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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
ESTUDOS IN SILICO DA PROTEÍNA AlkB EPROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM
SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR
MATHEUS SILVA PEREIRA
NATAL-RN 2007
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDOS IN SILICO DA PROTEÍNA AlkB E PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM
SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR
MATHEUS SILVA PEREIRA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha
NATAL-RN 2007
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRANA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDOS IN SILICO DA PROTEINA AlkB E PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM
SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR
MATHEUS SILVA PEREIRA
Dissertação apresentada pelo aluno Matheus Silva Pereira ao Curso de Mestrado em Genética do programa de Pós-graduação e Genética e Biologia Molecular do Departamento de Biologia Molecular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foi julgada pelos membros da banca examinadora, na sua redação final, para a conclusão do curso e à obtenção do título de Mestre em Genética.
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha DBG/UFRN
Prof. Dra. Valéria Maia de Oliveira CPQAB/UNICAMP
Profa. Dra. Magnólia F. Florêncio de Araújo DMP/UFRN
NATAL-RN 2007
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por tudo que me tem dado e sou muito grato por
isso. A Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela oportunidade da
realização deste trabalho. Ao Departamento de Biologia Celular e Genética
desta Universidade. Ao Programa de Pós Graduação de Genética e Biologia
Molecular.
Aos laboratórios LBMG, LDIC/DMP por terem cooperado e assim tornar
possível a realização dos experimentos.
Ao programa Capes, por ter cedido a bolsa e ao CT-PETRO/CNPq pelo
financiamento do projeto.
Um agradecimento especial ao grupo CROB, principalmente a Igor,
Carlos, Magda, Leonam, Cataline, Julliane, Carvalho, Moacyr, Bruno e Karol. A
Rodrigo pela grande paciência e amizade, ajudou bastante. E a galera da Pós-
graduação 2005.
A Carlos por ter acreditado e depositado confiança em mim, obrigado
pela paciência e pelo incentivo na minha formação acadêmica. E também como
um amigo que considero.
Aos meus amáveis pais, Antônio (Toinho, “bora chefe”) e Maria de
Lourdes (Malu), que são exemplos da minha vida. obrigado por me terem como
filho, tenho muito orgulho de vocês, pois amo vocês.
Aos meus queridos irmãos Lucas (monstro) e Ariama.
A minha linda e amada esposa Amanda que também é minha amiga,
pelos conselhos, carinhos, beijos e abraços. Te amo!
Ao meu cunhado André e aos meus maravilhosos sogrinhos Amâncio e
Núbia e amável família (Edneide "Neguinha', Zélia, Edna “loooove” e filhos),
obrigado pela compreensão, pois são muito importantes para mim.
Também obrigado muito especial aos meus amigos, por estarem
presentes na minha vida e que sabem da importância que tiveram sobre minha
pessoa nos bons e maus momentos.
A Tobby (cachorro) mesmo não sabendo ler me acompanhava nas
eternas leituras dos artigos nas madrugadas, praticamente saiu mestre
também.
v
LISTA DE FIGURAS
vi
Capítulo 2
vii
LISTA DE TABELAS
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AH – alcano hidroxilase
ARDRA - Análise de restrição de rDNA amplificado
Bdb – Banco de dados
Blast - Ferramenta de procura e alinhamento local de seqüências.
Boe - Barril óleo equivalente
BPP-RN – Bacia Petrolífera Potiguar-RN
ClustalW – Programa de alinhamento de seqüências hospedado em site
ClustalX – Programa de alinhamento para windows
CNTP - Condições normais de temperatura e pressão
CROB - Grupo de pesquisa em Biotecnologia do Petróleo- Cluster for
Research in Oil Biotechnonology
FAME - Análise de ésteres metílicos de ácidos graxos
HMMTP – Programa de hidrofobicidade
M - marcador digerido com PstI.
mDNA - DNA metagenêmico
Nro. – Número
P450 – Citocromo P450
PAGE – Gel de poliacrilamida não desnaturante
PCR-DGGE - Reação em cadeia da polimerase em eletroforese em gel com
gradiente de desnaturação.
PLFA - Análise de ácidos graxos e fosfolipídios
pOCT - Plasmídeo OCT
PREDATOR – Programa de Topologia de análise de estruturas secundárias
ix
rDNA – DNA ribossomal
RISA - Análise de espaçadores intergênicos ribossomais
SARST - Análise serial de etiquetas de seqüências ribossomais
SSCP - Polimorfismo de conformação de fita simples
TOPPRED2 – Programa de hidrofobicidade
T-RFLP - Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais
x
RESUMO
Alguns microrganismos de ecossistemas virgens são capazes de utilizar
petróleo como fonte de carbono e energia. O conhecimento dessa
biodiversidade microbiana pode revelar vias metabólicas microbianas para
utilizar alcanos que venham a ter importância biotecnológica. Os objetivos do
presente trabalho são: i) realizar estudos in silico da proteína AlkB visando
obter subsídios para a compreensão do mecanismo de seletividade na
utilização de alcanos em bactérias Gram positivas e Gram negativas; ii)
prospectar e avaliar a resposta de comunidades microbianas alcanotróficas de
solos e mangue da BPP–RN e solo da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois
Irmãos-PE utilizando o gene alkB como biomarcador molecular, e as técnicas
de PCR e PCR-DGGE.
xi
ABSTRACT
Some microorganisms from virgin ecosystems are able to use petroleum it as
source of carbon and energy. The knowledge of microbial biodiversity can help
to reveal new metabolic systems for utilization alkanes with biotechnological
importance. The aim of this study is: i) Accomplish an in silico study of the AlkB
protein aimed to understand the probable mechanism involved on selectivity of
alkanes in Gram positive and Gram negative bactéria. ii) prospect and analyze
the response of the microbial alkanotrophics communities in soil and mangrove
sediments of BPP–RN and soil of Atlantic forest in the Horto Dois Irmãos
Reserve area/PE using the molecular biomarker, gene alkB; with the PCR and
PCR-DGGE approach.
xii
xiii
1
INTRODUÇÃO GERAL
Atualmente os projetos genomas e diversas pesquisas geram dados
biológicos que estão aumentando exponencialmente a cada ano.
Proporcionalmente, as ferramentas da bioinformática tendem a solucionar
problemas impossíveis de serem abordados nas décadas passadas. Com a
disponibilidade dos Bancos de dados e as ferramentas computacionais é
possível realizar estudos in silico que permitem realizar inferências sobre
processos biológicos com relevância e confiabilidade independente de estudos
laboratoriais. Com esta base, serão realizados estudos in silico visando
identificar possíveis correlações entre propriedades estruturais da proteína
AlkB e a capacidade de utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas.
