DNA humano métodos de extração : Patentes e Aplicação

Uma vez que os experimentos pioneiros realizados por Friedrich Miescher, em l861, avanços extraordinários foram alcançados no campo da manipulação de DNA. Hoje ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir de qualquer tipo de material biológico tais como tecidos, células e vírus. Além disso, o aumento do conhecimento do genoma humano está pavimentando o caminho para um emprego eficaz da farmacogenômica e testes preditivos genéticos baseados na medicina. Neste contexto, a recuperação de ADN a partir de diferentes fontes de amostras biológicas (por exemplo, tecidos de autópsia arquivados fixados em formalina, manchas de sangue seco, o soro ou plasma congelado, armazenado a longo prazo de sangue total) também é uma área emergente em estudos de epidemiologia genética. Assim, tendo em conta o papel crucial desempenhado pelo DNA na investigação biomédica e em suas aplicações relacionadas, aqui vamos rever as principais patentes emitidas relevantes e avanços recentemente publicados na área de extração de DNA a partir de amostras e purificação humanos.

INTRODUÇÃO

Em 1869, o médico suíço Friedrich Miescher realizada a primeira extração de DNA durante um experimento para identificar os compostos químicos fundamentais celulares usando linfócitos coletados a partir do pus dos curativos cirúrgicos. Os estudos iniciais de Miescher demonstrado que as proteínas são o principal composto citoplasmática. Durante a purificação de proteínas que também encontrada uma substância desconhecida precipitar quando o ácido foi adicionado e, em seguida, novamente suspensas por meio de um tratamento alcalino. Este material foi chamado de ácido nucleico a partir de Richard Altman, um estudante Miescher [1]: era o ADN. Após esta primeira precipitação do DNA em bruto, ele desenvolveu alguns protocolos para se obter maiores quantidades deste material biológico. Depois de Miescher, foram desenvolvidas várias tecnologias de purificação com base na química do DNA e propriedades físicas. Primeira rotina de extracção de ADN foi realizada em 1958, por Stahl e Meselson, usando a centrifugação de gradiente de densidade, para demonstrar a replicação semi-conservadora de ADN.

Hoje em dia, o ADN pode ser isolado a partir de qualquer fonte de material biológico tais como tecidos, células e vírus. É também de salientar que o conhecimento cada vez mais do genoma humano está pavimentando o caminho para um emprego eficaz de farmacogenômica [3] e testes preditivos genéticos baseados na medicina [4]. Portanto, a coleta e a extração de DNA a partir de amostras humanas estão se tornando dois passos cruciais realizados em investigação biomédica. A este respeito, a recuperação e amplificação de ácidos nucleicos a partir de diferentes fontes de amostras biológicas (por exemplo, arquivado tecidos de autópsia fixados em formalina, manchas de sangue seco, o soro ou plasma congelado, a longo prazo armazenados (LTS) sangue completo) são campos que crescem em retrospectiva estudos genéticos.

Os métodos para o isolamento de ácidos nucleicos normalmente começar por adição da amostra a uma / solução de lise contendo detergente caotrópico. Alternativamente, as células podem ser primeiro concentradas por centrifugação e, em seguida, suspenso numa solução. As soluções de suspensão típicos são hipotónico, tal como a utilizada num passo de pré-tratamento de lise de glóbulos vermelhos [7] ou soluções isotónicas, solução salina tamponada como fosfato de [8], de glicose [9] ou o sorbitol [10]. O reagente de lise geralmente contém um detergente para dissolver membranas celulares e para solubilizar as proteínas e lípidos,

tais como os detergentes aniónicos dodecilsulfato de sódio (SDS) e N-lauroil sarcosina [11,12]. Para este efeito, não iónico [13] e os detergentes catiónicos [14] também foram relatadas. Após a lise, o ADN é purificado por separação a partir do lisado de complexo, que não contém ADN material celular tal como ARN, lípidos e proteínas. Purificação de ADN pode ser realizada utilizando protocolos baseados em coluna ou à base de solução.

Dada a crescente importância do DNA na investigação biomédica e em seus aplicativos relacionados, aqui vamos rever as principais patentes emitidas relevantes e avanços recentemente publicados na área da extracção de ADN e purificação de amostras humanas.

