DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Análise da produção de celulases

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Análise da produção de celulases e beta glicosidase produzidas por

Streptomyces sp.

ELVIA DENISE DE SOUSA VILELA

Goiânia

2013

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

Análise da produção de celulases e beta glicosidase produzidas por

Streptomyces sp.

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-graduação

em Biologia, da Universidade

Federal de Goiás, como

requisito parcial a obtenção

do titulo de Mestre.

Orientado: Elvia Denise de Sousa Vilela

Orientador: Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus

Co-orientadora: Profa. PhD. Rosália do Santos

Amorim Jesuino

Goiânia - 2013

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“Cada dia que amanhece assemelha-

se a uma página em branco, qual gravamos

os nossos pensamento, ações e atitude. Na

essência, cada dia é a preparação de nosso

próprio amanhã, por isso agradeço todas as

dificuldades que enfrentei; não fosse por

elas, eu não teria saído do lugar. As

facilidades nos impedem de caminhar.”

Chico Xavier

4

Dedico esse trabalho

a meus pais e irmão, que

ajudaram na superação dessa

nova etapa da minha.

5

AGRADECIMENTOS

Esse é o momento em que podemos dizer as pessoas que amamos e que fazem tanta

diferença na minha vida e sempre farão, o quanto sou grata a elas por ter conseguido obter êxito

em mais essa etapa da minha.

Em primeiro lugar devo agradecer a Deus por ter me concedido a graça da saúde e por ter

me dado a felicidade de ter nascido em um lar onde todos me amam, me protegem e incentivam,

as vezes com palavras duras, mas verdades que precisam ser ditas, para que possamos crescer.

Agradeço aos meus pais, pois se não fosse eles eu não seria quem sou, pois eles me

amaram desde o primeiro momento e me amam incondicionalmente, me proporcionam a

possibilidade de estudar sem precisar me preocupar com outras coisas, isso faz uma enorme

diferença e como faz. A minha mãe que sempre me ensinou os valores de família, redução e

amor. Ao meu pai, que sempre ensinou o que é amor e sempre me fez me sentir a menina mais

protegida do mundo, e que nada nem ninguém poderia me machucar. Eles me mostraram que a

única coisa que temos nossa e quem ninguém pode nos tirar são os estudos e assim podemos

crescer e nos tornar pessoas melhores.

Muitas vezes não entendemos o amor dos nossos pais, mas é o amor mais belo e puro que

temos e sou enormemente grata por eles me amarem tanto assim. Eu os amo mais que tudo na

minha vida.

Quero agradecer também aos meus irmãos que sempre me apoiaram e me incentivaram a

crescer. Agradeço a minha irmã Erica que sempre percebe como estou e chega sempre com as

palavras e atitudes certas, no momento que preciso. Agradeço ao meu irmão Paulo Sérgio que

sempre me incentivou a fazer o curso que eu queria e me formar nele, e tomando amor pela área

da pesquisa, que muitas vezes é difícil, mas no final é o que me do orgulho. Agradeço ao meu

irmão Mário vezes ríspido em seus comentários, mas incentivador. Obrigada

Agradeço também a profa Rosália que me aceitou em seu laboratório para começar minha

iniciação cientifica e me ajudou na minha dissertação. Obrigada

Agradeço a Lorena, que me ajudou no inicio do meu aprendizado e sempre me deu

ótimos conselhos, Carol que no inicio do meu mestrado me ajudou muito me ensinando todos os

processos e a Carla do LQP que me ajudou muito, me meu trabalho. Obrigada

Agradeço com muito carinho ao meu orientador prof. Luiz Artur, por ter me aceito em

seu laboratório, confiado em mim, por sempre me motivar quando tudo dava errado, sou grata a

ele pela paciência de sempre. Sempre me lembrarei dele com muito carinho. Obrigada

Agradeço ao prof. Ivan Campos, que sempre me ajudou muito tirando dúvidas e

descontraindo em alguns momentos. Bom amigo. Obrigada

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Agradeço a Glace, secretária da pós-graduação, sempre disposta a ajudar nós pós

graduando. Obrigada

Muito obrigado a Marilene e seu grupo de oração, que sempre rezarão por mim e me

ajudaram nos momentos que eu mais precisei, me ajudando a ter paz e me mostrando o amor de

Deus por seus filhos.

Enfim, sou grata a todos que direta ou indiretamente me ajudaram, apoiaram em mais

essa conquista de muitas em minha vida. A vocês, meus mais sinceros agradecimentos e

carinho...

i

ii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Estrutura celulósica de materiais lignocelulosico, ilustrando a extremidade redutora e não

redutora da celulose e a Celobiose formada pela união de duas moléculas de glicose (adaptado de

ZHANG & LYND, 2004). 3

Figura 2- Conformação da fibra cellulose (SANDGREEN et al., 2005). 4

Figura 3- Constituição monomérica da hemicelulose. Adaptada de Sjostrom & Alén (1999). 5

Figura 4- Estrutura das Xilanas. Adaptado de Palmeiras et al., (2010). 6

Figura 5- Esquema da ação das endoglicanases, celobiohidrolase e exoglicanases, em ação conjunta na

hidrólise da celulose. Adaptado de Carns & Esen (2010). 11

Figura 6- Representação esquemática da ação catalítica do complexo enzi¬mático (celulase) sobre

celulose com geração de glicose. 12

Figura 7- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo, suplementado

com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de levedura como

fonte de nitrogênio. 33

Figura 8- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo, suplementado

com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de levedura como

fonte de nitrogênio 34

Figura 9- Análise da produção de Beta glicosidase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,

suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de

levedura como fonte de nitrogênio. 34


suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de

levedura como fonte de nitrogênio. 35

Figura 11- Análise qualitativa de beta glicosidase por TLC. 35

Figura 12- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de levedura,

visando o aumento da produção de CMCase pelo Streptomyces sp (isolado I7). 38

Figura 13 - Predição Matemática do ótimo de atividade para produção de CMCase. 38

Figura 14 - Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de levedura,

visando o aumento da produção de Avicelase pelo Streptomyces sp (isolado I7). 39

Figura 15 - Predição matemática do ótimo de atividade de Avicelase. 39


visando o aumento da produção de FPase pelo Streptomyces sp (isolado I7). 40

Figura 17- Predição matemática do ótimo de atividadede de FPase produzida pelo isolado I7. 40


visando o aumento da produção de Beta glicosidase pelo Streptomyces sp (isolado I7) 41

Figura 19- Valores das concentrações ideais de farelo de trigo e de extrato de levedura para otimização

do processo de produção de beta glicosidase pelo Streptomyces I7. 41

Figura 20- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado I7

mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo de trigo

0,75% e extrato de levedura 0,1%. 44

iii

Figura 21- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de FPase, com isolado I7 mantido

por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e

extrato de levedura 0,1%. 45

Figura 22- Cinética de produção de celulases com ensaio de atividade de Avicelase, com isolado I7

mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com Farelo de trigo


Figura 23- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado I7

mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo de trigo


Figura 24 - Efeito da variação do pH sobre atividade de CMCase do isolado I7. O isolado I7 foi cultivado

em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 47

Figura 25 - Efeito da variação do pH sobre atividade de FPase do isolado I7. O isolado I7 foi cultivado

em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 48

Figura 26- Efeito da variação do pH sobre atividade de Avicelase do isolado I7. O isolado I7 foi

cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 48

Figura 27- Efeito da variação do pH sobre atividade de Beta glicosidase do isolado I7 cultivado em meio

mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.6.6 Influência da

temperatura na atividade das enzimas testadas. 49

Figura 28 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de CMCase. O ensaio foi relaizado em pH

4,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de

levedura 0,1%. 50

Figura 29 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de FPase. O ensaio foi realizado em pH

5,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de

levedura 0,1%. 51

Figura 30– Efeito da variação de temperatura sobre atividade de Avicelase. O ensaio foi realizado em

pH6,0. O ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de

levedura 0,1%. 51

Figura 31- Efeito da variação de temperatura sobre atividade de beta glicosidase (pH 4,5)do ilsolado I7

cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 52

Figura 32- Termoestabilidade de CMCase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade relativa

expressa em porcentagem. 54

Figura 33- Termoestabilidade de FPase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade relativa


Figura 34- Termoestabilidade de Avicelase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade relativa


Figura 35 - Termoestabilidade de beta glicosidase do sobrenadante de cultura produzida pelo isolado I7

com atividade relativa expressa em porcentagem 56

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iv

LISTA DE TABELA

Tabela I – Variação das concentrações de extrato de levedura e farelo de trigo respectivamente. 26

Tabela II– Composição centesimal do farelo de trigo, farelo de arroz e farelo de milho. 30

Tabela III – Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL) 37

Tabela IV– Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL) 42

Tabela V - Efeito dos diferentes íons e do EDTA na atividade de CMCase, Fpase, Avicelase e beta

glicosidase. 58

iv

1

v

LISTA DE ABREVIATURAS

Avicel- Celulose microcristalina

Avicelase- Atividade enzimática contra avicel

BGL- Beta glicosidase

BGA- Bagaço de cana-de-açucar

CBH- Celobiohidrolases

CMC- Carboxmetilcelulose

CMCase- Atividade enzimática contra CMC

DNS- Ácido 3,5- dinitrosalicílico

EL- extrato de levedura

FPase- Atividade enzimática contra papel de filtro

FA- Farelo de arroz

FM- Farelo de Milho

FT- Farelo de trigo

GGMs- Galactoglucomana

MM- Meio Mínimo

q.s.q- Quantidade suficiente para

SDS- Sódio dodecil sulfato

U- Unidade enzimática( quantidade de enzima capaz de formal 1 μmol de produto por minuto,

em condições experimentais).

1

RESUMO

No Brasil o bagaço de cana de açúcar é considerado um dos mais importantes resíduos

agroindustriais e sua utilização vêm sendo estudada. Uma das possibilidades é hidrólise

enzimática desse resíduo, visando à sacarificação e posterior produção de etanol. Uma das

prioridades de pesquisa nesta área é a busca por novos microrganismos que produzam celulases a

partir de matérias-primas de baixo custo. O objetivo desse trabalho foi o de estudar a produção

de celulases e beta glicosidases por uma nova linhagem de Streptomyces sp cultivada em

diferentes fontes de carbono. A produção de celulases e beta glicosidase foi analisada por

fermentação submersa em meio mínimo contendo farelo de milho, farelo de arroz e farelo de

trigo como fonte de carbono e extrato de levedura como fonte de nitrogênio. Os resultados

demonstraram que o farelo de trigo foi o melhor indutor para ambas as enzimas. A analise da

superfície de resposta foi utilizada para determinar as concentrações de farelo de trigo e de

extrato de levedura mais adequadas para aumentar a produção destas enzimas. O Streptomyces

sp. foi cultivado em meio contendo diferentes concentrações de farelo de trigo (0,25 a 75%) e

extrato de levedura (0,1 a 0,3%). A maior atividade foi obtida com 0,75% de farelo de trigo e

0,1% de extrato de levedura,tanto para celulases como parabeta glicosidases. As condições

sugeridas pela metodologia de superfície de resposta foram utilizadas para avaliar a influência do

tempo de cultivo sobre a produção das enzimas. A produção foi acompanhada por 12 dias. A

maior atividade de CMCase foi obtida no 8°dia de cultivo (26 U/mL), FPase no 9º dia de cultivo

(11,25 U/mL), Avicelase no 7ºdia de cultivo (5 U/mL) e beta glicosidase 9º dia de cultivo (7

U/mL). A influência do pH (3,0 – 10,0), temperatura (40 a 80°C) e íons metálicos foram

avaliados. A atividade de CMCase foi maior em pH 4.5 e temperatura de 50°C, FPase foi maior

em pH 5,5 e temperatura 50°C, Avicelase em pH 5,0 e temperatura de 40°C e beta glicosidase

em pH 4,5 e temperatura de 65°C. Vários íons metálicos analisados resultaram na indução da

atividade de CMCase e Avicelase. A atividade de FPase só foi estimulada pelo Mn2+

. O EDTA

reduziu a atividade de CMCase em 86%, FPase em 36%, Avicelase em 81%. A beta glicosidase

foi totalmente inibida. A termoestabilidade foi avaliada por pré-incubação a 50°C e 60°C para

celulases e 60º e 65ºC para beta glicosidase. A atividade de CMCase manteve-se plena por até

120 minutos de pré-incubação a60°C. FPase e Avicelase tiveram sua atividade aumentada por

pré-incubação a 50ºC. A beta glicosidase manteve atividade elevada por pré-incubação por

150minutos a 60ºC. Os resultados demostram que as enzimas produzidas por esse

microrganismo têmpotencial para ser utilizada em processos biotecnológicos.

