DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - repositorio.ufpe.br · fêmeas apresentou índice de inibição de 73,90% para a dose de 7mg/kg , 61,54% para a dose de 14mg/kg, 28,57% para a dose de

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

PERFIL FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DA ASPIDOSPERMA PYRIFOLIUM MART.

“ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS”

MÁRIO GUSTAVO LÚCIO ALBUQUERUQUE DA NÓBREGA

RECIFE-PE Junho, 2008

NÓBREGA, M.G.L.A. Perfil Fitoquímico e Farmacológico de Aspidosperma pyrifolium Mart……

MÁRIO GUSTAVO LÚCIO ALBUQUERQUE DA NÓBREGA

PERFIL FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DA ASPIDOSPERMA PYRIFOLIUM MART.

“ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, do Departamento de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Ivone Antonia de Souza

RECIFE –PE Junho, 2008

2


3


UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

REITOR

Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Gilson Edmar Gonçalves e Silva

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

José Thadeu Pinheiro

VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Jane Sheila Higino

VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Samuel Daniel de Sousa

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Pedro José Rolim Neto

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Beate Seagesser Santos

4


“Vencer é um privilégio, saber perder e

reconquistar a vitória é uma arte para

poucos homens.”

Mário Nóbrega

5


Dedico esse trabalho a Deus, ao meu

Padre Cícero, ao meu pai Josemar

Lúcio da Nóbrega, a minha mãe

Verônica Maria Albuquerque Lima da

Nóbrega, e aos meus irmãos Sérgio

Lúcio Albuquerque Nóbrega e Cynthia

Albuquerque Nóbrega

6


AGRADECIMENTOS

A Deus, por sempre iluminar meu caminho. Ao meu Padre Cícero, por me dar muita fé e força em todos os meus projetos profissionais. Ao meu pai Josemar Lúcio da Nóbrega, a minha mãe Verônica Maria Albuquerque Lima da Nóbrega, e a minha irmã Cynthia Albuquerque da Nóbrega, pelo carinho e compreensão. Em especial ao meu irmão, Sérgio Lúcio Albuquerque da Nóbrega, por toda a ajuda nos experimentos e força nas horas de desespero. Sem ele essa obra não teria chegado ao fim. A minha professora e orientadora Profa. Ivone Antônia de Souza, pelo carinho, apoio, orientação, amizade, paciência, incentivo, confiança e persistência, fatores imprescindíveis para a conclusão deste trabalho. Aos meus professores e colegas da Faculdade de Medicina de Juazeiro por toda a compreensão e ajuda em aulas práticas e teóricas que não pude ir para realizar essa obra. Aminha conterrânea e nova amiga Ruth, por toda a ajuda na reta final desse trabalho. A todos que me ajudaram na reta final deste trabalho, em especial a: Rita, Rebeca, Renata e Isla. A todos os professores, técnicos e amigos do Departamento de Ciências Farmacêuticas. A todos os amigos que contribuíram para a conclusão deste trabalho.

7


SUMÁRIOI

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 16 2.REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................... 21

2.1 Aspidosperma pyrifolium Mart................................................................................... 21 2.1.1 ASPECTOS BOTÂNICOS ................................................................................. 21 2.1.2 ASPECTOS FARMACOQUÍMICOS E TOXICOLÓGICOS DE ASPIDOSPERMA PYRIFOLIUM MART.................................................................. 24

2.2.CÂNCER.................................................................................................................... 25 2.2.1 CARCINOGÊNESE............................................................................................ 25 2.2.2 EPIDEMIOLOGIA.............................................................................................. 27 2.2.3 FÁRMACOS ORIUNDOS DE PLANTAS UTILIZADOS NA QUIMIOTERAPIA ...................................................................................................... 28

2.3 RESISTÊNCIA BACTERIANA................................................................................ 29 2.3.1 AGENTES ANTIMICROBIANOS .................................................................... 31 2.3.2. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA UTILIZANDO PLANTAS MEDICINAIS....................................................................................................................................... 32

3. ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Aspidosperma pyrifolium Mart. ................... 34 3.1.PESQUISA DE ALCALÓIDES................................................................................. 34 3.2 PESQUISA DE TRITERPENÓIDES E ESTERÓIDES............................................ 35 3.3 PESQUISA DE IRIDÓIDES...................................................................................... 35 3.4 PESQUISA DE SAPONOSIDEOS............................................................................ 36 3.5 PESQUISA DE AÇUCARES REDUTORES............................................................ 37 3.6 PESQUISA DE FLAVONÓIDES.............................................................................. 38 3.7 PESQUISA DE GLICOSÍDEOS CARDÍACOS ....................................................... 39

4. OBJETIVOS ................................................................................................................... 41 4.1OBJETIVO GERAL.................................................................................................... 41 4.1.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 41

5. ARTIGO I ....................................................................................................................... 42RESUMO ......................................................................................................................... 43 ABSTRACT ..................................................................................................................... 43

MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................. 45 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 49 CONCLUSÃO.................................................................................................................. 50 AGRADECIMENTOS ..................................................................................................... 51 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 516. ARTIGO II...................................................................................................................... 54 RESUMO ......................................................................................................................... 55 ABSTRACT ..................................................................................................................... 55 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 56 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................. 56 RESULTADOS ................................................................................................................ 59 DISCUSSÃO.................................................................................................................... 60 CONCLUSÃO.................................................................................................................. 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................................. 627. CONCLUSÕES............................................................................................................... 69 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 71

9


SUMÁRIO II LISTA DE FIGURAS REVISÃO DE LITERATURA Figura.1: Aspidosperma pyrifolium Mart, cujo nome popular é pereiro preto. Fonte:

Haroudo Sátiro Xavier (RECIFE-PE 04/05/2006)..........................................8

Figura 2: Flor de Aspidosperma pyrifolium Mart. Fonte: Haroudo Sátiro Xavier (RECIFE

04/05/2006)......................................................................................9

Figura 3: Fruto de Aspidosperma pyrifolium Mart. Fonte: Haroudo Sátiro Xavier (RECIFE-PE 04/05/2006)..............................................................................10

Figura 4: Sementes de Aspidosperma pyrifolium Mart. Fonte: Haroudo Sátiro Xavier

(RECIFE 04/05/2006)....................................................................................10 Figura 5: Representação de células cancerosas..............................................................14 Figura 6: Estruturas químicas dos compostos da vincristina, da vinblastina, vidensina e

vinorelbina (GILMAN, 2003).......................................................................15 Figura 7: Ilustração dos alcalóides obtidos nas frações do extrato metanólico de

Aspidosperma pyrifolium Mart......................................................................22 Figura 8: Cromatografia após revelação com Lieberman-Burchard, confirmando a

presença de triterpenos e esteroides...............................................................22 Figura 9: Ilustração mostrando a presença de iridoides após revelação com vanilina

sulfúrica.........................................................................................................23 Figura 10: Ensaio de afrogenicidade..............................................................................24 Figura 11: Açucares redutores........................................................................................25 Figura 12: Flavonóides observados em U.V.365 nm após revelação com o reagente de

NEU...............................................................................................................26 Figura 13: Cromatograma dos extratos e do padrão (extrato metanólico de folhas de

Nerium oleander), vendo-se manchas correspondentes a glicosídeos cardioativos apenas neste último................................................................26

ARTIGO II Figura 1. Média dos pesos dos tumores. *P < 0,05 comparado os grupos tratados com o

controle que recebeu apenas solução salina a 0,9%. Teste “t” de Student (n = 5/grupo).........................................................................................................56

10


LISTA DE TABELAS ARTIGO I Tabela 1. Preparo das soluções do extrato da casca de Aspidosperma pyrifolium com as respectivas alíquotas (µL) e massas (mg) por disco........................................................34 Tabela 2. Média dos diâmetros de halos de inibição (em mm) da atividade antibacteriana do extrato metanólico das cascas de Aspidosperma pyrifolium Mart......36 ARTIGO II Tabela 1. Principais reações comportamentais relacionadas ás doses administradas na fase preliminar da avaliação da toxicidade aguda por via intraperitoneal.........................54

Tabela 2. Principais reações comportamentais relacionadas ás doses administradas na fase preliminar da avaliação da toxicidade aguda por via intraperitoneal.........................55

11


LISTA DE ABREVIATURAS

% - PERCENTAGEM µL – MICROLITRO µm – MICRÔMETRO °C – GRAUS CENTÍGRADOS AcOET – ACETATO DE ETILA AcOH – ÁCIDO ACÉTICO ATCC – AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION CCDA – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ANALÍTICA DAUFPE – DEPARTAMENTO DE ANTIBIÓTICOS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO g – GRAMA h – HORA IPA – EMPRESA PERNAMBUCANA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA

Kg – QUILOGRAMA

MeOH – METANOL

mg – MILIGRAMA

mL – MILILITRO

NCCLS – NATIONAL COMITÊ FOR CLINICAL AND LABORATORY

STANDARS

U.V. – ULTRAVIOLETA

UFC – UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA

v/v – VOLUME/VOLUME

12


RESUMO Nóbrega, M.G.L.A. Perfil fitoquímico e farmacológico da Aspidosperma pyrifolium Mart. ensaios pré-clínicos. Mestrado em Ciências Farmacêuticas – UFPE – Recife, 2008.

A utilização de produtos naturais vem crescendo notadamente nestes últimos anos. A pesquisa farmacológica de plantas medicinais tem propiciado não só avanços importantes para a terapêutica de várias patologias, como também tem fornecido ferramentas extremamente úteis para o estudo teórico de fisiologia e farmacologia. Aspidosperma pyrifolium Mart. ocorre na caatinga e é conhecida como pereiro, pau-de-coaru e pequiá da mata. No Brasil, essa espécie é usada em casos de enfisema, bronquite e pneumonia, bem como no tratamento de dispnéia asmática e cardíaca. A pesquisa proposta avaliou a atividade toxicológica, microbiológica e antineoplásica, assim como o perfil fitoquímico do extrato metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium Mart.. A toxicidade foi avaliada em duas etapas: preliminar e definitiva, pelo método de Karber e Behrens (1964). O tratamento com o extrato metanólico, com a dose via intraperitoneal em camundongos fêmeas apresentou índice de inibição de 73,90% para a dose de 7mg/kg , 61,54% para a dose de 14mg/kg, 28,57% para a dose de 28mg/kg.O fármaco padrão, metotrexato, foi capaz de inibir 48,64% do crescimento tumoral. Os resultados da toxicidade demonstraram por via intraperitoneal os seguintes efeitos: agitação, movimentos estereotipados, circulantes e de vibrissas, piloereção, reação de fuga, irritabilidade, exoftalmia, aumento da freqüência cardiorespiratória, tremores grosseiros, contorções abdominais e convulsões. No ensaio microbiológico a média aritmética dos halos de inibição foram 8,67; 12,00 e 14,33 para S. aureus (ATCC 6538), 9,00; 12,67 e 15,33 para BIOCLÍNICO e 13,67; 17,67 e 21,00 para M. luteus (ATCC 9341) nas respectivas concentrações. Os resultados confirmaram a capacidade de inibição do crescimento bacteriano in vitro pelo extrato de A. pyrifolium, corroborando os relatos populares. Na abordagem fitoquímica, foi detectada a presença de triterpenos, esteróides, iridóides, saponósidios, acúcares redutores, flavonóides e uma negatividade pra glicosídeos cardíacos. Conclui-se que a Aspidosperma pyrifolium Mart. apesar da alta toxicidade apresenta propriedades antitumorais e antimicrobianas com perspectivas para novas investigações biológicas. UNITERMOS: Aspidosperma pyrifolium, toxicidade, perfil fitoquímico, microbiológico, antitumoral, câncer.

13


ABSTRACT Nóbrega, M.G.L.A. Phytochemistry and Pharmacologic aspects of Aspidosperma pyrifolium Mart: pre-clinic assays. Dissertation of Pharmaceutical Science – UFPE – Recife, 2008. The use of natural products has been growing remarkably in recent years. The search pharmacology of medicinal plants has not only brought about important advances for the treatment of various diseases, but also has provided extremely useful tools for the theoretical study of physiology and pharmacology. Aspidosperma pyrifolium Mart. occurs in the caatinga and is known as “pereiro”, “pau-de-caoru” and “pequiá da mata. In Brazil, this species is used in cases of emphysema, bronchitis and pneumonia, and in the treatment of dyspnea asthmatic and heart. The survey assessed the proposed activity toxicological, and microbiological antineoplastic as well as the phytochemical profile of methanol extract of the bark of Aspidosperma pyrifolium Mart. The toxicity was evaluated in two steps: preliminary and final, the method of Karber and Behrens (1964). Treatment with the extract methanol, with the dose in mice by intraperitoneal females presented index of inhibition of 73.90% for the dose of 7mg/kg, 61.54% for the dose of 14mg/kg, to 28.57% 28mg/kg. The methotrexate, was able to inhibit tumor growth of 48.64%. The results of toxicity demonstrated by the intraperitoneal route the following effects: agitation, stereotyped movements, circulating and vibrissae, reaction of escape, irritability, exophthalmos, tremors, abdominal constriction. In the microbiological testing the arithmetic mean of halos of inhibition were 8.67, 12.00 and 14.33 for S. aureus (ATCC 6538), 9.00, 12.67 and 15.33 for BIOCLÍNICO and 13.67, 17.67 and 21.00 for M. luteus (ATCC 9341) in their concentrations. The results confirmed the ability of inhibition of bacterial growth in vitro by the extract of A. pyrifolium, corroborating the reports popular. In the phytochemical approach has been detected the presence of triterpenes, steroids, iridoids, saponoisides, reducing sugars, flavonoids and get a negative cardiac glycosides. It follows that the Aspidosperma pyrifolium Mart. despite the high toxicity presents antitumor and antimicrobial properties with prospects for new biological research. UNITERMS: Aspidosperma pyrifolium, acute toxicity, phytochemistry, antimicrobial activity, antitumor activity , cancer.

14


1. INTRODUÇÃO

15


1. INTRODUÇÃO

Nas antigas civilizações as plantas já eram utilizadas como fitoterápicos. Pode-se

dizer que se trata de uma das primeiras manifestações do homem para compreender a

natureza. Todas as civilizações, em todos os continentes, desenvolveram pesquisas para

conhecer o mecanismo de suas propriedades terapêuticas (SILVA et al., 2004).

O conhecimento popular é desenvolvido por grupos culturais que ainda convivem

intimamente com a natureza, observando-a de perto no seu dia-a-dia e, explorando suas

potencialidades, mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação

sistemática e constante (ELISABETSKY, 1997).

