os grupamentos carboxila, presentes no estabilizante, e os grupos fosfato dos fosfolpides favorecem a organizao lamelar (Figura 5), possibilitando a formao dos lipossomas. A exposio dos lipossomas pH-sensveis a um meio cido resulta na protonao dos agentes estabilizantes, com conseqente desestabilizao das vesculas e a liberao do material encapsulado (OLIVEIRA et al., 2000).

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Figura 5 Fases de agregao dos lpides em meio aquoso (Adaptado de LASIC, 1998).

6 Propriedades fsicas e fsico-qumicas dos lipossomas

As propriedades e aplicaes dos lipossomas dependem das caractersticas fsicas e fsico-qumicas de suas membranas.

6.1 Transio de fase dos lipdes

A fluidez da bicamada, quando constituda de um nico tipo de lpide, depende da temperatura de transio de fase do estado gel (slido) para o estado lquido-cristalino (fluido) (Tm) (Figura 6). Quando a temperatura do meio igual a Tm, as cadeias carbnicas dos lipdes passam do estado ordenado (slido) para o estado fluido no qual as cadeias carbnicas encontram-se desordenadas e tm grande liberdade de movimento. Portanto, de acordo com a Tm, as membranas lipossomais de diferentes composies podem exibir diferentes nveis de fluidez sob as mesmas condies de temperatura. A permeabilidade da bicamada depende da fluidez da membrana e da natureza do soluto encapsulado. A taxa de permeabilidade mais elevada ocorre na Tm e menor no estado gel em comparao com o estado fluido (FRZARD et al., 1999).

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Figura 6 - Comportamento de fases das membranas lipdicas (Adaptado de FRZARD et al., 2005).

Um componente lipdico importante, muito utilizado na composio dos lipossomas, o colesterol. Este aumenta a rigidez das membranas no estado cristal-lquido e reduz a rigidez e os defeitos estruturais das membranas no estado gel.

6.2 Dimetro das vesculas

A obteno de lipossomas com dimetro reduzido e distribuio homognea das vesculas um importante fator para garantia da estabilidade dessa forma farmacutica. Muitos estudos utilizam lipossomas unilamelares homogneos com dimetro compreendido entre 50 e 150 nm. Essa faixa um meio termo entre a eficincia de encapsulao (aumenta de acordo com o aumento do dimetro), a estabilidade do lipossoma (diminui com o aumento do dimetro acima da faixa tima de 80-200 nm) e capacidade de extravasamento (diminui com o aumento do dimetro) (LASIC, 1998).

No presente trabalho, foi estudada uma formulao farmacutica destinada administrao parenteral. A Farmacopia americana 29 edio (USP 29), classifica as emulses injetveis lipdicas de acordo com o dimetro mdio vesicular (DMV) e inclui os lipossomas na classe das microemulses, isto , formulaes lipdicas cujo DMV seja menor que 0,1 m. Os limites farmacopicos para a garantia da estabilidade de armazenamento destas formulaes preconizam que estas apresentem pH entre 6-9, DMV menor ou igual a 500 nm, concentrao de cidos graxos livres menor que 0,07 mEq/g e que a concentrao percentual peso/volume de glbulos maiores que 5 m seja menor que 0,05 % do total da fase dispersa (DRISCOLL, 2006). Como os capilares sanguneos possuem dimetro interno

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entre 4 e 9 m, o limite de 5 m apresenta relevncia fisiolgica, por ser um preventivo da ocluso da microvasculatura.

So utilizadas diferentes tcnicas para anlise do dimetro e distribuio dos lipossomas. Dentre estas esto compreendidas tcnicas de espalhamento da luz (BERGER, N. et al., 2001; CASALS et al., 2003; YANG et al., 2006) e microscopia, como microscopia de criofratura (BERGER et al., 2001) e microscopia de fora atmica (RUOZI et al., 2005; RAMACHANDRAN et al., 2006). Neste trabalho foi empregada a tcnica denominada espectroscopia de correlao de ftons (PCS) ou espalhamento dinmico da luz (Quasielastic Light Scattering) na anlise do dimetro das vesculas lipossomais.

A tcnica de PCS consiste em atravessar determinada amostra com um feixe de laser, de modo que as partculas presentes espalhem a luz. O espalhamento da luz est relacionado ao movimento browniano das partculas de modo que a intensidade da luz espalhada por estas forme um padro de movimento. Por meio da disperso da luz, torna-se possvel determinar o dimetro mdio das partculas. Partculas menores so capazes de movimentarem mais rapidamente e causam rpidas modificaes no espalhamento da luz. Por outro lado, partculas de maior dimetro, as quais possuem menores coeficientes de difuso, resultam em menores flutuaes na intensidade do espalhamento da luz (HASKELL et al., 1998). Esta tcnica permite a medida de partculas cujos dimetros estejam compreendidos na faixa de 1 a 5000 nm (MALVERN INSTRUMENTS, 1996a).

