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UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS
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DDIISSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MMEESSTTRRAADDOO
POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA PROXIMAIS DO PROMOTOR DO GENE DA INTERLEUCINA-10 EM
PACIENTES PEDIÁTRICOS COM LINFOMA DE HODGKIN EM ASSOCIAÇÃO COM O VÍRUS EPSTEIN-BARR
JAQUELINE DE AZEVÊDO SILVA
RECIFE 2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética da UniveH-RSidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE.
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POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA PROXIMAIS DO PROMOTOR DO GENE DA INTERLEUCINA-10 EM
PACIENTES PEDIÁTRICOS COM LINFOMA DE HODGKIN EM ASSOCIAÇÃO COM O VÍRUS EPSTEIN-BARR
JAQUELINE DE AZEVÊDO SILVA
RECIFE 2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE.
Orientador: Maria Tereza Cartaxo Muniz
Co-Orientadora: Cláudia Esther Rocio Hassan
Silva, Jaqueline de Azevêdo Polimorfismos de base única proximais do promotor do gene da interleucina-10 em pacientes pediátricos com linfoma de Hodgkin em associação com o vírus epstein-barr / Jaqueline de Azêvedo Silva. – Recife: O Autor, 2010. 80 folhas : fig., tab.
Orientadora: Maria Tereza Cartaxo Muniz. Co-Orientadora: Claúdia Esther Rocio Hassan.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2010.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Genética – Pesquisa 2. Câncer – Aspectos genéticos 3. Linfoma 4. Hodgkin, Doença de I. Título.
576.5 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2010-121
“A consciência do dever cumprido derrama na nossa alma doce
alegria. “
George Herbert
Agradecimentos
Os agradecimentos sempre começam um pouco clichês, e agora não seria
diferente, pois seria ingratidão demais não começar com um agradecimento Àquele
que sempre esteve comigo, nos melhores e piores momentos, me suprindo de uma
energia que teimava em acabar, me levantando para enfrentar uma luta que muitas
vezes eu cheguei a pensar que seria inútil. Sim, agradeço a Deus, por ter me dado,
antes de qualquer coisa, a vida e por ter me permitido chegar até aqui.
Agradeço a meus pais, José e Aparecida, pelo apoio, carinho, paciência e amor
incondicionais. Sem a estrutura familiar que eles me proporcionam, muito
provavelmente, eu não teria ido muito longe. A eles meu imenso amor, carinho e
respeito. A meu irmão, Joca, que sempre acreditou em mim, mesmo quando eu
mesma não acreditava, por sua confiança, carinho e apoio, sempre.
Meu agradecimento especial ao meu noivo, Will, que tanto me apoiou, me dando
alegrias, me dizendo verdades (que muitas vezes eu preferia não escutar), me
fazendo achar o caminho quando este me parecia perdido, a ele, que com seu amor,
carinho, paciência e dedicação, não me permitiram sucumbir. Obrigada por tudo,
sem você as coisas poderiam ser muito diferentes, não no bom sentido.
À minha orientadora, Dra. Tereza Cartaxo, por seu acolhimento ao longo desta
jornada, por sua confiança e otimismo, mesmo nas situações mais críticas. A Dra
Rocio Hassan por me acolher em seu laboratório, por sua paciência, apoio,
confiança e por dividir comigo uma mínima parte do seu conhecimento. Ao Mário,
por sua inestimada dedicação com as amostras, e é claro, por conhecimento e
trabalho.
À equipe médica, em especial Dra Adriana Moraes, que com sua dedicação, me
proporcionou subsídios, me encaminhando os pacientes para que este trabalho
pudesse ser concluído.
Aos meus colegas de laboratório, que conseguiram alegrar os dias e noites de
“bancada”, e proporcionaram-me bons momentos. A minha amiga de longa jornada,
Karina, por emprestar o seu ouvido, por seus conselhos e bom humor. A Maíra, que,
juntamente com Karina, me proporcionou momentos valiosos de descontração,
fundamentais para renovar as energias e retomar a caminhada. À minha querida
amiga Heidi, vulgo “Raidi”, que com seu otimismo, alegria e aventura, alegrou meus
dias e a todos os meus colegas de mestrado, Bárbara, Isadora, Rafaelle, Rafaela,
Marcus, Carlos... todos! A amiga Carolina (Carol), por sua tão preciosa ajuda em um
momento crítico, sua presença foi de inestimável importância. Obrigada!
Às minhas amigas e amigos, que com sua simples presença, contribuíram para a
minha sanidade mental. A todos vocês, muito obrigada queridos.
Aos pacientes que me permitiram a realização deste trabalho, sem eles, com
certeza, nada disso seria feito. E sem eles, nada disso vale à pena. A Dra Rosilda,
por sua gentileza, dando suporte a esta pesquisa. A coordenação da PPGGBM, que
apoiou este trabalho, a mim e a minha orientadora, em especial ao Prof. Antônio
Carlos de Freitas e ao Prof. Valdir Balbino.
A todos que de alguma forma, mesmo que pequena, contribuíram para que este
trabalho fosse concluído. Obrigada a todos.
Agradecimento especial ao órgão fomentador da pesquisa: CNPq.
SUMÁRIO 1. Introdução 8 2. Revisão da Literatura 10
2.1. Linfoma de Hodgkin (LH) 10 2.1.1 Linfoma de Hodgkin – Importância no Brasil e no mundo 10 2.1.2 Linfoma de Hodgkin – Classificação 11 2.1.3 Caracterização do Linfoma de Hodgkin 13
2.2. Interleucina 10 (IL-10) 17 2.2.1 Importância da IL-10 no sistema imunológico 17 2.2.2 Gene IL-10 18 2.2.3 Polimorfismos do promotor do gene da IL-10 22 2.2.4 IL-10 associada a doenças 24 2.2.5 Interleucina-10 e Linfoma de Hodgkin 25
2.3 Microambiente tumoral 26 2.3 EBV 28
2.3.1Caracterização do EBV 28 2.4.2 EBV e LH 31 2.4.3 EBV e produção de IL-10 32
3. Objetivos 35 3.1. Objetivo Geral 35 3.2. Objetivos Específicos 35
4. Materiais e Métodos 36 4.1. Desenho Experimental 36 4.2. Local de Estudo 36 4.3. Período de Estudo 36 4.4. Critérios para Inclusão de Pacientes e Controles 36 4.5. Coleta de Material Biológico 36 4.6. Aspectos Éticos 37 4.7 Métodos de Extração 37
4.7.1 Extração de DNA de Sangue Total 37 4.8. Detecção dos SNPs – PCR alelo-específico 38 4.9. Detecção dos Haplótipos Proximais da IL-10 39 4.10. Análise do EBV 41 4.11 Análise dos Resultados 42
5. Resultados 44 6. Discussão 49 7. Conclusões 53 8. Memorial da Aluna 54 9. Referências Bibliográficas 55 10. Anexos 70
10.1 Anexo I 70 10.2 Anexo II 71
1
Lista de Abreviaturas µg Micrograma µl Microlitro µm Micrômetro µM Micromolar AIDS Síndrome de Imunodeficiência Humana APC Célula Apresentadora de Antígeno AS- PCR PCR- Alelo específica BCR Receptor de Células B (do inglês, B cell receptor) BCRF1 Fator de receptor de célula B 1 CCL Citocina regulada sob ativação, expressa e secretadas por
células T normais CD Célula Dendrítica CEONPE Centro de Oncohematologia Pediátrica de Pernambuco CG Centro Germinativo CMN Células Mononucleares DA Doença de Alzheimer dbSNP Single Nucleotide Polymorphisms Database DH Doença de Hodgkin DL Desequilíbrio de Ligação DNA Ácido Desoxirribonucléico (do Inglês: Deoxyribonucleic acid ) dNTP Desoxinucleotídio EBER RNA viral do Epstein Barr (do inglês, Epstein Barr encoded RNA)
EBNA Antígeno Nuclear Viral do Epstein Barr (do inglês, Epstein Barr virus)
EBV Vírus Epstein-Barr EDTA Ácido etilenodiamino tetra acético EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg FDC Células Dendrítica Folicular (do inglês, Follicular Dentric Cell) FIP Fixado e Impregnado em Parafina hIL-10 Interleucina-10 humana HIV Vírus da Imunodeficiência Humana HLA Antígeno de Leucócito Humano H-RS Hodgkin e Reed-Sternberg HUOC Hospital Universitário Oswaldo Cruz IARC Agência Internacional de Pesquisa do Câncer (do Inglês,
International Agency for Research on Cancer) IFN Interferon Ig Imunoglobulina IgH Cadeia pesada da Imunoglobulina (do inglês, Immunoglobulinheavy
chain) IL-10 Interleucina-10
2
INCa Instituto Nacional do Câncer INF Interferon ISH Hibridização in situ JAK Janus Kinase Kb Kilobase LB Linfoma de Burkitt LCV Linfocriptoviridae LH Linfoma de Hodgkin LHc Linfoma de Hodgkin Clássico LHPLN Linfoma de Hodgkin com Predominância Linfocítica Nodular LMP Proteína Latente de Membrana (do inglês, Latent Membrane
protein)
LNH Linfomas Não-Hodgkin MHC Complexo Maior de Histocompatibilidade ml Mililitro mRNA RNA mensageiro NCBI National Center for Biotechnology Information NFKB Fator de Necrose Kappa Beta NK Natural Killer nm Nanômetro nM Nanomolar OMS Organização Mundial de Saúde OR Odds Ratio pb Pares de base PCR Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, Polymerase chain
reaction) PPD-1 Proteína de Morte Celular Programada (do inglês, Programed
Protein Death 1) RNA Ribonucleic acid / Ácido ribonucléico rpm Rotações por minuto RV Rhabdo vírus SDS Dodecil Sulfato de Sódio ou Lauril sulfato SLE Sobrevida livre de eventos SNP Polimorfismo de base única (do Inglês: Single Nucleotide
Polymorphisms) STAT Sinal transdutor e ativador de transcrição (do inglês: signal
transducer and activator of transcription) T reg Células T reguladoras TARC Quimocina timo e ativação regulada (do inglês Thymus and
activation regulated chemokine) TFN Fator de Necrose tumoral TGF
Fator de Crescimento Tumoral (do inglês, transforming growth factor)
3
Th Célula T auxiliadora (do Inglês: T Cell Helper) TNF Fator de Necrose Tumoral (do inglês, Tumor necrosis factor) UICC União internacional contra o câncer UV Ultravioleta vIL-10 Interleucina-10 viral
4
Lista de Figuras Figura 1. Anatomia do sistema linfático. Fonte: National Cancer Institute –USA. ..... 10
Figura 2. Célula de Reed-Sternberg. Fonte: http://www.med-
ed.virginia.edu/courses/path/innes/wcd/hodgkin.cfm. Acesso em Outubro/2009.
........................................................................................................................... 15
Figura 3: Esquema do centro germinativo - papel hipotético do EBV na tumorigênese
do LH. Adaptado de Kutok & Wang,2006. ......................................................... 16
Figura 4. Esquema da estrutura de parte do cromossomo 1 humano, mostrando o
gene da IL-10 e os genes adjacentes. Fonte: http://genatlas.medecine.univ-
paris5.fr/fiche.php?symbol=IL10RA. .................................................................. 18
Figura 5. Estrutura dos Receptores de IL-10 humana e parte da via de sinalização
JAK/STAT para estes receptores. Fonte: Mosser e Zhang, 2008. ..................... 20
Figura 6. Elementos regulatórios do promotor do gene da IL-10 humana. ............... 21
Figura 7: Esquema da estrutura do gene da IL-10, mostrando os SNPs e os
microssatélites da região promotora. Adaptado de Howell et al, 2007. .............. 22
Figura 8. Interação das células H-RS com as células do microambiente tumoral.
Adaptado de Schmitz et al, 2009. ...................................................................... 28
Figura 9: Esquema com a comparação das principais características dos ciclos
líticos e lisogênicos de infecção pelo EBV. Adaptado de Kutok e Wang (2006).
........................................................................................................................... 30
Figura 10: Esquema didático das combinações utilizadas na Haplotipagem
Experimental. ..................................................................................................... 40
Figura 11: Perfil eletroforético do produto amplificado da posição -1082. Gel de
Agarose a 2%, com fragmentos amplificados de 139 pb. Ladder de 100pb. CN
= Controle Negativo (água e mix de PCR) e Lad.= Ladder (marcador de peso
molecular). ......................................................................................................... 45
Figura 12: Perfil eletroforético dos produtos amplificados dos haplótipos ACC, ATA e
GCC em gel de agarose 2% corado com Brometo de Etídio. ............................ 46
5
Lista de Tabelas Tabela 1: Estadios Clínicos do Linfoma de Hodgkin..................................................12
Tabela 2: Linfoma do Hodgkin Clássico:Subtipos, Características e Incidência........14
Tabela 3: Exemplos de seqüências regulatórias da região 5´do gene da IL-10
humana...................................................................................................................... 21
Tabela 4: Seqüência dos Iniciadores usados nas reações de genotipagem por AS-
PCR........................................................................................................................... 39
Tabela 5: Combinações de Iniciadores para cada haplótipo experimental...............40
Tabela 6: Sequências dos Iniciadores usados na haplotipagem experimental.........41
Tabela 7:Características Clínicas dos Pacientes analisados.....................................44
Tabela 8: Distribuição genotípica dos polimorfismos do gene da IL-10 no grupo de
pacientes e controles................................................................................................. 46
Tabela 9: Distribuição dos haplótipos do promotor do gene da IL-10 no grupo de
casos e controles....................................................................................................... 47
Tabela 10: Distribuição haplotípica e genotípica nos casos de EBV no grupo de
pacientes................................................................................................................. 48
6
Resumo O Linfoma de Hodgkin (LH) é uma neoplasia maligna caracterizada histologicamente pela presença de células denominadas Hodgkin-Reed-Sternberg (H-RS) no microambiente tumoral. A interleucina-10 (IL-10) é uma citocina imunoregulatória que exerce função linfoproliferativa nas células B. A regulação do produto do IL-10 pode ser controlado por diferentes genótipos no promotor do gene ou por transcritos do vírus Epstein-Barr (EBV) em células B infectadas, já que o EBV possui a capacidade de produzir uma IL-10 (vIL-10) similar a IL-10 humana (hIL-10). Os polimorfismos de base única (SNP) na posição proximal do promotor do gene IL-10 já foram relacionados com diversas doenças, entre elas o LH em algumas populações. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a existência de associação entre os polimorfismos proximais do IL-10 com LH e a possível associação com EBV. O estudo foi do tipo analítico com caso-controle, consistindo de 64 pacientes (2-18 anos) com LH, atendidos no CEONPE/HUOC e 131 indivíduos saudáveis compondo o grupo de controles. A investigação dos SNPs nas posições -1082 e -592, e de dos seus possíveis haplótipos, foi realizada por PCR alelo específica (AS-PCR). A análise do EBV foi realizada por hibridização in situ fluorescente da detecção do RNA do vírus Epstein-Barr (EBER-ISH). Indivíduos com genótipo -1082GG apresentaram 4,5 vezes menos chance de desenvolver LH que os portadores dos demais genótipos (OR = 4,45, IC95% 1,5-13,3 p = 0,007). Indivíduos com o genótipo -592CC apresentaram cerca de cinco vezes menos chance de desenvolver o LH que portadores dos demais genótipos (OR = 5,27, IC95% = 1,53-18,1 p = 0,007). Em relação aos haplótipos, portadores do haplótipo ACC apresentaram três vezes mais chances de desenvolver LH, em comparação aos demais haplótipos (OR= 3,28 IC95% 1,18 – 9,07 p= 0,03). Indivíduos com os haplótipos combinados ATA/ATA e GCC/GCC apresentaram menos chances de desenvolvimento do LH, em comparação às demais combinações (OR= 0,19 IC 95% 0,05 – 0,65 p= 0,007 e OR= 0,225 IC 95% 0,07 – 0,66 p= 0,007). A presença do EBV foi verificada em 36,8% das amostras analisadas. A amostra de casos de EBV apresentou maior freqüência do haplótipo ACC nos indivíduos EBV +; Já nos indivíduos EBV-, o haplótipo ATA apresentou maior freqüência; Em conclusão, as variantes genéticas das posições -1082 e -592 e os haplótipos sugerem associação ao risco de desenvolvimento de LH nos indivíduos do grupo estudado; A associação com o EBV não pode ser inferida nesta análise.
Palavras-chave: Interleucina-10; Linfoma de Hodgkin; EBV.
7
Abstract
Hodgkin´s Lymphoma (HL) is a malignancy characterized by cells named Hodgkin-Reed-Sternberg cells (H-RS) present in a microtumoral environment. Interleukin-10 (IL-10) is a pleiotropic immunoregulatory citokine with lymphoproliferative activity in B cells. Regulation of IL-10 product may be controlled by different genotypes in its gene promoter or by Epstein Barr virus (EBV) transcripts in infected B cells, since EBV is able to synthesize an IL-10 (vIL-10) similar to human IL-10 (hIL-10). IL-10 proximal single nucleotide polymorphisms (SNP) have been related to several diseases, including malignancies such as HL, in some populations. Therefore, the purpose of this study was to evaluate an association between IL-10 proximal polymorphisms and HL and its possible association with EBV. This was a case-control study, including 64 HL patients (2-18 years), admitted in CEONHPE/HUOC and 131healthy controls. Evaluation of -1082 and -592 polymorphisms and its haplotypes were performed by Allele specific PCR (AS-PCR) and -819 polymorphism was inferred from -592. EBV analysis was performed by in situ hybridization for EB encoding RNA (EBER-ISH). Individuals carrying -1082GG genotype showed thereabout 4-fold decreased risk of developing HL, compared to the others genotypes (OR = 4,45, CI95% 1,5-13,3 p = 0,007). Individuals harboring -592CC genotype showed thereabout 5-fold decreased risk of developing HL, compared to the other genotypes (OR = 5,27, IC95% = 1,53-18,1 p = 0,007). When haplotypes were analyzed regarding risk for developing HL, individuals harboring ACC haplotype showed more thereabout 3-fold increased risk for developing HL, compared to the others (OR= 3,28 CI95% 1,18 – 9,07 p= 0,03). Individuals carrying combined haplotypes ATA/ATA and GCC/GCC showed a decreased risk for developing HL, compared to the others (OR= 0,19 CI 95% 0,05 – 0,65 p= 0,007 e OR= 0,225 IC 95% 0,07 – 0,66 p= 0,007). Presence of EBV was detected in 36,8% of the samples. The EBV samples showed ACC haplotype greater frequency at EBV+, while at the EBV- samples the ATA haplotype was the prevalent one. In conclusion, the allelic variants at -1082, -819 and -592 positions and its haplotypes suggest association with the LH risk, but no association was found with EBV.
Keywords: Interleukin-10; Hodgkin´s Lymphoma; EBV.
8
1. Introdução
O Linfoma de Hodgkin (LH) é uma doença linfoproliferativa maligna,
caracterizada histologicamente pela identificação de células gigantes, mono, bi ou
polinucleadas, em um ambiente inflamatório. Estas células são denominadas de
Hodgkin -Reed-Sternberg (H-RS). A principal característica do LH é a escassez de
células tumorais, H-RS. Essas células representam 1% do infiltrado celular,
enquanto a vasta maioria das células infiltradas são linfócitos T, histiócitos,
eosinófilos granulócitos e plasmócitos. O LH é um dos linfomas mais freqüentes do
mundo ocidental, afetando geralmente adolescentes e indivíduos jovens, no entanto
sua biologia básica ainda permanece pouco compreendida. Os fatores implicados na
patogênese do Linfoma incluem desregulação dos mecanismos que levam a
apoptose, hiperestimulação das células B e participação de agentes infecciosos. A
interação das células H-RS com células do sistema imunológico no tumor constituem
o complexo microambiente tumoral do LH.
