Diversidade do Rizóbio – Evolução dos Estudos Taxonômicos · 222 Capítulo 9 (Hymenae courbaril) e o pau-brasil (Caesalpinia echinata).Os levantamentos mais recentes da capacidade

221Manejo Nutricional Integrado na Recuperação de Áreas Degradadas e na...

Capítulo 9

Diversidade do Rizóbio –Evolução dos Estudos Taxonômicos

Rosângela Straliotto

Introdução

A diversidade dos microrganismos freqüentemente reflete asassociações obrigatórias ou facultativas com organismos superiores eé determinada pela diversidade espacial e temporal de seus hospedeiros(WITCOMB; HACKETT, 1989). No caso das associações rizóbio-leguminosas, apesar de haver mais de 19 mil espécies conhecidas deleguminosas (ALLEN; ALLEN, 1981), apenas 30 espécies de rizóbiosforam até o momento descritas. Essa discrepância é surpreendente,uma vez que muitas espécies de rizóbio têm seu círculo de hospedeirasbastante restrito, e é certamente o reflexo do limitado número deespécies de leguminosas estudadas até o presente quanto a estaassociação (HAUKKA et al., 1996). Sabe-se que a capacidade deestabelecer a simbiose com o rizóbio não é comum a todas as espéciesde leguminosas. Entre as espécies não nodulantes estão o jatobá

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(Hymenae courbaril) e o pau-brasil (Caesalpinia echinata). Oslevantamentos mais recentes da capacidade de nodulação dentro dasdiferentes subfamílias de leguminosas indicam que cerca de 23% dasespécies descritas já foram estudadas, e, destas, 88% são nodulíferas(FARIA et al., 1999).

O estudo da biodiversidade do rizóbio tem aplicações agrícolasimportantes, tanto em termos de manejo cultural, visando implementara sobrevivência de populações mais eficientes e mesmo mais específicas,quanto da obtenção de germoplasma mais adaptado aos diferentes tiposde solos. Os dados levantados nos estudos de genética de populaçõesdos diferentes gêneros de rizóbio indicam que há um alto grau dediversidade genética dentro desse grupo (DEMEZAS et al., 1991, 1995;EARDLY et al., 1990, 1995; LEUNG et al.,1994; BOTTOMLEY et al., 1994;SOUZA et al., 1992; STRAIN et al., 1994; PAFFETTI et al., 1996). No entanto,a maioria dos estudos de biodiversidade tem sido conduzida em solosde clima temperado, sob condições completamente diferentes dos nossossolos tropicais. Na avaliação da biodiversidade do rizóbio, as modernastécnicas de DNA recombinante são uma ferramenta preciosa nas mãosdos pesquisadores das regiões tropicais, especialmente as técnicasbaseadas em PCR, relativamente baratas e de fácil manuseio (FELICE;ALSHINAWI, 1996).

Neste capítulo, serão discutidos os aspectos gerais e aimportância dos estudos da biodiversidade e a situação atual dataxonomia do rizóbio.

Extensão da biodiversidade microbiana

Apesar do enorme potencial em termos de avanço biotecnológicoque pode ser promovido pelos estudos, visando ao inventário dabiodiversidade presente na natureza, e do grande progresso alcançadonos últimos anos nessa área do conhecimento, estimativas mostram quemuito pouco da diversidade presente nos diferentes grupos deorganismos é conhecida, especialmente a dos vírus, fungos, bactérias einvertebrados. Em termos globais, foram descritos, até o presente, cercade 1,4 milhão de espécies vivas de todos os tipos de organismos, mas,

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no entanto, as estimativas indicam que sua magnitude fique entre 5e 30 milhões de espécies (WILSON, 1997). Por sua vez, essasestimativas apresentam uma grande amplitude de erro, uma vez queos grupos mais bem estudados são os dos vertebrados e os das plantascom flores. No caso dos insetos, que se constituem no grupo maisrico em espécies entre os organismos superiores, os recentes estudosde sua diversidade em florestas tropicais mostram uma grande riquezaem espécies ainda desconhecidas, elevando muito o limite superiorplausível de espécies.

Os microrganismos constituem cerca de 50% do protoplasmado planeta, representando a maior fonte de diversidade molecular ebioquímica da natureza. No entanto, as estimativas dos números totaisde espécies de bactérias, archaea e vírus são ainda mais problemáticas,em virtude das dificuldades tais como a detecção e recuperação dessesorganismos no ambiente, associações obrigatórias desconhecidas e oproblema do conceito de espécie neste grupo de organismos (BULLet al., 1992). Acredita-se que existam cerca de 1,5 milhão de espéciesde fungos, mas apenas 5% destas encontram-se descritas. Para asbactérias, as estimativas indicam sua magnitude em 300 mil a ummilhão de espécies, porém, o Manual de Bergey, tratado sobre asespécies bacterianas descritas, contém apenas 3.100 espécies. Outrasestimativas indicam que o número de espécies de bactérias conhecidasesteja em torno de 12% do seu total (BULL et al., 1992), estimativamuito otimista quando se observa a diversidade de determinadosgrupos de microrganismos. Um exemplo é o caso dos micoplasmas,procariotos que formam várias associações obrigatórias comorganismos eucariotos, possuem requerimentos nutricionais fastidiosose não são cultiváveis em meio de cultura, e que, no entanto, apresentamuma aparentemente notável diversidade genética. As evidênciaslevantadas pelo estudo de um gênero, Spiroplasma, descoberto em1972, indicam ser este o maior gênero da terra (WITCOMB; HACKETT,1989). Esses organismos são associadas principalmente a insetos,apresentando uma taxa anual de isolamento de novas espécies a partirdessas fontes de aproximadamente 6%, o que indica uma incrívelriqueza de espécies.

