Dissertação Deborah de Arruda Isoton - UFMT

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE MEDICINA

COORDENAÇÃO DE PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCI AS DA

SAÚDE

EFEITO DO ENALAPRIL E DO CAPTOPRIL SOBRE A RESPOTA IMUNE in vivo

DEBORAH DE ARRUDA ISOTON

CUIABÁ

2013

EFEITO DO ENALAPRIL E DO CAPTOPRIL SOBRE A RESPOTA IMUNE in vivo

DEBORAH DE ARRUDA ISOTON

Orientadora: Profª Drª Deijanira Alves de Albuquerque

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências da Saúde, para a obtenção do título de mestre

em Ciências da Saúde, área de concentração Doenças

Infecciosas e Tropicais, Linha de pesquisa Imunologia de

Doenças Infecciosas e Tropicais.

CUIABÁ

2013

Dedicatórias e agradecimentos

Começo agradecendo a Deus pela coragem, perseverança e momentos de

sabedoria.

Agradeço também a meus pais, Maria Helena de Arruda Isoton e João Isoton,

que mesmo nem sempre compreendendo, sempre ofereceram suporte.

Agradeço também ao meu namorado, Fábio dos Santos Mariano, pela

paciência e pelo consolo nos momentos de maior nervosismo.

Agradeço às loiras mestrandas e às morenas doutorandas do laboratório:

Juliana Lobo de Santana, Jacqueline Neres Castilho, Suize Oliveira e Liziane

Almeida pela companhia, auxílio, parceria e por estar sempre dispostas a ouvir

quando eu precisei reclamar de qualquer coisa, só pra relaxar.

Agradeço aos vizinhos e amigos Josieli Pescador Zys, Lorena Paula Machado,

Vytor Hugo Pereira Mendes, Weslley André Silva e José Roberto Tavares, por todos

os lanches compartilhados, desabafos, reclamações, conselhos e empurrões.

Resumidamente, pela amizade que fizemos e procuramos manter.

Agradeço imensamente a todas as pessoas de outros laboratórios que

participaram indiretamente do meu trabalho, seja cedendo espaço, ajuda, uso de

equipamentos e reagentes.

Agradeço às secretárias da pós-graduação Keylla Okada e Hélida Leseux por

me socorrer sempre com rapidez aos pedidos.

À Prof.ª Dr.ª Maria Luzinete Alves Vanzeler pela liberação do espaço físico do

Laboratório de Psicofarmacologia da UFMT para a experimentação com os

camundongos.

À minha banca de qualificação e defesa, pelas sugestões que ajudaram muito

no texto, profº Dr Cor Jesus Fernandes Fontes, profª Drª. Nair Honda Kawashita,

profª Drª Maria Luzinete Alves Vanzeler, profº Dr Rogério Alexandre Nunes dos

Santos

Aos animais utilizados no projeto, que deram suas vidas em troca do

conhecimento.

"O que verdadeiramente somos é aquilo que o impossível cria em nós."

Clarice Lispector

Resumo

Captopril e enalapril são dois medicamentos anti-hipertensivos que atuam sobre o

sistema renina-angiotensina-aldosterona inibindo a enzima conversora de angiotensina (ECA).

Há algum tempo tem sido relatada atividade protetora sobre os órgãos por estes medicamentos

e foi constatado que eles são capazes de regular a produção de citocinas, inibindo pró-

inflamatórias e estimulando antiinflamatórias. O adjuvante incompleto de Freund, por outro

lado, é conhecido por aumentar a resposta imune e também por causar inflamação.

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do enalapril e captopril sobre as células

do sangue periféricos, o perfil dos leucócitos, e dos esplenócitos, a produção de IgG1

específica e os pesos corporal, do baço e fígado especialmente durante a resposta imune

específica.

Doze camundongos C57BL/6 imunizados com ovalbumina emulsificada com o

adjuvante incompleto de Freund (OVA+IFA) foram divididos em três grupos: não tratado,

tratado com enalapril e tratado com captopril para acompanhamento da cinética de leucócitos

periféricos, produção de IgG1 e determinação de pesos corporal, do baço e fígado.

Constatou-se que os inibidores da ECA, captopril e enalapril, estudados não regularam a

quantidade de leucócitos circulantes, não alteraram a cinética esperada de mudança no perfil

percentual das subpopulações de leucócitos induzida pelo adjuvante, não alteraram a

quantidade de esplenócitos, não modificaram peso corporal e nem do fígado e baço, nem

influenciaram a cinética ou a quantidade de IgG1 produzida.

Conclui-se que os medicamentos captopril e enalapril não alteram significantemente a

resposta imune de animais imunizados com OVA+IFA.

Palavras-chave: enalapril, captopril, OVA+IFA, adjuvante incompleto de Freund, modulação

da resposta imune

Abstract

Captopril and enalapril are two anti-hypertensive medicines that act on the renin-

angiotensin-aldosterone system by inhibiting ACE. It has been reported for awhile some

protective activity over a few courts by these drugs, and they found their ability to regulate the

production of some cytokines inhibiting pro-inflammatory and stimulating anti-inflammatory

kinds. On the other hand, the incomplete Freund’s adjuvant is known to increase response to

immunization and also cause inflammation.

The objective was to establish the effects of these medicines on the peripheral blood

cells, leucocytes profile, spleen cells, IgG1 specific production and body, spleen and liver

weights during the specific immune response.

C57BL/6 mice immunized with OVA+IFA were divided into non-treated, enalapril

treated and captopril treated groups to monitor de kinetics of peripheral leucocytes, cytokine

and IgG1 production and monitoring body weight, spleen and liver.

It was found that the drugs did not modulate the amount of circulation leucocytes, did

not alter the expected kinetics of each subpopulation percentage on leucocytes induced by

adjuvant, spleen cells did not significantly change the weight of body, liver and spleen did not

change. It also did not influence the kinetics of the IgG1 production or the amount of antibody

produced.