A interleucina-10 (IL-10) é uma importante citocina imunoregulatória
produzida por muitas populações celulares. A sua principal função biológica parece
ser a limitação e terminação da resposta inflamatória e regulação da diferenciação e
proliferação de muitas células do sistema imune como células T, B, Natural Killers,
apresentadoras de antígenos, mastócitos e granulócitos. A regulação do produto do
gene IL-10 pode ser controlado por diferentes genótipos presentes no promotor do
gene ou por transcritos de EBV em células B infectadas, já que o EBV possui a
capacidade de produzir uma IL-10 (vIL-10) similar a IL-10 humana (hIL-10). O
promotor do gene da IL-10 possui mais de 20 polimorfismos depositados nos bancos
públicos de dados, no entanto seis polimorfismos (proximais -1082, -819 e -592;
distais 2763, 2849, 3575) são os mais estudados. Os três SNPs proximais da região
promotora estão em forte desequilíbrio de ligação, formando três haplótipos comuns
na população caucasiana – GCC, ACC e ATA. Além disto, o haplótipo GTA é uma
possível, mas extremamente rara combinação em indivíduos caucasianos. Os SNPs
na posição proximal já foram relacionados com diversas doenças e neoplasias, entre
elas o LH em algumas populações.
9
No entanto, a literatura diverge quanto aos resultados encontrados, indicando
que os SNPs proximais do gene IL-10 tendem a apresentar expressões diferentes de
níveis séricos de IL-10 de acordo com a enfermidade e população estudada. Sendo
de fundamental importância a caracterização e investigação dos SNPs do promotor
do gene da IL-10 em diversas populações e, por ser uma população que apresenta
grande heterogeneidade a população nordestina mostra-se uma candidata
interessante.
O vírus Epstein-Barr (EBV) pertence à família Herpesviridae, sendo um
dos vírus mais comum em humanos, com incidência no mundo todo. Nos Estados
Unidos cerca de 95% dos indivíduos entre 35 e 40 anos foram infectados com o
vírus. O EBV é conhecido por causar a mononucleose infecciosa e também por sua
participação na etiopatogênese do carcinoma nasofaríngeo, linfomas (Linfoma de
Hodgkin e Burkitt) e desordens linfoproliferativas em pacientes imunosuprimidos. O
EBV tem sido associado a 30- 50% dos casos de LH, sendo que esta associação
pode chegar a 80% em crianças com LH nos países subdesenvolvidos. Postula-se
que a infecção latente por EBV é um dos mecanismos que permitem recuperar
células B danificadas, que seguiriam para a apoptose no centro germinativo (CG).
Este trabalho investigou uma possível associação entre estes
polimorfismos proximais e o desenvolvimento do LH em pacientes pediátricos
atendidos no Centro de Oncohematologia Pediátrica de Pernambuco/ Hospital
Universitário Oswaldo Cruz - CEONHPE/HUOC, além de apresentar uma descrição
sobre a presença do EBV no microambiente tumoral destes indivíduos.
10
2. Revisão da Literatura
2.1. Linfoma de Hodgkin (LH)
2.1.1 Linfoma de Hodgkin – Importância no Brasil e no mundo
O Linfoma de Hodgkin – LH é um tipo de câncer que se origina nos linfonodos
(gânglios) do sistema linfático (Figura 1). Nos Estados Unidos o número de casos
estimados e de mortes pelo LH no ano de 2009 é de 8.510 e 1.290 respectivamente
(National Cancer Institute, 2009), sendo esta neoplasia responsável por
aproximadamente 30% de todos os linfomas (Stein, 2008). Em países
industrializados, o Linfoma de Hodgkin Clássico (LHc), tem uma distribuição bimodal
em relação à idade, com o primeiro pico ocorrendo entre 15 e 30 anos, e o segundo
pico na sexta década de vida (MacMahon, 1966).
Figura 1. Anatomia do sistema linfático. Fonte: National Cancer Institute –
USA.
11
O Instituto Nacional do Câncer -INCa estima que a incidência de LH para o
Brasil em 2009 seja de aproximadamente 2870 casos, sendo 1600 para o sexo
masculino e 1270 para o sexo feminino, resultando em uma incidência de 1,5 casos
a cada 100.000 indivíduos (INCa, 2009).
Esta neoplasia pode ocorrer em qualquer faixa etária; no entanto, no Brasil, é
mais comumente observado na idade adulta jovem, dos 15 aos 40 anos, atingindo
pico de incidência entre 25 e 30 anos de idade, apresentando-se freqüente em
pacientes pediátricos (0-18 anos). Segundo dados do Instituto Nacional de Câncer
(INCa), a incidência de novos casos permaneceu estável nas últimas cinco décadas,
enquanto a mortalidade foi reduzida em mais de 60% desde o início dos anos 70,
devido aos avanços no tratamento (INCa, 2009). Cerca de 60 a 90% dos pacientes
pediátricos com LH são curados com as atuais técnicas terapêuticas, no entanto, um
grupo considerável de pacientes ainda morre por progressão de doença (Voute et al,
1998). Por outro lado, cerca de 80% das crianças curadas de LH no Brasil
apresentam efeitos tardios secundários ao tratamento antineoplásico (Barros et al,
2003).
2.1.2 Linfoma de Hodgkin – Classificação
O LH pode ser classificado de duas maneiras, a primeira pelo estadiamento
clínico, ou seja, o estágio em que a doença se encontra no indivíduo, e a segunda,
pelo estadiamento patológico. O estadiamento clínico é reconhecido como
incompleto, porém é facilmente realizável e reprodutível. É determinado pelo exame
clínico do paciente, histórico clínico, diagnóstico por imagem, exames hematológicos
e laudo da biópsia inicial. O estadiamento patológico considera dados adicionais,
como os de estudo histopatológico mais completo, por exemplo, e tem uma maior
precisão (TNM Classification of Malignant Tumours, 2002). O estadio clínico
subdivide-se em quatro níveis, de acordo com a União Internacional Contra o Câncer
(UICC), descritos na Tabela 1.
Ainda de acordo com a UICC, cada estadio clínico deve ser dividido em A e B,
de acordo com a ausência ou presença, respectivamente, dos sintomas gerais
definidos:
12
• Perda inexplicável de mais de 10% do peso corporal habitual, nos seis meses
anteriores ao primeiro atendimento;
• Febre inexplicada, com temperatura acima de 38ºC;
• Sudorese noturna.
O prurido isolado ou um estado febril de curta duração, associado com uma infecção
conhecida, não qualificam para a classificação B.
O tratamento convencional para o LH, em geral, consiste em quimioterapia,
podendo ou não o paciente fazer uso de radioterapia. O tratamento dependerá do
estágio em que a doença se encontra. Para os pacientes que sofrem recaídas do
LH, o tratamento pode ser diversificado dependendo da forma de tratamento
inicialmente utilizada, incluindo a possibilidade de transplante de medula óssea.
(www.inca.gov.br, INCa, acesso em Outubro/ 2009.)
Tabela 1. Estadios clínicos do Linfoma de Hodgkin.
Estadios Características
I Comprometimento de uma única cadeia linfonodal, ou
comprometimento localizado de um único órgão ou localização extra-
linfática.
II
Comprometimento de duas ou mais cadeias linfonodais do mesmo
lado do diafragma, ou comprometimento localizado de um único
órgão ou localização extra-linfática e seu(s) linfonodo(s) regional(ais)
com ou sem comprometimento de outras cadeias linfonodais do
mesmo lado do diafragma.
III
Comprometimento de cadeias linfonodais em ambos os lados do
diafragma (III), que pode também ser acompanhado pelo
comprometimento localizado de um órgão ou localização
extralinfática relacionada, ou comprometimento do baço, ou de
ambos.
IV
Comprometimento difuso (multifocal) de um ou mais órgãos
extralinfáticos, com ou sem comprometimento linfonodal associado;
ou comprometimento isolado de um órgão extralinfático, com
comprometimento linfonodal à distância (não regional).
13
2.1.3 Caracterização do Linfoma de Hodgkin
A Doença de Hodgkin foi descrita inicialmente em 1932 pelo médico
patologista Thomas Hodgkin, e atualmente é conhecida como Linfoma de Hodgkin,
após a descoberta da natureza clonal de células B das células H-RS. Esta neoplasia
é uma entidade que tem confundido e intrigado médicos e patologistas por mais de
175 anos (Schnitzer, 2009).
Atualmente o LH é subdividido em duas formas: o Clássico e de
Predominância Linfocítica Nodular (Jaffe, 2001), que são diferenciados tanto por
aspectos morfológicos quanto por imunofenotípicos das células tumorais. Cerca de
95% dos casos diagnosticados são classificados como LH Clássico (LHc) e 5% de
Predominância Linfocítica Nodular (LHPLN). O LH Clássico é subdividido com base
nas diferenças na composição celular e histológica em 4 subtipos: 1.Esclerose
Nodular (EN), 2.Celularidade Mista (CM), 3.Depleção Linfocítica (DL), e 4.Rico em
Linfócitos (RL), como descrito na Tabela 2 (Schmitz et al, 2009). O Linfoma de
Hodgkin Clássico Esclerose Nodular e Celularidade Mista são os subtipos mais
freqüentes seguido dos subtipos Depleção Linfocítica e Rico em Linfócitos que são
mais raros.
No LH Clássico as células tumorais são chamadas de células de Hodgkin e
Reed Sternberg (H-RS) (Schmitz et al, 2009). Caracterizada por células gigantes
originadas das células B, ou linfócitos B, as células H-RS servem como importantes
marcadores para o diagnóstico do LH. (Felberbaum, 2005). As células H-RS
apresentam-se em pequena quantidade, aproximadamente 1% das células do
infiltrado (Küppers et al,2003) mas podem ser observadas quando uma amostra de
biópsia de tecido de linfonodo é examinada ao microscópio.
2.1.3.1 Células de Hodgkin e Reed-Sternberg
As células de Hodgkin e Reed-Sternberg (Figura 2) foram descritas
inicialmente como um marco na doença de Hodgkin. São assim chamadas, células
de Hodgkin, quando são monoclueadas e de Reed-Sternberg quando são
multinucleadas. Elas foram nomeadas por Thomas Hodgkin em 1832, (células de
Hodgkin) e posteriormente por Dorothy Reed e Carl Sternberg (célula de Reed-
14
Sternberg), que descreveram este tipo peculiar de célula nos tecidos com LH em
1902 e 1898, respectivamente (Hodgkin, 1832; Reed, 1902; Sternberg, 1898).
As células H-RS são derivadas da linhagem de linfócitos B e, em raras
exceções a origem é proveniente de células T (Küppers, 2009). As células H-RS
compartilham características com células B normais e maduras que foram expostas
a um antígeno. Por apresentarem um perfil imunofenotípico diferente das demais
células do sistema hematopoiético, com co-expressão de marcadores de várias
linhagens diferentes, a origem destas células foi por muito tempo, de difícil
caracterização.
Tabela 2. Linfoma de Hodgkin Clássico: Subtipos, características histológicas e
incidência.
Subtipo Características Incidência
Esclerose Nodular
Constituído de bandas de tecido fibrocolágeno,
formando nódulos de células inflamatórias com
variante celular H H-RS.
60 a 80% dos casos
de cHL.
Celularidade Mista
Caracteriza-se por predominância de pequenos
linfócitos T, um número variante de eosinófilos,
células plasmáticas, histiócitos epitelióides,
neutrófilos e fibroblastos. Células H-RS bi e
multinucleadas são freqüentemente encontradas.
15 a 25% dos casos
de
cHL.
Depleção Linfocítica
Caracteriza-se por possuir um número baixo de
linfócitos e por extremos de muitas ou poucas células
H-RS.
< 1% no Ocidente,
sendo mais comum
em países em
desenvolvimento.
Rico em linfócitos
Possui padrão de crescimento nodular, com contorno
irregular, composto predominantemente de
pequenas células B linfocíticas.
4 a 6% dos casos
de cHL.
Fonte: Schnitzer, 2009.
15
Figura 2. Célula de Reed-Sternberg. Fonte: http://www.med-
ed.virginia.edu/courses/path/innes/wcd/hodgkin.cfm. Acesso em Outubro/2009.
As alterações genéticas envolvidas na patogênese do LH ainda não estão
completamente elucidadas. No entanto, as células H-RS na maioria dos casos, se
não em todos, apresentam aberrações cromossômicas numéricas, amplificações e
deleções de subregiões cromossômicas (Joos et al, 2002; Weber-Matthiesen et al,
1995). Essas células também carregam rearranjos e mutações somáticas nos genes
da cadeia variável (V) da Imunoglobulina (Ig) em quase todas as situações. Observa-
se que em cerca de 25% dos casos de LHc, foram encontradas mutações somáticas
destrutivas nas células B do centro germinativo, que normalmente causariam a
morte imediata dessas células, no entanto algumas destas apresentaram a
habilidade de “driblar” a apoptose (Figura 3). Nesses casos, a restauração de parte
da função original da região variável da Ig, impede que estas células entrem em
processo de apoptose (Küppers et al, 1994;Kanzler et al, 1996; Bräuninger et al,
2006). Isto indica que as células H-RS que derivam de células B do centro
germinativo são incapacitadas e pré-apoptóticas (Kanzler et al,1996; Küppers et
al,1998).
16
A origem de células B e a natureza clonal das células H-RS foram
demonstradas pela detecção dos rearranjos dos genes da região variável da Ig
através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR- Polymerase Chain Reaction),
para amplificar os genes rearranjados dessas células isoladas de tecidos
neoplásicos (LH) (Küppers et al, 1994; Kanzler et al, 1996; Bräuninger et al,1997;
Marafioti et al, 2000). Curiosamente, uma característica importante do LHc é a rara
presença de células tumorais, H-RS, que representam apenas 1% do infiltrado
celular, enquanto que a grande maioria das células do infiltrado neoplásico são
linfócitos T, histiócitos, granulócitos eosinofilicos e células plasmáticas (Weiss et al,
1999).
Figura 3: Esquema do centro germinativo - papel hipotético do EBV na tumorigênese do LH. Adaptado de Kutok & Wang,2006.
17
2.2. Interleucina 10 (IL-10) 2.2.1 Importância da IL-10 no sistema imunológico
A interleucina-10 (IL-10) é uma citocina do tipo II e pertence à família de
citocinas que incluem IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28, e IL-29 (Commins et al.
2008). Todas estas citocinas possuem organização genômica íntron-éxon
semelhante, ligam-se a receptores com estruturas similares (Donnelly et al, 2004) e
ativam a via de sinalização JAK/STAT. Apesar destas semelhanças, as citocinas
desta família apresentam atividades biológicas diferentes, o que é determinado
pelas células produtoras das citocinas, pelas células que respondem às citocinas e
pelo ambiente imune no qual estas células são liberadas (Revisto por Mosser &
Zhang, 2008).
A IL-10 foi originalmente identificada por Mosmann e colaboradores
(Fiorentino et al. 1989; Moore et al. 1990). Desde a descrição original, a lista de
células produtoras de IL-10 cresceu rapidamente, como também o número de
células capazes de responder a esta citocina. As quatro principais fontes de IL-10
são as células T helper 2 (Th2), um subgrupo de células T regulatórias chamadas
Tr1, Th1 e Th17. As células T CD8+ também produzem IL-10. Outros produtores
importantes de IL-10 incluem monócitos e macrófagos estimulados, bem como
alguns subgrupos de células dendríticas (O’arra & Vieira, 2007).
As células B humanas são também uma fonte importante de IL- 10 (Fillatreau
et al, 2008), como também alguns granulócitos incluindo eosinófilos e mastócitos
(Ryan et al, 2007). Fontes celulares não imunes incluem queratinócitos, células
epiteliais e até células tumorais (Moore et al, 2001; Williams et al, 2004). Parece
razoável assumir que células Th2 representam uma importante fonte de IL-10
antígeno-específica. Não há dúvidas de que as células Th1 são capazes de produzir
IL-10 e estas células representam uma importante fonte desta citocina nas doenças
infecciosas (Jankovic et al, 2007; Anderson et al, 2007), mas parece mais provável
que esta produção ocorra como um mecanismo homeostático para prevenir a
ativação descontrolada de células T (O’arra & Vieira, 2007). A principal função
biológica da IL-10 parece ser exercida em células dendríticas e macrófagos. A IL-10
é um potente inibidor da apresentação de antígenos, inibindo a expressão do
Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex,
18
MHC) de classe II, bem como a ativação de moléculas co-estimulatórias (Cai et al.
1999).
A IL-10 inibe a diferenciação e a maturação de células dendríticas (CDs) a
partir dos monócitos precursores. Assim, muitas das características imuno-inibitórias
da IL-10 podem ser estudadas pelos seus efeitos nas células apresentadoras de
antígeno (APCs) para prevenir a produção de citocinas Th1-associadas, IL-2 e IFN-γ
e também Th2-associadas, IL-4 e IL-5. Assim, a definição original da IL-10 como um
regulador cruzado da imunidade Th1/Th2 é provavelmente não mais aplicável. O
outro efeito importante da IL-10 é inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias e
mediadores dos macrófagos e CDs. A IL-1, IL-6, IL-12 e TNF-α são todos reprimidos
pela exposição a IL-10 (Revisto por Mosser & Zhang, 2008)
É importante notar que nem toda atividade da IL-10 resulta em supressão da
resposta imune. A IL-10 pode co-estimular a ativação, a sobrevivência e contribuir
para o swtiching class nas células B. Ela pode também co-estimular a proliferação
de células Natural Killer (NK) e a produção de citocinas. A IL-10 pode ainda agir
como fator de crescimento para estimular a proliferação de certos subgrupos de
células T CD8+ (Cai et al. 1999).
2.2.2 Gene IL-10
O gene IL-10 humano apresenta aproximadamente 4,7 kilobases (Kb) e está
localizado no cromossomo 1q21-32, contendo cinco éxons separados por quatro
íntrons. A IL-10 murina está organizada de forma similar com 5,1 Kb no cromossomo
1E4. Existem diversos genes adjacentes ao gene IL-10 dentro de um segmento de
aproximadamente 200 Kb que compreende o cluster do IL-10 (Figura 4).
Figura 4. Esquema da estrutura de parte do cromossomo 1 humano, mostrando o gene da IL-10 e os genes adjacentes. Fonte: http://genatlas.medecine.univ-paris5.fr/fiche.php?symbol=IL10RA.
19
Dentro deste cluster, os genes codificantes da IL-20 e IL-19 são encontrados
aproximadamente a 90 Kb à montante do gene da IL-10, enquanto que os genes
codificantes do Mapkapk2 e Dyrk3 estão localizados à jusante do gene da IL-10.
Dentre estes cinco genes, a transcrição do gene da IL-10 é iniciada em uma direção
enquanto que os outros seguem na direção oposta (Donelly et al, 2004).
O sinal da IL-10 ocorre através de um complexo de dois receptores
consistindo de duas cópias de cada um dos receptores de IL-10R1 e IL-10R2
(Donnelly et al, 1999). A IL-10 liga-se ao IL-10R1 com alta afinidade (50-20 pM), e o
recrutamento do IL-10R2 para o complexo do receptor faz apenas uma contribuição
marginal à interação com o ligante. Contudo, o comprometimento deste segundo
receptor para o complexo, permite a transdução do sinal após a interação com o
ligante. Assim, o receptor funcional consiste de um dímero de heterodímeros de IL-
10R1 e IL-10R2 (Figura 5). A maioria das células hematopoiéticas expressam
constitutivamente baixos níveis de IL-10R1, e a expressão do receptor pode
freqüentemente ser ativada por diversos estímulos. Células não hematopoiéticas,
como fibroblastos e células epiteliais, podem também responder a estímulos para a
ativação de IL-10R1 (Williams et al, 2004). O IL10R2 é expresso na maioria das
células e assim, um grande número de células tem a habilidade de ligar-se e de
consumir a IL-10. Isto representa um problema para a administração terapêutica do
recombinante IL-10 (rIL10), porque boa parte da citocina pode ser desviada para
células não imunes, diminuindo a dosagem efetiva administrada (Murray et al, 2007).