COLHEITA

O primeiro passo crucial na realização de extração de DNA é a recolha e armazenagem de amostra. Sangue total periférico (o principal recurso utilizado para obter o ADN para estudos genéticos humanos) pode ser obtido usando tubos Vacutainer com EDTA ou tratados citrato de sódio para impedir a coagulação. A heparina não é recomendado porque pode inibir Polymerase Chain Reaction (PCR) ou Restriction Fragment Length Polymorphism análise (RFLP). Antes da extracção de DNA, as amostras de sangue total pode ser conservada por um máximo de três dias a + 4 ° C, ou vários anos congelado (-20 ° C ou -80 ° C). O tempo de armazenamento e modo de conservação afecta a razão de recuperação do DNA. Alguns protocolos exigem a eliminação dos glóbulos vermelhos do sangue (RBC) com um tampão de lise específica para a separação de glóbulos vermelhos por gradiente de Ficoll para melhorar a recolha linfócitos.

Vários grupos de pesquisa têm conseguido usando pequenas quantidades de amostras de sangue total não purificados como substrato para a PCR. A amplificação de DNA a partir de 1 ul a 2 ul de sangue total em reacções de 100 ul foi obtida depois de um pré-tratamento térmico cíclico em + 95 ° C e + 55 ° C [15]. Além disso, observou-se que Tth (T. thermophilus), mas não a polimerase Taq de ADN amplificado a partir de pequenas amostras de sangue não tratado e não purificada.

As amostras biológicas também podem ser coletados e armazenados usando papel FTA. FTA® é uma sigla para Technology Fast para Análise de ácidos nucleicos. É uma especialidade de papel tratada quimicamente para a preservação de ácidos nucleicos. Quando as amostras biológicas tais como sangue e saliva são manchadas sobre papel de TLC, o tratamento químico do papel [um radical monovalente de base fraca (tal como "Tris", tris-hidroximetil metano, quer como a base livre ou como o carbonato); um agente quelante (tal como EDTA, ácido etileno diamino tetra acético); um detergente aniónico (tal como SDS, de sódio Sulfato de dodecilo) e, opcionalmente, ácido úrico ou de um seu sal de urato] lisa as células e desnatura as proteínas. Danos de ácido nucleico a partir de nucleases, a oxidação, a luz ultravioleta (UV) dano, micróbios, e o fungo é reduzida quando as amostras são secas e devidamente armazenada no cartão FTA. Digno de nota, as amostras biológicas armazenados desta forma são extremamente estáveis à temperatura ambiente.

A maioria das amostras de tecido clínicos são rotineiramente fixados em formalina e embebidos em cera de parafina. Este processo é essencial para fins de arquivamento e para manter a excelente morfologia celular. Para que dizem respeito à fixação dos tecidos pela formalina, é bem sabido que a desnaturação e a modificação de macromoléculas por formalina (por exemplo, alquilação e reticulação de grupos funcionais), leva a sua insolubilização, minimizando assim a perda de ácidos nucleicos a partir de tecidos fixados . Por outro lado, a solubilização de ADN a partir de amostras fixadas com formalina está negativamente

correlacionada com a duração do tratamento com formalina e o rendimento de extracção de ADN podem ser seriamente reduzida quando comparado com uma amostra não fixadas [17-21]. Os tecidos também irá permanecer indefinidamente estável para a extracção de ácidos nucleicos e proteínas, se mantida a -70 / -80 °.

Dada a crescente ênfase sobre o papel da genética no desenvolvimento do câncer e prevenção, os métodos simples e de baixo custo são necessários para obtenção de DNA para estudos de larga escala. Embora a fonte de DNA para estudos epidemiológicos vem frequentemente a partir de colecções de sangue, este método é muito invasivo para alguns participantes e é caro para estudos de grande escala. Por isso, vários meios de coletar células bucais tornaram-se uma abordagem atraente para a obtenção de DNA. Os métodos de recolha de células bucais são de dois tipos: procedimentos seca que usam um cytobrush ou outros implementos para raspagem da mucosa oral e procedimentos molhadas que envolvem líquidos balançando na boca e cuspir em um recipiente de recolha. Há vantagens e desvantagens associadas a cada tipo de coleção. As vantagens do método abanada parecem ser maiores rendimentos de DNA média, fragmentos de ADN mais longos, e, possivelmente, percentagens mais elevadas de ADN humano [22, 23]. No entanto, o método abanada exige manuseio e centrifugação passos líquido durante o processamento da amostra, que resultam em aumento de custos para materiais, e-mails e processamento de amostras antes de congelar. As vantagens da coleta de rosto seco, tal como o método cytobrush, são montagem simples para correspondência de grande escala, porte leve, e um processamento eficiente e de baixo custo para arquivamento de longo prazo.