A importância histórica das substâncias ativas obtidas de plantas como protótipo

para o desenvolvimento de medicamentos, não foi representada apenas pelo surgimento de

grupos novos de compostos, mas proporcionou a identificação de uma nova possibilidade

de tratamento terapêutico. As opções de intervenções terapêuticas seriam muito escassas, se

não fosse a descoberta dessas substâncias ativas provenientes das plantas medicinais

(SIMÕES et al., 1999).

Dados históricos demonstram que foi a partir do uso de plantas medicinais que a

produção de medicamentos e o tratamento farmacológico das doenças deram seus primeiros

passos (CALIXTO, 2003). O isolamento da morfina da Papaver somniferum em 1803, pelo

farmacêutico Friedrich Wilhelm Adam Sertürner, marcou o início do processo de extração

de princípios ativos de plantas. A partir de então, outras substâncias foram isoladas, como

por exemplo, a quinina e a quinidina obtidas da Cinchona spp, em 1819, e a atropina da

Atropa belladona, em 1831, que passaram a ser utilizadas em substituição aos extratos

vegetais (SCHULZ, HÄNSEL, 2001).

O Brasil é o país de maior biodiversidade do planeta que, associada a uma rica

diversidade étnica e cultural, detém um valioso conhecimento social associado ao uso de

plantas medicinais, tendo assim um potencial necessário para o desenvolvimento de

16


pesquisas com resultados em tecnologias e terapêuticas apropriadas (BRASIL, 2006a).

Além disso, estima-se que cerca de cinqüenta milhões de brasileiros não tem acesso ao

medicamento, o que justifica a adoção de medidas que visem à amplificação das pesquisas

e propiciem o uso seguro de plantas medicinais como alternativa terapêutica em todo o

país, com especial atenção às regiões mais pobres (DINIZ, 2000).

Com base nisso, a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos foi

aprovada por meio do Decreto N° 5.813 de 22 de Junho de 2006, estabelecendo diretrizes e

linhas prioritárias para o desenvolvimento de ações em torno de objetivos comuns voltados

à garantia do acesso seguro e uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos no Brasil,

incentivando o desenvolvimento de tecnologias e o uso sustentável da biodiversidade

brasileira (BRASIL, 2006a).

Ainda em 2006 a Portaria nº 971, aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas

e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde. A Fitoterapia está inserida nestas

práticas integrativas e foi aprovada através do Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006

(BRASIL, 2006b).

O estímulo ao uso dos fitoterápicos tem como objetivo: prevenir, curar ou

minimizar os sintomas das doenças, com um custo mais acessível à população e aos

serviços públicos de saúde, comparativamente àqueles obtidos por síntese química, que são,

em geral, mais caros, devido às patentes tecnológicas envolvidas (TOLEDO et al., 2003).

É notório que o número de plantas estudadas cresce a cada ano. Esse fato encontra-

se associado ao crescimento do interesse da indústria farmacêutica pelo uso da

biodiversidade como fonte de novos medicamentos (CORDELL, 1995). Entretanto, nos

últimos vinte anos no Brasil, o número de informações sobre plantas medicinais tem

crescido apenas 8% anualmente. Isso mostra que em um país biologicamente tão rico, mas

com ecossistemas tão ameaçados, pesquisas com plantas medicinais, e, mesmo tóxicas,

deveriam ser mais incentivadas (MARIZ et al., 2006).

Já existe no mercado atual muitos medicamentos derivados de plantas, que foram

descobertos através de estudos direcionados para o isolamento de constituintes ativos dos

vegetais utilizados pela população. O agente anti-hipertensivo “reserpina”, o anticâncer

“Taxol®”, os agentes antileucêmicos “vimblastina” e “vincristina”, e o “psolarem”,

17


empregado no tratamento do vitiligo, são alguns exemplos desses produtos (DAVID,

NASCIMENTO, 2004; MULLER, MACEDO, 2005).

Embora a medicina moderna esteja bem desenvolvida na maior parte do mundo, a

Organização Mundial da Saúde (OMS) reconhece que grande parte da população dos países

em desenvolvimento depende da medicina tradicional para a sua atenção primária, tendo

em vista que 80% desta população utilizam práticas tradicionais nos seus cuidados básicos

de saúde e 85% destes utilizam plantas ou preparações destas (BRASIL, 2006). Das 252

drogas consideradas básicas e essenciais pela OMS, 11% são originárias de plantas e um

número significativo são drogas sintéticas de precursores naturais (RATES, 2001).

Sabe-se que muitas plantas medicinais apresentam substâncias que podem

desencadear reações adversas, seja por seus próprios componentes, seja pela presença de

contaminantes ou adulterantes presentes nas preparações fitoterápicas, exigindo um

rigoroso controle de qualidade desde o cultivo, coleta da planta, extração de seus

constituintes, até a elaboração do medicamento final (TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).

Toxicidade de uma substância é a capacidade intrínseca da mesma de afetar

negativamente ou causar dano a um organismo. Esta avaliação é realizada com o objetivo

de determinar o potencial das drogas e produtos relacionados. Testes que avaliam a

toxicidade sistêmica aguda são utilizados para classificar e apropriadamente rotular

substâncias de acordo com o seu potencial de letalidade ou toxicidade como estabelecido

pela legislação (LOPES; VALADARES, 2006).

A toxicidade de plantas medicinais é um problema sério e de saúde pública. Os

efeitos adversos dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxidez, bem como a ação

sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente. As pesquisas realizadas para

avaliação do uso seguro de plantas medicinais e fitoterápicos ainda são incipientes, assim

como o controle da comercialização pelos órgãos oficiais pelas feiras livres, mercados

públicos ou lojas de produtos naturais (VEIGA-JÚNIOR et al, 2005).

Com base nisso, em 2004 a Resolução nº 90, da ANVISA – Agência Nacional de

Vigilância Sanitária publicou um “GUIA PARA A REALIZAÇÃO DE ESTUDOS DE

TOXICIDADE PRÉ-CLÍNICA DE FITOTERÁPICOS” com objetivo de normatizar

métodos padronizados para os estudos de toxicologia pré-clínica no Brasil (BRASIL,

2004).

18


Então, as potencialidades de usos das plantas medicinais encontram-se longe de

estar esgotadas. Novos conhecimentos e novas necessidades certamente encontrarão, no

reino vegetal, soluções por meio da descoberta e do desenvolvimento de novas moléculas

com atividade terapêutica ou com aplicações tanto na tecnologia farmacêutica quanto no

desenvolvimento de fitoterápicos com maior eficiência de ação (SCHENKEL, et al., 2003).

19


2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

20


2.REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Aspidosperma pyrifolium Mart

2.1.1 ASPECTOS BOTÂNICOS A família Apocynaceae possui cerca de 200 gêneros e 2000 espécies, de distribuição

tropical e subtropical, podendo chegar até regiões temperadas. O gênero Aspidosperma

Mart. Ocorre desde o México até a Argentina e distingue-se pela ocorrência de alcalóides

indólicos ( JÀCOME et al, 2003). Toda a planta é bastante amarga o que pode ser atribuído

aos seus alcalóides; esse amargor até certo ponto, facilita seu reconhecimento, mesmo

quando totalmente desfolhada ou sem flores ou frutos ( LIMA, 1989).

No Brasil Aspidosperma pyrifolium Mart. (Figura 1) ocorre principalmente na

caatinga e é conhecida como pereiro, pau-de-coaru e pequiá da mata (CORREA, 1978).

Figura.1: Aspidosperma pyrifolium Mart, cujo nome popular é pereiro preto. Fonte:

Haroudo Sátiro Xavier (RECIFE-PE 04/05/2006).

21


É árvore de porte regular, podendo atingir até 5 metros de altura (BRAGA, 1976 e

TIGRE,1968). A sua madeira é amplamente empregada para serviços de carpintaria por

apresentar madeira de boa qualidade para estes fins (TIGRE, 1968). O nome popular

atribuído a esta espécie, mostra a semelhança que os primeiros estrangeiros aqui chegados

reconheceram na folhagem dessa planta com aquela da pereira ou pé-de-pêra, do gênero

Pyrus ( Pyrifolium = folha de Pyrus), (LIMA, 1989).

A floração ocorre geralmente no início das primeiras chuvas, com a folhagem ainda

não desenvolvida ou em início de desenvolvimento. As flores (figura 2) são aglomeradas

em pequenas cimeiras terminais, em média de 10 – 15 flores alvas, de perfume muito

agradável, que se espalha pela caatinga, especialmente à noite (GOMES &

CAVALCANTE, 2001; DUARTE, 1970). O fruto (figura 3), quando desenvolvido e

maduro, lenhoso, do tipo folículo, 5,0-6,0 cm de comprimento às vezes 4,0, até mesmo 7,0,

externamente castanho claro, apresentando formações verrugosas de cor cinza; amarelo-

castanho internamente, com grande quantidades de sementes (Figura 4) aladas, papiráceas,

de placentação marginal. As sementes são levadas pelo vento a grande distância, facilitando

a dispersão da espécie (LIMA, 1989).

22


Figura 2: Flor de Aspidosperma pyrifolium Mart. Fonte: Haroudo Sátiro Xavier (RECIFE

04/05/2006).

Figura 3: Fruto de Aspidosperma pyrifolium Mart. Fonte: Haroudo Sátiro Xavier

(RECIFE-PE 04/05/2006).

Figura 4: Sementes de Aspidosperma pyrifolium Mart. Fonte: Haroudo Sátiro Xavier

(RECIFE 04/05/2006).

23


2.1.2 ASPECTOS FARMACOQUÍMICOS E TOXICOLÓGICOS DE ASPIDOSPERMA PYRIFOLIUM MART.

O gênero Aspidosperma difere quimicamente de outras Apocynaceae pela

ocorrência freqüente de alcalóides indólicos, sendo esta uma característica marcante

(BOLZANI et al, 1987).

Em 1960, Gilbert et al descreve o isolamento de dois alcalóides do Aspidosperma

pyrifolium Mart., a pirifolina e a pirifolidina. Na análise espectral ultravioleta e de

infravermelho a pirifolina demonstra possuir um cromóforo N-acetil-7-methhoxi-

dihidroindol e uma função methoxi alifática.

Djerassi et al (1962) afirmava à época, que a aspidofilina representava o primeiro

alcalóide da classe hexacíclica abrangida pela pirifolina, refractina, kopsina e pelos seus

congêneres, com a parcela hidroaromática da molécula sem grupo funcional.

Os autores Serrur & Matos (1981) chamam atenção para os estudos químicos

realizados com os alcalóides do gênero Aspidosperma que se estenderam por um período

de mais de 100 anos. Afirmam esses autores a existência de três alcalóides do grupo da

aspidospermina para a espécie A. pyrifolium: a pirifolina e a pirifolidina encontradas na

casca do caule, a aspidofilina nas folhas e a própria aspidospermina encontrada nas cascas

das raízes.

Mitainee et al. (1996) trabalhando com Aspidosperma pyrifolium, originária da

Bolívia, isolou onze alcalóides inéditos da planta. Sendo eles : (-)-vincadifformina, O-

demetilpalosina, haplocina, N-formilaspidospermidina, vallesina, desmethoxiaspidos-

permina, palosina, (-)-aspidospermina, aspidospermidina, akuammicina e tubotaiwina.

Com relação a atividade farmacológica de substâncias isoladas de Aspidosperma

pyrifolium Mart., Deutsch et al. (1994) destaca a aspidospermina, molécula que ao lado da

quebrachamina, possui atividade bloqueadora adrenérgica sobre vários tecidos urogenitais,

justificando o emprego na medicina tradicional de extratos desses vegetais no alívio da

hiperplasia prostática benigna (HPB) e impotência erétil.

Craveiro et al. (1983) e Mitainee et al. (1996) ensaiaram um extrato do pereiro em

cães, verificando que o mesmo apresentava um forte efeito hipotensivo sobre a pressão

24


arterial. Porém devido a quantidade elevada de citotoxina presente nesse vegetal não é

recomendada a ingestão de qualquer preparação medicamentosa a partir do mesmo devido

aos sérios riscos produzidos por seus efeitos colaterais. Em estudo recente, Medeiros (2004)

responsabiliza a ingestão de material oriundo de Aspidosperma pyrifolium como

responsável pelo aborto e pela má formação em caprinos ocorrentes na região semi-árida do

nordeste brasileiro. No Brasil, essa espécie é usada ainda em casos de enfisema, bronquite e

pneumonia, bem como no tratamento de dispnéia asmática e cardíaca (LYON et al, 1973).

Na atualidade a farmacologia e a toxicologia têm chamado a atenção para

comprovação das possíveis propriedades terapêuticas, além da investigação dos

constituintes tóxicos (SILVA,2006).

Existe um número cada vez maior de estudos científicos que comprovam a

toxicidade de plantas antes usadas sem restrições e de forma indiscriminada. Podemos citar:

a kava-kava (Piber methysticum G. Forst, Piperaceae), o confrel (Symphytum officinale L.

Boraginaceae), mentrasto (Ageratum conyzoides L.), arnica (Arnica montana L.,

Asteraceae), carambola (Avehrroa carambola L., Oxalidaceae), Boldo do chile ( Peumus

boldus Molina, Monimiaceae), digitalis (Digitalis ssp, Escrofulariaceae), Ginkgo (Ginkgo

biloba L., Ginkgoaceae), boldos brasileiros (Plectranthus barbatus Andr e P.ornatus Codd,

Lamiaceae; Vernonia condensata L., Asteraceae) e entre outras (OLIVEIRA, 2006).

Apesar de existir uma crença popular de que produtos naturais não possuem

nenhum tipo de toxicidade, sabemos que não existe tal segurança na utilização destes

produtos, por isso se faz necessário à avaliação da toxicidade de seus efeitos tóxicos

(SILVA, 2007).

2.2.CÂNCER

2.2.1 CARCINOGÊNESE

Segundo RANG (2003) o câncer é uma doença caracterizada pela multiplicação e

propagação descontroladas no corpo de formas anômalas das próprias células. Uma célula

normal transforma-se em células cancerosas em decorrência de uma ou mais mutações do

DNA, que pode-ser congênita ou adquirida. As duas principais características de alterações

25


genéticas que levam ao desenvolvimento do câncer são: ativação de proto-oncogênese em

oncogênese e a inativação dos genes supressores tumorais.

Os agentes ou fatores etiológicos dos tumores malignos existem em quantidades

maiores que 1.500, todos agrupados em ordens: físicos, químicos e biológicos (RAMOS,

1984).

Com base em estudos experimentais realizados em roedores a carcinogênese

consiste em um processo de múltiplas etapas, que tem sido tradicionalmente divididos em

três estágios: iniciação, promoção e progressão (HARRIS, 1991).

