DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO … · Biologia Estrutural e Funcional. ... caatinga that inhabits rocky areas and have crepuscular habits. ... Esquema dos principais

MARIA EMANUELA MARTINS DOS REIS

DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO DIENCÉFALO

DO MOCÓ (Kerodon rupestris)

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Natal-RN

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL

DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO DIENCÉFALO

DO MOCÓ (Kerodon rupestris)

ORIENTADOR

Judney Cley Cavalcante

Natal-RN

2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas – SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências – CB

Reis, Maria Emanuela Martins dos.

Distribuição de neurônios nitrérgicos no diencéfalo do mocó (Kerodon rupestris) / Maria Emanuela Martins dos Reis. - Natal,

2016.

92 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional.

Orientador: Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante.

1. Óxido nítrico - Dissertação. 2. Kerodon rupestris - Dissertação. 3. Diencéfalo - Dissertação. I. Cavalcante, Judney Cley. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.

Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 661.982

REIS, M. E. M. Distribuição de neurônios nitrérgicos no diencéfalo do mocó

(Kerodon rupestris). Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio

Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Biologia Estrutural e

Funcional.

Aprovado em: 20/12/2016

Banca Examinadora

Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante. Instituição: UFRN

Julgamento: _________________________ Assinatura: ______________________

Prof. Dr. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima. Instituição: UFRN


Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior. Instituição: UNESP


AGRADECIMENTOS

A meus pais, Horácio por ter abdicado de muitas coisas para que eu realizasse meu sonho de fazer um mestrado, e minha mãe Ione, por tudo que faz por mim, sem você eu não seria quem sou hoje. A minha avó “Dona Nena” que me ajudou nos meus primeiros meses em Natal e por todo o seu amor. Ao professor Judney, meu orientador, por ter me apresentado ao mundo científico e ter disponibilizado seu tempo e paciência para tornar este trabalho concreto. A professora Miriam por ter ajudado a mim e aos meninos doando parte do seu projeto para que pudéssemos concluir nosso mestrado. Ao professor Expedito por todos momentos de descontração no LabNeuro e todas dúvidas tiradas durante todo o período do mestrado. Ao professor Ruthnaldo por aceitar meu convite para membro da banca da qualificação e defesa, e pelas sugestões feitas a mim para melhorar a qualidade desta dissertação. Ao professor José de Anchieta por vir de tão longe fazer parte da banca examinadora. A meus dois grandes “irmãos de orientação”, Wylqui por toda paciência que teve em me ensinar as técnicas necessárias para nosso trabalho, por ser amigo e me fazer dar muitas risadas e a Mario, por sempre que pode estar junto comigo nos experimentos, nas várias tentativas e erros, se tornando um grande amigo. A minhas amigas Ana Lídia, Larissa, Jéssica e Dandara, agradeço todos os dias, por tornarem a vida mais leve e me fazer esquecer os problemas (pelo menos por um momento). Aos colegas do LabNeuro, Fladjany, Joacil, Melqui, Nelyane, Nayana, Mayara, Brena, Paloma, Ana, Naryllene, Daniel (Tiago), Paulão e Hélder pelos momentos de descontração e risadas. E especialmente a Nayra, colegas de laboratório e da turma do mestrado, que sou eternamente grata por ter cedido parte de seu projeto, e por ter se tornado uma grande amiga. A dona Regina agradeço e peço desculpa pelas várias vezes em que esqueci de marcar antecipadamente os experimentos.

A CAPES e ao CNPQ pelo apoio financeiro.

RESUMO

O óxido nítrico (NO) é uma molécula muito simples (N=O), gasosa, com propriedades químicas de um radical livre e até meados da década de 1980 era considerado apenas membro de uma família de poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais. Desde sua descoberta no sistema nervoso, NO tem sido implicado em diversas funções, o que condiz com sua ampla distribuição no encéfalo. NO também tem sido descrito no encéfalo de diversas espécies animais, mas ainda não foi descrito em mocó (Kerodon rupestris), um roedor endêmico da caatinga brasileira que habita áreas rochosas e tem hábitos crepusculares. Devido a estas características interessantes objetivamos descrever a distribuição do NO do diencéfalo do mocó. Através das técnicas de imunoperoxidase padrão contra a óxido nítrico sintase (NOS), enzima de síntese de NO, e histoquímica para NADPH-diaforase pudemos identificar de forma indireta a presença de neurônios nitrérgicos ao longo de todo diencéfalo. O hipotálamo apresentou uma densidade alta de neurônios imunorreativos a NOS (NOS-IR) em vários núcleos, dentre eles alguns como o núcleo supraóptico, decussação supraóptica e a parte lateral da área retroquiasmática. Com densidade moderada temos a área pré-óptica lateral, o núcleo pré-óptico magnocelular, a parte parvocelular anterior e a parte parvocelular medial do núcleo paraventricular do hipotálamo, o núcleo ventrolateral do hipotálamo, a parte peduncular da área hipotalâmica lateral e o núcleo posterior do hipotálamo. A divisão anterior do núcleo ventromedial do hipotálamo e a área hipotalâmica dorsal apresentaram densidade baixa, e a parte lateral do núcleo pré-óptico medial apresentou densidade muito baixa. No tálamo, neurônios NOS-IR estiveram presentes no núcleo geniculado ventral com densidade alta. Na parte lateral do núcleo habenular lateral, o núcleo talâmico posterodorsal ventral e a parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior com densidade moderada. O núcleo paraventricular do tálamo, zona incerta e o núcleo talâmico parafascicular, apresentaram densidade baixa. Comparando nossos resultados com o descrito em outros animais podemos dizer que o sistema nitrégico é um sistema de neurotransmissor evolutivamente bem conservado.

Palavras-chave: Óxido nítrico, Mocó, Kerodon rupestris, Diencéfalo, Óxido nítrico

sintase.

ABSTRACT

Nitric oxide (NO) is a simple molecule (N=O), a gas with a free radical property whose until the 80s was considered a member of a family of environmental pollutants and a potential carcinogen. Since its discovery in the nervous system, NO has been implicated in several functions, what suits with its wide distribution in the brain. NO has been described in the brain of many animal species, but it was not described in the brain of the rocky cave (Kerodon rupestris), an endemic rodent of the Brazilian caatinga that inhabits rocky areas and have crepuscular habits. Due to these interesting characteristics we aim to describe the NO distribution of the rocky cavy diencephalon. Using standard immunoperoxidase against nitric oxide synthase (NOS), the NO synthesis enzyme, and histochemistry for NADPH-diaphorase, we were able to indirectly identify the presence of nitrergic neurons throughout the entire diencephalon. The hypothalamus showed a high density of NOS-IR neurons in several nuclei, among them the supraoptic nucleus, supraoptic decussation and the lateral part of the retrochiasmatic area. With moderate density we have the lateral pre-optic area, the preocular magnocellular nucleus, the anterior parvocellular part and the medial parvocellular part of the paraventricular nucleus of the hypothalamus, the ventrolateral nucleus of the hypothalamus, the peduncular part of the lateral hypothalamic area and the posterior nucleus of the hypothalamus. The anterior division of the ventromedial nucleus of the hypothalamus and the dorsal hypothalamic area presented low density, and the lateral part of the medial pre-optic nucleus presented very low density. In the thalamus, NOS-IR neurons were present in the ventral geniculate nucleus with high density. In the lateral part of the lateral habenular nucleus, the ventral posterodorsal thalamic nucleus and the mediocaudal part of the posterior thalamic nucleus with moderate density. The paraventricular nucleus of the thalamus, zona incerta and the parafascicular thalamic nucleus, presented low density. Comparing our results with those described in other animals we can say that the nitric system is an evolutionarily well-conserved neurotransmitter system.

Keywords: Nitric oxide, Rock cavy, Kerodon rupestris, Diencephalon, Nitric oxide

synthase.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Densidade e intensidade dos núcleos imunorreativos a NOS. (pag. 38)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Modelo linear da sequência de reconhecimento de fatores dentro do cDNA

de NOS. Nele temos área para a fosforilase da proteína cinase A (PKAP), ligante de calmodulina (CaM), ligante de flavinas (FMN e FAD) e de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994). (pag. 20) Figura 2. Síntese, liberação e terminação do NO (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994). (pag. 21) Figura 3. Reação catalisada pela NOS (Retirado de Calabrese et al., 2007). (pag. 22) Figura 4. Esquema dos principais núcleos do tálamo. DL, núcleo dorsal lateral; GL,

núcleo geniculado lateral; GM, núcleo geniculado medial; GNA, grupo nuclear anterior; LP, núcleo lateral posterior; MD, núcleo mediodorsal; P, pulvinar; R, núcleo reticular; VA, núcleo ventral anterior; VL, núcleo ventral lateral; VPL, núcleo ventral posterolateral; VPM, núcleo ventral posteromedial. (Adaptado de Standring, 2010). (pag. 24) Figura 5. Esquema dos principais núcleos e subdivisões do hipotálamo em regiões no encéfalo de rato. ac, comissura anterior; AHA, área hipotalâmica anterior; ArC, núcleo arqueado; DA, área hipotalâmica dorsal; DLPO, área pré-óptica dorsolateral; DMH, núcleo dorsomedial; LHA, área hipotalâmica lateral; MM, núcleo mamilar medial; MnPO, núcleo pré-óptico mediano; MPA, área pré-óptica medial; och, quiasma óptico; PHA, área hipotalâmica posterior; PaV, núcleo paraventricular do hipotálamo; SCh, núcleo supraquiasmático; SO, núcleo supraóptico; RMM, núcleo retromamilar medial; VLPO, núcleo pré-óptico ventrolateral; VMH, núcleo ventromedial. (Adaptado de Saper e Lowell, 2014). (pag. 26) Figura 6. O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural. (pag. 29) Figura 7. Encéfalo do mocó em vista ventral, lateral e dorsal. Escala de régua em centímetros. (pag. 33) Figura 8. Exemplos das diferentes intensidades de marcação celular das células

marcadas por imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo. (pag. 37) Figura 9. Exemplos da quantificação subjetiva da densidade das células marcadas por imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo. (pag. 37) Figura 10. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó

ilustrando a morfologia e a distribuição dos neurônios NOS-IR do diencéfalo e de fotomicrografias submetidas ao método de coloração de Nissl no nível correspondente. Representação do nível mais rostral em (A) e do nível mais caudal em (M). Ver lista de abreviações. (pag. 42) Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de

mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-

óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico mediano (MnPO). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo septohipotalâmico (SHy). f, fórnice; ac, comissura anterior; 3V, terceiro ventrículo; LV, ventrículo lateral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 48) Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de

mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão medial do núcleo pré-óptico medial (MPOM). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a área pré-óptica lateral (LPO). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo supraóptico. (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO). f, fórnice; LV, ventrículo lateral; 3V, terceiro ventrículo; och, quiasma óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C, D e E. (pag. 49) Figura 13. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte parvocelular anterior (PaAP). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular do hipotálamo lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo ventrolateral do hipotálamo (VLH). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 50) Figura 14. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão anterior do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHa). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 51) Figura 15. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de

mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsomedial do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHdm). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; EM, eminência mediana. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B ,C e D. (pag. 52) Figura 16. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de

mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte compacta do núcleo

dorsomedial (DMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventral do núcleo dorsomedial (DMV). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte posterior do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHp). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; mt, trato mamilotalâmico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 53) Figura 17. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo premamilar dorsal (PMD). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo premamilar ventral (PMV). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 54) Figura 18. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de

mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente as partes medial e lateral do núcleo retromamilar (RMM e RML). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral do núcleo mamilar medial (ML). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 55) Figura 19. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de

mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar lateral (RML). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar medial (RMM). 3V, terceiro ventrículo; cp, pedúnculo cerebral; MM, parte medial do núcleo mamilar medial. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 56) Figura 20. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo geniculado ventral (VG). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte caudal da zona incerta (ZIC). APTD, parte dorsal do núcleo pré-tectal anterior; APTV, parte ventral do núcleo pré-tectal anterior; MHb, núcleo habenular medial; PrC, núcleo pré comissural; opt, trato óptico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 58) Figura 21. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente

ao núcleo geniculado ventral (VG). bsc, braço do colículo superior MCPC, núcleo magnocelular da comissura posterior; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; SNR, parte reticulada da substância negra. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 59) Figura 22. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). csc, comissura do colículo superior; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial; Aq, aqueduto; opt, trato óptico; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; PP, núcleo peripeduncular. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B. (pag. 60) Figura 23. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de

mocó submetidas à histoquimica para NADPH-diaforase (A) e imunoistoquimica para NOS (B). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em B com área correspondente ao VMHvl. opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A e B, 100 µm em C e D. (pag. 61) Figura 24. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à histoquimica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte parvocelular anterior do núcleo paraventricular do hipotálamo (PaAP) (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular da área hipotalâmica lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a decussação supraóptica (sox). f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 62) Figura 25. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à histoquimica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). opt, trato óptico; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial Aq, aqueduto; csc, comissura do colículo superior . Barra: 500 µm em A, 100 µm em B. (pag. 63)

LISTA DE ABREVIATURAS

AC - comissura anterior

AHA - área hipotalâmica anterior

ARC - núcleo arqueado

AvP - arginina vasopressina

CaM - calmodulina

cGMP - guanosina monofosfato cíclico

CRH - hormônio liberador da corticotrofina

DHA - área hipotalâmica dorsal

DL - núcleo dorsal lateral

DLPO - área pré-óptica dorsolateral

DMC - divisão compacta do núcleo dorsomedial do hipotálamo

DMD - divisão dorsal do núcleo dorsomedial do hipotálamo

DMH - núcleo dorsomedial núcleus

DMV - divisão ventral do núcleo dorsomedial do hipotálamo

EDRF - endothelial-derivated relaxing factor

eNOS - óxido nítrico sintase endotelial

FAD - flavina adenina dinucleotídeo

FMN - flavina mononucleotídeo

GC - guanilato ciclase

GL - núcleo geniculado lateral

GM - núcleo geniculado medial

GNA - grupo nuclear anterior

GnRH - hormônio liberador de gonadotrofina

GTP - guanosina trifosfato

LHA - área hipotalâmica lateral

LHbL - parte lateral do núcleo habenular lateral

LM - núcleo mamilar lateral

LM - núcleos da linha média

LP - núcleo lateral posterior

LPMC - parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral

LPO - área pré-óptica lateral

LTD - long-term depression

LTP - long-term potentiation

macNOS - óxido nítrico sintase dos macrófagos

MAM - núcleo mamilar

MCPO - núcleo pré-óptico magnocelular

MD - núcleo mediodorsal

MGD - parte dorsal do núcleo geniculado medial

MGV - parte ventral do núcleo geniculado medial

ML - divisão lateral do núcleo mamilar medial

MNPO - núcleo pré-óptico mediano

MnPO - núcleo pré-óptico mediano

MPA - área pré-óptica medial

MPO - área pré-óptica medial

MPO - núcleo pré-óptico medial

MPOL - divisão lateral do do núcleo pré-óptico medial

MPOM - divisão medial do núcleo pré-óptico medial

N₂O - óxido nitroso

NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NADPHd - NADPH-diaforase

NMDA - N-metil-d-aspartato

nNOS - óxido nítrico sintase neuronal

NO - óxido nítrico

NOS - óxido nítrico sintase

NOS-IR - neurônios imunorreativos para NOS

och - quiasma óptico

P - pulvinar

PaAP - parte parvocelular anterior do núcleo paraventricular do hipotálamo

PaMM - parte parvocelular medial do núcleo paraventricular do hipotálamo

PaV - parte ventral do núcleo paraventricular do hipotálamo

Pe - núcleo periventricular do hipotálamo

PF - núcleo talâmico parafascicular

PH - núcleo posterior do hipotálamo

PHA - área hipotalâmica posterior

PHA - área hipotalâmica posterior

PKAP - fosforilase da proteína cinase A

PLH - área hipotalâmica lateral (parte peduncular)

PMD - núcleo pré-mamilar dorsal

PMV - núcleo pré-mamilar ventral

PV - núcleo paraventricular do hipotálamo

PVA - divisão anterior do núcleo paraventricular do tálamo

PVH - núcleo paraventricular do hipotálamo

PVM - divisão medial do núcleo paraventricular do tálamo

PVP - divisão posterior do núcleo paraventricular do tálamo

PVT - núcleo paraventricular do tálamo

R - núcleo reticular

RChL - área retroquiasmática (parte lateral)

RML - divisão lateral do núcleo retromamilar

RMM - divisão medial do núcleo retromamilar

RMM - núcleo retromamilar medial

SCN - núcleo supraquiasmático

SHy - núcleo septohipotalâmico

SO - núcleo supraóptico

SON - núcleo supraóptico

sox - decussação supraóptica

TMN - núcleo tuberomammilar

TuLH - área hipotalâmica lateral (parte tuberal)

VA - núcleo ventral anterior

VG - núcleo geniculado ventral

VL - núcleo ventral lateral

VLH - núcleo ventrolateral do hipotálamo

VLPO - núcleo pré-óptico ventrolateral

VLPO - núcleo pré-óptico ventrolateral

VMH - núcleo ventromedial

VMH - núcleo ventromedial do hipotálamo

VMHa - divisão anterior do núcleo ventromedial do hipotálamo

VMHc - divisão central do núcleo ventromedial do hipotálamo

VMHdm - divisão dorsomedial do núcleo ventromedial do hipotálamo

VMHvl - divisão ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo

VPL - núcleo ventral posterolateral

VPM - núcleo talâmico posterodorsal ventral

ZI - zona incerta

ZIC - parte central da zona incerta

SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................................................... 6

ABSTRACT ...................................................................................................................... 7

1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................19

1.1 Óxido nítrico.........................................................................................................19

1.1.1 Síntese do Óxido Nítrico .............................................................................20

1.1.3 Implicações funcionais ...............................................................................23

1.2 Diencéfalo .............................................................................................................25

1.2.1 Tálamo ............................................................................................................25

1.2.2 Hipotálamo ....................................................................................................26

1.2.3 Subtálamo ...................................................................................................28

1.2.4 Epitálamo ....................................................................................................28

1.3 Modelo experimental ..........................................................................................29

2. OBJETIVOS ................................................................................................................32

2.1 Objetivo Geral ......................................................................................................32

2.2 Objetivos específicos .........................................................................................32

3. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................33

3.1 Sujeitos .................................................................................................................33

3.2 Anestesia ..............................................................................................................33

3.3 Perfusão ................................................................................................................33

3.4 Remoção dos encéfalos ....................................................................................34

3.5 Microtomia ............................................................................................................35

3.6 Método de Nissl ...................................................................................................35

3.7 Imunoistoquímica ...............................................................................................36

3.8 Histoquímica ........................................................................................................36

3.9 Análise e documentação das imagens ...........................................................37

4. RESULTADOS ............................................................................................................39

4.1 Imunoistoquímica ...............................................................................................39

4.1.1 Hipotálamo ....................................................................................................41

Região pré-óptica ....................................................................................................41

Região anterior.........................................................................................................42

Região tuberal ..........................................................................................................46

Região mamilar ........................................................................................................47

4.1.2 Tálamo ............................................................................................................58

4.2 Histoquímica ........................................................................................................62

5. DISCUSSÃO ................................................................................................................65

5.1 O NO nos vertebrados........................................................................................66

5.2 Aspectos neuroanatômicos do diencéfalo do Mocó ....................................67

5.3 Aspectos funcionais do NO no diencéfalo .....................................................71

6. CONCLUSÃO ..............................................................................................................77

REFERÊNCIAS ...............................................................................................................78

ANEXOS ................................................................................ Erro! Indicador não definido.

19

1. INTRODUÇÃO

1.1 Óxido nítrico

O óxido nítrico (NO) é uma molécula muito simples (N=O), gasosa, com

propriedades químicas de um radical livre e frequentemente confundida com o gás

óxido nitroso (N₂O) que é conhecido como gás hilariante e terapeuticamente usado

como anestésico e ansiolítico (Snyder, 1992). Até meados da década de 1980, o NO

era considerado apenas membro de uma família de poluentes ambientais

indesejáveis e carcinógenos potenciais (James, 1995). A descoberta das funções

biológicas do NO foi quase simultânea em três diferentes estudos.

O primeiro estudo constava da investigação do papel do endotélio vascular

no processo de relaxamento do vaso sanguíneo. O interesse por esta questão teve

origem nas conclusões de Furchgott e colaboradores (1980) de que a ação de

alguns vasodilatadores, como a acetilcolina, era inteiramente dependente da

presença do endotélio intacto e envolvia a liberação do então chamado endothelial-

derivated relaxing factor (EDRF) devido a sua ação relaxante vascular, promovendo

vasodilatação pela ativação de guanilato ciclase, portanto produzindo um aumento

de guanosina monofosfato cíclico (cGMP). Cerca de sete anos após a descoberta do

EDRF, estudos detalhados da sua ação biológica nos vasos (Ignarro et al., 1987;

Palmer et al., 1987; Moncada et al., 1988) e nas plaquetas (Radomski et al., 1987)

demonstraram que este composto era idêntico ao NO.

O segundo estudo tratava da questão da produção de óxidos de nitrogênio

pelos mamíferos. Schmidt e Walter (1994) relataram que no início do século XX foi

sugerido que os mamíferos produziam óxidos de nitrogênio, quando se demonstrou

que a quantidade eliminada destes compostos excedia a quantidade ingerida. Esta

observação, entretanto, foi ignorada até o final da década de 1970. Durante todo

este período, acreditou-se que óxidos de nitrogênio inorgânicos eram produzidos

somente por bactérias, via reações de nitrificação e denitrificação, e que em

mamíferos estes compostos derivavam da dieta (Szabó, 1995). Depois de diversos

estudos sobre o tema (Green et al., 1981; Hegesh e Shiloah, 1982; Stuehr e

Marletta, 1985; Hibbs et al., 1987; Snyder e Bredt, 1992), esta hipótese foi

comprovada e ficou demonstrado que o NO é o principal mediador citotóxico de

20

células imunes efetoras ativadas e constitui a mais importante molécula reguladora

do sistema imune (Hibbs et al., 1988; Marletta et al., 1988).

O último estudo estava associado à investigação do mecanismo de ação de

neurotransmissores. Ferrendelli e colaboradores (1974) demonstraram que o

glutamato, um conhecido neurotransmissor, provocava um aumento de cGMP na

parte central do sistema nervoso. Miki e colaboradores (1977) demonstraram a

ativação da guanilato ciclase cerebral pelo NO. Em 1989, foi confirmada a produção

de NO no sistema nervoso (Bredt e Snyder, 1989; Knowles et al., 1989) e

demonstrado que o glutamato é o mediador da liberação de NO por receptores N-

metil-d-aspartato (NMDA) (Garthwaite et al., 1989). No ano seguinte, foi isolada do

cerebelo de rato e purificada uma isoforma da enzima responsável pela formação de

NO, a óxido nítrico sintase (NOS). O desfecho comum desses três estudos fez com

que o NO passasse da condição de molécula sem importância biológica e pouco

estudada para a de um dos mais importantes mediadores de processos intra e

extracelulares.

Apesar de estar presente em neurônios e satisfazer diversos critérios quanto

a sua ação como neurotransmissor, NO está longe de se assemelhar com outros

neurotransmissores. A maioria dos neurotransmissores conhecidos são pequenas

moléculas hidrofílicas, acumuladas, concentradas e transportadas em vesículas,

liberadas na fenda sináptica por exocitose, agem em receptores na membrana pós-

sináptica e são degradadas na fenda e/ou recaptadas para o interior do neurônio ou

glia. NO não obedece nenhum desses fenômenos, ele é uma molécula gasosa de

livre trânsito através da membrana celular, não possui um receptor de membrana,

não é acumulado em vesículas ou está associado com membranas, parecendo ser

amplamente citoplasmático (Knowles e Moncada, 1994). Mas assim como a maioria

dos outros neurotransmissores sua síntese é enzimática.

1.1.1 Síntese do Óxido Nítrico

A NOS converte arginina em citrulina e NO. Existem três tipos de NOS: a

produzida pelos macrófagos (macNOS); a produzida pelas células endoteliais dos

vasos (eNOS); e a neuronal (nNOS), sendo as duas últimas muito semelhantes

(Palmer et al., 1987; Ignarro et al., 1987; Marletta et al., 1988; Garthwaite et al.,

21

1988). Como nos destinamos apenas ao estudo do NO no sistema nervoso

passaremos a nos referir a nNOS apenas como NOS.

Estudos químicos mostraram que NOS é um complexo enzimático que

requer vários co-fatores e para isso existem áreas que reconhecem esse co-fatores

em sua sequência (Fig. 1).

Figura 1. Modelo linear da sequência de reconhecimento de fatores dentro do cDNA de

NOS. Nele temos área para a fosforilase da proteína cinase A (PKAP), ligante de calmodulina (CaM), ligante de flavinas (FMN e FAD) e de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994).

Entre estes estão nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH),

flavinas e Ca⁺/calmodulina (Bredt et al., 1991; Mayer, 1995). A síntese de NO

neuronal é estimulada pelo glutamato que é liberado de vesículas do neurônio pré-

sináptico e liga-se aos receptores, principalmente os do tipo NMDA do neurônio pós-

sináptico. Esta ligação abre um canal no receptor permitindo a entrada de Ca²⁺ para

o interior da célula. O aumento na concentração de íons cálcio no neurônio pós-

sináptico gera a ativação da proteína quinase dependente de cálcio, a calmodulina

(CaM) – uma proteína de baixo peso molecular e que age como uma subunidade

para muitas enzimas dependentes de Ca²⁺ (Fig. 2). Esta ativação cria o complexo

Ca²⁺/ calmodulina que se liga a NOS. A síntese de NO ocorre pelo transporte de

elétrons catalisado pela NOS e seus co-fatores, reação essa onde a L-arginina é

convertida em L-citrulina e NO (Fig. 3) (Saavedra, 1997).

Difundindo para o neurônio pré-sináptico, o NO ativa a enzima guanilato

ciclase (GC). GC é um heterodímero de aproximadamente 143kDa de massa

molecular. GC está livre no citoplasma onde converte guanosina trifosfato (GTP) em

cGMP, que é uma importante molécula sinalizadora envolvida em vários eventos

intracelulares (Koesling et al., 1995).

22

Figura 2. Síntese, liberação e terminação do NO (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994).

GC possui um domínio ligado a uma molécula de ferro onde NO se liga com

especificidade, removendo a molécula de ferro e ativando-a (Koesling et al., 1995).

Como citado acima GC formará cGMP. cGMP é uma grande família de proteínas

que podem ser basicamente divididas em três: cGMP cinases, cGMP reguladores de

fosfodiesterases e cGMP reguladores de canais de íons. cGMP cinase promove

fosforilação de outras proteínas que podem dar sequência a uma cadeia de

sinalização intracelular ou regular canais de íons; cGMP reguladora de canais de

íons promove a regulação de um canal específico, não seletivo de íons; cGMP

reguladora de fosfodiesterase regula fosfodiesterases, que são importantes em

cadeias intracelulares (Lincoln, 1995).

Por ser uma molécula que atravessa membrana celular, NO naturalmente se

difunde do neurônio em que é produzido para o neurônio pré-sináptico, cuja ativação

de GC leva a liberação de glutamato, realizando a regulação de LTP (long-term

potentiation) (Moncada e Higgs, 1993). A ação do NO é então finalizada com a sua

difusão para outras áreas, onde por reação com oxigênio será convertido em

nitrito/nitrato (Dawson e Snyder, 1994).

23

Figura 3. Reação catalisada pela NOS (Retirado de Calabrese et al., 2007).

Devido ao NO ter uma ação rápida, meia-vida curta e não ter enzima de

degradação, a ação da NOS tem que ser precisa e muito bem regulada. O principal

limitante da ação da NOS, como já citado, é a disponibilidade de arginina e

CA⁺/calmodulina. Porém, a disponibilidade e ação de outros co-fatores são

essenciais para regulação da NOS (Knowles et al., 1989; Tayeh e Marletta, 1989;

Know et al., 1990; Leone et al., 1991).

Estudos têm demonstrado que neurônios nitrégicos e que apresentam

atividade NADPH-diaforase (NADPHd) são os mesmos (Bredt et al., 1991; Dawson

et al., 1991) e que NADPHd agiria como uma NOS (Hope et al., 1991), portanto a

marcação histoquímica de NADPHd é uma excelente ferramenta para o estudo da

distribuição de NO, assim como a imunoistoquímica contra a NOS. Utilizando estas

técnicas foi possível observar que neurônios nitrégicos estão distribuídos por toda a

extensão da parte central do sistema nervoso desde o telencéfalo até a medula

espinal (Bredt et al., 1990; Bredt et al., 1991; Vincent & Kimura, 1992; Vincent,

1995).

1.1.3 Implicações funcionais

Desde sua descoberta no sistema nervoso, NO tem sido implicado em

diversas funções, o que condiz com sua ampla distribuição na parte central do

sistema nervoso. Assim como em macrófagos, NO neuronal também tem uma

função citotóxica (em altas concentrações) ao mesmo tempo que neurônios

24

nitrérgicos são resistentes a isquemia cerebral e doenças neurodegenerativas,

sugerindo assim um papel neuroprotetor ao NO (Varner e Beckman, 1995). Diante

disso, alguns autores como Schmidt e Walter (1994) denominam muito

apropriadamente o NO como uma “faca de dois gumes”.

Como mencionado anteriormente, NO tem um papel fundamental na

elevação dos níveis de cGMP após ativação celular por aminoácidos excitatórios,

principalmente via receptor NMDA (Garthwaite et al., 1988; Snyder, 1992), e isso

tem sido bastante relacionado ao papel de NO na LTP, que é um aumento da

transmissão sináptica que ocorre enquanto neurônios pós-sinápticos experimentam

uma despolarização acoplado com o aumento da atividade pré-sináptica (Kang e

Schuman, 1995).

A LTP foi primeiramente demonstrada por Böhme em um experimento com

camundongos, em que o bloqueio de formação de NO levou à ausência de

condicionamento e de resposta olfatória (Böhme et al., 1991 e 1993). A LTP tem

sido observada em diversas áreas da parte central do sistema nervoso, mas tem

sido estudada mais intensamente no hipocampo onde tem sido relacionada com

mecanismos de aprendizado e memória (Bon e Garthwaite, 2003). NO também tem

sido relacionado a LTD (long-term depression), que é um enfraquecimento

persistente da sinapse (Kang e Schuman, 1995). NO, por ser uma molécula de livre

trânsito através dos neurônios, pode promover uma sinapse retrógrada, ou seja,

dendro-axonal, e esta característica parece fundamental para os fenômenos na

envolvido na LTP e LTD.

O NO parece funcionar como um estimulador geral de neurônios

hipotalâmicos (Costa et al., 1993; Yasin, 1993; Tringali et al., 2006), mas também

como um grande regulador de sua atividade neurosecretora, pois o mesmo está

localizado em neurônios dos núcleos supraóptico e paraventricular do hipotálamo

que produzem o hormônio liberador da corticotrofina (CRH), arginina vasopressina

(AvP) e ocitocina (Stern, 2004; Toni et al., 2003), entre outros neurotransmissores.

Outro papel importante de NO no hipotálamo seria no eixo reprodutivo,

funcionando como regulador central da liberação do hormônio liberador de

gonadotrofina (GnRH) (Brann et al., 1997) e na ereção peniana (Argiolas e Melis,

2005).

25

1.2 Diencéfalo

O diencéfalo corresponde largamente às estruturas que se desenvolvem

inferolateralmente ao terceiro ventrículo. As paredes laterais do diencéfalo formam o

epitálamo mais superiormente, o tálamo centralmente, e o subtálamo e o hipotálamo

mais inferiormente.

1.2.1 Tálamo

O tálamo é constituído, na maioria dos mamíferos, por duas grandes massas

ovoides de tecido nervoso, situando-se na porção laterodorsal do diencéfalo, acima

do sulco hipotalâmico (Fig. 4).

Figura 4. Esquema dos principais núcleos do tálamo. DL, núcleo dorsal lateral; GL, núcleo geniculado lateral; GM, núcleo geniculado medial; GNA, grupo nuclear anterior; LP, núcleo lateral posterior; MD, núcleo mediodorsal; P, pulvinar; R, núcleo reticular; VA, núcleo ventral anterior; VL, núcleo ventral lateral; VPL, núcleo ventral posterolateral; VPM, núcleo talâmico

posterodorsal ventral. (Adaptado de Standring, 2010).

O tálamo é fundamentalmente constituído de substância cinzenta, na qual se

distinguem vários núcleos. Sua superfície dorsal é revestida por uma lâmina de

substância branca, o extrato zonal, que se estende à sua face lateral onde recebe o

nome de lâmina medular externa. O extrato zonal penetra no tálamo formando um

verdadeiro septo, a lâmina medular interna, que o percorre longitudinalmente e que

representa um ponto de referência para a divisão do tálamo em grupos nucleares

(Parent, 1996; Jones, 2007).

26

O tálamo pode ser dividido em quatro porções, a partir da lâmina medular

interna, sendo um grupo nuclear anterior, no polo anterior, um grupo nuclear medial,

localizado medialmente à lâmina medular interna, grupo nuclear ventrolateral e um

grupo nuclear posterior, ambos localizados lateralmente à lâmina medular interna.

Há ainda um grupamento de neurônios localizados intrinsecamente à lâmina

medular interna, os quais são denominados intralaminares (Kandel et al., 2000).

Lateralmente à esta massa ovoide está uma lâmina de substância branca chamada

lâmina medular externa e lateralmente a ela está o núcleo reticular do tálamo,

grupamento mais lateral de neurônios do tálamo (Kandel et al., 2000).

De uma forma geral, os grupos nucleares talâmicos desempenham um

dominante papel na regulação e manutenção do estado de consciência, alerta e

atenção, isso tudo integrado com correlatos emocionais que acompanham as

experiências sensoriais, que chegam massivamente ao tálamo em seu trajeto para

os córtices sensoriais primários. Determinados núcleos talâmicos integram

informações motoras e límbicas através de projeções para os núcleos da base,

cerebelo e estruturas límbicas (Deecke et al., 1973; Schlag-Rey e Schlag, 1984;

Freedman e Cassel, 1991; Bentivoglio et al., 1991; Burk e Mair, 2001; Glimcher e

Lau, 2005). Estudos afirmam também a participação do tálamo em circuitos de

processamento de memória (Aggleton e Brown, 1999; Aggleton et al., 2011;

Hembrook e Mair, 2011).

1.2.2 Hipotálamo

O hipotálamo ocupa a metade ventral do diencéfalo em ambos os lados do

terceiro ventrículo e encontra-se imediatamente acima da glândula pituitária.

Dorsalmente, o hipotálamo é delimitado ao longo de seu comprimento pela zona

incerta e borda medial do pedúnculo cerebral. Caudalmente, o hipotálamo funde-se

com a substância cinzenta periaquedutal e área tegmental ventral do mesencéfalo

(Simerly, 2004).

Anatomicamente podemos dividir o hipotálamo no sentido rostro-caudal em:

região pré-óptica, região anterior (supra-óptica), região tuberal e região mamilar

(Clark, 1938). Crosby e Woodburne (1939) reconheceram que o hipotálamo é

27

dividido em três zonas distintas longitudinais (periventriculares, medial e lateral) e

esta perspectiva é suportada pela fisiologia e análises comportamentais (Swanson,

1987).

O esquema na figura 5 mostra as subdivisões em regiões do hipotalâmico

sugerido por Saper e Lowell (2014).

Figura 5. Esquema dos principais núcleos e subdivisões do hipotálamo em regiões no

encéfalo de rato. ac, comissura anterior; AHA, área hipotalâmica anterior; ArC, núcleo arqueado; DHA, área hipotalâmica dorsal; DLPO, área pré-óptica dorsolateral; DMH, núcleo dorsomedial; LHA, área hipotalâmica lateral; MM, núcleo mamilar medial; MnPO, núcleo pré-óptico mediano; MPA, área pré-óptica medial; och, quiasma óptico; PHA, área hipotalâmica posterior; PaV, núcleo paraventricular do hipotálamo; SCh, núcleo supraquiasmático; SO, núcleo supraóptico; RMM, núcleo retromamilar medial; VLPO, núcleo pré-óptico ventrolateral; VMH, núcleo ventromedial. (Adaptado de Saper e Lowell, 2014).

Esta nomenclatura e esquema organizacional é o mais comumente usado e

em geral é suportado pela neuroquímica e estudos hodológicos. Mas certas

exceções e modificações são sugeridas por dados anatômicos recentes. O

hipotálamo é um centro integrador essencial para a sobrevivência de um organismo

e reprodução de sua espécie. Sistemas de regulação emergiram em cada organismo

adaptado ao seu ambiente e evoluíram para controle das interações complexas da

fisiologia e comportamento (Swanson, 2000).

28

A diversidade na função reguladora do hipotálamo é refletida em sua

estrutura, neuroquímica e conexões. Quase todas as principais subdivisões da parte

central do sistema nervoso se comunicam com o hipotálamo e estão sujeito à sua

influência. Além disso, o hipotálamo comunica-se com sistemas de órgãos

periféricos, convertendo informação sináptica em sinais hormonais transmitidos pelo

sangue. Por sua vez, o hipotálamo responde ao feedback dos sistemas periféricos

que regula (Squire et al., 2008).

Resumindo, o hipotálamo é conhecido como o centro integrativo de sistemas

neurais responsáveis pela manutenção de funções homeostáticas como o equilíbrio

eletrolítico, controle da ingestão de alimentos, consumo hídrico, metabolismo

energético, reprodução, regulação térmica e controle de estados emocionais,

regulação do ciclo sono-vigília e controle da secreção hormonal pela glândula

hipófise. O hipotálamo atua também como centro integrador entre as vias simpáticas

e parassimpáticas (Parent, 1996; Swanson, 1987).

1.2.3 Subtálamo

O subtálamo é uma complexa região de grupos nucleares e tratos de fibras

localizado no diencéfalo, ventralmente ao tálamo e dorsolateral ao hipotálamo. A sua

estrutura mais proeminente é o núcleo subtalâmico. O subtálamo é formado por

esse, pelo núcleo reticular, pela zona incerta, os campos de Forel e pelo núcleo pré-

geniculado. O subtálamo apresenta conexões eferentes para o estriado (núcleo

caudado e putamen) no telencéfalo, para o tálamo dorsal (grupos nucleares lateral e

medial) no diencéfalo, e para a substância negra e núcleo rubro do mesencéfalo. Ele

recebe aferentes da substância negra e estriado (Carpenter, 1991).

1.2.4 Epitálamo

O epitálamo é um segmento posterior do diencéfalo. O epitálamo

compreende o trígono das habênulas, a glândula pineal e comissura habenular. Ele

está ligado com o sistema límbico e os núcleos da base e algumas funções de seus

componentes incluem a secreção de melatonina pela glândula pineal (envolvida nos

ritmos circadiano) a regulação de vias motoras e emocionais (Carpenter, 1991).

29

1.3 Modelo experimental

O mocó (Kerodon rupestris) é um roedor encontrado nos estados do

Nordeste do Brasil e norte de Minas Gerais, habitando preferencialmente a caatinga

do semi-árido do Nordeste Brasileiro (Cabrera, 1961; Lacher Jr, 1981).

Taxonomicamente pode ser classificado como membro da superfamília

Cavioidea, família Caviidea, subfamília Caviinae, gênero Kerodon, juntamente com

os gêneros Cavia, Galea e Microcavia (Moojen, 1952; Cabrera, 1961; Lacher Jr,

1981). A este grupo pertencem pequenos animais já reconhecidamente domésticos,

como porquinho da índia (Cavia porcellus), os que vivem em pequenas colônias

feitas em buracos na terra ou usam cavidades nas bordas das rochas. Possuem

hábitos gregários e diurnos (Crandall, 1964). A família Caviinae apresenta animais

adaptáveis a diversos tipos de ambientes, podendo ser arborícolas, rupícolas e

terrícolas; costumam ser herbívoros em consequência de sua dentição ser

desprovida de caninos (Moojen, 1952).

O mocó é um animal que habita locais rochosos com diversas fendas onde

se abriga dos predadores e passam boa parte do tempo. São facilmente adaptáveis

às condições ecológicas locais como calor, escassez de água e de alimentos,

especialmente nos períodos de grandes secas do semi-árido nordestino. Extraem

sua alimentação de galhos de árvores e rochas, principalmente por serem

excelentes saltadores e escaladores. Tal alimentação é constituída de cascas de

árvores e gramíneas em geral, sendo as árvores mais procuradas o mufumbo

(Cobretum leprosum), faveleira (Cnidoscolus phyllacanthus) e a parreira brava

(Cissampelos parreira) (De Melo Carvalho, 1969; Lacher Jr, 1981; Mendes, 1985;

1987). Em cativeiro aceitam bem frutas (maçã, banana, melão, melancia, manga) e

raízes.

Apresenta coloração cinza clara com pelos pretos e amarelos ou

esbranquiçados na região dorsal, castanho ferruginoso na região caudal, um pouco

acastanhado nas patas e branco na cervical (Fig. 6). Suas patas possuem coxins

calosos pouco excedidos pelas unhas rígidas que lhes proporciona a habilidade de

saltar e escalar (Moojen, 1952). Seu olfato e audição são bastante aguçados,

detectando seu predador a longas distâncias (De Melo Carvalho, 1969). Atingem a

30

fase adulta aos 200 dias, podendo alcançar até 50 cm de comprimento e 1 quilo de

peso corporal (Moojen, 1952; De Melo Carvalho, 1969; Roberts et al., 1984).

A reprodução ocorre durante todo o ano, com exceção do período que vai de

abril a junho. Dentre os cavinnaes, o Kerodon possui a gestação mais longa (65

±1,34 dias), a menor média de tamanho da prole (1,28±0,09), o mais baixo peso de

filhotes e o mais longo tempo de maturidade sexual (Roberts et al., 1984). Apesar

das poucas crias por parto, o curto período de gestacional garante uma elevada

produção de crias durante o ano (Lacker Jr, 1981).

Figura 6. O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural.

Com relação ao seu padrão de atividade locomotora, tem sido relatado que

nos dias mais escuros o mocó sai para se alimentar pela manhã e à tarde, enquanto

nos dias mais claros sua atividade se concentra no período noturno (De Melo

Carvalho, 1969). Estudos realizados por Sousa e Menezes (2006) elucidaram que

embora o mocó apresente atividade ao longo de 24 horas, os períodos de transição

de fases claro-escuro são os de maior concentração de atividade, sugerindo,

portanto, comportamento predominantemente crepuscular.

Nesse sentido, em consequência das singularidades morfofuncionais e

hábitos comportamentais do mocó em relação a outros animais da ordem Rodentia é

31

que este animal vem sendo adotado como modelo para estudos neuroanatômicos

do Laboratório de Neuroanatomia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

– UFRN.

Considerando a importância de estudar os sistemas neurais do ponto de vista

comparativo-evolutivo e do papel do NO em funções diencefálicas, achamos

interessante ampliar o conhecimento acerca da distribuição de NO no diencéfalo de

mamíferos e pra isto lançamos mão do estudo em mocó, um roedor da fauna local

com características comportamentais próprias e interessantes.

32

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Descrever de forma indireta a distribuição de óxido nítrico no diencéfalo do

mocó.

2.2 Objetivos específicos

Descrever a distribuição de NOS no diencéfalo do mocó;

Descrever a distribuição de NADPH-diaforase no diencéfalo de mocó;

Caracterizar qualitativamente o nível de marcação dos neurônios nitrérgicos e

a densidade destes neurônios nos diversos núcleos diencefálicos.

33

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Sujeitos

Foram utilizados sete mocós adultos jovens (quatro machos e três fêmeas)

obtidos através de captura no município de Jucurutu (RN), mediante autorização do

IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis,

SISBIO no. 42960-3). O processo de captura se realizou a partir do uso de

armadilhas e/ou contenção química (ketamina + xilazina) a fim de reduzir o estresse

causado ao animal. Os animais foram mantidos na fazenda Samisa, no município de

Extremoz-RN.

É importante ressaltar que os animais utilizados nesse projeto foram os

mesmos de outro projeto em andamento no laboratório, previamente aprovado pelo

comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA), voltado para o mapeamento

neuroquímico deste animal sobre o protocolo 004/2004.

3.2 Anestesia

Os sete animais utilizados neste trabalho foram anestesiados com ketamina

e xilazina via intramuscular na dosagem de 20mg/kg e 2mg/kg respectivamente.

3.3 Perfusão

Ao atingir o plano anestésico, cada animal foi submetido à perfusão

transcardíaca, que compreende os seguintes passos:

1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame sob ponto

de água.

2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes

removidos em bloco, para exposição do coração.

3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de 17 mm x 1,5

mm, a qual é direcionada para a aorta, seguindo-se uma incisão no átrio

direito. A agulha é conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer),

34

passando-se 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4

com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina), seguido de

700 ml de solução paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7.4.

3.4 Remoção dos encéfalos

Após concluída a perfusão, os animais foram posicionados no aparelho

estereotáxico para roedores. Depois de fazer uma incisão longitudinal na pele e

rebatê-la lateralmente, foi feita a limpeza da superfície óssea, facilitando a

visualização do bregma e do lambda, os quais foram nivelados na mesma altura,

ajustando-se a barra dos incisivos, padronizando assim o plano de corte coronal

para todos os animais. Após anotação das coordenadas do bregma e lambda, o

osso da calota craniana foi removido com o uso de uma broca expondo-se o

encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, o encéfalo foi seccionado em três blocos,

através de duas secções coronais: uma no nível do bregma e outra no nível do

lambda. Os encéfalos foram retirados delicadamente para evitar danos (Fig. 7). Logo

após, os três blocos foram armazenados em uma solução de sacarose a 30% em

tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 a 4°C, até serem submetidos a microtomia.

Figura 7. Encéfalo do mocó em vista dorsal, lateral e ventral. Escala de régua em centímetros.

35

3.5 Microtomia

Terminada a etapa de pós-fixação e imersão em tampão sacarose 30%, os

encéfalos foram submetidos à microtomia cuja espessura dos cortes foi padronizada

em 30 µm. Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em

micrótomo de deslizamento, obtendo-se secções coronais. Estas foram coletadas

em um meio líquido de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 distribuídas sequencialmente

em 6 compartimentos, de maneira cíclica e sequenciada, de modo a manter a

distância de aproximadamente 180 µm entre uma secção e a outra imediatamente

seguinte de um mesmo compartimento. Os cortes de um compartimento foram

imediatamente montados em lâminas de vidro gelatinizadas e submetidas à

coloração pelo método de Nissl para permitir uma melhor demarcação das

estruturas. Os cortes dos demais compartimentos foram transferidos para solução

anticongelante e conservados a -20°C para utilização.

3.6 Método de Nissl

A coloração pelo método de Nissl é constituída por uma série de etapas que

se iniciam com a desidratação do tecido passando-o em concentrações crescentes

de álcoois etílicos (70% - 1 vez, por 1h, 95% - 2 vezes, 3 minutos cada, 100% - 2

vezes, 3 minutos cada). Posteriormente são deslipidificados em dois recipientes com

xilol, por 3 e 30 minutos, nessa ordem. Na sequência, o tecido é reidratado em

concentrações decrescentes de álcoois (mesmo processo anterior, mas no sentido

inverso), submergido em água destilada por 2 minutos, colocado 1 minuto na

solução thionina a 0,25%. Por fim os cortes foram rapidamente submergidos e

emergidos por 1 minuto em água destilada e novamente desidratados e

deslipidificados como descrito anteriormente, sendo acrescentada apenas uma

etapa (antes da desidratação em álcool 100%). Os cortes foram deslipidificados em

xilol em dois recipientes (2 e 4 minutos, respectivamente) e finalmente cobertos com

lamínula utilizando como meio de montagem o ERV-Mount.

36

3.7 Imunoistoquímica

A técnica consistiu de uma imunoperoxidase padrão pelo método ABC,

onde, após quatro lavagens com duração de dez minutos cada em tampão fosfato

0,1M (PB), pH 7,4, os cortes free floating foram submetidos a um pré-tratamento

com uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,03% em PB 0,1M durante 20

minutos em agitador orbital para inativação da peroxidase endógena. Após mais

quatro lavagens de dez minutos, os cortes então foram incubados em tampão

fosfato contendo tampão Triton X-100 a 0,4% (TXPB) com anticorpo primário anti-

nNOS feito em camundongo (1:1000, Sigma) e soro normal de cabra a 2% (Jackson

Laboratories) permanecendo em incubação por 16 a 24 horas em agitador orbital.

No dia seguinte, os cortes foram lavados em PB, por quatro vezes, e incubados em

anticorpo secundário biotilinado anti-camundongo feito em cabra (Jackson

Laboratories) diluído a 1:1000 e TXPB por 2 horas em agitador orbital. Os cortes

foram novamente lavados em PB e incubados em solução avidina-biotina-

peroxidase (kit ABC, Vector, 1:100) diluídos em TXPB a 0,4% contendo NaCl por

noventa minutos. Em seguida, os cortes foram lavados e para a visualização da

reação, as secções foram postas em meio contendo PB e H2O2 0,03% como

substrato e o cromógeno diaminobenzidina (DAB) 0,05% por aproximadamente 10

minutos. A reação foi parada com lavagens em PB em agitador orbital. Os cortes

finalmente foram montados em lâminas gelatinizadas, mergulhados em tetróxido de

ósmio 0,05% para intensificar a reação, desidratadas em uma sequência crescente

de álcoois e deslipidicados em xilol e cobertos com ERV-Mount e lamínula.

3.8 Histoquímica

Foi utilizado o método histoquímico para marcação de NADPH-diaforase.

Esse processo iniciou-se diluindo 45 mg de azul de nitrotetrazólio em 1,5 ml de

dimetil sulfóxido, formando a solução I. Em seguida acrescentou-se 900 mg de ácido

málico em um béquer contendo 150 ml de tampão TRIS 0,05M, ajustando o pH da

solução resultante para 8,0. Após o ajuste do pH foi acrescentado 150 mg do

composto β-NADP e 60 mg de cloreto de manganês, formando a solução II. Após a

37

homogeinização desta última, as duas soluções foram misturadas, acrescentando

em seguida 4,5 ml de Triton-X100. Uma vez que a solução resultante é fotossensível

ela foi sempre protegida da luz. As secções foram imersas nessa solução e

colocadas para reagir sob agitação manual constante a 39°C em banho maria e

protegidos da luz. A duração tem uma alta variabilidade que depende da

temperatura e da iluminação passando aproximadamente quatro horas em reação.

No entanto passado um período de 90 minutos foi observado em microscópio óptico

o grau de marcação em intervalos de 10 minutos. Após a reação foi feito 3 lavagens

sucessivas em PB de 3 minutos cada e por fim as lâminas foram cobertas com

lamínula usando ERV-Mount.

3.9 Análise e documentação das imagens

As secções do diencéfalo, coradas pelo método de Nissl e as submetidas à

imunoistoquímica e histoquímica foram examinadas e mapeadas ao microscópio

óptico (Nikon Eclipse Ci-L) em campo claro. Imagens digitais foram obtidas de

secções representativas usando uma videocâmera digital (Nikon DS-Ri1). As

imagens foram corrigidas minimamente para brilho e contraste e documentadas em

fotomicrografias e esquemas construídos utilizando Canvas (versão 12.0; ACD

Systems of America, Inc.; 2010).

Para a análise referente a densidade e intensidade de marcação dos

neurônios imunorreativos a NOS foram usados até o momento valores subjetivos

como mostrado nas figuras 8 e 9. Foram construídos esquemas no Canvas tendo

por base os cortes submetidos a técnica de Nissl e o atlas de Paxinos e Watson

(2007) de rato, Paxinos e colaboradores de sagui (2012) e Paxinos e Franklin (2008)

de camundongo.

38

Figura 8. Exemplos das diferentes intensidades de marcação celular das células marcadas

por imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo.

Figura 9. Exemplos da quantificação subjetiva da densidade das células marcadas por

imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo.

39

4. RESULTADOS

No presente estudo a imunoistoquímica para NOS e a histoquímica para a

NADPH-diaforase foram utilizadas. Encontramos neurônios imunorreativos para

NOS (NOS-IR) e coloração NADPH-diaforase (NADPHd) ao longo de todo

diencéfalo. A imunoistoquímica apresentou uma coloração castanha bem definida

onde neurônios NOS-IR apresentaram uma marcação que definiu bem o citoplasma,

enquanto que a NADPHd apresentou uma coloração azul com graus de intensidade

que variaram dependendo da atividade da enzima.

A descrição da distribuição de neurônios nitrérgicos será baseada na

imunoistoquímica e está listada na Tabela 1.

4.1 Imunoistoquímica

No sentido rostrocaudal, os neurônios corados no diencéfalo do mocó

apareceram desde a região pré-óptica até o nível do núcleo geniculado medial. O

padrão de distribuição dos neurônios marcados pelas técnicas de imunoistoquímica

foi bastante semelhantes entre os diferentes animais.

Tabela 1. Densidade e intensidade dos núcleos imunorreativos a NOS.

Núcleos e Regiões Densidade das células

Intensidade da

marcação

HIPOTÁLAMO

Região pré-óptica

Núcleo septohipotalâmico (SHy) +++ ++

Núcleo pré-óptico mediano (MnPO) +++ ++

Área pré-óptica lateral (LPO) ++ +++

Área pré-óptica medial (MPA) + ++

Núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO) ++ ++

Núcleo pré-óptico medial (parte medial) (MPOM) ++ +

Núcleo pré-óptico medial (parte lateral) (MPOL) +/- +

Região anterior

Núcleo supraóptico (SO) +++ ++/+++

40

Decussação supraóptica (sox) +++ +++

Núcleo paraventricular do hipotálamo (PV)

- Parte parvocelular anterior (PaAP) ++ ++

- Parte ventral (PaV) +++ ++

- Parte parvocelular medial (PaMP) ++ ++

Núcleo periventricular do hipotálamo (Pe) +/- +++

Núcleo ventrolateral do hipotálamo (VLH) ++ ++

Área hipotalâmica lateral (parte peduncular) (PLH) ++ ++

Área retroquiasmática (parte lateral) (RChL) +++ ++/+++

Região tuberal

Área hipotalâmica lateral (parte tuberal) (TuLH) + ++

Núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH)

- Divisão anterior (VMHa) + +

- Divisão ventrolateral (VMHvl) +++ ++

- Divisão dorsomedial (VMHdm) ++ +

Núcleo dorsomedial do hipotálamo

- Divisão dorsal (DMD) ++ +

- Divisão compacta (DMC) ++ +/++

- Divisão ventral (DMV) ++ +/++

Área hipotalâmica dorsal (DA) + +

Região mamilar

Núcleo pré-mamilar ventral (PMV) +++ ++

Núcleo pré-mamilar dorsal (PMD) +++ ++

Núcleo posterior do hipotálamo (PH) ++ ++

Núcleo retromamilar

- Divisão lateral (RML) +++ ++

- Divisão medial (RMM) +++ ++

Núcleo mamilar medial (divisão lateral) (ML) +++ +

Núcleo mamilar lateral (LM) +++ ++

Área hipotalâmica posterior (PHA) +++ ++

TÁLAMO

Núcleo paraventricular do tálamo (PVT) + +

41

Zona incerta (ZI) + +

Parte lateral do núcleo habenular lateral (LHbL) ++ ++

Núcleo talâmico parafascicular (PF) + ++

Núcleo talâmico posterodorsal ventral (VPM) ++ ++

Núcleo geniculado ventral (VG) +++ +++

Parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC) ++ ++

Parte dorsal do núcleo geniculado medial ++ +++

Regiões marcadas com NOS-IR. Nível da densidade dos neurônios nos núcleos: +++ Alta, ++ Moderada, + Baixa +/- Muito baixa; e da intensidade da marcação: +++ Forte, ++ Média, + Fraca (Baseado em observações subjetivas da densidade e intensidade de neurônios corados pelos métodos de imunoistoquímica em cada núcleo. Ver figura 8 e 9).

4.1.1 Hipotálamo

O hipotálamo apresentou células NOS-IR desde a sua região pré-óptica até

a região mamilar. Descrevemos a distribuição das células marcadas no hipotálamo

por regiões segundo Clark (1938).

Região pré-óptica

Os primeiros neurônios NOS-IR no diencéfalo do mocó apareceram

formando um grupamento situado entre o núcleo septal lateral e medial, e

inferiormente ao núcleo septal paralambdóide. Pela localização e relações,

identificamos esse grupamento como o núcleo septohipotalâmico (SHy), o qual se

estende caudamente até o nível da lâmina terminal, início da entrada do fórnice no

hipotálamo e fim da comissura anterior (Fig. 10 A; 11 A e C). Os neurônios NOS-IR

foram encontrados em toda a extensão desse núcleo, porém sua porção anterior

apresentou um número menor de células coradas. Tais células apresentaram

densidade alta e média marcação.

Neurônios NOS-IR também estavam presentes em outras regiões nesse

mesmo nível. O núcleo pré-óptico mediano (MnPO) apresentou células NOS-IR com

intensidade de marcação média em toda sua extensão, sendo menos numerosas na

porção anterior, diferente das demais que apresentaram densidade alta. O MnPO foi

42

bem delimitado pelo fórnice, comissura anterior e pelas células levemente mais

claras do SHy, laterais a ele em sua porção mais caudal (Fig. 10 A; 11 A e B).

Algumas fibras começaram a surgir na área pré-óptica lateral (LPO) e alguns

neurônios na área pré-óptica medial (MPA). Com exceção das porções mais rostrais

que apresentaram fibras e alguns neurônios NOS-IR corados fracamente, a LPO

apresentou uma densidade moderada de neurônios NOS-IR e com marcação forte

(Fig. 10 A e B; 12 A e C). A MPA apresentou neurônios NOS-IR com baixa

densidade e coloração média (Fig. 10 A e B).

O núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO) apresentou células com

coloração média e densidade moderada em toda a extensão do núcleo, estando

medialmente à área amígdalóide anterior (Fig. 10 A e B; 12 A e E).

O núcleo pré-óptico medial (MPO) apresentou células NOS-IR em sua

divisão medial (MPOM) e lateral (MPOL) tendo uma densidade moderada para a

MPOM e muito baixa para a MPOL, ambos com células fracamente marcadas (Fig.

10 A e B; 12 A e B). Ambas subdivisões do MPO estiveram presentes nos mesmos

níveis do núcleo da banda diagonal de Broca e do núcleo supraquiasmático que não

apresentou células NOS-IR.

Região anterior

O núcleo supraóptico (SO) se destacou na expressão de NOS dentro do

hipotálamo, apresentando neurônios NOS-IR em toda sua extensão, com densidade

de células alta e intensidade da marcação de média a alta (Fig. 10 A-C; 12 A e D).

Esse núcleo foi bem delimitado pelo núcleo pré-óptico ventrolateral (VLPO) que não

apresentou células NOS-IR, e este delimitado por alguns neurônios NOS-IR corados

da MPA. A decussação supraóptica (sox) apresentou neurônios NOS-IR com

densidade alta e marcação forte (Fig. 10 C).

No núcleo paraventricular do hipotálamo (PV), neurônios NOS-IR estiveram

presentes em algumas de suas subdivisões, porém com diferentes densidades. Os

níveis rostrais que correspondem a parte parvocelular anterior (PaAP) apresentaram

marcação média e densidade moderada de neurônios NOS-IR (Fig.10 B e C; 13 A e

B). Os primeiros neurônios NOS-IR com maior densidade foram os neurônios da

parte ventral (PaV) desse núcleo, e assim permaneceu até as porções mais caudais

43

(Fig. 10 D). A parte parvocelular medial (PaMP) apresentou neurônios NOS-IR com

densidade moderada e intensidade da marcação média (Fig. 10 E).

Figura 10. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó ilustrando

a morfologia e a distribuição dos neurônios NOS-IR do diencéfalo e de fotomicrografias de cortes submetidos ao método de coloração de Nissl no nível correspondente. Representação do nível mais rostral em (A) e do nível mais caudal em (M) com distância de 360 µm entre cada imagem. Ver lista de abreviações.

44

Figura 10. Continuação.

45


46


Alguns neurônios estiveram presentes próximo às paredes laterais do

terceiro ventrículo, estes fazem parte da divisão parvocelular periventricular do PV

que é contínua com o núcleo periventricular (Pe) adjacente ao PV, e que apresentou

neurônios com intensidade da marcação alta (Fig. 10 A; 14 A e B).

Um núcleo bem pequeno entre duas regiões com neurônios NOS-IR (núcleo

da banda diagonal de Broca e a parte peduncular do hipotálamo lateral) apresentou

densidade moderada e intensidade da marcação média, trata-se do núcleo

ventrolateral do hipotálamo (VLH) (Fig. 10 C; 13 A e D).

Já o hipotálamo lateral apresentou neurônios NOS-IR em suas partes

peduncular (PLH) e tuberal. O PLH (Fig. 10 C-H; 13 A e C) apresentou neurônios

NOS-IR com marcação média distribuídos em toda sua extensão com densidade

baixa por ser uma área extensa. Porém, seus neurônios eram visto agrupados em

regiões especificas, como por exemplo laterais ao fórnice. A parte lateral da área

retroquiasmática (RChL) apresentou células NOS-IR com densidade alta e

intensidade da marcação de média a alta (Fig. 10 D-G; 14 A e C; 15 A e D).

Região tuberal

A parte tuberal da área hipotalâmica lateral (TuLH; Fig. 10 D) apresentou

densidade baixa, com coloração média de seus neurônios. O núcleo ventromedial do

47

hipotálamo apresentou células NOS-IR com coloração fraca na divisão anterior

(VMHa; Fig. 10 D; 14 A e B), onde ainda não está subdivido nas suas partes

ventrolateral (VMHvl), central (VMHc) e dorsomedial (VMHdm). O VHMdm

apresentou densidade moderada e padrão de coloração fraca. Já o VMHvl

apresentou neurônios NOS-IR com densidade alta e intensidade da marcação média

(Fig. 10 E e F; 15 A-C). A porção posterior desse núcleo (VMHp) apresentou uma

neurópila intensa, delimitando bem o núcleo (Fig. 16 A e D). Nenhum neurônio NOS-

IR foi encontrado no VHMc.

O núcleo dorsomedial do hipotálamo apresentou células NOS-IR nas sua

subdivisões dorsal (DMD), compacta (DMC) e ventral (DMV). O DMD apresentou

densidade moderada na sua porção anterior, nas demais, densidade baixa e

marcação fraca (Fig. 10 F). Ao contrário, o DMC e o DMV apresentaram densidade

moderada e neurônios com intensidade fraca da marcação, porém com alguns

neurônios com intensidade média (Fig. 16 A-C).

A área hipotalâmica dorsal (DA) apresentou alguns neurônios NOS-IR com

densidade baixa e marcação fraca (Fig. 10 F).

Região mamilar

No núcleo pré-mamilar ventral (PMV) uma neurópila intensa demarcou o

núcleo que apresentou densidade alta e intensidade da marcação citoplasmática

média (Fig. 10 G; 17 A e D). O mesmo valor para intensidade da marcação e

desidade vai para o pré-mamilar dorsal (PMD) que também apresentou uma

neurópila que delimitou o núcleo (Fig. 17 A e C). O núcleo posterior do hipotálamo

(PH) apresentou neurônios NOS-IR nas suas porções mais posteriores, com uma

neurópila intensa na sua borda ventral. Seus neurônios marcados apresentaram

densidade moderada e intensidade da marcação média (Fig. 10 G e H; 17 e 18 A e

B).

O núcleo retromamilar apresentou neurônios NOS-IR com intensidade da

marcação média nas suas divisões lateral (RML) e medial (RMM), sendo a RML com

uma densidade alta de neurônios NOS-IR em toda sua extensão, ao contrário da

RMM que apresentou uma densidade pequena na sua porção rostral e densidade

alta na sua porção caudal (Fig. 10 H e I; 18 A e C; 19 A-C). O núcleo mamilar medial

48

apresentou células NOS-IR com intensidade da coloração fraca e densidade alta na

sua divisão lateral (ML) (Fig. 10 H-J; 18 A e D). O núcleo mamilar lateral (LM)

apresentou neurônios NOS-IR com densidade alta e intensidade da marcação média

(Fig. 10 H e I). Ambos ML e LM não apresenta neurônios NOS-IR em suas porções

posteriores (Fig. 10 I e J).

A área hipotalâmica posterior (PHA) apresentou neurônios NOS-IR

concentrados medialmente, onde apresentou densidade alta e marcação moderada

(Fig. 10 I).

49

Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico mediano (MnPO). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo septohipotalâmico (SHy). f, fórnice; ac, comissura anterior; 3V, terceiro ventrículo; LV, ventrículo lateral. Barra em C correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B e C.

50

Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó

submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão medial do núcleo pré-óptico medial (MPOM). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a área pré-óptica lateral (LPO). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo supraóptico. (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO). f, fórnice; LV, ventrículo lateral; 3V, terceiro ventrículo; och, quiasma óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C, D e E.

51

Figura 13. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A

com área correspondente a parte parvocelular anterior (PaAP). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular do hipotálamo lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo ventrolateral do hipotálamo (VLH). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra em D correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

52


submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão anterior do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHa). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra em C correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B e C.

53

Figura 15. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsomedial do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHdm). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; EM, eminência mediana. Barra em D correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B ,C e D.

54

Figura 16. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte compacta do núcleo dorsomedial (DMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventral do núcleo dorsomedial (DMV). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte posterior do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHp). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; mt, trato mamilotalâmico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.

55

Figura 17. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-mamilar dorsal (PMD). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-mamilar ventral (PMV). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

56

Figura 18. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente as partes medial e lateral do núcleo retromamilar (RMM e RML). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral do núcleo mamilar medial (ML). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

57


submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar lateral (RML). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar medial (RMM). 3V, terceiro ventrículo; cp, pedúnculo cerebral; MM, parte medial do núcleo mamilar medial. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.

58

4.1.2 Tálamo

No tálamo, os primeiros neurônios NOS-IR surgiram em sua porção

dorsomedial, no núcleo paraventricular do tálamo (PVT), na sua porção anterior

(PVA), media (PVM) e posterior (PVP) (Fig. 10 C-H). Esse núcleo e suas subdivisões

apresentaram uma densidade baixa, visto que poucos neurônios foram visíveis

dentro de sua borda, estes apresentaram uma marcação fraca. O mesmo aconteceu

com a zona incerta (ZI) e sua subdivisão caudal (ZIC) (Fig. 10 E-H; Fig. 20 A e C).

A habênula apresentou neurônios NOS-IR na porção lateral do núcleo

habenulal lateral (LHbL), estes com densidade moderada e intensidade da marcação

média (Fig. 10 J). O núcleo talâmico parafascicular (PF) apresentou um pequeno

número de neurônios NOS-IR com marcação média (Fig. 10 I).

Na região lateral, encontramos neurônios NOS-IR no núcleo talâmico

posterodorsal ventral (VPM), que foi muito bem delimitado por suas fibras. Ele

apresentou densidade moderada e intensidade da marcação média em toda sua

extensão (Fig. 10 H e I). Lateral ao VPM, uma densidade alta de neurônios NOS-IR

esteve presente na divisão ventral do núcleo geniculado lateral (VG) (Fig. 10 H-J;

Fig. 20 e 21 A e C). Estes estiveram presentes em suas 3 camadas e apresentaram

uma intensidade de marcação alta, com neurópila contornando a borda lateral (Fig.

20 A e B).

A parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC) apresentou

neurônios NOS-IR com densidade moderada e média marcação (Fig. 10. K e L; Fig.

21 A e B).

E finalmente, os últimos neurônios NOS-IR encontrados no diencéfalo foram

os da parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD), que apresentou densidade

moderada de neurônios fortemente marcados (Fig. 10 K-M; Fig. 22 A e B), sendo

que alguns neurônios estiveram presentes espalhados na parte ventral do

geniculado medial (MGV) (Fig. 10 M).

59


submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo geniculado ventral (VG). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte caudal da zona incerta (ZIC). APTD, parte dorsal do núcleo pré-tectal anterior; APTV, parte ventral do núcleo pré-tectal anterior; MHb, núcleo habenular medial; PrC, núcleo pré comissural; opt, trato óptico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.

60


submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo geniculado ventral (VG). bsc, braço do colículo superior MCPC, núcleo magnocelular da comissura posterior; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; SNR, parte reticulada da substância negra. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.

61


submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). csc, comissura do colículo superior; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial; Aq, aqueduto; opt, trato óptico; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; PP, núcleo peripeduncular. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B.

62

4.2 Histoquímica

A histoquímica para NAPDH-diaforase no diencéfalo apresentou uma

coloração azul característica da técnica. No entanto, nem sempre os neurônios

ficaram visíveis. O que pudemos observar foi que áreas e núcleos cujos neurônios

estiveram mais intensamente marcados pela imunoistoquímica contra NOS foram as

que os neurônios foram melhor marcados também pela NADPHd e puderam ser

observados, como mostram as figuras 23, 24 e 25, enquanto que áreas com

marcações mais fracas tenderam a ter uma marcação apenas residual pela técnica

de NADPHd.


submetidas à imunoistoquímica para NOS (A) e histoquímica para NADPHd (B). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em B com área correspondente ao VMHvl. opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A e B, 100 µm em C e D.

63


submetidas à histoquímica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte parvocelular anterior do núcleo paraventricular do hipotálamo (PaAP) (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular da área hipotalâmica lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a decussação supraóptica (sox). f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.

64


submetidas à histoquímica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). opt, trato óptico; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial Aq, aqueduto; csc, comissura do colículo superior . Barra: 500 µm em A, 100 µm em B.

65

4. DISCUSSÃO

O NO é um mensageiro molecular responsável pelo controle de uma grande

variedade de funções biológicas, que abrange da vasodilatação a mecanismos de

aprendizado e memória. Visto de uma perspectiva mecanicista, o NO não está de

acordo com muitas das regras que regem a neurotransmissão mais convencional,

em particular do tipo metabotrópica. Mas se destaca dos demais neurotransmissores

por ser mais econômico e versátil, atributos que, presumivelmente, são responsáveis

por seu sucesso evolutivo, sendo muito bem conservado entre as espécies.

Salvo alguns núcleos como o supraquiasmático, folheto intergeniculado e a

zona incerta que já foram descritos em outros trabalhos do nosso grupo de pesquisa

(Nascimento et al., 2010; de Góis Morais et al., 2014), a distribuição da NOS ou

NADPH no diencéfalo do mocó, um roedor típico da região Nordeste do Brasil ainda

não havia sido investigada, o que confere relevância e ineditismo aos nossos

resultados.

A imunoistoquímica contra NOS mostrou neurônios marcados em todo o

diencéfalo, especialmente no hipotálamo que apresentou um alto número de núcleos

nitrérgicos. Já a histoquímica para a NADPH não apresentou marcação em todos os

núcleos descritos na imunoistoquímica. Isso possivelmente aconteceu pois, segundo

a evidência de Hope e colaboradores (1991), a marcação histoquímica para

NADPHd só marca neurônios que contêm atividade NADPHd naquele momento,

enquanto que a imunoistoquímica revela todos os neurónios que contêm NOS,

independente de estarem sendo ou não sintetizados. Além disto, foi demostrado por

Matsumoto e colaboradores (1993), através de um estudo usando tecidos frescos de

oito diferentes regiões do cérebro de ratos, que durante a fixação a atividade da

NADPHd é reduzida ou pode ser inativada. Sendo assim, nem todos os neurônios

NOS-IR mostram atividade NADPHd em tecido fixado.

Pudemos evidenciar no presente estudo que a intensidade da marcação

histoquímica está diretamente relacionada com a imunoistoquímica, ou seja, os

núcleos com neurônios com mais forte marcação para NOS foram os que

apresentaram melhor marcação para NADPHd. Portanto, alguns neurônios podem

ter falhado na marcação histoquímica por não conter atividade atividade NADPHd no

momento da perfusão. Contudo, em alguns casos pudemos evidenciar uma

66

coloração azulada (característica da histoquímica para NADPHd) mais forte em

certos núcleos que tem neurônios NOS-IR. No entanto, estas marcações não foram

fortes suficientemente para delimitar os o citoplasma neuronal.

5.1 O NO nos vertebrados

O NO está presente nos vertebrados desde peixes até mamíferos,

parecendo ser bem conservado entre essas classes.

Em peixes, encontramos estudos da distribuição do NO no encéfalo da tenca

(Tinca tinca) (Arévalo et al., 1995), peixe-japonês (Carassius auratus) (Bruning et al.,

1995; Villani e Guarnieri, 1995), espada (Xiphophorus hellerii) (Anken and Rahmann,

1995) e paulistinha (Danio rerio) (Holmqvist et al., 2000). Outros estudos tratam da

distribuição do NO em áreas mais restritas do encéfalo, como no diencéfalo da truta-

arco-íris (Oncorhynchus mykiss) (Schober et al., 1993).

Estudos em anfíbios mostram a distribuição do NO no encéfalo da rã verde

(Rana perezi) (Muñoz et al., 1996), rã-de-unhas-africana (Xenopus laevis) (Bruning e

Mayer, 1996) e na salamandra-dos-poços (Pleurodeles waltl) (González et al., 1996)

e em répteis como a tartaruga-do-ouvido-vermelho (Pseudemys scripta elegans)

(Bruning et al., 1994), lagartixa-tokay (Gekko gecko) (Smeets et al., 1997) e a cobra

habu (Trimeresurus flavoviridis) (Jiang e Terashima, 1996).

Nas aves, estudos com a galinha doméstica (Gallus gallus) (Bruning, 1993),

codorna japonesa (Coturnix japonica) (Panzica et al., 1994), periquito (Melopsittacus

undulatus) (Cozzi et al., 1996) e no mandarim (Taeniopygia guttata) (Wallhãusser-

Franke et al., 1995) demonstram a distribuição do NO no encéfalo dessa classe.

E nos mamíferos, o NO apresentou-se presente no diencéfalo do nosso

modelo animal conforme demonstrado em outros animais na literatura, estando de

acordo com roedores (Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Ng et al., 1999;

Gotti et al., 2005), gato (Mizukawa et al., 1989), primatas não-humanos (Gerlach et

al., 1995) e humanos (Sangruchi e Kowall, 1991; Egberongbe et al., 1994).

67

5.2 Aspectos neuroanatômicos do diencéfalo do Mocó

O hipotálamo é uma das menores e filogeneticamente melhor conservada

partes do cérebro. Porém, esta pequena área contém um circuito altamente

conservado entre as espécies que controla funções básicas da vida, e o óxido nítrico

está envolvindo em muitos desses mecanismos.

Na região pré-óptica, encontramos neurônios NOS-IR nos núcleos:

septohipotalâmico, pré-óptico mediano, pré-óptico magnocelular e medial, e as áreas

pré-óptica lateral e medial. Sendo que destes os núcleos septohipotalâmico e o

núcleo pré-óptico mediano apresentaram maior densidade de células NOS-IR.

Em sentido rostrocaudal os primeiros neurônios NOS-IR no diencéfalo

surgiram no SHy, assim como descreve alguns estudos com ratos (Vincent e

Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994). Esses neurônios surgiram formando um

grupamento situado entre o núcleo septal lateral e medial, e inferiormente ao núcleo

septal paralambdóide.

No MnPO de mocó, células NOS-IR formaram um aglomerado que se

estendeu ao longo da porção superior da comissura anterior e da borda superior do

terceiro ventrículo, sendo contornado superiormente pelo fórnice e inferiomente pelo

núcleo septohipotalâmico, formando uma pequena área triangular, corroborando

trabalhos prévios (Simerly, 2004; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994;

Yamada et al., 1996) no hipotálamo de ratos. Assim como no camundongo (Gotti et

al., 2005), o MnPO do mocó apresentou marcação média de suas células.

A LPO do mocó apresenta algumas fibras com alguns neurônios NOS-IR

que foram aumentando em número conforme o núcleo seguia no sentido posterior,

onde classificamos uma densidade moderada dos neurônios que apresentaram

marcação forte. Para Rodrigo e colaboradores (1994) estes neurônios estiveram

presentes na LPO de ratos de forma dispersa. Vincent e Kimura (1992) encontraram

apenas fibras espessas, tanto na LPO como na MPA de ratos e Gotti e

colaboradores (2005) encontraram na LPO de camundongos algumas fibras e vários

neurônios nitrérgicos.

A MPA de camundongos apresentou muitos neurônios fracamente marcados

(Gotti et al., 2005), mas em ratos apenas alguns neurônios (Rodrigo et al., 1994). No

68

mocó, classificamos a densidade desses neurônios como baixa e a marcação

média.

O MCPO do mocó apresenta neurônios NOS-IR com coloração média e

densidade moderada em toda a extensão do núcleo. O MPO apresentou células

NOS-IR em sua divisão medial (MPOM) com densidade moderada e na divisão

lateral (MPOL) com densidade muito baixa, ambos com coloração fraca de suas

células. Estudos com roedores descrevem a presença de neurônios nitrérgicos no

MCPO e no MPO de ratos (Rodrigo et al., 1994; Yamada et al., 1996) e no MPO de

camundongos (Ng et al., 1999).

Na região anterior, os núcleos que apresentaram o maior número de

neurônios NOS-IR foram os núcleos supraóptico (SO), paraventricular do hipotálamo

(PV) e a parte lateral da área retroquiasmática (RChL).

O SO, formado por células magnocelulares, está presente no mocó nas

bordas laterais do quiasma óptico e assim permane até os primeiros níveis do trato

óptico. Estão presente neurônios NOS-IR em toda sua extensão, sendo este bem

delimitado pelo núcleo pré-óptico ventrolateral que não apresentou células NOS-IR.

Ng e colaboradores (1999) descrevem os neurônios NOS-IR do SO de

camundongos como estando dispostos em cachos de células, semelhante ao que foi

visto no mocó. Gotti e colaboradores (2005) descrevem os neurônios NOS-IR do SO

do camundongo com marcação média. Dentro do SO de mocó vimos que cerca de

metade dos neurônios nitrérgicos foram intensamente corados, enquanto os outros

exibiram apenas uma fraca reação. Este fato também foi relatado por Vincent e

Kimura (1992) e por Yamada e colaboradores (1996) em seus estudos com ratos.

Já o PV de mocó apresenta neurônios NOS-IR na parte ventral parvocelular,

parte parvocelular anterior e medial. Todas suas subdivisões foram bem delimitadas

pelos neurônios NOS-IR. Os neurônios NOS-IR do PV do mocó se apresentou mais

semelhante aos do camundongo do estudo de Gotti e colaboradores (2005), com

células mais dispersas e marcação média, diferente do rato que apresentou

densidade e intensidade elevadas (Yamada et al., 1996; Ng et al., 1999).

A RChL apresentou células NOS-IR com densidade alta conforme descreve

Rodrigo e colaboradores (1994). Ng e colaboradores (1999) não encontraram

neurônios NOS-IR no RChL em seu estudo com ratos e camundongos. Os demais

neurônios NOS-IR que encontramos na região anterior do hipotálamo foram a

69

decussação supraóptica, onde Vincent e Kimura (1992) encontraram um número alto

de fibras em ratos, o núcleo periventricular do hipotálamo descrito em vários estudos

com roedores (Leigh et al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Gotti

et al., 2005), o núcleo ventrolateral do hipotálamo e na parte peduncular da área

hipotalâmica lateral também descrito em diversos trabalhos com roedores (Leigh et

al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Yamada et al., 1996; Ng et

al., 1999; Gotti et al., 2005).

Na região tuberal de mocó, neurônios NOS-IR estão presentes

principalmente na divisão ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo.

Também esteve presente em mocó neurônios nitrérgicos na parte tuberal da área

hipotalâmica lateral (Leigh et al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994;

Yamada et al., 1996; Ng et al., 1999; Gotti et al., 2005), no núcleo dorsomedial

(Vincent e Kimura, 1992; Yamada et al., 1996) e na área hipotalâmica posterior

(Vincent e Kimura, 1992; Yamada et al., 1996; Gotti et al., 2005).

Citoarquitetonicamente o VMH do mocó se apresentou muito semelhante

ao do camundongo, rato e sagui, como todas as suas divisões como está descrito

nos atlas utilizados para comparação (Paxinos e Watson, 2007; Paxinos et al., 2012;

Paxinos e Franklin, 2008). Um número considerável de fibras foi visto no VMHa e

alguns neurônios NOS-IR foram encontrados entre estas fibras nervosas no estudo

de Ng e colaboradores (1999) usando rato e camundongo e Vincent e Kimura (1992)

com ratos. O mesmo aconteceu com o mocó não apenas no VMHa como também

no VMHp. O VMHvl de mocó apresentou neurônios NOS-IR com densidade alta e

intensidade da marcação média, assim como descreve Vincent e Kimura (1992) em

rato. O VHMdm apresentou densidade moderada e padrão de coloração fraca.

Alguns estudos mostram a presença de neurônios nitrérgicos no VMH, sem

descrever suas subdivisões (Yamada et al., 1999; Iwaze et al., 1998; Gotti et al.,

2005), e Rodrigo e colaboradores (1994) não encontraram neurônios NOS-IR no

VMHdm.

A região mamilar apresentou os maiores valores de densidade de neurônios

NOS-IR. As marcações para NO delimitaram bem os núcleos pré-mamilar ventral

(PMV) e dorsal (PMD) de mocó, o que está de acordo com a maior parte da

bibliografia (Leigh et al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Yamada

et al., 1996). No entanto, Yamada e colaboradores (1996) descrevem o PMV de

70

ratos com densidade moderada e marcação fraca. Estão presente no mocó

neurônios nitrérgicos ainda na divisão lateral e medial do núcleo retromamilar, na

divisão lateral do núcleo mamilar medial, no núcleo mamilar lateral e na área

hipotalâmica posterior, o que condiz com diversos estudos com roedores (Vincent e

Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Yamada et al., 1996; Iwaze et al., 1998; Ng et al.,

1999; Gotti et al., 2005).

No tálamo, os primeiros neurônios NOS-IR surgiram em sua porção

dorsomedial, nas porções anterior, média e posterior do núcleo paraventricular do

tálamo (PVT). Este núcleo e suas subdivisões apresentaram uma densidade baixa,

visto que poucos neurônios foram visíveis dentro de suas bordas e estes

apresentaram uma marcação fraca. Para Rodrigo e colaboradores (1994), em seu

estudo com ratos, estes neurônios estiveram mais presentes na porção anterior, já

Vincent e Kimura (1992) descrevem uma maior quantidade de neurônios NOS-IR na

porção posterior do PVT de ratos. Iwaze e colaboradores (1998) encontraram no

rato um rico número de células nesse núcleo, e Gotti e colaboradores (2005)

encontraram no camundongo apenas alguns neurônios fracamente corados.

A zona incerta (ZI) apresentou no mocó um número pequeno de neurônios

NOS-IR em sua subdivisão caudal (ZIC), com marcação de fraca a média. Rodrigo e

colaboradores (1994) descrevem em ratos uma rede de fibras imunorreativas na

parte ventral desse núcleo. Leigh e colaboradores (1990) encontraram na ZI de ratos

um grupo de células com coloração intensa, já no trabalho de Vincent e Kimura

(1992) também com ratos essas células eram levemente coradas.

Na habênula do mocó, neurônios NOS-IR estiveram presentes apenas na

porção lateral do núcleo habenulal lateral (LHbL), estes com densidade moderada e

intensidade da marcação média. Vincent e Kimura (1992) descreve a LHbL de ratos

com um plexo denso de fibras finas, fortemente corados, e Gotti e colaboradores

(2005), descrevem apenas poucos neurônios levemente corados em camundongos.

O núcleo talâmico parafascicular (PF) apresentou um pequeno número de

neurônios NOS-IR com marcação média. Vincent e Kimura (1992) descrevem no

rato fibras densas nesse núcleo. Rodrigo e colaboradores (1994) também

encontraram neurônios NOS-IR no PF de ratos.

Ainda no tálamo do mocó, neurônios NOS-IR estiveram presentes no núcleo

talâmico posterodorsal ventral (VPM) e na parte mediocaudal do núcleo talâmico

71

posterior lateral (LPMC), o que corrobora com os estudos de Vincent e Kimura

(1992) e Rodrigo e colaboradores (1994) em ratos.

O núcleo geniculado ventral (VG) é um núcleo visual do tálamo que recebe

projeções direta da retina (Hickey e Spear, 1976) e do córtex visual (Pasquier e

Villar, 1982; Brauer et al., 1983). Este núcleo, junto com o núcleo geniculado lateral

dorsal e o folheto intergeniculado (FIG) formam o complexo geniculado lateral. No

mocó, o VG apresenta uma densidade alta de neurônios NOS-IR, com intensidade

de marcação alta e neurópila contornando a borda lateral. O trabalho de Vincent e

Kimura (1992) mostra o VG de ratos com muitas células fortemente coradas e uma

neurópila densa fortemente corada. Trabalho prévio de nosso grupo, ao investigar a

presença de NOS no sistema de temporização circadiana verificou que não há

neurônios NOS-IR no FIG, mas mostrou claramente neurônios NOS-IR no VG

(Nascimento et al., 2010), corroborando os dados do atual trabalho.

A parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD) apresentou uma rede de

fibras com neurônios NOS-IR assim como descreve Vincent e Kimura (1992) em

ratos e Gotti e colaboradores (2005) em camundongos. Outros trabalhos de

distribuição também descrevem a presença do NO no MGD (Leigh et al., 1990;

Rodrigo et al., 1994).

A maioria dos estudos de distribuição do NO no encéfalo trazem as técnicas

imunoistoquímicas e histoquímicas para NADPHd. Porém, Iwaze e colaboradores

(1998) investigaram a distribuição do RNAm de NOS no encéfalo de ratos por

hibridização in situ, e, segundo descrevem seus resultados, a distribuição desses

neurônios foi semelhante aos demais estudos. Logo, foi semelhante com a

distribuição presente no mocó.

4.3 Aspectos funcionais do NO no diencéfalo

Para ajudar na compreensão das funções biológicas de NO, fontes

exógenas doadoras e inibidoras deste neurotransmissor têm sido desenvolvidas

como ferramentas de pesquisa. Então, antes de discutir a funcionalidade do NO, faz-

se necessário entender um pouco sobre o tema, visto que este é predominante na

maioria dos estudos que serão discutidos adiante.

72

Para aumentar os níveis de NO, compostos doadores são usados e vários já

foram descritos, como por exemplo o nitroprussiato de sódio (SNP), um fármaco

vasoativo. Quimicamente, todos os doadores têm a funcionalidade nitrato na

molécula e um grupo funcional nitroso está presente em todos estes compostos

(Yamamoto 2000).

Além de doadores, a produção endógena de NO pode ser controlada pelo

uso de inibidores da NOS. Estes inibidores funcionam como falsos substratos

através de sua ligação no local de ligação da L-arginina (Bryk e Wolff 1999). Uma

centena de inibidores de NOS foram descritos como possíveis ferramentas

farmacológicas (Moore e Handy, 1997), mas a N(Omega)-nitro-L-arginina metil éster

(L-NAME) é o inibidor de NOS não seletivo mais utilizado nesses estudos. Sendo

assim, muitos estudos usando doadores e inibidores foram realizados para

investigar a ação do NO no encéfalo.

O MnPO é conhecido por desempenhar um papel crítico em circuitos neurais

que controlam as respostas cardiovasculares e a homeostase dos fluidos (Saper e

Levisohn, 1983; Saper, 2003). Ele envia amplas projeções para o PV e grupos de

células magnocelulares, bem como para o núcleo dorsomedial do hipotálamo (Gu e

Simerly, 1997; Thompson e Swanson, 1998). Saad e colaboradores (2003)

investigaram o efeito do inibidor L-NAME e do doador SNP nas alterações induzidas

por pilocarpina no fluxo salivar, pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca

(FC) em ratos adultos. A pilocarpina é um agonista colinérgico muscarínico que

induz vasodilatação e salivação copiosa quando administrado sistemicamente

através da ativação do sistema parassimpático (Baum, 1987; Garret et al., 1991;

Ferguson, 1993). Eles implantaram uma cânula no MnPO e injetaram pilocarpina em

doses crescentes. Com isso eles viram que a pilocarpina injetada no MnPO induziu

um aumento na secreção salivar e na PAM, e diminuição da FC. A injeção de L-

NAME antes da pilocarpina no MnPO ou via intraperitoneal (IP) também aumentou a

secreção salivar e a PAM, e diminuiu a FC. As mesmas injeções utilizando SNP

antes da pilocarpina provocaram um efeito contrário na secreção salivar e na PAM.

Já via IP, a pilocarpina promove uma diminuição da PAM e um aumento da FC.

Conclui-se com esse estudo que no rato, o NO presente no MnPO atua no

mecanismo do fluxo salivar e que ele interfere com os efeitos colaterais da

pilocarpina na PAM e FC. Logo, pela presença de neurônios NOS-IR no MnPO do

73

mocó, hipotetizamos que nosso modelo animal apresenta a mesma função do NO

no MnPO que está presente em ratos.

Os neurônios NOS-IR do SO e o PV ganham destaque na região anterior do

hipotálamo. O NO participa da modulação neuroendócrina da liberação de

vasopressina e ocitocina, dois hormônios sintetizados principalmente nesses

núcleos (Du Vigneaud, 1953; George e Jacobowitz, 1975; Cunningham e

Sawchenko, 1991). Os estímulos mais potentes para liberação desses hormônios

são aumento de osmolaridade plasmática, hipotensão e hipovolemia (Dunn et al.,

1973; Cunningham e Sawchenko 1991) e estudos de co-localização têm

demonstrado que uma proporção de neurônios magnocelulares no PV e SO que

contém NOS também expressam os peptídeos vasopressina (Calka e Block, 1993) e

ocitocina (Miyagawa et al., 1994). A ocitocina é um hormônio muito importante no

parto e na ejeção de leite, e usado como indutor dos mesmos (Tortora e Grabowski,

2010; Lent, 2001).

Okere e colaboradores (1996) demonstraram que a injeção subcutânea ou

intracerebroventricular (icv) do doador de NO SNP em ratas no final da gravidez e

parturientes provocou o prolongamento do tempo total do parto e a inibição da

expressão do comportamento maternal. E que mesmo a injeção central de ocitocina

não conseguiu reduzir o tempo de parto provocada pela injeção de SNP, mas o

comportamento materno foi restaurado (Okere et al., 1996a). Estas observações

sugerem que o NO afeta o parto e a iniciação do comportamento materno, através

da interferência na liberação de ocitocina dentro do cérebro. O mesmo foi visto para

a ejeção do leite onde filhotes de ratas que receberam injeções crônicas de SNP

apresentaram um baixo peso corporal quando comparados aos filhotes das mães

que receberam solução salina ou L-arginina (Okere et al., 1996b e 1999).

A partir de registros eletrofisiológicos da atividade de neurônios do SO in

vitro usando o inibidor da NO L-NAME, Liu e colaboradores (1997) viram um

aumento na frequência de disparos desses neurônios. Nesse mesmo trabalho

também foi utilizado o SNP e foi percebida uma queda na frequência de disparos

dos neurônios do SO demonstrando assim um efeito inibitório do NO na atividade

desses neurônios. No entanto, existem alguns trabalhos na literatura que mostram o

contrário, ou seja, que o NO atua na liberação de vasopressina e ocitocina, como o

estudo de Ota e colaboradores (1993), onde eles sugerem que o NO pode agir

74

centralmente para estimular a liberação de vasopressina. Eles concluiram isso a

partir de seu estudo onde foi utilizado uma injeção icv do doador de NO S-Nitroso-N-

Acetilpenicilamina (SNAP) em ratos conscientes, que promoveu o aumento de

vasopressima no plasma desses animais. Outro estudo semelhante a este foi o de

Cao e colaboradores (1996), que utilizaram L-arginina, o precursor de NO, e L-

NAME, administrados via icv em ratos anestesiados com pentobarbital. Seus

resultados mostram que a concentração plasmática de vasopressina aumentou após

a injeção de L-arginina e diminuiu após a administração com L-NAME, mostrando

assim um efeito excitatório do NO na liberação de vasopressina.

Injeção de ocitocina no PV de ratos machos induz tanto ereção peniana

quanto bocejo (Argiolas, 1994; Argiolas e Melis, 1994 e 1998; Melis e Argiolas,

1997), o mesmo acontece com a injeção dos doadores de NO SNP, SNAP,

hidroxilamina e nitrito de isoamila no PV (Melis e Argiolas, 1995), e tratamento com

bloqueadores dos receptores de ocitocina pode eliminar os efeitos de doadores de

NO nesses comportamentos (Melis et al., 1999). Por fim, os agonistas da dopamina

e do NMDA (receptor de glutamato) induzem a ereção peniana e bocejo, agindo

sobre os receptores D2 que aumentam a atividade da NOS nos corpos celulares dos

neurônios do PV projetando para áreas extra-hipotalâmicas do cérebro (Melis et al.,

1994 e 1996).

Apesar da controvérsia entre alguns estudos, fica claro que NO tem um

papel nas funções endócrinas, fisiológicas e comportamentais dos núcleos SO e PV,

o que especulamos que também possa acontecer em mocó. Por exemplo, por ser

um animal que habita o semi-árido e enfrenta períodos longos de seca e escassez

de água, provavelmente a vasopressina tem um papel muito importante no controle

do balanço hídrico do mocó. Talvez até maior que em roedores que habitam

ambiente com menor excassez de água. Outro ponto importante é a ausência de NO

em neurônios magnocelulares do PV de mocó. Mocó é um roedor com baixa taxa de

reprodução e isto pode ser influenciado pela ausência de NO em neurônios

ocitocinérgicos.

Na região tuberal de mocó, neurônios NOS-IR estiveram presentes

principalmente no VMHvl. Já faz muito tempo que o VMH vem sendo descrito como

um grande "centro" de reações afetivas (Wheatley, 1944, Zwischenhirn, 1949),

funções hormonais (Sawyer, 1960) e comportamento alimentar (Hetherington e

75

Ranson, 1942). O VMHvl desempenha um papel na lordose, comportamento sexual

de ratas em resposta a estimulação sexual (Kow e Pfaff, 1998), e esse

comportamento pode ser modulado pelo NO. Mani e colaboradores (1994) viram que

a injeção icv de NG-monometil-L-arginina impede a lordose facilitada por

progesterona injetada também via icv. Já a injeção icv de SNP facilita o

comportamento de lordose em ratas. E lordose facilitada por progesterona ou SNP

foi bloqueada por injeção icv do anti-soro de LHRH. Esses resultados mostram que a

progesterona provoca a liberação de NO, o que estimula a libertação de LHRH, que

facilita a lordose. Assim, os resultados indicam que o NO induz a liberação de

LHRH, e que, em seguida, o LHRH desempenha um papel crucial na mediação do

comportamento sexual em ratas. Este efeito pode ser mediado pela produção de

cGMP, porque bloqueadores de cGMP também suprimem o comportamento de

lordose (Chu e Etgen, 1996, 1997). Até hoje nenhum estudo do comportamento

sexual em mocó foi publicado, no entanto podemos especular que neurônios NO no

VMH de mocó deve estar envolvido neste tipo de comportamento, como está em

outros roedores.

Ceccatelli e colaboradores (1996) investigaram o papel do estrogênio na

produção do RNAm de NOS por hibridização in situ. A análise quantitativa mostrou

um aumento em RNAm da NOS no VMH de ratas ovariectomizadas tratadas com

benzoato de estradiol durante 7 dias. O aumento foi principalmente no VMHvl. Esses

dados sugerem que a expressão de RNAm de NOS no VMH pode ser regulada pelo

estrogênio. Além disso, mais de 70% dos neurônios nitrérgicos do VMH contém

receptores para estrogênio (Okamura et al., 1994). Esses dados evidenciam um

relação anatômica entre estrogênio e a NOS no VMH, sugerindo que a atividade da

NOS pode ser modulada pelo estradiol em neurônios sensíveis a estrogênio. Logo, a

NOS está presente em áreas relevantes para o comportamento da lordose e é

modulado por níveis de esteróides ovarianos circulantes (Rachman et al., 1996,

1998), sugerindo um papel relevante de NO no comportamento sexual feminino, que

pode estar presente no mocó, visto a presença de neurônios NOS-IR no VMH.

A região mamilar apresentou a maior densidade de neurônios NOS-IR,

sendo que destes abrimos destaque ao PMV. Neurônios no PMV expressam um

grande número de receptores de esteróides sexuais e mantem conexões recíprocas

com áreas relacionadas com a reprodução, responsivas à feromônios e que são

76

sexualmente dimórficas (Simerly et al., 1990; Canteras et al., 1992; Cavalcante et

al., 2006; 2014; Leshan et al., 2009). Os feromônios tem acesso ao encéfalo através

do órgão vomeronasal que envia a informação olfativa para o bulbo olfatório

acessório, de onde será retransmitido para o núcleo medial da amígdala. Por fim, a

informação chega a núcleos hipotalâmicos, como o VMH e o PMV (Scalia e Winans,

1975; Canteras et al., 1995; Halpern e Martinez-Marcos, 2003). Donato e

colaboradores (2010) expuseram ratos machos sexualmente inexperientes a odores

de ratas e ratos, e avaliaram a atividade da proteína Fos (um indicador de atividade

neuronal) em neurônios que expressam NO no PMV. Os odores provocaram

expressão de Fos em neurônios NADPHd do PMV. Além disso, viu-se que esses

neurônios co-expressam o neurotransmissor chamado Transcrito Regulado pela

Cocaína e Anfetamina (CART). Logo, eles concluem que no PMV, neurônios

NADPHd/CART respondem a odores masculinos e femininos, sugerindo um papel

na regulação neuroendócrina e comportamental em resposta a estímulos olfativos.

Pela efusiva presença de neurônios nitrérgicos no PMV do mocó, hipotetizamos que

estes neurônios sejam importantes na resposta a odores de co-específicos de

ambos os sexos, assim como se apresenta em ratos.

No tálamo de mocó, especialmente no complexo geniculado lateral,

neurônios NOS-IR estiveram presentes apenas no VG (presente trabalho;

Nascimento Jr et al., 2010). Nos demais roedores, neurônios NOS-IR foram

descritos no VG e no núcleo geniculado lateral dorsal (DLG) (Vincent e Kimura,

1992; Rodrigo et al., 1994; Iwaze et al., 1998; Gotti et al., 2005). Sugere-se que o

VG esteja envolvido com o reflexo pupilar, detecção de cores, modulação dos ritmos

circadianos e integração visuomotora devido a uma grande entrada retiniana

elusivando estas funções visuais. Há também uma segunda possibilidade para as

conexões, como a do VG estar conectado ao colículo superior, pretecto, núcleo

óptico acessório, cerebelo e complexo vestibular (Jones, 2007). Meng e

colaboradores (1998) observaram que 96% dos neurônios nitrérgicos do VG

projetam para o núcleo pretectal ipsilateral o que sugere que esse núcleo é o

principal alvo dos neurônios nitrérgicos do VG de ratos. Hipotetizamos que os

neurônios NOS-IR encontrados no VG possam estar atuando no sistema visual. A

ausência de neurônios NOS-IR no DLG nos faz pensar que o NO no mocó tenha um

papel menor na função visual quando comparado com outros roedores.

77

5. CONCLUSÃO

A distribuição de NO no diencéfalo de mocó é bem semelhantes às

distribuições previamente descritas em outros roedores, mostrando que há uma

conservação deste sistema pelo menos em parte do sistema nervoso de mamíferos.

Isto também aponta para uma conservação da funcionalidade deste sistema,

indicando que em mocó NO tem funções importantes e diversas como tem em

outros animais estudados até o momento. Concluímos também que a atividade

NADPHd e o nível de imunorreatividade são diretamente proporcionais em mocó e

que a técnica de NADPHd não é a ideal para um estudo de mapeamento de

neurônios nitrérgicos em mocó.

78

REFERÊNCIAS1

AGGLETON, J. P.; BROWN, M. W. Episodic memory, amnesia, and the hippocampal–anterior thalamic axis. Behavioral and Brain Sciences, v. 22, n. 03, p. 425-444, 1999.

AGGLETON, J. P.; DUMONT, J. R.; WARBURTON, E. C. Unraveling the contributions of the diencephalon to recognition memory: a review. Learning & Memory, v. 18, n. 6, p. 384-400, 2011. ANKEN, R. H.; RAHMANN, H. An atlas of the distribution of NADPH-diaphorase in the brain of the highly derived swordtail fish Xiphophorus helleri (Atherinoformes: Teleostei). Journal fur Hirnforschung, v. 37, n. 3, p. 421-449, 1995.

ARÉVALO, R. et al. NADPH‐Diaphorase in the central nervous system of the tench (tinca tinca L., 1758). Journal of Comparative Neurology, v. 352, n. 3, p. 398-420,

1995. ARGIOLAS, A. Nitric oxide is a central mediator of penile erection. Neuropharmacology, v. 33, n. 11, p. 1339-1344, 1994.

ARGIOLAS, A.; MELIS, M. R. The neuropharmacology of yawning. European Journal of Pharmacology, v. 343, n. 1, p. 1-16, 1998. ARGIOLAS, A.; MELIS, M. R. Central control of penile erection: role of the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Progress in Neurobiology, v. 76, n. 1,

p. 1-21, 2005. ARGIOLAS, A.; MELIS, M. R. Oxytocin-induced penile erection. Role of nitric oxide. Advances in Experimental Medicine and Biology, v. 395, p. 247-254, 1994.

BAUM, B. J. Neurotransmitter control of secretion. Journal of Dental Research, v.

66, n. 2 suppl, p. 628-632, 1987. BENTIVOGLIO, M.; BALERCIA, G.; KRUGER, L. The specificity of the nonspecific thalamus: the midline nuclei. Progress in Brain Research, v. 87, p. 53-80, 1991.

BÖHME, G. A. et al. Altered synaptic plasticity and memory formation in nitric oxide synthase inhibitor-treated rats. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 90, n. 19, p. 9191-9194, 1993. BÖHME, G. A. et al. Possible involvement of nitric oxide in long-term potentiation. European Journal of Pharmacology, v. 199, n. 3, p. 379-381, 1991.

1 Norma ABNT NBR 6023

79

BON, C. L. M.; GARTHWAITE, J. On the role of nitric oxide in hippocampal long-term potentiation. The Journal of Neuroscience, v. 23, n. 5, p. 1941-1948, 2003. BRANN, D. W. et al. Gaseous transmitters and neuroendocrine regulation. Neuroendocrinology, v. 65, n. 6, p. 385-395, 1997.

BRAUER, K. et al. The ventral lateral geniculate nucleus of the albino rat morphological and histochemical observations. Journal fur Hirnforschung, v. 25, n. 2, p. 205-236, 1983. BREDT, D. S.; SNYDER, S. H. Nitric oxide mediates glutamate-linked enhancement of cGMP levels in the cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 86, n. 22, p. 9030-9033, 1989.

BREDT, D. S. et al. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase. Nature, v.351, p. 714-718, 1991. BREDT, D. S.; HWANG, P. M.; SNYDER, S. H. Localization of nitric oxide synthase indicating a neural role for nitric oxide. Nature, v. 347, n. 6295, p. 768-770, 1990.

BRÜNING, G.; MAYER, B. Localization of nitric oxide synthase in the brain of the frog, Xenopus laevis. Brain Research, v. 741, n. 1, p. 331-343, 1996. BRÜNING, G. Localization of NADPH‐diaphorase in the brain of the chicken. Journal of Comparative Neurology, v. 334, n. 2, p. 192-208, 1993.

BRÜNING, G.; KATZBACH, R.; MAYER, B. Histochemical and immunocytochemical localization of nitric oxide synthase in the central nervous system of the goldfish, Carassius auratus. Journal of Comparative Neurology, v. 358, n. 3, p. 353-382,

1995. BRÜNING, G.; WIESE, S.; MAYER, B. Nitric oxide synthase in the brain of the turtle Pseudemys scripta elegans. Journal of Comparative Neurology, v. 348, n. 2, p.

183-206, 1994. BRYK, R.; WOLFF, D. J. Pharmacological modulation of nitric oxide synthesis by mechanism-based inactivators and related inhibitors. Pharmacology & Therapeutics, v. 84, n. 2, p. 157-178, 1999. BURK, J. A.; MAIR, Robert G. Effects of intralaminar thalamic lesions on sensory attention and motor intention in the rat: a comparison with lesions involving frontal cortex and hippocampus. Behavioural Brain Research, v. 123, n. 1, p. 49-63, 2001. CABRERA, A. Catálogo de los mamíferos de América del Sur. 1961. CALABRESE, V. et al. Nitric oxide in the central nervous system: neuroprotection versus neurotoxicity. Nature Reviews Neuroscience, v. 8, n. 10, p. 766-775, 2007.

80

CALKA, J.; BLOCK, C. H. Relationship of vasopressin with NADPH-diaphorase in the hypothalamo-neurohypophysial system. Brain Research Bulletin, v. 32, n. 3, p. 207-210, 1993. CANTERAS, N. S.; SIMERLY, R. B.; SWANSON, L. W. Organization of projections from the medial nucleus of the amygdala: a PHAL study in the rat. Journal of Comparative Neurology, v. 360, n. 2, p. 213-245, 1995.

CANTERAS, N. S.; SIMERLY, R. B.; SWANSON, L. W. Projections of the ventral premammillary nucleus. Journal of Comparative Neurology, v. 324, n. 2, p. 195-212, 1992. CAO, L.; SUN, X.; SHEN, E. Nitric oxide stimulates both the basal and reflex release of vasopressin in anesthetized rats. Neuroscience Letters, v. 221, n. 1, p. 49-52, 1996. CARPENTER M. B. Core Text of Neuroanatomy. Williams and Wilkins, 1991.

DE MELO CARVALHO, J. C. Notas de Viagem de um Zoólogo à Região das Caatingas e Áreas Limítrofes. Imprensa Universitária do Ceará, 1969. CAVALCANTE, J. C.; BITTENCOURT, J. C.; ELIAS, C. F. Distribution of the neuronal inputs to the ventral premammillary nucleus of male and female rats. Brain Research, v. 1582, p. 77-90, 2014. CAVALCANTE, J. C.; BITTENCOURT, J. C.; ELIAS, C. F. Female odors stimulate CART neurons in the ventral premammillary nucleus of male rats. Physiology & Behavior, v. 88, n. 1, p. 160-166, 2006. CECCATELLI, S. et al. Estradiol regulation of nitric oxide synthase mRNAs in rat hypothalamus. Neuroendocrinology, v. 64, n. 5, p. 357-363, 1996.

CHU, H.; ETGEN, A. M. A potential role of cyclic GMP in the regulation of lordosis behavior of female rats. Hormones and Behavior, v. 32, n. 2, p. 125-132, 1997. CHU, H.; ETGEN, A. M. Effects of nitric oxide on stimulated release of norepinephrine from female rat hypothalamic slices. Brain Research, v. 741, n. 1, p.

60-67, 1996. CLARK, W. E. L. G. The Hypothalamus, Morphological, Functional, Clinical and Surgical Aspects. Pub. for the William Ramsay Henderson trust by Oliver and Boyd,

1938. COSTA, A. et al. Nitric oxide modulates the release of corticotropin-releasing hormone from the rat hypothalamus in vitro. Brain Research, v. 605, n. 2, p. 187-

192, 1993. COZZI, B.; MASSA, R.; PANZICA, G. Carlo. The NADPH-diaphorase-containing system in the brain of the budgerigar (Melopsittacus undulatus). Cell and Tissue Research, v. 287, n. 1, p. 101-112, 1996.

81

CRANDALL, L. S. et al. Family caviidae, In: Manangement of the wild Mammals captivity. The Management of Wild Mammals in Captivity. 1964.

CROSBY, E. C.; WOODBURNE, R.T. The comparative anatomy of the preoptic area and the hypothalamus. Research Publications-Association for Research in Nervous and Mental Disease, v. 20, p. 52-169, 1939.

CUNNINGHAM, E. T.; SAWCHENKO, P. E. Reflex control of magnocellular vasopressin and oxytocin secretion. Trends in Neurosciences, v. 14, n. 9, p. 406-411, 1991. DAWSON, T. M. et al. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 88, n. 17, p. 7797-7801, 1991.

DAWSON, T. M.; SNYDER, S. H. Gases as biological messengers: nitric oxide and carbon monoxide in the brain. The Journal of Neuroscience, v. 14, n. 9, p. 5147-5159, 1994. DEECKE, L.; SCHWARZ, D. W. F.; FREDRICKSON, J. M. The vestibular thalamus in the rhesus monkey. In: Current Studies in Otoneurology. Karger Publishers, p. 210-219, 1973. DONATO, J. et al. Male and female odors induce Fos expression in chemically defined neuronal population. Physiology & Behavior, v. 99, n. 1, p. 67-77, 2010. DU VIGNEAUD, V. Hormones of the posterior pituitary gland: oxytocin and vasopressin. Harvey Lectures, v. 50, p. 1-26, 1953.

DUNN, F. L. et al. The role of blood osmolality and volume in regulating vasopressin secretion in the rat. Journal of Clinical Investigation, v. 52, n. 12, p. 3212, 1973. EGBERONGBE, Y. I. et al. The distribution of nitric oxide synthase immunoreactivity in the human brain. Neuroscience, v. 59, n. 3, p. 561-578, 1994.

FERGUSON, M. M. Pilocarpine and other cholinergic drugs in the management of salivary gland dysfunction. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, v. 75, n. 2, p. 186-191, 1993. FERRENDELLI, J. A.; CHANG, M. M.; KINSCHERF, D. A. Elevation of cyclic gmp levels in central nervous system by excitatory and inhibitory amino acids1. Journal of Neurochemistry, v. 22, n. 4, p. 535-540, 1974.

FREEDMAN, L. J.; CASSELL, M. D. Thalamic afferents of the rat infralimbic and lateral agranular cortices. Brain Research Bulletin, v. 26, n. 6, p. 957-964, 1991. FURCHGOTT, R. F. et al. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, v. 288, n. 5789, p. 373-376, 1980.

82

GARRETT, J. R. et al. Secretory responses in granular ducts and acini of submandibular glands in vivo to parasympathetic or sympathetic nerve stimulation in rats. Cell and Tissue Research, v. 264, n. 1, p. 117-126, 1991.

GARTHWAITE, J.; CHARLES, S. L.; CHESS-WILLIAMS, R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain. Nature, v. 336, 385-388, 1988.

GARTHWAITE, J. et al. NMDA receptor activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices. European Journal of Pharmacology: Molecular Pharmacology, v. 172, n. 4, p. 413-416, 1989.

GEORGE, J. M.; JACOBOWITZ, D. M. Localization of vasopressin in discrete areas of the rat hypothalamus. Brain Research, v. 93, n. 2, p. 363-366, 1975. GERLACH, M. et al. Regional distribution and characterization of nitric oxide synthase activity in the brain of the common marmoset. Neuroreport, v. 6, n. 8, p.

1141-1145, 1995. GLIMCHER, P. W.; LAU, B. Rethinking the thalamus. Nature Neuroscience, v. 8, n. 8, p. 983-984, 2005. GONZÁLEZ, A. et al. Nitric oxide synthase in the brain of a urodele amphibian (Pleurodeles waltl) and its relation to catecholaminergic neuronal structures. Brain Research, v. 727, n. 1, p. 49-64, 1996.

GOTTI, S. et al. Distribution of nitric oxide synthase immunoreactivity in the mouse brain. Microscopy Research and Technique, v. 68, n. 1, p. 13-35, 2005. GREEN, L. C. et al. Nitrate synthesis in the germfree and conventional rat. Science, v. 212, n. 4490, p. 56-58, 1981. GU, G. B.; SIMERLY, R. B. Projections of the sexually dimorphic anteroventral periventricular nucleus in the female rat. Journal of Comparative Neurology, v. 384, n. 1, p. 142-164, 1997. HALPERN, M.; MARTINEZ-MARCOS, A. Structure and function of the vomeronasal system: an update. Progress in Neurobiology, v. 70, n. 3, p. 245-318, 2003. HEGESH, E.; SHILOAH, J. Blood nitrates and infantile methemoglobinemia. Clinica Chimica Acta, v. 125, n. 2, p. 107-115, 1982.

HEMBROOK, J. R.; MAIR, R. G. Lesions of reuniens and rhomboid thalamic nuclei impair radial maze win‐shift performance. Hippocampus, v. 21, n. 8, p. 815-826, 2011. HETHERINGTON, A. W.; RANSON, S. W. The relation of various hypothalamic lesions to adiposity in the rat. Journal of Comparative Neurology, v. 76, n. 3, p. 475-499, 1942.

83

HIBBS, J. B. et al. Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 157, n. 1, p. 87-94, 1988. HIBBS, J. B.; VAVRIN, Z.; TAINTOR, R. R. L-arginine is required for expression of the activated macrophage effector mechanism causing selective metabolic inhibition in target cells. The Journal of Immunology, v. 138, n. 2, p. 550-565, 1987.

HICKEY, T. L.; SPEAR, P. D. Retinogeniculate projections in hooded and albino rats: an autoradiographic study. Experimental Brain Research, v. 24, n. 5, p. 523-529, 1976. HOLMQVIST, B. et al. Identification and distribution of nitric oxide synthase in the brain of adult zebrafish. Neuroscience Letters, v. 292, n. 2, p. 119-122, 2000. HOPE, B. T. et al. Neuronal NADPH diaphorase is a nitric oxide synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 88, n. 7, p. 2811-2814,

1991. IGNARRO, L. J. et al. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 84, n. 24, p. 9265-9269, 1987. IWASE, K. et al. Precise distribution of neuronal nitric oxide synthase mRNA in the rat brain revealed by non-radioisotopic in situ hybridization. Molecular Brain Research, v. 53, n. 1, p. 1-12, 1998. JAMES, S.L. Role of nitric oxide in parasitic infections. Microbiological Reviews, v. 59, n. 4, p. 533-547, 1995. JIANG, P.; TERASHIMA, S. Distribution of NADPH-diaphorase in the central nervous system of an infrared-sensitive snake, Trimeresurus flavoviridis. Brain Research, v. 713, n. 1, p. 168-177, 1996. JONES, E. G. The Thalamus, Second Edition (New York, New York: Cambridge

University Press) 2007. KANDEL, E. R.; SCHWARTZ, J. H.; JESSELL, T. M. The Functional Organization of Perception and Movement. In: KANDEL E.R.; SCHWARTZ, J.H.; JESSELL, T.M. Principles of Neural Science, v. 4. New York: McGraw-hill, 2000. KANG, H.; SCHUMAN, E. M. Long-lasting neurotrophin-induced enhancement of synaptic transmission in the adult hippocampus. Science, v. 267, n. 5204, p. 1658,

1995. KNOWLES, R. G.; MONCADA, S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochemical Journal, v. 298, n. Pt 2, p. 249, 1994.

KNOWLES, R. G. et al. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate

84

cyclase. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 86, n. 13, p. 5159-

5162, 1989. KOESLING, D.; HUMBERT, P.; SCHULTZ, G. The NO receptor: characterization and regulation of soluble guanylyl cyclase. In Nitric Oxide in the Nervous System. Academic Press, London, p. 43-50, 1995. KOW, L.; PFAFF, D. W. Mapping of neural and signal transduction pathways for lordosis in the search for estrogen actions on the central nervous system, Behavioural Brain Research, v. 92, n. 2, p. 169-180, 1998. KWON, N. S. et al. L-citrulline production from L-arginine by macrophage nitric oxide synthase. The ureido oxygen derives from dioxygen. Journal of Biological Chemistry, v. 265, n. 23, p. 13442-13445, 1990. LACHER, T. E. The comparative social behavior of Kerodon rupestris and Galea spixii and the evolution of behavior in the Caviidae. 1981.

LEIGH, P. N.; CONNICK, J. H.; STONE, T. W. Distribution of NADPH-diaphorase positive cells in the rat brain. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology, v. 97, n. 2, p. 259-264, 1990.

LENT, R. Cem bilhões de neurônios? Conceitos fundamentais de Neurôciência

Brasil: Editora Atheneu, 2001. LEONE, A. M. et al. Constitutive and inducible nitric oxide synthases incorporate molecular oxygen into both nitric oxide and citrulline. Journal of Biological Chemistry, v. 266, n. 35, p. 23790-23795, 1991. LESHAN, R. L. et al. Direct innervation of GnRH neurons by metabolic-and sexual odorant-sensing leptin receptor neurons in the hypothalamic ventral premammillary nucleus. The Journal of Neuroscience, v. 29, n. 10, p. 3138-3147, 2009. LINCOLN, T. M. Cyclic GMP receptor proteins: role in nervous system and other tissues. In: Nitric Oxide in the Nervous System. Academic Press San Diego, CA,

1995. p. 51-82. LIU, Q.; JIA, Y.; JU, G. Nitric oxide inhibits neuronal activity in the supraoptic nucleus of the rat hypothalamic slices. Brain Research Bulletin, v. 43, n. 2, p. 121-125,

1997. MANI, S. K. et al. Nitric oxide mediates sexual behavior in female rats. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 91, n. 14, p. 6468-6472, 1994.

MARLETTA, M. A. et al. Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, v. 27, n. 24, p. 8706-8711, 1988. MATSUMOTO, T. et al. A correlation between soluble brain nitric oxide synthase and NADPH-diaphorase activity is only seen after exposure of the tissue to fixative. Neuroscience Letters, v. 155, n. 1, p. 61-64, 1993.

85

MAYER, B. Biochemistry and molecular pharmacology of nitric oxide synthases. In Nitric Oxide in the Nervous System. Academic Press, London, p. 21-42, 1995.

MELIS, M. R.; ARGIOLAS, A. Nitric oxide donors induce penile erection and yawning when injected in the central nervous system of male rats. European Journal of Pharmacology, v. 294, n. 1, p. 1-9, 1995.

MELIS, M. R.; ARGIOLAS, A. Role op central nitric oxide in the control of penile erection and yawning. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, v. 21, n. 6, p. 899-922, 1997.

MELIS, M. R.; STANCAMPIANO, R.; ARGIOLAS, A. Nitric oxide synthase inhibitors prevent N-methyl-D-aspartic acid-induced penile erection and yawning in male rats. Neuroscience Letters, v. 179, n. 1, p. 9-12, 1994.

MELIS, M. R.; SUCCU, S.; ARGIOLAS, A. Dopamine agonists increase nitric oxide production in the paraventricular nucleus of the hypothalamus: correlation with penile erection and yawning. European Journal of Neuroscience, v. 8, n. 10, p. 2056-

2063, 1996. MELIS, M. R. et al. The oxytocin antagonist d (CH 2) 5 Tyr (Me) 2-Orn 8-vasotocin reduces non-contact penile erections in male rats. Neuroscience Letters, v. 265, n.

3, p. 171-174, 1999. MENDES, B. V. Alternativas Tecnológicas Para a Agropecuária do Semi-Árido. 2 ed. São Paulo, Editora Nobel, 1985. MENDES, B. V. Plantas e Animais para o Nordeste. São Paulo, Editora Globo,

1987. MENG, X..; OHARA, P. T.; RALSTON III, H. J. Nitric oxide synthase containing neurons in the ventral lateral geniculate of the rat project to the optic pretectal nuclei. Neuroscience Letters, v. 256, n. 2, p. 89-92, 1998. MIKI, N.; KAWABE, Y.; KURIYAMA, K. Activation of cerebral guanylate cyclase by nitric oxide. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 75, n. 4,

p. 851-856, 1977. MIYAGAWA, A.; OKAMURA, H.; IBATA, Y. Coexistence of oxytocin and NADPH-diaphorase in magnocellular neurons of the paraventricular and the supraoptic nuclei of the rat hypothalamus. Neuroscience Letters, v. 171, n. 1, p. 13-16, 1994. MIZUKAWA, K. et al. Distribution of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase positive cells and fibers in the cat central nervous system. Journal of Comparative Neurology, v. 279, n. 2, p. 281-311, 1989. MONCADA, S.; HIGGS, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine, v. 329, n. 27, p. 2002-2012, 1993.

86

MONCADA, S.; RADOMSKI, M. W.; PALMER, R. M. J. Endothelium-derived relaxing factor: identification as nitric oxide and role in the control of vascular tone and platelet function. Biochemical Pharmacology, v. 37, n. 13, p. 2495-2501, 1988.

MOOJEN, J. Os Roedores do Brasil. Rio de Janeiro: Instituto Nacional do Livro,

1952. MOORE, P. K.; HANDY, R. LC. Selective inhibitors of neuronal nitric oxide synthase–is no NOS really good NOS for the nervous system? Trends in Pharmacological Sciences, v. 18, n. 6, p. 204-211, 1997. MOOS, F. C. GABA-induced facilitation of the periodic bursting activity of oxytocin neurones in suckled rats. The Journal of Physiology, v. 488, n. Pt 1, p. 103, 1995.

MORAIS, P. L. A. G. et al. Retinal projections into the Zona Incerta of the rock cavy (Kerodon rupestris): A CTb study. Neuroscience Research, v. 89, p. 75-80, 2014.

MUÑOZ, M. et al. Topographical distribution of NADPH‐diaphorase activity in the central nervous system of the frog, Rana perezi. Journal of Comparative Neurology, v. 367, n. 1, p. 54-69, 1996. NASCIMENTO, E. S. et al. The suprachiasmatic nucleus and the intergeniculate leaflet in the rock cavy (Kerodon rupestris): Retinal projections and immunohistochemical characterization. Brain Research, v. 1320, p. 34-46, 2010. NG, Y. K.; XUE, Y. D.; WONG, P. Different distributions of nitric oxide synthase-containing neurons in the mouse and rat hypothalamus. Nitric Oxide, v. 3, n. 5, p.

383-392, 1999. OKAMURA, H. et al. Colocalization of NADPH-diaphorase and estrogen receptor immunoreactivity in the rat ventromedial hypothalamic nucleus: stimulatory effect of estrogen on NADPH-diaphorase activity. Endocrinology, v. 135, n. 4, p. 1705-1708, 1994. OKERE, C. O. et al. Nitric oxide prolongs parturition and inhibits maternal behavior in rats. Neuroreport, v. 7, n. 10, p. 1695-1699, 1996a. OKERE, C. O. et al. The effect of systemic and central nitric oxide administration on milk availability in lactating rats. Neuroreport, v. 8, n. 1, p. 243-247, 1996b.

OKERE, C. O. et al. Intracerebroventricular injection of a nitric oxide donor attenuates Fos expression in the paraventricular and supraoptic nuclei of lactating rats. Brain Research, v. 828, n. 1, p. 104-114, 1999.

OTA, M. et al. Evidence that nitric oxide can act centrally to stimulate vasopressin release. Neuroendocrinology, v. 57, n. 5, p. 955-959, 1993. PALMER, R. M.; FERRIGE, A. G.; MONCADA, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, v. 327 p. 524-

526, 1987.

87

PANZICA, G. C. et al. Topographical distribution of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate‐diaphorase in the brain of the Japanese quail. Journal of Comparative Neurology, v. 342, n. 1, p. 97-114, 1994. PARENT, A.; Human Neuroanatomy. 9 ed. Canada: Willians & Wilkins, 1996. PASQUIER, D. A.; VILLAR, M. J. Subcortical projections to the lateral geniculate body in the rat. Experimental Brain Research, v. 48, n. 3, p. 409-419, 1982.

PAXINOS, G. F. K. B. J. The Rat Nervous System. 3rd edition. Elsevier, San Diego,

2004.

PAXINOS, G. F. K. B. J.; FRANKLIN, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2rd edition. San Diego: Academic Press, 2008.

PAXINOS, G. F. K. B.J.; WATSON, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.

6rn edition. Academic press, 2007.

PAXINOS, G. F. K. B. J. et al. The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates.

1rd edition. Academic Press, 2012.

RACHMAN, I. M.; PFAFF, D. W.; COHEN, R. S. NADPH diaphorase activity and nitric oxide synthase immunoreactivity in lordosis-relevant neurons of the ventromedial hypothalamus. Brain Research, v. 740, n. 1, p. 291-306, 1996. RACHMAN, I. M. et al. Regulation of neuronal nitric oxide synthase mRNA in lordosis-relevant neurons of the ventromedial hypothalamus following short-term estrogen treatment. Molecular Brain Research, v. 59, n. 1, p. 105-108, 1998. RADOMSKI, M. W.; PALMER, R. M. J.; MONCADA, S. Comparative pharmacology of endothelium‐derived relaxing factor, nitric oxide and prostacyclin in platelets. British Journal of Pharmacology, v. 92, n. 1, p. 181-187, 1987. ROBERTS, M.; MALINIAK, E.; DEAL, M. The reproductive biology of the rock cavy, Kerodon rupestris, in captivity: A study of reproductive adaptation in a trophic specialist. Mammalia, v. 48, n. 2, p. 253-266, 1984. RODRIGO, J. et al. Localization of nitric oxide synthase in the adult rat brain. Philosophical Transactions: Biological Sciences, p. 175-221, 1994.

SAAD, W. A. et al. Role of nitric oxide of the median preoptic nucleus (MnPO) in the alterations of salivary flow, arterial pressure and heart rate induced by injection of pilocarpine into the MnPO and intraperitoneally. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 36, n. 7, p. 897-905, 2003. SAAVEDRA, E. E. El óxido nítrico en medicina (I). Aspectos básicos. Medicina integral: Medicina Preventiva y Asistencial en Atención Primaria de la Salud, v.

29, n. 5, p. 199-208, 1997.

88

SANGRUCHI, T.; KOWALL, N. W. NADPH diaphorase histochemistry of the human hypothalamus. Neuroscience, v. 40, n. 3, p. 713-724, 1991. SAPER, C. B. Central Autonomic Nervous System. In “The Rat Nervous System” (Paxinos, G., Ed.), 3rd ed. Elsevier, San Diego, 2003. SAPER, C. B.; LEVISOHN, D. Afferent connections of the median preoptic nucleus in the rat: anatomical evidence for a cardiovascular integrative mechanism in the anteroventral third ventricular (AV3V) region. Brain Research, v. 288, n. 1, p. 21-31,

1983. SAPER, C. B.; LOWELL, B. B. The hypothalamus. Current Biology Vol 24 No 23, 1111-1116, 2014. SAWYER, C. H. Reproductive behavior. Handbook of Physiology, v. 2, p. 1225-

1240, 1960. SCALIA, F.; WINANS, S. S. The differential projections of the olfactory bulb and accessory olfactory bulb in mammals. Journal of Comparative Neurology, v. 161,

n. 1, p. 31-55, 1975.

SCHLAG-REY, M.; SCHLAG, J. Visuomotor functions of central thalamus in monkey. I. Unit activity related to spontaneous eye movements. Journal of Neurophysiology, v. 51, n. 6, p. 1149-1174, 1984. SCHOBER, A.; MALZ, C. R.; MEYER, D. L. Enzymehistochemical demonstration of nitric oxide synthase in the diencephalon of the rainbow trout (Oncorhynchus mickiss). Neuroscience Letters, v. 151, n. 1, p. 67-70, 1993. SCHMIDT, H. H. H. W.; WALTER, U. NO at work. Cell, v. 78, n. 6, p. 919-926, 1994. SIMERLY, R. B. Anatomical substrates of hypothalamic integration. In “The Rat Nervous System” (Paxinos, G., Ed.), 3rd ed. Elsevier, San Diego, 2004.

SIMERLY, R. B. et al. Distribution of androgen and estrogen receptor mRNA‐containing cells in the rat brain: An in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology, v. 294, n. 1, p. 76-95, 1990.

SMEETS, W. J. A. J.; ALONSO, J. R.; GONZÁLEZ, A. Distribution of

NADPH‐diaphorase and nitric oxide synthase in relation to catecholaminergic neuronal structures in the brain of the lizard Gekko gecko. Journal of Comparative Neurology, v. 377, n. 1, p. 121-141, 1997.

SNYDER, S. H. Nitric oxide: first in a new class of neurotransmitters. Science, v. 257, n. 5069, p. 494-496, 1992. SNYDER, S. H.; BREDT, David S. Biological roles of nitric oxide. Scientific American, v. 266, n. 5, p. 68-71, 1992.

89

SOUSA, R. A.; MENEZES, Alexandre, A. L. Circadian rhythm of motor activity of the Brazilian rock cavy (Kerodon rupestris) under artificial photoperiod. Biological Rhythm Research, v. 37, n. 5, p. 443-450, 2006.

SQUIRE, L. et al. (Ed.). Fundamental Neuroscience. Academic Press, 2008.

STANDRING, S. Gray’s Anatomy. Rio de Janeiro: Elsevier 40th ed. 2010.

STERN, J. E. Nitric oxide and homeostatic control: an intercellular signalling molecule contributing to autonomic and neuroendocrine integration? Progress in Biophysics and Molecular Biology, v. 84, n. 2, p. 197-215, 2004.

STUEHR, D. J.; MARLETTA, M. A. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 82, n.

22, p. 7738-7742, 1985. SWANSON, L. W. The hypothalamus. In: BJÖRKLUND, A.; HÖKFELT, T.; SWANSON, L. W. Handbook of chemical neuroanatomy. v. 5 Integrated systems of the CNS Part 1. Elsevier Science Publishers. p. 1-124, 1987. SWANSON, L. W. Cerebral hemisphere regulation of motivated behavior. Brain Research, v. 886, n. 1, p. 113-164, 2000.

SZABO, C. Alterations in nitric oxide production in various forms of circulatory shock. New Horizons (Baltimore, Md.), v. 3, n. 1, p. 2-32, 1995. TAYEH, M. A.; MARLETTA, M. A. Macrophage oxidation of L-arginine to nitric oxide, nitrite, and nitrate. Tetrahydrobiopterin is required as a cofactor. Journal of Biological Chemistry, v. 264, n. 33, p. 19654-19658, 1989. THOMPSON, R. H.; SWANSON, L. W. Organization of inputs to the dorsomedial nucleus of the hypothalamus: a reexamination with Fluorogold and PHAL in the rat. Brain Research Reviews, v. 27, n. 2, p. 89-118, 1998. TONI, R. et al. The human hypothalamus: a morpho-functional perspective. Journal of Endocrinological Investigation, v. 27, n. 6 Suppl, p. 73-94, 2003.

TORTORA, G. S.; GRABOWSKI, S. R. Princípios de anatomia e fisiologia. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2010 TRINGALI, G. et al. Lamotrigine inhibits basal and Na+-stimulated, but not Ca2+-stimulated, release of corticotropin-releasing hormone from the rat hypothalamus. Psychopharmacology, v. 188, n. 3, p. 386-392, 2006. VARNER, P. D.; BECKMAN, J. S. Nitric oxide toxicity in neuronal injury and degeneration. Nitric Oxide in the Nervous System, p. 191-206, 1995.

VILLANI, L.; GUARNIERI, T. Localization of NADPH-diaphorase in the goldfish brain. Brain Research, v. 679, n. 2, p. 261-266, 1995.

90

VINCENT, S. R. Localization of nitric oxide neurons in the central nervous system. Nitric Oxide in the Nervous System, p. 83-102, 1995.

VINCENT, S. R.; KIMURA, H. Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat brain. Neuroscience, v. 46, n. 4, p. 755-784, 1992.

WALLHÄUSSER‐FRANKE, E.; COLLINS, C. E.; DEVOOGD, T. J. Developmental changes in the distribution of NADPH‐diaphorase‐containing neurons in telencephalic nuclei of the zebra finch song system. Journal of Comparative Neurology, v. 356,

n. 3, p. 345-354, 1995. WHEATLEY, M. D. The hypothalamus and affective behavior in cats: a study of the effects of experimental lesions, with anatomic correlations. Archives of Neurology & Psychiatry, v. 52, n. 4, p. 296-316, 1944. YAMADA, K.; EMSON, P.; HÖKFELT, T. Immunohistochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat hypothalamus and colocalization with neuropeptides. Journal of Chemical Neuroanatomy, v. 10, n. 3, p. 295-316, 1996. YAMAMOTO, T.; BING, R. J. Nitric oxide donors. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 225, n. 3, p. 200-206, 2000.

YASIN, S. et al. Nitric oxide modulates the release of vasopressin from rat hypothalamic explants. Endocrinology, v. 133, n. 3, p. 1466-1469, 1993. ZWISCHENHIRN, D. Syndrome, Lokalisationen, Funktionen. Basel: Benno Schwabe & Co, 1949.

91

ANEXOS

92

Documents

DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO … · Biologia Estrutural e Funcional. ... caatinga that inhabits rocky areas and have crepuscular habits. ... Esquema dos principais