Métodos de extração de DNA

3.1. SDS-proteinase K proteinase K é uma serina protease de largo espectro utilizada para digerir proteínas e remover a contaminação a partir de preparações de ácido nucleico. A adição de proteinase K para preparações de ácidos nucleicos rapidamente activa nucleases. Este proteinase é estável ao longo de um ampla faixa de pH (4-12) e é ativa em presença de agente de desnaturação de proteínas, tais como SDS, uréia e EDTA [24,25]. A principal função da SDS é dissolver a bicamada lipídica e também actua como agente de desnaturação da proteína. Proteína se desenrola aumenta a acessibilidade para a protease resultando num aumento da actividade de proteinase K [25]. Após a incubação com proteinase K, uma fenol-clorofórmio ou uma extracção de salificação é realizada.

Fenol-clorofórmio extração método fenol-clorofórmio é o método de isolamento de DNA mais utilizada e é reconhecida como o padrão-ouro para avaliar outros métodos de extração. O fenol é um ácido carbólico corrosivos, inflamáveis e tóxicos que podem desnaturar proteínas rapidamente. Uma mistura de (25: 25: 1) de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (PCIA) é utilizado para atingir um inativação completa RNAse [26]. Emulsão bifásico é formado quando estes solventes orgânicos são misturados com a amostra. Após centrifugação desta emulsão é dividido em duas fases: a fase superior contém ADN diluído em água, enquanto a fase inferior é composta por solventes orgânicos e compostos hidrófobos celulares. Pós-tratamento com clorofórmio é necessário remover todos os vestígios de fenol a partir da fase aquosa. Em seguida, o DNA pode ser precipitado por adição de uma solução de acetato de sódio (pH 5,2) para alcançar uma concentração final de 0,3 M e etanol (a -20 ° C) ou isopropanol (temperatura ambiente) em 2: 1 ou 1: 1 rácios. Quando as amostras são tratadas com etanol frio, têm que ser incubados a -20 ° C durante uma hora, enquanto que na precipitação com isopropanol, a amostra deve ser incubada a temperatura ambiente apenas de alguns minutos. Depois disso, o ADN pode ser recolhido por centrifugação e lavado com etanol frio a 70% para

eliminar o excesso de sal. Finalmente, o ADN pode ser ressuspenso em água destilada esterilizada ou de tampão TE (Tris 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0) [26]. Recentemente, um protocolo phenolchloroform revisited para extracção de ADN a partir de sangue completo muito tempo armazenado também tem sido relatada [27]. Os problemas associados ao contacto físico do operador com os solventes poderia ser evitado através da adição de um gel de polímero, tal como um polímero de sílica gel à mistura da amostra [28]. Um método para o isolamento de ADN que utiliza compostos menos nocivos, tais

Salga Fora Método

Este é um protocolo de baixo custo muito adequado para purificação de DNA após a digestão de Proteinase K-SDS. Solubilidade da proteína depende de vários factores incluindo pH, temperatura e força iónica da solução. Neste método de extracção de ADN é conseguido por precipitação da proteína a uma concentração elevada de sal. Baixa concentração de sal aumenta a solubilidade da proteína (salga in) enquanto a alta solubilidade da proteína sal concentração diminuir rapidamente levando à precipitação de proteínas (salga). Depois de completa a digestão com proteinase K, salificação é realizada por adição de NaCl saturado (aproximadamente 6M) para dentro do tubo e a amostra é agitada vigorosamente durante 15 segundos, seguido de centrifugação a 3000 xg durante 15 minutos. O sedimento de proteína precipitada é deixado na parte inferior do tubo e o sobrenadante contendo o ADN é transferido para um outro tubo e o ADN é recuperado por precipitação com etanol ou isopropanol, tal como descrito antes. Este método apresenta uma boa relação 260/280 exibindo boa Desproteinização