As células cancerosas manisfestam-se em graus variáveis, com quatro características

que as distingue das células normais: proliferação descontrolada, perda da diferenciação e

da função, poder de invasão e metástases (GILMAN, 1996).

O crescimento do tumor maligno é o resultado do desequilíbrio entre a capacidade

de proliferação de suas células e a reação do organismo para detê-lo. Por último, existe

também um processo de autolimitação ao crescimento neoplásico originado em

desproporção entre o desenvolvimento celular e o desenvolvimento do mesênquima de

suporte - vasos e tecidos conectivos - que é responsável pela necrose e detenção da função

reprodutora das zonas menos vascularizadas do tumor (ROSSEL, 1984).

Carcinomas são denominados como as neoplasias malignas que se originam de células

epiteliais, derivadas de qualquer uma das três camadas germinativas (CONTRAN, 2000). O

carcinoma de Ehrlich, por ser um dos primeiros tumores transplantáveis conhecido, é um

dos mais extensamente utilizados para experimentação (SILVA, 2007).

O termo sarcoma deriva do grego sar que significa carnoso, refere-se a neoplasias

malignas do tecido mesênquimal (CONTRAN, 2000). O Sarcoma 180, é um tumor

neoplásico com critério de malignidade, cujas ás células são de fácil obtenção, sendo

utilizadas em vários centros de pesquisa e, após a inoculação o tumor desenvolve-se em 90

a 100% dos casos (SILVA, 2007).

26


Figura 5: Representação de células cancerosas.

A figura 5 demonstra os estágios do desenvolvimento de células neoplásicas no

organismo. Os principais agentes antineoplásicos podem ser classificados nas seguintes

categorias gerais: agentes citotóxicos (agentes alquilantes e compostos correlatos, agentes

antimetábolitos, antibióticos citotóxicos, derivados vegetais), hormônios e agentes diversos

que não se enquadram nas categorias anteriores. A maioria dos agentes antineoplásicos

utilizados são agentes antiproliferativos e não exercem nenhum efeito inibitório específico

sobre o poder de invasão, a perda de diferenciação ou a tendência a promover a metástase.

Além disso, uma grande parte destes, provoca efeitos colaterais que são considerados um

obstáculo para a aderência do paciente ao tratamento (RANG, 2003).

2.2.2 EPIDEMIOLOGIA

A tendência mundial é o aumento do número de casos de câncer, pois se trata de

uma doença que acomete principalmente os grupos etários mais avançados, e com os

progressos na saúde pública e na ciência médica um maior número de pessoas atinge a

idade em que se tornam vulneráveis a desenvolver câncer. No Brasil a trajetória é a mesma,

adiciona-se aqui os já conhecidos problemas sociais, sanitários e a heterogeneidade das

várias regiões territoriais (RANG, 2003).

As neoplasias malignas situam-se entre as principais causas de mortalidade,

correspondendo a segunda causa de morte natural. De acordo com os dados de registros de

câncer no Brasil, os tumores mais freqüentes no país são: próstata, pulmão, estômago,

27


colón e reto e esôfago na população masculina. Em mulheres predomina o câncer de mama,

seguido dos cânceres de colo uterino, cólon e reto, pulmão e estômago (GUERRA, 2005).

2.2.3 FÁRMACOS ORIUNDOS DE PLANTAS UTILIZADOS NA QUIMIOTERAPIA

Vários fármacos antineoplásicos têm origem primária de extratos de plantas que

contribuem de maneira significativa para o tratamento do câncer. O fracionamento do

extrato da planta pervinca (Vinca rōsea Linn.) forneceu quatro alcalóides dímericos:

vimblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina. Esses alcalóides são classificados como

agentes antimitóticos, pois atuam no ciclo celular possuindo a capacidade de ligar-se a

tubulina e de bloquear a capacidade da proteína de polimerizar-se em microtubulos

interrompendo a divisão celular na metáfase (BARACAT, 2000).

Os alcalóides da Vinca são muitos semelhantes quimicamente. As estruturas da

vincristina, vinoblastina e vindensina ( Figura 6) são compostos dímericos assimétricos.

Figura 6: Estruturas químicas dos compostos da vincristina, da

vinblastina, vidensina e vinorelbina (GILMAN, 2003).

28


O agente antimitótico placlitaxel é também derivado inicialmente da casca do eixo

ocidental (Taxus brevifolia Nutt.), diferenciando dos alcalóides da pervinca por atuar

inibindo a despolimerização dos microtúbulos, bloqueando o prosseguimento do ciclo

celular. Outro exemplo, é o alcalóide podofilotoxina extraído da planta mandragóra

(Podophyllum peltatum L.), que deriva dois glicosídeos semi-sintético denominados

etoposide e teniposida, que possuem atividade terapêutica em tumores do pulmão, tumores

dos testículos e linfomas (BARACAT, 2000).

2.3 RESISTÊNCIA BACTERIANA

A resistência bacteriana aumentou consideravelmente devido ao uso amplo e

indiscriminado de antibióticos em todo o mundo. Tal fenômeno resultou nos hospitais o

surgimento dos germes multiresistentes, mas também foi notado em bactérias na

comunidade, pela pressão seletiva determinada pelo uso clínico de antimicrobianos, tanto

humano como veterinário, pelo seu uso comercial para engorda de animais e no seu uso

industrial como conservantes de alimentos. Estima-se que nos anos 80 cerca 45% de todo

antibiótico vendido nos EUA era destinado para uso veterinário

(GOMES, 2001).

Quatro processos contribuem para o acúmulo da resistência: primeiro, espécies com

resistência intrínseca são favorecidas; segundo, mutantes resistentes de linhagens

previamente sensíveis são selecionados; terceiro, genes de resistência transferíveis

disseminam entre os isolados bacterianos, carreados por plasmídios, transposons e

integrons; e, por último, algumas linhagens resistentes propagam-se de modo epidêmico

entre pacientes, hospitais e países. A importância relativa destes processos varia com o

patógeno e com o local (LUIZ, 2006).

Mesmo bactérias muito tempo permaneceram susceptíveis às drogas usualmente

empregadas para o tratamento de doenças por elas causadas, paulatinamente apresentam

mudanças (GOMES, 2001). Vários são os mecanismos de resistência às drogas que

podemos citar: alteração no sitio de ligação, inativação ou destruição enzimática e

diminuição da entrada ou aumento da retirada da droga (GILMAN, 1996).

29


A resistência bacteriana pode ser definida como a concentração inibitória mínima

(CIM) para um determinado antibiótico acima da usualmente determinada por laboratórios

de referência, mas é importante lembrar que os resultados dos testes de resistência são

relativos e não absolutos. No caso de tolerância as bactérias apresentam bacteriostase na

presença do antimicrobiano, porém não acorre bacteriólise (GOMES, 2001).

A facilidade de obtenção dessa classe farmacológica para o uso incorreto também é

um desafio para as autoridades sanitárias de diversos países (FERNANDES, 2000).

Ehrlich e seus colaboradores Franke e Roehl , em 1905, descobriram o fenômeno da

resistência às drogas, ao observarem que em culturas de tripanossomas africanos tratados

com arsênico ou com determinados corantes havia a sobrevivência de alguns exemplares

da mesma população microbiana. Estes autores descreveram que infecções por

tripanossomas tratadas com doses baixas de arsenicais recaíam e relataram que um novo

tratamento falhava porque os tripanossomas haviam desenvolvido resistência às drogas e

que esta resistência passava a ser hereditária. O advento do uso clínico de sulfonamidas,

em 1933, e, em seguida, da penicilina, em 1941, levou à constatação de que a resistência

bacteriana aos agentes antimicrobianos podia ser uma característica natural das espécies de

bactérias ou ser adquirida por cepas individuais dentro de uma população sensível

(TAVARES, 2000).

No início início dos anos 70, infecções nosocomiais por A. baumannii eram tratadas

com sucesso com gentamicina, minociclina, ácido nalidíxico, ampicilina, ou carbenicilina,

tanto sozinhos quanto combinados, mas taxas de resistência em elevação começaram a ser

divulgadas entre 1971 e 1974. Desde 1975, surtos sucessivos têm demonstrado o aumento

da resistência em isolados clínicos de espécies de Acinetobacter. Uma elevada proporção

de isolados tornou-se resistente a antimicrobianos antigos; de fato, muitos Acinetobacter

são resistentes aos níveis clínicos da maioria dos antimicrobianos utilizados, incluindo

aminopenicilinas, ureidopenicilinas, cefalosporinas de pequeno espectro e amplo espectro,

cefamicinas, a maioria dos aminoglicosídeos, cloranfenicol, e tetraciclinas. Para alguns

antimicrobianos relativamente novos, tais como cefalosporinas de amplo espectro (quarta

geração), imipenem, tobramicina, amicacina e fluoroquinolonas, permanecem

relativamente sensíveis, mas a CIM destes antimicrobianos tem aumentado

substancialmente na última década (LUIS, 2004).

30


No Brasil, na atualidade, os estafilococos, tanto o S. aureus como o S. epidermidis,

mostram-se resistentes à penicilina G, ampicilina e amoxicilina em mais de 70% das cepas

isoladas, seja em ambiente hospitalar ou na comunidade, não sendo mais indicado o uso

destes antimicrobianos para o tratamento de infecções estafilocócicas, mesmo que benignas

e mesmo que procedam do ambiente extra-hospitalar. Além disto, estes germes vêm

mostrando elevado índice de resistência à meticilina (portanto, também à oxacilina e

cefalosporinas) no meio hospitalar no Brasil, repetindo-se o observado em outros países

(TAVARES, 2000).

No âmbito da saúde pública esse fenômeno é desastroso, pois esses microrganismos

multiresistentes não respondem de maneira satisfatória a antibioticoterapia disponível no

mercado (CARIBÉ, 2006). Por esse fato, é necessária a educação continuada dos

profissionais da saúde para a prescrição e dispensação dos antimicrobianos e a educação da

população sobre a sua utilidade, como também priorizar as medidas para controlar o seu

uso mediante prescrição médica, assegurar a qualidade dos produtos comercializados e

reduzir o seu uso na produção de alimento animal.

2.3.1 AGENTES ANTIMICROBIANOS

O advento dos antibióticos permitiu o controle e cura das doenças infecciosas,

mudando a evolução natural dessas doenças de forma marcante (MOREIRA, 2004).

Na atualidade os agentes antimicrobianos, do ponto de vista numérico, representam

um dos primeiros lugares no receituário geral. Muitas vezes, a prescrição de antibióticos é

abusiva, podendo-se afirmar que, na maioria dos casos, são indicados sem necessidade ou

com imprecisão (NETO, 1985).

Os antimicrobianos constituem uma categoria única de medicamentos, pois afetam

não somente o paciente que faz uso, mas também, de maneira mais ampla, o ambiente

microbiológico, interferindo com a flora de outros pacientes e das pessoas que direta ou

indiretamente entram em contato (GOMES, 2001). São classificados de acordo segundo o

mecanismo de ação: antimicrobianos que atuam na parede celular, antimicrobianos que

afetam a síntese ou a ação do folato, antimicrobianos que afetam a síntese protéica,

antimicrobianos que afetam a síntese de DNA e antimicrobianos citotóxicos ou que afetam

atividade enzimática (MOREIRA, 2004).

31


2.3.2. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA UTILIZANDO PLANTAS MEDICINAIS.

Tendo em vista que bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos representam

um desafio no tratamento de infecções, é notória a necessidade de encontrar novas

substâncias com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a esses

microrganismos (PEREIRA, 2004). Nesse sentido vários estudos foram realizados, afim de

verificar a atividade antimicrobiana de diversas plantas medicinais.

Nascimento (2004), realizou uma avaliação da atividade antimicrobiana de extratos

vegetais e fitofármacos frente a microrganismos sensíveis e resistentes a antibióticos, bem

como observado o possível efeito sinérgico da associação entre antibióticos e extratos

vegetais. Nesse estudo foram utilizados 10 extratos de plantas e ainda os fitofármacos,

ácido benzóico, ácido cinâmico, eugenol e farnesol. Na avaliação detectou-se que o maior

potencial antimicrobiano foi verificado para os extratos de cravo e jambolão que inibiram,

respectivamente, 64,2 e 57,1% dos microrganismos, inclusive com maior atividade sobre

os microrganismos resistentes a antibióticos (83,3%). Associação de antibióticos e extratos

vegetais ou fitofármacos, sobre bactérias resistentes a antibióticos, mostrou que em alguns

casos ocorreu sinergismo, possibilitando que antibióticos já ineficazes apresentassem ação

sobre estas bactérias.

A maioria dos óleos essenciais obtidos a partir das partes aéreas de Mentha

piperita, M. spicata, Thymus vulgaris, Origanum vulgare, O. applii, Aloysia triphylla,

Ocimum gratissimum e O. basilicum foram efetivos contra Enterococcus faecium e

Salmonella cholerasuis. A.triphylla e O. basilicum apresentaram inibição moderada contra

Staphylococcus aureus enquanto apenas A. tryphila e M. piperita foram capazes de inibir a

levedura Candida albicans (SARTORATTO, 2004).

Pereira (2004) realizou um estudo utilizando óleos essenciais de ervas medicinais

frente a 100 cepas de bactérias isoladas de indivíduos da comunidade com diagnóstico de

infecção urinária, constatou que a Salvia officinalis, L. apresentou eficácia de 100%

quando testadas em espécies de Klebsiella e Enterobacter, 96% contra em Escherichia

coli, 83% contra Proteus mirabilis e 75% contra Morganella morganii.

32


3. ABORDAGEM FITOQUÍMICA

33


3. ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Aspidosperma pyrifolium Mart.

O material vegetal recentemente coletado (caule) foi pesado, triturado em

microprocessador doméstico e submetido a percolação metanólica até a exaustão por um

período de 12hs, em aparelhos de Soxhlet, seguindo-se filtração em papel. O extrato

matanólico obtido do pereiro foi submetido à evaporação em rotaevaporador, até a

eliminação completa do solvente. O extrato bruto (seco) então obtido foi dissolvido em

metanol, sendo posteriormente analisado por cromatografia em camada delgada,

empregando-se diversos sistemas de desenvolvimento e reveladores apropriados,

conduzindo à prospecção de alcalóides, polifenenóis (cumarias, derivados cinâmicos,

flavonóides, proantocianidinas, e taninos gálicos), terpenóides (monoterpenóide,

sesquiterpenóides, diterpenóides, triterpenóides, esteróides, iridóides, saponósidos e

glicosídeos cardiotivos) e açucares redutores.