20
Figura 5. Estrutura dos Receptores de IL-10 humana e parte da via de sinalização JAK/STAT para estes receptores. Fonte: Mosser e Zhang, 2008.
A ligação da IL-10 ao receptor ativa as Janus Tirosina Quinases, JAK1 e
Tyk2, associados com IL-10R1 e IL-10R2, respectivamente, para fosforilar as caudas
citoplasmáticas dos receptores. Isto resulta no recrutamento de STAT3 para o IL10-
R1 (Donelly et al, 2004). A homodimerização de STAT3 resulta na sua liberação do
receptor e a translocação do homodímero STAT para o núcleo, onde ele interage
com elementos de ligação a STAT nos promotores de vários genes (Donelly et al,
1999) (Figura 6). Um destes genes é o próprio gene da IL-10, que é positivamente
regulado por STAT3 (Staples et al, 2007). A região 5´ flanqueadora do gene da IL-10
humana (hIL-10) foi caracterizada em 1995 por Kube e colaboradores. Esta região
foi analisada quanto à presença de motivos de ligação a fatores de transcrição
(Kube et al, 1995). Exemplos de possíveis sequências regulatórias no promotor do
gene da IL-10 são mostrados na tabela 3.
21
Figura 6. Elementos regulatórios do promotor do gene da IL-10 humana.
A sequência correspondente ao TATA Box (TATAA) está localizada na
posição -77, e o CAAT box na posição -226 da região. Apesar de a hIL-10 ser um
citocina Th1/Th2 nenhum motivo foi encontrado envolvido na regulação de IL-10
humana (Donelly et al, 2004).
O promotor do gene IL-10 (GenBank/EMBL acesso: X78437) possui mais de
4Kb de comprimento (Eskdale et al, 1997) e mais de 100 polimorfismos foram
descritos para esta região, depositados no banco de dados dbSNP (NCBI, National
Center for Biotechnology Information). Entre estes polimorfismos, destacam-se duas
regiões de microssatélites, IL-10.G e IL-10.R, além de diversos SNPs, localizados na
região proximal, principalmente nas posições -1082, -819 e -592, bem como na
região distal, nas posições -3575,-2849, -2763.
Tabela 3: Exemplos de seqüências regulatórias da região 5´do gene da IL-10 humana. Adaptado de Kube et al, 1995.
Sequência Reconhecida Posição Significado Possível
TATAA 2418-2422 TATA-box CCAAT 2269-2274 CAAT-box
CTTGGGAACTT 1922-1932 EBNA2-like (LMP2) GAGAA 1821-1825 Pu-box
GTGGAAA 1805-1811 Sequência insulin-like GATGGGAAACA 354-364 EBNA2-like (LMP2)
ACCNNNNNNGGT 309-320 PV-E2-transativador
22
2.2.3 Polimorfismos do promotor do gene da IL-10
As variações genéticas que podem ocorrer nas seqüências de nucleotídeos nos
promotores contribuem para expressão alterada de genes em doenças hereditárias
complexas (Marsh et al,1994; Meyers et al, 1994). O promotor do gene da IL-10 é
altamente polimórfico possuindo dois microssatélites informativos, IL10.G e IL10.R,
com 1.2 Kb e 4Kb, respectivamente, a montante do sítio de início da transcrição
(Eskdale & Gallagher, 1995; Eskdale et al, 1996), mostrado na Figura 7.
Entre os polimorfismos descritos na região promotora deste gene dois grupos de
polimorfismos são freqüentemente analisados por possuírem efeito funcional, e são
divididos em proximais sendo composto pelas posições 1082(G/A), -819(C/T) e -
592(C/A), e distais compreendendo as posições 3575 (T/A), -2849(G/A) e -2763(C/A)
o grupo distal. (Eskdale et al, 1999; Gibson et al, 2001).
Lewontin e Kojima, em 1960, observaram a existência de uma ligação entre os
alelos próximos, indicando que na maioria das situações, os SNPs quando vizinhos
são transmitidos juntos para a prole. Geneticamente, a essa associação física entre
esses polimorfismos de base única dá se o nome de desequilíbrio de ligação (DL)
(Lewontin e Kojima, 1960). Quando um conjunto de marcadores genéticos ou SNPs
Figura 7: Esquema da estrutura do gene da IL-10, mostrando os SNPs e os microssatélites da região promotora. Adaptado de Howell et al, 2007.
23
organizam-se linearmente em um mesmo cromossomo e tendem a serem herdados
em bloco, chamamos de haplótipo (Zhu et al, 2004).
Acredita-se que os SNPs no promotor do gene da IL-10 ocorrem dentro de
importantes regiões regulatórias, que talvez alterem a estrutura dos sítios de ligação
aos fatores de transcrição. Esses potenciais fatores de transcrição ainda estão
pouco definidos. O SNP na posição -1082 situa-se no sítio ETS de reconhecimento e
talvez afete a ligação deste fator de transcrição. O SNP na posição -819 acontece
dentro de uma região putativa de regulação positiva, e os SNP -592 ocorre dentro de
uma possível região de ligação de STAT3 e uma região putativa de regulação
negativa (Kube et al, 1995). Apesar de estudos in vitro serem criticamente
influenciados por vários fatores como a linhagem e estímulo celular, estudos in vitro
prévios na região promotora do gene IL-10 indicam que alguns polimorfismos
conferem produção diferenciada desta interleucina.
Existe um forte desequilíbrio de ligação entre os alelos -819C e -592C, o que
resulta na ocorrência do haplótipo ACC ou GCC, quando existe uma A ou uma
G, respectivamente, na posição -1082. No entanto, a combinação dos alelos -819T e -
592A, só ocorre na presença do alelo -1082A resultando na formação do
haplótipo ATA. Portanto, somente três dos quatro haplótipos possíveis foram
encontrados na população caucasiana (Lazarus et al, 2002; Fife et al, 2006). Juntos
os haplótipos ACC, ATA e GCC contribuíram para mais de 98% dos haplótipos
presentes na população norte-americana, com uma pequena representação de um
haplótipo raro “ATC” (Lazarus et al, 2002). Em populações asiáticas, além de o
haplótipo GCC ter sido encontrado em menor freqüência, foi observada a ocorrência
de outro haplótipo raro, “GTA” (Mok et al, 1998).
Os diferentes genótipos e haplótipos do gene da IL-10 foram associados, em
estudos in vitro e in vivo, com uma produção diferencial da proteína (Eskdale et al,
1999). Estudos in vitro mostraram que a variabilidade individual pode atingir
diferenças de até dez vezes na produção de IL-10 entre indivíduos portadores de
genótipos de alta e baixa produção (Eskdale et al, 1998; 1999). Na maioria dos
trabalhos focados no estudo da expressão de IL-10, o genótipo 1082GG, assim
como o haplótipo proximal GCC, foi relacionado à elevada expressão da proteína,
enquanto que o inverso foi encontrado em relação ao genótipo -1082AA e o haplótipo
ATA (Turner et al, 1997; Koss et al; 2000; Reuss et al 2002; Suárez et al,2003;
Mörmann et al, 2004; Miteva & Stanilova; 2008; Visentainer et al, 2008).
24
Outros autores encontraram que o genótipo -1082AA e haplótipo ATA são as
variantes de alta produção de IL-10 (Kilpinen et al, 2002; Temple et al, 2003; Warlé
et al, 2003). O SNP -592AA está associado a elevados níveis séricos de IgE, em
indivíduos hetero e homozigotos para esse polimorfismo (Immervoll et al,2001). As
controvérsias encontradas na literatura sugerem que as variantes alélicas do
promotor da IL-10 podem ter efeitos diferentes na regulação da expressão
desta molécula de acordo ao tipo celular.
2.2.4 IL-10 associada a doenças
Os polimorfismos presentes no promotor do gene IL-10 estão associados a
diversas doenças, incluindo autoimunes, infecciosas, neoplasias e Doença de
Alzheimer (DA) (Eskdale et al, 1997; Arosio et al, 2004; Ansari et al, 2009).
Bagnoli et al (2007) mostraram em indivíduos italianos caucasianos que a IL-10
pode estar relacionada à patogênese da DA, e que pode ser um importante alvo
para estratégias terapêuticas com a finalidade de limitar a resposta inflamatória
envolvida no desenvolvimento desta doença. Nenhuma hiper expressão do genótipo
AA na posição -1082 e nem nas demais posições foram encontradas nos pacientes
com DA, no entanto uma associação com o haplótipo AT foi detectada. Outros três
estudos conduzidos nas populações Italiana e Chinesa mostraram que
polimorfismos no promotor do gene da IL-10 são um fator de risco no
desenvolvimento da DA, demonstrando que os SNPs IL-10 -1082A, -819T e -592A
são significativamente representados nos pacientes com DA comparado com
controles não-dementes (Arosio et al, 2004; Lio et al, 2005; Ma et al, 2005). No
entanto, outros estudos não foram capazes de reproduzir esses resultados e isso
sugere que o papel no gene IL-10 na susceptibilidade da DA talvez seja limitado a
certas populações (Depboylu et al, 2003; Scassellati et al, 2004; Ramos et al, 2006).
Estudos de associação demonstram que níveis elevados da expressão do gene
IL-10 conduzem a uma redução na formação de lesões ateroscleróticas precoce e
tardia, em que a deficiência da IL-10 está associada com o aumento da aterogênese
(Potteaux et al, 2004; Namiki et al, 2004). Outro estudo observou que no
compartimento pulmonar a alta resposta do genótipo AA na posição -1082 do gene
da IL-10 tem um papel crucial em limitar o dano tissular na tuberculose pulmonar –
TBP (Ansari et al, 2007). Immervoll e colaboradores descreveram em 2001, em um
25
estudo de famílias caucasianas, que o polimorfismo na posição -592 está associado
à asma e ao aumento do número de eosinófilos (Immervoll et al, 2001). Além disso,
esse SNP tem sido associado com o aumento da severidade em um grande número
de doenças auto-imunes, incluindo artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, e
também a doença inflamatória do intestino (Hajeer et al, 1998; Eskdale et al, 1997;
Mok et al, 1998). Este polimorfismo (C A), na posição -592, está ligado a alterações
no processo de tumorigênese, tolerância em transplantes (Middleton et al,1998) e
rápida progressão em indivíduos infectados com o vírus da AIDS (Shin et al, 2000).
Todas essas enfermidades são de caráter imunológico e podem estar associadas a
um mecanismo molecular genético ligado a perda tanto da tolerância como da
repressão da resposta imune (Steinke et al, 2004).
Outros estudos mostram uma correlação entre alelos polimórficos do promotor
do gene IL-10 e a severidade da inflamação crônica e doenças reumatóides
(Lazarus et al,1997; Eskdale et al, 1998;Huang et al,1999; Tagore et al, 1999), bem
como nos resultados de tratamentos de doenças hematológicas, imunológicas,
infecções e condições atópicas (Edwards-Smith et al, 1999; Hobbs et al,1998).
Dados recentes sugerem que os polimorfismos no gene IL-10 estão associados a
um aumento do risco do desenvolvimento de Linfomas não-Hodgkin, particularmente
aqueles de células B difusas. Purdue et al, 2007, identificaram que as variantes -
3575A e -1082G do promotor do gene IL-10 estão associadas com aumento do risco
Linfoma de células B difusas.
2.2.5 Interleucina-10 e Linfoma de Hodgkin
O LH é uma neoplasia maligna com alteração na produção e atuação de
citocinas. As citocinas produzidas por células H-RS podem contribuir para a
patogênese do LH, iniciando e sustentando o estabelecimento do infiltrado
leucocitário reativo, além de contribuir para a proliferação celular e sobrevida das
células. A elevada expressão de citocinas, incluindo IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α e TGF-β
(fator de crescimento transformante –β) foram descritas no LH. Alguns estudos
demonstram a presença de citocinas em linhagens de células H-RS oriundas de
tecidos biopsiados, incluindo IL-6 e IL-8 (Skinnider & Mak, 2002; Maggio et al, 2000).
Esse padrão anormal na produção de citocinas observado no LH contribui não
somente para a proliferação das células H-RS como também para a manutenção de
26
um ambiente favorável no qual uma resposta imune efetiva do hospedeiro contra as
células H-RS não seja atingida (Maggio et al, 2000).
Bohlen et al 2000 relataram que altos níveis de IL-10 em pacientes com LH
são indicativos de um mau prognóstico. Nas células normais (não cancerígenas), a
expressão de IL-10 está estreitamente regulada, sendo o nível de expressão
constitutiva extremamente baixo. Há ainda, na literatura, observações que
relacionam a infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV) e produção de IL-10. Em casos
de LH, a alta expressão de IL-10 foi relacionada à detecção do genoma do EBV em
células tumorais e associada com um baixo número de células T citotóxicas
próximas ao tumor (Herbst et al, 1996; Moore et al, 2001).
2.3 Microambiente tumoral
O LHc é caracterizado por uma infiltração de diferentes tipos celulares do
sistema imune dentro do tecido neoplásico, incluindo células T, células B, células
plasmáticas, neutrófilos, eosinófilos e mastócitos, bem como as células H-RS,
freqüentemente presentes em cerca de apenas 1% das células no tumor. Há
evidências de que muitas dessas células são ativamente atraídas por células H-RS.
Por exemplo, Células H-RS secretam CCL5 (RANTES), CCL17 (TARC) e CCL22,
que atraem células Th2 e células T regulatórias (Treg) (B. F. & Mak, 2002; Aldinucci
et al, 2008). A secreção de IL-5, CCL5, CCL28 e o fator estimulante de colônia
granulócito-macrófago pelas células H-RS, presumivelmente, causa o recrutamento
de eosinófilos para o microambiente do LH (B. F. & Mak, 2002). O CCL5 também
atrai mastócitos e as células H-RS secretam IL-8 que atrai neutrófilos (B. F. & Mak,
2002). Notavelmente, as quimiocinas estão não apenas envolvidas na atração de
outras células para o microambiente do LH, como também possuem efeitos diretos
na sobrevivência e proliferação de células H-RS, como foi recentemente mostrado
para CCL5 (Aldinucci et al, 2008).
Há evidências de que o recrutamento de células inflamatórias no
microambiente do linfoma é essencial para a sobrevivência das células H-RS.
Diversas observações indicam que células H-RS são dependentes de sinais de
sobrevivência recebidos por outras células: é difícil controlar o crescimento de
células H-RS em cultura; estas células H-RS não sobrevivem em ratos
imunodeficientes; Células H-RS são raramente encontradas no sangue periférico e,
27
mesmo quando elas metastizam em órgãos não linfóides, elas são embutidas em
seu típico microambiente (Kapp et al, 1999).
As células H-RS também orquestram seu microambiente celular para evitar
um ataque por células T citotóxicas ou células NK. Uma fração considerável de
infiltrado de células T CD4 são células Treg, que apresentam atividade
imunossupressora no infiltrado de células T citotóxicas do LH (Marshall et al 2004;
Gandhi et al, 2006). A presença de uma grande população de células Treg no
microambiente do LH é estabelecida não apenas por atração mediada por
quimiocinas destas células, mas também por indução da diferenciação de células T
CD4 virgens em Treg pelas células H-RS (Tanijiri et al, 2007).
Um alto número de células Treg no microambiente tumoral, foi relacionada a
um bom prognóstico, indicando que células Treg também podem apresentar alguma
atividade supressora em células H-RS ou em outras células inflamatórias que
apóiam a sobrevivência e ou proliferação de células H-RS (Alvaro et al, 2005; Kelley
et al, 2006). Estas células podem também modular seu microambiente celular pela
mudança da resposta Th, a partir de uma resposta Th1 anticelular, para uma
resposta Th2 humoral, freqüentemente com atividade promotora de tumor (Tan et al,
2007). Células H-RS também produzem citocinas imunossupressoras, IL-10 e TGF-β
e galectina 1 e prostaglandina E2, que inibem funções efetoras de células T
(Juszczynski et al, 2007; Skinnider et al, 2002; Gandhi et al, 2007). Além disso, as
funções efetoras de células T são inibidas pela ligação da Proteína de Morte Celular
programada (PPD1) em células T para o ligante PD1, que é expresso por células H-
RS (Chemnitz et al, 2007; Yamamoto et al, 2008) (Figura 8).
Contudo, há pouca evidência para uma associação mais próxima do
desenvolvimento do LH com doenças autoimunes ou infecções crônicas. Assim
parece ser mais provável que no Linfoma de Hodgkin a resposta inflamatória típica
freqüentemente se desenvolva junto com a geração de células H-RS malignas
(Bräuninger et al, 1997;Klein et al, 1998; Irsch et al, 2001; Martin- Subero et al,
2002).
28
2.3 EBV
2.3.1 Caracterização do EBV
O vírus Epstein-Barr (EBV) é um dos membros mais extensivamente
caracterizados membros da subfamília Gamma herpesvírus. Esta subfamília inclui
dois gêneros o gamma-1 herpesvírus, ou linfocriptoviridae (LCV), e o gamma-2
herpesvírus, ou rhadnoviridae (RV). O LCV é encontrado somente em primatas, com
o EBV sendo o único representante que infecta humanos. O gamma-2 herpesvírus,
ou rhadnoviridae (RV), infecta tanto primatas quanto mamíferos em geral. O
Sarcoma de Kaposi associado ao herpesvírus (KSHV) é o único RV conhecido que
infecta humanos (Kutok e Wang, 2006) . Apesar de muitos vírus terem sido
Figura 8. Interação das células H-RS com as células do microambiente tumoral.
Adaptado de Schmitz et al, 2009.
29
identificados inicialmente por causa de doenças agudas, o EBV foi descoberto por
causa do seu isolamento a partir de uma célula tumoral, a célula do Linfoma de
Burtkitt – LB (Kutok e Wang, 2006). Denis Burkitt, cirurgião inglês, durante uma
missão na África Equatorial, foi o primeiro a descrever essas células B agressivas de
Linfoma no final dos anos 1950, início de 1960 (Burkitt e O´Connor, 1961; Burkitt,
1962).
Com base na distribuição climática e geográfica deste linfoma, à medida que
aumentava a incidência desta neoplasia em crianças na África, Burkitt suspeitou que
a sua etiologia pudesse ser ambiental ou infecciosa, mas ele não conseguiu
identificar o agente envolvido (Burkitt, 1962; Burkitt & Wright, 1966). Esse dado não
foi descoberto até o final do ano de 1964 quando Anthony Epstein, em parceria com
seus colegas Yvonne Barr e Bert Achong, obtiveram êxito na identificação em cultura
de células de linfoma de pacientes com LB e identificaram partículas de herpervírus
nessas células por microscopia eletrônica (Epstein, 1964; Epstein e Barr, 1964).
Como outros herpesvírus, o EBV apresenta duas formas de infecção: (1)
lítica, relacionada à infecção primária, e a (2) latente, relacionada à manutenção do
vírus nos indivíduos infectados e, algumas vezes, associada com cânceres humanos
(Figura 9). Além disso, a mudança de infecção latente para lítica é necessária para a
replicação do vírus e a sua propagação entre indivíduos (Cohen, 2000). O vírus
estabelece uma infecção persistente em células B e continuamente reativa-se para
produzir partículas virais para a sua transmissão (Kieff & Rickinson, 2006).