O solo é considerado um dos mais diversos hábitats da Terra,embora muito pouco dessa diversidade seja conhecida. Estima-se que

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apenas um grama de solo contenha muitos milhares de bactérias, e apopulação de fungos de solo é pouco estudada, com exceção dospatógenos vegetais e micorrizas. Entre a fauna do solo, estima-se queexistam cerca de 100 mil espécies de protozoários, 500 mil espécies denematóides e 3 mil espécies de minhocas, sem considerar a rica mesoe macrofauna (diversos autores citados por GILLER et al., 1997). Sabendo-se das diversas e importantes associações entre microrganismos eorganismos superiores, pode-se ter uma noção da ampla biodiversidadepresente neste hábitat. A avaliação da biodiversidade presente no soloé limitada por inúmeras dificuldades, começando pelos problemas deamostragem e extração dos organismos do solo. Qualquer distúrbio naamostra de solo modifica as condições dos micro-hábitats que seestabelecem nos microagregados de solo onde se alojam os microrga-nismos, especialmente bactérias. Além disso, no caso de bactérias, foiestimado que apenas 1% da população presente no solo pode serrecuperada pelos métodos convencionais de isolamento, em razão dasdiversas limitações nutricionais e das condições de crescimento quepodem estimular ou limitar o crescimento das diferentes populaçõespresentes (GILLER et al., 1997). Há ainda a influência da rizosfera dasplantas, levando ao desenvolvimento de uma população altamenteespecializada de microrganismos, sob condições de aeração, pH,disponibilidade de nutrientes e fatores estimulatórios completamentediferentes das áreas do solo fora dessa zona de influência.

O desconhecimento da biodiversidade presente nas regiõestropicais, em termos de sua magnitude, dificulta as estimativas a respeitode sua progressiva extinção. As velocidades de extinção das espéciessão baseadas não na observação direta de sua extinção, mas emprincípios de biogeografia. Usando uma relação área-espécie, Simberloff(1984, citado por WILSON, 1997), projetou perdas irrecuperáveis emrazão da destruição das florestas no continente tropical em torno de12% das espécies de aves e 15% das espécies de plantas em um século.A fragmentação das florestas, resultando em ilhas de matas de pequenaextensão circundadas por extensas áreas desmatadas, pode provocaruma redução ainda maior: em áreas de 1 a 25 quilômetros quadradosestimam-se perdas de 10% a 50% das espécies de aves, por exemplo(WILSON, 1997). Muitos outros fatores estão envolvidos nos cálculos

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dessas taxas de extinção, mas o que se sabe é que a diversidadebiológica mais ameaçada é também a menos conhecida e explorada.No entanto, dadas as extensas associações entre microrganismos e asdiferentes espécies de animais e plantas, e com os diferentes tipos demeio ambiente, conclui-se que as estimativas de perda e degradaçãodestes têm profundas conseqüências na diversidade microbiana. Nãohá nenhuma perspectiva de que se possa conhecer a diversidadebiológica presente em nosso planeta antes que uma grande parte dasespécies desapareça. Esse quadro é mais preocupante nas regiõestropicais pelo restrito número de profissionais sistematas competentespara trabalhar com a biodiversidade presente nessas áreas e peladiminuição na disponibilidade de fundos para pesquisa nos últimos anos,em virtude da priorização de outras áreas de pesquisa. O declínio foiacompanhado pela diminuição, em mais de 50%, no número depublicações em ecologia tropical, de 1979 a 1983 (COLE, 1984).O problema da conservação tropical é, assim, exacerbado, pela faltade conhecimento e escassez da pesquisa.

A importância dos estudos de biodiversidade decorre de umprincípio básico, válido para todas as áreas da pesquisa biológica,inclusive a microbiologia do solo. Para se fazer avaliações precisas erecomendações, é necessário se conhecer as espécies presentes, suaamplitude geográfica, propriedades biológicas e possível vulnerabilidadea mudanças ambientais (WILSON, 1997).

Diversidade do rizóbio

Entre as bactérias fixadoras de nitrogênio presentes no solo, cujaspopulações são altamente influenciadas pela rizosfera das plantas, orizóbio é considerado o grupo mais importante na agricultura tropical,pela sua associação com as leguminosas. Nesse contexto, todas asbactérias capazes de formar nódulos em raízes e caules de leguminosasserão coletivamente chamadas de rizóbio. Essa simbiose é responsávelpor uma substancial parte, talvez a maior, do fluxo global de nitrogênioatmosférico fixado nas formas de amônia, nitrato e compostos orgânicos(KAHINDI et al., 1997). Certamente, essa associação é a mais estudada,mas simbioses envolvendo actinomicetos do gênero Frankia,

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cianobactérias, especialmente a associação Azolla-Anabaena, eorganismos heterotóficos fixadores de nitrogênio de vida livre e asso-ciativos podem também fixar quantidades significativas de nitrogêniosob condições específicas.