3.1.PESQUISA DE ALCALÓIDES A fração do extrato metanóico do da casca de Aspidosperma pyrifolium foi

submetido á cromatografia em camada delgada (CCD), tendo como fase móvel uma

mistura de AcOEt- n-PrOH – HO ( 5,7 : 3,2 : 1,3 v/v ), o cromatograma foi revelado com

reagente de Dragendorff, tendo sido detectada a presença de fortes manchas de coloração

alaranjada características de alcalóides ( Figura 7) (WAGNER, 1996).

Alcalóides

Figura 7: Ilustração dos alcalóides obtidos nas frações do extrato metanólico de Aspidosperma pyrifolium Mart.

34


3.2 PESQUISA DE TRITERPENÓIDES E ESTERÓIDES A amostra do extrato metanólico da casca de foi submetido á cromatografia com

Ác. Ursólico, β-amirina e β-sitosterol, empregando-se uma mistura de AcOEt- C7H8(20 :

80 v/v), revelando-se como reagente Liebernann-Burchard (SHARMA, 1991), seguido de

aquecimento de estufa (100ºC), por 5 minutos. Procedendo-se a visualização do

cromatograma no visível e em câmara de U.V. (365 nm). O surgimento de manchas com

coloração levemente rósea a avermelhada (Figura 8) foi usado como critério de evidência

da presença de triterpenóides e esteróides.

β-amirina

β-sitosterol

ác. ursólico

Figura 8: Cromatografia após revelação com Lieberman-Burchard, confirmando a

presença de triterpenos e esteroides.

3.3 PESQUISA DE IRIDÓIDES Alíquotas do extrato metanólico da casca de Aspidosperma pyrrifolium foi

submetida á co-cromatografia com padrão de ipolimida, empregando-se como fase móvel

uma mistura AcOEt- HCOOH-AcOH-H2O ( 100 : 11 : 11:26 v/v), revelando-se com

vanilina sulfúrica, seguida de aquecimento em estufa (100º C), durante 5 minutos. O

35


surgimento de manchas com coloração violeta (Figura 9) foi usado como critério

diagnóstico da presença de irióides.

iIpolamiida

Figura 9: Ilustração mostrando a presença de iridoides após revelação com vanilina

sulfúrica.

3.4 PESQUISA DE SAPONOSIDEOS

Alíquotas de 100mg do extrato seco de Aspidosperma pyrifolium foram colocadas

em tubos de ensaio, diluídas com água destilada e submetidas ao teste de afrogenicidade,

onde as soluções previamente submetidas a forte agitação manual por cerca de 30 trinta

segundos, foram em seguida mantidas em repouso, observando-se a consistência e

persistência da espuma produzida por cada amostra. Espuma abundante e persistente por

mais de 15 minutos foi o critério usado para avaliar a presença saponósidos (COSTA,

2001). Foi observado presença de espuma duradoura no extrato da casca de Aspidosperma

pyrifolium Mart. (Figura 10).

36


Figura 10: Ensaio de afrogenicidade.

3.5 PESQUISA DE AÇÚCARES REDUTORES

A amostra do extrato metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium Mart. foi

submetida à co-cromatografia com glicose e fucose, empregando-se uma mistura de

AcOEt-n-PrOH-H2O (5,7 : 3,2 : 1,3 v/v). A revelação do cromatograma foi efetuada com

aplicação de cloreto de Trifeniltetrazólio (TTZ), seguido de aquecimento em estufa (100º

C) durante 5 minutos. O surgimento de manchas com coloração vermelha foi usado como

critério de evidência de presença de açúcares redutores. Foi verificada a presença de

mancha idêntica a de glicose (Figura 11), o que confirma a presença desse açúcar redutor.

37

Glicose

Fucose


Figura 11: Açucares redutores.

3.6 PESQUISA DE FLAVONÓIDES

Uma alíquota do extrato metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium Mart. foi

submetida à CCD, empregando-se uma mistura de AcOEt- HCOOH-AcOH-H2O (100 : 11

: 11 : 26 v/v), revelando-se o cromatograma com o reagente de NEU

(defenilboriloxietilamina), procedendo-se a observação em câmara de U.V. (365 nm).

Manchas de fluorescência alaranjada , amarela, vermelha ou verde, consoante o esqueleto

molecular, foram usadas como critério para evidência da presença de flavonóides. Foi

revelada a presença de flavonóides no ensaio, dentre eles destaca-se a rutina (Figura 12).

Flavonoides

Rutina

Figura 12: Flavonóides observados em U.V.365 nm após revelação com o reagente de NEU.

38


3.7 PESQUISA DE GLICOSÍDEOS CARDÍACOS Uma alíquota do extrato metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium Mart. foi

submetida à cromatografia em camada delgada usando-se como padrão um extrato

metanólico de folhas de Nerium oleander , empregando-se como fase móvel uma mistura

de AcOEt – MeOH –H2O [81 : 11 : 08 (v/v)]. O surgimento de manchas de coloração

violácea e azul-violácea após imediata revelação do cromatograma com o reagente de

Kedde foi usada como critério determinante de existência da glicosídeos cardíacos. Não foi

constatada a presença de glicosídeos cardíacos na amostra (Figura 13).

Figura 13: Cromatograma dos extratos e do padrão (extrato metanólico de folhas de Nerium oleander), vendo-se manchas correspondentes a glicosídeos cardioativos apenas neste último.

39


4. OBJETIVOS

40


4. OBJETIVOS

4.1OBJETIVO GERAL

Avaliar as propriedades farmacológicas e o perfil fitoquímico da espécie

Aspidosperma pyrifolium Mart.

4.1.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Identificação botânica do vegetal; ● Obter o extrato metanólico da casca do Aspidosperma pyrifolium Mart.; ● Investigar a toxicidade aguda do extrato de Aspidosperma pyrifolium Mart; ● Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato “in vitro”; ● Determinar a ação antineoplásica do extrato de Aspidosperma pyrifolium Mart.

em Sarcoma 180.

41


5. ARTIGO I Artigo submetido á Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas

ARTIGO I Atividade antimicrobiana in vitro do extrato metanólico de Aspidosperma pyrifolium

Mart.

42


Mário Gustavo Lúcio Albuquerque da Nóbrega1*; Haroudo Sátiro Xavier1; Sérgio Lúcio

Albuquerque Nóbrega1; Renata Patrícia Freitas Soares de Jesus1, Ivone Antônia de Souza2.

1- Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco; 2-

Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, Recife –PE, Brasil.

_________________________________________________________________________

RESUMO

Aspidosperma pyrifolium Mart. ocorre na caatinga e é conhecida como pereiro, pau-de-coaru e pequiá da mata. No Brasil, essa espécie é usada em casos de enfisema, bronquite e pneumonia, bem como no tratamento de dispnéia asmática e cardíaca. O trabalho objetivou avaliar o potencial antimicrobiano in vitro do extrato metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium, nas cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) e Staphylococcus aureus isolado de amostra clínica (BIOCLÍNICO). As cascas foram coletadas no estado da Paraíba, para preparação do extrato metanólico. Os testes de susceptibilidade bacteriana foram realizados através do método de difusão em disco e da concentração inibitória mínima (CIM). O extrato de A. pyrifolium inibiu o crescimento somente das bactérias Gram-positivas. A média aritmética dos halos de inibição foram 8,67; 12,00 e 14,33 para S. aureus (ATCC 6538), 9,00; 12,67 e 15,33 para BIOCLÍNICO e 13,67; 17,67 e 21,00 para M. luteus (ATCC 9341) nas respectivas concentrações. Os resultados confirmaram a capacidade de inibição do crescimento bacteriano in vitro pelo extrato de A. pyrifolium, corroborando os relatos populares. Unitermos: Aspidosperma pyrifolium, pereiro, atividade antimicrobiana.

ABSTRACT

Antimicrobial activity in vitro of methanol extract of Aspidosperma pyrifolium Mart.

Aspidosperma pyrifolium Mart. occurs in the caatinga and is known as pereiro, pau-de-coaru and pequiá da mata. In Brazil, this species is used in cases of emphysema, bronchitis and pneumonia, and in the treatment of dyspnea asthmatic and heart. The aim of this work was to evaluate the antimicrobial potential in vitro the methanol extract of the barks of Aspidosperma pyrifolium. The strains used were Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) and Staphylococcus aureus isolated from clinical specimen * Autor para correspondência: Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, 50670 – Recife – PE. Email: [email protected].

43


(BIOCLÍNICO). The barks were collected at the state of Paraiba, to prepare of the methanolic extract. The susceptibility bacterial tests were realized by the method of diffusion in disk and the minimal inhibitory concentration (MIC). The extract of A. pyrifolium only inhibited the growth of Gram-positive bacteria. The arithmetic average of halos of inhibition were 8.67, 12.00 and 14.33 for S. aureus (ATCC 6538), 9.00, 12.67 and 15.33 for BIOCLÍNICO and 13.67, 17.67 and 21.00 for M. luteus (ATCC 9341) in their respective concentrations. The results confirmed the ability of inhibition of bacterial growth in vitro by the extract of A. pyrifolium, corroborating the reports popular.

Uniterms: Aspidosperma pyrifolium, pereiro, antimicrobial activity.

INTRODUÇÃO

A família Apocynaceae possui cerca de 200 gêneros e 2000 espécies, de distribuição

tropical e subtropical, podendo chegar até regiões temperadas. O gênero Aspidosperma

Mart. ocorre desde o México até a Argentina e distingue-se pela ocorrência de alcalóides

indólicos ( JÁCOME et al, 2003).

Aspidosperma pyrifolium Mart. ocorre na caatinga e é conhecida como pereiro,

pau-de-coaru e pequiá da mata (CORREA, 1978). A árvore é de porte regular, podendo

atingir até 5 metros de altura (BRAGA, 1976). Toda a planta é bastante amarga o que pode

ser atribuído aos seus alcalóides; esse amargor até certo ponto, facilita seu reconhecimento,

mesmo quando totalmente desfolhada ou sem flores ou frutos (LIMA, 1989).

Com relação a atividade farmacológica, Aspidosperma pyrifolium Mart. possui

atividade bloqueadora adrenérgica, antineoplásica, hipotensora e na disfunção erétil.

(CRAVEIRO et al., 1983; DEUTSCH et al., 1994; MITAINEE et al.,1996). Em estudo

recente, Medeiros (2004) responsabiliza a ingestão de material oriundo de Aspidosperma

pyrifolium como responsável pelo aborto e pela má formação em caprinos ocorrentes na

região semi-árida do nordeste brasileiro. No Brasil, essa espécie é usada ainda em casos de

enfisema, bronquite e pneumonia, bem como no tratamento de dispnéia asmática e cardíaca

(LYON et al, 1973).

44


O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antimicrobiano in vitro

do extrato metanólico de Aspidosperma pyrifolium nas cepas de Staphylococcus aureus (

ATCC 6835), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Escherichia coli (ATCC 10536),

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) e em uma linhagem de Staphylococcus aureus

isolado de amostra clínica ( BIOCLÍNICO) e determinar a concentração inibitória mínima

(CIM).

MATERIAL E MÉTODOS Planta e coleta do material

A coleta do material foi realizada no estado da Paraíba, município de Pereiro,

durante o período da manhã. O material foi previamente identificado na Empresa

Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA) e registrado em exsicata sobre o número

70.203. O material vegetal foi depositado no biotério do departamento de antibióticos da

Universidade Federal de Pernambuco, acondicionado em sacos plásticos, e mantido em

local arejado e seco até sua utilização.

Metodologia para obtenção do extrato

O material após secagem por 48 horas em estufa, com temperatura de 42,00 °C foi

processado em moinho elétrico, para a obtenção do pó proveniente das cascas da

Aspidosperma pyrifolium Mart. Foi utilizada uma balança eletrônica para aferição do peso

do pó. Foram colocados em torno de 250,00 g do pó em um aparelho de Soxllet e

adicionados 600,00 ml de metanol puro para análise, para iniciar a extração. A extração foi

feita por aproximadamente 12hs. Após esse período foi testada uma pequena quantidade do

extrato metanólico para ser detectada a presença de alcalóides com os reagentes de

Bertrand, Dragendorff, Bouchardat e Mayer. Após esse período, foi feito um novo teste

45


com os reagentes identificadores de alcalóides a fim de verificar a ausência de alcalóides no

pó existente no aparelho de Soxllet. O extrato foi filtrado em papel de filtro, e rota

evaporado a uma temperatura de 45ºC e em constante rotação. O extrato foi armazenado em

frasco âmbar e mantido no dessecador até o preparo das soluções em diferentes

concentrações (WILLIAMSON et al, 1996).

Avaliação da atividade antimicrobiana

Os meios de cultura utilizados foram o ágar TSA (Tryptic Soy Agar) (Merck®) para

o crescimento e manutenção das bactérias, o meio ágar Mueller-Hinton (Biobrás

Diagnóstico®) para os testes de avaliação de sensibilidade pelo método da difusão em

disco e o caldo Mueller-Hinton (Himedia®) para determinar a concentração inibitória

mínima (CIM) do extrato vegetal. Os solventes utilizados nos experimentos foram o

metanol para preparo do extrato vegetal e o dimetilsufóxido (DMSO) para ressuspensão do

extrato e realização do teste de atividade antimicrobiana, ambos apresentando grau de

pureza analítico Merck®. Também foi usado o 2,3,5-Trifenil Tetrazólio Cloreto (TTC)

(Nuclear) para revelar o ensaio da CIM. Os discos (Laboclin®) e o pó (Henrifarma®) de

cloranfenicol foram usados como controle positivo nos ensaios. As suspensões bacterianas

foram diluídas em solução salina estéril e padronizadas pela turbidez conforme a escala 0,5

de MacFarland: 0,5 mL de BaCl2.2H2O (0,048 M) - 1,75% (p/v) em 99,5 mL de H2SO4

(0,36 N) - 1% (v/v).

Os ensaios antimicrobianos foram realizados em triplicata através do método de

difusão em disco de papel filtro (Whatman - tipo 3) de 6,0 mm de diâmetro em meio ágar

Mueller-Hinton. Os inóculos foram obtidos a partir de culturas recentes dos

microrganismos (entre 18-24 h a 37 °C), preparando-se suspensões padronizadas através da

escala 0,5 de MacFarland (OPLUSTIL et al., 2000; KONEMAN, 2001). O extrato

46


metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium foi testado pelo método de triagem em

três concentrações (1, 2 e 3 mg/disco). Os discos foram impregnados com alíquotas do

extrato nas concentrações descritas na tabela 1, e no teste controle foi adicionado 10 µl de

DMSO, que foi utilizado para ressuspensão do extrato. Como controle positivo utilizou-se

o disco de cloranfenicol (30 µg). As culturas com os discos foram incubadas a 37 ºC por 18

h. Os resultados foram obtidos através da mensuração do diâmetro dos halos de inibição

formados ao redor dos discos (NCCLS, 2003a), com auxílio de um halômetro e expressos

em milímetros (CARVALHO-JÚNIOR et al., 2004; LIMA et al., 2000).