30
A coexistência harmônica entre vírus e hospedeiro é o resultado de uma
longa história com adaptação mútua, baseado na variação na expressão gênica em
diferentes tipos de células infectadas e a resposta imune do hospedeiro,
cuidadosamente ajustada (Klein et al, 1998).Em países em desenvolvimento, a
infecção primária com EBV ocorre entre alguns meses e alguns poucos anos após o
nascimento, e a soroconversão quase universal ao redor dos seis anos de idade
(Chabay et al, 1999; Chang et al, 2005). Inversamente, em países industrializados, a
infecção por EBV ocorre na maior parte das vezes durante a segunda ou terceira
década de vida. A infecção pediátrica por EBV é freqüentemente assintomática, mas
ocasionalmente pode causar Mononucleose Infecciosa, uma desordem
linfoproliferativa benigna (Kimura et al, 2000). O EBV é considerado um agente
carcinogênico humano, visto que está associado com malignidades como o Linfoma
de Burkitt, Linfoma de Hodgkin e Carcinoma Nasofaringeal indiferenciado (Kieff &
Rickinson, 2006).
Figura 9: Esquema com a comparação das principais características dos ciclos líticos e lisogênicos de infecção pelo EBV. Adaptado de Kutok e Wang (2006).
31
2.4.2 EBV e LH
O reconhecimento de uma associação da mononucleose infecciosa com o LH
pré-data a descoberta do EBV e a atual compreensão é de que a doença possui
uma identidade maligna de células da linhagem B. Nos últimos anos, a compreensão
desta associação avançou consideravelmente. Existem novas percepções sobre a
mononucleose infecciosa e sobre a perturbação da imunidade celular, novas
percepções relacionadas com o papel que o vírus exerce na patogênese molecular
do LH, nova abordagem em relação ao aumento da incidência do LH nos indivíduos
HIV positivos e sua relação com a supressão imune, e novas técnicas para o
monitoramento clínico e terapia (Ambinder, 2007). Os linfomas associados ao EBV
são caracterizados por uma marcada variabilidade geográfica em relação às
características clínicas e etiopatogênicas (Hsu e Glaser, 2000), principalmente os
linfomas pediátricos, dos quais o linfoma de Burkitt (LB) e o de Hodgkin (LH) são os
mais importantes, não somente por causa de suas freqüências, mas também devido
aos modelos biológicos que representam.
A compreensão de como a biologia básica do EBV atua no LH pode gerar
novas estratégias terapêuticas para pacientes de LH EBV+ (Gandhi, 2004). Além
disso, a identificação do papel deste agente na etiologia do LH e a presença dos
antígenos EBV latentes em células malignas, podem representar um alvo para
imunoterapia celular (Khanna et al, 2001).
A infecção pelo EBV está associada com aproximadamente 30 - 50% dos
casos de LHc, mais freqüentemente com o subtipo celularidade mista. Este subtipo é
mais comum em homens e demonstra distribuição etária bimodal (<10 e >50 anos
de idade) (Kutok e Wang, 2006). Além disso, o LH na infância, particularmente nos
menores de 10 anos, parece ser uma doença predominantemente EBV+ tanto em
países desenvolvidos, quanto em países em desenvolvimento (Armstrong et al,
1993). Estudos recentes sugerem que parece ser improvável que casos de LH não
associados ao EBV tenham implicação com outros vírus oncogênicos e a etiologia
da doença nestes casos, ainda precisa ser esclarecida (Jarret, 2002; Gallagher et al,
2002).
Nos casos de LH EBV+, a infecção latente de um linfócito B pelo vírus é
aceita como um evento transformante primário. Apesar do vírus EB normalmente
persistir como um agente infeccioso inofensivo e adaptar-se ao desenvolvimento em
32
uma célula B, ele pode ter influência direta no processo de diferenciação destas
células. O EBV pode substituir os sinais de sobrevivência normalmente gerados pelo
receptor de células B (BCR) durante a reação do centro germinativo, e circunscrever
o caminho apoptótico normal, permitindo a sobrevivência de células B deficientes em
BCR (Küppers, 2003). O EBV fornece uma importante resposta para recuperar os
precursores de células H-RS da apoptose.
Atualmente, acredita-se que as citocinas produzidas por células H-RS
contribuem para a patogênese do LH, atuando como fatores de crescimento
autócrino, bem como ao iniciar e sustentar o infiltrado inflamatório dentro do tumor.
Alternativamente, citocinas produzidas por células inflamatórias podem também
apoiar a proliferação e sobrevivência de células H-RS (Skinnider & Mak, 2002;
Maggio et al, 2002).
2.4.3 EBV e produção de IL-10
A IL-10 altera o balanço Th1-Th2 em direção ao perfil humoral (Th2), inibindo
células T citotóxicas e estimulando a proliferação e diferenciação das células B (Opal
& DePalo, 2000). Alguns estudos relatam que os haplótipos definidos pelos SNPs no
promotor do gene da IL-10 podem estar associados com diferentes níveis de
produção de IL-10. De fato, a combinação do haplótipo GCC/GCC foi associada com
alta produção de IL-10; GCC/ATA, GCC/ACC e GTA/ACC foram associados com
expressão intermediária, enquanto que ATA/ATA, ATA/ACC e ACC/ACC foram
associados com baixa expressão de IL-10 (Suarez et al, 2003). Alguns autores têm
sugerido que o alelo -1082G é o mais importante fator genético na regulação da alta
produção constitutiva de IL-10 (Pelletier et al, 2000; Tambur et al, 2001).
Apesar da ampla distribuição do EBV em populações humanas, a presença
de genoma viral restrito às células H-RS nos casos de LH, sugere um papel chave
do EBV no desenvolvimento desta neoplasia maligna (Küppers, 2003). Em países
ocidentais, aproximadamente 50% dos casos de LH clássico são EBV positivo. O
subtipo esclerose nodular é EBV positivo em 15 a 30% dos casos, ao passo que a
freqüência da infecção viral no subtipo de celularidade mista pode alcançar até 70%
dos casos. Além disso, mais de 90% dos casos de LH clássico foram relatados como
EBV positivos em alguns países em desenvolvimento (Glaser et al, 1997).
33
Variações genéticas que perturbam o balanço entre citocinas anti-
inflamatórias e pró-inflamatórias provavelmente contribuem para desregulação
observada em pacientes com LH. O turnover anormal de algumas citocinas pode
não apenas aumentar a proliferação e sobrevivência de células H-RS, mas também
pode contribuir para a falha da resposta imune do hospedeiro contra elas. Então, o
perfil global de citocinas em indivíduos com LH, produzido por células H-RS ou
células inflamatórias não neoplásicas, pode explicar a presença e manutenção de
uma resposta imune falha contra células malignas (Papadaki & Stamatopoulos,
2003). Além disso, o EBV codifica um homólogo da IL-10 humana que pode ser
importante para modular o sistema imune e permitir a infecção viral permanente. A
proteína BCRF1 (também conhecida como IL-10 viral, vIL-10 compartilha 84% de
similaridade com a IL-10 humana). A vIL-10 pode imitar a atividade da IL-10 humana
inibindo a síntese de Interferon Gama (IFN- γ) pelas células mononucleares do
sangue periférico in vitro. Como o IFN- γ inibe o crescimento de células infectadas
com EBV in vitro, a expressão do IL-10 pode promover evasão imune viral durante
infecção aguda por EBV ou reativação viral a partir de células infectadas
latentemente (Jarret, 2002).
Huang et al (2005) sugeriram que os polimorfismos no promotor do gene da
IL-10 que estão associados com baixa produção da proteína, podem ser
responsáveis pelo aumento na suscetibilidade a linfomas. Abbas et al, 2005,
relataram que pacientes com hepatite C que produzem altos níveis de IL-10
apresentam menos injúria hepatocelular e menor habilidade de controlar infecções
enquanto que pacientes com baixa secreção de IL-10 apresentam uma maior
habilidade para eliminar a infecção. É possível que a baixa produção de IL-10 possa
desviar o sistema imune para a resposta do tipo Th1, facilitando a limpeza da carga
viral nesses casos. Da Silva et al, 2007, encontraram uma frequência mais alta de
genótipos -1082GG em pacientes com LH EBV+. Devido ao fato de que este
genótipo foi relatado como conferindo uma alta produção de IL-10, este resultado
sugere que LH EBV + provavelmente aparece em um cenário onde ocorrem altos
níveis de síntese de IL-10 .
Dukers et al (2000), relataram mais altos níveis de IL-10 em casos de LH
esclerose nodular comparado com casos EBV-. Neste estudo, os autores não
observaram a expressão BCRF1 (EBV vIL-10) ao nível do mRNA. Por outro lado,
Munro et al (2003), não encontraram associação significante entre a presença de
34
polimorfismos no promotor do gene da IL-10 e os fenótipos entre os subtipos
histológicos de LH. Bohlen et al (2000) estudou 73 pacientes com LH e relatou uma
correlação entre níveis elevados de IL-10 e idade do paciente mais velho (maior que
45 anos).
35
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Investigar a distribuição dos polimorfismos proximais (-A592C, C819T e
G1082A) do promotor do gene da IL-10 e verificar se existe associação com a
susceptibilidade para o LH na infância, bem como a possível associação com os
grupos de pacientes EBV+ e EBV- .
3.2. Objetivos Específicos
1. Determinar as freqüências genotípicas das variantes polimórficas proximais
do promotor da IL-10:-1082(G/A), -819(C/T) e - 592(C/A), em crianças com
Linfoma de Hodgkin e em indivíduos saudáveis;
2. Determinar o perfil haplotípico para os polimorfismos do gene da IL-10 dos
indivíduos e verificar se estão associados ao LH;
3. Determinar a presença do EBV nas células tumorais através de métodos in
situ, verificando a existência de associação entre os genótipos e/ou
haplótipos com do promotor da IL-10 com os subgrupos de linfomas EBV+ e
EBV -.
36
4. Materiais e Métodos
4.1. Desenho Experimental O presente estudo foi do tipo analítico, de corte transversal com comparação de grupos. 4.2. Local de Estudo O local de estudo foi o Laboratório de Biologia Molecular do
CEONHPE/HUOC e os estudos de hibridização in situ para detecção do EBV
(EBER-ISH) foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular do Centro de
Transplante de Medula Óssea – CEMO do Instituo Nacional do Câncer - INCa.
4.3. Período de Estudo
As análises foram realizadas entre Fevereiro de 2008 a Novembro de 2009.
4.4. Critérios para Inclusão de Pacientes e Controles
Os critérios para inclusão dos pacientes envolvidos nesta pesquisa foram:
diagnóstico positivo para o LH clássico, com confirmação clínica e histológica, sem
tratamento prévio, e idades entre 0 e 18 anos, atendidos no Centro de
Oncohematologia Pediátrica de Pernambuco (CEONHPE) do Hospital Universitário
Osvaldo Cruz (HUOC). Ao todo, foram analisadas amostras de 64 indivíduos
diagnosticados com LH. O grupo controle foi composto por 131 indivíduos
saudáveis, sem presença de histórico de câncer e/ou doenças de caráter
imunológico confirmada, com idades entre 0 e 18 anos à coleta, oriundos do estado
de Pernambuco.
4.5. Coleta de Material Biológico
O material biológico utilizado neste estudo foi o sangue periférico, coletado por
punção intra-venosa em tubo a vácuo contendo anticoagulante (EDTA). O sangue
periférico foi acondicionado e armazenado em freezer a –80° C para a extração
posterior de DNA. Este só pode ser utilizado exclusivamente para fins de pesquisa e,
quando necessário, para complementar o diagnóstico do paciente.
37
4.6. Aspectos Éticos
Todos os pacientes receberam informações claras e suficientes sobre a
natureza e objetivos deste estudo e, foram incluídos nele após a assinatura do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Este estudo foi desenhado de acordo
com o Código Brasileiro de Ética Médica (1988), a declaração de Helsinque (1986),
e as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres
Humanos (Resolução 196/1996 do Conselho Nacional de Saúde). A privacidade dos
pacientes é garantida durante e depois de finalizado o estudo. Este trabalho foi um
subprojeto da pesquisa “Estudos celulares e moleculares dos linfomas pediátricos associados ao vírus Epstein-Barr (EBV)”, aprovada pelo Conselho
Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP). Anexo 01.
4.7 Métodos de Extração 4.7.1 Extração de DNA de Sangue Total
O método utilizado foi o “salting out”, adaptado de Miller et al. (1988), o qual
possui basicamente quatro etapas: a primeira etapa consiste na limpeza do material
com tampão para lise da membrana, onde foi adicionado 1mL da solução em 300μL
de sangue total. O material foi homogeneizado por inversão do tubo e o mesmo foi
incubado à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, centrifugou-se
o material a 13.000 rpm por 4 minutos e em seguida descartou-se o sobrenadante.
Essa etapa foi repetida duas vezes ou mais, a fim de purificar o material. A segunda
etapa consistiu na desnaturação da membrana nuclear, onde foi adicionado ao tubo
200μL de solução de lise de núcleo e 50μl de dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%,
com agitação vigorosa, e posterior incubação por 10 minutos à temperatura
ambiente. Em seguida, adicionou-se mais 150μL de solução de lise de núcleo. A
terceira etapa consistiu na digestão protéica do material utilizando o complexo
proteinase K (20mg/mL), adicionando-se 10μL da mesma e incubando em banho-
maria a 65ºC por 2 horas ou a 37ºC por 24 horas. Após esse tempo, foi
acrescentado ao material, 175μl de NaCl 5,3M e o mesmo centrifugado a 13.000
rpm por 15 minutos. Posteriormente, transferiu-se o sobrenadante para outro tubo. A
38
quarta e última etapa consistiu na precipitação do material por etanol. Foi adicionado
1 ml de etanol 100%, homogeneizou-se o tubo por inversão e centrifugou-se a
13.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e adicionou-se ao pellet
de DNA 1 ml de etanol 70%. Em seguida uma nova centrifugação foi realizada a
13.000 rpm por 2 minutos e, finalmente, o sobrenadante foi descartado e, ao pellet,
adicionou-se 150μl de solução de reidratação TE (tris 10mM e 1 mM de EDTA; pH
8,0).
4.8. Detecção dos SNPs – PCR alelo-específico
A genotipagem por AS-PCR (Cavet et al,1999) realiza-se com duas reações
em paralelo. Um dos iniciadores é comum para ambas as reações e o outro é
desenhado em duas versões que diferem no nucleotídeo situado na extremidade 3´,
possibilitando a discriminação entre as variantes alélicas. As seqüências dos
iniciadores utilizadas para a genotipagem das posições -1082 e -592 encontram-se
descritas na tabela 4. As reações finais de genotipagem para ambos os SNPs foram
realizadas em volumes finais de 30 µl, com 30 ciclos e temperatura de anelamento de
60°C para o SNP-592 e 59°C para o SNP-1082.
As reações de PCR continham tampão de reação 10 mM KCl, 50 mM Tris-HCl
(pH 8,3), 0,2 mM de cada dNTP, 0,33 µM de cada oligonucleotideo iniciador e 1U
de Taq Polimerase Platinum (Invitrogen). Foram usados 50 ng de DNA genômico
como substrato para as reações de PCR. Os produtos das reações de AS-PCR foram
visualizados em géis de agarose 2% corados com brometo de etídeo. O tamanho
esperado dos produtos de amplificação variou entre 139pb para posição -1082 e
223pb para a posição – 592.
39
Tabela 4: Seqüência dos Iniciadores usados nas reações de genotipagem por AS-PCR.
4.9. Detecção dos Haplótipos Proximais da IL-10
Para a determinação dos haplótipos foi utilizada uma abordagem
experimental, para que as combinações que compõem os haplótipos proximais no
promotor gênico IL-10 pudessem ser definidas no par de cromossomos homólogos
dos indivíduos analisados. Isto foi possível devido ao desequilíbrio de ligação entre
as posições -819 e -592. Como esses polimorfismos arranjam-se linearmente em um
mesmo cromossomo, três AS-PCRs cruzadas foram realizadas simultaneamente
utilizando-se diferentes combinações de iniciadores para as posições -1082A/G, -
819C/T e -592C/A (Moñux-Ducajú et al, 2006). Estas combinações foram: -1082A
com -592C; -1082A com -819T e -1082G com -819C a fim de se amplificar
fragmentos relativos aos haplótipos ACC, ATA e GCC, respectivamente (Figura 10).
A separação, e análise dos produtos, foi realizada por eletroforese em gel de
agarose a 2%. Os fragmentos produzidos foram de 490pb para o haplótipo ACC e
263pb para os haplótipos ATA e GCC.
Iniciador Seqüência 3´ 5´ Função na reação
-1082 G/A
JWF AGCAACACTCCTCGTCGCAAC
5`conservado
B1 CCTATCCCTACTTCCCCC Alelo específico: G
B2 CCTATCCCTACTTCCCCT Alelo específico: A
-592C/A
-592 GTGACGTGGACAAATTGCCCATTC 5`conservado
592A ACACATCCTGTGACCCCGCCTGTA Alelo específico: A
592C ACACATCCTGTGACCCCGCCTGTC Alelo específico: C
40
As reações foram realizadas em um volume final de 25 µl, com 17,4 µL do
tampão de reação (10 mM KCl, 50mM Tris-HCl pH 8,30), 1µL de MgCl2 (50mM), 1µL
de dNTP (5mM), 1,5µL de cada iniciador (10pmol/µL), 0,1µL de Taq Platinum (5U) e
1µL de DNA. Foram realizadas duas reações independentes, com as combinações
iniciadoras para ACC, ATA e GCC, respectivamente, mostradas na tabela 5. As
sequências iniciadoras de cada posição da haplotipagem experimental estão
dispostas na tabela 6.
Tabela 5: Combinações de Iniciadores para cada haplótipo experimental.
Iniciadores Haplótipo Tamanho Esperado
-1082 A –592C ACC 490 pb
-1082 A –819T ATA 263 pb
-1082 G –819C GCC 263 pb
As condições de ciclagem foram padronizadas para: desnaturação a 95oC por
5 minutos, seguida de 2 ciclos de 95oC por 20 segundos, 65°C por 30 segundos e
72°C por 30 segundos, 2 ciclos de 95oC por 20 segundos, 64°C por 30 segundos e
72°C por 30 segundos, 2 ciclos de 95oC por 20 segundos, 63°C por 30 segundos e
Figura 10: Esquema didático das combinações utilizadas na Haplotipagem Experimental.
41
72°C por 30 segundos, 24 ciclos de 95oC por 20 segundos, 62°C por 30 segundos e
72°C por 60 segundos e por fim 72°C por 10 minutos . Os produtos de PCR foram
avaliados em géis de agarose 2% corados com brometo de etídeo.
Tabela 6: Sequências dos Iniciadores usados na haplotipagem experimental.