O rizóbio induz, em suas hospedeiras, a formação de estruturasespecializadas chamadas nódulos, em que o nitrogênio molecular éreduzido a amônia, envolvendo diferentes etapas para a diferenciaçãodessa estrutura por meio de um complexo controle exercido sobre cadaetapa por cada um dos simbiontes. Esses estudos têm demonstrado o altograu de especialização desenvolvido durante o processo evolutivo dessasimbiose, havendo importantes relações de especificidade e grandespossibilidades de manipulação desse conhecimento, visando melhorara eficiência simbiótica. Em razão da sua importância econômica, os estudosda interação rizóbio-leguminosas têm tido um bom suporte econômicoquando comparado às demais áreas de pesquisa agronômica em diversaspartes do mundo, e atualmente é a interação planta-microrganismo maisbem estudada. O estudo da biodiversidade dentro dessas espécies,especialmente em regiões tropicais, além de buscar entender suascomplexas relações ecológicas e evolucionárias, envolve a procura degenótipos tolerantes aos diferentes estresses ambientais presentes nessasáreas e limitantes a essa simbiose, visando ao manejo mais eficientedessa interação.

Os estudos taxonômicos e filogenéticos são necessários paraestruturar a biodiversidade do rizóbio presente no solo, facilitar acomunicação entre os cientistas e buscar um maior entendimento dabiologia e evolução dessa simbiose, com importantes aplicaçõespráticas. De acordo com Haukka (1997), a filogenia pode ser definidasimplesmente como uma história evolucionária de organismos e genes,cujo entendimento é um pré-requisito para estudos ecológicos e degenética de populações. A identificação correta de um microrganismo,de acordo com suas correlações filogenéticas, ajuda a predizerpropriedades genotípicas e fenotípicas esperadas para cada espécie.Em termos de microbiologia, durante muito tempo foi dada poucaimportância aos estudos taxonômicos, em vista das grandes dificuldadesde classificação impostas pelos métodos tradicionais baseados essen-cialmente em características fenotípicas, tanto morfológicas comofisiológicas. As primeiras modificações nesses estudos, extremamente

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empíricos, começaram a ser introduzidas pela utilização dos métodosde taxonomia numérica. Esse tipo de abordagem permite a análiseconjunta dos dados de fisiologia, morfologia, sorologia e outros, utilizandométodos estatísticos de avaliação das diferenças e similaridades entreos microrganismos, de uma forma menos subjetiva e mais rigorosa,fornecendo medidas quantitativas de similaridade entre as bactérias.Há uma grande aplicabilidade desses estudos na avaliação da biodiver-sidade de diferentes grupos de microrganismos (BULL et al., 1992), que,além de permitir um levantamento preliminar da diversidade presenteno ambiente em estudo, fornecem dados sobre a expressão de caracte-rísticas fisiológicas que podem ser correlacionados com determinadosfatores ambientais. O advento dos métodos moleculares, baseados noestudo do genoma bacteriano, constituiu-se, logo a seguir, numa fonteabundante de dados, reproduzíveis facilmente e passíveis de seremgerados sem a interferência de problemas técnicos importantes, comocondições de cultivo, estado fisiológico e outros fatores que, muitasvezes, mascaram os dados fenotípicos.

Um exemplo do efeito dessa revolução na taxonomia das bactériasé o que ocorreu na classificação taxonômica do rizóbio, a qual foiinicialmente baseada em sua especificidade hospedeira, que, emboraambígua, tem um aspecto prático pela sua utilidade para os usuários efabricantes de inoculantes. De acordo com essa classificação inicial,havia apenas um gênero, Rhizobium, dentro do qual foram reconhecidasseis espécies, Rhizobium leguminosarum (nodula Lathyrus, Pisum, Viciae Lens), R. trifolii (Trifolium), R. phaseoli (Phaseolus); R. meliloti(Melilotus, Medicago, Trigonella), R. japonicum (Glycine max) e R. lupini(Lupinus). O círculo de hospedeiras foi o fator mais importante nadefinição dessas espécies, embora tenham sido descritas tambémcaracterísticas morfológicas e fisiológicas (BALDWIN; FRED, 1929;FRED et al., 1932). Essa classificação, baseada essencialmente nainfecção da planta, de acordo com os chamados grupos de inoculaçãocruzada, foi abandonada em virtude do grande número de exceçõesdentro desses grupos (WILSON, 1944; GRAHAM, 1964). Evidênciasposteriores demonstraram que os genes que codificam para nodulação,especificidade hospedeira e fixação biológica de nitrogênio nos rizóbiosde crescimento rápido estão codificados nos plasmídeos simbióticos,transmissíveis entre as diferentes espécies (BREWIN et al., 1980; NUTI et al.,

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1979; PRAKASH et al., 1981), evidência que enfraqueceu o significadotaxonômico dessa classificação.