Nosso conhecimento a respeito da diversidade microbiana, bactérias e
fungos, são limitados em parte, principalmente devido à nossa inabilidade em
reproduzir todas as variáveis ambientais dos microrganismos nos diferentes
tipos de ecossistemas. Todos os organismos da biosfera dependem das
atividades microbianas pela sua capacidade no processo de ciclagem de
nutrientes e por, de certa forma, influenciar os ambientes abaixo e acima do
solo. No entanto, diversas atividades antropogênicas como a indústria do
petróleo, podem, potencialmente afetar a biodiversidade microbiana local,
sendo desconhecidas como estas alterações nas comunidades microbianas
podem influenciar os ecossistemas mais profundos e os mais superficiais.
Devido à escassez de informações a respeito dos microrganismos nativos nos
solos de ambientes que não tiveram nenhum tipo de exposição ao petróleo ou
derivados, houve a necessidade da realização de estudos microbiológicos e
moleculares destes microrganismos em diferentes ecossistemas localizados
dentro da Bacia Petrolífera Potiguar - RN, como por exemplo, através de
ensaios de microcosmos com solos de caatinga e de mangue, utilizando a
técnica independente de cultivo PCR-DGGE. Este trabalho é o primeiro estudo
de biodiversidade de bactérias alcanotróficas nativas sob impacto de
contaminação com petróleo em solos continentais e costeiros da Bacia
2
Petrolífera Potiguar (BPP-RN) e Mata Atlântica-PE utilizando o biomarcador
molecular alkB.
CAPÍTULO 1
Utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas: Estudos insilico da proteína AlkB
1. INTRODUÇÃO
Os alcanos são compostos químicos que consistem somente dos
elementos carbono e hidrogênio (como por exemplo, os hidrocarbonetos) onde
cada um desses átomos está ligado exclusivamente por ligações simples (por
isso são chamados de compostos saturados). Os alcanos podem ser lineares
(fórmula geral CnH2n+2), cíclicos (fórmula geral CnH2n, n>2) ou ramificados
(fórmula geral CnH2n+2, n>3) (Morrison e Boyde, 1995).
Alcanos lineares (também denominados de n-alcanos assim como
parafinas) são hidrocarbonetos alifáticos saturados, de fórmula geral CnH2n+2.
Estes se apresentam em cadeias lineares ou ramificadas. Os alcanos lineares
são designados, na nomenclatura oficial, através de prefixos, geralmente
gregos, seguidos do sufixo "ano". Eles são menos densos que a água e
praticamente insolúveis na mesma, à medida que o tamanho da cadeia
principal aumenta e seu peso molecular, os seus pontos de fusão e ebulição
aumentam (Masterton et al., 1990). Em CNTP os alcanos de CH4 até C4H10,
são gasosos; do C5H12 até C17H36, são líquidos; e depois de C18H38, se
apresentam no estado sólido. Por conterem ligações simples, os alcanos são
relativamente estáveis, difíceis de quebrar e são apolares (Morrison e Boyde,
1995).
Os alcanos constituem entre 20 e 50% do petróleo, sendo estas
variações dependentes da sua origem. O octano e hexadecano são os alcanos
mais conhecidos. E tais compostos são muitas vezes utilizados como fontes de
carbono pelos microrganismos, uma vez que estes desenvolveram rotas
degradativas na utilização dos compostos alcanos. Os alcanos são
quimicamente inertes, devendo ser ativados antes de serem metabolizados e
na presença de oxigênio isto leva à oxidação dos grupamentos metil terminais,
gerando álcool primário, que logo após são oxidados por desidrogenases até
ácidos graxos que são metabolizados através de -oxidação (Van Hamme et
4
al., 2003).
As monooxigenases que contêm dois átomos de Fe++ e Cu são encontradas
em bactérias metanotróficas como Methylococcus capsulatus (Murrel, 1994).
As Bactérias das classes , ß, e -proteobactéria, como por exemplo,
Acinetobacter, Alcanivorax, Burkholderia, Pseudomonas, e bactérias Gram-
positivas com alto conteúdo de G+C, como por exemplo: Nocardia,
Streptomyces, Bacillus, Rhodococcus possuem uma proteína de membrana
que contém dois átomos de Fe++ (Smits et al., 1999; Van Beilen et al., 2001,
Van Beilen et al., 2003). As leveduras e os fungos possuem citocromo P450
(CYP) de membrana (Ayala e Torres, 2004; Craft et al., 2003; van Beilen e
Funhoff, 2005), que estão envolvidos em degradação de alcanos. A alcano
hidroxilase de P. putida GPo1 e de outras eubactérias têm grande interesse
biocatalítico (Witholt et al., 1990; Van Beilen e Funhoff, 2007) e para aplicações
ambientais (Whyte et al., 2002), e é considerado o protótipo das proteínas non-
heme Ferro oxigenases que incluem as desaturares (proteínas que removem
dois átomos de hidrogênio de um composto orgânico criando uma dupla
ligação entre dois átomos de carbono) e xileno monooxigenases (Shanklin e
Cahoon, 1998).
A enzima AH (alcano hidroxilase) de P. putida GPo1 catalisa a
hidroxilação de compostos alifáticos lineares e ramificados, alicíclicos e aquil-
aromáticos (McKenna e Coon. 1970; Van Beilen et al., 1994), oxidação terminal
de álcoois a aldeídos correspondentes, demetilação de metil-ésteres
ramificados, sulfoxidação de tio-ésteres e epoxidação terminal de olefinas (May
e Abbott, 1972; Katopodis et al., 1984; May e Katopodis, 1986; Katopodis et al.,
1988). Após a primeira descrição de que os genes envolvidos na degradação
de alcanos estavam localizados num plasmídeo em Pseudomonas e a sua
completa descrição dos operons por Eggink et al (1987), o modelo proposto por
Van Beilen et al. (2001) (figura 1), baseado nos estudos de P. putida Gpo1,
também conhecida como Pseudomonas oleovorans, é o melhor modelo
alcanotrófico já proposto.
5
Figura 1. Modelo do sistema alcano hidroxilase descrito por Van Beilen et al. (2001) em Pseudomonas putida Gpo1. São apresentadas as proteínas envolvidas na conversão dos n-alcanos a ácidos graxos.
A P. putida possui um plasmídeo denominado OCT que abriga dois
operons. O primeiro contém os genes alkBFGHJKL que codificam para uma
alcano hidroxilase, duas rubredoxinas, um aldeído desidrogenase, um álcool
desidrogenase, uma Acil-CoA sintetase e uma proteína de membrana externa
de função ainda desconhecida, respectivamente. O segundo operon possui os
genes alkST, codificando uma proteína regulatória da expressão do operon
alkBFGHJKL e uma rubredoxina redutase (Grund et al., 1975). Entre os dois
operons ainda encontra-se o gene alkN o qual codifica para um transdutor
aceptor de grupamentos metil, que pode estar envolvido na quimiotaxia aos n-
alcanos (Smits et al. 1999; Staijen et al., 1998; Van Beilen et al. 1994; 2001).
Recentes pesquisas deram importantes contribuições ao descrever
aminoácidos críticos na proteína AH (Van Beilen et al., 2005) e no citocromo
P450 oxigenase (Funhoff et al., 2006) envolvidos na catálise de alcanos.