4.10. Análise do EBV A infecção pelo EBV foi também investigada nas amostras de tumor fixados e
incluídos em parafina (FIP), pela técnica de hibridização in situ, utilizando sondas
biotiniladas para o RNA EBER-1. Esta etapa do projeto foi realizada no INCa pelo
patologista Mário Magalhães. Descrição do método (Hassan et al, 2006):
a) Desparafinização dos cortes por incubação em xilol na estufa a 60°C por 30
minutos, seguida por 2 banhos em xilol de 10 minutos, cada um;
b) Hidratação dos cortes através de banhos sucessivos em etanol de concentração
descendente e água destilada (etanol 100%, etanol 95%, etanol 70%, água
destilada), durando cada banho 5 minutos;
c) Incubação dos cortes com proteinase K (20µg/ml) em câmara úmida e levadas por
15 minutos à estufa a 65º C para o bloqueio da fosfatase alcalina endógena. Após
este tempo, as lâminas foram incubadas em estufa a 37º C por 2 horas;
f) Após a hibridização, as lâminas foram lavadas em TBS 0,1% Triton X-100, três
banhos de 3 minutos cada um, e acondicionadas em câmara úmida. O bloqueio de
Posição Sequência Iniadora
1082G 5´-CTACTAAGGCTTCTTTGGGAG-3´
1082A 5´-CTACTAAGGCTTCTTTGGGAA-3´
819T 5´-GCAAACTGAGGCACAGAGATA-3´
819C 5´-CAAACTGAGGCACAGAGATG-3´
592C 5´-CCAGAGACTGGCTTCCTACAGG-3´
42
hibridização inespecífica foi realizado por incubação com 100µl de solução
bloqueante (TBS 0,1%; Triton X-100; BSA 3%) por 10 minutos a temperatura
ambiente;
g) O anticorpo anti-FITC conjugado com fosfatase alcalina (diluição 1:200 em
solução bloqueante) (Kit de Hibridização in situ para o vírus Epstein-Barr,
Novocastra), foi adicionado (100 µl) e incubado por 20 minutos. As lâminas foram
lavadas duas vezes em TBS, por 3 minutos, seguido de incubação em solução de
fosfatase alcalina (pH 9,0) por 5 minutos;
h) Detecção: Aplicou-se 100 µl de solução de detecção preparada no momento (1ml
de solução de fosfatase alcalina, 8 µl do BCIP/NBT, 1 µl de Levamisole) (Kit de
Hibridização in situ para o vírus Epstein-Barr, Novocastra).
Posteriormente, os cortes foram cobertos por lamínulas e a incubação procedeu por
16 horas à temperatura ambiente, em câmara úmida e escura;
m) Após a incubação com a solução de detecção, as lâminas foram lavadas em
água corrente por 5 minutos. Em seguida, as lâminas foram colocadas em solução
de hematoxilina de Harris por 30 segundos, sendo posteriormente lavadas em água
corrente por 5 minutos;
n) Desidratação das lâminas através de banhos sucessivos em álcool de
concentração ascendente (etanol 70%, etanol 100%, por 5 minutos), seguido por
banho em xilol por 5 minutos;
Utilizou-se para cada reação, como controle positivo, uma lâmina contendo corte de
linfoma de Burkitt EBV-positivo. A reação foi considerada positiva quando se
observou a marcação nuclear acastanhada. Os casos foram considerados positivos
para o EBV quando qualquer uma das células H-RS exibissem a marcação nuclear.
4.11 Análise dos Resultados
O presente estudo foi do tipo caso-controle com amostras independentes
constando de dados nominais (genótipos). As prevalências dos genótipos foram
estimadas pelo teste do qui-quadrado (χ2) de aderência. As frequências alélicas
foram estimadas pelo método de contagem gênica. A análise da hipótese do
equilíbrio genético de Hardy-Weinberg e a heterogeneidade entre os pacientes e
uma amostra controle foram testados pelo Qui-quadrado (χ2). A existência de
associações entre variáveis categóricas foi realizada utilizando o teste de χ2, de
43
acordo ao tamanho das amostras. A magnitude dessas associações foi estimada
com o cálculo da odds ratios (OR) utilizando intervalos de confiança de 95%. Para
estas análises foi utilizado o programa Bioestat versão 5.0.
44
5. Resultados
No presente estudo foi investigada a presença de alelos, genótipos e
haplótipos no promotor do gene da IL-10, que pudessem ter possível associação
com o LH em relação a um grupo controle de indivíduos saudáveis. Com a
finalidade de obter o perfil clínico dos pacientes deste estudo, foram avaliados os
seguintes aspectos: prevalência do subtipo histológico, estadio da doença,
presença ou ausência de sintomas, falha no tratamento (sumarizados na tabela 7),
sexo e idade.
Tabela 7. Características Clínicas dos Pacientes de Linfoma de Hodgkin
analisados.
O subtipo depleção linfocitária não foi encontrado nesta amostra.
Variáveis (N=64) Número %
Tipo Histológico
Esclerose Nodular
Celularidade Mista
Rico em Linfócitos
29
24
11
45
38
17
Estadio
I / II
III / IV
35
29
54
46
Sintomas B Sim
Não
46
18
72
28
Falha no Tratamento Sim
Não
43
21
33
67
45
Na análise dos polimorfismos proximais da IL-10 nas posições -1082 e -592
os produtos amplificados apresentam fragmentos de 139 e 223 pb, respectivamente,
como mostrados na figura 11.
Figura 11: Perfil eletroforético do produto amplificado da posição -1082. Gel de
Agarose a 2%, com fragmentos amplificados de 139 pb. Ladder de 100pb. CN =
Controle Negativo (água e mix de PCR) e Lad.= Ladder (marcador de peso
molecular).
Na tabela 8 apresenta-se a distribuição genotípica dos indivíduos
participantes deste estudo avaliados para os polimorfismos do promotor do gene da
IL-10. Ao todo, foram genotipados 195 indivíduos, sendo 64 pertencentes no grupo
de casos e 131 no grupo controle.
Na análise da distribuição dos genótipos para o polimorfismo -1082 entre
pacientes e controles foi demosntrada diferença estatisticamente significante (χ2 =
9,95 p = 0,007); Assim como a distribuição dos genótipos para os polimorfismos -819
e -592 entre os pacientes e controles (χ2= 9,7 p = 0,008).
139 pb
46
Tabela 8: Distribuição genotípica dos polimorfismos do gene da IL-10 no grupo de pacientes e controles.
Genótipos
(-1082)
N de Casos
(%)
p N de Controles
(%)
OR p 95%IC p
AA 23 (36%) 0,0320 49 (37%) 1 0,0305 Ref. NA AG 37 (58%) 52 (40%) 2,08 1,134-3,820 0,0256 GG 4 (6%) 30 (23%) 0,22 0,075-0,66 0.006*
GG/AG
41 (64%) 82 (63%) 1,065 0,572-1,982 0,967
(-592/819) CC 25 (39%) 0,0274 52 (40%) 1 0,0438 Ref. NA AC 36 (56%) 52 (40%) 1,953 1,066-3,578 0,0425 AA 3 (5%) 27 (21%) 0,19 0,05 – 0,65 0,007*
AA/AC 39 (61%) 79 (60%) 1,026 0,556-1,893 0,943 OR= Odds Ratio; IC= Intervalo de confiança; O primeiro valor de p corresponde à significância da comparação do genótipo. O segundo p= índice de significância.
Para o polimorfismo da IL-10 na posição -1082, indivíduos com o genótipo
GG apresentam 4,45 vezes menos chances de desenvolver LH do que os indivíduos
com os demais genótipos (OR = 4,45, IC95% = 1,5-13,3 p = 0,007). Para os
polimorfismos da IL-10 nas posições -819 e -592, indivíduos com os genótipos -
819TT e -592AA apresentam 5,27 vezes menos chances de desenvolver LH do que
os demais genótipos (OR = 5,27, IC95% = 1,53-18,1 p = 0,008).
Na análise dos haplótipos os produtos amplificados apresentam 490 e 263 pb
para ACC e ATA/GCC, respectivamente, como mostrado na figura 12.
Figura 12: Perfil eletroforético dos produtos amplificados dos haplótipos ACC, ATA e
GCC em gel de agarose 2% corado com Brometo de Etídio.
490 pb
263 pb
47
De acordo com o desequíbrio de ligação apresentado entre as posições -592
e -819, somente três haplótipos são representados: ATA, ACC e GCC. No grupo de
pacientes a freqüência do haplótipo ATA foi de 33%, ACC, 32% e o GCC foi de 35%.
Entre os indivíduos do grupo controle, a freqüência dos haplótipos ATA, ACC e GCC
foi de 40,5%, 16,8% e 42,7%, respectivamente. A distribuição destes haplótipos
entre pacientes e controles apresentou diferença estatisticamente significante (χ2 =
11,7 p = 0,003). Indivíduos com o haplótipo ACC apresentaram risco 2,33 vezes
maior de desenvolver LH (OR= 2,33 IC95% 1,41-3,82 p = 0,001) em relação aos
demais haplótipos. Com relação à distribuição dos haplótipos combinados possíveis,
entre os pacientes e entre os controles, as freqüências dos haplótipos estão
representadas na tabela 9.
A distribuição dos haplótipos combinados entre pacientes e controles
apresentou diferença significativamente significante com χ2 = 22,8 p = 0,0004. Na
população analisada, a chance de os indivíduos desenvolverem LH é cerca de 5
vezes menor em portadores do haplótipo ATA/ATA (OR= 5,278 IC 95% 1,538 –
18,123 p= 0,007) e cerca de 4,5 vezes menor nos portadores do haplótipo
GCC/GCC (OR= 4,455 IC 95% 1,496 – 13,266 p= 0,007) em relação aos demais
haplótipos.
Os indivíduos com o haplótipo ACC/ACC, nesta população, apresentam cerca
de 3 vezes mais chance de desenvolver LH em relação aos demais haplótipos
combinados (OR= 3,28 IC95% 1,18 – 9,07 p= 0,03).
Tabela 9: Distribuição dos haplótipos do promotor do gene da IL-10 no grupo de casos e controles e o risco de LH.
Haplótipo Combinado χ2 = 22,8 p= 0,0004; Haplótipo isolado χ2 = 11,71 p=0,003
Quanto ao status do EBV, a análise pôde ser realizada em apenas 19 dos 64
pacientes. Das amostras analisadss quanto a situação do EBV, 7 apresentaram
Distribuição dos Haplótipos do Promotor do Gene IL-10 Pacientes n (%) Controles n (%) OR IC p ATA/ATA 3(4,7) ATA/ATA 27(20,6) 0,189 0,05-0,65 0,007 ACC/ATA 10(15,6) ACC/ATA 15(11,5) 1,43 0,6-3,39 0,55 ACC/ACC 10(15,6) ACC/ACC 7(5,3) 3,28 1,18-9,07 0,03 GCC/GCC 4(6,3) GCC/GCC 30(22,9) 0,224 0,075-0,663 0,007 ATA/GCC 26(40,6) ATA/GCC 37(28,2) 1,73 0,928-3,25 0,115 ACC/GCC 11(17,2) ACC/GCC 15(11,5) 1,6 0,690-3,72 0,377
48
positividade, enquanto que 12 indivíduos mostraram-se negativos para a presença
do vírus. As distribuições genotípicas e haplotípicas em relação ao status do EBV
estão representadas na tabelas 10.
Tabela 10: Distribuição haplotípica e genotípica em relação ao status do EBV no
pacientes de Linfoma de Hodgkin.
Ditribuição Haplotípica e Genótipa em Relação ao Status do EBV Haplótipo EBV + n (%) EBV- n (%) Genótipo EBV + n EBV- n
ACC 3 (15,79) 4 (21,05) -1082 ATA 2 (10,52) 5 (26,68) AA 4 5 GCC 2 (10,52) 3 (18,42) AG 3 7
ACC/ATA 3 (42,85) 3 (25) -592 ACC/ACC 0 (0,0) 2 (16,66) CC 3 3 ACC/GCC 1 (14,3) 6 (50) AC 4 9 ACC/GCC 3 (42,85) 1 (8,33)
49
6. Discussão
As citocinas agem de forma complexa, coordenada e a IL10 tem como
principal in vivo limitar a resposta inflamatória. Entre 50 e 75% da variabilidade
observada da secreção de IL-10 é explicada geneticamente, a outra parte por
fatores ambientais (Westendorp et al, 1997; Reuss et al, 2002). No grupo de
indivíduos controle avaliado no presente trabalho, o SNP na posição -1082
apresentou maior prevalência do genótipo AA, em 37% dos indivíduos. Existe um
consenso na literatura no que se refere a este polimorfismo estar associado a baixos
níveis séricos de IL-10 (Turner et al, 1997). Na população analisada, a distribuição
genotípica apresentou prevalência de 58% para o genótipo heterozigoto -1082AG. O
estudo realizado com câncer renal, por López et al, 2009, mostrou um resultado
semelhante, indicando prevalência do heterozigoto AG na posição -1082 em cerca
de 50% dos casos analisados (López et al, 2009).
O genótipo GG, na mesma posição, mostrou uma freqüência de 6%,
representando uma taxa de 4,45 vezes menos chances de desenvolver LH do que
os indivíduos com os demais genótipos (OR = 4,45, IC95% = 1,5-13,3 p = 0,007).
Lech-Maranda et al (2004), em seu estudo com Linfoma de células B difusas (a
forma mais freqüente de LNH na América do Norte e na Europa Ocidental),
apresentou resultado semelhante ao encontrado neste trabalho, sugerindo que o
genótipo -1082GG pode ser um fator protetor nesta neoplasia (Lech-Maranda et al,
2004).
Por existir um forte desequilíbrio de ligação entre os SNPs das posições -592
e -819, os resultados encontrados a partir da posição -592 serviram como base para
a inferência dos dados na posição -819. Os resultados encontrados na distribuição
genotípica da posição -592 no grupo de controles apresentam-se de forma
homogênea com prevalência de 40% para os heterozigotos e homozigotos
selvagens. Esta distribuição apresenta-se em acordo com as populações estudadas
do Brasil (Moraes et al, 2003; Da Silva et al, 2007). No grupo de casos, a distribuição
genotípica para a posição -592 do promotor do gene da IL-10 apresenta prevalência
do genótipo heterozigoto de 56%; Para os polimorfismos -819 e -592, indivíduos
com os genótipos -819TT e -592AA apresentam 5,27 vezes menos chances de
desenvolver LH do que os demais genótipos (OR = 5,27, IC95% = 1,53-18,1 p =
50
0,007). Este dado apresenta similaridade com o encontrado por Langsenlehner,
onde foi avaliada a presença do SNP na posição -592 e associação ao câncer de
mama; sugere-se neste estudo que, o genótipo -592AA também apresenta risco
reduzido ao desenvolvimento de câncer de mama (Langsenlehner et al, 2005). O
resultado encontrado por Hohaus e colaboradores em 2007 apresenta o alelo A, na
posição em questão, como um fator de risco negativo para o prognóstico do LH; no
entanto o autor não consegue reproduzir o mesmo resultado em um estudo
subseqüente em que foi analisada a significância clínica dos polimorfismos do
promotor do gene IL-10 e os níveis sérios desta interleucina no LH (Hohaus et al,
2007; 2009).
O polimorfismo -819 apresenta-se em DL com o SNP de posição -592; -819C
e -592C são herdados em bloco, e o mesmo acontece com os SNPs -819T e -592A.
Juntos estes SNPs constituem os haplótipos GCC, ACC e ATA. O haplótipo GTA é
extremamente raro (Eskdale & Gallagher, 1995). Na amostra de controles analisada
a distribuição haplotípica apresentou prevalência do haplótipo GCC, com 42,7%. Dos
haplótipos combinados o que apresentou maior freqüência foi o haplótipo ATA/GCC
com 28,2%. Este resultado apresenta-se em sintonia com estudos de populações
caucasiana, onde existe uma prevalência do haplótipo GCC na população saudável
(Edwards-Smith et al, 1999; Constantini et al, 2002; Meenagh et al, 2002). No
entanto, este mesmo dado diverge dos estudos populacionais no Brasil, como no
estado do Rio de Janeiro e São Paulo, em que esse haplótipo apresenta baixa
prevalência (Moraes et al, 2003; Da Silva et al, 2007). Este resultado pode ser
devido ao tamanho continental do Brasil e da sua distribuição populacional bem
delineada, sugerindo assim que as populações do Nordeste e Sudeste brasileiros
podem ser, apesar da elevada miscigenação, geneticamente divergentes.
A análise estatística realizada no presente estudo entre os grupos de
pacientes e controles indicou que o haplótipo ACC apresenta risco 2,33 vezes maior
de desenvolvimento do LH (OR= 2,33 IC95% 1,41-3,82 p = 0,001) em relação aos
demais haplótipos. Tal resultado pode ser comparado com o encontrado por
Cunningham e colaboradores, onde este grupo associou o haplótipo ACC ao LNH
agressivo (Cunningham et al, 2003). Na população analisada, a chance de os
indivíduos desenvolverem LH é cerca de cinco vezes menor em portadores do
haplótipo combinado ATA/ATA e cerca de 4,5 vezes menor nos portadores do
GCC/GCC em relação aos demais haplótipos combinados. Os indivíduos portadores
51
da combinação haplotípica ACC/ACC, nesta população, apresentam cerca de 3
vezes mais chance de desenvolver LH em relação aos demais haplótipos
combinados.
Nos pacientes com LH, presume-se que os níveis de IL-10 tendem ao
aumento em relação aos indivíduos saudáveis, visto que a presença desta
interleucina é de fundamental importância para a manutenção do complexo
microambiente tumoral nesta neoplasia. O estudo realizado por Bogunia-Kubik et al,
sugere que o aumento da produção de IL-10 dentro do microambiente tumoral pode
apresentar valor de proteção e, reciprocamente,que baixos níveis de IL-10,
geralmente associado aos haplótipos ACC e ATA, estão relacionados com formas
mais agressivas nos Linfomas não-Hodgkin (Bogunia-Kubik et al, 2008). Os
resultados encontrados neste trabalho em relação aos polimorfismos da IL-10
corroboram a hipótese de que a presença desta interleucina está associada à
manutenção do microambiente tumoral estabelecido no LH, a proliferação de células
H-RS e que tais polimorfismos presentes no promotor do gene desta citocina podem
modulam sua produção afetando diretamente no desenvolvimento da doença
(Aldinucci et al, 2008).
Os dados do presente estudo sugerem ainda que a presença no alelo A na
posição -1082 quando associado aos alelos CC nas posições -819 e -592,
respectivamente, confere risco para os indivíduos, enquanto a presença deste
mesmo alelo -1082A, porém associado aos alelos T e A nas posições -819 e -592,
respectivamente, confere proteção aos indivíduos do grupo estudado. Na presença
do alelo -1082G, os únicos alelos possíveis, para esta população, são os -819C e o -
592C, e este conjunto alélico sugere proteção no grupo analisado. Isto pode indicar
que (com exceção do genótipo -1082GG, o qual na população estudada confere
proteção), os polimorfismos proximais do gene da IL-10 isolados, não influenciam no
aumento ou na diminuição do risco de desenvolvimento do LH. No entanto, as
combinações dos diferentes alelos nas três posições proximais do promotor podem
contribuir para o desenvolvimento do LH.
O EBV parece estar associado ao linfoma de Hodgkin em certos grupos
epidemiológicos particulares e a pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência
humana (HIV) (Zhou et al, 2001). Vários estudos mostraram a alta freqüência de
associação entre o EBV e o linfoma de Hodgkin pediátrico em distintos grupos
52
geográficos e sócio-econômicos (Armstrong et al, 1993; Leoncini et al, 1996; Zhou et
al, 2001; Jarrett et al, 2002).
Nos casos analisados quanto à presença do EBV, 63,2% dos pacientes de LH
apresentaram negatividade para o vírus, contra 36,8% que apresentaram
positividade. Estes resultados mostram se de acordo com o de Barros (2007) no
estudo com pacientes pediátricos (0-18 anos) com LH, do Rio de Janeiro, onde foi
descrita a prevalência de 47,7% nos casos EBV+. Indicando assim superioridade
dos casos EBV- tanto no atual estudo quanto no estudo descrito por Barros, e
apresentando também predominância de pacientes menores de 10 anos, 62,5%.