Com o prosseguimento dos estudos, tornou-se claro que o rizóbioera um grupo de bactérias bastante diverso, tanto em círculo dehospedeiras como em características fisiológicas, e que havia algumtipo de correlação entre essas duas propriedades. O grupo de rizóbiode crescimento lento em meio de cultura YMA (VINCENT, 1970), porexemplo, possui todo um conjunto de características distintas dos decrescimento rápido. O tempo de crescimento nesse meio de cultivo é,até o presente, uma característica importante na caracterizaçãopreliminar dessas bactérias. Inicialmente, considerava-se rizóbio decrescimento rápido as espécies que demoravam de 2 a 3 dias paraapresentar colônias isoladas nesse meio de cultura, e, acima disto, eramconsideradas de crescimento lento. Atualmente, existem as espéciesque apresentam crescimento intermediário (4 a 5 dias) e as decrescimento muito lento, que demoram mais de 10 dias para que sepossa observar o aparecimento de colônias.

Baseado em características morfológicas, fisiológicas, bioquímicase genéticas, meio século depois, Jordan (1982) reclassificou algumasespécies, separando-as de crescimento lento em um novo gênero,Bradyrhizobium. Logo a seguir, Jarvis et al. (1986) usaram cistrons derRNA para estudar o relacionamento intergenérico entre Rhizobium eBradyrhizobium, confirmando a disparidade filogenética entre esses doisgrupos. Os rizóbios de crescimento rápido, na classificação de Jordan(1984) reportada no Manual de Bergey, foram então reclassificados,novamente com base na planta hospedeira que nodula, em três espécies:R. meliloti, R. loti e R. leguminosarum. A espécie R. leguminosarum foientão subdividida em três biovares, viceae, trifolii e phaseoli, conformesua capacidade de nodular respectivamente ervilha, trevo e feijoeiro,permanecendo a deficiência no critério de classificação. Posteriormente,foi identificado um grupo de bactérias de crescimento rápido coletadona China, tanto a partir do solo como de nódulos de soja, cujas caracte-rísticas fisiológicas e bioquímicas indicavam uma posição taxonômicaintermediária entre Rhizobium e Bradyrhizobium (KEYSER et al., 1982;XU; GE, 1984, citados por CHEN et al., 1988). Scholla e Elkan (1984)propuseram uma nova espécie para este grupo, Rhizobium fredii,baseados principalmente em experimentos de hibridização de DNA.

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Nos últimos anos, conforme destacado, a taxonomia das bactériasfixadoras de nitrogênio, em geral, tem sofrido uma revisão substancial,em conseqüência do advento dos métodos moleculares de análisefilogenética (YOUNG, 1994), revelando novas relações entre os gruposde taxonomia confusa, com importantes aplicações práticas. Essesmétodos moleculares têm se revelado como ferramenta poderosa nosestudos de biodiversidade das populações de rizóbio presentes no solo.Métodos que consideram a variação genotípica e o relacionamento entreespécies de Rhizobium e Bradyrhizobium têm sido estabelecidos(MARTÍNEZ-ROMERO, 1994; LAGUERRE et al., 1996). Comparaçõesentre seqüências completas ou parciais de nucleotídeos do 16S rRNAtêm sido utilizadas para avaliar a relação filogenética entre as diferentesespécies de Rhizobium (JARVIS et al., 1992; LAGUERRE et al., 1993;LUCAS et al., 1995; BERKUM et al., 1996).

Atualmente, na definição de novas espécies, recomenda-se ouso da “taxonomia polifásica”, a qual procura integrar diferentes tiposde informações, fenotípicas, genotípicas e filogenéticas, do microrga-nismo de interesse, buscando uma classificação de consenso (GRAHAMet al., 1991; LAJUDIE et al., 1994; VANDAMME et al., 1996). Comoresultado desses estudos, até o presente, oito gêneros de bactériasfixadoras de nitrogênio são reconhecidos como simbiontes dasleguminosas. Os mais estudados são: Rhizobium e Bradyrhizobium(JORDAN, 1984), Sinorhizobium (CHEN et al., 1988; LAJUDIE et al., 1994),Azorhizobium (DREYFUS et al., 1988), Mesorhizobium (JARVIS et al.,1997) e Allorhizobium (LAJUDIE et al., 1998a). Esses gêneros, conformea versão on line (http://www.cme.msu.edu/bergeys/) de abril de 2001do manual de sistemática bacteriana The Bergeys Manual (GARRITYet al., 2001), encontram-se distribuídos em quatro famílias distintasdentro da Ordem Rhizobiales pertencente à Classe “Alphaproteobacteria”.A família Rhizobiaceae engloba três gêneros: Rhizobium ,Allorhizobium e Sinorhizobium. Os demais gêneros estão incluídosem três famílias distintas: Phyllobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae eHyphomicrobiaceae, que, respectivamente, englobam os gênerosMesorhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium.

Dois outros gêneros de bactérias foram recentemente relatadoscomo capazes de formar nódulos com plantas da família das leguminosas:

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Methylobacterium, também do grupo a-Proteobacteria, ordemRhizobiales, famíla Methylobacteriaceae, que nodula Crotalaria (SYet al., 2001) e Burkholderia, do grupo b-Proteobacteria, ordemBurkholderiales, família Burkholderiaceae, capaz de nodular Aspalathus,Machaerium e Macroptilium (MOULIN et al., 2001).