Método para extrair ADN de secado Amostras Este método de alto rendimento rápida [31] é fornecida para libertar DNA de amostras biológicas secas em substrato sólido, em especial quando são adsorvidos sobre um material celulósico, tais como papéis de base de algodão (por exemplo, Schleicher & Schuell 903 ( S & S 903), cartões Fitzco FTA ™ e esfregaço bucal). O protocolo pode ser realizada num único tubo, o que simplifica muito o processo de extracção de ADN de amostras biológicas, especialmente sangue total, secou-se sobre papéis à base de algodão. Este método compreende quatro etapas: o contacto de uma amostra biológica com a solução de extracção de ADN; incubação da mistura a uma temperatura baixa; incubação da mistura a temperatura elevada, e isolar o sobrenadante que contém ADN extraído. Um disco de material celulósico que contém a amostra biológica é adicionado a um tubo ou um bem, tal como um poço de microtitulação. Qualquer superfície de substrato pode ser mergulhado na solução de extracção de ADN adicionado ao tubo ou poço contendo o disco (s) numa quantidade de cerca de 50 ul. A solução de extracção de disco e ADN são primeiro incubadas à temperatura ambiente (+ 25 ° C) e em seguida a + 95 ° C. O sobrenadante é isolado por centrifugação, tal como 3000? g durante 10 minutos, e, em seguida, utilizada para análise molecular. Também tem sido relatado que o sobrenadante pode ser utilizado como molde para reacções de amplificação de sequência de uma diluição de 8 vezes, com um volume de reacção final de 10% a 20%.

Cromatografia protocolo baseado

Frequentemente protocolos tradicionais são muito demorados e requerem a utilização de solventes perigosos, como fenol ou clorofórmio. Estes problemas levaram ao desenvolvimento de kits comerciais rápidas com base em propriedades cromatográficas DNA. Há quatro formas de purificação com base nas propriedades cromatográficas de ADN: Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), cromatografia de permuta iónica (IEC), cromatografia de afinidade

(AC) e mini-coluna de centrifugação (MSC) [32,33]. Tamanho ADN recuperado e rendimento são influenciadas pelo método de cromatografia utilizada para a purificação genómica.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC), também conhecido como gel de filtração ou cromatografia de permeação em gel é um método de resolução cromatográfica baixo onde as moléculas em solução são separados de acordo com o seu volume hidrodinâmico. Geralmente, esta técnica é aplicada a grandes moléculas ou complexos macromoleculares, tais como proteínas e ácidos nucleicos.

Quando a amostra é transportada por água através da coluna, a técnica é conhecida como cromatografia de filtração gel (CFG) [34,35]. Três tipos de matriz são vulgarmente empregues para a purificação de ADN por GFC: poliacrilamida (Sephacryl ou Bio Gel), dextrano (Sephadex) ou agarose (Sepharose). Tipo de matriz é seleccionada de acordo com o tamanho do ADN e a filtração é realizada a baixa pressão. Kit comercial permite a separação de contaminantes de DNA somente quando taxa de ADN / contaminante é maior do que 3: 1 [36]. Em particular, não há nenhuma ligação de ADN para a matriz e a sua separação se baseia apenas em tamanho. Moléculas mais pequenas tendem a passar mais tempo no labirinto de canais e poros. Consequentemente, as moléculas maiores e ponderados moleculares mais elevados (isto é, ADN) são eluídos a partir da coluna antes de moléculas pequenas (por exemplo, ARNm e proteínas). Sephadex G-200 em coluna de purificação resultados o rendimento mais elevado de ADN, também remover mais contaminantes do que quer a electroforese em gel ou precipitação com acetato de amónio. Sephadex G-200 colunas são superiores às colunas à base de sílica com base em tanto rendimento e pureza, mas requerem mais tempo de preparação e centrifugação a baixa velocidade (130? G) para garantir o uso adequado de Sephadex G-200 pérolas.

Uma outra aplicação interessante cromatográfica é baseado na cromatografia de permuta iónica (IEC), permitindo a separação de iões e moléculas polares de acordo com a sua carga eléctrica. Ele pode ser usado para quase qualquer tipo de molécula carregada, incluindo ácidos nucleicos, proteínas, oligonucleótidos e ácidos aminados. Purificação de ADN é obtida por meio de cromatografia de permuta aniónica (isto é, em DEAE celulose). Os ácidos nucleicos são retidos na fase estacionária, mas pode ser eluída por aumento da concentração das espécies carregadas negativos e / ou modificação do pH deslocando o ADN a partir da fase estacionária. DNA é geralmente detectada por luz UV absorção.

Cromatografia de afinidade (AC) separa misturas bioquímicas com base em interacções biológicas altamente específicos, tais como ARNm e que entre o oligo (dA) ou cDNA e oligo (dT). AC combina a capacidade de fraccionamento por tamanho de SEC com a capacidade de conceber uma cromatografia de ligação reversivelmente um subconjunto da molécula conhecida.