Os Citocromos são proteínas, geralmente ligadas a uma membrana, que
contêm grupos heme e que efetuam o transporte de elétrons. São encontradas
sob a forma de proteínas monoméricas (por exemplo, citocromos c) ou como
subunidades de complexos enzimáticos maiores catalisadores de reações
redox. Podem ser encontrados na membrana interior das mitocôndrias e no
retículo endoplasmático de eucariontes, nos cloroplastos de plantas, em
microrganismos fotossintéticos e em bactérias.
6
O citocromo P450 (cuja abreviação é CYP, P450 e menos frequente
CYP450 faz parte da superfamília das hemoproteínas que são encontradas nas
bactérias, Archaea e eucariotos. A reação mais comum catalisada pela
CYP450 é a reação de monooxigenase, que é a inserção de um átomo de
oxigênio em um substrato orgânico (RH) enquanto o outro átomo de oxigênio é
reduzido a água.
RH + O2 + 2H+ + 2e– ROH + H2O
O desconhecimento do mecanismo de discriminação de substrato pela
proteína AlkB ainda persiste atualmente e ainda pode ser estendido para outros
microrganismos que possuem uma AH com diferentes graus de identidade,
porém utilizam substratos específicos ou até mesmo uma grande variedade de
alcanos (C8 a C44). Diversos microrganismos degradadores de alcanos são
detentores do gene alkB, mas o que não se sabe é como uma mesma proteína
(AlkB) que é participante nas etapas iniciais do sistema alcano hidroxilase,
pode se comportar de diversas maneiras em diferentes microrganismos frente
a diferentes substratos.
Utilizando as seqüências de proteínas alcano hidroxilase existentes em
microrganismos degradadores nos bancos de dados e através de uma
abordagem in silico, pretendemos explorar comparativamente utilizando-se das
proteínas AlkB de P. putida GPo1 e a P450 oxigenase da Mycobacterium sp
HXN 1500, as possíveis correlações entre propriedades estruturais da proteína
AlkB e a capacidade de utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas.
7
2. OBJETIVOS
Avaliar através de estudos in silico as possíveis correlações entre a
estrutura primária, estrutura secundária, domínios funcionais e topologia
das proteínas AlkB com a capacidade de discriminação de substratos
alcanos em bactérias Gram positivas e Gram negativas.
8
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Construção da base de dados
As seqüências de genes alkB e proteínas AlkB foram obtidas utilizando-
se o pacote BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI-USA) que
busca similaridades entre uma seqüência alvo (query) e as seqüências dos
bancos de dados e calcula a sua significância estatística. A seqüência do gene
alkB e proteína AlkB da bactéria Pseudomonas putida foram usadas como
seqüências query nas buscas de informações sobre microrganismos
degradadores de n-alcanos, devido ao grande número de informações
disponíveis sobre esta bactéria. Dos grandes bancos de dados (como por
exemplo, o Genbank, UM-BBD, SWISS-PROT) foi obtida uma grande
quantidade de seqüências de genes alkB e de proteínas AlkB com grande
similaridade, porém algumas seqüências foram descartadas, principalmente
aquelas seqüências que se apresentaram incompletas e cujos valores de E-
values maiores do que 1e-20. E com isso foi formada a nossa base de dados,
denominada por Bdbalk.
3.2. Edição das seqüências
Devido a grande quantidade de seqüências e sua dificuldade de
identificação quando analisadas nos programas de bioinformática, como por
exemplo o ClustalW, Predator, Toppred2 e outros. Essas seqüências passaram
por um processo de edição realizada de forma manual. Nesta edição foram
retiradas algumas letras presentes nas principais informações que
identificavam as seqüências depositadas no formato fasta, mas que não
comprometiam a identificação das mesmas. Isso propiciou o manuseio das
seqüências de forma prática e rápida na utilização destas nas diversas
ferramentas de bioinformática.
9
3.3. Análises de domínios conservados e assinaturas protéicas
Foram utilizados diversos bancos de dados especializados em proteínas,
entre eles:
PROSITE – Contém dados de domínios funcionais numa proteína utilizando consensos armazenados no banco de dados.
CDART - Conserved Domain Architecture Retrieval Tool - Detecção de domínios conservados.
CDD - Conserved Domain Database - Detecção de domínios conservados
INTERPRO – é um banco de dados de famílias de proteínas, domínios e sítios funcionais.
PIR - Protein Information Resource - Banco de dados de seqüências de proteínas anotadas funcionalmente.
SWISS-PROT - Banco de dados (Bd) de seqüências de proteínas possui integração com outros Bds.
UM-BBD – University Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database - banco de dados de diversos organismos envolvidos na biodegradação e biocatálise.
3.4. Alinhamentos múltiplos
Para realização dos alinhamentos foram utilizados os programas:
Clustal-W (Higgins e Sharp, 1988) ou Clustal-X, versão para Windows XP
(Thompson, 1997) e depois para melhor visualização foi utilizado o BIOEDIT
(Hall, 1999).
3.5. Análise topológica de proteínas
Foram utilizados os softwares Toppred2 (Claros e Von Heijne,1994) e
HMMTOP (Tusnady e Simon, 2001). Inicialmente foram empregados os dois
softwares para comparação dos resultados gerados, e em virtude da
equivalência dos dados, manuseio fácil e acessibilidade, o programa utilizado
definitivamente foi o Toppred2.
10
3.6. Análise da relação da estrutura primária, secundária e domínios funcionais de proteínas AlkB
Devido ao grande número de seqüências disponibilizadas nos bancos de
dados para as análises in silico da proteína AlkB, foram utilizados os seguintes
critérios: i) A proteína deveria ser completa, ii) não ser uma proteína hipotética
iii) a sua literatura deveria estar disponível.
As seqüências foram inicialmente analisadas pelo programa ClustalW e
os dados visualizados em programa BioEdit (Hall, 1999). Os alinhamentos
múltiplos também foram avaliados com o programa de topologia PREDATOR
(Frishman e Argos, 1996), o qual prediz estruturas secundárias com base nas
seqüências depositadas no programa. Para o alinhamento com o programa
PREDATOR foi incluída uma seqüência de proteína modelo que é, a
CYP153A6 da bactéria Mycobacterium sp HXN 1500. Esta seqüência serviu
como modelo comparativo, pois fornecia informações sobre os aminoácidos
críticos para a funcionalidade da proteína AlkB.
Tabela 1. Proteína CYP153A6 de Mycobacterium sp HXN 1500 modelo conhecido para uso comparativo com as outras proteínas AlkB de Pseudomonas.