Quanto à distribuição genotípica dos indivíduos estudados e a presença do
EBV, nada se pôde concluir, pois a distribuição dos genótipos nas posições -1082 e
-592, não apresentaram diferenças significantes. Nos indivíduos EBV + houve
prevalência o haplótipo ACC, o mesmo descrito anteriormente como conferindo risco
aos pacientes com LH. No caso dos indivíduos EBV- houve uma leve predominância
do haplótipo ATA, que interessantemente, representa proteção nos indivíduos
analisados neste grupo. De acordo com Helminen et al, em um estudo com
indivíduos menores de 18 anos, mostraram que os mesmos quando apresentavam o
haplótipo ATA estavam relacionados com altos níveis séricos de IL-10 e a uma
infecção tardia na infância ou adolescência com EBV, sugerindo assim que o
haplótipo ATA poderia estar associado a proteção contra o vírus EB nesse grupo
(Helminen et al, 2001).
Em relação ao EBV, devido ao número reduzido de amostras analisadas, não
foi possível fazer qualquer inferência a respeito da influencia do vírus no
desenvolvimento do LH ou mesmo da associação do mesmo com os polimorfismos
proximais da IL-10. Entretanto, o presente trabalho pode sugerir que existe uma
associação entre os polimorfismos proximais da IL-10 no desenvolvimento da LH.
53
7. Conclusões
Os resultados deste estudo sugerem proteção na presença no alelo G na
posição -1082, com 4,45 vezes menos chances de desenvolver LH que os
demais genótipos para a mesma posição;
O genótipo homozigoto -592CC apresentou proteção neste grupo de estudo,
com 5,27 vezes menos chance de desenvolver LH, em relação aos genótipos
-592AC e 592AA;
No que diz respeito aos haplótipos proximais da IL-10, o haplóticpo ACC
sugere um risco de 2,3 vezes para o desenvolvimento de LH;
Os haplótipos combinados ATA/ATA e GCC/GCC representam proteção para
o grupo deste estudo, com cerca de cinco vezes menos chance de
desenvolver o LH;
Com os dados apresentados sugere-se que o alelo na posição -1082, por si
só, não contribui para o aumento ou diminuição do risco de desenvolvimento
do LH, visto que a presença no alelo A na posição -1082 associado aos alelos
CC nas posições -819 e -592, respectivamente, confere risco para os
indivíduos. Em contrapartida, a presença deste mesmo alelo -1082A, porém
associado aos alelos TA nas posições -819 e -592, respectivamente, confere
proteção aos indivíduos do grupo estudado;
Na presença do alelo -1082G, os únicos alelos possíveis, para esta
população, são os -819C e o -592C, e este conjunto alélico apresenta
proteção no grupo analisado;
Houve predominância dos casos EBV- no grupo estudado de 63,2% das
amostras;
Nos casos de EBV+ e EBV - houve predominância dos indivíduos maiores de
10 anos de idade, com 71,4% e 83,3%, respectivamente;
A amostra de casos de EBV apresentou maior freqüência do haplótipo ACC
nos indivíduos EBV +; Já nos indivíduos EBV-, o haplótipo ATA apresentou
maior freqüência;
54
8. Memorial da Aluna Jaqueline de Azevedo Silva, nascida em março de 1984
na cidade de Recife, Pernambuco. Cursou Bacharelado em
Ciências Biológicas pela Universidade de Pernambuco em
2006 e adquiriu o título de especialista em Biologia Molecular
pela mesma Universidade em 2008. No mesmo ano (2008)
ingressou para o Programa de Pós-Graduação em Genética e
Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco
para obtenção do título de mestre. Durante a graduação,
estagiou voluntariamente por um ano no Laboratório de
Biologia Molecular Humana - CEON/PE-HUOC, liderado pela Dr. Tereza Cartaxo,
onde posteriormente realizou iniciação científica por mais dois anos com
Polimorfismos do Gene P53 e Câncer de Pulmão. Após a graduação, trabalhou na
área de pesquisa com Biossensores no Pronto Socorro Cardiológico de Pernambuco
- PROCAPE, onde foi bolsista de ITI- CNPq. Retornou ao Laboratório de Biologia
Molecular Humana – CEON/PE-HUOC, onde desenvolveu durante dois anos a
pesquisa para o mestrado com os Polimorfismos do Promotor do gene da IL-10 e
Linfoma de Hodgkin Pediátrico.
55
9. Referências Bibliográficas Abbas Z, Moatter T, Hussainy A, Jafri W (2005) Effect of cytokine gene
polymorphism on histological activity index, viral load and response to treatment in patients with chronic hepatitis C genotype. World J Gastroenterol. 11:6656–6661.
Aldinucci D, Lorenzon D,Cattaruzza L, Pinto A, Gloghini A, et al (2008) Expression of
CCR5 receptors on Reed-Sternberg cells and Hodgkin lymphoma cell lines: involvement of CCL5/Rantes in tumor cell growth and microenvironmental interactions. Int. J. Cancer 122:769–76.
Alvaro, T. et al (2005) Outcome in Hodgkin's lymphoma can be predicted from the
presence of accompanying cytotoxic and regulatory T cells. Clin Cancer Res, 11:467-473.
Ambinder R F (2007) Epstein-Barr Virus and Hodgkin Lymphoma. American Society
of Hematology, 204-2010. Ambinder R, Browning P, Lorenzana I, et al (2003) Epstein-Barr virus and childhood
Hodgkin’s disease in Honduras and the United States. Blood, 81:462–467. Anderson CF, Oukka M, Kuchroo VJ, Sacks D (2007) CD4(+)CD25(-)Foxp3(-) Th1
cells are the source of IL-10-mediated immune suppression. J Exp Med,204:285–297.
Ansari A, Talat N, Jamil B, Hasan Z, Razzaki T, Dawood G, Hussain R. (2009)
Cytokine gene polymorphisms across tuberculosis clinical spectrum in Pakistani patients. Plos One, 4(3):4778.
Armstrong AA, Alexander FE, Paes RP, et al (1993) Association of Epstein-Barr virus
with pediatric Hodgkin’s disease. Am J Pathol.;142:1683–1688. Arosio B, Trabattoni D, Galimberti L, Bucciarelli P, Fasano F, Calabresi C, Cazzullo
L, Vergani C, Annoni G, Clerici, M.(2004) Interleukin-10 and interleukin-6 gene polymorphisms as risk factors for Alzheimer’s disease, Neurobiol, 1009–1015.
Bagnoli S, Cellini E, Tedde A, Nacmias B, Piacentini S, Bessi V, Bracco L, Sorbi S.
(2007) Association of IL10 promoter polymorphism in Italian Alzheimer's disease. Neurosci Lett., 18;418(3):262-5.
Barros, M. H. M. et al.(2003) Late effects in Brazil : experience of the Cured
Evaluation Program. Med Pediatr Oncol, 41,361.
56
Barros, M. H. M.(2007) Linfoma de Hodgkin na Infância e Adolescência. Um estudo
das Características Histológicas, Clínicas, Epidemiológicas e de Associação com o Vírus Epstein-Barr. Dissertação de Mestrado em Oncologia. Ministério da Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Rio de Janeiro, 188f.
Bogunia-Kubik G .Mazur;T . Wrobel; K . Kuliczkowski & A (2008) Interleukin -10 gene
polymorphisms influence the clinical co urse of non-Hodgkin’s lymphoma. Lange. Journal compilation. Blackwell Munksgaard Tissue Antigens 71, 146–150.
Bohlen H, Kessler M, Sextro M, Diehl V, Tesch H. (2000) Poor clinical outcome of
patients with Hodgkin’s disease and elevated interleukin-10 serum levels. Ann Hematol.79:110–113.
Bräuninger A, Schmitz R, Bechtel D, Renne C, Hansmann M-L, Küppers R. (2006)
Molecular biology of Hodgkin’s and Reed/Sternberg cells in Hodgkin’s lymphoma. Int. J. Cancer.118, 1853–1861.
Bräuninger A, Küppers R, Strickler JG, Wacker HH, Rajewsky K, Hansmann ML
(1997) Hodgkin’s and Reed–Sternberg cells in lymphocyte predominant Hodgkin’s disease represent clonal populations of germinal center-derived tumor B cells. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 9337–42.
Brousset P, Rochaix P, Chittal S, et al (1993) High incidence of EpsteinBarr virus
detection in Hodgkin’s disease and absence of detection in anaplastic large-cell lymphoma in children. Histopathology. 23:189–191.
Burkitt D, O’Conor G. (1961) Malignant lymphoma in African children. I. A clinical
syndrome. Cancer 14:258–69. Burkitt D, Wright D. (1966) Geographical and tribal distribution of the African
lymphoma in Uganda. Br. Med. J. 5487:569–73. Burkitt D. (1962) A children’s cancer dependent on climatic factors. Nature.
194:232–34. Cai G, Kastelein RA, Hunter CA. (1999) IL-10 enhances NK cell proliferation,
cytotoxicity and production of IFN-gamma when combined with IL-18. Eur J Immunol,29:2658–2665.
Cavet, J. et al (1999) Recipient tumor necrosis factor-alpha and interleukin-10 gene
polymorphisms associate with early mortality and acute graft-versus-host
57
disease severity in HLA-matched sibling bone marrow transplants. Blood,. 1;94(11):3941-6.
Chabay P, Burna V, Moar A, Grinstein S, Preciado MV. (1999) Prevalencia de la
infección por el virus de Epstein-Barr en pacientes pediátricos. Rev Hosp De Niños B Aires, 41:88–91.
Chang, K. C., Khen, N. T., Jones, D. & Su, I. J. (2005) Epstein–Barr virus is
associated with all histological subtypes of Hodgkin lymphoma in Vietnamese children with special emphasis on the entity of lymphocyte predominance subtype. Hum. Pathol. 36, 747–755.
Chemnitz JM, Eggle D, Driesen J, Classen S, Riley JL, et al (2007) RNA fingerprints
provide direct evidence for the inhibitory role of TGFB and PD-1 on CD4 T cells in Hodgkin lymphoma. Blood, 110:3226–33.
Claviez A, Tiemann M, Luüders H, et al (2005). Impact of latent Epstein Barr virus
infection on outcome in children and adolescents with Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 23:4048–4056.
Cohen JI. (2000) Epstein-Barr virus infection. N.Engl. J. Med. 343:481–492. Commins S, Steinke JW, Borish L. (2008) The extended IL-10 superfamily: IL-10, IL-
19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28, and IL-29. J Allergy Clin Immunol;121:1108–1111.
Constantini, P.K., Wawrzynowicz-Syczewska, M., Clare, M., Boron-Kaczmarska, A.,
McFarlane, I.G., Cramp, M.E. and Donaldson, P.T. (2002) Interleukin-1, interleukin-10 and tumour necrosis factor-alpha gene polymorphisms i n hepatitis C virus infection: an investigation of the relationships with spontaneous viral clearance and response to alpha-interferon therapy. Liver 22, 404–412.
Cunningham LM, Chapman C, Dunstan R, Bell MC, Joske DJ.(2003) Polymorphisms
in the interleukin 10 gene promoter are associated with susceptibility to aggressive non-Hodgkin's lymphoma.Leuk Lymphoma. 44; 251-5.
Da Silva GN, Bacchi MM, Rainho CA, de Oliveira DE. (2007) Epstein-Barr virus
infection and single nucleotide polymorphisms in the promoter region of interleukin 10 gene in patients with Hodgkin lymphoma,131(11):1691-6.
Depboylu, Y Du, U Muller, A Kurz, R Zimmer, M Riemenschneider, T Gasser, WH
Oertel, T Klockgether, RC Dodel (2003) Lack of association of interleukin-10
58
promoter region polymorphisms with Alzheimer’s disease, Neurosci. Lett., 342, 132–134.
Donnelly R.P., Dickensheets H, Finbloom D.S.( 1999) The interleukin-10 signal
transduction pathway and regulation of gene expression in mononuclear phagocytes. J Interferon Cytokine Res;19:563– 573.
Donnelly R.P., Sheikh F., Kotenko S.V., Dickensheets H. (2004) The expanded
family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain. J Leukoc Biol,76:314–321.
Dukers D.F., Jaspars L.H., Vos W.,et al. Quantitative immune histochemical analysis
of cytokine profiles in Epstein-Barr virus Edwards-Smith CJ, Jonsson JR, Purdie DM, Bansal A, Shorthouse C, Powell EE.
(1999) Interleukin-10 promoter polymorphism predicts initial response of chronic hepatitis C to interferon alfa. Hepatology; 30: 526–530.
Epstein MA, Achong BG, Barr YM.(1964) Virus particles in cultured lymphoblasts
from Burkitt’s lymphoma. Lancet. 15:702–3. Epstein MA, Barr YM. (1964) Cultivation in vitro of human lymphoblasts from Burkitt’s
malignant lymphoma. Lancet,. 41:252–53. Eskdale & Gallagher (1995) A polymorphic dinucleotide repeat in the human IL-10
promoter. Immunogenetics. 42(5):444-5. Eskdale J, Kube D, Gallagher G. (1996)A second polymorphic dinucleotide repeat in
the 5' flanking region of the human IL10 gene. Immunogenetics, 45(1):82-3. Eskdale J, Wordsworth P, Bowman S, Field M, Gallagher G (1997) Association
between polymorphisms at the human IL-10 locus and systemic lupus erythematosus. Tissue Antigens;49(6):635-9.
Eskdale J, Gallagher G, Verweij CL, Keijsers V, Westendorp RG, Huizinga TW.
Interleukin 10 secretion in relation to human IL-10 locus haplotypes. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95: 9465–9470.
Eskdale J, McNicholl J, Wordsworth P, Jonas B, Huizinga T, Field M, Gallagher G.
Interleukin-10 microsatellite polymorphisms and IL-10 locus alleles in rheumatoid arthritis susceptibility. Lancet, 1998; 352: 1282–1283.
Eskdale J, Keijsers V, Huizinga T, Gallagher G. (1999) Microsatellite alleles and
single nucleotide polymorphisms (SNP) combine to form four major
59
haplotype families at the human interleukin-10 (IL-10) locus. Genes Immun;151-5.
Felberbaum R S. (2005) The Molecular Mechanisms of Classic Hodgkin’s
Lymphoma, Medical Review.78,201-207. Fife M.S.(2006) Novel IL10 gene family associations with systemic juvenile
idiopathic arthritis. MS, et al. Arthritis Res Ther, v. 8, p.148. Fillatreau S, Gray D, Anderton SM (2008). Not always the bad guys: B cells as
regulators of autoimmune pathology. Nat Rev Immunol,8:391–397. Fiorentino DF, Bond MW, Mosmann TR. (1989) Two types of mouse T helper cell
Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. J Exp Med,170,2081–2095.
Gallagher A, Perry J, Shield L, Freeland J, Mackenzie J, Jarret RF (2002)
Virusesand Hodgkin disease: no evidence of novel herpes viruses in non-EBV-associated lesions. Int J Cancer, 101:259–264.
Gandhi M K. (2004) Epstein–Barr virus-associated Hodgkin’s lymphoma. British
Journal of Haematology, 125, 267–281. Gandhi MK, Lambley E, Duraiswamy J, Dua U, Smith C, et al. Expression of LAG-3
by tumorinfiltrating lymphocytes is coincident with the suppression of latent membrane antigen-specific CD8 T cell function in Hodgkin lymphoma patients. Blood, 2006,108:2280–89.
Gandhi MK, Moll G, Smith C, Dua U, Lambley E, et al. Galectin-1-mediated
suppression of Epstein-Barr virus–specific T cell immunity in classic Hodgkin lymphoma. Blood, 2007,110:1326–29.
Gibson AW, Edberg JC, Wu J, Westendorp RG , Huizinga T W, Kimberly R P. Novel
single nucleotide polymorphisms in the distal IL-10 promoter affect IL-10 pro-duction and enhance the risk of systemic lupus erythematosus. J I mmunol 2001;16 6:3915–22.
Glaser SL, Lin RJ, Stewart SL, et al. Epstein-Barr virus-associated Hodgkin’s
disease: epidemiologic characteristic in international data. Int J Cancer, 1997.70:375–382.
Hajeer A H, Lazarus M, Turner D, Mageed R A, Vencovsky J, Sinnott P, Hutchinson I
V, and Ollier W E R. IL-10 gene promoter polymorphisms in rheumatoid arthritis. Scand. J. Rheumatol., 1998; 27:142.
60
Helminen, M.E., Kilpinen, S., Virta, M. and Hurme, M. Susceptibility to primary
Epstein–Barr virus infection i s associated with interleukin-10 gene promoter polymorphism. J. Infect. Dis. 2001,184, 777–780.
Herbst, H. et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein expression in Hodgkin
and Reed Sternberg cells. Proc Natl Acad Sci USA, v.88, p.47664770, 1991. Hobbs K, Negri J, Klinnert M, Rosenwasser L J, and Borish L.. Interleukin-10 and
transforming growth factor-_ promoter polymorphisms in allergies and asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med, 1998. 158:1958.
Hodgkin, T. On some morbid appearances of the absorbent glands and spleen.
Medical Chirurgical Transactions, 1832.17, 68–114. Hohaus S, Giachelia M, Di Febo A , Martini M, Massini G, Vannata B , et al. Po
lymorphism in cytokine genes as prognostic markers in Hodgkin’s ly mphoma. Ann Oncol 2007;18:1376–81.
Hohaus S, Giachelia M, Massini G, et al. Clinical significance of interleukin-10 gene
polymorphisms and plasma levels in Hodgkin lymphoma. Leuk Res.,2009.33:1352-6.
Howell HW, Rose-Zerilli MJ. Cytokine gene polymorphisms, cancer susceptibility,
and prognosis. The Journal of Nutrition, 2007;194-199. Hsu J L, Glaser S L. Epstein-Barr virus-associated malignancies: epidemiologic
patterns and etiologic implications. Crit Rev Oncol Hematol, 2000. 34: 27– 53. Huang DR, Zhou YH, Xia SQ, Liu L, Pirskanen R, Lefvert AK. Markers in the
promoter region of interleukin-10 (IL-10) gene in myasthenia gravis: implications of diverse effects of IL-10 in the pathogenesis of the disease. J Neuroimmunol 1999; 94: 82–87.
Huang YC, Tsukamoto K, Sharma V. Interleukin-10 promoter gene polymorphisms
have no clear influence on interleukin-10 protein secretion in AIDS associated B-cell lines. Biochem Biophysis Res Commun, 2005.335:529–535.
http://genatlas.medecine.univ-paris5.fr/fiche.php?symbol=IL10RA Immervoll, T, et al. Fine mapping and single nucleotide polymorphism association
results of candidate genes for asthma and related phenotypes. Hum., 2001;. 18:327.
61
Irsch, J. et al. Class switch recombination was specifically targeted to immunoglobulin (Ig)G4 or IgA in Hodgkin’s disease-derived cell lines. Br.J. Haematol. 2001, 113, 785–793.
Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. WHO Classification of Tumors:
Pathology and Genetics of Tumors of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC,2001.
Jankovic D, et al. Conventional T-bet(+)Foxp3(-) Th1 cells are the major source of
host-protective regulatory IL-10 during intracellular protozoan infection. J Exp Med, 2007;204:273–283.
Jarret RF. Viruses and Hodgkin’s lymphoma. Ann Oncol. 2002;13:23–29. Joos S, Menz CK, Wrobel G, Siebert R, Gesk S, Ohl S, Mechtersheimer G, Trumper
L, Moller P, Lichter P, Barth TF. Classical Hodgkin’s lymphoma is characterized by recurrent copy number gains of the short arm of chromosome 2. Blood, 2002. 99:1381–7.
Juszczynski P, Ouyang J, Monti S, Rodig SJ, Takeyama K, et al. 2007. The AP1-
dependent secretion of galectin-1 by Reed-Sternberg cells fosters immune privilege in classical Hodgkin lymphoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:13134–39.