Thus, we can conclude that the drugs captopril and enalapril did not alter significantly

the immune response parameters analyzed of the immunized animals.

Key Word: enalapril, captopril, OVA+IFA, incomplete Freund’s adjuvant, immune response

modulation

Lista de Figuras

Figura 1: Estrutura química do captopril e do enalapril.. ......................................................... 14

Figura 2: Leucócitos totais periféricos... .................................................................................. 24

Figura 3: Percentual de neutrófilos ......................................................................................... 266

Figura 4: Percentual de linfócitos ............................................................................................. 27

Figura 5: Percentual de monócitos.. ......................................................................................... 28

Figura 6: Percentual de eosinófilos. ......................................................................................... 30

Figura 7: Número de esplenócitos ............................................................................................ 31

Figura 8: Dosagem de IgG1 nos dias 14 e 21 ........................................................................... 32

Lista de tabelas

Tabela 1: Medianas do número de leucócitos 24

Tabela 2: Medianas do percentual de neutrófilos 25

Tabela 3: Medianas do percentual de linfócitos 26

Tabela 4: Medianas do percentual de monócitos 28

Tabela 5: Medianas do percentual de eosinófilos 29

Tabela 6: Medianas dos pesos: corporal antes e após tratamento e dos órgãos fígado e baço 31

Lista de abreviaturas e siglas

Ang: Angiotensina

BSA: Albumina de soro bovino

CP: Captopril

ECA: Enzima conversora de angiotensina

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay

EP: Enalapril

HRP: Horseradish peroxidase

IFA: Adjuvante incompleto de Freund

IFN-γ: Interferon gamma

IgG1: Imunoglobulina do isotipo G, subclasse 1

IL-1 β: Interleucina 1 beta

IL-10: Interleucina 10

IL-5: Interleucina 5

IP: Intraperitoneal

Meio RPMI 1640: Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute, composição de variação

tipo 1640

mRNA: Ácido ribonucleido mensageiro

NO: Óxido nítrico

OPD: Ortho-phenyldiamine

OVA: Ovalbumina de ovo de galinha

PBS: Phosphate buffered saline ou Tampão fosfato-salino

RPM: Rotações por minuto

TGF- β: Transforming growth factor ou fator de transformação de crescimento beta

TMB: Tetramethylbenzidine

TNF-α: Tumor necrosis factor alpha ou fator de necrose tumoral alpha

v/v: Volume por volume

Sumário

1. Introdução 13

1.1 Sistema renina-angiotensina-aldosterona 13

1.2 Inibidores da enzima conversora de agiotensina I (ECA) 14

1.3 Resposta imune e adjuvantes 16

2. Justificativa 17

3. Objetivos 18

3.1 Objetivo geral 18

3.2 Objetivos específicos 18

4. Material e métodos 19

4.1 Animais 19

4.2 Medicamentos 19

4.3 Antígeno e adjuvante 19

4.4 Preparo da emulsão ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund 19

4.5 Imunização e reforço 20

4.6 Grupos de animais e tratamento 20

4.7 Tratamento 20

4.8 Coletas de sangue 21

4.9 Contagem de leucócitos periféricos 21

4.10 Contagem diferencial de leucócitos periféricos 21

4.11 Pesagem dos animais e das vísceras 22

4.12 Preparo da suspensão de esplenócitos 22

4.13 Contagem de esplenócitos 22

4.14 Quantificação de IgG1 sérica específica para ovalbumina 22

4.15 Análise estatística 23

5. Resultados 24

5.1 Efeito do enalapril e do captopril sobre o número de leucócitos circulantes em

animais imunizados com ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund 24

5.2 Avaliação do efeito do enalapril e captopril sobre as subpopulações de leucócitos

circulantes em camundongos imunizados com ovalbumina com adjuvante incompleto de

Freund 25

5.2.1 Variação do percentual de neutrófilos segmentados em animais imunizados com

ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund e tratados com enalapril ou captopril 25

5.2.2 Variação do percentual de linfócitos em animais imunizados com ovalbumina com

adjuvante incompleto de Freund e tratados com enalapril ou captopril 26

5.2.3 Variação do percentual de monócitos em animais imunizados com ovalbumina com


5.2.4 Variação do percentual de eosinófilos em animais imunizados com ovalbumina com


5.3 Efeito do enalapril e do captopril sobre a contagem de esplenócitos de animais

imunizados com ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund 30

5.4 Efeito do enalapril e do captopril sobre os pesos corporais e de vísceras de animais

imunizados com ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund 31

5.5 Quantificação de IgG1 sérica anti-ovalbumina dos animais imunizados com

ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund não-tratados e tratados com enalapril e

captopril 32

6. Discussão 33

7. Conclusão 35

8. Referências bibliográficas 36

9. Anexo 40

13

1. Introdução

1.1 Sistema renina-angiotensina-aldosterona

O sistema renina-angiotensina-aldosterona é constituído por uma cascata de hormônios

responsáveis, principalmente, pelo controle da pressão arterial, volemia e equilíbrio

hidroeletrolítico. Os principais sítios anatômicos deste sistema incluem rins, coração, pulmões

e todo o conjunto vascular. Os principais elementos do sistema renina-angiotensina-

aldosterona são o angiotensinogênio, a renina, a angiotensina I, a enzima conversora de

angiotensina I (ECA) e a angiotensina II 1,2,3.

O angiotensinogênio é secretado pelo fígado e circula na forma inativa no plasma até

contatar uma molécula de renina. A renina liberada pelos rins circula e cliva o

angiotensinogênio, formando a angiotensina I. A ECA converte a angiotensina I em

angiotensina II, esta com função vasoconstrictora. O local com maior abundância da ECA é o

endotélio dos vasos, principalmente dos pulmões. Porém, a enzima pode sofrer proteólise nas

membranas e ficar livre e ativa no plasma. Nem toda a angiotensina II resulta da conversão

pela ECA, uma menor parte pode ser convertida por uma via alternativa de enzimas, sendo

estas mais relacionadas à ação local em tecidos 1,2,3.