2

ABSTRACT

Sugar cane bagasse is considered one of the most important agro-industrial residues in

Brazil and its use has been studied. One possibility is the enzymatic hydrolysis of this waste,

aiming further saccharification for ethanol production. One of the main research goals in this

area is the search for new microorganisms that produce cellulases from lower-cost source

materials. The aim of this work was to study the production of cellulases and beta-

glucosidasesfrom a novel Streptomyces sp strain grown on different carbon sources. The

production of cellulases and beta-glucosidases was analyzed by submerged fermentation in

minimal medium containing corn bran, rice bran and wheat bran as carbon sources and yeast

extract as nitrogen source. Wheat bran was the best inducer for both enzymes. A response surface

analysis was used to determine the concentrations of wheat bran and yeast extract best suited to

increase the production of cellulases and beta-glucosidases. The Streptomyces sp. was grown in a

medium containing different concentrations of wheat bran (0.25 to0.75%) and yeast extract (0.1

to 0.3%). The highest activity was obtained with 0.75% wheat bran and 0.10% yeast extract for

both cellulases and beta glucosidases. Conditions suggested by the response surface analysis

were used to evaluate the influence of culture time on enzyme production. The production was

monitored for 12 days with the highest activity of CMCase obtained on the 8th day of culture (26

U / mL), FPase on the 9th day of culture (11.25 U / mL), Avicelase on the 7th day of culture (5 U

/ mL) and beta glucosidase on 9th day of culture (7 U / ml). The influence of pH (3.0 to 10.0),

temperature (40 to 80 °C) and metal ions was evaluated. CMCase activity was highest at pH 4.5

and 50 °C, FPase at pH 5.5 and 50 °C, Avicelase at pH 5.0, and 40 °C and beta-glucosidase at pH

4.5 and 65 °C. Several metal ions analyzed resulted in the induction of CMCase and Avicelase

activity, while FPase activity was only stimulated by addition of Mn2+. EDTA reduced CMCase

activity by 86%, FPase by 36%, Avicelase by 81% and beta-glucosidase was completely

inhibited. The thermostability of these enzymes was evaluated by preincubation at 50 °C and 60

°C for cellulases, and 60°C and 65 °C for beta glucosidases. Full enzymatic activity remained

after 120 minutes of pre incubation at 60 °C and 180 minutes at 50 °C for CMCase. FPase and

Avicelase activities were increased with 30 minutes of pre-incubation at 50 ºC and 60 ºC. Beta

glucosidase activity remained elevated for at least 2 hours of incubation at either 60 ºCor 65 ºC.

These results demonstrate that the enzymes produced by this microorganism have the potential to

be used in biotechnological processes.

1

Introdução

Atualmente, no Brasil tem se investido bastante em pesquisas que envolvam a obtenção

de energia a partir de fontes alternativas e renováveis, com intuito de reduzirà utilização de

energia fóssil, que particularmente tem causado enormes alterações ao clima como aquecimento

global, pela emissão de gás carbônico(SANCHEZ , 2009;PICCOLO &BEZZO, 2009).

Existem inúmeras fontes de se obter energia renovável como a partir do milho, beterraba,

trigo, cana-de-açúcar e etc., no Brasil se destaca a produção de bioetanol de cana-de-açúcar. O

bioetanol nacional vem substituindo, atualmente, metadeda gasolina que seria consumida no

país, por ser o etanol uma forma eficiente de combustível (LAVARACK et al., 2002).

O etanol produzido a partir da cana-de-açúcar pela fermentação da sacarose contida no

caldo é chamado de etanol de primeira geração. As usinas geram durante a produção do etanol

uma grande quantidade debiomassa residual, que geralmente tem sidoempregada na manutenção

de caldeiras e para gerar eletricidade, entretanto esta biomassa lignocelulósica pode ser utilizada

na produção de etanol denominado de segunda geração, garantido, desta maneira, um melhor

aproveitamento destes resíduos (BUCKERIDGE et al., 2009).

Esta biomassa é rica em lignina, celulose e hemicelulose, sendo a remoção da lignina por

pré-tratamento essencial para que haja a hidrólise dos polissacarídeos, em seus monossacarídeos

correspondentes, os quais serão fermentados a etanol de segunda geração. E a hidrólise destes

carboidratos em suas unidades monoméricas é realizada por hidrolases conhecidas como

celulases.

Neste contexto, a busca por microrganismos produtores de celulases vem crescendo nos

últimos anos e tem incentivado vários grupos de pesquisa a procurá-los nas mais diversas

microbiotas e a isolá-los de acordo com o seu potencial em hidrolisar os resíduos

lignocelulósicos.

1.1 Lignocelulose

Hoje se reconhece que os mecanismos de biodegradação dos materiais lignocelulósicos

podem ser conduzidos de forma controlada, usando fungos e bactérias pré-selecionados como

alternativa biotecnológica, por produzirem enzimas eficientes na degradação desses materiais.

2

Tais enzimas tem sido de grande importância na indústria como uma solução adequada, no que

diz respeito à reciclagem dos resíduos sólidos de origem vegetal, como resíduos lignocelulósicos.

A lignocelulose é o principal componente estrutural das plantas, é rica em carboidratos. A

biomassa lignocelulósica é um material complexo que consiste de três grandes frações orgânicas,

onde a celulose é um homopolímero cristalino de glicose compondo 40-50% da biomassa da

planta. Já a hemicelulose é um polímero heterogêneo com diferentespentoses e hexoses, podendo

alcançar entre 25-35% da biomassa lignocelulósica. A ligninaencontra-se ligada a celulose e a

hemicelulose, formando um lacre físico, uma barreira impenetrável, que confere resistência e

proteção contra ataques de microrganismo e estresse oxidativo. Esta pode representar entre 25-

35% da biomassa (VARNAI et al., 2010; DOUGHERTYet al., 2012).

A lignocelulose compreende metade do peso seco dos vegetais (SANCHEZ, 2009;

ADSULet al., 2005), sendoproduzida em grandes quantidades e muitas vezes sua utilização

resulta em uma grande quantidade de resíduos lignocelulósicos que não sãoutilizados

(TURNERet al., 2007). Um dos principais fins dado a esses resíduos era a incineração, hoje com

a nova legislação ambiental, essa prática é proibida em muitas regiões do país, que exigem o

adequado destino para esses resíduos. Um dos possíveis destinos dado a esses resíduos é a sua

degradação por enzimas produzidas por microrganismos, que conseguem hidrolisar celulose e

fazer que esta seja utilizada como matéria prima por algumas indústrias (SANDRIMet al., 2005)

1.2 Celulose

A celulose desempenha papel exclusivamente estrutural nas plantas, conferindo a célula

proteção osmótica e resistência mecânica. É o principal polissacarídeo da parede celular das

plantas representando de 35 a 50% do peso seco (BAYER&LAMED, 1992). É um polímero

linear de 8.000 a 12.000 unidades de glicose ligados por ligações β-1,4 glicosídicas, sendo que a

menor unidade repetitiva é a celobiose com sucessivos resíduos de glicose, assim a degradação

desta representa uma parte importante no ciclo do carbono na biosfera (LIMA et al., 2005;

TURNERet al., 2007). Este polímero apresenta uma extremidade redutora e uma extremidade

não redutora. Na figura abaixo (Figura 1), está demonstrado um modelo estrutural da molécula

de celulose, ressaltando a extremidade redutora e a não redutora da celulose, a ligação glicosídica

β-1,4 e a Celobiose.

3

Figura 1- Estrutura celulósica de materiais lignocelulósico, ilustrando a extremidade redutora e

não redutora da celulose e a Celobiose formada pela união de duas moléculas de glicose

(adaptado de ZHANG & LYND, 2004).

Após a síntese da celulose, esta se organiza em unidades de microfibrilas, sendo que essas

microfibrilas são mantidas unidas por ligações de hidrogênio, que mantém a rede mais fixa e

com caracteristicas hidrofóbicas (DASHTBANet al., 2009; FERREIRAet al., 2009). O

comprimento das cadeias de celulose na microfibrila varia de 100 a 40.000 nm, dependendo da

fonte onde esta é sintetizada, a partir de 2000-25.000 unidades de glicose em paredes primarias

(SANDGREENet al., 2005; FERREIRA et al., 2009). Essas microfibrilas (Figura 2) também são

mantidas por interações de Vander Waals entre as cadeias poliméricas que formam zonas com

estruturas cristalinas, em sua maioria, bastante ordenadas que não permite a água penetrar no seu

interior. Estas ligações, juntamente com as zonas cristalinas, que alternam com zonas amorfas,

correspondem a dois terços da celulose presente na madeira. A organização cristalina da celulose

influência na sua reatividade ao controlar o acesso a substâncias químicas ou enzimas aos grupos

funcionais e às ligações químicas nas regiões cristalinas. Dependendo da fonte, a celulose

cristalina varia de 50% a 90% (FERREIRAet al., 2009).

Extremidade Não-

redutora Ligação glicosidica β-1,4 Extremidade Redutora

Celobiose

4

Figura 2-Conformação da fibra cellulose (SANDGREEN et al., 2005).

1.3Hemicelulose

A hemicelulose é um polissacarídeo de baixa massa molecular associado à celulose e a

lignina. A hemicelulose se assemelha mais a celulose do que a lignina.Juntas formam a parede

celular das células vegetais e compreendem de 25-30% do peso seco dos vegetais (ALBERTON

et al., 2009).

A hemicelulose é um conjunto de componentes poliméricos presente nos vegetais, onde

cada componente tem sua particularidade.Este polissacarídeo tem uma estrutura complexa de

carboidratos, incluindo a xilana (homopolímero), xiloglucana (heteropolímero de D-xilose e D-

glucose), glucomanana (heteropolímero de D-glucose e D-manose), galactoglucomanana

(hetreopolímero de D-galactose, D-glucose e D-manose) e arabinogalactana (heteropolímero de

D-galactose e D-arabinose) (figura 3)(SANCHEZ, 2009 ; ALBERTONet al., 2009). A cadeia

principal pode ser constituída de uma só unidade(homopolímero) como a xilana, ou de duas ou

mais unidades (heteropolímero) como as glucomananas e arabinogalactanas, sendo que a

hemicelulose de madeira dura contém mais xilana e a hemicelulose presente em madeira mole

contém maior quantidade de glucomananas (PASTORE2004; SJOSTROM &ALÉN, 1999).O

componente mais abundante na hemicelulose é a xilana, constituindo aproximadamente 25% da

biomassa total de madeiras e gramas (ALBERTON et al., 2009).

5

Figura 3- Constituição monomérica da hemicelulose. Adaptada de Sjostrom & Alén (1999).

1.3.1 Xilana

A xilana é o principal componente da hemicelulose. É o segundo polissacarídeo mais

abundante na natureza depois da celulose. A cadeia principal é constituída por unidades do

homopolímero D-xilanopiranose ligados por β- 1,4 D-glicosídicas (SAHA, 2002; MERYANDIet

al., 2006; COLLINSet al., 2005)

Além da cadeia principal da xilana pode apresentar substituintes formando ramificações,

essa são denominadas de cadeis laterais. Entre os substituintes são encontradosO-acetil, α-L-

arabinofuranose, D-glucoronil e resíduos de O-metil-D-glucoronil.Pequenas quantidades de

ácido ferúlico e ρ-cumárico ligados a resíduos de L-arabinose também podem ser encontrados

(Figura 4) (MERYANDINIet al., 2006; KULKARANI et al., 1999).

6

Figura 4- Estrutura das Xilanas. Adaptado de Palmeiras et al., (2010).

A xilana situa-se entre a fibra de celulose e lignina, sendo essa camada responsável pela

manutenção da integridade da fibra, protegendo-as do ataque das celulases. Muitos

microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas extracelulares que são capazes de

degradar a biomassa lignocelulósica, promovendo a hidrólise desta. A hidrólise enzimática

completa da xilana requer a ação de enzimas xilanolíticas, a endoxilanase β-1,4, β-xilosidase e

enzimas acessórias tais como: α-glucoronidase, acetil esterase e α-L-arabinofuranosidase. Estas

enzimas são responsáveis pela conversão da xilana em xilose (GEORISet al., 2000;

MERYANDINIet al., 2006; RAWEESRIet al., 2008). A xilose pode ser usada para a formação de

alguns compostos úteis: como a fermentação do xilitol para obter ácidos orgânicos e também

etanol (RAWEESRIet al.,2008).

1.3.2 Galactoglucomanana

As galactoglucomanas é um dos principais componentes das madeiras macias,

perfazendo de 15 a 30% do peso seco (REYES et al., 2013). É constituída principalmente por

galactose, manose e glicose. Forma o segundo principal grupo das estruturas hemicelulósicas e

são constituídas por resíduos de D-manose ligados por ligações β 1,4, podendo estar substituídas

por resíduos de D-galactose, unidos por ligações α 1,6 (SOMERA, 2008). As proporções de cada

monossacarídeo (manose e galactose) podem variar de acordo com a espécie da planta (CAPEK

et al., 2002), sendo que as galactoglucomananas solúveis apresentam maiores quantidades de

galactose do que as GGMs insolúveis (MANASRAH et al., 2012).

A hidrólise das GGMs ocorre por ação das β-endomananases e β-manosidases. Essas

enzimas são normalmente obtidas de fungos (SOMERA, 2008). Segundo Reyes (2013) as

7

galactoglucomananas poderiam ser uma fonte potencial de açúcares fermentáveis visando à

produção de etanol.

1.3.3 Arabinogalactana

As arabinogalactanas são polissacarídeos estruturais e são encontrados em todos os

vegetais superiores, estando presente na estrutura da parede celular primaria (NGUEMA-ONA et

al., 2013).

As arabinogalactanas são formadas por uma cadeia de arabinose ligada a uma cadeia de

galactose, a fibra de celulose estaria coberta por varias moléculas de xiloglucanas ligadas

covalentemente a uma unidade interna de galactose da arabinoglucana (MELLINGER, 2006).

As arabinogalactanas apresentam diferenças na cadeia principal, que leva a classificação

desta em dois grupos: as arabinogalactanas tipo I, que são as pouco ramificadas e com cadeia

principal de (1 4) β-D-galactanas e as do tipo II, altamente ramificadas que são constituídas por

cadeia principal (1 3) e /ou (1 6) β-D-galactana (OOSTERVELD et al., 2002). As enzimas que

atuam sobre esta molécula são denominadas de arabinogalactanases, as quais têm sido utilizadas

na extração de sucos.

1.4 Lignina

A lignina é encontrada em plantas terrestres, está associada à celulose e a hemicelulose,

conferindo a planta rigidez, impermeabilidade e resistência a ataques microbiológicos e

mecânico aos tecidos vegetais, sendo que o que confere essa maior resistência, é a lignificação

que ocorre nos espaços interfibrilares da parede celular, fazendo com que ocorra perda da

elasticidade da parede celular, devido a esse fator a passagem de água pelas paredes celulares,

fica reduzida (NULTSH et al., 2000; RAVE et al., 2001). A lignina é um polímero derivado de

unidades fenilpropanóides, amorfo e insolúvel em água, tem estrutura com nove átomos de

carbono, que são repetidos de forma irregular, originada da polimerização do álcool coniferílico

e álcool sinergil. Os polímerosde lignina são altamente ramificados e não cristalinos. A lignina

varia sua composição química de acordo com a fonte de origem. Essa variação determina

diferença desusceptibilidade a hidrólise enzimática (SALIBA et al., 2001; SANCHEZ, 2009).