Kanzler H, Küppers R, Hansmann ML, Rajewsky K. Hodgkin’s and Reed–Sternberg
cells in Hodgkin’s disease represent the outgrowth of a dominant tumor clone derived from (crippled) germinal center B cells. J Exp Med, 1996.184:1495–505.
Kapp U, Yeh WC, Patterson B, Elia AJ, Kagi D, et al. 1999. Interleukin 13 is secreted
by and stimulates the growth of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. J. Exp. Med. 189:1939–46.
Kelley, T. W., Pohlman, B., Elson, P. & Hsi, E. D. The ratio of FOXP3+ regulatory T
cells to granzyme B+ cytotoxic T/NK cells predicts prognosis in classical Hodgkin lymphoma and is independent of bcl-2 and MAL expression. Am. J. Clin. Pathol. 2007,128, 958–965.
Khanna, R., Tellam, J., Duraiswamy, J. & Cooper, L. Immunotherapeutic strategies
for EBV-associated malignancies. Trends in Molecular Medicine, 2001. 7, 270–276.
Kieff E, Rickinson A. Epstein-Barr virus and its replication. In:Fields BN,
KnipeDM,Howley PM, Griffin DE,LambRA, Martin MA, editors. Fields virology,
62
5th edition. Vol. 2. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2006. 2603–2654.
Kilpinen S, Huhtala H, Hurma M. The combination of the interleukin-1alpha (IL-
1alpha-889) genotype and the interleukin-10 (IL-10 ATA) haplotype is associated with increased interleukin-10 (IL-10) plasma levels in healthy individuals. Eur Cytokine Netw, 2002. v. 13, p. 66-71.
Klein, U. et al. Somatic hypermutation in normal and transformed human B cells.
Immunol.1998 Rev. 162, 261–280. Koss, K. et al. Cytokine (TNF alpha, LT alpha and IL-10) polymorphisms in
inflammatory bowel diseases and normal controls: differential effects on production and allele frequencies. Genes Immun, 2000; v. 1, p. 185-190.
Kube D, Platzer C, von Knethen A, Straub H, Bohlen H, Hafner M, Tesch H. Isolation
of the human interleukin 10 promoter. Characterization of the promoter activity in burkitt’s lymphoma cell lines. Cytokine, 7, 1-7, 1995.
Küppers R., Rajewsky K, Zhao M, Simons G, Laumann R, Fischer R, Hansmann ML.
Hodgkin disease: Hodgkin and Reed-Sternberg cells picked from histological sections show clonal immunoglobulin gene rearrangements and appear to be derived from B cells at various stages of development.Proc Natl Acad Sci U S A. 91(23):10962-6, 1994.
Küppers R., Hansmann M.L., Rajewsky K. Clonality and germinal centre B-cell
derivation of Hodgkin/Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease. Ann Oncol. 1998;9 Suppl 5:S17-20.
Küppers R, Klein U, Schwering I, Distler V, Brauninger A, Cattoretti G, Tu Y,
Stolovitzky GA, Califano A., Hansmann, M.L. & Dalla-Favera, R. Identification of Hodgkin and ReedSternberg cell-specific genes by gene expression profiling. Journal of Clinical Investigation, 2003.111, 529–537.
Küppers R, Rajewsky K, Zhao M, Simons G, Laumann R, Fischer R, Hansmann ML.
Hodgkin’s disease: Hodgkin’s and Reed–Sternberg cells picked from histological sections show clonal immunoglobulin gene rearrangements and appear to be derived from B cells at various stages of development. Proc Natl Acad Sci USA, 1994.91:10962–6.
Küppers R. The biology of Hodgkin´s Lymphoma. Nature Review Cancer. 2009,9, 15-
27.
63
Küppers, R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein–Barr virus. Nature Review Immunology, 2003. 3, 801–812.
Kusuda M, Toriyama K, Kamidigo NO, et al. A comparison of epidemiologic,
histologic, and virologic studies on Hodgkin’s disease in western Kenya and Nagasaki, Japan. Am J Trop Med Hyg. 1998; 59:801–807.
Kutok J.L. and Wang F. Spectrum of Epstein-BarrVirus–Associated Diseases Annu.
Rev. Pathol. Mech. Dis. 2006.1:375-404. Langsenlehner U, Krippl P, Renner W, Yazdani-Biuki B, Eder T, Köppel H, Wascher
TC, Paulweber B, Samonigg H. Interleukin-10 promoter polymorphism is associated with decreased breast cancer risk.Breast Cancer Res Treat. 2005 Mar;90(2):113-5.
Lazarus M, Hajeer A H, Turner D, Sinnott P, Worthington J, Ollier W. E. R., and
Hutchinson I. V. Genetic variation in the interleukin 10 gene promoter and systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol,1997; 24:2314.
Lazarus, R. et al. Single-nucleotide polymorphisms in the interleukin-10 gene:
differences in frequencies, linkage disequilibrium patterns, and haplotypes in three United States ethnic groups. Genomics, 2002; v. 80 n. 2, p. 223-228.
Lech-Maranda E, Baseggio L, Bienvenu J et al. Interleukin-10 gene promoter
polymorphisms influence the clinical outcome of diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2004; 103: 3529–34.
Leoncini, L. et al. Neoplastic cells of Hodgkin´s disease show differences in EBV
expression between Kenya and Italy. Int J Cancer, v.65, p.781-784, 1996. Lewontin RC, Kojima K. The evolutionary dynamics of complex polymorphisms.
Evolution, 1960;v 14, n. 4, p. 458-472. Lio D, Licastro F, Scola L, Chiappelli M, Grimaldi LM, Crivello A, Colonna-Romano
G, Candore G, Franceschi C, Caruso C. Interleukin-10 promoter polymorphism in sporadic Alzheimer’s disease, Genes Immun.,2003; 234–238.
López P S, Alonso F V, Romero J M, Carretero R, Buñue M T, Cabello F R, Olmo J
M C. Polymorphisms in inflammatory response genes in metastatic renal cancer. ACTAS UROLÓGICAS ESPAÑOLAS 2009;33(5):474-481.
64
Ma S L, N.L. Tang, L.C. Lam, H.F. Chiu, The association between promoter polymorphism of the interleukin-10 gene and Alzheimer’s disease, Neurobiol.,2005; 1005–1010.
MacMahon B. Epidemiology of Hodgkin’s disease. Cancer Res 1966; 26: 1189–201. Maggio E, Van Der Berg A, Diepstra A, Kluiver J, Visser L, Poppema S.
Chemokines, cytokines and their receptors in Hodgkin’s lymphoma cell lines and tissues. Ann Oncol,2000.;13:52–56.
Maggio, E. M. et al. TP53 gene mutations in Hodgkin lymphoma are infrequent and
not associated with absence of Epstein-Barr virus. Int J Cancer, v.94, p.60-66, 2002.
Marafioti T, Hummel M, Foss HD, Laumen H, Korbjuhn P, Anagnostopoulos I,
Lammert H, Demel G, Theil J, Wirth T, Stein H. Hodgkin’s and Reed–Sternberg cells represent an expansion of a single clone originating from a germinal center B-cell with functional immunoglobulin gene rearrangements but defective immunoglobulin transcription. Blood, 2000.95:1443–50.
Marsh, D. G., J. D. Neely, D. R. Breazeale, B. Ghosh, L. R. Freidhoff, E. Ehrlich-
Kautzky, C. Schou, G. Krishnaswamy, and T. H. Beaty. Linkage analysis of IL4 and other chromosome 5q31.1 markers and total serum immunoglobulin E concentrations. Science, 1994;264:1152.
Marshall NA, Christie LE, Munro LR, Culligan DJ, Johnston PW, et al.
Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma. Blood, 2004, 103:1755–62.
Martin-Subero JI, Gesk S, Harder L, Sonoki T, Tucker PW, et al. 2002. Recurrent
involvement of the REL and BCL11A loci in classical Hodgkin lymphoma. Blood 99:1474–77.
Meenagh, A., Williams, F., Ross, O.A., Patterson, C., Gorodezky, C., Hammond, M .,
Leheny, W.A. and Middleton, D . (2002) Frequency of cytokine polymorphisms in populations from western Europe, Africa, Asia, the Middle East and South America. Hum. Immunol. 63, 1055–1061.
Meyers, D. A., D. S. Postma, C. I. M. Panhuysen, J. Xu, P. J. Amelung, R. C. Levitt,
and E. R. Bleecker. Evidence for a locus regulating total serum IgE levels mapping to chromosome 5. Genomics,1994; 23:464.
65
Middleton, P. G., P. R. Taylor, G. Jackson, S. J. Proctor, and A. M. Dickinson.. Cytokine gene polymorphisms associating with severe acute graft-versushost disease in HLA-identical sibling transplants. Blood, 1998 92:3943.
Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA
from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988;16: 1215. Miteva L, Stanilova S. The combined effect of interleukin (IL)-10 and IL-12
polymorphisms on induced cytokine production. Hum Immunol,2008; v. 69, p.562-566.
Mok, et al. Interleukin-10 promoter polymorphisms in Southern Chinese patients
with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1998; v.41, p.1090-1095. Moore KW, de Waal MR, Coffman RL, O’Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-
10 receptor. Annu Rev Immunol 2001;19:683–765. Moore KW, Vieira P, Fiorentino DF, Trounstine ML, Khan TA, Mosmann TR.
Homology of cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) to the Epstein-Barr virus gene BCRFI. Science 1990;248:1230– 1234.
Moraes MO, Santos AR, Schonkeren JJM, et al. Interleukin-10 promoter haplotypes
are differently distributed in the Brazilian versus the Dutch population. Immunogenetics. 2003;54:896–899.
Mörmann, M. et al. Mosaics of gene variations in the interleukin-10 gene promoter
affect interleukin-10 production depending on the stimulation used.Genes Immun,2004; v.5, p.246-255.
Mosser D. M. e Zhang X. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine,
Immunol Rev,2008; 226: 205–218. Munro LR, Johnston PW, Marshall SJ, et al. Polymorphisms in the interleukin-10 and
interferon gamma genes in Hodgkin lymphoma. Leuk Lymphoma, 2003.44:2083–2088.
Moñux-Ducajú, G. et al. Papel de los polimorfismos del promotor del gen de
la interleucina-10 en la génesis de los aneurismas de la aorta abdominal.
Angiologia, 2006.58, 279-285.
Murray PJ. The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration. J
Immunol 2007;178:2623–2629.
66
Namiki M, Kawashima S, Yamashita T, Ozaki M, Sakoda T, Inoue N, Hirata K, Morishita R, Kaneda Y, Yokoyama M. Intramuscular gene transfer of interleukin-10 cDNA reduces atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice. Atherosclerosis 2004; 172:21-9.
National Cancer Institute- www.cancer.gov. Acesso em outubro de 2009. O’arra A, Vieira P. T(H)1 cells control themselves by producing interleukin-10. Nat
Rev Immunol, 2007;7:425–428. Opal SM, DePalo VA. Anti-inflammatory cytokines. Chest, 2000. 117: 1162–1172. Papadaki T, Stamatopoulos K. Hodgkin disease immunopathogenesis: longstanding
questions, recent answers, further directions. Trends Immunol.,2003.24:508–511.
Pelletier R, Pravica V, Perrey C, Xia D, Ferguson RM, Hutchinson Orosz C. Evidence
for a genetic predisposition towards acute rejection after kidney and simultaneous kidney-pancreas transplantation. Transplantation, 2000.70:674–680.
Potteaux S, Esposito B, van Oostrom O, Brun V, Ardouin P, Groux H, Tedgui A,
Mallat Z. Leukocyte-derived interleukin 10 is required for protection against atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24:1474-8.
Purdue MP, Lan Q, Kricker A,Grulich AE, Vajdic CM, Turner J, etal. Polymorphisms
in immune function genes and risk of non-Hodgkin lymphoma: findings from the NewSouth Wales non-Hodgkin lymphoma study. Carcinogenesis 2007; 28:704-12.
Ramos EM, Lin MT, Larson EB, Maezawa I, Tseng LH, Edwards KL,. Schellenberg
GD, Hansen JA, Kukull WA, Jin L.W. Tumor necrosis factor alpha and interleukin 10 promoter region polymorphisms and risk of late-onset Alzheimer disease, Arch. Neurol.,2006; 63 ,1165–1169.
Reed, D. On the pathological changes in Hodgkin’s disease with special reference to
its relation to tuberculosis. John Hopkins Hospital Reports,1902. 10, 133–193. Reuss, E. et al. Differential regulation of interleukin-10 production by genetic and
environmental factors -a twin study. Genes Immun, 2002; v.3, p.407-413. Ryan JJ, et al. Mast cell homeostasis: a fundamental aspect of allergic disease. Crit
Rev Immunol 2007;27:15–32.
67
Scassellati C, Zanardini R, Squitti R, Bocchio-Chiavetto L, Bonvicini C, Binetti G,
Zanetti O, Cassetta E, Gennarelli M. Promoter haplotypes of interleukin-10 gene and sporadic Alzheimer’s disease, Neurosci. Lett., 2004; 356,119–122.
Schmitz R, Stanelle J, Hansmann M-L, Küppers R. Pathogenesis of Classical and
Lymphocyte-Predominant Hodgkin Lymphoma, Annu Rev Pathol. 2009;4:151-74. 2009.4:151-74.
Schnitzer B. Hodgkin Lymphoma. - Hematol Oncol C lin N Am,2009. 747–768. Shin, H. D., C. Winkler, J. C. Stephens, J. Bream, H. Young, J. J. Goedert, T. R.
O’Brien, D. Vlahov, S. Buchbinder, J. Giorgi, et al. Genetic restriction of HIV-1 pathogenesis to AIDS by promoter alleles of IL10. Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97:14467.
Skinnider BF, Mak TW. The role of cytokines in classical Hodgkin lymphoma. Blood.
2002 15;99(12):4283-97. Review. Staples KJ, et al. IL-10 induces IL-10 in primary human monocyte-derived
macrophages via the transcription factor Stat3. J Immunol 2007;178:4779–4785.
Stein H. Introduction. In: Swerdlow S, Campo E, Harris N, et al, editors. WHO
classifications of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. 4th edition. Lyon, France: IARC Press; 2008. 322.
Steinke J W, Barekzi E, Hagman J, and Borish L,2004. Functional Analysis of _571
IL-10 Promoter Polymorphism Reveals a Repressor Element Controlled by Sp1. The Journal of Immunology, 2004, 173: 3215–3222.
Sternberg C. Ueber eine Eigenar tige unter dem Bilde der Pseudoleukaemie
verlaufende Tuberculosis des lymphatischen Apparates. Ztschr Heilk, 1898.19: 21–30.
Suarez A, Castro P, Alonso R, Mozo L, Gutierrez C. Interindividual variations in
constitutive interleukin-10 messenger RNA and protein levels and their association with genetic polymorphisms. Transplantation, 2003.75:711–717.
Tan, T. T. & Coussens, L. M. Humoral immunity, inflammation and cancer. Curr.
Opin. Immunol.2007, 19, 209–216 .
68
Tagore A, Gonsalkorale WM, Pravica V, Hajeer AH, McMahon R, Whorwell PJ, Sinnott PJ, Hutchinson IV. Interleukin-10 (IL-10) genotypes in inflammatory bowel disease. Tissue Antigens, 1999; 54: 386–390.
Tambur AR, Ortegel JW, Bem Ari Z, et al. Role of cytokine gene polymorphism in
hepatitis C recurrence and allograft rejection among liver transplant recipients. Transplantation,2001.71:1475–1480.
Tanijiri T, Shimizu T, Uehira K, Yokoi T, Amuro H, Sugimoto H, Torii Y, Tajima K, Ito
T, Amakawa R, Fukuhara S. Hodgkin's reed-sternberg cell line (KM-H2) promotes a bidirectional differentiation of CD4+CD25+Foxp3+ T cells and CD4+ cytotoxic T lymphocytes from CD4+ naive T cells.J Leukoc Biol. 200782(3):576-84.
Temple, S.E. et al. Alleles carried at positions -819 and -592 of the IL10 promoter
affect transcription following stimulation of peripheral blood cells with Streptococcus pneumoniae. Immunogenetics, 2003; v. 55, p. 629-632.
Thomas R, Re D, Zander T, et al. Epidemiology and etiology of Hodgkin’s lymphoma.
Ann Oncol. 2002;13:147–152. TNM Classification of Malignant Tumours – 6th ed., 2002. Turner DM,Williams DM, Sankaran D, Lazarus SM, Sinnott PJ, Hutchinson IV. An
investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter. Eur J Immunogenet., 1997. v. 24,24:1–8.
Visentainer, J.E. et al. Correlation of IL-6 and IL-10 production following bone marrow
transplantation with donor cytokine gene polymorphisms. Rev. Bras. Hematol. Hemoter, 2008; v. 30, p. 475-479.
Voute P.A.; Kalifa, C.; Barret, A. Cancer in Children: Clinical Management. 2. ed.
Great Britain: Oxford, 1998. 137-153. Warlé, M.C.; et al. Are cytokine gene polymorphisms related to in vitro cytokine
production profiles? Liver Transpl, 2003; v. 9, n. 2, p.170-181. Weber-Matthiesen K., Deerberg J., Poetsch M., Grote W., Schlegelberger B.
Numerical chromosome aberrations are present within the CD30 Hodgkin’s and Reed–Sternberg cells in 100% of analyzed cases of Hodgkin’s disease.Blood1995;86:1464–8.
Weinreb M, Day P, Niggli F, et al. The consistent association between Epstein-Barr
virus and Hodgkin’s disease in children in Kenya. Blood. 1996;87:3828–3836.
69
Weiss LM, Chan JKC, MacLennan K, Warnke RA. (1999) Pathology of classical
Hodgkin’s disease. In: Mauch PM, Armitage JO, Diehl V, Hoppe RT, Weiss LM, eds. Hodgkin’s Disease. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins,.101–20.
Westendorp, R.G., Langermans, J.A., Huizinga, T.W., Elouali, A.H., Verweij, C.L.,
Boomsma, D.I., Vandenbroucke, J.P. and Vandenbrouke, J.P. (1997) Genetic influence on cytokine production and fatal meningococcal disease. Lancet 349, 170–173.
Williams LM, Ricchetti G, Sarma U, Smallie T, Foxwell BM.(2004) Interleukin-10
suppression of myeloid cell activation – a continuing puzzle. Immunology, 113:281–292.
www.inca.gov.br – Acesso em outubro de 2009. http://www.med-ed.virginia.edu/courses/path/innes/wcd/hodgkin.cfm - Acesso em
Outubro de 2009. Yamamoto R, Nishikori M, Kitawaki T, Sakai T, Hishizawa M, et al. (2008). PD-1-PD-
1 ligand interaction contributes to immunosuppressive microenvironment of Hodgkin lymphoma. Blood 111:3220–24.
Zhou, X. G. et al. (2001) Epstein-Barr virus (EBV) in chinese pediatric Hodgkin
disease. Cancer,92, 6, 1621-1631,. Zhu X, Zhang S, Kan D. Cooper R. (2004) Haplotype block definition and its
application. Pac Symp Biocomput, 152-63.
70
10. Anexos
10.1 Anexo I
71
10.2 Anexo II
Polymorphisms IL-10 Gene Promoter Distribution in Pediatric
Hodgkin´s Lymphoma of the Northeast Brazil
Jaqueline de Azevêdo Silva 1, Mário Henrique Magalhães Barros3, Vera Lúcia Lins
Moraes4, Adriana Lins Moraes4, Rocio Hassan3, Maria Tereza Cartaxo Muniz1,2
1- Departamento de Genética – Universidade Federal de Pernambuco 2- Instituto de Ciência Biológicas – Universidade de Pernambuco 3- CEMO/INCa – Bone Marrow Transplant Center / National Cancer Institute,
Brazil. 4- Centro de Oncohemalotologia Pediátrica – Hospital Universitário Oswaldo
Cruz – Universidade de Pernambuco.