O resultado da ação da angiotensina II está relacionado ao tipo de receptor ao qual ela se

liga. O principal receptor da angiotensina II é o AT1-R, relacionado à vasoconstrição,

inflamação, estresse oxidativo e efeitos cardiovasculares e renais. Existe, em muito menor

quantidade e tendendo a diminuir com o envelhecimento, o receptor AT2-R, com função

oposta à do AT1-R, promovendo principalmente a vasodilatação. Existem ainda os AT3-R e o

AT4-R que até o conhecimento atual, não atuam de forma tão direta à

vasoconstrição/vasodilatação ou à regulação da pressão arterial 1,2,3,4.

Mecanismos do próprio organismo podem atuar antagonicamente à ligação da

angiotensina II ao AT1-R. Recentemente, foi demonstrada a existência de uma enzima

homóloga à ECA, a ECA2, que hidrolisa a angiotensina I em ang (1-9), um composto

biologicamente inativo, que é convertido pela ECA em ang (1-7). A ang (1-7) tem atividade

vasodilatadora em várias espécies animais e em humanos antagoniza a vasoconstrição

induzida pela angiotensina II, sendo a vasodilatação relacionada também ao antagonismo ao

14

receptor AT1-R, além de inibir antagonistas da ECA e induzir aumento da bradicinina.

Entretanto, inibidores da ECA parecem inibir também a formação da ang (1-7) 3,4.

1.2 Inibidores da enzima conversora de agiotensina I (ECA)

O uso de inibidores de ECA no tratamento da hipertensão surgiu a partir da descoberta

de um peptídeo extraído de veneno de cobra Bothrops jararaca e passaram a ser produzidos

industrialmente 3. A inibição da ECA leva à redução da angiotensina II e aldosterona, porém

ocorre feedback negativo induzindo aumento da renina e angiotensina I. Os inibidores da

ECA aumentam os níveis de bradicinina e estimulam a biossíntese de prostaglandinas,

induzindo vasodilatação. O uso desses medicamentos é, geralmente, bem tolerado, sendo o

efeito colateral mais comum é tosse seca, relacionada ao aumento da bradicinina. Os mais

conhecidos inibidores da ECA incluem captopril e enalapril 1,2,3,4.

O captopril é um medicamento inibidor da ECA, que contém sulfidrila em sua estrutura

química, enquanto o enalapril e sua forma ativa, o enalaprilato, contém dicarboxila em sua

estrutura (Figura 1). Captopril foi o primeiro a ser comercializado e enalapril o segundo.

Captopril é droga ativa e enalapril é pró-fármaco que, quando hidrolisado por esterases no

fígado, é convertido em enalaprilato. A meia-vida do captopril é de cerca de 2 horas e do

enalaprilato 1,3 horas livre e 11 horas quando está ligado à ECA 1,3.

Figura 1: Estrutura química do captopril e do enalapril. No enalapril o local indicado demonstra sítio de hidrólise para conversão na droga ativa, o enalaprilato.

Por sua ação inibitória da ECA, ambos captopril e enalapril são anti-hipertensivos e

vem sendo utilizados ao longo dos anos. Estudos tem demonstrado que os inibidores da ECA

15

poderiam exercer, além da atividade anti-hipertensiva, uma atividade protetora sobre os

órgãos, especialmente os já afetados por patologias, destacando-se atividade cardioprotetora e

renoprotetora, relacionadas ao controle da pressão arterial 5,6,7,, volemia 8 e da fibrose

induzida pela angiotensina II 9,10,11,12,13.

Os resultados obtidos a partir do tratamento de pacientes com hipertensão e de estudos

experimentais, usando inibidores da ECA, tem mostrado que os benefícios desses

medicamentos vão além daqueles que seriam esperados devido ao seu clássico efeito sobre

sistema cardiovascular. Nesse contexto, dados mais recentes, obtidos também a partir de

estudos clínicos e experimentais tem enfatizado um importante papel de inibidores da ECA

sobre funções não hemodinâmicas, imuno mediadas, tais como a produção de

citocinas14,15,16,17,18. Além disso, esses medicamentos reduzem a migração de macrófagos e

neutrófilos para sítios de inflamação e reduzem a expressão de moléculas de atração e adesão

para essas células 19,20,23,24,26. Embora já tenha sido mostrado que os inibidores da ECA

modulam a resposta inflamatória localizada, os dados sobre os efeitos desses medicamentos

sobre as células do sangue periféricos ainda são escassos ou inexistentes, requerendo estudos

no sentido de estabelecer se esses medicamentos alteram o perfil dos leucócitos do sangue

periférico, especialmente durante a resposta imune específica.

Com relação ao efeito de inibidores da ECA sobre a resposta humoral, captopril e

enalapril estão elencados entre os medicamentos que causam lúpus. Esse possível efeito

adverso do captopril e enalapril não foi comprovado cientificamente, mas é suportado por

dados de um estudo clínicos mostrando que pacientes tratados com esses anti-hipertensivos

desenvolveram IgM anti-DNA de fita dupla20. Para esclarecer um possível efeito dos

inibidores da ECA sobre a produção de auto-anticorpos, dois grupos de pesquisadores,

estudaram o efeito desses medicamentos sobre a produção de auto-anticorpos e mostraram

que, no modelo murino, captopril não altera a produção de auto-anticorpos específicos para

DNA 15 ou miosina 27. Além disso, em um desses estudos foi mostrado que captopril não

altera a resposta de anticorpos anti-OVA em camundongos imunizados com OVA

emulsificada com o adjuvante completo de Freund 27. Entretanto, nesse estudo, foi mostrado

que captopril reduziu a reação de hipersensibilidade tardia (DTH), anti-OVA e anti-miosina.