Os gêneros Rhizobium, Allorhizobium, Sinorhizobium eAzorhizobium podem ser, de modo geral, considerados como rizóbiosde crescimento rápido; o gênero Mesorhizobium, como de crescimentointermediário, e os gêneros Bradyrhizobium, como de crescimento lentoa muito lento. Conforme pode ser visto na Tabela 1, a taxonomia deBradyrhizobium encontra-se muito menos avançada em termos denúmero de espécies descritas do que dos rizóbios de crescimento rápido.Esse fato reflete tanto a diferença em termos de manipulação das estirpesde crescimento rápido e lento como também a relutância dos autoresem rapidamente descrever novas espécies (SPRENT, 2001).

Análises baseadas nas seqüências do 16S rDNA revelaram queos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium, apesar de pertencerem àsubdivisão alfa de Proteobacteria, possuem uma relação bem distanciadaentre si, mas bem próxima a outros grupos de bactérias que não incluemsimbiontes de plantas (SAWADA et al., 1993; WILLEMS; COLLINS, 1993;YANAGI; YAMASATO, 1993; YOUNG et al., 1991). O gêneroBradyrhizobium é proximamente relacionado, por exemplo, a bactériasdo gênero Afipia e a Rhodopseudomonas palustris, uma bactéria de vidalivre, fototrófica e fixadora de nitrogênio (KAHINDI et al., 1997), o quenão é tão surpreendente, pois o rizóbio fototrófico BTAi1 (EAGLESHAMet al., 1990), inicialmente classificado como Photorhizobium, foiposteriormente considerado uma espécie, ainda não definida, deBradyrhizobium (YOUNG et al., 1991). O gênero Rhizobium, por suavez, é relacionado a Agrobacterium, um patógeno de plantas,amplamente utilizado como vetor em trabalhos de engenharia genética.O gênero Phyllobacterium, que forma hipertrofias nas folhas de váriasplantas tropicais, pertence à mesma família de Mesorhizobium. Dentroda ordem Rhizobiales encontram-se ainda gêneros como Brucella eBartonella (MARTINEZ-ROMERO, 1994).

Apesar de o gênero Bradyrhizobium possuir, até 1992, apenas umaespécie descrita, japonicum, há muito vinha sendo relatada a grande

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Tabela 1. Espécies atualmente descritas de rizóbio, atualizado a partirde Sprent (2001).

Gênero Espécie Planta hospedeira Referência

Allorhizobium undicola Neptunia natans Lajudie et al. (1998a)

Azorhizobium caulinodans Sesbania rostrata caule

Bradyrhizobium elkanii Glycine maxjaponicum Glycine maxliaoningense Glycine maxsp. (gênero da Várias espécieshospedeira) potenciais. Ex. sp.

(Lupinus)

Mesorhizobium amorphae Amorpha fruticosa Wang et al. (1999a)ciceri Cicer arietinumhuakuii Astralagus sinicusloti Lotus corniculatusmediterraneum Cicer arietinumplurifarium Acacia senegal Lajudie et al. (1998b)tianshanense Glycyrrhiza

pallidiflorachacoense Prosopis alba Velazquez et al. (2001)

Rhizobium etli bv. mimosae Mimosa affinis Wang et al. (1999b) bv. phaseoli Phaseolus vulgarisgallicum bv. gallicum Phaseolus vulgaris bv. phaseoli Phaseolus vulgarisgalegae bv. officinalis Galega officinalis bv. orientalis Galega orientalisgiardinii bv. giardinii Phaseolus vulgaris bv. phaseoli Phaseolus vulgarishainanense Desmodium sinuatumhuautlense Sesbania herbacea Wang et al. (1998)leguminosarum bv. phaseoli Phaseolus vulgaris bv. trifolii Trifolium pratense bv. viciae Pisum sativummongolense Medicago ruthenicatropici (tipos I e II) Phaseolus vulgaris

e outrasyanglingense Amphicarpaea

trisperma; Coronillavaria; Guedenstaetiamultiflora Tan et al. (2001)

Continua...

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diversidade genética presente nesse grupo (HOLLIS et al., 1981; KEYSERet al., 1982; DEVINE et al., 1983; HUBER et al., 1984; KUYKENDALLet al., 1988; Minasawa, 1989, 1990; FUHRMANN, 1990; MINASAWA;FUKAI, 1991). Essas diferenças levaram Kuykendall et al. (1992) adescreverem uma nova espécie, B. elkanii, baseados numa série deanálises de homologia de DNA, RFLP (Restriction Fragment LenghPolymorphism – polimorfismo no comprimento dos fragmentos derestrição), perfil de ácidos graxos e de resistência a antibióticos,composição de exopolissacarídeos e do citocromo, além do seqüencia-mento do 16S rRNA. Além dessa, B. liaoningense (XU et al., 1995) foitambém proposta como simbionte da soja baseada em taxonomianumérica, hibridização de DNA e seqüenciamento do 16S rDNA.Segundo Lindström et al. (1995), a diferença de apenas sete bases naseqüência do 16S rDNA entre a espécie proposta e B. japonicum, e agrande variabilidade existente nesses genes em Bradyrhizobium nãojustificariam a descrição de uma nova espécie para esse grupo deestirpes. Estirpes de Bradyrhizobium apresentando ampla diversidadegenotípica e fenotípica têm sido isoladas de diferentes gêneros deplantas (GAULT et al., 1986; THIES et al., 1991; YOUNG et al., 1991;DUPUY; DREYFUS, 1992; MOREIRA et al., 1993; OYAIZU et al., 1993;DUPUY et al., 1994; THOMAS et al., 1994; CHEN et al., 1995;VANROSSUM et al., 1995; BARRERA et al., 1997), sendo provávelque haja centros adicionais de variação taxonômica que precisamser identificados e descritos (BARRERA et al., 1997).