11
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dados protegidos para publicação
25
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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30
CAPÍTULO 2
Prospecção de bactérias alcanotróficas nativas em solos e mangue da BPP-RN e Mata Atlântica-PE
1. INTRODUÇÃO
1.1. Ecologia microbiana e sua importância
Os estudos de ecologia microbiana têm sua importância pelo fato de os
microrganismos representarem as formas de vida mais abundantes no planeta
e possuírem a maior proporção da diversidade global estimada. A microbiota
dos solos é responsável por transformações fundamentais nos ciclos
biogeoquímicos, reciclando a matéria orgânica, degradando resíduos
industriais e xenobióticos, fixando N2 atmosférico e produzindo gases
relacionados ao efeito estufa, entre outros processos conhecidos. A microbiota
do solo também está associada à formação e manutenção da estabilidade de
agregados, pela produção de proteínas e polissacarídeos extracelulares que
contribuem à diversidade vegetal e de outros organismos que vivem acima do
solo (Hughes et al., 2001; Dabert et al., 2002, Schmidt, 2006).
Os microrganismos têm um papel fundamental na manutenção da
qualidade dos solos. Organizando-se de forma às vezes pouco conhecidas em
diferentes condições edáficas e/ou em resposta a diferentes distúrbios, por
exemplo, contaminação com petróleo, as comunidades microbianas podem ser
utilizadas como indicadoras da qualidade do solo. No entanto, como a maioria
dos microrganismos dos solos não pode ser cultivada nos meios de cultura
convencionais, o entendimento de um microbioma só será possível pela
utilização de técnicas avançadas de biologia molecular, associadas às técnicas
de bio e ecoinformática (Ovreas, 2000; Tyson e Banfield, 2005; Martiny et al.,
2006).
31
1.2. Importância econômica e impactos causados pela indústria do petróleo
O petróleo é um recurso não renovável resultante de processos físico-
químicos e biológicos sofridos pela matéria orgânica. Esta é depositada
juntamente com fragmentos de rochas durante a formação de rochas
sedimentares há milhões de anos. Devido a efeitos mecânicos, ocorre a
migração do petróleo no subsolo, acumulando-se em rochas porosas e
permeáveis, denominadas rochas reservatório. O petróleo é utilizado
principalmente para gerar combustível, contudo possui uma série de
subprodutos que são gerados após o refino e amplamente utilizados pela
sociedade, como por exemplo, lubrificantes, plásticos, fertilizantes,
medicamentos, tintas e tecidos (Magot et al., 2000; Van Hamme et al., 2003;
Head et al., 2003).
O petróleo é explorado comercialmente há mais de 140 anos. Desde o
início da produção comercial de óleo, engenheiros do petróleo têm enfrentado
problemas causados por microrganismos (Magot et al., 2000; Van Hamme et
al., 2003). O Brasil possui 30 bacias sedimentares, ocupando uma área de
4.650.000 km² na parte terrestre e 2.570.000 km² no mar até o limite do mar
territorial, ou seja, 200 milhas da costa. Dentre estas 30 bacias, oito são
produtoras de petróleo e gás natural. O Brasil produziu até hoje mais de cinco
bilhões de boe (barril óleo equivalente) e possui uma reserva total de 15,5
bilhões de boe. O potencial petrolífero, ou seja, o volume remanescente a
descobrir está entre 14 e 177 bilhões de boe. Geralmente, o fator de
recuperação de hidrocarbonetos pode variar entre 10% e 60%, sendo
freqüentemente extraído entre 20% e 30% (www.petrobras.com.br).
As atividades na Bacia Petrolífera Potiguar, on-shore, só foram
efetivamente implementadas quando um leigo descobriu óleo por acaso em um
poço artesiano perfurado para abastecer uma piscina em 1978. Hoje esta bacia
é a maior produtora em terra do país, produzindo 100 mil barris diários (figura
1). Está previsto para o período entre 2004 e 2008 o investimento de 840
milhões de reais na Bacia do Rio Grande do Norte e do Ceará. Desses 840
milhões, 22% serão investidos no mar, 8% na exploração, 13% em Mossoró-
RN, 21% em gás e energia, 11% em suporte, 10% em Guamaré-RN e 15% no
32
município de Alto Rodrigues-RN. Os investimentos serão disponibilizados para
as áreas de exploração, segurança e meio ambiente, comunicações,
informática e suporte, processamento e novas instalações, produção, malha de
gás e Termoaçu. Hoje, a Petrobrás possui no RN e CE 556 km de oleodutos,
542 km de gasodutos; 5.900 km de linhas de surgências, 9 estações de
tratamento de óleo, 2 unidades de processamento de gás, 6.099 poços
perfurados, 4.580 poços produtores, 50 campos de produção no RN e 6 no CE,
17 estações de injeção de vapor, 6 estações de compressão de gás, 67
estações coletoras de óleo e gás. Também possui unidade de produção de
diesel e nafta, 8 equipamentos de perfuração, 17 sondas de intervenção em
poços e 34 plataformas marítimas de exploração, demonstrando que além de
ser uma excepcional produtora on-shore a BPP do RN e CE possui uma
considerável estrutura para a captação de petróleo off-shore (figura 1)
(www.anp.gov.br).
Figura 1. Dados econômicos e setorias óleo e gás da Bacia petrolífera potiguar (ANP)
Desde o primeiro grande acidente em 1969 no canal da Inglaterra e o
desastre de Exxon Valdez no Alaska, ocorreram mais de 40 grandes
derramamentos marinhos de petróleo. Os vazamentos durante o transporte são
33
responsáveis por 45,5% do petróleo lançado ao mar, enquanto que os
vazamentos de atividades em terra vêm em segundo lugar, representando 29%
(Scherrer e Mille, 1989). A contaminação principalmente de manguezais devido
a derramamentos de petróleo é freqüente (Getter et al., 1981), ficando a flora e
a fauna desse ecossistema vulneráveis ao poluente, devido principalmente à
facilidade de sua acumulação no solo (Scherrer e Mille, 1989). As condições de
inundação e as características da vegetação, com suas raízes abundantes
formando uma malha superficial, dificultam o acesso às regiões contaminadas,
impedindo a descontaminação imediata (Getter et al., 1984).
Após a chegada ao ambiente, o petróleo sofre alterações de suas
características originais, devido a fatores físicos (evaporação, dissolução,
dispersão, oxidação fotoquímica, adsorção às partículas) e principalmente
biológicos (biodegradação) (Getter et al., 1984). As transformações físicas e
biológicas são reguladas pelas características específicas do derramamento e
do ambiente atingido. Assim, o grau de impacto ambiental e a persistência do
petróleo no ambiente dependem de fatores como: habitat atingido, tipo e
quantidade do óleo, espécies de organismos atingidos, época do ano,
condições hidrográficas e meteorológicas, clima, freqüência e duração da
exposição ao petróleo e as práticas utilizadas na tentativa da descontaminação
(Getter et al., 1981).
O petróleo e seus derivados podem persistir por mais de vinte anos em
manguezais, antes que a vegetação se recupere totalmente. Esta alta
persistência é explicada pela lenta biodegradação dos hidrocarbonetos devido
à limitação de oxigenação do meio e a lenta ciclagem dos nutrientes,
essenciais para a atividade microbiana aeróbia (Scherrer e Mille, 1989). A
persistência dos hidrocarbonetos depende também da exposição do sítio
contaminado aos fluxos de águas marinhas, influenciados pelas marés. A maior
freqüência de exposição a esses fluxos pode acelerar a remoção dos
hidrocarbonetos, contribuindo para a recuperação da vegetação (Getter et al.,
1984).