Como a DTH é uma reação mediada classicamente por células T auxiliares do tipo 1, os

autores investigaram a produção de IFN-gama e a proliferação de células T, estimuladas por

OVA, miosina ou anti-CD3 e mostraram esses dois eventos não foram alterados pelo

captopril. Como o captopril não estimulou a produção de IFN-gama, mas inibiu a DTH, os

16

autores postularam que a inibição da DTH pelo captopril é independente da ação direta desse

medicamento sobre células T.

1.3 Resposta imune e adjuvantes

A resposta imune está didaticamente dividida entre resposta celular, envolvendo

linfócitos T citotóxicos, linfócitos auxiliares (Th), produtores de citocinas, e resposta

humoral, envolvendo linfócitos B, produtores de anticorpos. Dependo de fatores como a via

de administração de um Ag, a dose desse e o tipo de adjuvante usado, a resposta de linfócitos

Th, pode polarizar, para o padrão 1, no qual há produção predominante de IFN-gama e IL-2

ou para o padrão 2, no qual ocorre a produção predominante de IL-4, IL-5 e IL-13. Numa

imunização, uma substância exógena é apresentada a um organismo, que ao reconhecê-la

como antígeno, passa a responder de forma específica a ele. O uso de adjuvantes, de um modo

geral, tem como objetivo melhorar a eficácia da resposta imune.

Entre os adjuvantes mais usados na pesquisa experimental, estão os adjuvantes

completo e incompleto de Freund, que tem na sua composição o óleo mineral e são excelentes

estimulantes da resposta imune. Um dos mecanismos pelo qual os adjuvantes de Freund

potenciam a resposta imune é pela retenção do Ag no local da injeção. Além de estimular a

resposta imune, os adjuvantes de Freund também promovem uma reação inflamatória no local

da injeção, que varia de moderada a acentuada. A imunização de camundongos com OVA

emulsificada com o adjuvante incompleto de Freund (IFA) leva a um aumento da produção de

IgE, IgG1 e IgG2a, no camundongo, que caracteriza uma resposta mista, do tipo 1 e do tipo 2 21, 22, 23,24,25.

Quanto ao padrão de citocina induzida pelos adjuvantes de Freund, o IFA, normalmente

não regula a resposta dos linfócitos Th para o padrão Th1 ou Th2, havendo, conforme o

antígeno utilizado, uma leve tendência para um ou o outro padrão. Com a ovalbumina (OVA)

a tendência é de levemente aumentar a resposta Th2, porém não havendo diferença

significante16, 22,23,24,25.

17

2. Justificativa

Como os dados da literatura a respeito do efeito de inibidores da ECA sobre a resposta

humoral e sobre leucócitos circulantes ainda são escassos, contraditórios ou inexistentes,

pesquisas devem ser realizadas para consolidar o conhecimento sobre o possível efeito desses

medicamentos sobre a produção de anticorpos e sobre a dinâmica das células do sangue

periféricos em animais que estejam respondendo especificamente a um Ag T-dependente.

18

3. Objetivos

3.1 Objetivo geral

Determinar o efeito do enalapril e do captopril sobre as células do sangue periféricos, o

perfil dos leucócitos, e dos esplenócitos, a produção de IgG1 específica e os pesos corporal,

do baço e fígado especialmente durante a resposta imune específica à ovalbumina.

3.2 Objetivos específicos

• Avaliar o efeito do enalapril e do captopril sobre a variação da quantidade dos

leucócitos periféricos em camundongos imunizados com OVA emulsificada com IFA;

• Verificar o efeito do enalapril e do captopril sobre a variação da quantidade dos

leucócitos diferenciais, subpopulações neutrófilo, linfócito, monócito e eosinófilo, em

camundongos imunizados com OVA emulsificada com IFA;

• Quantificar o efeito do enalapril e do captopril sobre os esplenócitos em camundongos

imunizados com OVA emulsificada com IFA;

• Determinar se o enalapril e o captopril tem efeito sobre o pesos do corpo, do fígado e

do baço em camundongos imunizados com OVA emulsificada com IFA;

• Determinar o efeito do enalapril e do captopril sobre a produção de IgG1 anti-OVA

em camundongos imunizados com OVA emulsificada com IFA.

19

4. Material e métodos

4.1 Animais

Doze camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6 fêmeas foram obtidos da

Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ – de Salvador-BA. Os animais foram mantidos em

gaiolas de polipropileno, à temperatura constante de 25 ºC, com ciclos claro/escuro de 12 h

com acesso ad libiditum à ração e água autoclavadas. Os experimentos foram iniciados com

os animais adultos, com doze semanas de idade. A manipulação dos animais durante os

experimentos foi feita de acordo com as regras de cuidados de animais de laboratório (NIH

publicação número 86-23) e com os princípios de ética da experimentação animal (COBEA –

Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), sob a supervisão da Médica Veterinária

Danúbia de Sousa Fontana, CRMV nº 03792. Os experimentos com animais ocorreram no

Laboratório de Psicofarmacologia do Departamento de Ciências Básicas em Saúde, Faculdade

de Medicina, Universidade Federal de Mato Grosso.

4.2 Medicamentos

Os medicamentos captopril (Captotec®, lote CH4123) e enalapril (Enaprotec®) foram

obtidos comercialmente do laboratório Hexal sob forma de comprimidos.

4.3 Antígeno e adjuvante

Foi utilizado como antígeno a ovalbumina (OVA, grau V) e como adjuvante foi usado o

adjuvante incompleto de Freund (IFA), ambos comprados da Sigma Chemical Co., St. Louis,

USA.

4.4 Preparo da emulsão ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund

A emulsão água em óleo de OVA+IFA foi preparada segundo o método de Moncada et

al (1993)26, modificado para o uso de seringas de vidro. Em resumo: Um mililitro (mL) de

OVA dissolvida em PBS (0,2 mg/mL) foi adicionado a 1 mL de IFA e emulsificado até

20

formar a emulsão água em óleo. A estabilidade da emulsão foi testada conforme descrito por

Becher (1965)27, sendo considerada estável quando gotejada em água destilada gelada e não

correu dispersão em até 5 minutos.