Abstract Key Words: Interleukin-10, Single Nucleotide Polymorphism, Haplotype, Hodgkin´s Lymphoma. Introduction
Classical Hodgkin´s lymphoma (HLc) is unique among human lymphoma since
it has specific tumor cells under reprogramming gene expression. Hodgkin/Reed-
Sternberg cell, which is a specific feature in HLc, are derived from B cells from
germinative center (GC). These cells have lost its expression of most B typical cell
genes and acquired expression from multiple genes from immune system [1]. HL is
one of the most frequent lymphomas in the Western world affecting mainly young
adults [2]. In industrialized countries, the onset of HL shows a bimodal distribution
with a first peak in young adults and a second one after the fifth decade of life. In
developing countries, the first peak occurs predominantly during childhood and its
incidence decreases with age, whereas in industrialized countries, young children are
only rarely affected by HL in contrast with young adults in which incidence increases
with age [3].
Interleukin-10 (IL-10) is of particular interest in the immunopathology of HL
since it is a pleiotropic cytokine with immunosuppressive properties. IL-10 is mainly
produced by activated T cells, mast cells, monocytes/macrophages and stimulated B
cells. IL-10 changes the Th1-Th2 balance towards humoral profile (Th2), hence
inhibiting cytotoxic T cells and stimulating the proliferation and differentiation of B
72
cells [4]. Between 50% and 75% of the variability in IL-10, secretion is explained by
genetic factors [5]. Nucleotide variations in the gene such as single nucleotide
polymorphisms (SNPs) may affect transcription, translation or function of the gene
product. Several Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) has been described for IL-
10 gene promoter but, the most investigated are the ones at positions -1082, -819
and -592, numbered relative to the transcriptional start site in the proximal region
[6,7]. These proximal SNPs are in Linkage Disequilibrium (LD), and together they
compose the haplotypes frequently present in the populations [8].
Many previous studies have described the influence of IL-10 on prognosis [9] of HL,
but most of them have been controversial when comparing different populations. The
aim of this study was to analyze whether exists an association of the genotypes
and/or haplotypes of IL-10 promoter gene in HL pediatric patients comparing to
pediatric health controls in Northeast Brazil population, since it has never been
described.
Material and Methods
Study Population
This is an exploratory with case-control study and it was carried out at Pediatric
Oncoheamatolgy Center from Oswaldo Cruz University Hospital (CEONHPE/HUOC).
Patient’s inclusion criteria were positive diagnosis to Hodgkin´s lymphoma,
histological positivity, with no previous treatment, age range 0-18 years admitted in
CEONHPE/HUOC. Informed consent had been obtained from all study subjects, 64
HL patients (mean age 11 years, range 2-18 years, 21 female and 43 male and 131
controls age range 0-18 from Pernambuco State, Brazil (table 1). The study protocol
has been approved by the Ethics Committee for human research of the Pernambuco
University .
Analysis Genomic DNA was isolated from peripheral blood according to Miller et al,
1988 [10]. Allelic discrimination for -1082 position was performed by Allele Specific –
Polymerase Chain Reaction (AS-PCR) using the following oligos: forward JWF 5´
AGCAACACTCCTCGTCGCAAC 3´; reverse B1 5´ CCTATCCCTACTTCCCCC 3´ for
G allele and reverse B2 5´ CCTATCCCTACTTCCCCT 3´ for A allele. For -592 position
the oligos were forward -592F 5´ GTGACGTGGACAAATTGCCCATTC 3´, reverse C
73
5´ACACATCCTGTGACCCCGCCTGTC3´ and reverse A 5´
ACACATCCTGTGACCCCGCCTGTA 3´. AS-PCR was performed in a 30 µl final
volume reaction, containing 50 ng of genomic DNA, buffer [10 nM KCL, 50 mM Tris-
HCl (pH 8,3)], 0,2 mM from each Dntp (5mM), 0,33 µM from each oligo primer
(10pmol/ µL) and 1,0 µL (1U) of Taq Polimerase Platinum (Invitrogen*). AS-PCR
amplification was performed at GenAmp - Eppendorf thermal cycler. Temperature
cycles for -1082 and -592 positions were: 94 °C for 5 min for initial denaturing and 30
cycles of 94 °C for denaturing, 59 °C for annealing and 72 °C for extension. DNA
fragments were detected in a 3% agarose gel electrophoresis, presenting 139 bp for -
1082 position and 223 bp for – 592 position. For experimental haplotyping
evaluation an AS-PCR was performed as described in following combinations to identify
ACC haplotype -1082A 5´-CTACTAAGGCTTCTTTGGGAA-3´ and -592C 5´-
CCAGAGACTGGCTTCCTACAGG-3´; ATA haplotype -1082A 5´-
CTACTAAGGCTTCTTTGGGAA-3´ and -819T 5´-GCAAACTGAGGCACAGAGATA-
3´; GCC haplotype -1082G 5´-CTACTAAGGCTTCTTTGGGAG-3´ and -819C 5´-
CAAACTGAGGCACAGAGATG-3´. DNA fragments were detected in a 2% agarose
gel electrophoresis, presenting 139 bp for -1082 position and 223 bp for – 592
position. AS-PCR was performed in a 25 µl final volume reaction, containing 50 ng of
genomic DNA, buffer [10 nM KCL, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3)], 0,2 mM from each
dNTP (5mM), 0,33 µM from each oligo primer (10pmol/ µL) and 0,1 µL (5U) of Taq
Polimerase Platinum (Invitrogen). DNA fragments were detected in a 2% agarose gel
electrophoresis, presenting 490 bp for ACC haplotype and 263 bp for ATA and
GCC haplotypes.
Statistical Analysis The frequencies of each genotype were calculated as q=(2a+b)/n, with a, b and n
corresponding to the number of homozygotes, the number of heterozygotes, and the
number of alleles analyzed respectively. Hardy-Weinberg equilibrium was tested for
each SNP by comparing observed with expected frequencies using a χ2 test. The
differences in genotypes from each polymorphic position between cases and controls
were assessed by Pearson's χ2 or Fisher's exact tests using Bioestat 5.0 software.
For each SNP, we did unconditional logistic regression to compute odds ratio (OR)
and 95% confidence interval (95% CI).
74
Results Clinical patients data evaluated were age, sex, histological subtype, stage of disease,
presence of “B” symptoms and treatment failure. They are all summarized on table 1.
Genotype Frequencies
The genotype frequencies among patients were as follows to -1082 position: AA – 36%,
AG – 58%, and GG – 6%; to -819 and -592: CC – 39%, CT and AC – 56%, TT and AA
– 5%. The T and C allele at -819 loci are known to be strongly linked to the A and C
allele from -592 position, respectively. Among the 131 control subjects the genotype
frequencies found were AA – 37% , AG – 40%, GG – 23% for -1082 position; At -819
and -592 were as follows: CC – 40%, CT and AC – 40%, TT and AA –20%. We found
significant statistic differences between HL patients and healthy control group (-1082: χ2
= 9,95 p = 0,007; -819 and -592:χ2= 9,7 p = 0,008). Genotype frequencies from
patients and controls to -1082, -819 and -592 positions are shown on table 2. At -1082
position, the genotype GG has shown a 4,45-fold decreased risk to LH development in
comparison to AG and AA genotypes (OR = 4,45, CI95% = 1,5-13,3 p = 0,007). At -
819 and -592 positions, the genotype CC has shown a 5,27 fold decreased risk to LH
development than other genotypes (OR = 5,27, CI95% = 1,53-18,1 p = 0,007).
Haplotype Frequencies
The frequencies of each haplotype found among LH patients were as follows: ATA –
33%, ACC – 32% and GCC – 35%. For the healthy control group the haplotype
frequencies found were: ATA, ACC and GCC, 40,5%, 16,8% and 42,7%,
respectively. There were significant statistic difference between LH patients and
healthy control subjects (χ2 = 11.7 p = 0.003). The ACC haplotype has shown 2,33-
fold increased risk to LH development (OR= 2,33 CI95% 1.41-3,82 p = 0.001) in
comparison to other haplotypes. The frequency of possible combined haplotypes
among patients were as follows: ATA/ATA, ACC/ATA, ACC/ACC, GCC/GCC,
ATA/GCC, ACC/GCC foi de 4.7%, 15.6%, 15.6%, 6.3%, 40.6% and 17.2%,
respectively. Among the control subjects, the frequency found were 20.6% 11.5%,
5.3%, 22.9%, 28.2%, 11.5%, respectively (Table 3).
75
Discussion Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of HL by acting in a highly
complex, coordinated network [11]. IL-10 and its polymorphisms have been reported
to play a role for both the susceptibility and prognosis of various diseases, including
infectious and autoimmune diseases [9]. This study was performed to determine if IL-
10 gene promoter proximal polymorphisms are associated to LH development. The
subjects groups analyzed in this study indicate protection to -1082GG genotype. Lech-
Maranda and cols., 2004, in a B diffuse cell Lymphoma study (most frequent Non-
Hodgkin Lymphoma –NHL, in North America and Western Europe) presented a
similar result, suggesting that -1082GG may be a protection factor in this kind of
neoplasia [12]. Some authors have demonstrated that the IL-10 gene promoter
proximal SNPs are responsible for different IL-10 serum levels in individuals [13].
According to Perrey et al, the haplotypes GCC/GCC was defined as “high”,
GCC/ACC and GCC/ATA as “medium”, ACC/ACC, ACC/ATA and ATA/ATA as ‘low’
expression IL-10 genotypes. Considering IL-10 -1082 SNP genotypes alone, GG was
considered as a ‘high’ expression genotype, GA as ‘medium’ and AA as a ‘low’
expression genotype [13,14]. Since IL-10 -1082GG was previously found to be
associated with high IL-10 expression, our data suggest that increased IL-10
production within the complex tumor microenvironment may be protective,
conversely, IL-10 low expression plays as negative factor to LH development.
At -819/592 position our results shows a 5.27 fold decrease risk to LH
development (OR = 5.27, IC95% = 1.53-18.1 p = 0.007) for CC genotype. This result
may be complementary to Hohaus, which showed that the homozygous carriers of
the A allele at position -592 in the IL-10 promoter region is a negative prognostic
factor for failure-free survival [9]. Macarthur ´s group demonstrates opposite results,
showing IL-10 gene C-592A polymorphism allele incidence in 264 patients with
colorectal cancer and 408 healthy residents of North-Eastern Scotland with 2-fold
decreased risk of disease for A allele carriers [15]. Although, displaying similarity to our
results, Langsenlehner et al, 2005, conclude that the IL-10 –592C > A promoter
polymorphism may be associated with a reduced breast cancer risk [16]. Despite the
opposite scenarios, only few studies [9;11;16] on hematopoietic malignances and IL-
10 role, have been developed, indicating further (and with a larger number of
samples) studies need to be performed. When studying the IL-10 influence of clinical
course of NHL, Bogunia-Kubik found ACC carries to be associated with unfavorable
76
prognosis. shown that ACC haplotype carries 2.33 fold increased risk to LH
development (OR= 2.33 IC95% 1.41-3.82 p = 0.001) [17]. ACC haplotype has been
associated to low IL-10 expression by the majority of authors [17]. Since our data
shows ACC haplotype as an unprotective factor to HL development, low IL-10
expression may has an important role in HL pathogenesis.
At our analysis group, the combined haplotype ATA/ATA and GCC/GCC
showed around 5 fold decreased risk each to LH development (ATA/ATA - OR=
5.278 IC 95% 1.538 – 18.123 p= 0.007 and GCC/GCC- OR= 4.455 IC 95% 1.496 –
13.266 p= 0.007). Langsenlehner and colleagues supported the findings in our study
by presenting the haplotype ATA as a protective factor against breast cancer
(OR=0,56, 95% confidence interval 0.32–0.97) [15]. Likewise relating their study to
the findings presented by our group, Lee et al, 2006 [18] when studying Non-Hodgkin
Lymphoma, also demonstrated the ATA haplotype as a favorable prognostic factor (P
= 0.037, hazard ratio 2.1). The presented data suggests that the presence of A allele at -1082 position,
when associated with C alleles at -819 and -592, respectively, confers risk to
individuals, while -1082A instead, associated to T and A allele at -819 and -592
position, respectively, confers protection to the studied subject group. The -1082G
allele associated with C allele at -819 and -592 position confers protection in our
study. This may indicate that, with exception of -1082GG genotype, which confers
protection, at least in the analyzed population, the proximal SNPs of IL-10 gene
promoter by themselves, do not influence the increase or decrease LH development
risk. On the other hand, the combination of different alleles at these three positions
may contribute to development of HL.
In conclusion, our study suggests that IL-10 gene promoter proximal SNP are
associated to LH development. However, larger and prospective HL studies are
necessary to confirm our findings.
Acknowledgement We thank the patients and their families, whose collaboration and understanding
have made this work possible. This study was supported by FACEPE (Fundação de
Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco) and CNPq (Conselho
77
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). R.H and M.H.M.B. work is
supported by the SwissBridge Foundation (Switzerland).
References [1] Küppers. The biology of Hodgkin´s lymphoma. Nature Review Cancer. 2009, 9, 15 – 27. [2] Braüninger A, Schmitz R, Bechtel D, et al. Molecular biology of Hodgkin’s and Reed/Sternberg cells in Hodgkin’s lymphoma. Int J Cancer. 006;118:1853–1861. [3] Thomas R, Re D, Zander T, et al. Epidemiology and etiology of Hodgkin’s lymphoma. Ann Oncol. 2002;13(suppl 4):147–152. [4] Opal SM, DePalo VA. Anti-inflammatory cytokines. Chest. 2000, 17: 1162–1172. [5] Reuss E, Fimmers R, Kruger A et al. Differential regulation of interleukin-10 production by genetic and environmental factors—a twin study. Genes Immun. 2002, 3, 407–413. [6] Eskdale J, Keijsers V, Huizinga T et al. Microsatellite alleles and single nucleotide polymorphisms (SNP) combine to form four major haplotype families at the human interleukin-10 (IL-10) locus. Genes Immun. 1999, 1, 151–155. [7] Kurreeman FA, Schonkeren JJ, Heijmans BT et al. Transcription of the IL10 gene reveals allele-specific regulation at the mRNA level. Hum Mol Genet. 2004, 13, 1755–1762. [8] Kilpinen S, Huhtala H, Hurme M. The combination of the interleukin-1alpha (IL-1alpha-889) genotype and the interleukin-10 (IL-10 ATA) haplotype is associated with increased interleukin-10 (IL-10) plasma levels in healthy individuals. Eur Cytokine Netw. 2002, 13, 66–71.
[9] Hohaus S, Giachelia M, Di Febo A, et al. Polymorphism in cytokine genes as prognostic markers in Hodgkin's lymphoma. Ann Oncol. 2007;18(8),1376-81.
[10] Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16: 1215.
[11] Skinnider BF, Mak TW. The role of cytokines in classical Hodgkin lymphoma. Blood 2002; 99: 4283–4297.
[12] Lech-Maranda E, Baseggio L, Bienvenu J et al. Interleukin-10 gene promoter polymorphisms influence the clinical outcome of diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2004; 103: 3529–34.
78
[13] Perrey C, Pravica V, Sinnott PJ, Hutchinson IV. Genotyping for polymorphisms in interferon-g, interleukin-10, transforming growth factor-b1 and tumour necrosis factor-a genes: a technical report. Transplant Immunol 1998; 6: 193–97.
[14] Turner DM, Williams DM, Sankaran D, Lazarus M, Sinnott PJ, Hutchinson IV. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene. Eur J Immunogenet 1997; 24: 1–8.
[15] M. Macarthur, L. Sharp, G. L. Hold, et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 14, No. 7, 1613-1618 (2005).
[16] Langsenlehner U, Krippl P, Renner W, Yazdani-Biuki B, Eder T, Köppel H, Wascher TC, Paulweber B, Samonigg H. Interleukin-10 promoter polymorphism is associated with decreased breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat. 2005 90(2):113-5.
[17] Howell M. and Rose-Zefirilli M., 2007 Martin Howell and Matthew J. Rose-Zerilli. Cytokine Gene Polymorphisms, Cancer Susceptibility, and Prognosis., The Journal of Nutrition. J.Nutr. 137:194S–199S, 2007.
[17] Bogunia-Kubik K, Mazur G, Wróbel T, Kuliczkowski K, Lange A. Interleukin-10 gene polymorphisms influence the clinical course of non-Hodgkin's lymphoma. Tissue Antigens 2008,71(2):146-50.
[18] Je-Jung Lee, Dong Hwan Kim , Nan Young Lee et al Interleukin-10 gene polymorphism influences the prognosis of T-cell non-Hodgkin lymphomas British Journal of Haematology Volume 137 Issue 4, Pages 329 – 336, 2007.
79
Tables:
Table 1. Characteristics of 64 patients with Hodgkin’s lymphoma.
Table 2. Genotype and Allelic Frequencies from SNPs -1082, -819 and -592. Polymorphisms in IL-10 Promoter Gene
Genotypes N°. Cases (%) Allelic Freq. N°. Controls(%) Allelic Freq. p OR 95%IC
-1082 0,007 4,45 1,5-13,3 AA 23 (36%) A = 65% 49 (37%) A = 57% AG 37 (58%) G=35% 52 (40%) G=43% GG 4 (6%) 30 (23%)
-819/592 0.008 5,27 1,53-18,1 CC 25 (39%) C=67% 52 (40%) C=60%
AC/CT 36 (56%) A/T=33% 52 (40%) A=40% AA/TT 3 (5%) 27 (21%)
-1082 χ2 = 9,95 e -819CT/-592/CA χ2= 9,7.
Variables (N=64) Number % Age, years
>10
<10
36
28
56,3
43,8
Gender Female
Male
21
43
33 67
Histotype (N=64)
Nodular Sclerosis
Mixed Cellularity
Rico em Linfócitos
29
24
11
45
38
17
Stage
I / II
III / IV
35
29
54
46
B Symptoms Yes
No
46
18
72
28
Treatment Failure Yes
No
43
21
33
67
80
Table 3: Combined haplotype frequency between LH patients and control subjects.
Haplotype distribuition of IL-10 gene promoter
Patients Controls OR 95%IC p ATA/ATA 3 (4,7%) ATA/ATA 27 (20,6%) 0,19 0,06 0,65 ACC/ATA 10 (15,6%) ACC/ATA 15 (11,5%) 1,43 0,6 3,9 ACC/ACC 10 (15,6%) ACC/ACC 7 (5,3%) 3,28 1,19 9,07 GCC/GCC 4 (6,3%) GCC/GCC 30 (22,9%) 0,22 0,08 0,67 ATA/GCC 26 (40,6%) ATA/GCC 37 (28,2%) 0,17 0,06 0,5 ACC/GCC 11 (17,2%) ACC/GCC 11 (11,5%) 1,67 0,62 3,88
ATA ACC GCC ATA ACC GCC 42 41 45 106 44 112
33% 32% 35% 40,5% 16,8% 42,7% Combined Haplotype χ2 = 22,8 p= 0,0004; Haplotype only χ2 = 11,71 p=0,003
![Interleucina-17A como biomarcador da atividade da dermatomiosite e polimiosite · 2020-01-13 · Interleucina-17A como biomarcador da atividade da dermatomiosite e polimiosite [tese]](https://img.document.onl/doc/110x75/5f7b91353675187f264806cc/interleucina-17a-como-biomarcador-da-atividade-da-dermatomiosite-e-polimiosite-2020-01-13.jpg)