Tabela 1. Preparo das soluções do extrato da casca de Aspidosperma pyrifolium com as respectivas alíquotas (µL) e massas (mg) por disco.

Solução de trabalho Alíquota Massa do extrato por disco

100 10 1

100 20 2

100 30 3

47


Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Os ensaios de sensibilidade de microdiluição em caldo foram feitos em

triplicata, seguindo as recomendações da NCCLS (2003b). Os testes foram realizados

em caldo Mueller-Hinton contido em microplacas de 96 poços. O extrato metanólico da

casca de Aspidosperma pyrifolium foi depositado nos poços, seguindo a técnica de

diluição em série, na escala de 0,0098 a 20,0000 mg/mL. Foi realizado controle do

extrato, do caldo Mueller-Hinton, dos microrganismos e do cloranfenicol. As placas

foram incubadas a 37 °C por 24 h. A leitura foi realizada através da mudança de cor da

solução reveladora (TTC), considerando o resultado positivo a ausência de coloração e

negativo na presença de coloração rosa-avermelhada.

Microrganismos

Quatro cepas bacterianas foram usadas no controle de sensibilidade dos ensaios:

Staphylococcus aureus ATTC 6835, Micrococcus luteus ATCC 9341, Escherichia coli

ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 e uma linhagem de

Staphylococcus aureus isolada de amostra clínica (BIOCLÍNICO), que apresenta

resistência à penicilina, ampicilina e sensibilidade intermediária a tetraciclina, doada por

um laboratório privado de ARARIPINA-PE.

Análise estatística

Os resultados foram avaliados através da análise estatística descritiva e de testes

não-paramétricos de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney U (Beiguelman, 2002;

Callegari-Jacques, 2003). Foi utilizado o programa estatístico GraphPad InsTat (versão

3) para análise dos dados. Os testes foram considerados significantes quando o valor de

P < 0,05.

48


RESULTADOS E DISCUSSÃO Os ensaios de atividade antimicrobiana in vitro mostraram que o extrato

metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium inibiu o crescimento das cepas Gram-

positivas, mas não foi capaz de inibir o crescimento das cepas Gram-negativas.

As culturas de S. aureus (ATCC 6835), BIOCLÍNICO e M. luteus (ATCC 9341)

apresentaram halos crescentes de inibição de crescimento bacteriano, de acordo com as

concentrações testadas (1, 2 e 3 mg/disco). A média aritmética dos halos de inibição

foram 8,67; 12,00 e 14,33 para S. aureus (ATCC 6538), 9,00; 12,67 e 15,33 para

BIOCLÍNICO e 13,67; 17,67 e 21,00 para M. luteus (ATCC 9341) nas respectivas

concentrações.

Tabela 2. Média dos diâmetros de halos de inibição (em mm) da atividade antibacteriana do extrato metanólico das cascas de Aspidosperma pyrifolium Mart.. Concentração (mg/disco)

Microorganismos

1 2 3

S. aureus ATCC 6835 8,67 12,00 14,33

Bioclínico 9,00 12,67 15,33

M. luteus ATCC 9341 13,67 17,67 21,00

Cloranfenicol 20,67 20,67 40,67

A capacidade de inibição do crescimento bacteriano do extrato da casca de

Aspidosperma pyrifolium frente às cepas Gram-positivas pode estar diretamente

relacionado com a estrutura da parede celular das mesmas. Tendo em vista que essa é a

principal característica que separa os dois grupos e também devido à presença da

membrana externa das cepas Gram-negativas, pois ela age como barreira para certos

tipos de antibióticos, enzimas digestivas, detergentes e metais pesados (TORTORA;

FUNKE; CASE, 2003).

49


Mesmo o BIOCLÍNICO possuindo um perfil de sensibilidade de resistência para

alguns antibióticos, quando comparado com a cepa de S. aureus (ATCC 6835) não

houve diferença significativa (P < 0,05) de inibição do crescimento pelo extrato da

casca de Aspidosperma pyrifolium, ao utilizar o teste de Mann-Whitney U, sendo o

valor de P: 0,70, 0,40 e 0,40, nas concentrações de 1, 2 e 3 mg/disco, respectivamente.

Entretanto, quando comparado às médias dos diâmetros dos halos de inibição do

crescimento de S. aureus (ATCC 6835), BIOCLÍNICO e M. luteus (ATCC 9341) pelo

teste de Kruskal-Wallis, os resultados foram considerados significativo, sendo o P igual

a 0,04 para as concentrações de 1, 2 e 3 mg/disco, respectivamente. Essa diferença é

decorrente da maior sensibilidade da cepa de M. luteus ao extrato da casca de

Aspidosperma pyrifolium, que possibilitou a formação de halos de inibição do

crescimento superior ao BIOCLÍNICO e a cepa de S. aureus.

O extrato metanólico da casca de Aspidosperma pyrifolium apresentou um CIM

de 0,1562 mg/mL para M. luteus e de 0,3125 mg/mL para S. aureus (ATCC 6835) e

BIOCLÍNICO. O resultado do teste de Kruskal-Wallis confirma a diferença

significativa (P = 0,0498) das concentrações inibitórias mínimas do extrato de

Aspidosperma pyrifolium frente aos microrganismos testados.

CONCLUSÃO

Os testes utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana in vitro com o

extrato metanólico de A. pyrifolium sinalizam uma capacidade de inibição do

crescimento de bactérias Gram-positivas, principalmente da família Micrococcaceae.

Entretanto, novos testes in vitro com extratos de outras polaridades ainda precisam ser

realizados. Dessa maneira, a busca pela atividade antimicrobiana de extratos vegetais

50


poderá colaborar na descoberta de novas alternativas mais eficazes e econômicas para

combater algumas infecções causadas por microrganismos patógenos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte (FMJ) pelo

uso do seu laboratório de microbiologia, ao Biomédico do laboratório Bioclínico,

Dárcio Duarte, que forneceu a amostra clínica, e a todos os funcionários do

departamento de Farmácia e Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BEIGUELMAN B 2002. Curso prático de bioestatística. São Paulo: FUNPEC.

BRAGA, R. Plantas do Nordeste, Especialmente do Ceará. 3ª Edição Fortaleza, p.

407, 540p., 1976.

CALLEGARI-JACQUES, SM 2003. Bioestatística: princípios e aplicações. Porto

Alegre: ARTMED.

CARVALHO-JÚNIOR PM, RODRIGUES RFO, SAWAYA ACHF, MARQUES

MOM, SHIMIZU MT 2004. Chemical composition and antimicrobial activity of the

essential oil of Cordia verbenacea D.C. J Ethnopharmacol 95: 297-301.

CORREA. M.P. Dicionário das plantas úteis do Brasil, Rio de Janeiro: IBDF, 1978. v.5,

687p.

CRAVEIRO, A.A.; MATOS, F. J.A.; SERUR, L>M> Alkaloids of Aspidosperma

pyrifolium. Phytochemistry. 22, n. 6, p. 1526-1528, 1983.

DEUTSCH, H. F.; EVERSON, M. A.; DRESCHER, P.; SPARWASSER, C.;

MADSEN, P. Isolation and biological activiy of aspidosperpermine and quebrachamine

51


from Aspidosperma tree source. Journal of Pharmaceutical & Biomedical analysis.

V 12, n. 30, p. 1283-1287, 1994.

JÁCOME, R.L.R.P.; SOUZA, R.A., OLIVEIRA, A.B. Comparação cromatográfica

entre o extrato de Aspidosperma parvifolim e o fitoterápico “ Pau-Pereira”. Revista

Brasileira de Farmacognosia. Vol. 13, Suplemento 1, p. 39 – 41, 2003.

KONEMAN EW 2001. Diagnóstico microbiológico. 5.ed. Rio de Janeiro: MEDSI,

p.551-578.

LYON, R. L; FONG, H. H. S.; FARNSWORTH, N. R.; SVOBODA, G. H.; J. Pharm.

Sci. 1973, 62, 218.

LIMA CAA, PASTORE GM, LIMA EDPA 2000. Estudo da atividade antimicrobiana

dos ácidos anacárdicos do óleo da casca da castanha de caju (CNSL) dos clones de

cajueiro-anão-precoce CCP-76 e CCP-09 em cinco estágios de maturação sobre

microrganismos da cavidade bucal. Ciência e Tecnologia de Alimentos 20: 358-362.

MEDEIROS R. M. T.; NETO S. A.; RIET-CORREA A. L. & SOUZA N. L.

Mortalidade embrionária e abortos em caprinos causados por Aspidosperma pyrifolium.

Pesquisa Veterinária Brasileira, 24(supl.): p. 42-43, 2004.

MITAINE, A. C.; MESBAH, K.; RICHARD, B.; PETERMANN, C.; ARRAZOLA, S.;

1996.

NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute) 2003a. Performance standards for

antimicrobial disk susceptibility tests: approved standard. NCCLS document M2-A8

(ISBN 1-56238-485-6), Wayne, Pennsylvania.

NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute) 2003b. Methods for dilution

antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: approved standard.

NCCLS document M7-A6 (ISBN 1-56238-486-4), Wayne, Pennsylvania.

52


OPLUSTIL CP, ZOCCOLI CM, TOBUTI NR, SINTO SI 2000. Procedimentos básicos

em microbiologia clínica. São Paulo: Savier.

TORTORA GJ, FUNKE BR, CASE CL 2003. Microbiologia. Porto Alegre: ArtMed.

WILLIANSON EM, OKPAKO DT, EVANS FJ 1996. Pharmacological methods in

phytotherapy reseaach: selection, preparation and pharmacological evaluation of plant

material. New York: John & Sons.

53


6. ARTIGO II Artigo a ser submetido á Revista de Ciências da Saúde Santa Maria

ARTIGO II AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA E EFEITO ANTITUMORAL DE Aspidosperma

pyrifolium Mart. FRENTE AO SARCOMA 180

Mário Gustavo Lúcio Albuquerque da Nóbrega ¹*; Sérgio Lúcio Albuquerque da Nóbrega ¹; Ivone Antônia de Souza ² ______________________________________________________________________ 1 Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de pernambuco. Rua

Desembargador Virgilio de Sá Pereira, nº 544, apto- 703, CEP 50721-040, Cordeiro,

Recife-PE.

54


2 Departamento de antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, PE. Av. Prof.

Moraes Rego, s/n CEP, Recife – PE, Brasil.

* Contato com o autor: (81) 3272-6888 (88) 8806-1253

E-mail: [email protected]

RESUMO

Aspidosperma pyrifolium Mart. ocorre na caatinga e é conhecida como “pereiro”, “pau-de-coaru” e “pequiá da mata”. O material após secagem por 48 horas em estufa, com temperatura de 42,00 °C foi processado em moinho elétrico, para a obtenção do pó proveniente das cascas. Os animais foram divididos em grupos (n=5/grupo), e a toxicidade foi avaliada em duas etapas: preliminar e definitiva, pelo método de Karber e Behrens (1964). O tratamento com o extrato metanólico, com a dose via intraperitoneal em camundongos fêmeas apresentou índice de inibição de 73,90% para a dose de 7mg/kg , 61,54% para a dose de 14mg/kg, 28,57% para a dose de 28mg/kg.O fármaco padrão, metotrexato, foi capaz de inibir 48,64% do crescimento tumoral. Os resultados da toxicidade demonstraram por via intraperitoneal os seguintes efeitos: agitação, movimentos estereotipados, circulantes e de vibrissas, piloereção, reação de fuga, irritabilidade, exoftalmia, aumento da freqüência cardiorespiratória, tremores grosseiros, contorções abdominais e convulsões. No ensaio antitumoral houve significativa inibição do crescimento do Sarcoma 180. Os resultados obtidos foram animadores, satisfatórios e significantes. Palavras Chave: toxicidade, atividade antitumoral, Aspidosperma pyrifolium Mart., câncer.

ABSTRACT Aspidosperma pyrifolium Mart. occurs in the caatinga and is known as “pereiro”, “pau-de-coaru” and “pequiá da mata”. The material after drying for 48 hours under glass, with temperature of 42.00 ° C was processed in electric grinder, to obtain the dust from the shells. The animals were divided into groups (n = 5/grupo), and toxicity was evaluated in two steps: preliminary and final, by the method of Karber and Behrens (1964). Treatment with the extract methanol, with the dose in mice by intraperitoneal females presented index of inhibition of 73.90% for the dose of 7mg/kg, 61.54% for the dose of 14mg/kg, to 28.57% 28mg/kg.O standard dose of drug, methotrexate, was able to inhibit tumor growth of 48.64%. The results of toxicity demonstrated by the intraperitoneal route the following effects: agitation, stereotyped movements, circulating and vibrissae, reaction of escape, irritability, exophthalmos, tremors and abdominal constriction. In the trial there was a significant inhibition of growth of sarcoma 180. The results were encouraging, satisfactory and significant. Key words: antitumoral activity, Aspidosperma pyrifolium, cancer.

55

mailto:[email protected]


INTRODUÇÃO

Aspidosperma pyrifolium Mart. ocorre na caatinga e é conhecida como pereiro,

pau-de-coaru e pequiá da mata (CORREA, 1978). A árvore é de porte regular, podendo

atingir até 5 metros de altura (BRAGA, 1976). Toda a planta é bastante amarga o que

pode ser atribuído aos seus alcalóides; esse amargor até certo ponto, facilita seu

reconhecimento, mesmo quando totalmente desfolhada ou sem flores ou frutos (LIMA,

1989).

A toxicidade de plantas medicinais é um problema sério e de saúde pública. Os

efeitos adversos dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxidez, bem como a

ação sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente. As pesquisas

realizadas para avaliação do uso seguro de plantas medicinais e fitoterápicos ainda são

incipientes, assim como o controle da comercialização pelos órgãos oficiais pelas feiras

livres, mercados públicos ou lojas de produtos naturais (VEIGA-JÚNIOR et al, 2005).

As neoplasias malignas situam-se entre as principais causas de mortalidade,

correspondendo a segunda causa de morte natural. A tendência mundial é o aumento do

número de casos de câncer, pois se trata de uma doença que acomete principalmente os

grupos etários mais avançados, e com os progressos na saúde pública e na ciência

médica um maior número de pessoas atinge a idade em que se tornam vulneráveis a

desenvolver câncer (RANG, 2003; GUERRA, 2005).

O presente trabalho visou avaliar a toxicidade aguda e a atividade antitumoral de

Aspidosperma pyrifolium Mart. frente ao Sarcoma 180.