Tabela 1. Continuação.

Gênero Espécie Planta hospedeira Referência

Sinorhizobium arboris Acacia senegal Nick et al. (1999)fredii Glycine maxkostiense Acacia senegal Nick et al. (1999)medicae Medicago truncatulameliloti Medicago sativasaheli Sesbania pachycarpaterangae bv. acaciae Acacia laeta bv. sesbaniae Sesbania rostrata

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O gênero Azorhizobium possui uma única espécie descrita até omomento, A. caulinodans, que nodula as raízes e caule de Sesbaniarostrata (DREYFUS et al., 1988). Azorhizobium é bastante distinto dos outrosgêneros de rizóbio em uma série de propriedades, de modo que, apesarde conter apenas uma espécie, foi descrito como um novo gênero.

O gênero Sinorhizobium foi originalmente proposto para os rizóbiosde crescimento rápido isolados das raízes de soja (R. fredii) (CHEN et al.,1988), mas essa proposta foi rejeitada, uma vez que as seqüências do16S rRNA indicaram que R. fredii era de fato muito proximamenterelacionado a R. meliloti (JARVIS et al., 1992; YOUNG, 1992). Pesquisasposteriores identificaram duas novas espécies muito proximamenterelacionadas a esse grupo, e levaram à conclusão de que R. melilotidevia ser incluído no gênero Sinorhizobium (S. meliloti), o qual abrangeutambém R. fredii (S. fredii) e duas novas espécies isoladas no Senegal,Sinorhizobium terangae e Sinorhizobium saheli (LAJUDIE et al., 1994).A posição taxonômica da espécie S. xinjiangense proposta por Chen et al.(1988) foi questionada com base nos estudos de rRNA, e até o presentepermanece a ser determinada (LAJUDIE et al., 1994). Três novas espéciesforam posteriormente descritas dentro desse gênero: S. medicae (ROMEet al., 1996), a qual abrange o chamado tipo B de S. meliloti, segundodivisão proposta por Eardly et al. (1990); Sinorhizobium arboris eSinorhizobium kostiense (NICK et al., 1999), simbiontes de Acaciasenegal.

Mesorhizobium (JARVIS et al., 1997) foi o gênero proposto para asbactérias do ramo de R. loti (JARVIS et al., 1982) em virtude do consenso,há muito tempo existente entre os pesquisadores, de que essa espécieera bastante distinta dos outros rizóbios de crescimento rápido, tais comoR. leguminosarum e R. meliloti. Outras espécies muito proximamenterelacionadas passaram a ser incluídas no gênero Mesorhizobium (JARVISet al., 1997; LINDSTRÖM et al., 1998), tais como R. huakii (CHEN et al.,1991), R. ciceri (NOUR et al., 1994), R. mediterraneum (NOUR et al., 1995)e R. tianshanense (CHEN et al., 1995). M. tianshanense teve sua posiçãotaxonômica controversa, pela similaridade dos dados de seqüenciamentocom M. ciceri, e pela falta de dados de homologia de DNA com outrasespécies de rizóbio recentemente descritas. Para confirmar sua posiçãofilogenética, Tan et al. (1997) publicaram dados de hibridização de DNA,

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seqüenciamento completo do 16S rDNA e de perfil de proteínasincluindo outros isolados dessa espécie e estirpes de referênciapertencentes a 11 espécies distintas de rizóbio. Lindström et al. (1998)sugerem a inclusão das espécies M. amorphae, descrita finalmente porWang et al. (1999a), para englobar a maioria dos isolados de Amorpha,uma leguminosa tropical, e de M. plurifarium, que inclui isolados dediferentes espécies de leguminosas da África e do Brasil. A espécieM. plurifarium foi proposta por Lajudie et al. (1998b) para incluir um grupode estirpes previamente classificadas como pertencentes ao cluster U,distinto inicialmente das demais espécies por eletroforese de proteínase hibridização de DNA. De acordo com esses autores, o gêneroMesorhizobium é bastante heterogêneo e os critérios de taxonomiapolifásica são ainda mais importantes quando se trata de estudos decaracterização de espécies dentro desse grupo. Recentemente, aespécie M. chacoense foi descrita para um grupo de estirpes isoladasde solos da Província do Chaco, na Argentina, simbiontes de Prosopisalba (VELAZQUEZ et al., 2001).