4.5 Imunização e reforço

No dia 0, todos os animais foram imunizados com emulsão de ovalbumina emulsificado

com o adjuvante incompleto de Freund (OVA+IFA). No 14º dia do experimento, os animais

receberam reforço com 10 µg de OVA dissolvida em 100 µL de PBS. Ambas as imunizações

foram feitas por via intraperitoneal e o volume injetado foi de 100 µL por animal.

4.6 Grupos de animais e tratamento

Após imunização, os animais foram aleatoriamente divididos em três grupos, sendo:

Grupo 1 (OVA+IFA): Os camundongos foram imunizados e não receberam

tratamento.

Grupo 2 (OVA+IFA+EP): Os camundongos foram imunizados e receberam enalapril

dissolvido em água potável, na dose de 5 mg/kg/dia, conforme descrito anteriormente de

forma a manter níveis normotensos 15,16,28.

Grupo 3 (OVA+IFA+CP): Os camundongos foram imunizados e receberam captopril

dissolvido na água potável, na dose de 30 mg/kg/dia, conforme descrito anteriormente de

forma a manter níveis normotensos 15,16,28.

4.7 Tratamento

A dose do enalapril (5 mg/kg/dia/5 mL de água) e do captopril (30 mg/kg/dia/5 mL de

água) foi calculada tomando como base a somatória de peso corporal dos animais de cada

grupo a ser tratado. Tanto o enalapril como o captopril foram comprados na forma de

comprimido para ser administrado por via oral. Os comprimidos foram macerados em gral

com pistilo de porcelana e a água potável e autoclavada foi medida em provetas de vidro. A

21

água foi adicionada ao gral com o comprimido macerado, de forma a recuperar todo o

macerado, que foi depositado na mamadeira, tendo sido esses trocados a cada 24 h.

4.8 Coletas de sangue

Semanalmente, a partir do dia zero e nos dias sete, 14 e 21 do experimento, amostras de

sangue foram colhidas, via plexo retro-orbital, com a utilização de pipetas Pasteur de vidro.

Foram colhidos aproximadamente 200 µL de sangue nos dias zero, sete e 14 e

aproximadamente 500 µL no dia 21. O sangue colhido foi depositado em tubos cônicos, tipo

eppendorf, foi mantido em gelo e deixado em repouso por 2 a 3 h para coagulação e retração

do coágulo. Após, as amostras foram centrifugadas a 2 000 RPM por 30 min e o soro obtido

por esse processo foi armazenado em tubos cônicos tipo eppendorf a -20 ºC para análise

posterior de anticorpos. Antes de serem armazenadas, as amostras para teste de anticorpos

foram diluídas a 1:100 em PBS contendo albumina de soro bovino (BSA, Sigma Chemical

Co., St. Louis, USA).

Para a contagem de leucócitos totais e diferenciais, uma amostra de 10 µL do sangue foi

diluída a 1:20 em líquido de Turk, para posterior contagem de leucócitos totais e uma gota foi

depositada em lâmina de vidro para confecção de esfregaço sanguíneo.

4.9 Contagem de leucócitos periféricos

O tubo com sangue fresco e diluído a 1:20 em líquido de Turk foi homogeneizado e as

contagens foram realizadas em no máximo 4 h a partir do preparo da amostra. As contagens

foram feitas em câmaras de Neubauer, ao microscópio óptico com objetivas de 40x e o

resultado foi expresso como leucócitos x 106/mL.

4.10 Contagem diferencial de leucócitos periféricos

A contagem das subpopulações de leucócitos periféricos foi realizada a partir dos

esfregaços confeccionados a partir do sangue fresco, após extensão nas lâminas de vidro,

secagem por 24 h e coloração com corante tipo panótico rápido® (Instant Prov, Newprov,

Brasil) no esquema 12 seg corante nº 1, 15 seg corante nº 2 e 25 seg corante nº 3. As

22

contagens foram realizadas ao microscópio óptico, com objetivas de 100x, utilizando óleo

mineral de imersão. Foram contados 200 leucócitos e o resultado para cada subpopulação foi

expresso em percentual.

4.11 Pesagem dos animais e das vísceras

Os animais foram pesados individualmente nos dias zero e 21, dentro de um bécquer

para contê-los. O baço e o fígado foram pesados em balança semianalítica, após necrópsia e

evisceração dos animais pós-eutanásia.

4.12 Preparo da suspensão de esplenócitos

O baço de cada animal foi macerado e divulsionado em 3 mL de meio incompleto para

cultura de células (meio RPMI 1640, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Essa suspensão

foi homogeneizada tendo sido retirada uma alíquota de 10 µL para diluição em líquido de

Turk para posterior contagem das células.

4.13 Contagem de esplenócitos

Uma amostra de esplenócitos foi diluída a 30 vezes em líquido de Turk. A contagem

das células foi realizada em câmara de Neubauer, ao microscópio óptico, com objetivas de

40x e o resultado expresso como esplenócitos x 106/mL.

4.14 Quantificação de IgG1 sérica específica para ovalbumina

Os soros obtidos nos dias zero, 14 e 21 foram analisados pelo método Enzyme Linked

Immunosorbent Assay (ELISA) para a detecção de IgG1 anti-OVA. As reações foram feitas

em microplacas de poliestireno de fundo chato (Corning Incorporated Costar, USA). As

placas foram sensibilizadas com OVA a 20 µg/mL em tampão carbonato/bicarbonato de

sódio, pH 9,0, bloqueadas com BSA a 1% em PBS, incubadas com os soros teste diluídos a

1:2000 em BSA a 0,1%. As placas foram incubadas por cerca de 18 h a 4 ºC, lavadas e

incubadas com anticorpo monoclonal rabbit anti-IgG1 mouse (Zymed) marcados com

23

horseradish peroxidase (HRP) e as reações foram reveladas com peróxido de hidrogênio e

cromógeno orthophenyldiamine (OPD, Sigma, USA), dissolvidos em tampão ácido

cítrico/citrato de sódio, pH 5,0. A reação foi interrompida com solução de ácido sulfúrico a 1

M. Todas as lavagens entre as etapas do teste foram realizadas com tampão PBS contendo

Tween 20 a 0,05%.

As leituras das reações foram realizadas em leitor de microplacas de ELISA Thermo

Plate (modelo TP READER nm) a 492 nm e os resultados expressos em absorbância.

4.15 Análise estatística

Os dados obtidos foram tratados por teste de Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunns,

para comparações múltiplas e a significância considerada foi p < 0,05. As análises foram

realizadas utilizando o software GraphPad Prism 5.

24

5. Resultados

5.1 Efeito do enalapril e do captopril sobre o número de leucócitos circulantes em

animais imunizados com ovalbumina emulsificada com o adjuvante incompleto de Freund

A tabela 1 indica as medianas do número de leucócitos dos grupos experimentais, nos

dias analisados

Tabela 1: Medianas do número de leucócitos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tratados com enalapril ou captopril nos dias zero, sete, 14 e 21.

Dia 0 (x106

céls/mL) Dia 7 (x106

cél/mL) Dia 14 (x106

cél/mL) Dia 21 (x106

cél/mL)

OVA+IFA 5,6875 9,0375 6,7 6,9125

OVA+IFA+EP 4,1875 8,85 7,6625 6,4875

OVA+IFA+CP 8,2 10,6625 8,5375 7,1

Os dados apresentados na figura 2 apresentaram os leucócitos dos animais imunizados

com OVA+IFA e tratados, tanto com enalapril quanto com captopril. Não havendo diferença

significante na quantidade de leucócitos periféricos, seja intragrupos e intergrupos, nos dias

zero, sete, 14 e 21 de acordo com os testes Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunns.

Figura 2: Leucócitos totais periféricos. Leucócitos totais periféricos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tratados com enalapril ou captopril, nos dias zero, sete, 14 e 21.

25

5.2 Avaliação do efeito do enalapril e captopril sobre as subpopulações de

leucócitos circulantes em camundongos imunizados com ovalbumina emulsificada com o

adjuvante incompleto de Freund

Foram avaliadas percentualmente as principais subpopulações de leucócitos

periféricos.

5.2.1 Variação do percentual de neutrófilos em animais imunizados com

ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund e tratados com enalapril ou captopril

A tabela 2 indica as medianas do número percentual de neutrófilos dos grupos

experimentais, nos dias analisados

Tabela 2: Medianas do percentual de neutrófilos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tratados com enalapril ou captopril nos dias zero, sete, 14 e 21.

Dia 0 (%) Dia 7 (%) Dia 14 (%) Dia 21 (%)

OVA+IFA 5 24,125 12,375 4,5

OVA+IFA+EP 4,375 22 9,875 3,375

OVA+IFA+CP 8 28,625 12,875 5,5

A subpopulação de neutrófilos dos animais imunizados não tratados e tratados com

enalapril ou captopril não apresentou diferença estatística significante intergrupos nos dias

zero, sete, 14 e 21. A figura 3 ilustra a variação do percentual dos neutrófilos no sangue

periférico entre os grupos, ao longo dos dias zero, sete, 14 e 21 de acordo com os testes

Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunns.

Os grupos que apresentaram diferença foram de um modo geral: aumento de neutrófilos

entre os animais imunizados e tratados com enalapril (p = 0,007) ou com captopril (p = 0,01),

no dia sete, em comparação ao grupo imunizado não tratado, no dia zero; diferença de

segmentados nos animais imunizados e tratados com captopril, no dia sete, e os animais

imunizados a ser tratados com enalapril, no dia zero (p = 0,01).

26

Todos os grupos apresentaram diferença interna entre os dias sete e 21, sendo não-

tratados (p = 0,03), tratados com enalapril (p = 0,007) ou captopril (p = 0,01).

Os grupos tratados apresentaram diferença entre os dias sete e 21 de um com outro,

sendo os animais imunizados e tratados com captopril, no dia sete, com os animais

imunizados e tratados com enalapril, no dia 21 (p = 0,01) e os animais imunizados e tratados

com enalapril, no dia sete, com os animais imunizados e tratados com captopril, no dia 21 (p

=0,04).

Figura 3: Percentual de neutrófilos. Representação de percentual de neutrófilos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tradatos com enalapril ou captopril, nos dias zero, sete, 14 e 21.

5.2.2 Variação do percentual de linfócitos em animais imunizados com


A tabela 3 indica as medianas do número percentual de linfócitos nos grupos


Tabela 3: Medianas do percentual de linfócitos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tratados com enalapril ou captopril nos dias zero, sete, 14 e 21.

Dia 0 (%) Dia 7 (%) Dia 14 (%) Dia 21 (%)

OVA+IFA 94,875 69,375 85,25 92,75

OVA+IFA+EP 95,125 69,625 88,375 71,125

OVA+IFA+CP 90,625 63,375 85,625 93,25

27

Os animais imunizados, tratados ou não-tratados com enalapril ou captopril, não

apresentaram diferença significante intergrupos nos dias zero, sete, 14 e 21. A figura 4 ilustra

a variação do percentual dos linfócitos no sangue periférico entre os grupos, ao longo dos dias

zero, sete, 14 e 21 de acordo com os testes Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunn.

Apresentaram diferença interna, entre os dias zero e sete, os grupos: animais imunizados

e não-tratados (p = 0,04) e os animais imunizados e tratados com enalapril (p = 0,006).