MATERIAL E MÉTODOS Material botânico

56


A coleta do material foi realizada no estado da Paraíba, município de Pereiro,

durante o período da manhã. O material foi previamente identificado na Empresa

Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA) e registrado em exsicata sobre o número

70.203. O material vegetal foi depositado no biotério do departamento de antibióticos

da Universidade Federal de Pernambuco, acondicionado em sacos plásticos, e mantido

em local arejado e seco até sua utilização.

Obtenção do extrato

O material após secagem por 48 horas em estufa, com temperatura de 42,00 °C

foi processado em moinho elétrico, para a obtenção do pó proveniente das cascas da

Aspidosperma pyrifolium Mart. Foi utilizada uma balança eletrônica para aferição do

peso do pó. Foram colocados em torno de 250,00 g do pó em um aparelho de Soxllet e

adicionados 600,00 ml de metanol puro para análise, para iniciar a extração. A extração

foi feita por aproximadamente 12hs. Após esse período foi testada uma pequena

quantidade do extrato metanólico para ser detectada a presença de alcalóides com os

reagentes de Bertrand, Dragendorff, Bouchardat e Mayer. Após esse período, foi feito

um novo teste com os reagentes identificadores de alcalóides a fim de verificar a

ausência de alcalóides no pó existente no aparelho de Soxllet. O extrato foi filtrado em

papel de filtro, e rota evaporado a uma temperatura de 45ºC e em constante rotação. O

extrato foi armazenado em frasco âmbar e mantido no dessecador até o preparo das

soluções em diferentes concentrações (WILLIAMSON et al, 1996).

Animais

Os animais utilizados foram camundongos adultos albinos Swiss (Mus

musculus), fêmeas, com pesos entre 25-35g. provenientes do Biotério do Departamento

de antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Os mesmos receberam água e

57


ração ad libitum e foram mantidos em gaiolas de polipropileno com ciclo 12 h

claro/escuro e temperatura 22 ± 2ºC. O manuseio dos animais durante o experimento foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE

(protocolo nº 6499/2007-65).

Foram utilizados cinco animais por grupo devidamente identificados. No grupo

padrão por via intraperitoneal (i.p.), utilizou-se metotrexato (10 mg/Kg), enquanto o

grupo controle recebeu solução salina 0,9%. Os grupos tratados receberam

administração, também via i.p. do extrato bruto metanólico de Aspidosperma pyrifolium

Mart. nas doses de 0,3; 0,6 e 1,0 mg/Kg.

Toxicidade Aguda

A toxicidade aguda em camundongos (n = 5) foi avaliada através da

administração intraperitoneal de doses crescentes (aí vc coloca as doses que foram

administradas) do extrato metanólico de Aspidosperma pyrifolium Mart.ou de igual

volume do veículo (solução salina 0,9%). Os animais foram observados após a

administração, durante 60 minutos, sendo analisados as alterações comportamentais e os

sinais de toxicidade. Após 48 horas o número de óbitos foi registrado. (Lorke, 1983).

Transplante dos tumores e tratamento

No experimento realizado foram utilizadas células tumorais da linhagem de

Sarcoma 180 (forma sólida). A massa tumoral inicialmente foi retirada do animal

doador e implantada fragmentos de 3mm de diâmetro na região axilar direta aos animais

receptores (STOCK, 1995). Após 48h do transplante dos tumores iniciou-se o

tratamento de cada grupo respectivo, por um período de sete dias.

58


Avaliação da atividade antitumoral

Após 24h do término do tratamento, todos os animais foram sacrificados, e os

tumores foram avaliados macroscopicamente, dissecados e pesados. Os seguintes

órgãos: fígado, baço e rins dos animais de cada grupo também foram avaliados na

macroscopicamente em relação ao tamanho, coloração e consistência (DAGLI, 1989).

Análise estatística

Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). As

diferenças entre os grupos foram avaliadas através da analise de variância (ANOVA)

seguida pelo teste “t” de Student. O nível de significância foi de p < 0,05.

RESULTADOS

Durante a realização do ensaio de toxicidade aguda por via intraperitoneal foram

observados e registrados a quantidade de óbitos em cada grupo durante a fase preliminar

com a finalidade de obter a maior dose que não apresentou letalidade (D1) e a menor

dose que apresentou 100% de letalidade (D2). As reações comportamentais relacionadas

às doses administradas do extrato de Aspidosperma pyrifolium Mart. estão descritas na

tabela 1, onde se encontrou a D1 de 5 mg/Kg e a D2 de 15,62 mg/Kg.

Na tabela 2 foram observados sinais de toxicidade na fase definitiva após 30

minutos da administração, reações com características estimulantes tais como; agitação,

movimentos circulares, reações de fuga, tremores grosseiros, movimento de vibrissias e

taquicardia.

Em seguida os animais passaram a apresentar reações com características

depressoras como: ambulação diminuída, flacidez muscular e analgesia (diminuição dos

reflexos). Outros efeitos observados foram; contorções abdominais, tônus da

musculatura abdominal, espasmos e irritação da conjuntiva.

59


As médias dos tumores de Sarcoma 180 dos grupos controle, padrão e tratados

com o extrato bruto metanólico de Aspidosperma pyrifolium Mart. nas doses de 7,0;

14,0 e 28,0 mg/kg estão representados na Figura 1.

Macroscopicamente, os animais do grupo controle não apresentaram alterações

nos órgãos. Nos animais tratados com o extrato observou-se alterações hepáticas e

renais a medida que aumentou a dose administrada aos animais. Contudo, os animais

tratados com metotrexato (10 mg/Kg) todos os órgãos se apresentaram atrofiados.

Nos animais tratados com o extrato, os tumores se mostraram bem delimitados e

com consistência sólida, reduzidas infiltrações e pontos hemorrágicos. No grupo

controle os tumores foram invasivos e sem delimitações.

Apesar de ter havido uma relevante taxa de inibição nas doses do tratado,

referentes às médias doses pesos dos tumores, somente os grupos tratados que

receberam as doses de 7,0mg/kg e 14mg/kg do extrato da planta nos animais portadores

do Sarcoma 180 é que foi estatisticamente significantivas em relação ao grupo controle,

como mostra a Figura 2. O tratamento com o extrato bruto metanólico de Aspidosperma

pyrifolim Mart., por via intraperitoneal em camundongos fêmeas, apresentou índice de

inibição de 73,90% para a dose de 7mg/kg , 61,54% para a dose de 14mg/kg, 28,57%

para a dose de 28mg/kg. O fármaco padrão, metotrexato, foi capaz de inibir 48,64% do

crescimento tumoral.

DISCUSSÃO

O câncer é uma doença caracterizada pela multiplicação e propagação

descontroladas no corpo de formas anômalas das próprias células. As duas principais

características de alterações genéticas que levam ao desenvolvimento do câncer são:

60


ativação de pronto-oncogênese em oncogênese e a inativação dos genes supressores

tumorais (RANG, 2003).

A inibição do câncer através de uma variedade de fitoconstituintes foi

confirmada em diferentes modelos de experimentação animal, a partir disso, vêm sendo

elaboradas estratégias de prevenção (SINGLETARY,2000).

A literatura também indica que muitos produtos naturais são utilizados

popularmente quimioprotetores contra alguns tipos de câncer (LIMA, 2007).

Pesquisas tem descritos que um crescimento tumoral causa distúrbios em

sistemas antioxidante, como uma inibição de enzimas chaves envolvidas neste processo

(EL-DIN, 2004). O perfil fitoquímico de Aspidosperma pyrifolim Mart. demonstrou a

presença de compostos fenólicos como os flavonóides. Os flavonóides são reconhecidos

por apresentar ação antioxidante e promover uma estabilização genômica, com efeito no

reparo do DNA, inibindo a ação das enzimas topoisomerases, as quais exercem papel

primordial na transcrição e replicação do DNA.

Os resultados encontrados evidenciaram que Aspidosperma pyrifolim Mart.

provocou significativa inibição tumoral em grupos tratados frente ao Sarcoma 180 com

as doses de 7,0 mg/kg e 14,0 mg/Kg. A redução causada pelo Padrão (Metotrexato) não

foi significativa, nem a dose de 28mg/kg.

Podemos associar esta atividade antitumoral a presença de flavonóides e

alcalóides, esses dados nos conduziram a estudos histopatológicos para analisar os

efeitos do extrato de Aspidosperma pyrifolim Mart.

CONCLUSÃO

O extrato metanólico de Aspidosperma pyrifolium Mart. provocou piloereção,

agitação e aumento da frequência respiratória nos camundongos, provavelmente devido

à presença de terpenos no extrato. Houve significativa inibição do crescimento tumoral

61


do Sarcoma 180. Recomenda-se estudos mais aprofundados com concentrações

menores e maiores do extrato, bem como a utilização de outras linhagens tumorais.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ALMEIDA, E. R. Plantas Medicinais Brasileiras: Conhecimentos populares e

Cientificos. Hermus, 1993. p.70-71

ALONSO, J. R. Tratado de Fitomedicina:bases clinicas y farmacológicas. 2. ed.

Buenos Aires: Isis Ediciones SRL, 2004.

BARACAT, F. F.; FERNANDEZ, H. J.; SILVA, M. J. Cancerologia Atual – Um

enfoque multidisciplinar. São Paulo: Roca, 2000.


407, 540p., 1976.

BENT, S.; KO, R. Commonly used herbal medicines in the United States: a review. The

American Journal of Medicine. n. 116, 478–485, 2004.

BRODY, M. et al. Farmacologia Humana - da molecular à clínica. 2. Ed. São Paulo:

Guanabara Koogan, 1991.

CARIBÉ, R. A. Análise de prescrição e administração da vancomicina nas clínicas

cirúrgicas do Hospital da Restauração, 2006. Monografia em planejamento e gestão de

serviços farmacêuticos, Pernambuco.

CONTRAN, R. S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Neoplasias. In: COTRAN, R. S.;

KUMAR, V.; COLLINS, T. (Eds.) Robbins – Patologia Estrutural e Funcional. Rio

de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 233-295, 2000.

CORRÊA, M. P. Diccionário das plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas.

Rio de Janeiro : IBDF, Imprensa nacional, v. 5, 1978, p. 687.

DALE, M. M.; RANG, H. P.; RITTER, J. M. Farmacologia, 4. Ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2001. p. 12-15.

62


DAVID, J. P.; DAVID, J. M. Plantas Medicinais. Fármacos derivados de Plantas. In:

SILVA, P., Farmacologia. 6. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara koogan, 2002, p. 134-145.

DO NASCIMENTO, J. E. et al. Medicinal plants products traded in Pernambuco –

Northeastern Brazil, Acta Farmaceutica Bonaerense, v. 24, n. 1, p. 113-122, 2005.

FLORÊNCIO, A. P. S. et al. Estudo da atividade anti-tumoral do polissacarídeo (PJU)

extraído de Anacardium occidentale frente a um modelo experimental do sarcoma 180.

Rev. Elet. Bras. v. 4, p. 61-65, 2007.

GILMAN, A. G. et al. As Bases Farmacológicas da Terapêutica, 9º Ed. Rio de

Janeiro, 1996.

GOTTILIEB, O. R., KAPLAN, M. A. Das plantas medicinais aos fármacos naturais.

Ciência hoje. v. 15, p. 686-691, 1995.

GUERRA M.R. Riscos de câncer no Brasil: tendências e estudos epidemiológicos mais

recentes. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 51, n. 3, p. 227-234, 2005.

HARRIS C. C. Chemical and physical carcinogenesis: advances and perspectives for

the 1990. Cancer Res. , V.51, p. 5023-5044, 1991.

KAWAHARA, N. et al. Two new cucurbitacin glucosides, opercurins A and B, from

the Brazilian folk medicine “Buchinha” (Luffa operculata). Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, v. 52, n. 8, p. 1018-1020, 2004.

KAWAHARA, N. et al. Two novel cucurbitacins, neocucurbitacins A and B, from the

Brazilian folk medicine “Buchinha” (Luffa operculata) and their effect on PEBP2A and

OCIF gene expression in a human osteoblast-like Saos- 2 cell line. Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, v. 49, n. 10, p. 1377 -1379, 2001.

KLOSS, P. On the bitter substance from Luffa operculata Cong. Archiv der

Pharmazie und Berichte der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, v. 299, n.

4, p. 351-355, 1966.

63


LORENZI, M.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais do Brasil. Nova Odessa, Instituto

Platarum, 2002, p. 196-7.

OLIVEIRA, F.; AKISUE, G. Fundamentos de Farmacobotânica. 2º Ed. Editora

Atheneu, 1998.

PEREIRA, R. S. et al. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de

infecção urinária. Rev. Saúde Pública, v.38, n.2, p. 68- 73, 2004.

RANG H.P., DALA M. M.; RITTER J.M.; MOORE P. K., Farmacologia, 5. ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2003.

RAMOS, J.; Oncologia Clínica, 2. ed., São Paulo: Sarvier, 1984, p. 320.

ROBBERS, J. E.; SPEEDIE, M.; TYLER, V. E. Farmacognosia e

farmacobiotecnologia. São Paulo: Premier, 1997, p. 372.

ROCHA, M. S. Fundamentos da Farmacologia e suas aplicações à terapêuticas, 3.

Ed, São Paulo: Edart, 1973.

ROSELL, R. et al. Manual da Oncologia. Barcelona: Toray, 1984, p-707.

SHADOMY, S.; et al. Are plant factors a missing link in teh evolution of endemic

Burkitt’s lymphoma? British Journal of Cancer. London, v. 68, p. 1232-1235, 2000.

SILVA, A. C. P. Abordagem da atividade biológica do látex de Euphorbia Tirucalli.

LIMA CAA, PASTORE GM, LIMA EDPA 1989. Estudo da atividade antimicrobiana

dos ácidos anacárdicos do óleo da casca da castanha de caju (CNSL) dos clones de

cajueiro-anão-precoce CCP-76 e CCP-09 em cinco estágios de maturação sobre

microrganismos da cavidade bucal. Ciência e Tecnologia de Alimentos 20: 358-362.

Linn. (Euphorbiaceae), 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas),

Universidade Federal do Pernambuco.

64


SILVA, E. C. B. Avaliação da Caesalpinia echinata Lam. (Fabaceae –

Caesalpinioideae) Uso e riscos, 2007. Dissertação (Mestrado em Ciências

Farmacêuticas), Universidade Federal do Pernambuco.

SINGLETARY, K. Diet, natural products and cancer chemoprevention. The J. of

Nutrition. p.465-6, 2000.

STOCK, C.C.; CLARCK, D.A.; PHILIPS, F.S.; BARCLAY, R.K. Sarcoma - 80

Inhibiton screening data. Cancer Res. vol.2, p.2-3, 1955.