Derramamentos de poluentes podem ocorrer com freqüência e são a
principal e mais danosa causa de contaminação de solos e de águas,
entretanto, processos como a bioremediação, onde são utilizados
microrganismos capazes de biodegradar os mais diversos poluentes, podem
34
ser utilizados para minimizar os impactos ambientais causados por tais
desastres (Head et al., 2003). Para um experimento de bioremediação
eficiente, após um derramamento de petróleo, seriam elucidativas informações
prévias sobre o comportamento das populações microbianas com potencial
intrínseco para degradação de hidrocarbonetos no solo impactado.
1.3. Microbiologia do petróleo
Até há poucas décadas, acreditava-se que as profundezas dos
reservatórios de petróleo eram estéreis, e as bactérias isoladas de tais
ambientes poderiam ser apenas de origem exógena. Nossa percepção disto
mudou recentemente com descobertas inesperadas de populações diversas de
microrganismos, realizando uma série de atividades metabólicas diferentes,
expandindo os limites onde seria possível esperar atividade nesses ambientes
extremos de subsuperfície (Pedersen, 2000, Röling et al., 2003; Van Hamme et
al., 2003; Head et al., 2003).
A presença de microrganismos nas reservas petrolíferas pode levar à
biodegradação do petróleo em reservatórios, resultando em um decréscimo do
seu conteúdo de hidrocarbonetos nobres e aumento no conteúdo de enxofre,
na acidez e na viscosidade. Essas modificações têm conseqüências
econômicas negativas para a produção de petróleo e as operações de refino.
Este processo ocorre na maioria das reservas de petróleo do mundo, entre elas
as brasileiras. A presença de bactérias em reservatórios de petróleo tem sido
relatada na literatura e os trabalhos baseiam-se na sua identificação. Vários
gêneros, abrangendo eubactérias e Archaea bactérias, têm sido identificados
em diferentes campos de exploração de petróleo (Magot et al., 2000; Röling et
al., 2003).
Os doadores e aceptores de elétrons disponíveis nos reservatórios de
petróleo determinam o tipo de atividade metabólica dentro desses ambientes.
Os principais doadores de elétrons incluem o CO2, H2 de origem geoquímica ou
bacteriana e inúmeras moléculas orgânicas. Uma vez que os campos de óleo
são ambientes subterrâneos profundos e geralmente são isolados das águas
de superfície, seu potencial redox é muito baixo e, dessa forma, aceptores de
35
elétrons estão freqüentemente ausentes, em particular o oxigênio, nitrato e íons
férricos (Barth e Riis, 1992). Águas profundas geralmente contêm sulfato e
carbonatos em várias concentrações, tais fatores sugerem que os principais
processos metabólicos ocorrentes em tais ambientes são: a redução de sulfato,
metanogênese, acetogênese e fermentação (Barth, 1991; Magot et al., 2000).
As características fisiológicas de microrganismos nativos das reservas de
petróleo podem esclarecer sob quais condições a degradação do petróleo pode
ocorrer e quais os mecanismos envolvidos. Apesar de um grande número de
microrganismos já terem sido isolados das reservas petrolíferas e
caracterizados, o cultivo dessa população microbiológica nativa ainda é um
desafio (Van Hamme et al., 2003). O termo nativo refere-se a microrganismos
que estão presentes nos reservatórios, sem influência de contaminantes
provenientes da perfuração (Grassia et al., 1996).
Muitos dos parâmetros físico-químicos críticos para o estabelecimento
de comunidades microbianas em subsuperfície também são válidos para
comunidades microbianas localizadas em camadas superficiais. Exceto que
não conferem, necessariamente, as condições extremófilas. Portanto elas terão
papel importante sobre a diversidade microbiana nativa e seu papel na
manutenção nos ecossistemas terrestres, de mangue e marinhos, quer sem
impacto quer impactado por petróleo. As potencialidades de sobrevivência
dessas comunidades microbianas sob impacto de diversos poluentes
originários da indústria de petróleo são dependentes de genes que codificam
proteínas envolvidas com a degradação de hidrocarbonetos, alguns deles
utilizados como fonte de carbono. Genes amplamente distribuídos foram
encontrados em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Lazar et al., 1999;
Smits et al., 1999; Van Beilen et al., 2002; Van Hamme et al., 2003).
Monooxigenases e dioxigenases são enzimas-chave na biodegradação
de uma grande variedade de alcanos e os genes codificantes dessas enzimas
têm sido caracterizados. Entre eles podemos citar: alkB, ndoB, todC1, xylE,
cat23, bphA, etc (Van Hamme et al., 2003).
Em Pseudomonas oleovorans, por exemplo, foram identificados genes
que codificam para uma alcano-hidroxilase responsável pela conversão de
alcanos (C5 - C44) em ácidos graxos (Chen et al., 1996; Whyte et al., 1997;
Staijen et al., 1999; Margesin et al., 2003; Chaillan et al., 2004; Luz et al.,
36
2004). Outros genes de biodegradação de hidrocarbonetos já têm sido
descritos (Vomberg e Klinner, 2000; Belhaj et al., 2002; Kotik et al., 2005).
Recentemente verificou-se que em P. aeruginosa um gene codificador da
alcano hidroxilase é necessário para seu crescimento em óleo cru como única
fonte de energia e de carbono (Belhaj et al., 2002; Siciliano et al., 2003).
1.4. Análises microbiológicas independentes de cultivo
A existência de enorme e desconhecida diversidade de microrganismos
não cultivados em amostras ambientais tem encorajado o desenvolvimento de
novas metodologias para o seu estudo, sem a necessidade de cultivo prévio.
Os métodos mais recentes exploram diferentes moléculas biológicas, incluindo
rDNAs (tabela 1). Juntamente com a bioinformática, as análises estatísticas e
filogenéticas são vistas como as mais promissoras ferramentas nos estudos
visando a caracterização das comunidades microbianas e o papel delas em
diferentes condições ambientais (Ovreas, 2000).
Tabela 1. Técnicas para estudo da microbiota de amostras ambientais
37
O estudo de um grande número de comunidades de microrganismos de
forma independente de cultura através do metagenoma pode brindar
informações únicas ao acessar diretamente a informação genética dos
microrganismos. Duas estratégias podem ser empregadas para melhorar o
rendimento e a pureza do DNA metagenômico (mDNA) recuperado das
amostras, representando de forma mais precisa a diversidade microbiológica: i)
a primeira metodologia consiste na extração direta de ácidos nucléicos de
partículas do solo através de lise celular in situ, seguida de purificação do DNA;
(Ogram et al., 1987; Bruce et al, 1992; Orphan et al., 2000; Kirk et al., 2004). ii)
metodologia baseada na separação bacteriana das partículas do solo, seguida
de lise celular e purificação do mDNA (Yeates et al., 1998; Robe et al., 2003).