Também entre os dias zero e sete foram diferentes os grupos imunizados a ser tratados

com enalapril, dia 0, com imunizados e tratados com captopril, dia sete (p = 0,009) e

imunizados não-tratados, dia 0, com imunizados e tratados com enalapril, dia sete (p = 0,006).

Outra diferença interna ocorreu entre os dias sete e 21, com os grupos imunizados e

tratados com enalapril (p = 0,006) e imunizados e tratados com captopril (p = 0,1).

Ainda, entre os dias sete e 21, foram diferentes um com o outro os grupos imunizados e

tratados com enalapril, dia sete, com imunizados e tratados com captopril, dia 21 (p = 0,01) e

imunizados e tratados com captopril, dia sete, com imunizados e tratados com enalapril, dia

21 (p = 0,01).

Figura 4: Percentual de linfócitos. Representação de percentual de linfócitos dos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tradatos com enalapril ou captopril, nos dias zero, sete, 14 e 21.

28

5.2.3 Variação do percentual de monócitos em animais imunizados com


A tabela 4 indica as medianas do número percentual de monócitos nos grupos


Tabela 4: Medianas do percentual de monócitos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tratados com enalapril ou captopril nos dias zero, sete, 14 e 21.

Dia 0 (%) Dia 7 (%) Dia 14 (%) Dia 21 (%)

OVA+IFA 0,125 6,125 0,625 1,5

OVA+IFA+EP 0,5 6,875 0,875 0,375

OVA+IFA+CP 1,125 6,625 0,375 0,5

Não houve diferença significante intergrupos entre os animais imunizados, tratados ou

não tratados com enalapril ou captopril, nos dias zero, sete, 14 e 21. A figura 5 ilustra a

variação do percentual dos monócitos no sangue periférico entre os grupos, ao longo dos dias

zero, sete, 14 e 21 de acordo com os testes Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunn.

Apresentou diferença, entre os dias zero e sete, o grupo dos animais imunizados não

tratados (p = 0,03). Também entre o dia zero dos animais imunizados não tratados, foram

diferentes, no dia sete, os grupos imunizados e tratados com enalapril (p = 0,02) e captopril (p

= 0,02).

Houve diferença interna, entre os dias sete e 14, no grupo imunizado e tratado com

captopril (p = 0,03). Com relação ao dia sete do grupo imunizado e tratado com captopril,

também foi diferente o grupo imunizado e tratado com enalapril, no dia 14 (p = 0,02).

Também ocorreu diferença interna, entre os dias sete e 21, no grupo imunizado e tratado

com enalapril (p = 0,02). Ocorreu ainda diferença entre o grupo imunizado e tratado com

captopril, no dia sete, e o grupo imunizado e tratado com enalapril, no dia 21 (p = 0,01).

29

Figura 5: Percentual de monócitos. Representação de percentual de monócitos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tradatos com enalapril ou captopril, nos dias zero, sete, 14 e 21.

5.2.4 Variação do percentual de eosinófilos em animais imunizados com


A tabela 5 indica as medianas do número percentual de eosinófilos nos grupos


Tabela 5: Medianas do percentual de eosinófilos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tratados com enalapril ou captopril nos dias zero, sete, 14 e 21.

Dia 0 (%) Dia 7 (%) Dia 14 (%) Dia 21 (%)

OVA+IFA 0 0,375 1,75 1,25

OVA+IFA+EP 0 1,5 0,875 1

OVA+IFA+CP 0,25 1,375 1,125 0,75

Não houve diferença intergrupos entre os animais imunizados, tratados ou não tratados

com enalapril ou captopril, nos dias zero, sete, 14 e 21. A figura 6 ilustra a variação do

percentual dos eosinófilos no sangue periférico entre os grupos, ao longo dos dias zero, sete,

14 e 21 de acordo com os testes Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunn.

30

Houve diferença estatística interna entre os dias zero e sete no grupo imunizado e

tratado com enalapril (p = 0,03). Com relação ao dia zero do grupo imunizado a ser tratado

com enalapril, também foi diferente o grupo imunizado e tratado com captopril (p = 0,03).

Ainda, o grupo não tratados, no dia zero, foi diferente do grupo imunizado e tratado

com enalapril, no dia sete (p = 0,03). Foi diferente também o grupo não tratado entre os dias

zeo e 21 (p = 0,02).

Figura 6: Percentual de eosinófilos. Representação de percentual de eosinófilos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tradatos com enalapril ou captopril, nos dias zero, sete, 14 e 21.

5.3 Efeito do enalapril e do captopril sobre a contagem de esplenócitos de animais

imunizados com ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund

Os grupos analisados não apresentaram diferença estatística entre si, conforme mostrado

na figura 7 de acordo com os testes Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunn.

As medianas do número de esplenócitos por grupo foram 29,66 x 106 céls/mL grupo

OVA+IFA, 27,49 x 106 céls/mL grupo OVA+IFA+EP e 25,71 x 106 céls/mL grupo

OVA+IFA+CP.

31

Figura 7: Número de esplenócitos. Número de esplenócitos dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tradatos com enalapril ou captopril.

5.4 Efeito do enalapril e do captopril sobre os pesos corporais e de vísceras de

animais imunizados com ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund

Não houve diferença estatística entre os grupos analisados para nenhum peso de acordo

com os testes Kruskal-Wallis, com pós teste de Dunn.

Tabela 6: Medianas dos pesos: corporal antes e após tratamento e dos órgãos fígado e baço dos animais imunizados com OVA+IFA dos grupos não tratado e tratados com enalapril ou captopril.

Peso corporal pré-tratamento (g)

Peso corporal pós- tratamento (g)

Peso do fígado (g)

Peso do baço (g)

OVA+IFA 18,32 21,05 996 0,069

OVA+IFA+EP 20,6975 21,88 953 0,073

OVA+IFA+CP 20,5075 20,78 956 0,057

32

5.5 Quantificação de IgG1 sérica anti-ovalbumina dos animais imunizados com

ovalbumina com adjuvante incompleto de Freund não tratados e tratados com enalapril e

captopril

Os resultados expressos na figura 11 mostram que os valores de absorbância tinham

medianas no 14º dia: 0,32 grupo OVA+IFA, 0,42 grupo OVA+IFA+EP e 0,41 grupo

OVA+IFA+CP e medianas no 21º dia 0,92 grupo OVA+IFA, 1,31 grupo OVA+IFA+EP e

1,03 grupo OVA+IFA+CP. Esses valores não diferem de forma estatisticamente

significantemente dos níveis séricos nem a cinética da produção de IgG1 específica para OVA

em camundongos imunizados com OVA+IFA de acordo com os testes Kruskal-Wallis, com

pós teste de Dunn.

Figura 8: Dosagem de IgG1 nos dias 14 e 21. Comparativo de dosagem de IgG1 nos dias 14 e 21 entre os animais imunizados com OVA+IFA nos grupos não tratado e tradatos com enalapril ou captopril.

33

6. Discussão

Neste estudo, verificou-se que os medicamentos, captopril e enalapril, não induziram

mudanças estatisticamente significantes nem no número de leucócitos totais, nem no perfil

percentual do diferencial leucocitário induzido pelo adjuvante neste modelo murino com

camundongos C57BL/6.

As quantidades iniciais de leucócitos totais levemente aumentadas, porém sem

significância estatística entre os grupos, foi basicamente mantida ao longo do experimento,

tendendo a um leve aumento entre o dia zero e o dia sete e redução gradual do dia sete até o

dia 21, concordando com a cinética da resposta imune clássica e com o uso de uma

quantidade pequena do adjuvante incompleto de Freund, usado somente na primeira

imunização.

Concomitante ao aumento do percentual de neutrófilos foi encontrado um aumento do

percentual de monócitos, possivelmente relacionados ao potencial fagocítico dessas células,

num esforço para eliminar o adjuvante, que é à base de óleo mineral e, portanto não

metabolizável. O aumento do numero de neutrófilos circulantes corrobora os dados de Yang

et al (2010)29 que mostraram um aumento do número de neutrófilos logo após imunização

com posterior redução até níveis basais semelhantes aos iniciais. Simultâneo ao aumento de

neutrófilos e monócitos, ocorreu uma leve redução do percentual de linfócitos. Postula-se que

a redução moderada dos linfócitos circulantes, pode estar relacionada à compensação pelo

aumento dos neutrófilos e monócitos circulantes. Pode-se também postular que a leve

diminuição dos linfócitos circulantes, verificada no 7º dia após a imunização primária, pode

estar relacionada ao aprisionamento, no baço, dos linfócitos específicos para a ovalbumina,

com posterior normalização da quantidade das células circulantes.

É bem conhecido que em uma resposta imune induzida por antígenos T-dependentes há

o recrutamento dos linfócitos específicos para o local da resposta ³¹. Sabe-se também que,

decorridos alguns dias após o inicio da resposta, ocorre a contração dessa devido à morte das

células efetoras e redistribuição dos plasmócitos de vida longa e das células de memória

imunológica para o antígeno. Esses eventos clássicos da resposta imune justificam o não

aumento do número de esplenócitos, verificado no 21º dia após a imunização inicial.

34

Verificou-se, nesse estudo, que não houve diferença no ganho do peso corporal entre

camundongos que foram tratados com captopril ou enalapril e aqueles que foram deixados

sem tratamento. Esse resultado corrobora os dados da literatura, mostrando que o uso de

captopril e enalapril, não acarreta em ganho ou perda de peso corporal significante, o que já

era esperado pelos resultados pré-clínicos dos laboratórios farmacêuticos que trabalham com

os medicamentos e nunca relataram efeito de aumento de peso.

Verificou-se também que o peso do fígado e do baço não apresentaram diferenças

significantes entre os animais que receberam captopril ou enalapril e aqueles que foram

deixados sem tratamento. Esse dado mostra que o uso racional desses medicamentos na

pesquisa experimental não promove um aumento do peso de órgãos como o fígado e o baço,

sugerindo que o modelo murino tolera bem esses medicamentos, no caso do fígado a

manutenção do peso refutando uma hepatotoxicidade e, no caso do baço, refletindo a

normalidade do número de esplenócitos.

O aumento dos títulos de IgG1 séricos reflete a atividade imune esperada no mecanismo

de secreção de IgG 30,31, por se tratar de uma classe de anticorpos naturalmente tardia, foi

observada principalmente nos 14º e 21º dias, exemplificando o modelo imunológico clássico

da produção de imunoglobulinas gamma. O aumento estatisticamente insignificante do título

de anticorpos entre o 14º e o 21º dias, mesmo com o reforço de antígeno, provavelmente se

deve ao fato de que no 14º dia havia grande quantidade de anticorpos circulantes, fazendo

com que o antígeno injetado no reforço fosse rapidamente ligado aos anticorpos circulantes,

formando um imunocomplexo facilmente eliminado pelo organismo.

35

7. Conclusão

A partir dos dados obtidos pode-se concluir que nas condições experimentais deste

trabalho o tratamento com captopril ou enalapril não alterou o número de leucócitos totais. O

perfil do diferencial leucocitário seguiu a influencia do adjuvante utilizado na imunização,

sem alterações pelo uso desses medicamentos.

Com a metodologia empregada, o tratamento com captopril ou enalapril não alterou os

pesos, tanto corporal quanto dos órgãos, fígado e baço.

A quantidade de anticorpos IgG1 seguiu a cinética padrão esperada pelo sistema imune.

De um modo geral, nem o uso de enalapril nem o uso de captopril não incorreu alterou

os parâmetros imunológicos avaliados em animais imunizados com OVA+IFA.

36

8. Referências bibliográficas

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9. Anexo

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Dissertação Deborah de Arruda Isoton - UFMT