TALALAY, P.; TALALAY, P. The importance of using scientific principles in the

development of medicinal agents from plants. Academic Medicine. n. 76, 238–247,

2001.

VALDARES, M. C.; Avaliação de Toxicidade Aguda: Estratégias após “era do teste

DL50”. Rev. Eletrônica de Farmácia, v. 3, n. 2, p.93-8, 2006.

VASQUES, C.A. V. VASQUES, N. V.; ARRAES, L. A., GELLER,M. Revisão

farmacognóstica da cabacinha (Luffa operculata Cong.). F MED. (BR), v. 93, n. 3, p.

185-7, 1986.

WÜNSCH, V. F.; MONCAU, J. E.; Mortalidade por câncer no Brasil 1980-1995:

padrões regionais e tendências temporais. Rev. Assoc. Med. Bras., São Paulo, v. 48, n.

3, p. 52-63, jul./set. 2002.

65


TABELA 1. Principais reações comportamentais relacionadas ás doses administradas na fase preliminar da avaliação da toxicidade aguda por via intraperitoneal. (-) sem efeito; (+) efeito leve; (++) efeito moderado; (+++) efeito acentuado.

EFEITOS DOSES

(mg/kg)

2,0 5 (D1)

7,5

10,25 15,62 (D2)

31,25

62,5

ESTIMULANTES

Taquicardia - ++ ++ ++ +++ +++ +++ Taquipnéia - + + ++ +++ +++ +++ Piloereção + + + + + + + Agitação - - - + + ++ ++ Exoftalmia - + + + + + + Movimentos Estereotipados - + + ++ ++ +++ +++ Movimentos circulares + + ++ ++ ++ +++ Movimentos de vibrissas - + + + + + + Ondulação caudal - - + + + + + Ereção de cauda - + + ++ ++ ++ +++ Tremores finos/grosseiros - + + + +++ +++ +++ Postura de ataque - + + + ++ ++ ++ Levantamento dos membros posteriores

- + + + + + +

Convulsão focal - - - - - - -

DEPRESSORES

Abaixamento dos membros posteriores

- - - + + + +

Apnéia - - - + ++ ++ +++ Alteração de marcha + + + + + + + Sonolência - - - - - - - Prostração - - - - + ++ +++

OUTROS

Excreção fecal - - - - - + + Diurese - - - - - - - Contorções abdominais - - + + ++ +++ +++ Espasmos - + ++ ++ +++ +++ ++ Reação de fuga - + +++ +++ +++ +++ +++ Palidez - + + + + + ++ Distensão abdominal - + + + ++ +++ +++ Petéquias - - + + + + + Edema de focinho - - + ++ ++ ++ ++ Cianose - - + + + ++ ++ Fotofobia - - - - - - - Refluxo - - - - - - -

66


TABELA 2. Principais reações comportamentais relacionadas ás doses administradas na fase preliminar da avaliação da toxicidade aguda por via intraperitoneal. (-) sem efeito; (+) efeito leve; (++) efeito moderado; (+++) efeito acentuado.

EFEITOS DOSES

(mg/kg)

5 7,5 10,2 12,6 13,2 14,5 15,62

ESTIMULANTES

Taquicardia - + ++ ++ ++ +++ +++ Taquipnéia - ++ ++ ++ ++ +++ +++ Piloereção + + + + + ++ ++ Agitação - - - + ++ ++ ++ Exoftalmia + + + + + ++ ++ Movimentos Estereotipados + + ++ ++ ++ ++ +++ Movimentos circulares + + ++ ++ ++ ++ +++ Movimentos de vibrissas + + + + + + + Ondulação caudal - - - - - - - Ereção de cauda + + + + + + + Tremores finos/grosseiros ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ Postura de ataque + + + ++ ++ ++ +++ Levantamento dos membros posteriores

- - - - - - -

Convulsão focal - - - - - - - DEPRESSORES

Abaixamento dos membros posteriores

+ + + + + + +

Apnéia - - - + + + + Alteração de marcha + + + + + + + Sonolência - - - - - - - Prostração - - - + + ++ ++

OUTROS Excreção fecal - - - + + + + Diurese - - - - - - - Contorções abdominais + + + + ++ ++ +++ Espasmos + + + ++ ++ ++ +++ Reação de fuga ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ Palidez + + + + + + + Distensão abdominal + + + + ++ ++ ++ Petéquias - - - - - - - Edema de focinho + + + + + ++ ++ Cianose + + + + + + + Fotofobia - - - - - - - Refluxo - - - - - - -

67


* *

0

0,5 1

1,5 2

2,5 3

3,5 4

Controle Padrão A. pyrifolium7mg/kg

A. pyrifolium14mg/kg

A. pyrifolium28mg/kg

Média dos pesos dos Tumores

Série1

Figura 1. Média dos pesos dos tumores. *P < 0,05 comparado os grupos tratados com o controle que recebeu apenas solução salina a 0,9%. Teste “t” de Student (n = 5/grupo).

68


7.CONCLUSÕES

7. CONCLUSÕES

Os resultados demonstraram que o extrato metanólico da casca de Aspidosperma

pyrifolium Mart. apresentou inicialmente efeitos estimulantes do Sistema Nervoso

69


Central como taquicardia, agitação, irritabilidade , movimentos circulares, tremores

finos e grosseiros, entre outros. Porém, após trinta minutos de observação foram vistos

efeitos depressores como alteração de marcha e prostação.

Na avaliação anti-tumoral de frente ao Sarcoma 180, os animais tratados com

7,0 mg/Kg e 14,0 mg/Kg do extrato de Aspidosperma pyrifolium Mart. obtiveram índice

de inibição significativo de 73,90% e 61,54% quando comparado com o grupo controle.

No que diz respeito a análise microbiológica, o extrato bruto de Aspidosperma

pyrifolium Mart. apresentou atividade antimicrobiana contra bactérias gram-

positivas,como Staphylococcus aureus e Micrococcus luteus.

Conclui-se que a Aspidosperma pyrifolium Mart. apesar da alta toxicidade

apresenta propriedades antitumorais e antimicrobianas com perspectivas para novas

investigações biológicas.

70


8. REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANTÔNACCIO, L.D. Aspidofiline, the phenolic alkaloid of Aspidosperma pyrifolium.

J. Org. Chem. v. 25, Rio de Janeiro. p. 1262-1263, 1960.

ASHTON, P. M. S.; BERLYN, G. P.. Leaf adaptations of some Shorea species to sun

and shade. New Phytologist, 121: 587-596. 1992.

BARACAT, F. F.; FERNANDEZ, H. J.; SILVA, M. J. Cancerologia Atual – Um

enfoque multidisciplinar. São Paulo: Roca, 2000.

71


BARBOSA, W.L.R.; TAVARES, I.C.C.; SOARES, D.C. Alcalóides de Aspidosperma

auriculatum Standl. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 13, supl., p. 06-08, 2003.

BASTIN, E. S. Botanical Medicine Monographs and Sundry. Structure: of Cimicifuga.

American Journal of Pharmacy, v. 67, n. 3, 1895.

BRASIL. Ministério da Saúde. Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos.

Brasília-DF, 60p, 2006.

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE

nº 90, de 16 de março de 2004. Diário Oficial da União, Poder Executivo, Brasília, DF,

18 de Março de 2004.

BRASIL. Portaria nº 971 de 03 de maio de 2006. Aprova a Política Nacional de Práticas

Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde. Diário Oficial

União, Brasília, DF, 4 maio.2006b . seção 1, p.

BRASIL. Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006. Aprova a Política Nacional de

Plantas Medicinais e a Fitoterápicos e dá outras providências. Diário Oficial da União,

Brasília, DF, jun. 2006 . seção 1, p.


407, 540p., 1976.

BONATES, L. C. M. Estudos ecofisiológicos de Orchidaceae da Amazônia II.

Anatomia ecológica foliar de espécies com metabolismo CAM de uma campina da

amazonia central. Acta Amazonica, 23:315-348, 1993.

BOLZANI, V. da S. SERUR, L. M. MATOS, F. J. de A.; GOTTLIEB, O. R. Indole

alkaloide evolution in Aspidosperma. Biochemical Systematics and Ecology, v. 12, nº

2, pp. 187- 200, 1987.

72


BOLZANI, V. DA S.; SILVA, M. F. DAS G.; ROCHA, A. I. DA and GOTTLIEB, O.

R. Indole Alkaloids as Systematic Markers of the Apocynaceae. Biochemical

Sistematics and Ecology, Vol. 12, No. 2, pp. 159-166, 1984.

BRIDSON, D.; FORMAN, L. The herbarium handbook. 3.ed. Great Brain: Whistable

Litho Printers, 334 p. 1998.

BRUMMITT, R. F.; POWELL, C. E. Authors of plant names. London: Kew Royal

Botanic Gardens, p. 732, 1992.

CRONQUIST, A. An integrated system of classification of flowering plants. New

York: Columbia University Press.1262p. 1981.

CALIXTO, J. B. Biodiversidade como fonte de medicamentos. Ciência e Cultura. v.

55, n. 3, p. 37-39, 2003.

CARIBÉ, R. A. Análise de prescrição e administração da vancomicina nas clínicas

cirúrgicas do Hospital da Restauração. 2006. Monografia em planejamento e gestão de

serviços farmacêuticos, Pernambuco.

CONTRAN, R. S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Neoplasias. In: COTRAN, R. S.;

KUMAR, V.; COLLINS, T. (Eds.) Robbins – Patologia Estrutural e Funcional. Rio

de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 233-295, 2000.

CORDELL, G.A. Changing strategies in natural products chemistry. Phytochemistry,

v.40,

n.6, p.1585-1612, 1995.

COSTA, A. F. Farmacognosia. III volume / Farmacognosia Experimental. 3ª ed.

Revista e actualizada pelo Prof. A. Proença da Cunha. Fundação Calouste Gulbenkian /

Lisboa. 992p. , 2001.

CRAVEIRO, A.A.; MATOS, F.J.A.; SERUR, L.M. Alkaloids of Aspidosperma

pyrifolium. Phytochemistry. v. 22, n. 6, p. 1526-1528, 1983.

73


DAVID, J. P.; DAVID, J. M. Plantas Medicinais. Fármacos derivados de Plantas. In:


DAVID, J.P.L.; NASCIMENTO, J.A.P.; DAVID, J.M. Produtos fitoterápicos: uma

perspectivade negócio para a indústria, um campo pouco explorado pelosfarmacêuticos.

Infarma. Vol.16, n.9-10, p.71-76, 2004.

DEUTSCH, H. F.; EVENSON, M. A.; DRESCHER, P.; SPARWASSER, C.;

MADSEN, P. Isolation and biological activity of aspidospermine and quebrachamine

from Aspidosperma tree source. Journal of Pharmaceutical & Biomedical analysis. v.

12, n. 30, p. 1283-1287, 1994.

DINIZ, M.F.F.M. et al. A. Memento fitoterápico: as plantas como alternativa

terapêutica;

conhecimentos populares e científicos. João Pessoa: Ed Universitária/UFPB, 1997.

205p.

DINIZ, M.F.F.M. Ensaios toxicológicos pré-clínicos com as folhas de Cissampelos

sympodiales Eichl (Menisperaceae). 2000. 147p. Tese (Doutorado em Produtos

Naturais e Sintéticos Bioativos) Centro de Ciências da Saúde. Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa.

DJERASSI, C.; OWELLEN, R. J.; FERREIRA, J. M.; ANTONACCIO, L. D. Alkaloid

studies XXXVII. The structure of aspidofiline. Experientia, V-18, p. 397, 1962.

DJERASSI, C.; GILBERT, B.; SHOOLERY, J.N.; JOHNSON, L.F.; BIEMAN, K.

Experientia. v. 17, p. 162-163, 1961.

DUARTE, A.P. Contribuição para uma revisão do gênero Aspidosperma. Simpósio

Sobre Produtos Naturais Da América Tropical. An. Acad. Bras. Cien. v. 42, p. 289-

327, Suplemento, Rio de Janeiro – RJ.1970.

74


ELISABETSKY, E. Etnofarmacologia de algumas tribos brasileiras. In: Ribeiro D,

editor.

Suma etnológica brasileira. Petrópolis: Vozes, 1997.

EHLERINGER, J. R. & MOONEY, H. A.. Leaf hairs: effect on physiological activity

and adaptative value to a desert shrub. Oecologia, 37:183-200, 1978.

FAHN, A. & CUTLER, D.. Xerophytes. Gebruder Borntraeger, Berlin. 1992

FAHN, A. Anatomia Vegetal. H. Blume, Madrid. 1978.

FAHN, A. Structural and functional properties of trichomes of xeromorphic leaves.

Annals of Botany, 57:631-637, 1986.

FERNANDES, A.T. Infecção Hospitalar e suas interfaces na Área de Saúde. 2. ed.

São

Paulo: Atheneu, 2000.

FLORÊNCIO, D. C.; XAVIER, H. S. Anais do X Congresso De Iniciação Científica

da UFPE. Abordagem Fitoquímica de parasita (Phoradendron coriaceum Mart. ) e

hospedeiro (Aspidosperma pirifolium Mart.). Cd Rom, Recife, 2002.

GILBERT, B.; FERREIRA, J.M.; OWELLEN, R.J.; SWANHOLM, C.E.;

BUDZIKIEWICZ, H.; DURHAN, L. J.; DJERASSI, C. Mass spectrometry in structural

and stereochemical problems. XVI. Structures of the Aspidosperma alkaloid,

aspidoalbina. Tetrahedron Letters, v. 59, p. 1001-1009, 1962.

GILBERT, B.; ANTONACCIO, L.D.; ARCHER, A.A.P.G.; DJERASSI, C. Alkaloid

studies. XXIV. The structure of the aspidospermaalkaloids cylindrocarpine and

cylindrocarpidine. Experientia, v. 16, p. 61-65, 1960.

GILBERT, B.; ANTONACCIO, L.D.; ARCHER, A.A.P.G.; DJERASSI, C. Alkaloid

studies. XXIII. Isolation of four new aspidosperma alkaloids-cylindrocarpine, refractine,

pyrifoline, and pyrifolidine. Experientia, V-16, p. 61-62, 1960.

75


GILBERT, B. Um estudo fitoquímico do gênero Aspidosperma. Annais da Academia

Brasileira de Ciências 38 (supl.): 315-319. 1966

GILMAN, A. G. et al. As Bases Farmacológicas da Terapêutica, 9º Ed. Rio de

Janeiro, 1996.