O emprego de kits comerciais torna a extração do mDNA onerosa porém
compensatório em termos de pureza e rendimento de mDNA propício para as
reações de PCR (Nakatsu et al., 2000; Fredslund et al., 2001; Martin-Laurent et
al., 2001; Evans et al., 2004a; Evans et al., 2004b; Kaplan e Kitts, 2004 e Mumy
e Findlay, 2004).
Seqüências de DNA genômico (DNAg) e mDNA provenientes de
comunidades bacterianas nativas presentes no solo, sedimento e areia podem
ser amplificadas pelo uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) e
analisadas através de DGGE (Muyzer et al., 1993). A utilização de PCR-DGGE
foi disseminada em estudos da diversidade genética microbiana em amostras
ambientais mediante a utilização de primers para o gene 16S rDNA (Bruce et
al., 1992; Amann et al., 1995; Orphan et al., 2000; Watanabe et al., 2001; Robe
et al., 2003; Zhu et al., 2003; Evans et al.,2004a; Evans et al., 2004b; Kirk et al.,
2004; Santos, 2006).
A técnica de DGGE é uma poderosa ferramenta que é comumente
usada na biologia molecular para a caracterização das estruturas e dinâmicas
populacionais dos microrganismos. O fornecimento de dados são bastante
rápidos e eficazes no que diz respeito ao conteúdo global das populações
presentes na área de estudos.
O emprego do DGGE consiste na análise da separação de fragmentos
de bandas de DNA de dupla fita com tamanhos idênticos. Na prática, isso se
refere à separação dos fragmentos de DNAs produzidos por reação de PCR. A
façanha desta técnica (dentre outros fatores) baseia-se na estabilidade do
38
conteúdo GC (seu pareamento, possui três ligações de hidrogênio) em relação
ao pareamento AT (o qual possui duas ligações de hidrogênio). A mistura de
diferentes seqüências de DNAs são eletroforizados em gel de poliacrilamida
contendo um gradiente que aumenta a desnaturação do DNA.
Em geral os fragmentos de DNAs gerados que possuem um alto
conteúdo GC apresentam uma tendência a serem mais estáveis,
permanecendo dupla fita mesmo nos altos gradientes desnaturantes (Muyzer et
al., 1993). Fragmentos dupla fita migram melhor no gel, enquanto moléculas de
DNAs desnaturadas tornam-se efetivamente maiores e migram mais
lentamente. Dessa maneira, fragmentos de DNAs de diferentes seqüências
podem ser separados.
1.5. Diversidade microbiana relacionada a petróleo e derivados
É importante destacar que a maioria dos estudos da diversidade
microbiana biodegradadora de petróleo e/ou seus derivados e xenobióticos
realiza as análises em ambientes associados a petróleo (Smits et al., 1999;
Orphan et al., 2000; Milcic-Terzic et al., 2001; Tanaka et al., 2002; Margesin et
al, 2003; Pepi et al., 2003; Chaillan et al 2004; Luz et al., 2004; Chang et al,
2005, Nievas et al, 2006; Sette et al, 2006). No entanto, praticamente se
desconhece sobre a diversidade de comunidades microbianas nativas de locais
não impactados, porém com elevado risco de impacto ambiental, como os
realizados no Kuwait (Obuekwe et al, 2003) e na Alemanha (Kloos et al., 2006).
Pesquisas sobre a diversidade microbiana nativa em diferentes
ecossistemas em bacias petrolíferas no Brasil são limitadas (Sebastian, 1999;
Evans et al., 2004ab,). Já em ambientes contaminados, vários trabalhos
reportam experiências de isolamento e caracterização microbiológica: Praia do
Recreio dos Bandeirantes RJ, (Del Arco, 1999); Bacia de Campos (Rosa,
2001); Baia de Guanabara - RJ (Santos de Oliveira, 2001); Petrobras, Lagoa de
Baixo, Guamaré, RN (Costa Duarte, 2004); Região de Icapuí-CE (Marques,
2004); Petrobras, Guamaré-RN (Pinto da Silva, 2004), porém somente
Bellicanta (2004) e Luz et al. (2004) realizaram estudos com abordagens
moleculares no sistema estuarino de Santos e São Vicente, SP; Cubatão-SP,
39
respectivamente.
Na Bacia Petrolífera Potiguar-RN (BPP-RN), a mais importante
produtora de petróleo on shore, os estudos são pioneiros, como o de Santos
(2006), que verificou através de PCR-DGGE que a população microbiana
nativa de solos de Macau,RN (caatinga) e de Diogo Lopes-RN (Mangue)
responde à contaminação por petróleo, revelando uma correlação na dinâmica
de comunidades microbianas em função do tempo e tipo de solo impactado
com petróleo, inclusive em amostras de solo da Mata Atlântica na Reserva
Horto Dois Irmãos-PE. Ainda, Coutinho (2005) estudou in vitro a ocorrência de
microrganismos nativos de Diogo Lopes-RN (Mangue) e da Mata Atlântica na
Reserva Horto Dois Irmãos-PE com potencial de crescimento utilizando
petróleo como única fonte de carbono. Silva (2005) observou a ocorrência de
bactérias redutoras de Ferro (III), e prospectando os mesmos microcosmos
experimentais isolou bactérias que também crescem utilizando petróleo como
única fonte de carbono. Souza Junior (2006) avaliou a produção de
biosurfactantes por bactérias biodegradadoras de petróleo isoladas de solos e
de mangue da Bacia Petrolífera Potiguar-RN (BPP-RN), observando que estas
apresentam uma produção aumentada de moléculas biosurfactantes quando
crescem em petróleo como única fonte de carbono.
Neste trabalho, através da aplicação de métodos moleculares como
PCR-DGGE, espera-se contribuir para uma visão particular da diversidade de
microrganismos alcanotróficos de microbiomas nativos da BPP-RN, baseado
na ocorrência de genes catabólicos responsáveis pela biodegradação de
alcanos e inferir suas potenciais aplicações em bioremediação em situações de
impacto ambiental por petróleo e derivados na Bacia Petrolífera Potiguar-RN
(BPP-RN).
40
2. OBJETIVOS
Prospectar bactérias alcanotróficas de solos e mangue da Bacia
Petrolífera Potiguar – RN e solo da Mata Atlântica na Reserva Horto
Dois Irmãos-PE utilizando o gene alkB como biomarcador molecular
Avaliar a resposta de comunidades microbianas alcanotróficas nativas
de solos e mangue da Bacia Petrolífera Potiguar – RN ao impacto de
contaminação por petróleo através de PCR-DGGE
Comparar respostas ao impacto de contaminação por petróleo de
comunidades microbianas da Bacia Petrolífera Potiguar – RN e solo da
Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE.
41
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Locais de amostragem de solos e sedimentos
Foram utilizados como materiais de coleta: luvas, espátulas e
contêineres com a capacidade para 20Kg que foram previamente esterilizados.