8

1.5Utilização industrial dos resíduos lignocelulósicos

Os resíduos lignocelulolíticostêm sido utilizados como fonte de proteína e energia para a

indústria da produção de ração animal. Segundo Tamanini & Hauly (2004) resíduos

lignocelulolíticos como bagaço de cana, palha de arroz e resíduos florestais, são fontes

abundantes de carboidratos com potencial aplicação biotecnológica. Estes compostos precisam

ser hidrolisados quimicamente ou por ação microbiana para sua utilização. A hemicelulose pode

ser degrada a xilose, por ação de xilanases, o qual pode ser convertido finalmente em xilitol. O

xilitol tem sabor doce semelhante à sacarose, é anticariogênico, tolerado por diabéticos e

recomendado para pessoas obesas.

Outra possibilidade de utilização dos resíduos lignocelulósicos é sua completa hidrólise

em monossacarídeos e dissacarídeos, os quais são utilizados para fermentação e produção de

etanol. Essa tecnologia é conhecida como etanol de segunda geração. Os resíduos sofrem pré-

tratamento por agentes químicos são hidrolisados por enzimas que liberam os açucares

fermentescíveis (KIM et al., 2013) .

A biomassa lignocelulósica é naturalmente degradada na natureza com o auxilio de

diversos microrganismos, principalmente diversos gêneros de fungos e bactérias, que produzem

enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas, em condições aeróbicas e anaeróbicas. Para a utilização

industrial dos resíduos lignocelulósicos, é necessário que estes sejam hidrolisados pela ação de

enzimas produzidas por microrganismos, gerando subprodutos rentáveis (SOCCOLet al., 2010).

A conversão de lignocelulose em glicose representa a etapa crucial na conversão deste

polímero em outros produtos químicos e no bioetanol. A hidrólise deste polímero por um

complexo de celulases tem atraído o interesse de muitos pesquisadores e no desenvolvimento de

muitos projetos de biotecnologia (NASCIMENTOet al., 2009).

A busca por novos microrganismos que produzam enzimas capazes de hidrolisar a

celulose vem sendo realizada por vários grupos de pesquisa.Dentre osmicroorganismos

estudados destacam-se os fungos e as bactérias. Dentre as bactérias um dos grupos mais

promissores é aquele formado pelas bactérias do gênero Streptomyces.

9

1.6Streptomyces sp.

Actimomicetos são bactérias Gram positivas, filamentosas, distribuídas no ambiente

aquático e terrestre, a maioria é estritamente saprófitos, mas algumas espécies podem ser

parasitas associados a plantas ou animais. Streptomyces é o principal gênero desse grupo, estes

possuem três características principais: micélio vegetativo (em substrato sólido ou liquido),

micélio aéreo e artrósporos. Bactérias desse gênero parecem existir no solo por longos períodos

como esporos e o que determina seu desenvolvimento são os nutrientes exógenos (BERGEY’S,

1984; SCHREMPF& WALTER, 1995).

Os Streptomyces possuem colônias de tamanhos pequenos, inicialmente lisas, hifas

vegetativas, com micélio aéreo e ramificado e raramente fragmentado, seus esporos não tem

motilidade, o aspecto liso das colônias é modificado quando o micélio aéreo promove um

aspecto floculado à colônia, crescem àstemperaturas de 25°C- 37°C, e em pH que pode variar

entre 6,5- 8,0. Os Streptomyces são usualmente conhecidos por serem mais ativos em estágios

mais avançados de decomposição de plantas e de outros materiais orgânicos, devido à produção e

liberação de enzimas que ajudam na degradação do material orgânico, desempenhado um papel

importante no volume relativamente complexo de polímeros recalcitrantes (BERGEY’S, 1984).

Esse gênero é o mais importante do grupo, pois são os principais produtores de um

grande número de compostos biologicamente ativos e utilizam uma diversidade de compostos

orgânicos, sendo que 45% desses compostos são produzidos por Actinomicetos, 38% por fungos

e 17%por bactérias unicelulares (KAVITHAet al., 2007). Dentre esses compostos está à

produção de antibióticos que são encontrados nos metabólitos secundários produzidos

principalmente por Streptomyces spp.Dentre os compostos produzidos por Streptomyces spp.,

estão importantes enzimas envolvidas em processos industriais e em processos de degradação de

material lignocelulosico, celulose, hemicelulose e lignina (VARNAIet al., 2010;

NASCIMENTOet al., 2009), este também tem grande potencial de degradar naturalmente outros

polímeros como quitina, queratina, pectina e atuar como fungicida, podendo também ser

aplicado na degradação de herbicida (VINHA et al., 2011).

Os microrganismos, principalmente os isolados de solos, são dotados de um imenso

potencial de degradação de material orgânico. Normalmente, produzem um conjunto de enzimas

hidrolíticas. A microbiologia do solo do cerrado ainda é pouco explorada e pouco conhecida,

10

estes microrganismos presentes neste solo e sua extrema resistência no meio ambiente permitirão

os rastreamentos dessas celulases, o que poderá ajudar na superação dos desafios na produção e

utilização destas enzimas (MAKI et al., 2011; TURNER et al., 2007).

Dentre as enzimas produzidas por esses microrganismos estão ascelulases. As celulases

produzidas por Streptomyces vêm sendo estudadas devido as suas características de serem

efetivas em diferentes faixas de pH e temperatura. Outra característica importe é que algumas

delas são termofílicas. A utilização de enzimas nos processos industriais tem como gargalo o

custo elevado das enzimas e suas características cinéticas. Uma das formas de se contornar esse

problema é pelo isolamento e caracterização de novos microrganismos produtores de enzimas.

1.7Hidrólise enzimática da celulose

As celulases são enzimas que hidrolisam celulose nas ligações glicosídicas β-1,4, e estão

presentes em 13 das 82 famílias de glicosilhidrolases conhecidas (SIGHANIAet al., 2010). A

hidrólise enzimática da celulose envolve três enzimas funcionando em sinergismo:

endoglicanases (endo 1,4 β-D- glicanase EC 3.2.1.14), celobiohidrolases ou exoglicanases (exo-

1,4 β-D-glicanase EC 3.2.1.91) e β-glicosidase (1,4 β-D-glicosidase EC 3.2.1.21) (Figura 5). A

celulose é clivada por endoglicanases, as quais promovem cortes no polímero de celulose,

expondo as extremidades redutoras e não redutoras. Enquanto as celobiohidrolases agem nas

extremidades redutoras e não redutoras deste polissacarídeo liberando oligossacarídeos, dentre

estes, unidades de celobiose. As beta glicosidases clivam a celobiose, liberando duas unidades de

glicose. Após a ação sinergística deste sistema celulolítico se tem a completa hidróliseda celulose

(VARNAIet al., 2010; SIGHANIAet al., 2010).

Fungos e bactérias, presentes no solo, produzem enzimas celulolíticas que hidrolisam a

celulose com o objetivo de obter energia a partir de unidades de glicose. Um ponto de partida

físico, muitas vezes uma moagem, auxilia as enzimas a alcançarem esse substrato mais

facilmente, pois o processo biológico emprega hidrolases diferentes, dependendo do tipo de

cultura e fracionamento (TURNERet al., 2007). As enzimas celulolíticas são eficientes na

degradação de materiais lignocelulósicos.

A hidrólise é o primeiro passo da bioconversão de celulose em glicose (um açúcar

solúvel), essa etapa envolve um complexo multienzimático, sendo este reconhecido como o

11

passo limitante no desenvolvimento de processos biotecnológicose na produção de

biocombustíveis (CHAUVAUX et al., 2010).

Figura 5-Esquema da ação das endoglicanases, celobiohidrolase e exoglicanases, em ação

conjunta na hidrólise da celulose. Adaptado de Carns & Esen (2010).

1.7.1 Celulases e Beta glicosidases

O termo celulases é amplamente aplicado à família das enzimas que hidrolisam celulose

(UEDAet al., 2010). Sendo que as enzimas relacionadas à degradação da celulose são divididas

em endoglicanases, exoglicanases e beta-glicosidases, e tem capacidade de hidrolisar ligações

glicosídicas β-1,4, diferindo apenas no ponto de partida e do substrato quando hidrolisado. As

endoglicanases clivam nas ligações internas da fibra de celulose, liberando celo-oligossacarideos,

as exoglicanases atuam nas extremidades do polímero(celulose), liberando a celobiose. As beta

Celulose Celobio-hidrolases

(GH 5,6,7,9,48)

Celobiohidrolases

(GH 5,6,7,9,48)

Endoglucanase (GH 5-

9,12,44,45,48,51,61,74

Celo-oligossacarideos Celobiose

Celodextrinase Beta glicosidase

Glicose

12

glicosidases hidrolisam a celobiose em oligossacarídeos solúveis (Figura 6) (MAEDAet al.,

2012; UEDAet al., 2010).

A hidrólise enzimática tem sido uma prática, uma vez que, condições moderadas de

temperatura e pressão, exigem baixo consumo de energia, apresentando elevada especificidade e

elimina a geração de substâncias tóxicas, normalmente encontradas na hidrólise química

(MAEDAet al., 2012).

Figura 6- Representação esquemática da ação catalítica do complexo enzimático (celulase)

sobre celulose com geração de glicose.

1.7.2 Endoglicanases

As endoglicanases atuam de forma aleatória sobre a fibra de celulose, liberando

oligossacarídeos de tamanhos variados. Essa enzima cliva a ligação β1,4 liberando extremidades

redutoras e não redutoras. Esta ação é muito importante para permitir a ação das

celobiohidrolases ou exoglicanases as quais são enzimas que irão hidrolisar os oligossacarídeos

em moléculas menores, como celobiose. Elas atuam sobre regiões amorfas da celulose, abrindo

espaço para ação de outras enzimas, elas não apresentam praticamente nenhuma atividade sobre

a celulose cristalina. São encontradas em diversos microrganismos, como fungos e bactérias.

Essas endoglicanases capacitam o microrganismo a sobreviver nos mais diversos habitats.Sua

atuação permite a obtenção de oligossacarídeos menores, os quais são mais facilmente

importados pelo microrganismo (TAKENAKA et al., 1999).

13

Algumas endoglicanases podem atuar sobre outros substratos como, por exemplo, a

xilana ter atividade sobre diferentes substratos, algumas dessas endoglicanases apresentam

atividade sobre xiloglucanas. Essa característica é importante para auxiliar na desestruturação da

fibra de celulose, permitindo uma maior taxa de hidrólise (LYND et al., 2002). Isso faz com que

as enzimas hidrolisem hemicelulose, auxiliando na remoção da lignina, o que permite a melhor

ação do sistema celulolítico sobre a fibra de celulose liberando extremidades redutoras e não

redutoras para a ação da exoglicanases (celobiohidrolases) (LYND et al., 2005)

1.7.3 Exoglicanases

As exoglicanase atuam sobre os oligossacarídeos gerados pela hidrólise da

endoglicanases e são importantes para a hidrólise da celulose cristalina, pois atuam de forma

lenta e gradual na diminuição do grau polimerização. As exoglicanase normalmente não atuam

sobre outros substratos. Podemos classificar essa atividade enzimática como sendo atividade de

celobiohidrolase que pode ser denominada exoglicanase (E.C 3.2.1.91) (KRUUS et al., 1995).

Os ensaios enzimáticos utilizando papel de filtro e avicel como substrato,foram

desenvolvidos para caracterizar atividade de exoglicanase. Esses substratos apresentam grande

quantidade de celulose cristalina na sua estrutura. Com base nesses ensaios, as celulases acabam

sendo classificadas como FPase e Avicelases quando conseguem hidrolisar esses substratos.

Normalmente apresentam baixa atividade devido ao mecanismo de ação das exoglicanases, que

atuam lenta e gradualmente removendo celobiose das extremidade da fibra de celulose

(COUGHLAN, 1985). A exoglicanase catalisa a hidrólise das ligações β1,4- D-glicosídicas na

celulose e celotetrose, liberando a celobiose das extremidades não redutoras da fibra de celulose,

podem ser também denominada celobiohidrolases (CBH)(KRUUS et al., 1995; CASTRO &

PEREIRA JR., 2010).

1.7.4Beta glicosidase

A beta glicosidase é uma enzima que catalisa a hidrolise da celobiose em duas moléculas

de glicose. Estes monossacarídeosserão fermentados e convertidos em biocombustível, o

etanol.A atuação das celulases geram celobiose, este dissacarídeo normalmente exerce efeito

inibitório na produção das celulases. Assim a ação das beta glicosidasetambém remove esse

efeito inibitório, permitindo que mais celulases sejam produzidas pelo microorganismo

(HARDIMANet al., 2010 ; SCHELLER & ULSKOR, 2010).

14

As beta glicosidases têm sido descritas na literatura como glicosil hidrolases pertencentes

as famílias GH1, GH3, GH5, GH9 e GH30, entretanto algumas beta glicosidases precisam ser

classificadas. Essas famílias são classificadas em diferentes grupos por apresentarem a mesma

estrutura de domínios catalíticos e aminoácidos conservados. As famílias GH1, GH5 e GH30 são

agrupadas na superfamíliaGH-A (CAIRNS&ESEN, 2010).

Em microrganismos são encontradas beta glicosidases da família GH1. Embora muito se

tenha estudado sobre as beta glicosidases dos microrganismos, o maior foco tem sido dado a sua

aplicação, e não a sua função endógena. Estas enzimas sãofrequentementecomponentes de

complexos denominados de celulossomo, que contémendoglicanases e proteínas que se ligam a

carboidratos que são responsáveis pela ligação entre a celulose e a membrana celular(CAIRNS &

ESEN, 2010).

1.8Aplicações biotecnológicas das celulases

Dentre as enzimas utilizadas em biotecnologia, as celulases tem atraído muito interesse

devido a suas diversas aplicações. As celulases tem mostrado um enorme potencial

biotecnológico, pois podem ser usadas com diversas finalidades, como degradação de materiais

lignocelulósicos e na desintoxicação de resíduos agroindustriais (El-SERSYet al., 2010;

NARAIANet al., 2010). Entre as principais aplicações industriais das celulases estão: a indústria

têxtil, fabricação de rações animal, indústria de bebidas, tais como cerveja, vinhos e sucos, na

indústria de papel e na produção de biocombustíveis.

As celulases são muito empregadas na indústria têxtil, devido a sua capacidade de modificar

a fibra de celulose de forma controlada, melhorando a qualidade dos tecidos, sendo empregadas

também no momento da fiação, tingimento e acabamento. Quando utilizadas em detergentes,

melhora o desempenho deste, pois permite a remoção de pequenas fibrilas difusas do tecido,

conferindo assim brilho e maciez ao tecido. As hidrolases quando utilizadas na alimentação de

animais ruminantes, aumentam o valor nutritivo dos alimentos, pois possuem a capacidade de

hidrolisar polissacarídeos presentes na parede celular dos vegetais (BATH,2000; El-SERSYet

al.,2010).

Na indústria da cerveja a ativação das hidrolases ocorre durante a maltagem e a fermentação.

Na indústria de vinhos, os principais benefícios dessas enzimas ocorrem em três etapas da

15

produção, na primeira ocorre ação da enzima no momento da maceração da pele da uva; segunda

há a facilitação da filtração devido à ação dessas enzimas e na terceira e última etapa, é no

momento da clarificação da bebida e no melhoramento da estabilidade do vinho. Na indústria do

papel essas celulases são utilizadas com diferentes finalidades. São utilizadas no momento em

que ainda é popa, pois esta enzima promove a modificação da popa alterando sua resistência,

quando o papel é produzido, são as celulases que auxiliam no biobranqueamento deste, o que faz

com que o papel branco tenha uma cor diferente do papel reciclado (BATH, 2000).

Na indústria de biocombustíveis as celulases estão presentes durante a hidrólise da celulose,

liberando os açúcares e facilitando assim o processo de fermentação e posterior formação do

bioetanol (LIMAYEN & RICK, 2012).

A bioconversão de celulose em etanol envolve dois processos importantes; sacarificação e

fermentação. A sacarificação é a hidrólise de polímeros de hidratos de carbono (celulose e

hemicelulose) em monossacarídeos. Este hidrolisado em seguida é utilizado como substrato para

segunda etapa que é a fermentação realizada por microrganismos. Durante a fermentação, as

enzimas produzidas pelos microrganismos degradam a lignocelulose e fermentam os açúcares

liberados (TURNERet al., 2007).

A conversão da biomassa em açúcares, para sua utilização como fonte de energia era uma

preocupação a cerca de trinta anos atrás. Hoje em dia o número de empresas que utilizam

biotecnologia tem crescido. A utilização de enzimas termoestáveis e microrganismo tem tido

atenção especial para pesquisas na área. Durante as ultimas décadas, tem havido um grande

interesse no emprego de microrganismos termófilos devido as suas proteínas serem capazes de

funcionar em temperaturas elevadas (TURNERet al., 2007).

A necessidade de utilização de celulases ocorreu devido ao interesse em diminuir custos de

produção e aumentar a eficiência nos processos que necessitavam do emprego de enzimas que

suportassem condições extremas inerentes da produção industrial. O desenvolvimento de

processos biotecnológicos para converter resíduos agroindustriais em produtos que não sejam

tóxicos ao meio ambiente vem sendo estudado, devido,principalmente, às recentes preocupações

ambientais (NARAIANet al., 2010).

16

Enzimas termofílicas oferecem alternativas de catalizadores capazes de suportar condições

relativamente extremas apresentadas nos processos industriais, podendo ser empregadas em uma

vasta gama destes processos, devido a esta extraordinária característica de estabilidade

operacional e tolerância à desnaturação. O interesse em biocatalizadores renováveis surgiu

recentemente, visto o possível esgotamento dos recursos fósseis de petróleo, bem como a

preocupação com o meio ambiente (TURNER et al., 2007; El-SERSY et al., 2010).

O emprego dessas enzimas vem sendo largamente pesquisado, buscando também a redução

de custos de produção e o aumento de eficiência, principalmente porque por meio de pesquisas

foi possível isolar enzimas que suportam condições extremas exigidas em processos industriais.

Sendo assim, são necessários mais estudos visando à melhoria dos processos de produção de

celulases.

1.9Aplicações biotecnológicas da Beta glicosidase

A beta glicosidase é de grande interesse para conversão da biomassa lignocelulósica, essa

conversão e realizada por três enzimas, exo-beta glicanase, endo-beta glicanases e a beta

glicosidase. A identificação e a produção da beta glicosidase, especialmente aquelas com elevada

tolerância à glicose, produzidas por fungos e bactérias, tem sido de grande interesse comercial

(CAIRNS& ESEN, 2010).

Fatores limitantes na conversão da celulose em glicose para a fermentação, para a posterior

produção do etanol, incluem a inibição das celulases por oligossacarídeos, devido à falta de

concentrações adequadas de beta glicosidase produzidas por microrganismo (CAIRNS& ESEN,

2010).

As enzimas celulolíticas com propriedades desejáveis podem ser alvo de programas de

melhoramento, com auxílio de engenharia genética pode se melhorar a produção de enzimas

liberadas pelo microrganismo, tendo como objetivo o aumento de suas propriedades catalíticas

(DOUGHERTYet al., 2012).

A beta glicosidase vem sendo utilizada largamente na indústria de alimento, devido a sua

capacidade de realçar o sabor dos alimentos e bebidas, sendo que esta pode promover também

melhora nutricional dos alimentos, com a liberação de vitaminas e antioxidantes e outros

17

compostos benéficos, potencializando o aproveitamento do alimento e todos benefícios que estes

podem trazer a saúde animal (DOUGHERTYet al., 2012).

Existem centenas de compostos flavorizantes em plantas, estes compostos apresentam

estruturas beta glicosídicas. A transformação desses compostos em bebidas e alimentos, tem

qualidade enriquecida pela ação das beta glicosidase. As hidrólises das ligações betas

glicosidicas, aumentamas qualidades sensoriais das bebidas e dos alimentos tratados (CAIRNS &

ESEN, 2010).

Algumas Vitaminas são encontradas em fontes vegetais na forma glicosídica e quando

convertida em angliconas pelas beta glicosidases, melhoram a disponibiladade nutricional, pois

quando convertida essas isoflavonas são rapidamente absorvidas pelo organismo, e ação da beta

glicosidase aumenta o teor de angliconas nos alimentos, aumentando a biodisponibilidade

nutricional dos alimentos (CAIRNS& ESEN, 2010).

Alguns vegetais utilizados como alimento, como raízes, folhas de mandioca, feijão, sementes

de linho e folhas de trevo, produzem ácido cianídrico (HCN) e quando macerados durante o

preparo ou na mastigação liberam este composto tóxico.

Um dos alimentos muito consumido em grande escala na Ásia, África e América do Sul, é a

mandioca. Alguns tipos de mandioca contêm compostos beta glicosídicos cianogênicos.Quando

consumidos crus, a enzima beta glicosidase linamarase atua liberando os compostos

cianogênicos. Estes compostos podem provocar intoxicação, provocando sintomas como;

dificuldade na respiração, convulsões, paralisia e por fim podendo levar a óbito. O cozimento da

mandioca provoca desnaturação da beta glicosidase linamarase evitando a liberação do HCN

(CARBONELL et al., 2000; SCHELLER & ULSKOR, 2010).

Em adição a sua atividade catalítica, também apresentam ação de transglicosilação. Essas

transglicosilações são úteis na produção de novos oligossacarídeos e novos compostos

glicosilados, como por exemplo, glicoproteínas e glicolipídos.

Nos últimos anos as enzimas do complexo celulolítico vêm despertando grande interesse na

indústria, principalmente na utilização de compostos lignocelulosico, visando à produção de

compostos de maior valor agregado. Umas das formas de se abordar esse problema, é o

18

isolamento de novos microorganismos capazes de produzir enzimas que tenham largo espectro

de utilização, que atuem em uma larga faixa de pH e temperatura. Neste trabalho buscou-se

caracterizar as enzimas produzidas por um microorganismos isolado do solo do cerrado, produtor

de enzimas do complexo celulolítico.

19

Objetivos

2.1 Objetivo Geral

No presente trabalho estudou-se produção e caracterização celulases e beta glicosidases

produzidas pelo Streptomyces sp (isolado I7) cultivados em presença de diferentes resíduos

lignocelulolíticos.

2.2 Objetivos específicos

Cultivar o Streptomyces sp por fermentação submersa em diferentes fontes de carbono: farelo

de trigo, farelo de milho, farelo de arroz e extrato de levedura;

Aperfeiçoar a produção de celulases e beta glicosidasepelo microrganismo selecionado;

Caracterizar bioquimicamente as diferentes celulases e a beta glicosidase;

Analisar á cinética de produção enzimática;

Estudar o efeito do pH e da temperatura na atividade das enzimas;

Analisar a termoestabilidade das enzimas;

Estudar os efeitos de diferentes íons metálicos sobre a atividade das enzimas;

Analisar o perfil das celulases e beta glicosidasesecretadas em SDS PAGE.

20

3. MATERIAIS

3.1.LINHAGEM DA BACTÉRIA Streptomyces sp.

A linhagem da bactéria Streptomyces sp. utilizada no presente trabalho foi isolada do

bagaço de cana-de-açúcar seco de usinas do estado de GO cedido pelo Prof. Dr. Américo José

dos Santos Reis, da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás e estocado no

laboratório de biotecnologia de fungos da Universidade Federal de Goiás- UFG.

3.2. SUBSTRATOS LIGNOCELULÓSICOS

Para a produção de enzimas, a bactéria Streptomyces sp. foi cultivada em meio mínimo

(MM) suplementado com os seguintes substratos lignocelulósicos: farelo de arroz (FA), farelo

de milho (FM) e farelo de trigo (FT). Os farelos utilizados foram, submetidos à lavagem com

água destilada, depois foram secos em estufa á 60°C por 24h.

3.3. MEIOS DE CULTURA

As soluções foram preparadas com água bidestilada e quando necessário foram esterilizadas por

autoclavagem (125°C, 1,3 atm e 15 min) ou filtração em membrana com poros de 0,2 µm

(Millipore®). As soluções foram agrupadas de acordo com a metodologia na qual foram

empregadas.

3.3.1. Meio Mínimo (PONTECORVOet al, 1953)

KH2PO4 9,000 g/L

K2HPO4 1,500 g/L

MgSO4.7H2O 0,200 g/L

CaCl2 0,050 g/L

MnSO4.7H2O 0,010 g/L

ZnSO4.7H2O 0,001 g/L

Ajustar o pH para 7.0

3.3.2Meio Mínimo (NASCIMENTO et al., 2003)

FeCl3 (0,03%) 1,000 mL

21

CaCl2.2H2O 0,050 g/L

MgSO4.7H2O 0,100 g/L

NaCl 0,010 g/L

KCl 0,010 g/L

NH4Cl 0,300 g/L

H3PO4 (85%) 1,800 g/L

Extrato de levedura 0,070 g/L

1,000 mL de solução traço:

MnSO4 2,200 g/L

ZnSO4 0,500 g/L

H3BO3 0,500 g/L

CuSO4 0,016 g/L

Na2MoO4 0,025 g/L

CoCl2.6H2O 0,046 g/L

Ajustar o pH para 7,0

3.3.3Meio Pridham (PRIDHAMet al., 1948)

Extrato Levedura 4,0 g/L

Extrato de Malte 10,0 g/L

Ágar bacteriológico 20,0 g/L

Água destilada (q.s.q) 1 L

3.4. SUBSTRATOS PARA DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS

Na dosagem da atividade celulolítica foram utilizados os seguintes substratos: celulose-

micro-cristalina (CMC de baixa viscosidade - Sigma®), celulose semi-cristalina (Avicel –

Sigmacell - Sigma®) e papel de filtro Whatman nº 1. Na dosagem de atividade de Beta

glicosidase foi utilizado pNP-β-D-glicopiranosídeo (Sigma®) .

22

3. SOLUÇÕES

As soluções foram preparadas com água bidestilada e quando necessário foram

esterilizadas por autoclavação (120°C, 1,3 atm, 15 min). As soluções foram agrupadas de acordo

com metodologia na qual foram empregadas.

3.4.1. Solução para determinação da atividade enzimática

3.4.1.1.Solução de Ácido Dinitrosalicílico –DNS

Ácido 3,5-Dinitrosalicílico 0,75% (p/v)

NaOH 1,40% (p/v)

Tartarato de Sódio e Potássio 21,60% (p/v)

Fenol 0,54% (p/v)

Metabissulfito de Sódio 0,58% (p/v)

Inicialmente, o DNS e o NaOH foram dissolvidos em água bidestilada. Posteriormente

adicionou-se o tertarato de sódio e potássio, o fenol aquecido a 50°C e o metabissulfito de sódio.

A solução final foi titulada com HCl 0,1M utilizando fenolftaleína como indicador.

3.4.1.2.Tampão Citrato de Sódio 0,05M

Ácido cítrico 50mM

Citrato de sódio 50mM

3.4.1.3.Tampão Fosfato de Sódio 0,05M

Fosfato de sódio monobásico 50mM

Fosfato de sódio dibásico 50mM

3.4.1.4.Tampão Tris-HCl

Tris-HCl 50mM

HCl 50mM

23

3.4.1.5.Tampão Glicina

Glicina 50mM

NaOH 50mM

Uma solução é adicionada na outra até atingir o pH desejável.

3.4.1.6.Solução de Carboximetilcelulose (CMC)

CMC 2,0g/ 100mL

A solução foi preparada em tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8, sendo aquecida no

microondas até solubilização completa do soluto.

3.4.1.7.Solução de Avicel

Avicel 1,0g/ 100mL

A solução foi preparada, no momento do uso, com água destilada sob agitação.

3.4.1.8.Solução pNP-β-D-Glicopiranosideo

Solução pNP-β-D-Glicopiranosideo 15 mM

Tampão citrato de sódio 50 mM pH 4.8

Carbonato de sódio 0,5 mM

3.6 Cromatografia de Camada Delgada

3.6.1 Fase fixa

Placa de sílica-gel (DC-Fertigfolien ALUGRAM® Xtra SIL G/UV254)

3.6.2 Fase móvel

Butanol 4 (p/v)

Metanol 2 (p/v)

Água 1 (p/v)

24

3.6.3 Solução Reveladora

Ácido fosfórico (85%) 7,5 mL

Anilina 1,0 mL

Difenilamina 1,0 g

Acetona 50,0 mL

25

4. Métodos

4.1. Obtenção de isolados de Streptomyces sp a partir de BCA.

Para a obtenção dos isolados, 50 g de BCA foram homogeneizados com 450 mL de

solução salina 0,9% sob agitação mecânica em vórtex. A mistura foi submetida à centrifugação

(3.000 g, 10 min) e o sobrenadante foi diluído sereadamente até 1x10-9

, em solução salina,

plaqueado em meio mínimo suplementado com CMC 0,5% (SANCHEZ, 2009) e incubado a

45°C por 4 dias.

4.2. Seleção em placa dos isolados produtores de celulases.

Os isolados obtidos foram selecionados de acordo com a atividade enzimática

determinada pelo teste de atividade em placa de acordo com o protocolo descrito a seguir: os

isolados foram inoculados em placas contendo meio mínimo, suplementado com 0,5% de CMC

(Sigma) e incubados a 45°C por 4 dias.

Para a revelação dos halos de atividade, foi adicionada a solução de vermelho Congo a

0,1% e as placas foram agitadas suavemente durante 10 min. Então, a solução de vermelho

Congo foi descartada, as placas lavadas com solução de NaCl 1 M até o aparecimento dos halos,

posteriormente adicionou solução de HCl 0,1 M sobre a solução de NaCl para melhor

visualização dos halos. A atividade enzimática foi visualizada como um halo claro ao redor da

cultura (CHELAPANDI & HIMANSHU, 2008). Para avaliar os melhores produtores de

celulases foi mensurado o índice de produção de celulases (IPC), o diâmetro do halo de hidrólise

foi dividido pelo diâmetro da colônia.

4.3. Escolha da melhor fonte de carbono para a produção de CMCases, FPases, Avicelases

e Beta glicosidase pelo isolado I7.

Esporos dos isolados selecionados pelo protocolo de atividade em placa foram inoculados

em meio mínimo (MM) suplementado com FA, FM e FT á 0,5% e extrato de levedura á 0,1%,

foram incubados a 37°C por 144 h sob constante agitação de 110 rpm. A cultura foi submetida à

centrifugação (3.000 g por 15 min) e o sobrenadante do meio de cultura foi analisado quanto à

atividade de CMCase, FPase, Avicelase e Beta glicosidase.

26

4.3.1 – Otimização da produção de celulases

Após seleção da melhor fonte de carbono, foi realizado o ensaio de determinação da influência

das fontes de carbono e nitrogênio sobre a produção das celulases. Os esporos do microrganismo

selecionado foram inoculados em MM suplementado com FT variando de 0,25% a 0,75% e EL

0,1 a 0,3% conforme descrito na tabela abaixo.

Tabela I – Variação das concentrações de extrato de levedura e farelo de trigo

respectivamente.

Amostras Extrato de levedura Farelo de trigo

1 0,1% 0,25%

2 0,1% 0,5%

3 0,1% 0,75%

4 0,2% 0,25%

5 0,2% 0,5%

6 0,2% 0,75%

7 0,3% 0,25%

8 0,3% 0,5%

9 0,3% 0,75%

4.3.2 – Cinética de produção das celulases

Esporos do isolado que produziu maior atividade das celulases e da beta glicosidase

foram inoculados em Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de MM suplementado com 0,75%

de FT e 0.1% de extrato de levedura e incubado a 37°C, por até 12 dias sob agitação constante de

110 rpm. Amostras foram coletadas a cada 24 h e analisadas quanto a atividade de Avicelase,

CMCase, FPase e Beta glicosidase.

27

4.4. Determinação da Atividade Celulolítica pelo Método dos AçúcaresRedutores

(MILLER, 1959).

As atividades enzimáticas de celulase total (FPase), endoglicanase (CMCase), Avicelase

foram avaliadas segundo metodologia proposta por Miller (1959), Ghose (1987) e Adney e Baker

(1996). A quantificação do teor de açúcares redutores liberados foi ensaiada pelo método do

ADNS e os substratos utilizados foram: Papel de filtro, CMC e Avicel respectivamente. Uma

unidade de atividade enzimática (U) foi definida como aquela que libera um µmol do açúcar

redutor correspondente por minuto nas condições do experimento. Os ensaios de atividade

enzimática dos experimentos foram realizados em triplicata.

4.4.1. Determinação da Atividade Celulolítica

4.4.1.1. FPase

Expressa a atividade de celulase total, utilizando papel de filtro Whatman nº 1 (1 cm x 6

cm – 50 mg) como substrato. A atividade de FPase foi determinada homogeneizando-se 500 µL

de amostra, 500 µL de tampão citrato pH 4.8 e uma tira de papel de filtro (1x6 cm). A solução

foi mantida a 50ºC por 1 h, em seguida, a reação foi interrompida em banho de água fria. A

quantificação do teor de açúcares redutores liberados foi ensaiada pelo método do DNS, foi

adicionado 500 µL de DNS, as amostras foram fervidas por 5 min e realizada a leitura

espectrofotométrica a 540 nm.

4.4.1.2. CMCase

Expressa a atividade de endoglicanase, utilizando CMC 1% como substrato. A atividade

de CMCase foi determinada homogeneizando-se 250 µL de amostra e 250 µL da solução de

CMC 2% . A solução foi mantida a 50 ºC por 1 h e em seguida, a reação foi interrompida em

banho de água fria. A quantificação do teor de açúcares redutores liberados foi ensaiada pelo

método do DNS, foi adicionado 500 µL de DNS, as amostras foram fervidas por 5 min e

realizada a leitura espectrofotométrica a 540 nm.

4.4.1.3. Avicelase

Expressa a atividade de exoglicanase, utilizando Avicel 1 % como substrato. A atividade

de Avicelase foi determinada homogeneizando-se 250 µL de amostra e 500 µL da solução de

Avicel 1%. A solução foi mantida a 50 ºC por 1 h sob agitação constante e, em seguida, a reação

foi interrompida em banho de água fria. Em seguida, a solução foi submetida a centrifugação a

11.200 g durante 10 min a 4°C. Para a quantificação do teor de açúcares redutores liberados, 250

28

µL do sobrenadante foram homogeneizados com 700 µL de ADNS, as amostras foram fervidas

por 5 min e realizada a leitura espectrofotométrica a 540 nm.

4.4.2 Determinação da Atividade de Beta glicosidase

A atividade de Beta glicosidase foi realizada pelo método de Costons & Loomis (1969),

adicionando- se 100 μL do reagente pPNPG (pNP- β-D – glicopiranosideo- Sigma) 15 mM,

preparado em tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8 e 100 μL do sobrenadante de cultura. A

reação foi incubada por 1hora a 50°C, e em seguida, foi adicionado 1 mL de carbonato de sódio

0,5 M para cessar a reação. A leitura foi realizada a 410 nm .

4.4.2.4. Curva padrão da concentração de glicose

A curva padrão para os testes de FPase , CMCase e Avicelase foi estabelecida utilizando-

se glicose nas concentrações de 1-20 µmoles/mL. A curva padrão para o teste de foram

estabelecida utilizando glicose nas concentrações de 0,15 a 1,5 mg/mL. As leituras foram

utilizadas para fazer um gráfico (Absorbância X Concentração de glicose). Obtendo-se assim a

equação da reta que foi utilizada nos cálculos de atividade enzimática. Já a curva padrão da Beta

glicosidase foi realizada, utilizando- se p- nitrofenol- cristalino (Sigma) de 1 a 150 mM.

4.5. Caracterização bioquímica de um conjunto de enzimas extracelulares.

O sobrenadante do meio de cultura foi utilizado como fonte de enzimas. A influência da

temperatura sobre as atividades de Avicelase, CMCase, FPase e Beta glicosidase foi determinada

realizando-se os ensaios enzimáticos na faixa de temperatura entre 40 a 80 ºC em pH 4,8.

A influência do pH sobre a atividade de Avicelase, CMCase, FPase e Beta glicosidase foi

determinada realizando-se os ensaios enzimáticos na faixa de pH de 3,0-7,0, com os seguintes

tampões (0,05 molL-1

) incubados a 37ºC: Citrato de sódio 3,0-6,5; Fosfato de sódio 7,0 e 8,0;

Tris-HCl 9,0 e Glicina-NaOH 10,0 .

Para o estudo da termoestabilidade das enzimas celulolíticas, o sobrenadante do meio de

cultura foi pré-incubado a 50°C e 60ºC e para atividade de beta glicosidase o sobrenadante de

cultura foi pré-incubado a 60°C e 65°C. As atividades foram analisadas na mesma variação de

tempo, por 0,30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 min. Todos os experimentos foram realizados em

triplicata e os resultados expressos em valores médios.

29

A influência de íons metálicos nas atividades de Avicelase, CMCase, FPase e beta

glicosidase foi avaliada. Os ensaios foram realizados nas melhores condições de cada atividade,

sendo adicionandos aos ensaios cloretos dos íons (alumínio, bário, cálcio, potássio, magnésio,

sódio, manganês e amônia) para uma concentração final de 10 mM. A influência do EDTA

também foi analisada nas mesmas condições.

4.6. Cromatografia de Camada Delgada

Cromatografia de camada delgada foi realizada em placa de sílica-gel (DC-Fertigfolien

ALUGRAM®

Xtra SIL G/UV254); 2,5 μL de glicose (1%), celobiose (1%) e xilose (1%) foram

utilizados como marcadores. Para detectar a atividade de beta glicosidase, o sobrenandante do

quinto dia de cultivo foi utilizado para hidrolisar celobiose 1%. 250 µL deo sobrenadante de

cultura foi incubado com 250 µL da solução de celobiose 1% a 50oC por aproximadamente 15

horas. Em seguida, a reação foi interrompida em banho de água fria. 10 μL dessa reação foram

adicionados para análise dos produtos formados. Para leitura, a placa foi vaporizada com a

solução reveladora e submetida à secagem em estufa a 100°C até a total visibilidade de bandas.

30

6 Resultados e Discussão

6.1 Escolhas da fonte lignocelulolítica que induz a maior atividade de celulases

Para avaliar a fonte de carbono que induz a maior atividade de enzimas celulolíticas, o

Streptomyces sp I7 foi inoculado em meio mínimo suplementado com extrato de levedura. Como

fonte de carbono foram testados três diferentes resíduos lignocelulolíticos: FA, FM e FT. O

sobrenadante de cultura do sexto dia de incubação foi utilizado como fonte de enzimas. Este

sobrenadante foi utilizado para testar todas as atividades estudadas neste trabalho.

Para estimar a produção de endocelulases foi medida a atividade de CMCase. Os

resultados obtidos estão demonstrados na Figura 3. A maior atividade de CMCase foi detectada

quando o microrganismo foi cultivado em presença de FT (1,70 U/mL). A segunda maior

atividade foi obtida na presença de FA (0,25 U/mL). A atividade detectada em presença de FT foi

6,8 vezes maior do que a obtida em presença de FA. Esse dado mostra a importância de se

avaliar as fontes de carbono para obter uma maior atividade das enzimas estudadas.

A análise da composição dos diferentes farelos testados como fonte de carbono, ajuda a

explicar as diferenças obtidas na produção das enzimas estudadas (Tabela II).

Tabela II– Composição centesimal do farelo de trigo, farelo de arroz e farelo de milho.

Farelo de Trigo Farelo de Arroz Farelo de Milho

Proteína 17,41 (Belobrajicet

al., 2011)

0,732 (Silva et al.,

2007)

0,08 (Horácio, 2001)

Lipidios 0,7 (Belobrajicet al.,

2011)

0,69 (Silva et al.,

2007)

0,36 (Horácio, 2001)

Carboidratos 44,72 (Silva et al.,

2007)

0,79 (Horácio, 2001) -

Fibras

- 1,57 (Horacio, 2001) 0,17 (Horacio, 2001)

Celulose 16,48 (Silva et al.,

2007)

0,04 (Silva et al.,

2011)

-

Valores expressos em porcentagem

A literatura científica relata que a indução de celulases é muito influenciada pelo

substrato lignocelulolítico onde o microrganismo é cultivado. Diferentes resíduos vêm sendo

estudados visando aumentar a produção de enzimas, dentre elas as celulases. Experimentos

31

descritos por Lima et al. (2005), Nascimento et al. (2009), utilizaram várias fontes de carbono

na produção de celulases por Streptomyces. Os dados obtidos por esses autores mostram que FT

foi a fonte de carbono que permitiu a maior produção de celulases. Os resultados obtidos neste

trabalho estão de acordo com os resultados obtidos por esse autores.

Os três resíduos analisados nesse trabalho podem ser classificados como lignocelulósicos.

Entretanto estes resíduos apresentam composições diferentes. A composição centesimal desses

resíduos foi descritas por Belobrajicet al. (2011), Silva et al. (2007) e Horárcio (2001). Na tabela

I esta relatada a composição centesimal desses resíduos. Em relação as proteínas o FT apresenta

uma concetranção 23 vezes maior do que o FA. Com relação a composição de celulose o FT

apresenta uma quantidade de celulose 4.200 vezes maior do que o FA, esses dados sugerem que a

maior de atividade celulolítica em presença de FT pode ser explicada por sua composição mais

rica em celulose e proteínas.

A atividade de Avicelase apresentou o mesmo comportamento da atividade de CMCase.

A maior atividade de Avicelase foi obtida em presença de FT (26 U/mL), está atividade foi 6,5

vezes maior do que a obtida na presença de FA (0,4 U/mL).

Com relação a atividade de FPase novamente a maior atividade foi detectada em presença

de FT (3U/mL). Essa atividade foi maior do que a obtida em presença de FM (22 U/mL). A

atividade de beta glicosidase tambem foi maior em presença de FT (0,45 U/mL).

Com relação a atividade de CMCase, o FT influenciou a indução de atividade de

CMCase, Avicelase e FPase com intensidade diferentes (Figuras 7 a 10). Ao avaliar a atividade

de CMCase, na presença de FT, observou-se uma atividade de 18 U/mL, enquanto que o FA e o

FM resultaram em atividades de CMCase inferiores á 5 U/mL (Figura7). A atividade de

Avicelase em presença de FT foi de 0,25 U/mL, enquanto as atividades em presença de FA e FM

foram inferiores 0, 5 U/mL (Figura8).

Os ensaios de determinação de FPase, também indicaram o FT como melhor indutor

desta atividade, tendo sido observado atividade de 3U/mL e o FM de 2 U/mL. Ainda com relação

à atividade de FPAse, o FM mostrou-se um bom indutor. Para essa atividade o FM resultou

32

numa indução próxima da alcançada pelo FT (Figura 5). O FA está associado a indução das

menores atividade das enzimas testadas (Figura 7 a 10).

Ensaios de determinação de beta glicosidase indicaram o FT como melhor indutor da

atividade desta enzima, sendo que foi observado atividade de de 0,5 U/mL. Já o FA induziu a

atividade desta enzima em 0,45 U/mL e o FM em 0,4 U/mL, ambos resultaram em valores de

atividade relativamente próximas (Figura 10). O FT novamente foi a fonte que resultou em maior

atividade. Mas para essa enzima os valores de atividades são semelhantes o que difere dos

comportamentos das outras celulases estudadas no presente trabalho.

Para a atividade de beta-glicosidase o FT também foi o melhor indutor. Entretanto essa

enzima apresentou um comportamento diferente das demais. A atividade dessa enzima foi

pequena em todas as fontes testadas, sendo que a atividade obtida em presença de FT foi próxima

das atividades observadas com os outros farelos.

Segundo Palmarola-Adradus et al. (2005) o FT contém 34% de amido, 18% de xilanas,

10,5% de glucanas, 10,1% de arabinanas, 1,1% de galactanas e 5% lignina. Além desses

polissacarídeos ele apresenta ainda 13,5% de proteínas. Devido a grande quantidade e variedade

de polissacarídeos o FT é uma boa fonte de carbono para a produção de enzimas por

microrganismos. Essa diversificada composição de polissacarídeos, provavelmente deverá

induzir diferentes enzimas hidrolíticas, tais como amilases, celulases, xilanases e glucanases

sendo essa últimas de interesse deste trabalho. Além da diversidade de polissacarídeos o FT tem

uma grande quantidade de proteínas. Para induzir a síntese de novas enzimas é importante que o

microrganismo tenha disponibilidade de aminoácidos. Tais características tornam o FT uma boa

fonte de nutrientes para a produção por microrganismos.

Por meio deste estudo, utilizando diferentes fontes de carbono, constatou-se que o FT foi

a melhor fonte de carbono para produção das celulases estudadas. Uma possível explicação seria

a composição desse farelo, o qual é mais rico em nutrientes quando comparado com os outros

farelos testados. Ele apresenta uma grande quantidade de polissacarídeos e de proteínas em sua

composição. Esses dois componentes provavelmente são importantes na indução de celulases.

33

Jang & Chen (2003) estudaram a produção de ceulases por Streptomyces sp T3-1. O

microrganismo foi cultivado em meios contendo diferentes concentrações de CMC e de (NH4)2

SO4. Eles estudaram a produção de CMCase, Avicelase e de beta glicosidase. O meio contendo

CMC (15 g/L) e (NH4)2 SO4 (2,0 g/L) resultou na maior produção de CMCase e de Beta

glicosidase. A maior atividade de Avicelase foi obtida com CMC (15 g/L) e (NH4)2 SO4 (2,0

g/L).

Figura 7- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,

suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e

extrato de levedura como fonte de nitrogênio.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

F.Milho F.Trigo F.Arroz

Ati

vid

ade

Avi

cela

se (

U/m

L)

34

Figura 8- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,






0

0,5

1

1,5

2

2,5


Ati

vid

ade

CM

Cas

e (

U/m

L)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5


Ati

vid

ade

Be

ta g

lico

sid

ase

(U

/mL)

35




6.2 Cromatografia de camada delgada do produto da hidrólise da Celobiose (TLC)

Figura 11- Análise qualitativa de beta glicosidase por TLC.

Foi realizada uma TLC com os sobreadantes de cultura do primeiro dia de indução e com

o nono dia. Foi utilizado como substrato a CMC e Celobiose, foi feita cinética no intervalo de

tempo de 20minutos para observar se teria a formação de produtos especifícos. Foi observado

então atividade de beta glicosidase quando utilizado celobiose como substrato. O ensaio que

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35


Ati

vid

ae F

pas

e (

U/m

L)

36

apresentou melhor resultado foi com 1hora de incubação, utilizando celobiose como substrato.

Sendo assim, baseado no marcadores escolhidos para o teste (celobiose, glicose e xilose) todos a

1% , foi observado bandas de celobiose e bandas de glicose, este resultado comprova a presença

de beta glicosidase no sobrenadante de cultura utilizado(figura 11).

Estudos de Cromatografia de camada delgada realizados por Reese & Mandels (1959)

apud Giese et al.(2003), analisaram a produção de Beta 1,3 glucanases e sugeriram o mecanismo

de ação destas observando os produtos da hidrólise enzimática da laminarina. Apesar dos

avanços na área, a TLC ainda é utilizada para determinar qualitativamente a ação de beta

glicosidase.

6.3 Otimização experimental

Uma vez determinada a melhor fonte de carbono, o próximo passo foi realizar um

experimento do tipo superfície de resposta para determinar condições para maximizar a produção

de celulases e beta glicosidase. O método de superficie de resposta permite analisar a influência

de diferentes parametros na produção de enzimas por microrganismo, tais como temperatura, pH

e concentrações dos nutrientes utilizados (BATISTAet al., 2013). No presente trabalho foram

testadas diferentes concentrações de FT e de EL, utilizando a metodologia de ponto central,

conforme descrito na tabela I.

Na tabela II estão descritos as atividades enzimáticas em resposta aos diferentes

tratamentos. Para todas as atividades enzimáticas testadas a melhor condição foi a do tratamento

número 3 (FT 0,75% e EL 0,1%).

A Figura 12é uma representação gráfica da produção de CMCase em função das

concentrações de EL e FT descritas na tabela II. Esta figura mostra o gráfico da superfície de

resposta. Na figura 13 encontra-se o perfil de desejabilidade, uma predição das concentrações

que poderão resultar na maior produção de CMCase. Os dados obtidos sugerem que as

concentrações de FT a 0,75% e EL a 0,1%. A figura 13 mostra que o FT influencia

positivamente enquanto que EL influencia negativamente.

As figuras 13 a 19 são a representação gráfica da produção de FPase, Avicelase e beta

glicosidase em resposta à variação da concentração de FT e EL nessas enzimas, respectivamente.

Para todas as atividades testadas o FT influência positivamente e o EL tem efeito contrário.Para

37

todas as enzimas testadas as concentrações de FT e EL foram preditas como sendo FT a 0,75% e

EL a 0,1%.

Tabela III – Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL)

Variação Avicelase CMCase FPase Beta glicosidase

1 (FT 0,25%, EL 0,1%) 1,534 U/mL 14,917 U/mL 0,900 U/mL 0

2 (FT 0,50%, EL 0,1%) 3,466 U/mL 24,218 U/mL 5,756 U/mL 0,034 U/mL



5 (FT 0,50%, EL 0,2%) 1,508 U/mL 21,194 U/mL 0 0,0215 U/mL

6 (FT 0,75%, EL 0,2%) 0 21,106 U/mL 0 0

7 (FT 0,25%, EL 0,3%) 0 10,319 U/mL 2,033 U/mL 0

8 (FT 0,50%, EL 0,3%) 0 10,354 U/mL 1,561 U/mL 0

9 (FT 0,75%, EL 0,3%) 0 9,183 U/mL 1,840 U/mL 0

38

Fitted Surface; Variable: CMCase

2**(2-0) design; MS Residual=362528E2

DV: CMCase

26000

22000

18000

14000

10000

z=10132;666666667+29039;*x+3102;5*y-104370;*x*y+0;

Figura 12- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de

levedura, visando o aumento da produção de CMCase pelo Streptomyces sp (isolado I7).

Profiles for Predicted Values and Desirability

Farelo

-3E4

24394,

60000,

Extrato de Levedura Desirability

0,

,5

1,

9183,0

16701,

24218,

CM

Case

,25 ,75

1,0000

,1 ,3

Desir

ability

Figura 13 - Predição Matemática do ótimo de atividade para produção de CMCase.

39

Fitted Surface; Variable: Avicelase

2**(2-0) design; MS Residual=749656,3

DV: Avicelase

3000

2000

1000

0 z=598;70916666667+6111;*x-2572;925*y-20370;*x*y+0;


levedura, visando o aumento da produção de Avicelase pelo Streptomyces sp (isolado I7).


Farelo

-6000,

3396,9

10000,


0,

,5

1,

,915001786,03571,0

Avic

ela

se

,25 ,75

,95124

,1 ,3

Desir

ability

Figura 15- Predição matemática do ótimo de atividade de Avicelase.

40

Fitted Surface; Variable: FPase

2**(2-0) design; MS Residual=1831713,

DV: FPase

6000

4000

2000

0

z=-5524;7921666667+19890;487*x+16581;3825*y-66303;17*x*y+0;


levedura, visando o aumento da produção de FPase pelo Streptomyces sp (isolado I7).


Farelo

-8000,

6078,5

14000,


0,

,5

1,

,915003

316,06631,0

FP

ase

,25 ,75

,91666

,1 ,3

Desir

ability

Figura 17- Predição matemática do ótimo de atividadede de FPase produzida pelo isolado I7.

41

Fitted Surface; Variable: Betaglicosidase

2**(2-0) design; MS Residual=,0001195

DV: Betaglicosidase

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0

z=-;040333333333333+;1581*x+;13175*y-;527*x*y+0;


levedura, visando o aumento da produção de Beta glicosidase pelo Streptomyces sp (isolado I7).


Farelo

-,0800

,05189

,12000


0,

,5

1,

0,0

000,0

2635,0

5270

Beta

glicosid

ase

,25 ,75

,98466

,1 ,3

Desir

ability

Figura 19- Valores das concentrações ideais de farelo de trigo e de extrato de levedura para

otimização do processo de produção de beta glicosidase pelo Streptomyces I7.

42

Os resultados da superfície de resposta mostram que para todas as enzimas estudadas os

FT influência positivamente a expressão das enzimas estudadas enquanto que o EL tem

comportamento contrário. A análise multivariada dos dados obtidos evidenciou que a variável EL

afetou negativamente todas as atividades enzimáticas testadas. Na tabela III estão mostrados os

resultados obtidos pela análise do gráfico de Pareto.

Tabela IV– Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL)

Variável CMCase Avicelase FPase Beta glicosidase

FT +0,68 +1,18 +2,45 +2,41

EL -1,63 -2,95 -2,45 -2,41

FT/EL -0,87 -1,18 -2,45 -2,41

O trabalho de Palmarola-Adrados et al. (2005) relata que existe uma grande concentração

de carboidratos e proteínas no FT. Devido a essa composição o FT pode servir tanto como fonte

de carbono como fonte de nitrogênio. Podemos observar no trabalho de Shitkha et al. (2007) que

o FT foi utilizado como fonte de nitrogênio, para a produção de proteases por Bacillussp. A

composição do FT pode explicar os resultados obtidos na analíse da significância das variáveis

independentes estudadas, avaliadas pelo gráfico de Pareto, que visa verificar as alterações na

produção enzimática (LADEIRAet al., 2010). Esta análise tenta explicar a variação da produção

enzimática em resposta às concentrações de FT e EL separadamente e na interação entre elas.

6.4 Cinética de produção de enzimas

A produção das celulases foi acompanhada por até 12 dias. O Streptomyces sp I7 foi

cultivado nas condições preconizadas pela superfície de resposta (FT a 0,75% e EL a 0,1%).

Alíquotas do sobrenandante de cultura, foram retiradas a cada 24 horas e as atividades das

celulases foram determinadas. A figura 20 mostra a cinética de produção de CMCase. Pode-se

observar a presença de dois picos de atividade, o primeiro entre o segundo e quarto dia, e o

segundo pico entre o sétimo e o nono dia de incubação. A maior atividade foi encontrada no

oitavo dia de incubação (26,1 U/mL).

A produção de CMCase por S.viridobrunneus SCPE-09 incubado em presença de FT foi

estudada por Vinha et al. (2011). A maior atividade de CMCase foi observada no segundo dia de

43

incubação (0,45U/mL). A atividade de CMCase descrita nesse trabalho é maior do que a

apresentada no trabalho de Vinha et al. (2011).

A maior atividade para FPase foi observada no nono dia de incubação com 20 U/mL

(Figura 21). Avicelase apresentou dois picos de atividade, no terceiro e no sétimo dia de

incubação, a maior atividade foi observada no segundo pico com 4,12 U/mL (Figura22). Após o

oitavo dia de incubação essa atividade não foi mais detectada. A beta glicosidase apresentou dois

picos de atividade. A maior atividade foi observada no nono dia de incubação com 0,2 U/mL

(Figura 23). Estudos envolvendo cinética de produção de celulases são muito raros.

Ao análisar a cinética de Avicelase e beta glicosidase é possível perceber que os dois

picos de atividade de Avicelase correspondem a dois picos de atividade de beta glicosidase com

dois dias de diferença. Uma vez que a Avicelase atua como exoglicanase, liberando celobiose,

pode-se inferir que o produto da hidrólise da Avicelase está induzindo a síntese da beta

glicosidase (figuras 22 e 23).

Em muitas bactéria Archeas e eucariotos existem uma super família de transportadores

ABC. Este conjunto de proteínas é responsável pela captação de uma grande variedade de

nutrientes para a celula. Além disso, os transportadores ABC estão envolvidos no exportação de

drogas, fatores de virulência, proteases extracelulares, transdução de sinal e interação planta

patogêno (SCHLOSSER et al., 1999).

O sistema ABC de transporte é formado por pelo menos cinco proteínas, sendo duas

inseridas na membrana, dois componentes citoplasmáticos (no qual está inserido o sítio de

ligação ao ATP) e uma proteína de ligação presente no lado externo da membrana, a qual é

responsável pelo reconhecimento do nutriente a ser transportado. O gênero Streptomyces

apresenta um sistema de transporteadores ABC específico para celobiose/celotriose. Nos

Streptomyces também é encontrado um operon relacionado ao metabolismo de celobiose:

transporte, reconhecimento e hidrólise, denominado operon ceb. Este operon é regulado pelo

gene cebR. A proteína CebE, é uma lipoproteína que se liga à celobiose. A celobiose é

transportada para dentro da célula e se liga à proteína CebR, liberando a expressão do operon

ceb. Em presença de celobiose a proteína CebE é induzida para capturar mais celobiose, ao

mesmo tempo a proteína beta glicosidase é induzida (SCHLOSSER et al., 1996 e 1999).

44

A ação sinergítica deste sistema é bastante interessante. As endocelulases (CMCase)

atuam clivando a parte amorfa e expondo as extremidades. As exoglicanases (FPases e

Avicelases) atuam na parte cristalina liberando celobiose. A celobiose é captada pelos

transportadores ABC e induz o operon ceb, o qual expressa CebE (proteína que captura a

celobiose), aumentando a captação da celobiose e promovendo a hidrólise através da ação da

beta glicosidase. Estas ações diminuem a celobiose extracelular, a qual normalmente, atua

inibindo as CMCases, permitindo assim que o sistema celulolitico continue atuando sobre a

celulose.

Figura 20- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado

I7 mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com

farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ati

vid

ade

En

zim

átic

a (U

/mL)

Dias

Cinética CMCase

45

Figura 21- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de FPase, com isolado I7

mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo

de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.

Figura 22- Cinética de produção de celulases com ensaio de atividade de Avicelase, com isolado

I7 mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com

Farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.

-5

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

Dias

Cinética FPase

-1

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

Dias

Cinética Avicelase

46

Figura 23-Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado I7

mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo

de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.

6.5 Influência do pH na atividade das enzimas avaliadas

A atividade das enzimas do sobrenadante de cultura foram analisadas na faixa de pH entre

3 e 10. A atividade máxima para CMCase foi em pH 4,5 com 14 U/mL, foi observado também

um segundo pico em pH 5,5, o que sugere a presença de mais de uma enzima (Figura24). A

máxima atividade de FPase foi em pH 5,5 (Figura 25). A Avicelase apresentou atividade máxima

em pH 6,0 com 5 U/mL, no entanto, observamos dois picos na figura 26, o que sugere a atuação

de uma segunda enzima trabalhando em pH 7,0. Walter & Schrempf (1995), descrevem que o

pH ótimo para atividade de Avicelase produzida pelo S. reticuli em pH 4,5-5,0. Resultados

obtidos por Tuncer et al. (2004) mostram a atividade ótima em pH 7,0, para atividade de

Avicelase produzida por Streptomyces sp. Rastogi et al. (2010) descrevem o pH 5,0 como ótimo

para atividade de CMCase produzidas por Bacillus sp e Geobacilllus sp.

Lima et al. (2005) e Alani et al. (2008) , descrevem pH 5,0 como sendo o ótimo para

atividade de CMCase produzida pelo S. drozdowiczii e Streptomyces sp, respectivamente,

enquanto Semêdo et al. (2000) descrevem como sendo o ótimo para a atividade de CMCase o pH

7,0, sendo que um segundo pico foi observado em pH 11. Já Silva et al (2008) descreve como o

pH 4,8 como sendo o melhor para endoglicanase produzida pelo Streptomyces sp, e com pico

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ati

vid

ade

En

zim

átic

a (U

/mL)

Dias

Cinética Beta glicosidase

47

extra em pH 7,0. Já Jan&Chen (2003) descrevem em seu trabalho, endoglicanases com pico de

atividade em pH 7,0 Streptomyces T3-1. Resultados obtidos no presente trabalho demontram o

maior pico de atividade de CMCase em pH 4,5 e um pico extra observado em pH 5,5.

Kusamaet al. (1986) descrevem em seu trabalho com um Streptomycessp , o pH 6,0 como

o ideal para atividade de beta glicosidase produzida por este microrganismo, um segundo pico foi

observado em pH 7,0, sugerindo a presença de uma segunda enzima. Já Faijes et al. (2006)

descreve como sendo pH otimo para atividade de beta glicosidase de Streptomyces sp E383-A, o

pH 8,5. Já Heupel et al. (1993) descrevem o pH 7,0 como sendo o ótimo para a beta glicosidase

produzida pelo Streptomyces reticuli. Resultados obtidos no presente trabalho mostram que a

maior atividade de beta glicosidase foi em pH 4,5 (0,08 U/mL), sendo que foi observado

também, um segundo pico em pH 6,5. Dados obtidos nesse trabalho sugerem a presença de duas

enzimas, onde cada uma atua em pH diferentes.

Figura 24 - Efeito da variação do pH sobre atividade de CMCase do isolado I7. O isolado I7 foi

cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10

Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

pH

CMCase

48

Figura 25 - Efeito da variação do pH sobre atividade de FPase do isolado I7. O isolado I7 foi


Figura 26- Efeito da variação do pH sobre atividade de Avicelase do isolado I7. O isolado I7 foi


-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

pH

FPase

-1

0

1

2

3

4

5

6

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10

Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

pH

Avicelase

49

Figura 27- Efeito da variação do pH sobre atividade de Beta glicosidase do isolado I7 cultivado

em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.

6.6 Influência da temperatura na atividade das enzimas testadas.

Estudou-se também o efeito da temperatura nas atividades avaliadas variando a

temperatura de 40 a 80ºC. A temperatura ótima para atividade de CMCase foi de 50ºC, sendo que

nas temperaturas acima desta a enzima teve um declínio (Figura 28). A atividade de FPase foi

maior na temperatura de 50ºC, mas um outro pico de atividade foi observado a 70ºC, sugerindo a

atuação de diferentes enzimas, que atuam em diferentes temperaturas (Figura 29). A temperatura

ótima observada para a atividade enzimática de Avicelase foi a 40ºC (Figura 30). Já a atividade

de beta glicosidase foi maior a 65°C, mas um outro pico foi observado a 50°C (Figura31).

Experimentos descritos por Lima et al. (2005); Vinha et al. (2011) e Alani et al. (2008),

concordam com os resultados obtidos no presente trabalho, onde a temperatura ótima para

atividade das CMCase foi de 50ºC, sendo que FPase apresentou dois picos de atividade em 50°C

e um segundo pico em 70°C, sugerindo a presença de duas ou mais enzimas, já a Avicelase

apresentou atividade ótima a 40ºC. Li et al. (2008) descrevem em seu trabalho uma CMCase

produzida por um Bacillus sp. com pico de atividade a 50ºC, como a CMCase produzida pelo

Streptomyces sp I7 descrita neste trabalho.

-1

0

1

2

3

4

5

6

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10

Ati

vid

ade

En

zim

átic

a (U

/mL)

pH

Beta glicosidase

50

Em experimentos realizados por Kusamaet al. (1986) com um Streptomyces sp foi

observado que a temperatura ótima para a atividade da beta glicosidase foi de 60°C. Já Faijes et

al. (2006) descrevem em seu trabalho a temperatura de 45°C como sendo ótima para a atividade

de beta glicosidase produzida pelo Streptomyces E383- A. Heupel et al. (1993) descrevem como

a temperatura de 40°C como sendo ótima para atividade de beta glicosidase produzida pelo S.

ritculi. Como observado na figura 31, os dados obtidos no presente trabalho mostram que a

temperatura ótima para atividade da enzima é de 65°C (0,08 U/mL).

Figura 28 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de CMCase. O ensaio foi

relaizado em pH 4,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de

trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.

0

5

10

15

20

25

30

40 45 50 55 60 65 70 75 80

Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

Temperatura (°C)

CMCase

51

Figura 29 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de FPase. O ensaio foi realizado

em pH 5,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e

extrato de levedura 0,1%.

Figura 30– Efeito da variação de temperatura sobre atividade de Avicelase. O ensaio foi

realizado em pH6,0. O ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo

0,75% e extrato de levedura 0,1%.

0

1

2

3

4

5

6

7

40 45 50 55 60 65 70 75 80

Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

Temperatura (°C)

FPase

0

2

4

6

8

10

12

40 45 50 55 60 65 70 75 80

Ati

vid

ade

En

zim

atic

a (U

/mL)

Temperatura (°C)

Avicelase

52

Figura 31- Efeito da variação de temperatura sobre atividade de beta glicosidase (pH 4,5)do

ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de

levedura 0,1%.

6.7 Termoestabilidade enzimática

Para a análise da estabilidade térmica das celulases, o sobrenadante de cultura foi pré

incubado á 50ºC e 60ºC, já para atividade de beta glicosidase, as temperaturas utilizadas foram

de 60°C e 65°C. As enzimas foram foram pré incubadas por até 4 horas, alíquotas foram

coletadas em intervalos de 30 min. No teste para CMCase (Figura 32) as enzimas apresentaram

atividade maior que a inicial nos primeiros 120min de pré-incubação, sugerindo que a atividade

CMCase é ativada pela temperatura, chegando a apresentar 40% de aumento em sua atividade a

50ºC e 25% de aumento a 60ºC. Após 1 h e 30 min de incubação a atividade teve uma queda de

10% a 50ºC e 25% a 60ºC, sendo que após 3 h e 30 min de pré-incubação a enzima havia perdido

mais de 50% de sua atividade. Resultados similares foram descritos por Vinha et al. (2011). Eles

mostraram que a CMCase produzida pelo S. viridobrunneus retém 76% de sua atividade após 2

horas de pré-incubação à 50ºC. Dados descritos por Nascimento et al. (2009) descrevem que

após 2 horas de pré-incubação à 50ºC, apenas 50% da atividade de CMCase produzida pelo S.

malaysienses foi mantida.

No teste para FPase a enzima apresentou uma ativação nos primeiros 30 minutos de pré-

incubação tanto a 50ºC quanto a 60ºC. Com 1 hora de pré-incubação a 60ºC a enzima reteve

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

40 45 50 55 60 65 70 75 80

Ati

vid

ade

En

zim

átic

a (U

/mL)

Temperatura (°C)

Beta glicosidase

53

apenas 20% de sua atividade, após 2 horas de pré-incubação a 50ºC a enzima reteve cerca de

30% de atividade (Figura 33). No ensaio para Avicelase após 30 min de pré-incubação a 60ºC a

enzima perdeu 60% de atividade, sendo que em 1 hora a enzima diminuiu em 70% a sua

atividade, após 1 hora e 30 min de pré-incubação esta enzima não apresentava mais atividade

(Figura 34). Entre 30 e 60min de pré-incubação a 60°C, a Avicelases retomou parte de sua

atividade, chegando a alcançar aproxidamente 75% de sua atividade inicial.

No ensaio de beta glicosidase nos primeiros 30 minutos de pré-incubação a 60°C a

enzima apresentou 98% de atividade, sendo que após 60 min de a enzima ultrapassou os 100%

de ativação. Somente após 2 horas de pré-incubação, a enzima perdeu 60% de sua atividade

inicial, sendo que com 3 horas de pré-incubação, a enzima reteve 50% de sua atividade inicial.

Nos primeiros 30 minutos de pré-incubação a 65°C, a enzima apresentou ativação de 30%, após

60 minutos de pré-incubação a enzima se manteve estável. Após 90 minutos de pré-incubação, a

enzima perdeu 20% de sua atividade e após 3 horas de pré-incubação a enzima perdeu 80% de

sua atividade (figura 34).

Experimentos realizados por Kusama et al. (1986) demonstram que a atividade de beta

glicosidase produzida por Streptomyces sp se manteve estável a 55°C após 10 minutos de pré-

incubação, após esse período, em temperaturas mais elevadas, a beta glicosidase perdeu

completamente sua atividade.

Esse comportamento diferente poderia ser explicado pela presença de mais de uma

enzima no sobrenadante de cultura. Os dados obtidos nesse trabalho permitem dizer que a

CMCase produzida pelo Streptomyces sp I7 é uma enzima termoestável.

Em Streptomyces é comum encontrar a presença de sistemas celulolíticos apresentando

multiplas enzimas. Este parece ser o caso deste isolado. A análise dos gráficos relacionados a pH

e temperatura, sugerem a presença de mais de uma enzima (Figuras 24 a 31). Vinha et al. (2011)

mostrou a produção de multiplas celulases por S. viridobrunneus. A técnica de zimograma foi

utlizada para mostrar a produção de duas enzimas com massas moleculares de 37 e 119 KDa.

Entretanto o gráfico da variação da temperatura mostrou um único pico de atividade. De forma

semelhante, três celulases foram descritas por Nascimento et al. (2009). Um sistema contendo

54

cinco isoenzimas produzidas por S. antibioticus (ENGER & SLEEPER, 1965). Brito (2012)

demonstrou a produção de três celulases diferentes por Streptomyces sp I3.

A presença de multiplas celulases também ocorre em outras bactérias e fungos. Em

Bacillus licheniformis foi descrito a presença de cinco isosenzimas diferentes (BISCHOFF et al.,

2006). Esse complexo enzimático parece ser importante para capacitar os microrganismos a

hidrolisarem diferentes polissacarídeos em variadas condições. Esse arsenal de enzimas permite

hidrolisar as diferentes estruturas da celulose.

Figura 32- Termoestabilidade de CMCase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade

relativa expressa em porcentagem.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 30 60 90 120 150 180 210 240

Ati

vid

ade

Re

lati

va (

%)

Tempo (min)

Termoestabilidade CMCase

50°C

60°C

55

Figura 33- Termoestabilidade de FPase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade


Figura 34- Termoestabilidade de Avicelase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade


0

20

40

60

80

100

120

140

0 30 60 90 120 150 180 210

Ati

vid

ade

Re

lati

va (

%)

Tempo (min)

Termoestabilidade FPase

50°C

60°C

0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90 120 150 180 210

Ati

vid

ade

Re

lati

va (

%)

Tempo (min)

Termoestabilidade Avicelase

50°C

60°C

56

Figura 35 - Termoestabilidade de beta glicosidase do sobrenadante de cultura produzida pelo

isolado I7 com atividade relativa expressa em porcentagem.

6.8 Efeito de íons metálicos e do EDTA sobre atividade das enzimas testadas

A Tabela IV mostra o efeito dos íons metálicos e do EDTA sobre atividades enzimáticas

avaliadas. A atividade de CMCase foi inibida apenas na presença do EDTA, reduzindo sua

atividade em 86%. Todos os íons metálicos estimularam a atividade da enzima CMCase,

resultados semelhantes foram descritos por Lima et al. (2005) para o S. drozdowiczii, onde os

íons Mg2+

, Ba2+

, Fe2+

e o K+ também estimularam a atividade da enzima, concordando com os

resultados obtidos neste trabalho.

Estudos realizados por Vinha et al. (2011) descrevem que na presença dos íons Mg2+

,

Zn2+

, Na+, Ba

2+, Mn

2+,Ca

2+, K

+ e Fe

2+ ocorre inibição da atividade de CMCase, produzida pelo S.

viridobrunneus, o EDTA também inibiu a atividade dessa enzima. Os resultados obtidos neste

trabalho estão em acordo com os dados obtidos por estes autores.

O trabalho de Franco-Cirigliano et al. (2013) estudou a influência do íon Mn2+

sobre a

atividade da endoglicanase de S.misionensis PESB-25. Eles mostraram que o Mn2+

melhorou a

atividade da enzima em 200%. Devido a esse grande efeito, eles estudaram a influência desse íon

0

50

100

150

200

250

0 30 60 90 120 150 180 210

Ati

vid

ade

Re

lati

va (

%)

Tempo (min)

Termoestabilidade Beta Glicosidase

60°C

65°C

57

variando sua concentração desde 1 até 10mM. A maior atividade foi encontrada na concentração

de 8mM.

Íons metálicos podem ser requeridos para atividade da enzima podendo eventualmente

fazer parte do complexo da enzima ou servirem como cofatores para atingir sua atividade

máxima. Manganês e outros íons metálicos podem aumentar a afinidade de ligação das enzimas

ao substrato, podendo ainda estabilizar a conformação do sitio catalítico (CHAUVAUX et al.,

1995).

Tejirian & Xu (2010) estudaram a inibição de celulases por íons metálicos. Eles citam

que Fe+2

e Cu+2

geralmente são inibidores de celulases, entretanto Mn, Co, Ni e Zn não são

inibidores, apesar de terem tamanhos e cargas semelhantes. É bastante interessante que o Mn+2

foi um ativador das enzimas CMCase, FPase e Avicelase produzidas pelo Streptomyces sp I7,

essa característica é semelhante à da endoglicanase produzida por S. misonensis.

A maioria dos íons testados inibiram a atividade de FPase, exceto o íon Mn+2

que

estimulou a atividade FPase em 43,66%, o EDTA inibiu a atividade em 36%. Em relação à

atividade de Avicelase apenas os íons K+, NH4

+ e Mg

+2 inibiram a atividade da enzima. Os

demais íons (Na+, Al

3+, Ba

2+, Ca

2+ e o Mn

2+) estimularam a atividade de Avicelase. O EDTA

reduziu a atividade de Avicelase em 81%.

A atividade de beta glicosidadase foi inibida em 5,74% pelo Al3+

. Os íons Ba2+

e Ca+

estimularam a atividade da enzima, o K+ foi o íon que estimulou a atividade da enzima mais

eficientemente, com aumento de 12% na atividade de beta glicosidase, na presença dos íons

Mn2+

e NH4+

e do EDTA não foi detectada atividade de beta glicosidase. Kusama et al.(1986)

estudou a inibição por íons metálicos e a influência do EDTA na atividade de beta glicosidase de

um Streptomyces sp. Eles descrevem que a atividade de beta glicosidase foi inibida por Hg2+

(98%) e por Fe2+

(25%), já a presença de Ca2+

manteve a atividadedessa enzima em 100%. O

EDTA no trabalho de Kusama et al. (1986) inibiu a atividade de beta glicosidase em 18%, já no

presente trabalho o EDTA inibiu completamente a atividade da enzima.

A inibição pronunciada obtida na presença de EDTA sugere que íons metálicos,

principalmente os divalentes, são importantes para a atividade das enzimas estudadas. Esses íons

poderiam auxiliar na ligação da enzima com o substrato, em uma mudança conformacional da

58

enzima ou na modificação do sítio ativo. Jonhson & Demain (1984) descrevem que a inibição de

celulases por íons metálicos pode ocorrer por ligação destes com grupo tiol que fazem parte do

sítio ativo desse tipo de enzimas. Esses autores mostraram que a utilização de DTT (ditiotreitol)

pode aumentar a ação das celulases por deixar o grupo sulfídril presente no sítio ativo na sua

forma reduzida.

Tabela V - Efeito dos diferentes íons e do EDTA na atividade de CMCase, Fpase, Avicelase

e beta glicosidase.

Íons Metálicos CMCase FPase Avicelase Beta glicosidase

Controle 100 100 100 100

AlCl3 163.6 41.9 190.77 94.26

BaCl2 138.24 88.81 161.7 108.2

CaCl2 134 94.7 111 105

KCl 142 99.14 91.4 112

MgCl2 124.64 82.8 98.1 102

NaCl 125.6 86.88 224 101

MnCl2 205 143.66 305 0

NH4Cl 126 88 22 0

EDTA 14 64 19 0

Atividade relativa expressa em porcentagem em relação ao controle (100%)

Concentração final dos íons foi de 10Mm

59

7. CONCLUSÃO

O Streptomyces sp isolado I7 é bom produtor de enzimas celulolíticas;

A melhor fonte de carbono foi o FT;

A melhor condição de indução foi predita pela metodologia da superfície de

resposta como sendo FT a 0,75% e EL a 0,1%;

A cromatografia (TLC) mostra a presença de beta glicosidase;

A enzima beta glicosidase pode ser considerada termoestável por manter mais de

75% de sua atividade inicial após pré incubação por 150 minutos a 65°C;

O EDTA inibiu fortemente as enzimas CMCase, Avicelase e beta glicosidase. A

enzima FPase manteve 64% de atividade na presença do EDTA;

O Íon Mn+2

é um forte ativador das enzimas, CMCase, FPase e Avicelase e é um

potente inibidor da beta glicosidase;

As enzimas CMCase, FPase e Beta glicosidase foram ativadas quando pré

incubadas a temperaturas entre 50°C e 60°C;

O perfil de atividade nos diferentes pH e temperaturas testados sugere a existência

de sistema celulolítico composto por múltiplas enzimas.

60

8 PERSPECTIVAS

Purificar as enzimas e caracterizar as enzimas produzidas pelo Streptomyces sp I7;

Estudar a indução da beta glicosidase em diferentes meios de cultura, variando as fontes

de carbono e nitrogênio, bem como suas concentrações;

Estudar a indução das enzimas utilizando somente FT;

Testar suas aplicações biotecnologicas;

Testar se a beta glicosidase é secretada ou não.

61

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71

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________ ii

LISTA DE TABELA _________________________________________________________________ iv

LISTA DE ABREVIATURAS _________________________________________________________ v

RESUMO __________________________________________________________________________ 1

ABSTRACT ________________________________________________________________________ 2

1.Introdução _______________________________________________________________________ 1

1.1 Lignocelulose __________________________________________________________________ 1

1.2 Celulose ______________________________________________________________________ 2

1.3 Hemicelulose __________________________________________________________________ 4

1.3.1 Xilana _____________________________________________________________________ 5

1.3.2 Galactoglucomanana _________________________________________________________ 6

1.3.3 Arabinogalactana ____________________________________________________________ 7

1.4 Lignina _____________________________________________________________________ 7

1.5 Utilização industrial dos resíduos lignocelulósicos ____________________________________ 8

1.6 Streptomyces sp. ________________________________________________________________ 9

1.7 Hidrólise enzimática da celulose _________________________________________________ 10

1.7.1 Celulases e Beta glicosidases __________________________________________________ 11

1.7.2 Endoglicanases _____________________________________________________________ 12

1.7.3 Exoglicanases ______________________________________________________________ 13

1.7.4 Beta glicosidase ____________________________________________________________ 13

1.8 Aplicações biotecnológicas das celulases ___________________________________________ 14

1.9 Aplicações biotecnológicas da Beta glicosidase______________________________________ 16

2. Objetivos ________________________________________________________________________ 19

2.1 Objetivo Geral ________________________________________________________________ 19

2.2 Objetivos específicos ___________________________________________________________ 19

3. MATERIAIS __________________________________________________________________ 20

3.1. LINHAGEM DA BACTÉRIA Streptomyces sp. __________________________________ 20

3.2. SUBSTRATOS LIGNOCELULÓSICOS _______________________________________ 20

3.3. MEIOS DE CULTURA _____________________________________________________ 20

3.3.1. Meio Mínimo __________________________________________________________ 20

3.3.2 Meio Mínimo _____________________________________________________________ 20

3.3.3 Meio Pridham _____________________________________________________________ 21

72

3.4. SUBSTRATOS PARA DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS ________ 21

3. SOLUÇÕES ___________________________________________________________________ 22

3.4.1. Solução para determinação da atividade enzimática _____________________________ 22

3.4.1.1. Solução de Ácido Dinitrosalicílico –DNS __________________________________ 22

3.4.1.2. Tampão Citrato de Sódio 0,05M __________________________________________ 22

3.4.1.3. Tampão Fosfato de Sódio 0,05M _________________________________________ 22

3.4.1.4. Tampão Tris-HCl _____________________________________________________ 22

3.4.1.5. Tampão Glicina _______________________________________________________ 23

3.4.1.6. Solução de Carboximetilcelulose (CMC) ___________________________________ 23

3.4.1.7. Solução de Avicel _____________________________________________________ 23

3.4.1.8. Solução pNP-β-D-Glicopiranosideo _______________________________________ 23

3.6 Cromatografia de Camada Delgada ___________________________________________ 23

3.6.1 Fase fixa ______________________________________________________________ 23

3.6.2 Fase móvel ____________________________________________________________ 23

3.6.3 Solução Reveladora______________________________________________________ 24

4.Métodos _________________________________________________________________________ 25

4.1. Obtenção de isolados de Streptomyces sp a partir de BCA. ______________________________ 25

4.2.Seleção em placa dos isolados produtores de celulases. _________________________________ 25

4.3. Escolha da melhor fonte de carbono para a produção de CMCases, FPases, Avicelases e Beta

glicosidase pelo isolado I7. __________________________________________________________ 25

4.3.2 – Cinética de produção das celulases ____________________________________________ 26

4.4. Determinação da Atividade Celulolítica pelo Método dos Açúcares Redutores ______________ 27

4.4.1. Determinação da Atividade Celulolítica _________________________________________ 27

4.4.1.1. FPase __________________________________________________________________ 27

4.4.1.2. CMCase ________________________________________________________________ 27

4.4.1.3. Avicelase _______________________________________________________________ 27

4.4.2 Determinação da Atividade de Beta glicosidase ___________________________________ 28

4.4.2.4. Curva padrão da concentração de glicose ______________________________________ 28

4.5. Caracterização bioquímica de um conjunto de enzimas extracelulares. ________________ 28

4.6. Cromatografia de Camada Delgada ______________________________________________ 29

6 Resultados e Discussão ____________________________________________________________ 30

6.1 Escolha da fonte lignocelulolítica que induz a maior atividade de celulases ______________ 30

6.2 Cromatografia de camada delgada do produto da hidrólise da Celobiose (TLC) _________ 35

73

6.3 Otimização experimental _______________________________________________________ 36

6.4 Cinética de produção de enzimas ________________________________________________ 42

6.5 Influência do pH na atividade das enzimas avaliadas ________________________________ 46

6.7 Termoestabilidade enzimática ___________________________________________________ 52

6.8 Efeito de íons metálicos e do EDTA sobre atividade das enzimas testadas _______________ 56

7. CONCLUSÃO ___________________________________________________________________ 59

8 PERSPECTIVAS _________________________________________________________________ 60

9 Referências bibliográficas __________________________________________________________ 61

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DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Análise da produção de celulases