GOLDWASSER, A, Y.; WESTWOODB, J. H. and YODERC, J. I. The Use of

Arabidopsis to Study Interactions between Parasitic Angiosperms and Their Plant

Hosts. American Society of Plant Biologists. 2002. p. 1-17.

GOMES, S. M., E CAVALCANTI, T. B. Morfologia floral de Aspidosperma Mart &

Zucc. (Apocynaceae). Acta bot. bras. 15 (1): 73-88. 2001

GOMES, M.J.V.M.; REIS, A. M. M. Uma Abordagem em Farmácia Hospitalar. São

Paulo: Atheneu, 2001.

GREENWAY, H. & OSMOND, C. D. Ion relations, growth and metabolism of

Atriplex at high, external electrolyte concentrations. In: JONES, R. The Biology of

Atriplex. CSIRO. Canberra. Australia, p. 49-56. 1970.

GUERRA M.R. Riscos de câncer no Brasil: tendências e estudos epidemiológicos mais

recentes. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 51, n. 3, p. 227-234, 2005.

HARRIS C. C. Chemical and physical carcinogenesis: advances and perspectives for

the 1990. Cancer Res. , v. 51, p. 5023-5044, 1991.

HEISER, C. B.; SCHILLING, E. E. Phylogeny and distribution of Luffa

(Cucurbitaceae). Revista Biotropica, v. 20, n. 3, p. 185-191, 1988.

JÁCOME, R.L.R.P.*; SOUZA, R.A., OLIVEIRA, A.B. ESTUDO QUÍMICO E

PERFIL CROMATOGRÁFICO DAS CASCAS DE Aspidosperma parvifolium A. DC.

(“PAUPEREIRA”). Quim. Nova, Vol. XY, No. 00, 1-x, P. 1-4, 2004

76


JÁCOME, R.L.R.P.*; SOUZA, R.A., OLIVEIRA, A.B. Comparação cromatográfica

entre o extrato de Aspidosperma parvifolium e o fitoterápico "Pau-Pereira". Revista

Brasileira de Farmacognosia. Vol. 13, Suplemento 1, p. 39 – 41, 2003.

JOHANSEN, D. A. Plant Microtechnique. McGraw Hill Book, New York. 1940.

KOZLOWSKI, T. & PALLARDY, S. G. Physiology of woody plants. Academic

Press, San Diego. 1997.

KRAUTER, D. Erfahrungen mit Etzolds FSA-Färbung für Pflanzenschnitte.

Mikrokosmos, v. 74, n. 8, p. 231-233, 1985.

LARCHER, W. Ecofisiologia vegetal. Rima Artes e Textos, São Carlos. 2000.

LIERAS, E. Differences in stomatal number per unit area within the same species under

different microenvironmental conditions: a working hypothesis. Acta Amazônica,

7:473-476, 1977.

LYON, R. L; FONG, H. H. S.; FARNSWORTH, N. R.; SVOBODA, G. H.; J. Pharm.

Sci. 1973, 62, 218.

LOPES, S.G. Fundamentos da Toxicologia Clínica. São Paulo: Editora Atheneu, 158p.,

2006.

LUIZ, S. O. Caracterização da resistência de amostras de Acinetobacter baumannii

isoladas no hospital de clinicas de Curitiba, 2006. Dissertação (Mestrado em Micologia)

Universidade Federal do Paraná, Curitiba.

MARCONDES-FERREIRA NETO, W. Aspidosperma Mart., nom. cons.

(Apocynaceae): estudos taxonômicos. Tese de Doutorado. Universidade Estadual de

Campinas, Campinas-SP. 1988.

MARCONDES-FERREIRA, W. & KINOSHITA, L. S.. Uma nova divisão

infragenérica para Aspidosperma Mart. (Apocynaceae). Revista Brasileira de Botânica

19 (2): 203-214. 1996

77


MARKHAM, K. R. Techiniques of flavonoididentifiction.ACADEMIC PRESS,

LONDON. 1982.

MATOS, F. J. A. Formulário fitoterápico do professor Dias da Rocha: informações

sobre o emprego na medicina caseira, de plantas do Nordeste, especialmente do

Ceará. 2ª ed. F.J. de Abreu Matos. Ed. Fac-sim. – Fortaleza: EUFC, 260p, 1997.

MATOS, F.J.A. Formulário fitoterápico do professor Dias da Rocha. COLEÇÃO

ESAM ANO, Vol. 18, Coleção Mossoroense, volume CCCLXV, p. 108-109, 222p.,

1987

MARIZ, S.R.; CERQUEIRA, G.S.; ARAÚJO, W.C.; DUARTE, J.C.; MELO, A.F.M.;

SANTOS, H.B.; OLIVEIRA, K.; MELO DINIZ, M.F.F.; MEDEIROS, I.A. Estudo

toxicológico agudo do extrato etanólico de partes aéreas de Jatropha gossypiifolia L. em

ratos. Rev. Bras. Farmacogn. 16(3):jul/set. 2006.

MEDEIROS R. M. T.; NETO S. A.; RIET-CORREA A. L. & SOUZA N.

L.Mortalidade embrionária e abortos em caprinos causados por Aspidosperma

pyrifolium. Pesquisa Veterinária Brasileira, 24(supl.): p. 42-43, 2004.

METCALFE, C.R.; CHALK, L. 1979. Anatomy of the Dicotyledons. 2ª ed. V.1.

Clarendon Press, Oxford.

METZ, H. Naturwisenchaften. 48, 596, 161.

MITAINE, A. C.; MESBAH, K.; RICHARD, B.; PETERMANN, C.; ARRAZOLA, S.;

MOREIRA, L. B., Princípios para uso Racional de antimicrobianos. Revista AMRIGS,

Porto Alegre, v. 48, p. 118-120, abri-jun. 2004.

MORETTI, C.; ZECHES-HANROT, M.; LE MEN OLIVIER, L. Alkaloides from

Aspidosperma species from Bolivia. Planta Medica, V-62(5), p. 458-461, 1996.

78


MOTT. K. A., GIBSON, A. C. & O’LEARY, J. W. The adaptative significance of

amphistomatic leaves. Plant Cell and Environment, 5:455-460, 1982.

MULLER, A.C.; MACEDO, M.F. Patentes de fitomedicamentos: como garantir o

compartilhamento dos benefícios de P&D e do uso sustentável de recursos genéticos.

Rev.

Fitos. vol.1,n.2, nov/2005.

NETO, V. A. et al, Antibióticos na prática médica, 3. ed, São Paulo: Savier, 1985,

p.209.

NEU, R. A new Reagent Forddifferentiating and Determining Flavones on Paper

Chromatograms. Naturswissenchaften. n. 43, p.82. 1956.

OLIVEIRA, A. J. B. DE; KOIKE, L.; REIS, F. DE A. M.; SHEPHERD, S. L. K. Callus

culture of Aspidosperma ramiflorum Muell. Arg.: growth and alkaloid production. Acta

Scientiarum. Maringá, v. 23, n. 2, p. 609-612, 2001.

OLIVEIRA, A. J. B. Estudo de seis espécies do Gênero Aspidosperma utilizando GC,

GC/MS e HPLC: Análise qualitativa e quantitativa. Teste bioautográfico; Cultura de

tecidos e Células vegetais e Rota de preparação dos compostos diméricos ramiflorina A

e ramiflorina B. Campinas, 1999. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de

Campinas, 1999.

OLIVEIRA, F. Q.; GONÇALVES, L. A.; Conhecimentos sobre plantas medicinais e

fitoterápicos e potencial de toxicidade por usuários de Belo Horizonte, Minas Gerais.

Rev. Eletrônica de Farmácia, v. 3, n. 2, p. 36-41, 2006.

ORRU, S., SCALONI, A., GIANNATTASIO, M., URECH, K., PUCCI, P. and

SCHALLER, G. Amino acid sequence, S-S bridge arrangement and distribution in plant

tissues of thionins from Viscum album. Biol. Chem. 378, 986-996 (1997).

PARKHUST, D. F. The adaptative significance of stomatal occurrence on one or both

surfaces of leaves. Journal of Ecology , 66:367-383,1978.

79


PEREIRA, R. S. et al. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de

infecção urinária. Rev. Saúde Pública, v.38, n.2, p. 68- 73, 2004.

RAMOS, J.; Oncologia Clínica, 2. ed., São Paulo: Sarvier, 1984, p. 320.

RANG H.P., DALA M. M.; RITTER J.M.; MOORE P. K., Farmacologia, 5. ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2003.

RATES, S.M.K. Plants as source of drugs. Toxicon. v.39, p.603-13, 2001.

REIS F. A. M.; MARQUES M. F. S.; FILHO H. L. F.; KATO L. Indole alkaloids from

Aspidosperma ramiflorum. Phytochemistry, 41: 963-967, 1996.

RICE, E. L: Allelopathy. 2 ed. Orlando, Academic Press. 1984.

ROBERT, G. M. T.; AHOND, A.; POUPAT, C.; POTIER, P.; JOLLES, C. &

JOUSSELIN, A. Aspidosperma de Guyane: alcaloides d’ Aspidosperma

markgravianum. Journal of Natural Products 46 (5): 694-707. 1983

ROBERTSON, E. H; CARTWRIGHT, R. A; WOOD, J. J. Sci. Food Agr. 7, 637-640,

1956.

ROWE, J. W. Natural products of woody plants. Berlin: Spring-Verlag, 1989.

SAMUELSSON, G. and JAYAWARDENE, A. L. Isolation and characterization of

viscotoxin 1-PS from Viscum album. Acta Pharm. Suec. 11, 175-184 (1974).

SANTOS, A. V. P. DOS; & GRISI, B. M. Anatomia foliar ecológica de algumas plantas

da caatinga. Ver. Rio de Janeiro, Brasileira de Biologia, Vol. 36(4), p. 773 – 787,

1976.

SARTORATTO, A. et al. Composition and antimicrobial activity of essential oils from

aromatic plants used in Brazil . Braz. J. Microbiol., São Paulo, v. 35, n. 4, p. 56-61,

out./dez. 2004

80


SAUPE, S. G. Parasites are Welcome for Christmas. SAGATAGAN SEASONS; Vol.

5, No. 4, p. 7. Winter 2002.

SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; PETROVICK, P.R. Produtos de origem vegetal e

o desenvolvimento de medicamentos. In. SIMÕES CMO, et al. Farmacognosia: da

planta ao medicamento. 5 ed. rev. ampl. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da

UFRGS/Editora da

UFSC, cap. 15, p. 371-400, 2003.

SCHULZ, V.; HÄNSEL, R.; TYLER, V.E. Medicinal plants, phytomedicines, and

phytotherapy. In: Rational phytotherapy: a physician’s guide to herbal medicine. 4.ed.

New

York, Berlin: Springer, cap.1, p.1-39, 1996.

SMITH, W. K. & MCCLEAN, T. M. Adaptive relationship between leaf water

repellency, stomatal distribution, and gas exchange. American Journal of Botany,

76:465 - 469, 1989.

SILVA, L. F. F. Polifenóis majoritários de Phthirusa pyrifolia Heichl. (Loranthaceae).

Dissertação de Mestrado em Ciências Farmacêuticas – UFPE, 1996.

SILVA, M.C.; CARVALHO, J.C.T. Inflamação. In: CARVALHO JCT. Fitoterápicos

antiinflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. Ribeirão

Preto, SP. Ed. Tecmed, 2004.

SILVA, E.C.B. Avaliação Biológica da Caesalpinia echinata Lam. Fabaceae-

Caesalpinoideae. Usos e riscos. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) –

Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife

2006.


81


de Albuquerque, U. P.; Monteiro, J. M. et al. Medical and magic plants a public market

in northeastern Brazil. Journal Ethnopharmacology, v. 1, p. 76-91, 2007.

SIM, S. K. Medicinal plant alkaloids – An introduction for Pharmacy Students. 2ª ed.

Toronto (CD). 1970.

SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ,

L.A.;

PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto

Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 1999.

STAFLEU, F. A.; COWAN, R.S. Taxonomic Literature. Utrecht: Scheltema e

Holkema, v. 7. 1976/1988.

STAFLEU, F. A.; COWAN, R. S. Taxonomic Literature. Utrecht: Scheltema e

Holkema, v. 7. 1976/1988.

TAVARES, S. Madeiras do Nordeste do Brasil. Ministério da Agricultura – Brasil.

Monografia V. Junho de 1959. imprensa da universidade Rural de Pernambuco, p. 140 –

141.

TAVARES, W. Bactérias gram-positivas problemas: resistência do estafilococo, do

enterococo e do pneumococo aos antimicrobianos. Rev. Soc. Bras. Med.

Trop., Uberaba, v. 33, n. 3, p. 43-46, maio/jun. 2000.

TOLEDO, A.C.O.; et al. Fitoterápicos: uma abordagem farmacotécnica. Revista Lecta,

Bragança Paulista, v. 21, n. 1/2, p. 7-13, jan./dez. 2003.

TUROLLA, M.S.R.; NASCIMENTO, E.S. Informações toxicológicas de alguns

fitoterápicos utilizados no Brasil. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. vol. 42,

n.

2, abr./jun., 2006.

VALADARES, M.C. Avaliação de toxicidade aguda: estratégias após a “era do

teste”.Revista Eletrônica de Farmácia. vol.3, n.2, p.93-98, 2006. DL50

82


VEIGA-JÚNIOR, V.F.; PINTO, A.C.; MACIEL, M.A.M.. Plantas medicinais: cura

segura?

Quim. Nova, 28:3. 2005.

WAGNER, H. & BLADT, S.: Plant drug analisis – a thin layer chromatography

atlas. SPRINGER. 2ª ed. MUNICH, 1996WALLENFELS, K. Detection of reducing

sugars in paper chromatogram and quantitative evaluation. Naturwissenschaften 37,

491-492 (1950).

WALLENFELS, K. Detection of reducing sugars in paper chromatogram and

quantitative evaluation. Naturwissenschaften 37, 491-492 (1950).

Wilcox, D.; Dove, B.; McDavid, D.; Greer, D. Image Tool. University of Texas Health

Science Center. San Antonio, Texas. 2002.

Van Cothem, W. R. J. A classification of stomatal types. Botanical Journal of

Linnean Society. v. 63, p. 235-246. 1970.

VOLK, G. M., LYNCH-HOLM, V. J., KOSTMAN, T. A., GOSS, L. J. &

FRANCESCHI, V. R. The role of druse and raphide calcium oxalate crystals in tissue

calcium regulation in Pistia stratiotes leaves. Plant Biology, 4:34-45, 2002.

83

Documents

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - repositorio.ufpe.br · fêmeas apresentou índice de inibição de 73,90% para a dose de 7mg/kg , 61,54% para a dose de 14mg/kg, 28,57% para a dose de