Em uma área demarcada de 1m2 e a uma profundidade de 10cm da superfície
foram coletados 20 Kg de amostras de solos de cada ambiente de estudo. Os
locais de amostragens foram escolhidos de forma aleatória, observando-se
apenas o distanciamento do local de possíveis ações antrópicas. A seguir
segue a localização dos pontos com suas respectivas caracterizações:
Distrito de Macau-RN em Diogo Lopes-RN (05°05’39’’ de Latitude Sul e
36°21’33’’ de Longitude Oeste) na área de Proteção Ambiental
(Mangue), pertencente à Bacia Petrolífera Potiguar, sem nenhum
histórico registrado de contaminação por petróleo (figura 2).
Os mangues são árvores ou arbustos que apresentam a característica
idêntica de crescer em águas rasas e lodosas ou salobras, em especial em
costas e estuários de águas tranqüilas. Produzem massas emaranhadas de
raízes arqueadas, que ficam expostas durante a maré baixa. Os manguezais
são alguns dos ecossistemas mais produtivos da natureza, proporcionando
complexas relações ecológicas entre seus componentes e funcionando, por
vezes, como um exportador de matéria orgânica para ecossistemas costeiros
adjacentes. É um ecossistema de transição do ecossistema marinho e terrestre
característico de regiões tropicais e subtropicais, este tipo de ambiente está
sujeito ao regime de marés (recebendo diariamente ação de águas salgadas ou
mesmo salobra) (Pereira e Soares-Gomes, 2002).
Distrito de Macau-RN na “Estrada do Óleo” (05°18’28’’ de Latitude Sul e
36°40’31’’ de Longitude Oeste) pertencente à Bacia Petrolífera Potiguar
(Caatinga). Sem contaminação por petróleo conhecida, embora existam
cavalos mecânicos para extração do petróleo no local (figura 2).
42
O bioma Caatinga é o principal ecossistema existente na Região
Nordeste, estendendo-se pelo domínio de climas semi-áridos, numa área de
73.683.649 ha, 6,83% do território nacional; ocupa os estados da BA, CE, PI,
PE, RN, PB, SE, AL, MA e MG. O termo Caatinga é originário do tupi-guarani e
significa mata branca. É um bioma único, pois, apesar de estar localizado em
área de clima semi-árido, apresenta grande variedade de paisagens, relativa
riqueza biológica e endemismo. A ocorrência de secas estacionais e periódicas
estabelece regimes intermitentes aos rios e deixa a vegetação sem folhas. A
folhagem das plantas volta a brotar e fica verde nos curtos períodos de chuvas.
(www.ibama.gov.br)
Dois Irmãos-PE (08°03’00’’ de Latitude Sul e 34°59’17’’ de Longitude
Oeste) área de Reserva Florestal em remanescente de Mata Atlântica,
localizada fora da Bacia Petrolífera Potiguar, em local selvagem não
afetado por ação antrópica e sem histórico de contaminação por petróleo
(figura 2).
Em termos gerais, a Mata Atlântica pode ser vista como um mosaico
diversificado de ecossistemas, apresentando estruturas e composições
florísticas diferenciadas, em função de diferenças de solo, relevo e
características climáticas existentes na ampla área de ocorrência desse bioma
no Brasil.
O ecossistema de Mata Atlântica compreende a região costeira do
Brasil. O seu clima é equatorial ao norte e quente temperado sempre úmido ao
sul, possui temperaturas médias elevadas durante o ano todo e não apenas no
verão. A alta pluviosidade nessa região deve-se à barreira que a serra constitui
para os ventos que sopram do mar. Seu solo é pobre e a topografia é bastante
acidentada. No interior da mata, devido à densidade da vegetação, a luz é
reduzida. As condições físicas na floresta atlântica variam muito, dependendo
do local estudado, assim, apesar de a região estar submetida a um clima geral,
há micro climas muito diversos e que variam de cima para baixo nos vários
estratos. Os teores de oxigênio, luz, umidade e temperatura são bem
diferentes, dependendo da camada considerada. Os solos da floresta são, via
43
de regra, pobres em minerais e sua natureza é granítica ou gnáissica. A maior
parte dos minerais está contida nas plantas em vez de estar no solo
(www.ibama.gov.br).
Figura 2. Os pontos de amostragens no Rio Grande do Norte e Pernambuco.
3.2. Ensaio de microcosmo
A construção do ensaio de microcosmo foi realizada por Santos (2006)
na qual utilizou os três solos coletados (indicados no item 3.1 deste trabalho)
em contêineres de 20Kg, o ensaio foi realizado em triplicata. Destes foram
utilizados 15Kg, que foram divididos em dois contêineres menores de 7,5Kg,
um mantido puro (nas condições encontradas no ambiente) e o outro foi
contaminado com 3% de petróleo (não havendo reposição durante o
experimento). Posteriormente, foram construídos 42 microcosmos para cada
tipo de solo em estudo, 21 contendo solo puro e 21 contendo solo
contaminado, gerando um total de 126 microcosmos com 250g de solo cada.
Antes da acomodação dos solos nos recipientes, foi efetuada uma
homogeneização tanto dos solos de microcosmos puros, quanto dos solos de
microcosmos contaminados por petróleo, para assim serem mantidos durante
44
todo o experimento. As amostragens dos solos de microcosmos para análises
foram realizadas a cada 2 meses (Tempos 0, 60, 120, 180, 240, 300 e 360
dias), durante um período total de 12 meses de experimento. A seguir segue o
esquema do ensaio do microcosmo (figura 3):
Figura 3. A esquerda uma Ilustração do ensaio de microcosmo e no lado direito desenho esquemático de sua montagem.
3.3. Cultivo de microrganismos em meio de cultura Luria Bertani (LB)
O meio de cultura Luria Bertani (LB) foi preparado segundo Sambrook e
Russell (2001). Para isolamento das colônias foi utilizado o método de
esgotamento. As culturas foram feitas pela semeadura nos meios de cultura
sólidos, distribuídos em placa de Petri e incubados a 37°C. Por se tratarem de
microrganismos desconhecidos até o momento, o tempo de incubação variou
para cada isolado.
3.4. Linhagens bacterianas utilizadas
As cepas bacterianas controle utilizadas foram cedidas pelo pesquisador
Bernard Witholt do Instituto Federal de Tecnologia da Suíça (ETHZ). São elas
Escherichia coli W3110 (pGEc47) contendo o operon alk, Pseudomonas putida
GPo1 (comumente conhecida como Pseudomonas oleovorans GPo1) (pOCT),
45
e P. putida GPo12 (curada do pOCT) (Van Beilen et al, 2001; Smits et al,
2002), utilizadas para verificar a especificidade dos primers construídos, os
quais foram designados como mat. Também foram utilizadas linhagens que
fazem parte da coleção do CROB (Cluster for Research in Oil Biotechnology),
previamente selecionadas por Coutinho (2005) e Santos (2006) (Tabela 2).