6.3 Potencial zeta

A medida do potencial zeta uma ferramenta muito til na deteco da magnitude de interaes repulsivas entre as partculas coloidais e comumente utilizada para avaliar a estabilidade dos colides (CASALS et al., 2003).

O potencial zeta pode ser definido como a carga existente na fronteira entre a superfcie de uma partcula individual e seus ons associados, no plano de cisalhamento. A carga no pode ser medida diretamente, mas pode-se determinar a grandeza da carga eltrica pelas medidas da mobilidade eletrofortica das partculas submetidas aplicao de um determinado campo eltrico (FLORENCE;ATTWOOD, 2003).

Para a determinao do potencial zeta dos lipossomas foi utilizado um mtodo que consiste na incidncia de um feixe de luz e aplicao de um campo eltrico de fora

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conhecida atravs da amostra. Neste mtodo, as partculas carregadas se deslocam com velocidades distintas induzindo deslocamentos da frequncia do feixe de luz incidente, gerando um espectro de frequncias. As frequncias so ento utilizadas para os clculos das velocidades, as quais so convertidas para valores de mobilidades eletroforticas. Atravs da aplicao da equao de Henry (Figura 7) pode-se ento determinar o potencial zeta das partculas. Nesta equao, a funo de Henry, f(Ka), pode ser representada pela aproximao de Huckel, igual a 1, quando o dimetro da partcula muito menor que a espessura da dupla camada de cargas ao redor da partcula. Utiliza-se a aproximao de Smoluchowsky, igual a 1,5, quando o dimetro da partcula maior que a espessura da dupla camada de cargas (MALVERN INSTRUMENTS, 1996b).

( )3

Ka2Ue f=

na qual, Ue a mobilidade eletrofortica, a constante dieltrica da amostra, o potencial zeta, f(Ka) a funo de Henry e a viscosidade do solvente.

Figura 7 Equao de Henry utilizada no clculo do potencial zeta das partculas.

6.4 Teor e eficincia de encapsulao

O teor e a eficincia de encapsulao de uma substncia em lipossomas so dois parmetros importantes que devem ser considerados na escolha do mtodo de preparao, sobretudo quando se procura desenvolver uma composio farmacutica. Esses parmetros podem ser otimizados atravs da escolha do mtodo de encapsulao e da manipulao da composio lipdica da membrana. importante a obteno de altas taxas de encapsulao, particularmente quando o frmaco possui doses elevadas ou quando no possvel o reaproveitamento do frmaco no-encapsulado. A relao frmaco/lipde tambm dever ser maximizada, visto que determina a quantidade de lipde a ser administrada ao paciente. Assim, quanto menor for a quantidade de lipde veiculada, menores sero os riscos de efeitos colaterais associados aos mesmos (FRZARD et al., 2005; SWARBRICK;BOYLAN, 1994).

32

7 Estabilidade qumica e fsico-qumica dos lipossomas e do frmaco encapsulado

Para funcionar efetivamente como um vetor de frmacos, importante que os lipossomas mantenham-se suficientemente estveis por um perodo de tempo razovel. Esses podem sofrer mudanas tanto fsicas quanto qumicas durante a estocagem. As mudanas fsicas podem ocorrer nas vesculas fosfolipdicas, incluindo agregao e fuso. J as mudanas qumicas incluem hidrlise das ligaes ster dos fosfolpides em disperses aquosas de lipossomas e oxidao dos fosfolpides que contm cidos graxos insaturados, bem como a oxidao do colesterol. Todas essas transformaes podem causar a perda do material encapsulado (CHOW et al., 1995). As instabilidades fsicas tambm podem ser provocadas durante as transies de fase dos lpides; entretanto, a incluso de colesterol ou derivados nas bicamadas podem reduzir ou erradicar esses fenmenos de transio (McMULLEN et al., 1993).

7.1 Estabilidade fsica

A estabilidade fsica de lipossomas pode ser entendida como um tipo de estabilidade coloidal. Um dos aspectos mais importantes dessa estabilidade a mudana do tamanho das partculas e de sua distribuio. As mudanas no sistema coloidal podem ocorrer principalmente por dois mecanismos: (i) a nvel molecular, pela troca molecular assimtrica (conhecido como maturao de Ostwald), (ii) a nvel de partculas ocorre na maioria das vezes agregao, fuso, coacervao ou flutuao/precipitao. No caso de lipossomas, agregao e fuso so as principais fontes de instabilidade. Agregao de lipossomas neutros causada por interaes de Van der Waals, e tende a ser mais pronunciada em vesculas grandes. Embora fatores como resduos de solventes e traos de elementos possam potencializar esse processo, a formao de agregados de lipossomas um fenmeno natural e inevitvel para membranas sem carga. A maneira mais simples de contornar essa situao utilizar lpides carregados na formulao (NEW, 1990). Casals e colaboradores (2003) afirmam que a presena de 25 % de lpides carregados confere uma suficiente estabilidade eletrosttica que evita a agregao e fuso de vesculas por um perodo de 3 meses, a 4 C. Outra forma de aumentar a estabilidade dos lipossomas revesti-los com polmeros hidroflicos no-inicos, como PEG, o que leva ao aparecimento da repulso de hidratao caracterizada pela presena de uma barreira estrica que impede a aproximao das vesculas (ULRICH, 2002).