O gênero Allorhizobium é monoespecífico, contendo a espécieA. undicola (LAJUDIE et al., 1998a). Análises comparativas de seqüênciasdo 16S rDNA mostram que essa espécie é muito próxima de Agrobacteriumvitis.

O gênero Rhizobium sofreu diversas modificações, algumas járelatadas, como a definição dos gêneros Sinorhizobium e Mesorhizobiumque acabaram englobando espécies que anteriormente pertenciam aesse gênero. Atualmente, pertencem a esse gênero nove novas espécies,além de R. leguminosarum descrita por Jordan em 1984: R. tropici(MARTÍNEZ-ROMERO et al., 1991); R. etli (SEGOVIA et al., 1993);R. galegae (LINDSTRÖM, 1989); R. hainanense (CHEN et al., 1997);R. gallicum (AMARGER et al., 1997); R. giardinii (AMARGER et al., 1997);R. huautlense (WANG et al., 1998); R. mongolense (BERKUM et al., 1998)e R. yanglingense (TAN et al., 2001).

A ampla diversidade genética presente dentro do gêneroRhizobium é evidenciada pelos estudos de isolados de apenas uma plantahospedeira, o feijoeiro (P. vulgaris). É reconhecida há bastante tempo agrande diversidade genética dos simbiontes de P. vulgaris, inicialmente

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classificados como R. leguminosarum bv. phaseoli, cuja diversidaderelatada sempre foi maior do que a presente nos demais biovares(GRAHAM; PARKER, 1964; JARVIS et al., 1980; JORDAN, 1984). Todosesses trabalhos foram baseados em isolados de rizóbio que nodulam ofeijoeiro e que ocorrem naturalmente em solos de países de climatemperado, resultando em comparações desses isolados com o rizóbioisolado de plantas originárias dessas regiões, como ervilha e trevo.A partir de 1985, foi publicada uma série de estudos sobre os simbiontesde feijoeiro isolados nas Américas, incluindo os provenientes das regiõesde Cerrado brasileiras, liderada pelo grupo de pesquisa da UniversidadeAutônoma do México – Unam –, com a colaboração da EmbrapaAgrobiologia. Esses estudos, que levaram em consideração diversascaracterísticas fisiológicas e genéticas correlacionadas com aespecificidade hospedeira, resultaram na definição de novas espéciese hipóteses sobre sua distribuição geográfica. Inicialmente, essasbactérias foram divididas em dois grupos, denominados tipo I e II(MARTÍNEZ et al., 1985, 1987, 1988; QUINTO et al., 1985; BROM et al.,1988). O prosseguimento desses estudos levou à descrição de R. tropici,incluindo as estirpes do tipo II, subdivididas em dois grupos, IIA e IIB(MARTÍNEZ-ROMERO et al., 1991) e de R. etli, que incluem as estirpesdo tipo I isoladas no México (SEGOVIA et al., 1993). A partir daí ficouestabelecido pelo Subcomitê Internacional de Taxonomia de Agrobacteriume Rhizobium que somente seriam consideradas como R. leguminosarumbv. phaseoli as estirpes que estivessem estreitamente relacionadas comos genes cromossomais dos outros biovares dessa espécie (HUNGRIAet al., 1997).

Quanto à distribuição geográfica do Rhizobium que nodula ofeijoeiro, a hipótese lançada por Segovia et al. (1993) é de que a espécieR. etli seria encontrada normalmente na Mesoamérica, tendo sidointroduzida na Europa juntamente com sua hospedeira no século 16.Pela transferência horizontal do plasmídeo simbiótico dessas estirpespara R. leguminosarum, teria surgido R. leguminosarum bv. phaseoli.Por sua vez, R. tropici seria originário da América do Sul (MARTÍNEZ-ROMERO et al., 1991), em virtude da freqüência de isolamento dessaespécie principalmente no Brasil (HUNGRIA et al., 1995; MERCANTEet al., 1998). No entanto, dados de levantamento de espécies de rizóbionodulando o feijoeiro na Europa mostram uma ampla diversidade,

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incluindo a presença significativa de isolados de R. etli, R. tropici e maisrecentemente duas novas espécies, compreendendo principalmenteestirpes isoladas de nódulos de feijoeiro na França (LAGUERRE et al.,1993; AMARGER et al., 1994), R. gallicum e R. giardinii (AMARGERet al., 1997). Em resumo, até o presente, três espécies distintas de rizóbiosão de reconhecida importância ecológica como simbiontes do feijoeiro,R. leguminosarum bv. phaseoli, R. etli e R. tropici, sem considerar ainda asduas novas espécies descritas recentemente na França. Além dessegênero, um número bastante representativo de isolados de feijoeiro que,por meio de análise genética de restrição do 16SrDNA foram incluídosdentro do gênero Sinorhizobium, ocorre naturalmente em solos tropicaisdo Brasil (STRALIOTTO et al., 1997) e da África (MURPHY et al., 1997).Essa diversidade observada nos estudos dos simbiontes do feijoeiro nãoé, provavelmente, uma exceção e dá uma idéia do universo em termosde espécies de rizóbio ainda desconhecidas, presentes em nossos solos,associadas às mais de 19 mil espécies de leguminosas descritas, poréma maioria das espécies da família, cerca de 11.200, ainda não foipesquisada quanto à capacidade de nodular (MOREIRA; SIQUEIRA,2002). Apenas para citar mais alguns exemplos, estudando as leguminosasarbóreas, Zhang et al. (1991) relacionaram oito agrupamentos distintosentre os isolados obtidos de Leucaena, Acacia e Prosopis. Haukka et al.(1996) confirmaram essa ampla diversidade genotípica entre os isoladosde Acacia e Prosopis, pois, para essas duas espécies arbóreas, encontrou12 genótipos distintos de rizóbio com base no seqüenciamento parcialdo 16S rRNA.