Os isolados microbianos 18R – 35 da tabela 2 são provenientes do
microcosmo do solo de Diogo Lopes previamente isolados por Santos (2006). E
os isolados 1.2 - 1.12 (Horto de Dois Irmãos), 2.6 - 2.11 (Diogo Lopes), são
provenientes de microcosmos líquidos contendo petróleo a 3% realizados por
Coutinho (2005).
Tabela 2. Linhagens utilizadas para estudos do gene alkB.
3.5. Desenho de oligonucleotídeos para PCR
Foi construída uma base de dados de genes alk de degradação de
alcanos, através de mineração em bancos de dados: NCBI (The National
Center for Biotechnology Information - USA), KEGG (Kyoto Encyclopedia of
Genes and Genomes - JAPÃO) e UMBBD (University of Minnesota
Biocatalysis/Biodegradation Database - USA). A escolha das seqüências
nucleotídicas para desenho dos primers degenerados mat foi realizada a partir
de alinhamentos múltiplos gerados pelo programa CLUSTALW (Higgins e
Sharp, 1988). Para a construção dos primers específicos para o gene alkB em
Pseudomonas foi utilizado o programa Fast PCR (by Ruslan Kalendar, versão
3.8.82 para windows) e adicionalmente foi sintetizado um grampo de GC com
40 nucleotídeos 5’ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG
GCA CGG GGG G 3’ como descrito por Nakatsu et al. (2000), ligando a
46
extremidade 5` do primer forward específico, sendo denominado de matg.
Também foram utilizados primers universais baseados no gene 16S rDNA
desenvolvidos por Santos (2006).
3.6. Extração de DNA metagenômico de solos e extração de DNA genômico dos isolados microbianos
O mDNA das amostras de solos puros e contaminados do microcosmo
foram extraídos segundo o método descrito por Ausubel et al., (1995) e/ou
utilizando o kit FastDNA SPIN (BIO101, Carlsbad, CA, USA). As extrações de
DNA genômicos a partir de culturas bacterianas puras foram realizadas de
acordo com o método “extração por fervura”. Foram fervidas as bactérias
crescidas em meios líquidos enriquecidos, retirada uma alíquota de 500 µL das
bactérias crescidas e colocou-se em microtubos de 2 mL, centrifugou-os
durante 5 minutos a 13000 rpm, retirou-se o sobrenadante, ressuspendeu-se
com água deionizada estéril, e furou-se as tampas dos microtubos com agulhas
estéreis. Os microtubos foram colocados em banho-maria, (com a água
previamente aquecida) dentro de um forno microondas em sua potência
máxima por dois ciclos de 5 minutos. Em seguida, os microtubos foram
centrifugados durante 10 minutos e o conteúdo foi recuperado e transferido
para um outro microtubo estéril. A solução de DNA foi estocada no freezer (-
20°C).
3.7. PCR e DGGE
Os produtos gerados nas reações de PCR foram analisados
eletroforeticamente em agarose, como descrito por Sambrook et al. (1989). O
programa de ciclagem (denominado DOWNTM) foi o mesmo para ambos os
pares de primers ISBA (rDNA16S), mat (alkB primer degenerado) e matg (alkB
primer específico), como descrito pela metodologia de Santos (2006).
Para amostras de DNA metagenômicos e DNA genômico de consórcios
bacterianos foi utilizado o seguinte protocolo de PCR:
1 µL de DNA (~40 ng/ µL) , 1 µL de 2,5 mM MgCl2, 2 µL de
47
tampão de PCR10X (Biosystem), 2 µL de primer foward (20
pmol), 2 µL primer reverse (20 pmol), 1 µL DNTPs e 2,5 U de Taq
polimerase (Biosystem).
Para amostras de DNA genômico dos isolados bacterianos crescidos
dos microcosmos que foram extraídas pelo método de “extração por fervura” foi
utilizado o seguinte protocolo de PCR:
5µL ácidos nucléicos dos consórcios, 1 µL de 2,5 mM MgCl2, 2
µL de tampão de PCR 10X (Biosystem), 2 µL de primer foward
(20 pmol), 2 µL primer reverse (20 pmol), 1 µL DNTPs e 2,5 U de
Taq (Biosystem) e/ou GoTaq® Flexi DNA Polymerase
(PROMEGA).
Após a reação de PCR com mDNA, as amostras foram analisadas em
gel de agarose a 1,8%.
Depois da avaliação com gel de agarose, os amplicons foram analisados
pela técnica de PCR-DGGE, utilizando o aparelho DGGE-1001 (C.B.S.,
Scientific Company). As análises foram feitas em poliacrilamida a 8% durante
16 horas a 80 V e 22 mA, com gradiente de desnaturação uréia-formamida de
40% a 60%. Em cada canaleta do DGGE foram aplicados 10 l das reações de
PCR. Os géis foram corados com nitrato de prata a 0,2% e fotodocumentados.
48
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dados protegidos para publicação
59
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70
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A biodegradação aeróbica de petróleo, particularmente alcanos é
amplamente divulgada, já o conhecimento sobre os processos biológicos
envolvidos em microrganismos Gram positivos e Gram negativos é restrito a
poucos gêneros bacterianos, sendo Pseudomonas aeruginosa o organismo
melhor estudado. A grande maioria dos microrganismos possuem a proteína
AlkB ou proteínas homológas, no entanto, os mecanismos e/ou processos
envolvidos na preferência ou capacidade de utilizar alcanos específicos ainda
são pouco conhecidos.
As constantes atualizações e disponibilidade de novas ferramentas na
área de bioinformática, bem como as inclusões de novas informações e
seqüências nucleotídicas nos bancos de dados, e novas descrições
microrganismos alcanotróficos, contribuirão para uma análise in silico mais
abrangente e representativa das variações encontradas nas proteínas AlkB dos
distintos gêneros bacterianos utilizadas neste estudo e possíveis correlações
com a habilidade de utilização de substratos alcanos. Novas avaliações,
incluindo modelagem 3D com outras oxigenases, permitirão obter subsídios
para uma melhor compreensão sobre o possível papel da proteína AlkB na
discriminação de alcanos.
Acessar a biodiversidade microbiana de ambientes naturais e conhecer
a resposta dessas comunidades microbianas perante o impacto por
contaminação com petróleo tem grande relevância para a indústria de petróleo.
Nossos resultados sugerem que o emprego de novas estratégias de
enriquecimento devem ser incorporadas e contribuirão para aperfeiçoar a
detecção molecular de bactérias alcanotróficas. A caracterização de
hidrocarbonetos totais do petróleo utilizado contribuirá para estimar quais
comunidades microbianas nativas possam ser bioestimuladas/selecionadas
nos ensaios de microcosmos. A identificação molecular por sequenciamento de
DNA de alguns amplicons de isolados e/ou OTUs originários de DGGE
contribuirão para o conhecimento da biodiversidade de comunidades
microbianas nativas nos ambientes estudados. na Bacia Petrolífera Potiguar –
RN como também da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE.