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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
DIVERGÊNCIA NO CRESCIMENTO FOLICULAR EM NOVILHAS DA RAÇA NELORE E SUA INFLUÊNCIA SOBRE A
COMPETÊNCIA OOCITÁRIA PARA O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO IN VITRO
Caliê Castilho
Orientador: Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, para obtenção do Título de Doutor em Medicina Veterinária, área de concentração em Reprodução Animal.
Jaboticabal - São Paulo – Brasil
Fevereiro 2003
iii
DADOS CURRICULARES
CALIÊ CASTILHO - Nascida aos 19 dias de maio de 1972 em Rancharia - SP.
Graduou-se em Medicina Veterinária na Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE -
no período de Janeiro de 1990 a Dezembro de 1994. Foi residente em Medicina
Veterinária, Área de Reprodução Animal, da Faculdade de Medicina veterinária e
Zootecnia - UNESP - Câmpus de Botucatu, no período de Fevereiro de 1995 a Janeiro
de 1996. Em Janeiro de 1996 ingressou no programa de pós-graduação em Ciências
Biológicas, Área de Concentração Farmacologia, no Instituto de Biociências – UNESP -
Câmpus de Botucatu, obtendo o título de Mestre em Fevereiro de 1999. Exerceu
atividade de docente no período de Fevereiro de 1999 a Julho de 2001 na Universidade
do Oeste Paulista – UNOESTE, disciplina de Fisiologia Humana e Animal para os
cursos de Medicina Veterinária, Medicina, Odontologia, Farmácia e Bioquímica,
Nutrição, Fisioterapia, Enfermagem e Psicologia. Ingressou no Programa de Doutorado
em Medicina Veterinária, Área de Concentração Reprodução Animal, pela faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP - Jaboticabal-SP, no ano de 1999.
iv
Dedico este trabalho
Aos meus pais Esta é mais uma vitória nossa!
Ao meu amor Walner Tudo é possível e suportável,
desde que você esteja comigo.
Obrigada por vocês existirem.
v
Agradeço ao meu orientador
Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia
Exemplo de capacidade e humanismo.
Impossível expressar toda minha admiração!
Há homens que lutam um dia e são bons,
Há outros que lutam um ano e são melhores,
Há os que lutam muitos anos e são muito bons,
Mas há os que lutam toda a vida e estes são imprescindíveis.
Bertold Brecht
vi
AGRADECIMENTOS
À minha querida tia Jeanne Mary Sant’Anna Spera pelo grande exemplo de vida
o que determinou minha escolha pela docência e pesquisa.
Ao Prof. Dr. Gilson Toniollo, pela acolhida e orientação formal por um período e
informal durante toda a execução deste trabalho, exemplo de pessoa e profissional.
À Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
de Jaboticabal, e ao departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução
Animal – DRA pelas instalações, condições de trabalho e oportunidade oferecida.
À Agropecuária J. Garcia pelo incentivo a pesquisa em nome do amigo Gilmar
Garcia que gentilmente cedeu os animais para todos os experimentos e sua
propriedade para execução do experimento do capítulo I. Serei eternamente grata!
Ao Prof. Dr. Guilherme de Paula Nogueira pela colaboração na execução deste
trabalho, amizade, conhecimentos transmitidos, além da disponibilidade em participar
da banca.
Ao estagiário e amigo Gustavo Silva companheiro incansável em todos os
momentos difíceis, meu braço direito na obtenção dos dados aqui apresentados.
Aos demais professores do DRA, Prof. Dr. Cesar R. Esper, Prof. Dr. Wilter
Ricardo Russiano Vicente, Prof. Dr. Paulo Henrique Franceschini, Prof. Dr. Francisco
Guilherme Leite e Profa Dra Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, pela amizade,
interesse e conhecimentos transmitidos.
Aos funcionários do DRA, Isabel Aparecida P. Natarelli, Paulo Sérgio da Silva,
Ivo L. de Almeida Jr e Roberta Vantini, pela amizade e contribuição indispensável.
vii
Às amigas pós-graduandas Andréa Cristina Basso, Karina Belloti Avelino, Raquel
Zanetti Puelker e Simone Souza pelo companheirismo, amizade, ajuda na execução do
trabalho e cumplicidade durante esses anos de convivência. Grandes amigas são para
sempre.
Aos pós-graduandos que participaram diretamente na execução dos
experimentos ou confecção da tese em especial Andréa Renesto, Edson Guimarães Lo
Turco, Felipe Perecin, Kleber Luciano Ancioto pela ajuda concedida nos momentos de
maior necessidade.
As amigas de pós-graduação Letícia de Sá Barretto e Viviane Sgobbi Dias pelo
agradável convívio em nosso aprendizado e amizade que ficará.
Aos demais pós-graduandos do DRA, Christina Ferreira, Eric Caiado Castro,
Tânia Cavalcanti, Simone Cristina Méo, Walt Yamazaki, Alexandre Wolf, André Buck,
Jacira, Gerson Azeredo, Lorivaldo Paz Landim Jr, e Sandra Helena Gabaldi, pelo
convívio e amizade.
Aos demais estagiários Bidú Benesi, Denise, Naiara, Ismael e Paulo, pela ajuda
indispensável.
Aos amigos de esbórnia Ricardo Serchelli “porcão”, Ângela (nova amiga e
conterrânea) e Luciana (velha raposa do oeste) por estarem sempre presentes nas
dificuldades e conquistas.
Aos meus sogros Natália e Argenor pela acolhida em sua casa e apoio
incondicional.
viii
APOIO FINANCEIRO
Esse projeto teve bolsa concedida pela Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo – FAPESP, sob processo nº 00/14921-0.
ix
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS......................................................................................................................XI
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................................... XII
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS ........................................................................... 17
INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 17 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................................... 19 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 28
CAPÍTULO 2 - CARACTERIZAÇÃO ULTRA-SONOGRÁFICA E ENDÓCRINA DA DIVERGÊNCIA NO CRESCIMENTO FOLICULAR EM NOVILHAS DA RAÇA NELORE (BOS TAURUS INDICUS) ............................................................................................................. 38
INTRODUÇÃO E OBJETIVO .................................................................................................... 39 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................................... 41
Animais........................................................................................................................................ 41 Sincronização da primeira onda folicular................................................................................ 41 Exame Ultra-sonográfico........................................................................................................... 41 Definições utilizadas.................................................................................................................. 42 Colheita de Sangue..................................................................................................................... 42 Dosagem hormonal .................................................................................................................... 43 Análise Estatística...................................................................................................................... 43
RESULTADOS ............................................................................................................................. 44 DISCUSSÃO................................................................................................................................. 49 CONCLUSÃO ............................................................................................................................... 51 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 52
CAPÍTULO 3 - INFLUÊNCIA DA ONDA FOLICULAR SOBRE A COMPETÊNCIA IN VITRO DE OÓCITOS OBTIDOS DE NOVILHAS DA RAÇA NELORE............................. 55
INTRODUÇÃO E OBJETIVO .................................................................................................... 57 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................................... 59 EXPERIMENTO I............................................................................................................................... 59
Animais........................................................................................................................................ 59 Grupos Experimentais e Sincronização da Onda Folicular.................................................... 59 Aspiração folicular para obtenção dos oócitos........................................................................ 61 Lavagem, Seleção e Transporte................................................................................................ 61 Maturação in vitro dos oócitos.................................................................................................. 62 Fertilização in vitro dos oócitos................................................................................................ 62 Cultivo in vitro de desenvolvimento.......................................................................................... 63 Análise Estatística...................................................................................................................... 63
EXPERIMENTO II.............................................................................................................................. 64 Animais........................................................................................................................................ 64 Grupos Experimentais e Sincronização da Onda Folicular.................................................... 64 Obtenção e transporte dos ovários........................................................................................... 66 Obtenção dos oócitos................................................................................................................. 66
x
Análise Estatística...................................................................................................................... 66 RESULTADOS ............................................................................................................................. 67 EXPERIMENTO I............................................................................................................................... 67 EXPERIMENTO II.............................................................................................................................. 70 DISCUSSÃO................................................................................................................................. 75
Experimento I ............................................................................................................................. 75 Experiento II ............................................................................................................................... 77
CONCLUSÃO ............................................................................................................................... 81 Experimento I ............................................................................................................................. 81 Experimento II ............................................................................................................................ 81
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 82
xi
LISTA DE TABELAS
Página
CAPÍTULO 2 - CARACTERIZAÇÃO ULTRA-SONOGRÁFICA E ENDÓCRINA DA DIVERGÊNCIA NO CRESCIMENTO FOLICULAR EM NOVILHAS DA RAÇA NELORE (Bos taurus indicus)......................................................................................
38
Tabela 1. Características da divergência folicular durante a primeira onda em novilhas Nelore, avaliadas por ultra-sonografia...............................................................
46
Tabela 2. Momento (horas), diâmetro máximo (mm), início da atresia (horas) e diâmetro no início da atresia (mm) do maior folículo subordinado observados pela ultra-sonografia em novilhas Nelore (n=7)......................................................................
48
CAPÍTULO 3 - INFLUÊNCIA DA ONDA FOLICULAR SOBRE A COMPETÊNCIA IN VITRO DE OÓCITOS OBTIDOS DE NOVILHAS DA RAÇA NELORE..........................................................................................................................
55
Experimento I Tabela 1. Efeito da fase da primeira onda folicular e aplicação de FSH na qualidade dos oócitos recuperados de novilhas da raça Nelore......................................................
67
Tabela 2. Efeito do momento da aspiração e aplicação de FSH sobre a porcentagem de embriões clivados (48 h após fecundação) e blastocistos desenvolvidos no 8o dia após a maturação............................................................................................................
68
Experimento II Tabela 1. Efeito da fase de divergência folicular da primeira onda sobre a quantidade de folículos classes 1, 2 e 3.............................................................................................
70
Tabela 2. Efeito da fase de divergência no crescimento folicular sobre a qualidade dos oócitos recuperados de novilhas da raça Nelore......................................................
72
Tabela 3. Efeito da fase de divergência no crescimento folicular sobre a porcentagem de embriões clivados (48 h após fecundação) e blastocistos desenvolvidos no 8o dia após a maturação............................................................................................................
73
xii
LISTA DE FIGURAS
Página
CAPÍTULO 2 -CARACTERIZAÇÃO ULTRA-SONOGRÁFICA E ENDÓCRINA DA DIVERGÊNCIA NO CRESCIMENTO FOLICULAR EM NOVILHAS DA RAÇA NELORE (Bos taurus indicus)..............................................................................................................
38
Figura 1. Exemplos de diferentes padrões de crescimento folicular observados por ultra-sonografia durante a primeira onda folicular, em novilhas da raça Nelore......................................................................................................................................
45
Figura 2. Variações no diâmetro do folículo dominante (FD) e maior subordinado (FS) e na concentração de FSH, durante a primeira onda folicular em novilhas da raça Nelore (n=7)........................................................................................................................................
47
Figura 3. Variações na concentração sérica média de progesterona (ng/mL0 nas amostras colhidas a cada 12 horas durante a primeira onda folicular de novilhas da raça Nelore (n=7).........................................................................................................................................
48
CAPÍTULO 3 - INFLUÊNCIA DA ONDA FOLICULAR SOBRE A COMPETÊNCIA IN VITRO DE OÓCITOS OBTIDOS DE NOVILHAS DA RAÇA NELORE...................................................................................................................................
55
Experimento I Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos realizados.......................................
60
Figura 2. Distribuição da porcentagem de oócitos recuperados de novilhas da raça Nelore de acordo com a qualidade e expanção do cumulus..............................................................
68
Figura 3. Porcentagem de embriões clivados e desenvolvidos até o estádio de blastocisto após a maturação de oócitos oriundos de novilhas da raça Nelore......................................................................................................................................
69
Experimento II Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos realizados.......................................
65
Figura 2. Distribuição do percentual de folículos classificados pelo diâmetro, após dissecação em diferentes momentos da primeira onda folicular.............................................
71
Figura 3. Distribuição do percentual de oócitos recuperados de novilhas da raça Nelore, de acordo com a qualidade em diferentes momentos da primeira onda folicular.....................................................................................................................................
73
Figura 4. Percentual de clivagem e de produção de blastocisto in vitro de oócitos obtido de novilhas da raça Nelore em diferentes momentos da primeira onda folicular.....................................................................................................................................
74
xiii
ABREVIATURAS
BSA Albumina sérica bovina
° C Graus Celsius
CIV Cultivo in vitro
COC Complexo cumulus oophorus
FD Folículo dominante
FIV Fecundação in vitro
FS Folículo subordinado
FSH Hormônio Folículo Estimulante
FSHp Hormônio Folículo Estimulante suíno
hCG Gonadotrofina Corônica Humana
Hg Mercúrio
LH Hormônio Luteinizante
LHr Receptor de hormônio luteinizante
MHZ Mega Hertz
mL Mililitro
mm Milímetro
µL Microlitro
MIV Maturação in vitro
ng Nanograma
OPU Ovum Pick-up
PBS Tampão Fosfato Salina
PGF2α Prostaglandina F2α
PHE Penicilamina, Hipotaurina e Epinefrina
RIA Radioimunoensaio
RT-PCR Transcriptase Reversa - Reação em
Cadeia da Polimerase
SFB Soro Fetal Bovino
xiv
SOF Meio para cultivo celular
TCM Meio de Cultura para Tecidos
TE Transferência de Embriões
TALP-FIV Meio para fecundação
UI Unidade Internacional
15
DIVERGÊNCIA NO CRESCIMENTO FOLICULAR EM NOVILHAS DA RAÇA NELORE
E SUA INFLUÊNCIA SOBRE A COMPETÊNCIA OOCITÁRIA PARA O
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO IN VITRO
RESUMO: O capítulo 1 traz uma revisão geral sobre o desenvolvimento folicular,
sobretudo a fase de seleção do folículo dominante ou divergência no crescimento
folicular, além de aspectos gerais da aspiração folicular para obtenção de oócitos e
fatores que influenciam a competência oocitária para o desenvolvimento embrionário in
vitro, tais como as fases de ciclo estral e do desenvolvimento folicular. No entanto
pesquisas adicionais se mostravam necessárias, principalmente na raça Nelore, para
melhorar as taxas de produção in vitro que permanecem ao redor de 30% de
blastocisto. No capítulo 2 a primeira onda folicular foi acompanhada por ultra-
sonografias a cada 12 horas para visualização da divergência no crescimento folicular
em novilhas da raça Nelore. A divergência no crescimento folicular ocorreu entre 60 e
96 horas após a ovulação quando o folículo dominante mediu 7,2 mm e o maior
subordinado 5,5 mm. A concentração plasmática de FSH, em torno de 10 vezes menor
que em novilhas Holstein, embora não significativa, antecedeu em 24 horas o momento
da divergência folicular. No capítulo 3 a influência do desenvolvimento folicular sobre a
competência oocitária para produção de embriões in vitro foi testada em 2
experimentos. No experimento I novilhas da raça Nelore foram tratadas com diferentes
protocolos de FSH e os oócitos aspirados em diferentes momentos da onda. A taxa de
clivagem não diferiu significativamente (p<0,06) entre os grupos estudados, entretanto a
taxa de blastocisto foi significativamente menor nos grupos G-I (11,29%) e G-II
(16,66%) quando comparado aos grupos controle (46,15%), G-III (46,87%) e GIV
(41,30%). No experimento II foi realizada a sincronização da primeira onda para a
obtenção dos ovários 60, 96 e 108 horas após a ovulação induzida por LH exógeno. As
taxas de clivagem e desenvolvimento até blastocisto dos oócitos recuperados de
novilhas com 60, 96 e 108 horas após a ovulação induzida com LH exógeno, diferiram
significativamente (p<0,0001), sendo decrescente com o aumento no tempo. A taxa de
clivagem teve efeito significativo do diâmetro folicular, sendo melhor nos oócitos
16
oriundos de folículos classe 3 (� 8 mm), enquanto a taxa de blastocisto não teve efeito
do diâmetro, mas houve interação do diâmetro pelo grupo. Conclui-se que o intervalo
entre a aspiração para emergência da onda de 33 horas para aplicação de FSH afetou
negativamente a porcentagem de blastocisto. O momento da onda influencia a
competência oocitária de oócitos obtidos de folículos dissecados, sendo o início da
onda o melhor momento.
Palavras-chave: OPU-FIV, FSH, competência oocitária, novilhas Nelore (Bos indicus),
oócitos, divergência folicular
17
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS
INTRODUÇÃO
O crescimento do oócito dentro do folículo ovariano é determinado por vários
fatores que influenciam sua viabilidade e competência para o desenvolvimento in vitro.
Estes fatores incluem tamanho folicular, dia do ciclo estral, nível de atresia e influência
de outros folículos, tal como o folículo dominante.
A fase de seleção do folículo dominante é visualizada por ultra-sonografia como
um rápido aumento no diâmetro do folículo dominante, enquanto os outros folículos da
mesma onda cessam seu crescimento ou regridem. Estas mudanças que ocorrem no
diâmetro refletem as importantes alterações endócrinas, parácrinas e autócrinas que
acompanham ou antecedem este momento crítico do desenvolvimento folicular e, por
sua vez, podem influenciar a qualidade do oócito e a competência para o
desenvolvimento in vitro.
A aspiração folicular guiada por ultra-sonografia e posterior fecundação in vitro
dos oócitos obtidos de doadoras vivas e de alto valor genético tem sido uma técnica em
franca ascensão no território nacional, sobretudo devido ao importante incremento no
melhoramento genético do rebanho, além de outras vantagens como a obtenção de
oócitos em qualquer fase do ciclo estral sem tratamento gonadotrófico, utilização de
fêmeas prenhes, pré-puberes ou apresentando patologias reprodutivas adquiridas.
Um dos principais problemas atuais da técnica é a variabilidade nos resultados
do desenvolvimento in vitro de embriões bovinos, uma vez que, em média, apenas 30%
dos oócitos maturados se desenvolvem até o estádio de blastocisto. Portanto, para
otimizar a utilização da aspiração folicular em termos de número e qualidade dos
complexos cumulus oócitos (COCs) recuperados e a competência para o
desenvolvimento in vitro é necessário conhecer melhor a fisiologia folicular e seu
controle endócrino.
No presente estudo visou-se avaliar a influência do folículo selecionado sobre os
outros folículos da mesma onda, avaliando-se a competência para o desenvolvimento in
18
vitro de oócitos colhidos em diferentes fases do desenvolvimento folicular. Devido à
ausência destes estudos em animais da raça Nelore, primeiramente foi necessário
investigar através de ultra-sonografias seriadas, o momento (horas após a ovulação) e
o diâmetro dos dois maiores folículos ovarianos durante a divergência no crescimento
folicular.
Todos os fatores que afetam o desenvolvimento folicular influenciando o oócito
não estão completamente elucidados e são, em sua grande maioria, estudados em
animais de origem européia (Bos taurus taurus). No Brasil, mais de 80% do rebanho é
composto por animais de raças zebuínas (Bos taurus indicus), portanto é necessário
investigar estes fatores nestas raças, sobretudo na raça Nelore.
19
REVISÃO DA LITERATURA
O processo contínuo de crescimento e atresia dos folículos que leva ao
desenvolvimento do folículo pré-ovulatório é conhecido como dinâmica folicular,
enquanto que o padrão de crescimento e atresia de um grupo de folículos ovarianos é
denominado onda de crescimento folicular (LUCY et al., 1992). A dinâmica folicular em
novilhas ou vacas zebuínas e européias tem sido caracterizada desde a década de 80
pela ultra-sonografia diária e apresenta-se em um padrão de duas (PIERSON;
GINTHER, 1988; GINTHER; KNOPF; KASTELIC, 1989; FIGUEIREDO et al., 1997) ou
três (SAVIO et al., 1988; GAMBINI et al., 1998; CASTILHO et al., 2000) ondas de
crescimento folicular durante o ciclo estral.
Cada onda folicular é composta por uma fase de recrutamento, no qual um grupo
de folículos primordiais e primários inicia seu crescimento. Dentre estes, um folículo é
selecionado, não sofre atresia e potencialmente pode chegar a ovular (fase de seleção).
O folículo selecionado passa a exercer dominância (fase de dominância) sobre os
demais folículos, suprimindo o crescimento dos mesmos e inibindo o recrutamento de
um novo grupo de folículos (GINTHER et al., 1996; GINTHER; KNOPF; KASTELIC,
1989; SIROIS; FORTUNE, 1990).
A seleção do folículo dominante capaz de ovular dentro de um grupo de folículos
antrais é um processo dinâmico regulado por interações entre gonadotrofinas, fatores
de crescimento e substâncias intra-ovarianas (AUSTIN et al., 2001; YUAN et al., 1998),
resultando em uma fase de transição crítica para o desenvolvimento folicular.
Divergência no crescimento folicular
O sinal mais evidente para a seleção folicular é observado pela ultra-sonografia
ovariana seriada como uma divergência no diâmetro do folículo dominante em relação
ao maior folículo subordinado. O termo divergência foi primeiramente proposto e
definido por Ginther et al. (1996) como o momento no qual se observa o início da maior
20
diferença nas taxas de crescimento entre o futuro folículo dominante e o maior
subordinado.
Em novilhas Holstein, após mensurações seriadas do diâmetro dos dois maiores
folículos ovarianos, foi observado que a divergência na taxa de crescimento ocorre em
média 2,8 dias após a emergência da primeira onda folicular, quando o futuro folículo
dominante apresenta um diâmetro médio de 8,5 mm e o maior folículo subordinado 7,2
mm (GINTHER et al., 1996 e 1997). O futuro folículo dominante de 3 mm foi detectado
em média 6 horas antes do maior subordinado, sendo que os dois demonstraram um
crescimento paralelo até a divergência (GINTHER at al., 1997 e 1999).
Estes resultados sugerem que o mecanismo de divergência foi ativado quando o
futuro folículo dominante alcançou um diâmetro determinante (8,5 mm), o qual foi
concluído antes que o folículo subordinado alcançasse um diâmetro similar (KULICK et
al., 1999).
Hormônio Folículo Estimulante (FSH)
O aumento na concentração sérica de FSH antecede em 1 a 2 dias a
emergência de cada onda e somente diminui após a seleção do folículo dominante
(ADAMS et al.,1992; GIBBONS; WILTBANK; GINTHER, 1999). As concentrações de
FSH são mantidas em níveis basais até o folículo dominante perder sua dominância,
resultando em novo aumento nos níveis de FSH e subseqüente emergência da próxima
onda folicular (BODENSTEINER et al., 1996).
Alguns trabalhos têm demonstrado que qualquer folículo saudável ou em
crescimento é capaz de se tornar dominante. Tratamentos com FSH no início do
desenvolvimento folicular estimulam muitos folículos a obterem um diâmetro de
dominância (ADAMS et al., 1993), sendo a base dos protocolos de superovulação com
FSH para colheita de embriões. Além disso, o aumento da concentração sérica de FSH,
decorrente da destruição do folículo dominante após a divergência, resulta na
dominância do maior folículo subordinado (KO et al., 1991, GINTHER et al., 2000a). Da
mesma forma, um folículo aleatoriamente escolhido dentre um grupo de folículos de 5
21
mm, no início da onda folicular, pode ser direcionado para a dominância após a
aspiração de todos os outros da onda (GIBBONS; WILTBANK; GINTHER,1997). O
potencial para dominância no esperado início da divergência é maior nos folículos
maiores e decresce progressivamente com o diâmetro, estando ausente nos folículos
menores de 7 mm (GINTHER et al., 2001).
Talvez todos os folículos recrutados na mesma onda possuam habilidade
intrínseca para tornar-se dominante, porém ao se aproximar da divergência, esta
capacidade se mantenha apenas naqueles que alcancem primeiro diâmetros maiores.
Supressores de FSH
A produção de estradiol e inibina, sobretudo pelas células da granulosa do
folículo dominante, atua inibindo a liberação de FSH pela hipófise anterior (FINDLAY;
CLARKE, 1987). Parece que estes hormônios são os principais responsáveis pela
supressão das concentrações sistêmicas de FSH para níveis abaixo do limiar
necessário para manter o crescimento dos folículos subordinados, os quais entram em
atresia (DRIANCOURT, 1991).
Inibina
Além do seu efeito na supressão do FSH, o papel preciso da inibina na seleção
do folículo dominante não está completamente elucidado. No entanto, formas de ativina
e inibina sintetizadas pelas células da granulosa estão envolvidas na produção de
andrógenos pelas células da teca (FINDLAY, 1993). Em novilhas Mihm et al., 2000, não
observaram qualquer diferença nas concentrações de folistatina, inibina-A e várias
formas de inibina com diferentes pesos moleculares no fluido folicular dos três maiores
folículos quando o maior deles atingiu 7,6 mm. Em outro estudo, usando o momento do
esperado início da divergência como referência (8,5 mm), também não houve diferença
na quantidade total de inibina e inibina-A entre o folículo dominante e o maior
subordinado (BEG et al., 2001). Por outro lado, Austin et al., 2001 observaram aumento
22
significativo de formas precursoras da inibina (> 48kDa) no maior folículo, porém
apenas no início da onda (5 a 33 horas após pico de FSH), mantendo-se igual nos 4
maiores folículos após a divergência e queda na concentração de FSH.
Estradiol
Em novilhas, observou-se aumento na concentração sérica de estradiol no início
da divergência. O aumento ou decréscimo na concentração de estradiol neste ponto
resulta em decréscimo ou aumento, respectivamente, na concentração de FSH,
indicando uma relação funcional entre estes dois hormônios (KULICK et al., 1999;
GINTHER et al., 2000b).
Além de atuar na regulação da liberação de FSH, algumas ações locais do
estradiol no ovário incluem: estímulo do crescimento folicular (GOLDENBERG;
BRIDSON; ROHLER, 1972); aumento da sensibilidade da granulosa às gonadotrofinas,
aumento na expressão de receptores de LH e atividade da enzima P-450 aromatase
(HILLIER, 1991); proliferação celular (BLEY; SARAGUETA; BARANAO, 1997) e
proteção destas células contra apoptose (MURDOCH, 1998).
Vários autores têm detectado aumento de estrógeno no fluído folicular do folículo
destinado a ser o dominante. Estudos utilizando folículos de diâmetros em torno da
divergência folicular (8 a 10 mm) demonstram maiores concentrações de estradiol no
fluido folicular do folículo dominante quando comparado ao subordinado
(SUNDERLAND et al., 1994; EVANS et al., 1997; KULICK et al., 1999). Recentemente,
Minhn et al, 2000 ao dosar estrógeno dos três maiores folículos no dia 3 do ciclo, ou
seja 1,5 dias após a emergência da onda, observaram aumento na concentração de
estradiol no maior deles (7,6 mm) quando comparado ao primeiro (6,9 mm) e segundo
(6,1 mm) folículos subordinados.
Existem evidencias de que o estradiol atua como um facilitador local para a
mudança na responsividade do maior folículo do FSH para o LH (GONG et al., 1996) no
momento que ocorre queda na concentração sérica de FSH.
23
Receptores de LH na Célula da Granulosa
Acredita-se que a aquisição de receptores para LH (LHr) tem um importante
papel na manutenção do crescimento do folículo selecionado após a queda nos níveis
de FSH.
Alguns estudos sobre aquisição de LHr nas células da granulosa iniciaram-se no
final do século XX, na metade da década de 90, com Xu et al., (1995) quando
demonstraram que RNAm para LHr começam a ser expressos nas células da granulosa
no dia 4 do ciclo estral (dia 0 = dia da emergência) em folículos com 10,8 mm de
diâmetro estando ausente em folículos de 6,8 mm no dia 2 do ciclo. Posteriormente,
Bao et al., (1997) comprovaram o achado anterior e observaram que em folículos
maiores 13,0 e 15,0 mm a expressão de RNAm para LHr (detectáveis pela hibridização
in situ) nas células da granulosa destes folículos foi 2 e 4 vezes maior, respectivamente,
quando comparado a folículos de 10,8 mm de diâmetro. Por outro lado, Evans et al.,
(1997) demonstraram aumento na concentração de estradiol no folículo dominante em
relação ao subordinado nos dias 2 (8,0 mm) e 3 (9,7 mm) do ciclo estral, entretanto sem
níveis detectáveis de RNAm (hibridização in situ) para LHr nas células da granulosa
destes folículos. Recentemente, Beg et al., (2001) observaram uma diferença na
expressão de RNAm de LHr nas células da granulosa, pela RT-PCR (reação em cadeia
da polimerase), entre os dois maiores folículos, em média 8 horas antes de detectar
qualquer aumento no diâmetro de divergência ou na concentração de estradiol no fluido
folicular.
Uma outra evidência do papel do LH na divergência no diâmetro é observado em
vacas após tratamento crônico com um análogo do GnRH, o qual suprime a secreção
pulsátil de LH e o maior folículo não cresce acima de 7 a 9 mm (GONG et al., 1995,
FIKE et al., 1997). Recentemente, um estudo avaliou o momento no qual o folículo
dominante adquire capacidade para ovular após administração de doses crescentes de
LH. Neste estudo eles observaram que folículos com 7,0 a 8,5 mm de diâmetro eram
incapazes de ovular, mesmo perante altas doses de LH (40 mg) e apenas folículos com
no mínimo 10 mm de diâmetro ovulavam com esta dosagem (SARTORI et al., 2001).
24
É provável que a seleção do folículo dominante seja um processo progressivo e
que os estágios iniciais da seleção ocorram antes de uma perceptível diferença no
diâmetro (FORTUNE et al, 2001). O mecanismo completo que leva à seleção ou
divergência no diâmetro não está completamente definido, mas parece estar
claramente associado à aquisição de LHr pelas células da granulosa, ao aumento da
concentração circulante de estradiol-17β e ao decréscimo na concentração de FSH.
Em fêmeas bovinas, inúmeras pesquisas acerca desta fase crítica do
desenvolvimento folicular foram e estão sendo realizadas, no entanto utilizando-se
apenas animais de raças européias em seus modelos experimentais. A grande maioria
do rebanho de corte brasileiro é composta por animais zebuínos ou cruzados e
trabalhos anteriores avaliando o crescimento folicular monitorado por ultra-sonografia
foram efetivos em demonstrar diferenças, sobretudo no que se refere ao diâmetro
folicular (FIGUEIREDO et al., 1997; GAMBINI et al., 1998; CASTILHO et al., 2000).
Aspiração Folicular (OPU)
A indústria de produção bovina tem mostrado, nos últimos anos, grande interesse
no uso de novas biotecnologias da reprodução, tendo em vista o melhoramento genético
do rebanho. O que tem sido utilizado ultimamente é a aspiração folicular trans-vaginal
guiada por ultra-sonografia, também chamada Ovum Pick Up (OPU) e posterior
fecundação in vitro (FIV), uma vez que juntas, estas técnicas podem ser de grande valia
na reprodução animal. O método não cirúrgico é comumente empregado na
recuperação repetida de oócitos imaturos dos folículos ovarianos de animais vivos e
tem um potencial para substituir os procedimentos convencionais de superovulação
(SOV) e a tradicional técnica de transferência de embriões (TE) (KRUIP et al., 1994).
Desde o nascimento do primeiro bezerro oriundo de fecundação in vitro
(BRACKET et al., 1982), os processos de maturação, fecundação e cultivo in vitro foram
aprimorados tornando esta técnica viável em programas de melhoramento. Apesar dos
avanços obtidos com a OPU seguida da FIV nos últimos 10 anos, o uso desta técnica
ainda é baixo na indústria de TE. Foi estimado que somente 6% dos embriões
25
transferidos na Europa em 1996 foram produzidos in vitro, dos quais somente metade
era proveniente de doadoras vivas (HEYMAN, 1997). No Brasil em 1994 nasceu o
primeiro bezerro da raça Nelore após FIV (PEIXER et al., 1994) e, a partir de então,
esta técnica passou a ser estudada e recentemente aplicada comercialmente (DAYAN
et al., 2000).
A OPU permite a repetida recuperação de oócitos de animais vivos sem trauma
aparente do trato reprodutivo, permitindo, desta forma, a produção de embriões
oriundos de vacas com problemas reprodutivos adquiridos (LOONEY et al., 1994;
HASLER et al., 1995; RODRIGUES & GARCIA, 2000), durante o primeiro trimestre de
gestação (BUNGARTZ et al., 1995; MEINTJES et al., 1995) ou em novilhas pré-puberes
(ARMSTRONG et al., 1994; BROGLIATTI; ADAMS, 1996).
Devido a dinâmica folicular em novilhas ou vacas zebuínas e européias ser
caracterizada pela presença de duas ou três ondas de desenvolvimento folicular, é
possível realizar a recuperação de oócitos por via trans-vaginal durante todo o ciclo
estral, mesmo repetidamente (KRUIP et al., 1994; PIETERSE et al., 1991; BOLS;
VANDENHEEDE; SOOM, 1995; BUNGARTZ et al., 1995). Os protocolos têm
geralmente consistido de uma ou duas aspirações semanais usando animais
superovulados ou não (LOONEY et al., 1994; BOLS; VANDENHEEDE; SOOM, 1995;
BUNGARTZ et al., 1995; HASLER et al., 1995; STUBBINGS; WALTON, 1995).
A eficácia do sistema de produção de embriões in vitro é dependente da
qualidade da maturação in vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV).
Quando os oócitos são removidos de seus folículos e cultivados in vitro, a maturação
meiótica ocorre espontaneamente (PINCUS; ENZMANN, 1935). Entretanto, a
capacidade de desenvolvimento após a fecundação é limitada e, apesar dos progressos
feitos nas condições de cultivo durante a maturação e desenvolvimento embrionário,
somente em torno de um terço (LONERGAN et al., 1994) ou 15 a 20% (HENDRIKSEN
et al., 2000) dos oócitos selecionados morfologicamente antes de serem submetidos a
MIV, resultam em embriões viáveis. Além disso, a taxa de recuperação de oócitos
associada à aspiração folicular trans-vaginal, tem-se mostrado variável entre os
laboratórios e as vacas doadoras (PIETERSE et al., 1988; BORDIGNON et al.,1997;
26
WATANABE et al., 2002). O sucesso na taxa de aspiração folicular pode ser
mensurado, em parte, pelo número de oócitos imaturos recuperados de animais
superestimulados ou não, em relação ao número de folículos presentes no momento da
colheita e por fatores que afetam a eficiência da colheita (GARCIA; SALAHEDDINE,
1998).
Têm sido reportadas taxas de recuperação em torno de 2 a 3 oócitos por
doadora, por sessão de aspiração (PIETERSE et al., 1988), 4,7 (BOUSQUET et al.,
1999) e acima de 11 oócitos (BORDIGNON et al.,1997). Existe uma ampla diferença
também na produção de embriões, Kruip et al., (1994) relataram uma variação entre as
doadoras de 9% a 26% e Hasler at al., (1995) observaram variação entre 4% a 33%.
Posteriormente, Watanabe et al., (2002) observaram que esta variação não estava
relacionava com a idade das doadoras e sim com a resposta individual dos animais,
onde observaram uma variação de 0,3% a 13%. Por outro lado, Seneda et al., (2001)
não observaram diferenças entre os animais estudados, provavelmente devido ao
número de animais utilizados, 7 a 9 animais submetidos 1 a 3 vezes à técnica de OPU.
Para otimizar a utilização da OPU, em termos de número e qualidade dos
complexos cumulus oócitos (COC’s) recuperados e, a capacidade para o
desenvolvimento in vitro, é necessário melhor conhecimento da fisiologia ovariana e
seu controle endócrino. O crescimento do oócito dentro do folículo ovariano é
determinado por um grande número de fatores que influenciam sua viabilidade e
competência para o desenvolvimento in vitro.
A influência do tamanho folicular na competência oocitária para o
desenvolvimento in vitro foi confirmada por Lonergan et al., (1994), quando verificaram
aumento significativo na produção de embriões oriundos de oócitos aspirados de
folículos com mais de 6 mm de diâmetro. Pavlok et al., (1992), também observaram
melhor desempenho na produção de blastocistos quando oócitos de folículos médios
(2-4 mm) e grandes (4-8 mm) foram utilizados em comparação a oócitos de folículos
pequenos (1-2 mm). Em revisão, Hendriksen et al., (2000) concluíram que a
competência para o desenvolvimento in vitro é maior para oócitos oriundos de folículos
maiores que 6-8 mm quando comparado com folículos de 3-6 mm. No entanto, Carolan
27
et al. (1996) não observaram influência do tamanho folicular sobre a maturação do
oócito. Resultado similar foi obtido por Seneda et al., (2001) estudando oócitos oriundos
de folículos pequenos (<4 mm) e grandes (>4 mm) aspirados in vivo.
Com relação ao estádio do desenvolvimento folicular, Machatková et al., (1996)
demonstraram que oócitos colhidos nos dias 14 a 16 do ciclo estral apresentavam
melhores índices de competência para o desenvolvimento embrionário quando
comparados aos aspirados nos dias 7, 8 e 9. Em revisão, Hagemann, (1999) conclui
que o desenvolvimento até blastocisto foi significativamente maior em oócitos colhidos
durante a fase de crescimento folicular independente do diâmetro do folículo, porém a
competência oocitária tendeu a aumentar em oócitos oriundos de folículos maiores.
Segundo Hendriksen et al. (2000), o folículo dominante afeta negativamente a
competência oocitária dos folículos subordinados provavelmente por induzir avanço no
estádio de atresia. Menores taxas de recuperação e de blastocisto são observadas
quando a OPU é realizada semanalmente em comparação com OPU a cada 3-4 dias
(GOODHAND et al., 1999). Possivelmente a alta freqüência nas aspirações previna o
estabelecimento do folículo dominante (HENDRIKSEN et al., 2000).
Stock e Smith, (1996) utilizaram COC’s de folículos grandes para maturar oócitos
aspirados de folículos pequenos e observaram que a taxa de blastocisto foi semelhante
às obtidas de oócitos de folículos grandes (6-9 mm). Demonstrando, portanto, que
fatores parácrinos secretados pelo oócito e/ou células do cumulus durante a maturação
final são importantes para o desenvolvimento pós-clivagem.
Em suma, o oócito para ser fertilizado in vivo é doado pelo folículo saudável,
durante uma fase específica do ciclo estral. Enquanto os oócitos colhidos para a
produção in vitro são obtidos de folículos em diferentes etapas do desenvolvimento e
em fases distintas do ciclo estral, portanto, expostos a diferentes concentrações de
estradiol, progesterona, LH e FSH. Estes fatores podem afetar a competência oocitária
para o desenvolvimento de embriões in vitro (WIT et al., 2000).
28
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38
CAPÍTULO 2 - CARACTERIZAÇÃO ULTRA-SONOGRÁFICA E ENDÓCRINA DA
DIVERGÊNCIA NO CRESCIMENTO FOLICULAR EM NOVILHAS DA RAÇA NELORE
(Bos taurus indicus)
RESUMO: O presente experimento foi desenvolvido para observar o momento, em
horas, após a ovulação em que ocorre a divergência na taxa de crescimento entre os
dois maiores folículos ovarianos. Foram utilizadas 7 novilhas da raça Nelore, nas quais
foram realizadas ultra-sonografias ovarianas com intervalo de 12 horas. Em cada
exame ultra-sonográfico foi procedida medida dos folículos ovarianos e colheita de
sangue para posterior dosagem de FSH e progesterona pela técnica de
radioimunoensaio (RIA). Os exames iniciaram-se após o cio para detectar a ovulação e
acompanhar o crescimento dos folículos da primeira onda folicular, prosseguindo até
120 horas (5 dias) em 2 novilhas e 144 horas (6 dias) no restante dos animais (n=5). A
hora da ovulação definida como hora zero foi adotada como referência para a análise
de todos os intervalos. Observou-se uma diferença significativa na taxa de crescimento
entre os dois maiores folículos (divergência), 84,0 horas após a ovulação (p<0,008),
com o folículo dominante (FD) medindo 7,2 mm, o qual foi 1,7 mm maior que o diâmetro
do maior folículo subordinado (FS) 5,5 mm. O início da atresia do FS foi observado 92,6
horas após a ovulação com um diâmetro médio de 5,3 mm. Não houve aumento da
taxa de crescimento do FD durante a divergência. Antes da divergência o FD cresceu
0,66 mm e durante e após a divergência 0,60 e 0,62mm, respectivamente a cada 12
horas, enquanto o maior subordinado cresceu FS 0,50 mm. Em novilhas da raça Nelore
não foi observado efeito significativo (p>0,05) na concentração de FSH em relação aos
momentos avaliados, embora tenha ocorrido queda na concentração de FSH
antecedendo em 24 horas o início da divergência. A concentração de progesterona
aumentou de 0,27 ± 0,21 ng/mL no momento da ovulação para 4,2 ± 0,53 ng/mL 144
horas após, indicando a ciclicidade das novilhas estudadas. Concluí-se que a
divergência folicular em novilhas Nelore (Bos indicus) segue um padrão semelhante ao
observado em novilhas Holstein (Bos taurus) com algumas alterações no momento e
diâmetros dos dois maiores folículos ovarianos.
Palavras-chave: divergência folicular, Nelore (Bos indicus), ultra-sonografia, FSH.
39
INTRODUÇÃO E OBJETIVO
O desenvolvimento folicular em espécies mono-ovular é um processo complexo
no qual um único folículo continua seu crescimento enquanto o restante dos folículos
recrutados cessam seu crescimento e regridem (BEG et al., 2002).
Em fêmeas bovinas de raças européias (KNOPF et al., 1989; GINTHER;
WILTBANK; KASTELIC, 1989) ou zebuínas (RHODES; DE’ATH; ENTWISTLE, 1995;
FIGUEIREDO et al., 1997; GAMBINI et al., 1998) o crescimento folicular exibe um
padrão de ondas, as quais ocorrem periodicamente em diferentes fases reprodutivas
(GINTHER et al., 1997). Cada onda folicular é composta por três fases distintas: fase de
recrutamento, seleção e dominância (SIROIS;FORTUNE, 1990). Sob a influência do
incremento na concentração sérica de FSH, um conjunto de folículos começa a crescer
e uma onda inicia-se (fase de recrutamento) (ADAMS et al.,1992; GIBBONS;
WILTBANK; GINTHER,, 1999). Durante o subseqüente decréscimo na concentração de
FSH, o futuro folículo dominante começa a ultrapassar o diâmetro dos outros folículos
(fase de seleção) e quando a concentração de FSH se torna basal, o folículo dominante
continua seu crescimento enquanto o restante dos folículos detém seu crescimento ou
regridem (fase de dominância) e são chamados de subordinados (BODENSTEINER et
al., 1996; GINTHER et al., 1997; GINTHER et al., 2000).
O início da diferença nas taxas de crescimento entre os dois maiores folículos da
onda foi definido por Ginther et al. (1996) como divergência. Os dois maiores folículos
demonstram uma taxa de crescimento paralelo até atingirem determinado diâmetro, o
qual coincide com a queda na concentração de FSH, então apenas um deles continua
seu crescimento (GINTHER et al., 1997; GINTHER et al., 2000). Em novilhas Holstein a
divergência na taxa de crescimento ocorre em média 2,8 dias após a emergência da
onda folicular, quando o futuro folículo dominante apresenta um diâmetro médio de 8,5
mm e o maior folículo subordinado 7,2 mm (GINTHER et al., 1996; 1997).
40
Em fêmeas bovinas, inúmeras pesquisas acerca desta fase crítica do
desenvolvimento folicular foram e estão sendo realizadas em animais de raças
européias (Bos taurus taurus). A grande maioria do rebanho de corte brasileiro é
composta por animais zebuínos ou cruzados e trabalhos anteriores avaliando o
crescimento folicular monitorado por ultra-sonografia foram efetivos em demonstrar
diferenças, sobretudo ao que se refere ao diâmetro folicular (FIGUEIREDO et al., 1997;
GAMBINI et al., 1998; CASTILHO et al., 2000).
Como contribuição para o conhecimento da fisiologia reprodutiva da raça Nelore
brasileira pretendemos avaliar por meio de ultra-sonografias seriadas o momento e
diâmetro no qual se observa a divergência no crescimento entre os folículos dominante
e o maior subordinado durante a primeira onda folicular e correlacionar com as
alterações na concentração sérica de FSH e progesterona.
41
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Foram utilizadas 13 novilhas da raça Nelore (Bos taurus indicus), com idade
variando de 24 a 36 meses, pesando em média 300 Kg, pertencentes à Agropecuária J.
Garcia, localizada no município de Regente Feijó-SP. Durante o experimento, as
novilhas foram mantidas em pasto de Brachiaria decumbens, com acesso a água e sal
mineral ad libitum.
Sincronização da primeira onda folicular
A sincronização foi realizada com implante de liberação lenta de progestágeno
(Crestar Intervet International B.V-Boxmeer-Holanda) e aplicação de 3 mg de
norgestomet e 5 mg de valerato de estradiol no dia da inserção. O implante foi mantido
por nove dias e no oitavo dia 2 mL de PGF2α (150 mg de D+Clorprostenol, Veteglan
Calier, Barcelona-Espanha) foi aplicado por via intra-muscular.
Exame Ultra-sonográfico
Após a detecção do estro, observado duas vezes ao dia, foi utilizado aparelho de
ultra-som Aloka SSD-500 com transdutor de 7,5 MHZ para acompanhar a ovulação e
posterior desenvolvimento da primeira onda folicular como previamente descrito por
(FIGUEIREDO et al., 1997). Nos exames ultra-sonográficos, a cada 12 horas todos os
folículos ovarianos eram identificados e desenhados em diagramas, sendo os maiores
acompanhados individualmente pela posição e diâmetro durante dias sucessivos para
posterior identificação retrospectiva do folículo dominante e maior subordinado. As ultra-
sonografias foram realizadas desde a detecção da ovulação até 5 (duas novilhas) e 6
(cinco novilhas) dias após por um único operador.
42
Os dados avaliados foram calculados com base na hora da ovulação (hora 0)
devido a impossibilidade de observar com exatidão a emergência da onda folicular nos
animais estudados.
Definições utilizadas
Detecção da ovulação: média em horas entre a última visualização do folículo
pré-ovulatório e o exame no qual o mesmo estava ausente, sendo a ovulação definida
como hora zero;
Início da Divergência: definido como o início da maior diferença nas taxas de
crescimento entre os dois maiores folículos ovarianos;
Diâmetro máximo: maior diâmetro atingido pelo maior folículo subordinado;
Hora do diâmetro máximo: primeiro exame no qual o maior folículo subordinado
exibiu seu diâmetro máximo;
Duração do crescimento: número de horas entre a primeira mensuração do maior
folículo subordinado até o exame em que cessou seu crescimento progressivo;
Taxa de crescimento: a taxa de crescimento foi obtida individualmente por
mensuração realizada a cada 12 horas.
Início da atresia: primeiro exame ultra-sonográfico no qual o maior folículo
subordinado apresentou diminuição no diâmetro.
Colheita de Sangue
Concomitante aos exames ultra-sonográficos foram colhidas amostras de sangue
em tubos de 15 mL heparinizados, mantidos em gelo, por no máximo 1 hora e
centrifugados a 750 g durante 15 minutos para a separação do plasma, o qual foi
congelado a –20°C para posterior dosagem de progesterona e FSH pelo método de
radioimunoensaio (RIA).
43
Dosagem hormonal A dosagem da concentração plasmática de progesterona foi realizada utilizando-
se um kit comercial (Coat-a-Count, Diagnostic Products Corporation, CA, USA). Em um
ensaio realizado a sensibilidade foi 0,01 ng/mL e o coeficiente intra-ensaio 2,2%.
A dosagem da concentração plasmática de FSH foi determinada usando
radioimunoensaio validado para bovinos. Foi utilizado FSH bovino (USDA-bFSH) para
iodação e padrão de referência e NIDDK-anti-oFSH como primeiro anti-corpo,
previamente descrito por Bolt e Rollins, 1983. Em um ensaio realizado a sensibilidade
foi 0,009 ng/mL e o coeficiente intra-ensaio 5,6%.
Análise Estatística
Todas as análises foram executadas através do programa Statistical Analysis
System. (SAS Institute Inc, 1989), SAS\STAT Software, Release 8.2. Cary: SAS
Institute Inc. (LITTLELL et al., 1996).
Foi procedida análise de medidas repetidas para todas as variáveis avaliadas,
sendo cada novilha a unidade experimental. Devido à perda de informações nas
análises laboratoriais, utilizou-se a correção de SATTHERWAITHE dos graus de
liberdade para os testes na análise de variância.
44
RESULTADOS
Foi observado que duas novilhas haviam perdido o implante, sendo as mesmas
retiradas do experimento. Das 11 novilhas restantes 90,9% (n=10) exibiram
comportamento estral em torno de 38 horas após a retirada dos implantes, 68,6% (n=7)
ovularam em um período de 56 horas e foram utilizadas durante o experimento.
O acompanhamento ultra-sonográfico da primeira onda folicular demonstrou
diferentes padrões de crescimento dos dois maiores folículos ovarianos (Figura 1). A
divergência folicular ocorreu em 6 animais 60 a 96 horas após a ovulação num período
compreendido entre 36 horas. Apenas na novilha n° 22 o FD e o FS apresentaram
diâmetros semelhantes até 96 horas e com 108 horas após a ovulação a diferença foi
de apenas 1 mm.
O futuro folículo dominante foi detectado pela ultra-sonografia ligeiramente mais
cedo que o maior folículo subordinado 29,14 e 32,57 horas, respectivamente, após a
ovulação. Em apenas uma (14,3%) novilha estudada (n° 19) o FS foi maior que o FD
nas primeiras 48 horas de desenvolvimento. Por outro lado, em duas novilhas (n° 18 e
20) o FD foi maior que o FS desde do momento de sua detecção até o momento da
divergência.
45
Figura 1. Exemplos de diferentes padrões de crescimento folicular observados por ultra-sonografia
durante a primeira onda folicular, em novilhas da raça Nelore. FD (▲) folículo dominante; FS
(▲) folículo subordinado.
Novilha 20
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 1440
2
4
6
8
10
12
FD
FS
Novilha 18
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 1440
2
4
6
8
10
12 FD
FS
Novilha 22
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 1440
2
4
6
8
10
12
FD
FS
Novilha 14
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 1440
2
4
6
8
10
12
FD
FS
Horas após a ovulação
Diâ
met
ro (
mm
)
46
Na análise dos resultados observou-se diferença significativa na taxa de
crescimento entre os dois maiores folículos (divergência) 84,0 horas após a ovulação
(p<0,008) com o folículo dominante medindo 7,18 mm, o qual foi maior 1,71 mm que o
diâmetro do maior folículo subordinado (5,47 mm) (Figura 2). Na tabela 1 são exibidas
as principais características dos folículos dominantes e subordinados, observadas
antes, durante e após a divergência no diâmetro folicular durante a primeira onda
folicular. A taxa de crescimento do FD não se alterou em virtude da divergência,
permanecendo em torno de 0,60 mm/12 horas e o FS cresceu 0,50 mm/12 horas.
Tabela 1. Características (média ± EPM*) da divergência folicular durante a primeira onda em novilhas Nelore, avaliadas por ultra-sonografia.
CARACTERÍSTICAS
Folículo
Dominante
Maior Folículo Subordinado
Início da Divergência (horas pós-ovulação) 84,00 ± 5,04 Momento da primeira detecção (horas) 29,14 ± 2,2 32,57 ± 4,30 Diâmetro no momento da divergência (mm) 7,18 ± 0,42 5,47 ± 0,42 Taxa de crescimento (mm/12 horas) Primeira detecção até 84 horas 0,66 ± 0,07 0,50 ± 0,08
84 a 96 horas 0,60 ± 0,13 ---- 84 a 120 horas 0,62 ± 0,11 ----
Diâmetro máximo (mm) ---- 5,88 ± 0,24 Hora do diâmetro máximo ---- 75,43 ± 5,04 Duração do crescimento (horas) ---- 42,86 ± 3,56 Taxa de cresc. (mm/12 h) até o último exame 0,65 ± 0,09 0,59 ± 0,11 * EPM = erro padrão da média.
Não foi observado efeito significativo (p>0,05) na concentração de FSH em
relação aos momentos avaliados, embora a concentração de FSH tenha sido mais
elevada antes da divergência e sofrido uma queda 24 horas antes do momento da
divergência (Figura 2).
47
Figura 2. Variações no diâmetro do folículo dominante (FD) e maior subordinado (FS) e na
concentração de FSH, durante a primeira onda folicular em novilhas da raça Nelore (n=7).
Concentração de FSH (▲) ng/mL; FD (▲) = folículo dominante; FS (▲) = folículo
subordinado.* divergência folicular (p<0,008)
Os resultados dos parâmetros: momento e diâmetro máximo, momento e
diâmetro folicular no início da atresia, os quais foram observados no maior folículo
subordinado por imagens ultra-sonográficas, durante a primeira onda folicular em
novilhas da raça Nelore estão apresentados na tabela 2.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
Horas após ovulação
Diâ
met
ro (
mm
)
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
0,27
0,3
FS
H (
ng
/mL
)
FD
FS
FSH
*
48
Tabela 2. Momento (horas), diâmetro máximo (mm), início da atresia (horas) e diâmetro no início da atresia (mm) do maior folículo subordinado observados pela ultra-sonografia em novilhas Nelore (n=7).
Novilha Momento do diâmetro máx.
(horas)
Diâmetro Máximo
(mm)
Início da atresia (horas)
Diâmetro folicular Início da atresia
(mm) 12 84 5,0 96 4,0 14 60 5,5 96 5,0 17 72 5,8 84 5,5 18 84 7,0 108 6,1 19 60 6,0 72 5,5 20 72 6,0 84 5,0 22 96 5,5 108 5,0
média ±±±± EPM 75,43 ±±±± 5,04 5,88 ±±±± 0,24 92,57 ±±±± 5,04 5,15 ±±±± 0,24
A concentração de progesterona aumentou de 0,27 ± 0,21 ng/mL no momento da
ovulação para 4,2 ± 0,53 ng/mL 144 horas após, indicando a ciclicidade das novilhas
estudadas (Figura 3).
Figura 3. Variações na concentração sérica média de progesterona (ng/mL0 nas amostras colhidas a
cada 12 horas durante a primeira onda folicular de novilhas da raça Nelore (n=7). progesterona (▲) ng/mL.
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108120 132 144 1560.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Horas após ovulação
ng/
mL
49
DISCUSSÃO
Os dois maiores folículos ovarianos exibiram desenvolvimento similar até atingir
um determinado diâmetro, no qual o futuro folículo dominante continuou seu
crescimento ao passo que o maior subordinado diminuiu ou cessou seu
desenvolvimento, resultado semelhante ao observado em novilhas Holstein (GINTHER
et al., 1996;1997).
A disparidade com as novilhas Holstein se deu, sobretudo no que se refere ao
diâmetro folicular no momento da divergência. Nas novilhas da raça Nelore os
diâmetros dos maiores folículos da onda na divergência foram 7,2 e 5,5 mm, enquanto
em novilhas Holstein estes diâmetros foram 8,5 e 7,2 mm (BODENSTEINER et al.,
1996; GINTHER et al., 1996;1997).
Embora o acompanhamento ultra-sonográfico neste experimento tenha
começado antes da ovulação para emergência da primeira onda folicular, foi difícil
observar o momento exato da emergência devido ao temperamento das novilhas e
principalmente à população exuberante de folículos menores que 4 mm presente nos
ovários. Portanto, todos os dados foram analisados de acordo com a ovulação, evento
seguramente observado.
Analisando individualmente o momento da divergência, observamos que dentre
as 7 novilhas estudadas 6 delas exibiram início da divergência entre 60 e 96 horas após
a ovulação, enquanto em apenas 1 ocorreu 108 horas após. Na análise de variância foi
observada diferença significativa na taxa de crescimento entre os dois maiores folículos
(divergência) 84,0 horas após a ovulação (p<0,008). A divergência em novilhas Holstein
foi relatada 2,5 dias após o início da onda folicular (GINTHER et al., 1996;1997) sendo
neste estudo a emergência da onda 1,5 dias após a ovulação, portanto a divergência
iniciou-se 4 dias após a ovulação, entretanto nas novilhas Nelore foi ligeiramente mais
cedo 3,5 dias em média após a ovulação. Por outro lado nossos resultados estão em
acordo com os observados por Rivera e Fortune, 2001, os quais detectaram parada no
crescimento do FS iniciando-se em média 60 horas após a emergência da onda
50
detectada 1 dia após a ovulação, portanto, o início da divergência foi 84 horas após a
ovulação.
A detecção do FD foi ligeiramente mais cedo que o FS 29,14 e 32,57 horas,
respectivamente, intervalo este menor que o observado por Ginther et al. 1997, onde o
FD antecedeu em 6 a 10 horas à emergência do maior subordinado.
A taxa de crescimento diária do FD não teve diferença entre os tempos avaliados
e foi ligeiramente maior antes da divergência. Entre a detecção do FD até a divergência
o crescimento foi de 1,32 mm, no dia da divergência foi de 1,20 mm e após a
divergência, 1,24 mm. Entretanto, Ginther at al. 1997 observaram taxa de crescimento
diária do FD de 1,6 mm antes da divergência, 2,7 mm no dia da divergência e 1,5 mm
por dia subseqüente. Porém, outro estudo recente do mesmo grupo demonstrou
resultado semelhante ao nosso, onde a taxa de crescimento do maior folículo (F1) 24
horas antes da divergência (1,4 mm/16 horas) foi igual à observada no momento da
divergência (1,4 mm/16 horas) (GINTHER at al., 2001). Em nosso estudo a divergência
foi observada quando o FS parou seu crescimento e não por aumento na taxa de
crescimento do FD.
A concentração de FSH nas novilhas zebuínas estudadas não apresentou
variação significativa, antes e após a divergência como observada em outros estudos
(GINTHER et al., 1997; GIBBONS; WILTBANK; GINTHER, 1999). Embora, sem
diferença significativa, a concentração de FSH começou a decrescer em torno de 36
horas antes da divergência no diâmetro folicular, estando em seu menor nível 24 horas
antes da divergência. As concentrações de FSH detectados pelo RIA em novilhas Bos
indicus (0,2 a 0,3 ng/mL) se mostraram em torno de 10 vezes menores que a
concentração deste em fêmeas Holstein (1 a 2 ng/mL) (ADAMS et al., 1992; GIBBONS;
WILTBANK; GINTHER, 1999; GINTHER et al., 2000). Por outro lado, em outros estudos
concentrações na ordem de 0,2 a 0,5 ng/mL também foram observadas em novilhas
Holstein (KULICK et al., 1999; GINTHER et al., 2001). Nossos resultados corroboram
com o único trabalho em novilhas da raça Nelore no qual foi realizada dosagem de
FSH, as concentrações encontradas foram semelhantes, ou seja, em torno de 0,2 ng/ml
(BURATINE et al., 2000).
51
CONCLUSÃO
Em novilhas da raça Nelore a divergência no crescimento folicular durante a
primeira onda ocorre na maioria das novilhas entre 60 e 96 horas após a ovulação;
Folículo dominante acima de 7,2 mm e maior subordinado com 5,5 mm
presentes no ovário sugerem que a seleção do folículo dominante já se estabeleceu em
novilhas da raça Nelore;
A concentração plasmática de FSH, em torno de 10 vezes menor que em
novilhas Holstein, embora não significativa, antecede em 24 horas o momento da
divergência folicular.
52
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dynamics during the first follicular wave in heifers. Theriogenology. v. 52, p. 913-921,
1999.
LITTLELL ROMAN C., MILLIKEN GEORGE A., STROUP WALTER W., WOLFINGER
RUSSEL D. SAS system for Mixed models, Cary, NC, USA: SAS Institute Inc., 1996.
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RHODES F.M., DE’ATH G., ENTWISTLE K.W. Animal and temporal effects on ovarian
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RIVERA G.M., FORTUNE J.E. Development of codominant follicles in Cattle is associated
with a follicle-stimulating hormone-dependent insulin-like growth factor binding protein-4
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SIROIS J., FORTUNE J.E. Lengthening of the bovine estrous cycle with low levels of
exogenous progesterone: a model for studying ovarian folicular dominance.
Endocrinology, v.127, p.916-25, 1990.
55
CAPÍTULO 3 - INFLUÊNCIA DA ONDA FOLICULAR SOBRE A COMPETÊNCIA IN
VITRO DE OÓCITOS OBTIDOS DE NOVILHAS DA RAÇA NELORE
RESUMO: Os efeitos do momento da primeira onda folicular e estimulação com FSH
sobre a competência oocitária na produção in vitro de embriões bovinos foram
avaliadas em 2 experimentos: No experimento I, onze novilhas da raça Nelore foram
aspiradas em estádio aleatório do ciclo estral e constituíram o grupo controle e
dezenove novilhas tiveram a primeira onda sincronizada por aspiração folicular seguida
de aplicação de PGF2α e foram dividas em 5 grupos: G-I (n=5) aplicação de 150 UI de
FSHp 36 horas após a aspiração para emergência da onda e 24 horas após o FSH
aspiração para obtenção dos oócitos; G-II (n=5) idem ao G-I exceto que foram 2
aplicação de FSH (75 UI com intervalo de 24 h), G-III (n=5) e G-IV (n=4) o FSH foi
iniciado 48 horas após a aspiração para emergência da onda, no G-III utilizou-se 2
aplicações de FSH (75 UI com intervalo de 24 h) e no G-IV 1 aplicação de 50 UI de FSH
e 48 h após procedeu-se a obtenção do oócitos. A taxa de clivagem não diferiu
significativamente (p<0,06) entre os grupos estudados, entretanto a taxa de blastocisto
foi significativamente menor nos grupos G-I (11,29%) e G-II (16,66%) quando
comparado aos grupos controle (46,15%), G-III (46,87%) e GIV (41,30%). No
experimento II foi realizada a sincronização da primeira onda folicular utilizando-se
Crestar mantido por nove dias e no oitavo dia foi aplicada dose luteolítica de PGF2α.
Vinte e quatro horas após a retirada dos implantes cada novilha recebeu 10 mg de LH
(Lutropin-V) Em seguida as novilhas foram aleatoriamente divididas em 3 grupos
experimentais: G-60, G-96 e G-108 os quais variaram de acordo com o momento da
obtenção dos ovários após a ovulação induzida pelo LH. As taxas de clivagem e
desenvolvimento até blastocisto dos oócitos recuperados de novilhas com 60, 96 e 108
horas após a ovulação induzida com LH exógeno, diferiram significativamente
(p<0,0001), sendo decrescente com o aumento no tempo. A taxa de clivagem teve
efeito significativo do diâmetro folicular, sendo melhor nos oócitos oriundos de folículos
classe 3 ( � 8 mm), enquanto a taxa de blastocisto não teve efeito do diâmetro, mas
houve interação do diâmetro pelo grupo. As melhores taxas de blastocisto foram
56
obtidas com oócitos aspirados de folículos classe 1 ( � 5 mm) no grupo G-60 (64,52%),
oócitos de folículos classe 2 (5-7 mm) (33,33%) no grupo G-96 e no G-108 os oócitos
de folículos classe 3 (50%). Conclui-se que o intervalo entre a aspiração para
emergência da onda de 48 horas para aplicação de FSH afetou a porcentagem de
blastocisto. O momento da onda influencia a competência oocitária de oócitos obtidos
de folículos dissecados, sendo o início da onda o melhor momento.
Palavras-chave: OPU-FIV, FSH, competência oocitária, novilhas Nelore (Bos indicus),
oócitos.
57
INTRODUÇÃO E OBJETIVO
A obtenção de embriões pela técnica de produção in vitro tem crescido nos
últimos anos, sobretudo em bovinos onde está mais evoluída. O incremento na
proporção de embriões produzido in vitro, oriundo de oócitos colhidos de doadoras
vivas pela aspiração folicular guiada por ultra-sonografia (Ovum Pick-up, OPU), tem
sido almejado. Este procedimento permite a repetida produção de embriões de
doadoras vivas de alto valor genético e contribui como uma alternativa para a
superovulação, uma vez que a OPU permite a obtenção de oócitos uma ou duas vezes
por semana sem trauma aparente do trato reprodutivo, independente da fase do ciclo
estral (KRUIP et al., 1994; PIETERSE et al., 1991; BOLS; VANDENHEEDE; SOOM,
1995). Porém, a média atual do desenvolvimento in vitro permanece em torno de 30%
do total de oócitos maturados. De 8 a 10 oócitos colhidos pela OPU há uma produção
média de 2 embriões transferidos (GALLI et al., 2000) em bovinos de raças européias.
Em animais da raça Nelore (Bos indicus) Dayan et al., 2000 observaram grande
variação na taxa de blastocisto entre as doadoras com média de 42% de embriões
produzidos in vitro. A capacidade para fecundação e desenvolvimento de oócitos
maturados in vivo é maior que os oócitos maturados in vitro (BLONDIN et al., 2002).
Existem fortes evidências de que a origem do folículo é importante para determinar a
qualidade do oócito (SIRARD et al., 1999).
O crescimento do oócito dentro do folículo ovariano é determinado por grande
número de fatores que influenciam sua viabilidade e competência para o
desenvolvimento in vitro. Estes fatores incluem: tamanho folicular (LONERGAN et al.,
1994; HENDRIKSEN et al., 2000), dia do ciclo estral (MACHATKOVÁ et al., 1996) nível
de atresia e influência do folículo dominante (HAGEMANN, 1999a). Quando a aspiração
folicular é realizada independe da fase do ciclo estral mais de 85% dos folículos
ovarianos são atrésicos. Em poucas palavras pode-se assumir que a origem do folículo
pode determinar o futuro do oócito (revisado em HENDRIKSEN et al., 2000).
Em suma, o oócito para ser fertilizado in vivo é doado pelo folículo saudável,
durante uma fase específica do ciclo estral. Enquanto, os oócitos colhidos para a
58
produção in vitro são obtidos de folículos em diferentes etapas do desenvolvimento e
em fases distintas do ciclo estral, portanto, expostos a diferentes concentrações de
estradiol, progesterona, LH e FSH. Estes fatores, por sua vez, podem afetar a
competência oocitária para o desenvolvimento de embriões in vitro (WIT et al., 2000).
Com o objetivo de contribuir para o aprimoramento da produção in vitro de
embriões, avaliamos a influência da fase do desenvolvimento folicular sobre
competência oocitária para o desenvolvimento embrionário in vitro. Tendo como ponto
de referência da onda à fase de divergência no crescimento folicular, ou seleção do
folículo dominante, testamos duas hipóteses:
O efeito de diferentes protocolos com baixas doses de FSH para causar co-
dominância e colheita dos oócitos em 60, 84 e 96 horas após a ovulação, sobre a
competência oocitária;
A influência do diâmetro folicular e momento da onda (60, 96 e 108 horas após a
ovulação) sobre a competência oocitária.
59
MATERIAL E MÉTODOS
Experimento I
Animais
Foram utilizadas 24 novilhas da raça Nelore (Bos taurus indicus), com idade
variando de 24 a 36 meses, pesando em média 300 Kg, pertencentes à Agropecuária J.
Garcia. Durante o experimento, as novilhas foram mantidas em uma propriedade no
município de Barrinha SP localizada a 28 km da UNESP - Campus de Jaboticabal, em
pasto nativo do tipo várzea, com acesso a água e sal mineral ad libitum.
Grupos Experimentais e Sincronização da Onda Folicular
Vinte e quatro novilhas da raça Nelore, das quais 11 constituíram o grupo
controle, tiveram os ovários aspirados em estádio aleatório do ciclo estral e em seguida
foi administrado 1,0 mL de PGF2α (Veteglan, 75 mg de D+Clorprostenol, Laboratório
Calier, Barcelona, Espanha) por via intra-vulvar. A completa aspiração dos folículos
ovarianos induziu a emergência de uma nova onda folicular e a administração de
PGF2α o mesmo padrão endócrino em todas as novilhas.
Estas mesmas novilhas foram divididas aleatoriamente em 4 grupos
experimentais G-I (n=5), G-II (n=5), G-III (n=5) e G-IV (n=4).
A aplicação de FSHp (Pluset Laboratório Calier, Barcelona, Espanha) foi
iniciada 36 (G-I e G-II) ou 48 horas (G-III e G-IV) após a aspiração e aplicação de
PGF2α, utilizando-se uma dose de 150 UI (G-I) ou duas de 75 UI com 24 horas de
intervalo (G-II e G-III). Nestes grupos a aspiração folicular para a obtenção dos oócitos
foi realizada 24 horas após a última dose de FSH. No gupo G-IV foi administrado 50 UI
de FSHp 48 horas após a PGF2α e 48 horas após procedeu-se as aspirações. Os
grupos experimentais estão esquematizados a seguir.
60
Grupo I (60 horas, n=5)
Dias 0 Aspiração Folicular
36 horas 24 horas após
Aspiração FSH PGF2αααα (150 UI) (75 mg) Grupo II (84 horas, n=5)
Dias 0 Aspiração Folicular
36 horas 24 horas 24 horas
Aspiração FSH FSH PGF2αααα (75 UI) (75 UI) (75 mg) Grupo III (96 horas A, n=5)
Dias 0 Aspiração Folicular
48 horas 24 horas 24 horas
Aspiração FSH FSH PGF2αααα (75 UI) (75 UI) (75 mg) Grupo IV (96 horas B, n=4)
Dias 0 Aspiração Folicular
48 horas 48 horas
Aspiração FSH PGF2αααα (50 UI) (75 mg)
Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos realizados.
61
Aspiração folicular para obtenção dos oócitos
O procedimento de aspiração folicular foi realizado utilizando-se um equipamento
de ultra-som SCANNER 200 VET, Pie Medical com transdutor convexo de 5,0 e 7,5
MHZ acoplado em uma guia de biópsia para uso trans-vaginal. As aspirações foram
realizadas com agulha hipodérmica descartáveis 40 X 10 (Becton Dickson) e mangueira
de silicone com 2 mm de diâmetro interno e 80 cm de comprimento. A pressão de
vácuo utilizada foi de 65 a 70 mm de Hg, (15 mL de água/minuto) mantida com uma
bomba de aspiração (Rocket Medical, Inglaterra) de acordo com Bols et al. (1995).
Para evitar movimentos peristálticos e desconforto ao animal, em cada
aspiração, foi realizada anestesia epidural com 2,5 mL de cloridrato de lidocaína 2%
seguida ela limpeza da região perineal com água e álcool. Imediatamente após o
procedimento anterior o transdutor foi completamente inserido no fundo vaginal e, com
auxílio de manipulação transretal, os ovários foram posicionados para obtenção de uma
boa visualização ultra-sonográfica. Os folículos a serem aspirados foram posicionados
na linha de punção indicada na tela do ultra-som e após inserir a agulha no folículo a
ser aspirado a bomba de vácuo era acionada. Este procedimento foi realizado em todos
os folículos acima de 2 mm visualizados em cada ovário. O meio de aspiração e
lavagem do sistema foi composto de PBS, kanamicina (0,075 mg/mL) e heparina sódica
(10000 UI/L).
Lavagem, Seleção e Transporte
O material aspirado foi imediatamente transferido para um filtro de colheita de
embriões (EmCom) e lavado com o mesmo meio utilizado para lavagem do sistema.
O sedimento restante foi depositado em placas de Petri para efetuar a contagem e
avaliação da qualidade dos oócitos. Após a classificação dos oócitos recuperados em
grau I, II, III, expandido, desnudo e atrésico os mesmos foram envasados em criotubos
contendo: 0,5 mL de TCM 199 Hepes (Life Techinologies), suplementado com 10% de
soro fetal bovino (SFB), 50µg de amicacina, 50 UI de hormônio luteinizante (Profasi,
62
Serono), 0,5µµµµg de hormônio folículo estimulante (FSH - Folltropin, Vetrepharm), 1µg
de estradiol (Estradiol-17β - Sigma E - 8875), 2,2µg de piruvato. Os criotubos foram
mantidos a 35°C até chegar ao laboratório de Reprodução Animal - UNESP- Campus
de Jaboticabal.
Maturação in vitro dos oócitos
Os oócitos obtidos foram lavados três vezes em meio de lavagem TCM-199
Hepes, suplementado com 10% de SFB e 50µg de amicacina. Em seguida, os oócitos
foram transferidos para gotas contendo 100 µL de meio de maturação em placas de
Petri, mantidos à temperatura de 39°C em atmosfera gasosa de 5% de CO2 em ar,
durante 24 horas. Os oócitos foram cultivados em meio de maturação TCM 199
Bicarbonato suplementado com 10% SFB, 50UI de hCG/mL, 0,5µg de FSH/mL, 1µg de
estradiol/mL, 2,2µg de piruvato/mL, 50µg de amicacina/mL e mantidos nas mesmas
condições descritas acima.
Fertilização in vitro dos oócitos
Os oócitos maturados foram lavados três vezes em meio de fecundação TALP-
FIV e aproximadamente 20 foram transferidos para cada microgota de 100µL de meio
de fecundação Tyrode modificado (TALP) suplementado com 10 µg/mL de heparina e
160µL da solução PHE. O sêmen congelado foi separado em Gradiente de Percoll 90 e
45%, submetido a uma força de centrifugação de 900g durante 30 minutos. O
sedimento foi recuperado e avaliado quanto ao volume, concentração e motilidade
espermática. A concentração final foi ajustada para 25 x 106 espermatozóides vivos por
mL, de modo que, ao adicionar 4µL do sêmen em cada microgota de 100µL de meio
TALP-FIV–Gotas, obteve-se a concentração final de 100x103 espermatozóides vivos
por gota. Posteriormente, foram incubados em temperatura de 39°C por 18 a 20 horas,
com atmosfera de 5% de CO2 em ar, para a fecundação.
63
Cultivo in vitro de desenvolvimento
Passado o tempo de fecundação (24 horas), os zigotos foram lavados por três
vezes em meio SOF e depositados em microgotas contendo 100µL deste meio,
recobertas por óleo mineral. No terceiro e quinto dia após, 50 µL de SOF foi renovado
em cada microgota (feeding). A taxa de clivagem foi avaliada 48 horas após a
fecundação e o desenvolvimento dos blastocistos no 8° dia após serem depositados em
meio de maturação.
Análise Estatística
Todas as análises foram executadas através do programa Statistical Analysis
System. (SAS Institute Inc, 1989), SAS\STAT Software, Release 8.2. Cary: SAS
Institute Inc. (LITTLELL et al., 1996).
Foi realizada análise de Variância para um modelo linear generalizado de uma
via utilizando-se a macro glimmix para as variáveis: qualidade do oócito, taxa de
clivagem e blastocisto. Para a comparação entre os tratamentos utilizou-se teste t-
student.
64
Experimento II
Animais
As mesmas novilhas, mantidas nas mesmas condições do experimento anterior,
foram utilizadas.
Grupos Experimentais e Sincronização da Onda Folicular
Inicialmente foi feita sincronização da primeira onda folicular utilizando-se
implante de liberação lenta de progestágeno (Crestar Intervet International B.V-
Boxmeer-Holanda) e aplicação de 3 mg de norgestomet e 5 mg de valerato de estradiol
no dia da inserção. O implante foi mantido por nove dias e no oitavo dia 1,0 mL de
PGF2α (75 mg de D+Clorprostenol, Veteglan Calier, Barcelona-Espanha) foi aplicado
por via intra-vulvar. Vinte e quatro horas após a retirada dos implantes cada novilha
recebeu 10 mg de LH (Lutropin-V Vetrepharm, Beleville, Ontário, Canadá) por via intra-
muscular. Em seguida as novilhas foram aleatoriamente divididas em 3 grupos
experimentais: G-60, G-96 e G-108 os quais variaram de acordo com o momento do
abate das novilhas para colheita dos ovários após a ovulação induzida pelo LH. Os
grupos experimentais estão esquematizados a seguir.
65
Grupo G-60 (n=8)
Dias 0 8 9 10 11 ABATE
60 horas
Crestar PGF2αααα Retirada LH Ovulação (75 mg) Crestar (10 mg) Grupo G-96 (n=5)
Dias 0 8 9 10 11 ABATE
96 horas
Crestar PGF2αααα Retirada LH Ovulação (75 mg) Crestar (10 mg) Grupo G-108 (n=6)
Dias 0 8 9 10 11 ABATE
108 horas
Crestar PGF2αααα Retirada LH Ovulação (75 mg) Crestar (10 mg)
Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos realizados.
66
Obtenção e transporte dos ovários
Devido ao grande número de folículos a serem dissecados, os animais do grupo
G-60 foram abatidos em um dia, sendo as novilhas dos grupos G-96 e G-108 abatidas
juntas no dia seguinte. O intervalo para a obtenção dos ovários em cada dia no
abatedouro não ultrapassou o período de uma hora. Os ovários foram depositados aos
pares separadamente por animal em sacos plásticos identificados contendo solução
fisiológica aquecida (35°C) e imediatamente enviados para o laboratório.
Obtenção dos oócitos
No laboratório cada par de ovário foi dissecado por animal e momento da onda,
os folículos contados e medidos com paquímetro foram classificados pelo diâmetro em
3 classes: Classe 1 ( � 5 mm), classe 2 (5-7mm), classe 3 ( � 8 mm). Os oócitos
separados de acordo com a classe do folículo e momento foram maturados,
fecundados e cultivados in vitro como descrito no experimento anterior com algumas
variações no tempo de maturação. O grupo G-60 foi maturado por 28 horas e os grupos
G-96 e G-108 por 32 horas devido ao tempo despendido na obtenção dos oócitos.
Análise Estatística
Todas as análises foram executadas através do programa Statistical
Analysis System. (SAS Institute Inc, 1989), SAS\STAT Software, Release 8.2. Cary:
SAS Institute Inc. (LITTLELL et al., 1996).
Foi realizada análise de Variância para um modelo linear generalizado de
uma via utilizando-se a macro glimmix para as variáveis: qualidade do oócito, taxa de
clivagem e blastocisto. Para a comparação entre os momentos utilizou-se teste t-
student. Para este experimento os tratamentos foram arranjados em um fatorial 3 x 3
correspondentes a 3 momentos da onda (G-60, 96 e 108) e 3 classes de diâmetro
(classe 1, 2 e 3).
67
RESULTADOS
Experimento I
Foram realizadas 31 sessões de aspiração folicular em 24 novilhas divididas em
5 grupos experimentais: Controle (n=11), grupo I (n=5), grupo II (n=5), grupo III (n=5),
grupo IV (n=4), totalizando ao final 328 oócitos maturados, ou seja, em média 10,58
oócitos por animal, resultando em 94 embriões desenvolvidos em estádio de mórula e
blastocisto no oitavo dia após a maturação oocitária, totalizando 3,03 embriões por
sessão de aspiração.
Na tabela 1 e figura 2 estão demonstrados o efeito do momento da primeira onda
folicular e do tratamento com FSH na qualidade dos oócitos recuperados.
Tabela 1. Efeito da fase da primeira onda folicular e aplicação de FSH na qualidade dos oócitos recuperados de novilhas da raça Nelore.
Qualidade dos oócitos
Grupos Grau I Grau II Grau III Expandido Desnudo Atrésico Controle (n=11) (39/117)
33,33% a (34/117) 29,06% a
(26/117) 22,22% a
(0/117) 0% b
(6/117) 5,12% a
(12/117) 10,25% a
G-I (n=5) (19/62) 30,64% a
(11/62) 17,74% a
(6/62) 9,67% a
(18/62) 29,03% a
(1/62) 1,61% a
(7/62) 11,29% a
G-II (n=5) (24/66) 36,36% a
(18/66) 27,27% a
(11/66) 16,66% a
(6/66) 9,09% b
(2/66) 3,03% a
(5/66) 7,57% a
G-III (n=5) (8/36) 22,22% a
(10/36) 27,77% a
(12/36) 33,33% b
(0/36) 0% b
(2/36) 5,55% a
(4/36) 11,11% a
G-IV (n=4) (6/46) 10,63% b
(11/46) 25,53% a
(18/46) 40,42% b
(3/46) 6,38% b
(0/46) 0% a
(8/46) 17,02% a
Valores na mesma coluna com diferentes letras sobrescritas (a, b) diferem entre si (p<0,05).
Com relação aos oócitos grau I o único grupo que diferiu significativamente
(p<0,02) entre os tratamentos foi o G-IV (10,63%), sendo os melhores tratamentos os
grupos controle (33,33%), G-I (30,64%) e G-II (36,36%).
Não houve diferença significativa (p<0,57) para a porcentagem de oócitos grau II
e a porcentagem de oócitos grau III foi significativamente (p<0,001) maior nos grupos
G-III (33,33%) e G-IV (40,42%) quando comparado aos grupos controle, G-I e G-II os
quais não diferiram entre si. Houve diferença altamente significativa (p<0,0001) na
porcentagem de oócitos expendidos no grupo G-I (29,03%), e a quantidade de oócitos
68
desnudos não apresentou diferença significativa (p<0,42), nem tão pouco a quantidade
de atrésicos (p<0,62).
Figura 2. Distribuição da porcentagem de oócitos recuperados de novilhas da raça Nelore de acordo com a qualidade e expanção do cumulus. Tratamentos: 1 (controle), 2 (G-I), 3 (G-II), 4 (G-III) e 5 (G-IV). Diferentes letras sobrescritas (a, b) diferem entre si (p<0,05).
Na tabela 2 observa-se o número e a taxa de oócitos clivados e desenvolvidos
no oitavo dia. A taxa de clivagem observada 48 horas após a fecundação não
demonstrou diferença significativa (p<0,06) entre os grupos estudados (Tabela 2 e
Figura 3). No entanto a taxa de blastocisto foi significativamente menor nos grupos G-I
(11,29%) e G-II (16,66%) quando comparado aos grupos controle (46,15%), G-III
(46,87%) e GIV (41,30%) (Tabela 2 e Figura 3).
Tabela 2. Efeito do momento da aspiração e aplicação de FSH sobre a porcentagem de embriões
clivados (48 h após fecundação) e blastocistos desenvolvidos no 8o dia após a maturação.
Controle (n=11)
G-I (n=5)
G-II (n=5)
G-III (n=5)
G-IV (n=4)
Oócitos clivados
(67/91) 73,62% a
(38/62) 61,29% a
(47/66) 71,21% a
(26/32) 81,25% a
(39/46) 84,78% a
Blastocistos
(42/91) 46,15% a
(07/62) 11,29% b
(11/66) 16,66% b
(15/32) 46,87% a
(19/46) 41,30% a
Valores na mesma linha com diferentes letras sobrescritas (a, b) diferem entre si (p<0,05).
1 2 3 4 50
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50Grau I
Grau II
Grau III
Expandido
a a
a
a
b
a
a
aa
a
a
a
a
b
b
a
b b
Tratamentos
% Q
ual
idad
e do
s o
ócito
s
69
Figura 3. Porcentagem de embriões clivados e desenvolvidos até o estádio de blastocisto após a
maturação de oócitos oriundos de novilhas da raça Nelore. Tratamentos: 1 (controle), 2 (G-I), 3 (G-II), 4 (G-III) e 5 (G-IV). Diferentes letras sobrescritas (a, b) diferem entre si (p<0,05)
1 2 3 4 50
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100Maturados
%Clivagem
%Blastocisto
aa
a
a a
a
bb
aa
Tratamentos
% c
livag
em e
bla
sto
cist
o
70
Experimento II
Nos 15 pares de ovários estudados foram visualizados 415 folículos (27,6 por
animal), nos quais 369 (24,6 por animal) foram dissecados. Em 24 novilhas 404 oócitos
foram recuperados por dissecação ou aspiração (16,8 por animal) resultando em 267
clivados (66%) e 126 blastocistos desenvolvidos (31,18%).
Ao avaliarmos o percentual de folículos classe 1 ( � 5 mm) observamos que não
houve diferença significativa (p<0,09) entre os tratamentos. Quanto aos folículos classe
2 (5-7 mm) o grupo G-96 diferiu significativamente (p<0,04) dos grupos G-60 e G-108,
os quais apresentaram maior número de folículos desta classe 19,53% e 26,08%,
respectivamente. No que se refere aos folículos classe 3 ( � 8 mm) o grupo G-60 não
apresentou nenhum, e os grupos G-96 e G-108 apresentaram 9,41% e 4,34%,
respectivamente.
Tabela 1. Efeito da fase de divergência folicular da primeira onda sobre a quantidade de folículos classes 1, 2 e 3.
Classe 1 (� 5 mm) Classe 2 (5-7mm) Classe 3 ( � 8 mm) G-60 (103/128)
80,46% a (25/128) 19,53% a
(0/128) 0% b
G-96 (51/80) 71,76% a
(11/80) 12,94% b
(7/80) 9,41% a
G-108 (112/161) 69,56% a
(42/161) 26,08% a
(7/161) 4,34% b
Valores na mesma coluna com diferentes letras sobrescritas (a, b) diferem entre si (p<0,05).
71
Figura 2. Distribuição do percentual de folículos classificados pelo diâmetro, após dissecação em
diferentes momentos da primeira onda folicular. Diferentes letras sobrescritas (a, b) diferem entre si (p<0,05).
60 96 1080
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100Classe 1
Classe 2
Classe 3
aa a
a
ba
ba
Grupos
% c
lass
e fo
licul
ar
72
Com relação à qualidade dos oócitos obtidos das diferentes classes de folículos
observamos que não houve efeito (p<0,82) do diâmetro folicular ou interação diâmetro
por grupo (p<0,10) para os oócitos grau I. Houve um aumento significativo (p<0,01) na
proporção de oócitos grau II no grupo G-60 (23,03%), seguido pelo G-96 (15,75%) e G-
108 (11,72%), sem, no entanto, efeito do diâmetro folicular (p<0,72) sobre a proporção
de oócitos de grau II. A tabela 2 e figura 3 demonstraram a porcentagem da qualidade
dos oócitos obtidos nos diferentes momentos da onda.
Para os oócitos grau III, não foi observado efeito do momento da onda (p<0,59)
ou interação do diâmetro (P<0,36) nos tempos estudados. Já para a proporção de
oócitos desnudo houve diferença significativa (p<0,002) nos tempos estudados, sendo
G-60 (2,45%) o grupo que apresentou a menor proporção, porém sem efeito do
diâmetro folicular (p<0,43) sobre a quantidade de oócitos desnudos.
Não houve efeito do diâmetro folicular (p<0,26) sobre o número de oócitos
atrésicos, nem efeito do grupo (p<0,06) estudado.
Tabela 2. Efeito da fase de divergência no crescimento folicular sobre a qualidade dos oócitos
recuperados de novilhas da raça Nelore.
Qualidade dos oócitos Grupos Grau I Grau II Grau III Desnudo Atrésico
G-60 (127/204) 62,25% a
(47/204) 23,03% a
(23/204) 11,27% a
(02/204) 2,45% a
(05/204) 0,98% a
G-96 (87/146) 63,69% a
(23/146) 15,75% ab
(12/146) 8,21% a
(11/146) 7,53% ab
(07/146) 4,79% b
G-108 (95/145) 65,51a
(17/145) 11,72% b
(13/145) 8,96% a
(17/145) 11,72% b
(03/145) 2,06% ab
Valores na mesma coluna com diferentes letras sobrescritas (a, b) diferem entre si (p<0,05).
73
Figura 3. Distribuição do percentual de oócitos recuperados de novilhas da raça Nelore, de acordo com a
qualidade em diferentes momentos da primeira onda folicular. Diferentes letras sobrescritas (a,
b) diferem entre si (p<0,05).
As taxas de clivagem e desenvolvimento até blastocisto dos oócitos recuperados
de novilhas com 60, 96 e 108 horas após a ovulação induzida com LH exógeno, diferem
significativamente (p<0,0001), sendo decrescente com o aumento no tempo (Tabela 3).
Tabela 3. Efeito da fase de divergência no crescimento folicular sobre a porcentagem de embriões
clivados (48 h após fecundação) e blastocistos desenvolvidos no 8o dia após a maturação.
G-60 (n=8)
G-96 (n=8)
G-108 (n=7)
Oócitos clivados
(149/184) 80,90 a
(65/105) 61,90% b
(53/115) 46,08% c
Blastocistos
(90/184) 48,91% a
(24/105) 22,85% b
(12/115) 10,43% c
Valores na mesma linha com diferentes letras sobrescritas (a, b, c) diferem entre si (p<0,05).
60 96 1080
10
20
30
40
50
60
70
80Grau I
Grau II
Grau III
Desnudo
Atrésico
a
bab
a a a
a ab
aa a
a
abab
b
Grupos
% q
ual
idad
e do
s o
ócito
s
74
Quando a taxa de clivagem foi avaliada de acordo com o diâmetro folicular,
houve efeito significativo (p<0,0001) na taxa de clivagem a qual foi maior em folículos
classe 3 ( � 8 mm) (100%) e não diferiu nas classes 1 ( � 5 mm) (56,74%) e 2 (5-7 mm)
(66,20%) e não houve interação do diâmetro pelo grupo (p<0,46). A taxa de blastocisto
não teve efeito do diâmetro (p<0,33), mas houve interação do diâmetro pelo grupo
(p<0,02), tendo os oócitos de folículos classe 1 no grupo G-60 a melhor taxa de
desenvolvimento (64,52%), no grupo G-96 os oócitos obtidos de folículos classe 2
(33,33%) e no G-108 os oócitos de folículos classe 3 (50%).
Figura 4. Percentual de clivagem e de produção de blastocisto in vitro de oócitos obtido de novilhas da
raça Nelore em diferentes momentos da primeira onda folicular. Diferentes letras sobrescritas (a, b, c) diferem entre si (p<0,05)
60 96 1080
102030405060708090
100Maturados
% Clivagem
% Blastocisto
a
b
ca
b
c
Grupos
% C
livag
em e
Bla
stoc
isto
75
DISCUSSÃO
Experimento I
No experimento I observamos o efeito do momento de aplicação de FSH após a
sincronização da onda folicular por aspiração dos folículos ovarianos acima de 2 mm,
para indução da nova onda folicular, sobre a porcentagem de desenvolvimento dos
embriões in vitro.
O grupo I exibiu a menor porcentagem de desenvolvimento embrionário (11,29%)
seguido pelo grupo II (16,66%), nestes grupos a aplicação de FSH iniciou-se apenas 33
horas após a aspiração de todos os folículos ovarianos acima de 2 mm. Por outro lado,
os grupos III e IV, onde a aplicação de FSH iniciou-se 48 horas após a aspiração para
emergência da onda folicular, apresentaram as melhores taxas de desenvolvimento
46,87% e 41,30%, respectivamente e não diferiram do grupo controle (46,15%). A
dosagem de FSH também pode ter influenciado nestes resultados, uma vez que o
Grupo I recebeu a maior dose (150 UI) em uma única aplicação, entretanto nos grupos
II e III a dose de FSH foi igual, ou seja, duas aplicações de 75 UI com intervalo de 24
horas, o que não justifica a diferença na taxa de desenvolvimento (16% vs 46%).
Portanto o que parece ter afetado a competência para o desenvolvimento embrionário
foi o momento de aplicação de FSH.
Uma possível explicação para este achado é que em torno de 1 dia após a
aspiração do folículo dominante ocorre aumento da concentração endógena de FSH e
início de uma nova onda folicular, tanto em novilhas Bos taurus (AMARIDIS et al., 1999)
quanto Bos indicus (BURATINE et al., 2000). Talvez, nos grupos onde o intervalo foi de
33 horas o FSH exógeno somou-se ao endógeno e afetou a competência do oócito.
Tanto que morfologicamente no grupo I, que recebeu a maior dose de FSH houve a
maior proporção de oócitos expandidos (29,9%) seguido pelo grupo II (9,09%) e III
(6,38%). Alguns autores têm demonstrado que tratamentos superovulatórios podem
induzir variação na maturação nuclear e citoplasmática do oócito (DIELEMAN et al.,
1993) afetando a competência oocitária (BLONDIN et al., 1996). Em outro trabalho
Blondin et al. 1996 confirmam estes achados sugerindo que, embora a superovulação
76
aumente o diâmetro folicular e diminua o nível de atresia, estas condições não são
suficientes para conferir competência para o desenvolvimento embrionário.
O grupo IV embora tenha apresentado a menor porcentagem de oócitos grau I,
as maiores taxas de oócitos grau III, atrésico e 6,38% de expandidos não houve
comprometimento da taxa de desenvolvimento embrionário. Oócitos bovinos com
células do cumulus exibindo sinais médios de atresia tiveram taxas maiores de
desenvolvimento embrionário que oócitos sem sinais de atresia e a competência para o
desenvolvimento embrionário in vitro somente é afetada por altos níveis de atresia
(BLONDIN; SIRARD, 1995).
O uso de baixas doses de FSH antes do esperado momento da seleção folicular
é usualmente utilizado para estudar a dependência hormonal da seleção morfológica
(ADAMS et al., 1993) e funcional (MIHM et al., 1997). No presente estudo a despeito da
estimulação com gonadotrofina para causar co-dominância e estudar o efeito da fase
do desenvolvimento folicular, os melhores resultados foram obtidos quando a aspiração
foi realizada 96 horas após a ovulação. Ou seja, os folículos estavam em sua maioria
em fase de crescimento ou apenas iniciando a atresia, achados do experimento
realizado no capítulo 2 indicam que em média a atresia do maior subordinado inicia-se
em torno de 92 horas após a ovulação. Alguns trabalhos têm demonstrado que um
certo nível de atresia folicular não afeta negativamente a competência oocitária
(BLONDIN; SIRARD, 1995) e que folículos com mais de 73% de células apoptóticas
podem gerar oócitos com competência para o desenvolvimento embrionário
(HAGEMANN et al., 1999a).
No presente estudo o intervalo entre a aplicação de FSH para a aspiração
folicular de 24 horas (G-III) e 48 horas (G-IV) não afetou a taxa de desenvolvimento
embrionário. Alguns trabalhos têm demonstrado que o intervalo de 48 horas após o
tratamento com FSH para a recuperação dos oócitos é melhor que 24 horas (BLONDIN;
GUILBAULT; SIRARD, 1997) ou 33 horas (SIRARD et al., 1999). Talvez a baixa dose
de FSH utilizada no presente experimento tenha abolido este efeito sobre o intervalo
entre o FSH e a recuperação dos oócitos.
77
Experiento II
No presente estudo observou-se influência do momento da onda sobre a
competência para o desenvolvimento in vitro, sendo o início da onda o melhor tempo
para a obtenção dos oócitos, tanto para a taxa de desenvolvimento quanto a
porcentagem de oócitos graus I, II e III.
Em novilhas Nelore nos 3 momentos estudados, 60, 96 e 108 horas após a
ovulação a população de folículos visualizados na superfície dos ovários foi em média
27,6 folículos por animal, no entanto após a dissecação foram obtidos 24,9 folículos por
animal. Estes dados estão abaixo dos obtidos de vacas Brahman cruzadas (3/4-7/8) em
estádio aleatório do ciclo estral onde em média 40 folículos foram dissecados por
animal (FITZPATRICK; ENTWISTLE, 1997). Entretanto, no presente estudo em
novilhas Nelore o grande número de folículos menores que 4 mm no momento da
dissecação dificultou a separação dos folículos.
Após a dissecação dos folículos e separação por classe de diâmetro observou-se
que a porcentagem de folículos classe 1 ( � 5 mm) não diferiu entre os momentos
estudados e foi mais abundante que as classes 2 e 3, variando de 69,56% no grupo G-
108 a 80,46% no G-60. Estes dados estão de acordo com os resultados obtidos em
vacas Brahman no qual os folículos classe 1 (<4 mm) foram encontrados em maior
número (28/40) quando comparados as classes 2 (4-8 mm) (11,6/40) e 3 (> 8mm)
(0,7/40) (FITZPATRICK; ENTWISTLE, 1997). Esta variação entre os momentos para as
classes de folículos demonstra claramente a seleção folicular, ou seja, no início da onda
G-60 folículos pequenos em maior quantidade (80,46%), os quais diminuem com o
avanço da onda, e conseqüente diminuição na concentração de FSH (ADAMS et al,
1993; GINTHER et al., 1997). Por outro lado os folículos classe 2 (5-7 mm) foram
significativamente mais abundantes no grupo G-108 (26,08%), ao passo que os
folículos classe 3 ( � 8 mm) ausentes no grupo G-60 surgiram no grupo G-96 (9,41%) e
G-108 (4,34%). Estes resultados estão de acordo com experimentos realizados com
ultra-sonografia para visualizar a divergência folicular (GINTHER et al., 1997).
78
A qualidade do oócito é de suprema importância em tecnologias de reprodução
assistida (VASSENA, et al., 2003). O momento da onda não influenciou a quantidade
dos oócitos grau I e III, mas a porcentagem de oócitos grau II diferiu significativamente
entre os tempos (G-60, 96 e 108), sendo no grupo G-60 a maior proporção (23,03%). O
grupo G-60 foi o que apresentou a maior porcentagem (96,5%) de oócitos graus I, II e
III, seguido pelo G-96 (87,7%) e G-108 (86,1%). Não houve interação do diâmetro
folicular com nenhuma das qualidades (grau I, II, III, atrésico e desnudo) dos oócitos
estudados. Por outro lado, Fukui e Sakuma, 1980 observaram que 86 a 94% dos
oócitos aspirados de folículos � 5 mm apresentavam células do cumulus, no entanto
houve uma queda de aproximadamente 30% quando provenientes de folículos maiores,
mas o tamanho do folículo não influenciou a maturação do oócito. Em outro estudo
avaliando oócitos aspirados de folículos de 2 a 6 mm e >6 mm a taxa de oócitos grau II
foi maior em folículos de 2 a 6, no entanto os folículos maiores tiveram maior
porcentagem de oócitos grau I (70,2 vs 46,8%).
A taxa de clivagem teve efeito significativo do diâmetro folicular, sendo melhor
nos oócitos oriundos de folículos classe 3, sem no entanto haver interação do diâmetro
pelo grupo. A taxa de blastocisto não teve efeito do diâmetro, mas houve interação do
diâmetro pelo grupo. As melhores taxas de blastocisto foram obtidas com oócitos
aspirados de folículos classe 1 no grupo G-60 (64,52%), oócitos de folículos classe 2
(33,33%) no grupo G-96 e no G-108 os oócitos de folículos classe 3 (50%). Neste
experimento o tempo de maturação se estendeu por 28 (G-60) e 32 horas (G-96 e 108)
o que pode ter corroborado para a queda na taxa de desenvolvimento. Entretanto, em
outro estudo no qual diferentes tempos de maturação foram testados a porcentagem de
blastocisto foi maior em oócitos maturados por 24 horas (39,3%), mas com 28 ou 32
horas as taxas não diferiram 26,5% e 24,8% respectivamente (WARD et al., 2002).
Alguns trabalhos têm comprovado que oócitos provenientes de folículos maiores
se desenvolvem melhor in vitro (PAVLOK et al., 1992; LOONERGAN et al., 1994;
ARLOTTO et al., 1996; HAGEMANN et al., 1999b). Hagemann et al. 1999b não
encontraram diferença significativa na taxa de blastocisto entre oócitos obtidos de
folículos 3 a 5 ou 6 a 8 mm, mas a taxa de desenvolvimento foi significativamente maior
79
em oócitos de folículos dominantes (> 13 mm) durante a fase de crescimento. Oócitos
aspirados de grandes folículos possuem maior competência para se desenvolver até
blastocisto comparando a oócitos de pequenos folículos, embora com potencial igual
para a maturação (ARLOTTO et al., 1996). No entanto, Carolan et al. (1996) não
observaram influência do tamanho folicular sobre a maturação do oócito. Resultado
similar foi obtido por Seneda et al. (2001) estudando oócitos oriundos de folículos
pequenos (<4 mm) e grandes (>4 mm) aspirados in vivo.
O oócito adquire competência para se desenvolver em um sistema in vitro
quando o folículo adquire um diâmetro de 2 a 3 mm (BLONDIN; SIRARD, 1995). Este
diâmetro coincide com o término da maior parte da síntese de RNA e crescimento do
oócito (FAIR; HYTTEL; GREVE, 1995).
A taxa de clivagem teve efeito altamente significativo (p<0,0001) nos tempos
estudados, sendo melhor no G-60 (80,9%) e decaindo nos grupos G-96 (61,9%) e G-
108 (46%). O mesmo foi observado com relação à porcentagem de blastocisto a qual foi
significativamente melhor no G-60 (48,9%) decaindo nos outros tempos G-96 (22,8%) e
G-108 (10,4%). Em outro estudo, a taxa de clivagem também foi maior em oócitos
colhidos de folículos nos dias 0, 1 e 2 (19/35) e dias 3 e 4 (20/33) quando comparado
aos dias 5 e 6 (2/11) da onda folicular (RODHES et al., 1997). O desenvolvimento
embrionário foi maior em oócitos colhidos de folículos durante a fase de crescimento
folicular comparado a fase de alta dominância (HAGEMANN, 1999a; MACHATKOVÁ et
al., 2000). Em outro estudo oócitos colhidos de folículos subordinados nos dias 2, 3 e
principalmente no dia 7 da onda demonstraram menor competência que aqueles
recuperados no dia 5 (citado em VASSENA, 2003).
Entretanto, Machatková et al., 1996 estudando várias fases do ciclo estral
observaram que oócitos colhidos nos dias 14 a 16 do ciclo demonstraram maior taxa de
blastocisto quando comparado ao oócitos recuperados no dia 2 e dias 7 a 9 ou 19 e 20
do ciclo estral.
Vários estudos têm demonstrado que a fase do ciclo estral e inclusive do
desenvolvimento folicular influenciam a competência oocitária, uma vez que o status do
folículo afeta diretamente o oócito. No entanto não há um consenso entre os trabalhos
80
para definir um momento adequado da onda para se realizar a aspiração in vivo, pois
os resultados variam muito. No presente estudo observou-se efeito do momento da
onda, no experimento I com estímulo gonadotrófico o melhor momento foi 96 horas, ou
seja, dia 4, já no experimento II os melhores resultados foram obtidos com 60 horas (2,5
dias), entretanto as condições experimentais foram diferentes entre os tratamentos e
outros fatores além do tempo podem ter influenciado os resultados.
81
CONCLUSÃO
Experimento I
O intervalo entre a aspiração completa dos folículos ovarianos e a aplicação de
FSH afetou a porcentagem de blastocisto;
O intervalo entre a última aplicação de FSH e a aspiração para obtenção dos
oócitos não afetou a taxa de blastocisto;
A maior dose de FSH utilizada resultou em alta taxa de oócitos expandidos;
Experimento II
Oócitos obtidos de folículos maiores resultou em melhores taxas de clivagem;
O diâmetro não influenciou a taxa de blastocisto, mas houve interação do
diâmetro com o tratamento;
O momento da onda influenciou a taxa de desenvolvimento embrionário, sendo o
início da onda o melhor momento para aspiração.
82
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