Ainda dentro do gênero Rhizobium, a espécie R. hainanense foiproposta por Chen et al. (1997), no entanto essa nomenclatura haviasido desencorajada por Lindström et al. (1995) após sua publicaçãoinicial no International Symposium on Rhizobium Diversity andTaxonomy, realizado na China, em outubro de 1994. Essa espécie foiidentificada por taxonomia numérica e contém 13 estirpes isoladas de13 diferentes espécies de plantas que crescem na ilha tropical chinesade Hainan. A similaridade com R. tropici verificada pelo seqüenciamentoparcial do 16S rRNA e a falta de estudos de homologia de DNA comoutros isolados de R. tropici geraram as críticas quanto à validade danova espécie. O trabalho final propondo a nova espécie (CHEN et al.,1997) já inclui comparações da homologia de DNA com seis estirpes

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diferentes de R. tropici, além de estirpes pertencentes a outras espéciesdescritas de rizóbio, assim como dados de seqüenciamento do 16S rDNAe círculo de hospedeiras. Após essas caracterizações adicionais,Lindström et al. (1998) passaram a incluir a espécie dentro do gêneroRhizobium.

Continuam sendo classificadas como pertencentes ao gêneroRhizobium as bactérias do grupo de R. galegae (LINDSTRÖM, 1989), erecentemente, com base em uma análise polifásica, foram sugeridosdois biovares, R. galegae bv. orientalis e R. galegae bv. officinalis, paraas estirpes que formam simbiose efetiva, respectivamente com Galegaorientalis e Galega officinalis (RADEVA et al., 2001). No entanto, umquarto gênero de rizóbio de crescimento rápido deverá abranger essaespécie, uma vez que o seqüenciamento do 16S rRNA mostra umdistanciamento dos outros gêneros de Rhizobium, e uma maior proximidadecom Agrobacterium (YOUNG; HAUKKA, 1996). Esse grupo é chamadode “rizóbio semelhante à agrobactéria”, constituindo um grupofenotípica e genotipicamente distinto das bactérias capazes de formarnódulos (LINDSTRÖM et al., 1998). No entanto, há ainda uma grandedistância evolucionária também em relação às agrobactérias (Fig. 1),de modo que essas diferenças precisam ser melhor estabelecidas emaiores estudos são necessários, juntamente com a identificação deoutras espécies proximamente relacionadas, para permitir o seudeslocamento para um novo gênero (LINDSTRÖM et al., 1995).

O cladrograma apresentado na Fig. 1 mostra o relacionamentogenético entre a maioria das espécies de rizóbio citadas com as demaisespécies de bactérias. Uma nova revisão no gênero Rhizobium foirecentemente proposta por Young et al. (2001), em função da similari-dade com Agrobacterium, incluindo todas as espécies deste último eAllorhizobium, dentro do gênero Rhizobium, em virtude da naturezamonofilética desse grupo. Baseados em uma extensiva revisão, osautores concluem que esses três gêneros não representam entidadesfenotípicas distintas e, desse modo, não possuem circunscrição genéricarepresentativa. Além disso, sua diferenciação filogenética não éconvincente, dependendo do algorítimo usado e das seqüênciasincluídas na análise. Dessa maneira, Allorhizobium seria renomeadocomo Rhizobium undicola, e as espécies do gênero Agrobacterium

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Fig. 1. Cladograma, baseado no 16S rDNA, ilustrando as relações entrealgumas espécies de rizóbio e outras bactérias.Fonte: Sprent (2001), após Nick (1998).

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ficariam classificadas nessa nova revisão como: Rhizobium radiobacter(substituindo A. tumefaciens e A. radiobacter), Rhizobium rhizogenes(A. rhizogenes), Rhizobium rubi (A. rubi) e Rhizobium vitis (A. vitis).

Percebe-se que os estudos taxonômicos desse grupo estão empermanente evolução e, à medida que os estudos de prospecção denovas simbioses, especialmente nas condições tropicais, forem descre-vendo a ocorrência de novos grupos taxonômicos, espera-se que osestudos filogenéticos possam avançar para a compreensão da origeme evolução do processo de fixação biológica de nitrogênio. Além disso,os estudos da diversidade desse importante grupo de microrganismos,visando determinar sua distribuição geográfica e adaptabilidade aestresses ambientais, permitirá o manejo mais eficiente do processode fixação biológica de nitrogênio nos diversos agroecossistemastropicais.

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Diversidade do Rizóbio – Evolução dos Estudos Taxonômicos · 222 Capítulo 9 (Hymenae courbaril) e o pau-brasil (Caesalpinia echinata).Os levantamentos mais recentes da capacidade