33

7.2 Estabilidade qumica

Muitas disperses de fosfolpides contm lpides insaturados (cadeias acila) como parte de sua cadeia molecular. Os lpides insaturados sofrem degradao oxidativa ou peroxidao lipdica. Essas reaes podem ocorrer durante a preparao, o armazenamento ou no momento do uso. A peroxidao um processo complexo envolvendo reaes radicalares que resultam na formao de perxidos cclicos e hidroperxidos. Essa degradao oxidativa acontece rapidamente se os lpides insaturados no forem protegidos durante a preparao e o armazenamento. Devem ser protegidos pela manuteno em atmosfera de gs inerte, como nitrognio ou argnio; pela remoo de metais pesados (adio de EDTA) ou pela adio de antioxidantes, como alfa-tocoferol ou butilhidroxitolueno.

A hidrlise dos lpides leva a formao de lisofosfolpides (Figura 8) e cidos graxos livres. Os lisofosfolpides podem ser posteriormente hidrolisados em glicerofosfocompostos e cidos graxos. Esses produtos de reao podem alterar a rigidez da bicamada lipossomal, a reteno do material encapsulado e o dimetro das vesculas e, portanto, devem ser mantidos em nveis mnimos (VEMURI et al., 1995).

Figura 8 Estrutura qumica do lisofosfolpide da DOPE (1-oleil 2-hidroxi glicero-3-fosfoetanolamina).

7.3 Hidrlise da CDDP

Em soluo aquosa, os tomos de cloro da CDDP so facilmente substitudos por ligantes aquo (Figura 9), originando espcies mais reativas. Parte destes ligantes podem ser desprotonados a hidroxo ligantes, que ocasiona uma diminuio da reatividade do complexo (JAKUPEC et al., 2003). Visando a manuteno da integridade da molcula do frmaco, a soluo de CDDP deve conter, no mnimo, cloreto de sdio 0,2 % p/v (THOMPSON, 1998).

34

---- Cl -, +H2O---- Cl -, +H2O

P t

H3N

O H2H3N

O H+

P t

H3N

O H2H3N

O H2+2

P t

H3N

ClH3N

O H2+

P t

H3N

ClH3N

O H

P t

H3N

O HH3N

O H

P t

H3N

ClH3N

Cl

- H+ - H+

- H+

Figura 9 CDDP e seus produtos de hidrlise.

8 Liofilizao

Com o objetivo de aumentar a estabilidade fsica e qumica dos lipossomas, o processo de liofilizao tm sido utilizado, aumentando dessa forma a vida de prateleira das formulaes lipossomais (YANG et al., 2006). Em relao estabilidade desta forma farmacutica, a utilizao de uma suspenso aquosa como um produto comercial questionvel. Em contraste, uma preparao seca para ser hidratada imediatamente antes da sua utilizao pode evitar muitos problemas associados com as disperses aquosas de lipossomas. O processo pode ser aplicado sobre os lpides ou sobre os lipossomas propriamente ditos (PAYNE et al., 1986). Tem sido relatado que lipossomas contendo molculas encapsuladas podem ser liofilizados e reconstitudos com significante reteno da taxa de encapsulao e sem alteraes significativas no tamanho das vesculas (VEMURI et al., 1995).

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Liofilizao o processo empregado na desidratao de substncias extremamente sensveis ao calor. Nesse processo, a soluo ou suspenso lquida inicialmente congelada; em seguida, a presso sobre a matria congelada reduzida e, por fim, a gua removida por sublimao (AULTON, 2005). O processo de liofilizao envolve 3 estgios: (i) congelamento da suspenso lipossomal; (ii) secagem primria (perda de gua por sublimao at 0,5 %) e (iii) secagem secundria (remoo da gua residual e obteno de p seco poroso) (MOHAMMED et al., 2006; AULTON, 2005).

O programa de liofilizao empregado influencia as caractersticas do produto. Lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol (PC:CHOL, razo molar 4:1, respectivamente) foram submetidos diferentes ciclos de liofilizao. Seguindo as etapas de liofilizao, constitudas do congelamento, secagem primria e secundria sob temperaturas de - 70 C, - 50 C e - 30 C, respectivamente (programa 1); - 50 C, - 40 C e - 25 C (programa 2) e - 30 C, - 20 C e - 10 C (programa 3), as formulaes do programa 1 e 2 mantiveram-se com dimetro vesicular mdio menores que 200 nm quando acrescidos de crioprotetores; enquanto que a formulao submetida ao programa 3 sofreu significativa agregao e fuso das vesculas (MOHAMMED et al., 2007).

9 Crioproteo

Como dito anteriormene, a liofilizao bastante utilizado para prolongar a vida de prateleira dos lipossomas. Entretanto, tanto o congelamento quanto a secagem podem induzir a danos, resultando no aparecimento de fenmenos relacionados agregao e/ou fuso das vesculas. Os lipossomas podem ter seu dimetro alterado durante a liofilizao e/ou durante a subseqente rehidratao se estabilizantes apropriados no forem empregados (MOHAMMED et al., 2006). Assim sendo, para promover estabilidade fsica durante o processo de liofilizao, agentes crioprotetores como acares (por exemplo: sacarose, trealose e lactose) e seus derivados so utilizados. Aminocidos tambm tm sido estudados quanto a sua capacidade crioprotetora (MOHAMMED et al., 2007).

A partir da observao da capacidade de muitos organismos sobreviverem completa desidratao, em estado de anidrobiose, os pesquisadores chegaram descoberta de que essa sobrevivncia possibilitada pela presena de grande quantidade de dissacardeos (particularmente sacarose e trealose) sintetizados durante o processo de perda de gua. Os acares inserem-se entre as pores polares do fosfolpide no estado seco, levando

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formao de ligaes de hidrognio. Essas interaes entre os acares e os fosfolpides permitem a manuteno do estado fsico das membranas no estado seco de forma similar existente no estado hidratado. Tem sido proposto que essas interaes acares/fosfolpides resultam na diminuio da temperatura de transio gel/lquido-cristalino do fosfolpide (Tm) no seu estado desidratado. Dessa forma, essa transio de fase no ocorre durante o processo de desidratao/rehidratao, evitando a perda do material encapsulado (van WINDEN et al., 1997).

Figura 10 Representao esquemtica da interao fosfolpide-acar.

Anlises de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e de calorimetria exploratria diferencial (DSC) demonstraram que a reduo da temperatura da transio de fase gel/lquido-cristalino depende da razo de massa de acar:lpide. Alm disso, a manuteno da integridade da membrana lipdica na presena de acares est associada com a formao de uma matriz vtrea dos acares temperatura ambiente. Esta amorfa, termodinamicamente instvel e caracterizada por alta viscosidade e baixa mobilidade molecular. A formao dessa matriz vtrea evita a fuso da membrana lipdica, sendo isto importante para a manuteno do dimetro das vesculas e a reteno do contedo encapsulado (CACELA;HINCHA, 2006; van WINDEN et al., 1997; RICKER et al., 2003). Em misturas de trealose e lpides no estado seco, duas populaes distintas de acar esto presentes: uma interage diretamente com pores polares do fosfolpide (ocupando o lugar da gua) e a outra populao forma a matriz vtrea (CROWE et al., 1987).

A crioproteo oferecida pelos solutos influenciada pela temperatura de transio dos lpides e pela temperatura de transio vtrea (Tg) dos carboidratos. A utilizao de

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crioprotetores durante a liofilizao deve observar a Tg do soluto empregado como tal, a fim de preservar a natureza porosa do liofilizado. A secagem primria deve ser feita a aproximadamente 4 C abaixo da Tg dos carboidratos. Em uma mistura de lipossomas de PC:CHOL e trealose, este acar apresentou Tg de - 30 C e quando a temperatura da secagem primria foi mantida abaixo desta, produtos estveis foram obtidos nos programas de liofilizao 1 e 2, citados no item 9. Entretanto, sob temperatura em torno da Tg (programa 3) ocorreu fuso da vescula, possivelmente devido falta de formao da matriz vtrea (MOHAMMED et al., 2006).

De acordo com mtodos calorimtricos e de difrao de raio-X, cerca de 18-24 molculas de gua, dependendo se os lpides esto estabilizados em vesculas grandes ou pequenas, contribuem para a espessura da bicamada e, portanto, para a barreira de permeabilidade. Luzardo e colaboradores (2000) descreveram a estrutura de hidratao da interface da bicamada lipdica, como sendo composta por 3 ou 4 molculas de gua, que so deslocadas por sacarose ou trealose de forma coligativa (isto , por efeito osmtico); 7 molculas de gua fortemente ligadas s carbonilas que so deslocadas apenas por trealose; 7 molculas de gua muito fortemente ligadas aos fosfatos que podem ser substitudos por sacarose ou trealose se a desidratao for extremamente drstica, como no caso da liofilizao. Os mecanismos de ao da sacarose e da trealose so diferentes, provavelmente devido estereoqumica do grupos hidroxila nas posies equatorial e axial. Entretanto, sob condies drsticas, nas quais a gua completamente removida, os dois acares atuam de maneira semelhante.

Zadi e Gregoriadis (2000) utilizaram a sacarose como agente crioprotetor em razes de massa lpide:acar variando de 1:1 at 1:15, na produo de lipossomas pelo mtodo de congelamento/descongelamento, seguido de liofilizao. O emprego de relao sacarose:lpide igual a 1:1 resultou em aumento considervel do teor de encapsulao de diferentes solutos, porm com a formao de vesculas maiores (213-687 nm). Para razo sacarose:lpide igual a 5:1 foi observada reduo do dimetro das vesculas lipossomais (93-116 nm), sem apresentar variao significativa sobre o teor de frmaco encapsulado. Entretanto, em razes sacarose:lpide muito maiores (10:1 a 15:1), o teor de frmaco encapsulado diminuiu e o dimetro das vesculas permaneceu inalterado, em virtude da proteo efetiva proporcionada pela sacarose contra a desestabilizao das estruturas lipossomais. Portanto, a escolha da razo crioprotetor:lpide ideal para a encapsulao de substncias e manuteno do dimetro das partculas depende do balano dessas avaliaes.

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Hincha e Hagemann (2004) investigaram a habilidade da sacarose, trealose, 2-O-(-D-glicopiranosil)glicerol (GG), derivados do aminocido betana (glicinobetana e glutamatobetana) e sorbitol em estabilizar lipossomas durante a desidratao e a rehidratao. Na ausncia de qualquer soluto protetor, os lipossomas perdem completamente seu material encapsulado e sofrem o fenmeno de fuso. Sacarose e trealose foram aproximadamente iguais quanto capacidade de estabilizar lipossomas, sorbitol foi superior aos ltimos, enquanto GG mostrou-se menos eficaz e os derivados da betana no apresentaram nenhuma proteo. Estudos feitos por Glavas-Dodov e colaboradores (2005) demonstraram que o processo de congelamento/descongelamento no alterou o tamanho das partculas de lipossomas rehidratados contendo sacarose como crioprotetor e, apenas uma pequena diminuio na taxa de encapsulao foi observada, com taxas superiores a 76 %.

10 Produo em escala piloto

O escalonamento de lipossomas depende dos seguintes fatores crticos: o desenvolvimento de um processo eficiente e adequado para a produo de lipossomas estreis e livres de pirognios em escala industrial; altos e reprodutveis nveis de encapsulao do frmaco, com uma quantidade mnima de frmaco livre (no-encapsulado) presente no produto final; e ainda, que a formulao do lipossoma seja estvel durante o armazenamento (AMSELEM et al., 1990). O extenso interesse no uso de lipossomas como carreadores de frmacos exige procedimentos que atendam aos padres farmacuticos quanto preparao e caracterizao das vesculas. Procedimentos tecnolgicos aceitveis devem ser reprodutveis em larga escala e economicamente viveis. VEMURI e RHODES (1995) tambm consideram que para a produo em larga escala de lipossomas, deve-se garantir a remoo de todo o solvente orgnico, a proteo dos fosfolpides contra a oxidao, a remoo das endotoxinas, a remoo da droga livre (no-encapsulada), o controle do tamanho das vesculas e a esterilizao dos lipossomas.

Quando um sistema solvente for selecionado para um dado procedimento devem-se levar em considerao os limites de segurana, solubilidade e pureza do mesmo. Os resduos de solventes na preparao acabada podem causar danos sade do paciente. Solventes como etanol e hidrocarbonetos podem levar desestabilizao dos lipossomas por interferirem nas interaes cooperativas hidrofbicas entre os grupos metileno dos fosfolpides que mantm a estrutura unida. Estudos de VEMURI e RHODES (1995) demonstraram que quanto menor o

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lote e maior a temperatura do banho, menor ser a quantidade de resduo de clorofrmio no filme fosfolipdico. Estes estudos ainda sugerem que o tamanho do lote influencia mais na quantidade de resduo de clorofrmio do que a temperatura do banho.

A melhor maneira de controlar os nveis de endotoxinas das preparaes de lipossomas a utilizao de matria-prima de alta qualidade com baixos nveis de endotoxinas e a conduo do processo em condies asspticas com utenslios despirogenizados. Para a utilizao dos lipossomas como um sistema controlador da liberao de drogas, necessria a completa remoo da droga livre. Para isso so utilizadas vrias tcnicas como cromatografia de troca inica (AMSELEM et al., 1990), ultrafiltrao e cromatografia por excluso de tamanho (VEMURI;RHODES, 1994).

Lipossomas no podem ser esterilizados pela exposio a altas temperaturas, e tambm so sensveis aos vrios tipos de irradiao, bem como esterilizao por agentes qumicos. Logo, o nico mtodo disponvel para a esterilizao a filtrao em membranas de 0,22 m, para lipossomas pequenos. Para lipossomas maiores, o processo deve ser conduzido em condies asspticas (NEW, 1990).

Mtodos comumente utilizados para a preparao de lipossomas que podem ser utilizados no escalonamento incluem hidratao do filme lipdico, homogeneizao sob alta presso, injeo de solvente orgnico e uso de gradiente de pH. Amselem e colaboradores (1990) compararam cinco mtodos de preparao de lipossomas por hidratao do filme lipdico. Para o escalonamento de lipossomas de doxorrubicina, um frmaco lipoflico, foi escolhido o processo chamado hidratao lenta do filme lipdico delgado, constitudo de fosfatidilcolina:fosfatidilglicerol:colesterol (concentrao lipdica 35 mM, razo molar 7:3:4). Aps a hidratao do filme, foi realizada a extruso em membranas de policarbonato de 0,4 e 0,2 m. Lipossomas oligolamelares foram obtidos, de dimetro compreendido entre 300-500 nm, com taxa de encapsulao de 97 % .O dimetro dos lipossomas no sofreu alterao por um perodo de 5 meses, a 4 C. Este mtodo mostrou-se o mais eficiente em termos de encapsulao do frmaco.

Um outro mtodo utilizado para o escalonamento de lipossomas foi a homogeneizao sob alta presso. Mesoporfirina de estanho, um inibidor competitivo da hemeoxigenase, foi dissolvido em metanol. A esta soluo foi adicionada fosfatidilcolina de ovo previamente dissolvida em uma mistura metanol:clorofrmio (9:1). O solvente foi evaporado em rotavapor sob presso reduzida. Ao filme lipdico formado foi adicionada uma soluo de lactose 0,05 M/tampo fosfato 0,004 M. Essa mistura foi ento homogeneizada por 2 horas e aps esse

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perodo, submetida microfluidizao, a 60-80 psi. As vesculas obtidas apresentaram dimetros menores de 200 nm e taxa de encapsulao acima de 90 %. Os lipossomas de mesoporfirina de estanho foram esterilizados por filtrao e liofilizados em um ciclo de um dia, com reteno do dimetro das vesculas e manuteno da taxa de encapsulao. A lactose foi utilizada por suas propriedades crioprotetoras e por sua aceitabilidade em formulaes para uso parenteral (CANNON et al., 1993).

Jeffs e colaboradores (2005) utilizaram o mtodo da injeo de solvente seguida de ultrafiltrao da preparao de lipossomas constitudos de colesterol: diestearoilfosfatidilcolina:dioleiloxidimetimetilaminopropano:diestearoilglicerometoxipolietilenoglicol 2000 (concentrao lipdica 20 mM, razo molar 55:20:15:10, respectivamente) para a encapsulao de plasmdeo de DNA em larga escala. Com esse mtodo foram obtidas vesculas de dimetro inferior a 200 nm e taxa de encapsulao acima de 80 %.

VEMURI e RHODES (1994) sugeriram a utilizao do mtodo de encapsulao por gradiente de pH seguido de diafiltrao para o escalonamento de lipossomas constitudos por fosfatidilcolina de ovo:fosfatidilglicerol de ovo:colesterol contendo sulfato de orciprenalina (100 mg/mL). O filme lipdico foi hidratado com tampo fosfato contendo 5 % lactose, pH 4,5, e o frmaco foi dissolvido em tampo fosfato contendo 5 % de lactose, pH 9,5. Por esse mtodo, foram obtidos lipossomas unilamelares e oligolamelares, de dimetro inferior a 200 nm e com taxa de encapsulao de 80-85 %. O processo de liofilizao no alterou o dimetro das vesculas, porm reduziu a porcentagem de encapsulao em 15 %. O extravasamento do frmaco foi associado ao aumento do tamanho das vesculas, durante o armazenamento.

Para a produo em larga escala de lipossomas unilamelares grandes (LUV) pode-se utilizar o mtodo da microfluidizao, no qual a suspenso lipdica forada repetidamente sob alta presso atravs de um pequeno orifcio para colidir contra uma parede ou um fluido que venha em sua direo contrria. As desvantagens so a relativa alta polidispersibilidade da disperso lipossomal, dificuldades em refinar o dimetro das vesculas e algum risco de degradao da amostra (ULRICH, 2002).

BARNADAS-RODRGUEZ e SABS (2001) estudaram uma variedade de fatores a fim de avaliar as caractersticas de lipossomas obtidos em um microfluidizador. Fatores tais como a presso, tempo que as amostras so processadas (ciclos), a fora inica, a concentrao de fosfolpide e a quantidade de solvente orgnico (etanol) foram relacionados com o dimetro mdio dos lipossomas e sua heterogeneidade. Para minimizar o nmero de experimentos foi aplicado o design fatorial, como estratgia estatstica de otimizao. Como

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as caractersticas das suspenses lipossomais determinam sua eficincia de encapsulao e aplicao, um conhecimento detalhado do processo de homogeneizao pode facilitar a escolha das condies de trabalho para a obteno de um tipo de lipossoma pr-determinado. Atravs da variao do nmero de ciclos (0-9) e da presso empregada (1273-5092 Bar), os resultados mostram que o dimetro sempre diminui com o aumento do nmero de ciclos e com o aumento da presso. Entretanto, h um limite no nmero de ciclos empregado para um valor de presso constante, a partir do qual, no ocorre mais a diminuio do dimetro. Esse valor constante foi atingido em todos os valores de presso em aproximadamente sete ciclos. Em amostras homogeneizadas a aproximadamente 3000 Bar, por 9 ciclos, foram obtidos lipossomas de dimetro igual a 134 nm.

11 Proposta de estudo da estabilidade e produo em escala piloto de SpHL-CDDP sob a forma liofilizada

Uma formulao de SpHL-CDDP foi desenvolvida em escala laboratorial, pelo nosso grupo de pesquisa, mediante o emprego do mtodo de evaporao em fase reversa (REV) seguida de extruso e ultracentrifugao. Estudos de biodistribuio mostraram que aps a administrao de SpHL-CDDP, por via endovenosa, a CDDP atingiu uma concentrao aproximadamente 2 vezes maior em tumores slidos de camundongos do que aps a administrao de CDDP livre (JUNIOR et al., 2007a,b). Diante desses resultados, teve incio a pesquisa da viabilidade da transposio de escala e da produo desta formulao sob as formas lquida e liofilizada para futura avaliao em testes clnicos. O processo deve ser reprodutvel e levar produo de lipossomas estreis e livres de pirognios (WAGNER et al., 2002). Outro fator a ser considerado a estabilidade do produto, que no caso dos lipossomas pode ser limitada pelo extravasamento do frmaco a partir das vesculas, mudanas no tamanho das partculas durante a estocagem e pela estabilidade qumica do frmaco e dos componentes lipdicos (CANNON et al., 1993). A liofilizao na presena de dissacardeos, como sacarose e trealose, permite a manuteno da estabilidade de uma formulao, impedindo o extravasamento do material encapsulado e a alterao do dimetro vesicular (CROWE et al., 1998). Desse modo, nessa dissertao de mestrado foram avaliados o uso de crioprotetores na preparao de SpHL-CDDP na forma liofilizada, um mtodo de preparo dessa formulao em escala piloto e a estabilidade de armazenamento da mesma.

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OBJETIVOS

Objetivo geral

O presente trabalho de dissertao de mestrado teve como objetivos estudar diferentes parmetros relacionados estabilidade qumica e fsico-qumica de uma formulao de SpHL-CDDP, assim como estabelecer um processo eficiente para a sua produo em escala piloto.

Objetivos especficos

Desenvolver uma formulao farmacutica de SpHL-CDDP sob a forma liofilizada e avaliar o teor de encapsulao, dimetro e potencial zeta das partculas;

Avaliar a estabilidade fsico-qumica da formulao de SpHL-CDDP lquida e liofilizada ao longo do tempo de armazenamento;

Avaliar a eficincia de um processo de preparo de uma formulao de SpHL-CDDP em escala piloto constitudo pelas etapas de evaporao sob vcuo/homogeneizao sob alta presso/ultrafiltrao.

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MATERIAL E MTODOS

1 Material

Dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) e diestearilfosfatidiletanolamina-polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG2000) foram adquiridos da Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha). Hemisuccinato de colesterila (CHEMS) foi fornecido pela Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). A CDDP foi adquirida da Quiral Qumica do Brasil S/A (Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil). A sacarose e a trealose dihidratada, N-[2-hidroxietil] piperazina N-[2-cido etanosulfnico] (HEPES) e hidrxido de sdio foram adquiridos da Vetec Qumica Fina Ltda. (Rio de Janeiro, Brasil).

O metanol, acetato de etila e a N, N- dimetilformamida (DMF), todos solventes grau HPLC, foram adquiridos da Tedia (Fairfield, Ohio, Estados Unidos). Os solventes clorofrmio P.A. e ter etlico P.A. foram adquiridos da Synth (So Paulo, Brasil). O cloreto de sdio P.A. e o isopropanol foram provenientes da Merck (Darmstadt, Alemanha). A gua utilizada em todos os experimentos foi deionizada e destilada.

2 Mtodos gerais

Os lipossomas foram preparados utilizando um rotavapor Buchi Labortechnik AG CH-9233, modelo R-210, acoplado a uma bomba de vcuo de mesma marca, modelo V-700 (Flawil, Sua). A calibrao dos lipossomas produzidos em pequena escala foi feita atravs de um extrusor Lipex Biomembranes, modelo T 001 (Vancouver, Canad). Para a calibrao dos lipossomas produzidos em larga escala foi utilizado um homogeneizador de alta presso de estgio nico, modelo APV 2000 (Albertslund, Dinamarca). A purificao dos lipossomas foi realizada por ultracentrifugao, utilizando uma ultracentrfuga Sorvall Ultra 80 (Albertville, Estados Unidos) ou por ultrafiltrao em um dispositivo Millipore Pellicon XL com membrana de politersulfona Biomax de 300 kDa (Massachusetts, Estados Unidos) acoplada a uma bomba peristltica Watson-Marlow 313S (Inglaterra). Os lipossomas obtidos foram caracterizados quanto ao dimetro das partculas e potencial zeta utilizando o Zetasizer Malvern Instruments, modelo 3000 HSA (Malvern, Inglaterra). A liofilizao foi realizada em liofilizador E-C Modulyo, acoplado a uma bomba Edwards, modelo E2M18FF (Inglaterra). O teor de encapsulao foi determinado em cromatgrafo lquido de alta eficincia Waters Instruments, composto por uma bomba modelo 515, um auto-injetor modelo 717 Plus e um

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detector DAD modelo 2996 (Milford, Estados Unidos), conectado a um computador apresentando o software Empower, verso 2.0. As amostras foram vortexadas em Mini-shaker Ika, modelo MS1 (Wilmington, Estados Unidos).

3 Obteno da curva de calibrao para doseamento da CDDP

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) foi utilizada como mtodo de doseamento da CDDP, segundo mtodo analtico descrito na Farmacopia Americana 24 edio (USP 24), com modificaes no eluente empregado. O eluente descrito na USP 24 constitudo por acetato de etila, metanol, dimetilformamida e gua, na proporo de 25:16:5:5, respectivamente; enquanto o eluente utilizado neste trabalho constitudo por acetato de etila, metanol, dimetilformamida e gua, na proporo 4:4:1:1, respectivamente. A cisplatina foi separada utilizando como fase estacionria a coluna Lichrosper 100 NH2, 25

cm x 4 mm, 10 m (Darmstadt, Alemanha). O volume de injeo foi de 20 L, em fluxo igual a 1,0 mL.min-1 e o material eludo foi detectado em comprimento de onda igual a 310 nm.

3.1 Linearidade

Para a determinao da linearidade do mtodo de CLAE empregado no doseamento da CDDP foi construda uma curva de calibrao apresentando 6 pontos relativos a diferentes concentraes de soluo padro de CDDP, preparadas em triplicatas. Inicialmente, uma soluo concentrada de CDDP 2 mg/mL foi preparada pela solubilizao de 50 mg de CDDP em 20 mL de soluo de cloreto de sdio 0,9 g% (p/v), sob aquecimento em temperatura inferior a 45 C, seguida de agitao em vrtex. A soluo de CDDP obtida foi transferida quantitativamente para um balo volumtrico de 25 mL, completando-se o volume com soluo de NaCl 0,9 g% (p/v). A partir desta soluo, foram transferidas alquotas de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 e 8,00 mL para bales volumtricos de 10 mL. O volume de cada balo foi completado com fase mvel para a obteno das respectivas concentraes de 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,80 e 1,60 mg/mL de CDDP. As solues foram mantidas a temperatura ambiente e protegidas da luz, seguido de sua injeo no cromatgrafo lquido utilizando as condies cromatogrficas descritas acima. A partir das reas dos picos obtidos, a curva de calibrao foi construda e a linearidade do mtodo foi avaliada mediante o clculo de regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados.

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4 Preparao de lipossomas pH-sensveis furtivos de CDDP (SpHL-CDDP)

A preparao de SpHL-CDDP foi realizada mediante o emprego do mtodo de evaporao em fase reversa (REV). Aps a obteno das vesculas lpidicas, a produo foi efetuada por dois mtodos distintos, que foram denominados como Mtodo 1, a produo de liposssomas em pequena escala; e Mtodo 2, a produo em escala piloto (Figura 11).

Figura 11 Organograma da produo de lipossomas pH-sensveis furtivos.

4.1 Mtodo 1 Preparao de SpHL-CDDP em pequena escala pelo mtodo REV

4.1.1 Obteno de uma emulso gua em leo (A/O)

Alquotas clorofrmicas de DOPE, CHEMS e DSPE-PEG2000 (concentrao lipdica total igual a 40 mM; razo molar igual a 5,7:3,8:0,5; respectivamente) foram transferidas para um balo de fundo redondo, sendo o solvente, em seguida, evaporado sob vcuo. O filme lipdico obtido foi dissolvido em 3,0 mL de ter etlico, previamente tratado com soluo de tampo HEPES 10mM para eliminao de perxidos e em uma quantidade de soluo de hidrxido de sdio necessria para ionizar completamente o CHEMS. Posteriormente, para a obteno de lipossomas de CDDP, foi adicionado 1,0 mL de uma soluo de NaCl 0,9 g%

Preparao de lipossomas pH-sensveis furtivos por

REV

PEQUENA ESCALA MTODO 1

ESCALA PILOTO MTODO 2

Extruso em membranas de policarbonato

Homogeneizao sob alta presso

Ultracentrifugao

Ultrafiltrao

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(p/v) contendo CDDP 2,0 mg/mL, soluo lipdica. A mistura obtida foi, ento, submetida ao vrtex durante 5 minutos, produzindo uma emulso do tipo A/O.

4.1.2 Obteno de SpHL-CDDP

Posteriormente, a emulso A/O foi submetida evaporao sob vcuo a fim de se eliminar o solvente orgnico, permitindo a formao das vesculas lipdicas. Em seguida, os lipossomas foram submetidos calibrao mediante sua passagem atravs de membranas de policarbonato da marca Millipore (Bedford, Estados Unidos).