Kits comerciais normalmente proporcionam sílica-membrana para purificação de ácidos nucleicos a partir de qualquer tipo de amostra, tais como esfregaços bucais, fluido cerebrospinal, sangue, fluidos corporais ou células lavadas a partir da urina. O procedimento spin-coluna não requer homogeneização mecânica, de modo total de hands-on tempo de preparação é mais ou menos 40 minutos. Os tecidos ou sangue são incubados com um tampão de lise durante alguns minutos e, em seguida os lisados celulares brutos são carregados para uma coluna de separação por centrifugação de ADN genómico a partir de centrifugação outras fracções de células. Coluna de centrifugação de alta velocidade de execução combina com processo livre de solvente, o que permite um rendimento elevado e níveis baixos de

contaminantes. Purificação de DNA também pode ser automatizado usando algum kit comercial.

A purificação do grânulo-Baseado Magnética

Bio-separação magnética é uma técnica emergente que mostra uma ampla gama de possíveis aplicações em biociência. Micro- magnético ou nano-esferas pode ser facilmente e rapidamente separados por forças magnéticas e pode ser usado em combinação com ligandos bio-afim (por exemplo, anticorpos ou proteínas com uma alta afinidade para o alvo). Os alvos podem ser células, bactérias ou ADN / ARN. Partículas magnéticas para bioseparação consistir em um ou mais núcleos magnéticos geralmente [magnetite (Fe3O4) ou maghemite (gama Fe2O3)] com uma matriz de revestimento de polímeros, sílica ou hidroxiapatite com grupos terminais funcionalizado. Saiyed et ai. [40] desenvolveram uma abordagem universal para extrair DNA genômico utilizando nanopartículas magnéticas nuas como um meio de purificação. Em uma extracção típica, 30 ul de 1% (w / v) de solução de SDS são adicionados a um volume igual de amostra (sangue completo, a suspensão de células de cultura, ou homogenato de tecido). O tubo é misturada por inversão suave para duas ou três vezes e incubaram-se à temperatura ambiente durante um minuto. Após a incubação, 10 ul de nanopartículas magnéticas são adicionadas ao ligado celular, seguido de 75 ul de tampão de ligação (cloreto de sódio 1,25 M e 10% de polietileno glicol 6000). A suspensão é misturada por inversão e deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 3 minutos. O pellet magnética é imobilizado através da aplicação de um magneto externo, permitindo sobrenadante descarga. O sedimento magnético é lavada com etanol a 70% e secou-se. O sedimento é então ressuspenso completamente em 50 ul de tampão TE e as partículas magnéticas ligadas ADN são eluídos por incubação a + 65 ° C através de agitação continua. Este procedimento simples, rápido e barato de ADN produz suficiente para 30 reacções de PCR a partir de pequena quantidade de espécimes biológicos em menos de 15 minutos.

Baseado-dendrímero ADN Método de Extracção

Dendrímeros são uma nova classe de materiais poliméricos. Eles têm gerado um grande interesse para várias aplicações, devido às suas propriedades estruturais excepcionais, tais como monodispersity, alta densidade de grupos funcionais periféricos, forma globular bem definida e multi-valência.? No entanto, dendrimer é apenas um motivo arquitectónico e não um composto. Dendrímeros iónicos Poly não apresentam uma forma persistente, e pode sofrer alterações de tamanho, forma, e flexibilidade como uma função de aumento das gerações.? Eles são sintetizadas como uma única entidade molecular possuindo homogeneidade estrutural e química elevada. Eles oferecem uma superfície macromolecular precisamente controlada, com uma base de custos muito mais baixos do que as proteínas e fornecer um andaime para a fixação de vários elementos funcionais em proporções e posições precisas. Diversas estratégias foram concebidas para modificar dendrímeros com moléculas da droga, materiais genéticos, agentes de direccionamento, corantes e agentes de imagem, seja por encapsulamento ou conjugação.

Fukushima et ai. [41] desenvolveram um método à base de dendrímero para extrair eficientemente biopolímeros tais como o ADN, ARN e proteínas a partir de células. Neste método, uma pluralidade de moléculas de dendrímero (por exemplo, um dendrímero de poliamida multi-ramificado) é formada sobre as paredes de um canal de fluxo em forma de U de um biochip através do qual uma solução contendo ADN alvo é feito fluir. Dendrímero é produzida por fornecimento de tratamento de silano amino sobre as superfícies de canal de

fluxo e que cobre um filme de amidoamina, o qual é produzido pela reacção de acrilato de metilo com etilenodiamina, em cima da área tratada com amino-silano como uma unidade dendron. Em seguida, as moléculas de polímero da sonda (como um oligonucleótidos) complementares para as moléculas de biopolímero-alvo estão ligados para as pontas dos dendrímeros. Quando uma solução contendo o DNA-alvo é vertida para o biochip estruturado como descrito acima e é feita para fluir através do canal de fluxo, o ADN alvo combina com o ADN sonda de uma forma complementar. Consequentemente, o ADN alvo é capturado de uma maneira altamente eficiente. Dependendo do tipo de alvo (ADN, ARNm ou proteína), o valor da densidade óptima de moléculas de ADN sonda ligada às pontas de dendrímero, pode ser obtida por alteração da quantidade de camada de dendrímero (gerações). Sob condição normal, dendrímeros segundo ou superiores geração são utilizados. Enquanto o método convencional utilizando contas magnéticas requer partes móveis mecânicas, este método elimina a necessidade, o que torna possível miniaturizar facilmente a área de pré-processamento onde um biopolímero-alvo ou proteína é recuperada.

Matrix Mill para Extração de DNA

A patente descrito por Weeden et ai. [42] refere-se a um dispositivo electromagnético desenvolvida para permitir o processamento de um grande número de pequenas amostras de tecidos orgânicos a serem processados para a extracção do ADN. Amostras de tecido (10 a 100 mg) são colocados numa pluralidade de tubos não ferrosos (96 na forma de realização preferida) que apresenta um pino ou "micro pilão", com pelo menos um núcleo ferroso inseridos nos tubos. 50? L de hidróxido de sódio 0,1 M são adicionados juntamente com o pilão de moagem. Basicamente, um campo electromagnético pulsante acciona os motores 96 "" separadas (em uma matriz de células 12? 8), cada um com aproximadamente a mesma força, de modo que até 96 amostras podem ser processados simultaneamente. Eletromagnetismo fornece a energia para o movimento destes pinos e pilões que aproximam o movimento aleatório do método manual de preparação de argamassa-and-pilão normalmente usado para extração de DNA. A placa de poços múltiplos é imprensada entre as estruturas inferiores e superiores da bobina e do poder ligado para entre 10 segundos e 5 minutos. De notar que a contaminação da amostra é evitada por uma camada de folha de plástico na superfície inferior do conjunto de bobina superior. Os extractos, em pH alcalino, são neutralizados com ácido acético ou de Tris-HCl (pH 7,0) e diluiu-se para análise de PCR. Dez segundos de moagem versões de ADN suficientes para mais de 100 ensaios de PCR.

O moinho de matriz reduz o tempo necessário para separar o DNA a partir de tecido. Isto poupa cerca de 10 horas por 100 amostras, ou seja, 10 horas de tempo técnico vs. cerca de 5 minutos de tempo técnico para a extracção. Há seis usinas de matriz de existência. Um está presente no laboratório de Weeden; cinco outros estão sendo testados em campo em locais que envolvem plantar, bem como tecidos animais. Um padrão custos moinho matriz ao redor $ 5.000.

Análise Forense e Extração de DNA mitocondrial

As células podem conter centenas de milhares mitocôndrias, cada um possuindo várias cópias do DNA mitocondrial (mtDNA). O ADN genómico é mais longo do que o mtDNA, mas mtDNA exibe um maior número de cópias. Esta característica faz com que o mtDNA muito útil quando a quantidade de DNA genómico é muito baixo. Além disso, é um mtDNA fontes típicas de DNA recuperado de cenas de crimes, incluindo cabelos, ossos, dentes e fluidos corporais como saliva, sêmen e sangue. Nos seres humanos, o mtDNA estritamente herdado da mãe [43-45].

Assim, as seqüências de mtDNA obtidos de indivíduos maternalmente relacionados, tais como um irmão e uma irmã ou uma mãe e uma filha, vai corresponder exatamente um ao outro, na ausência de uma mutação de novo. Portanto, o mtDNA é muito útil em casos de pessoas desaparecidas como amostras de mtDNA de referência pode ser fornecido por qualquer parente materna do indivíduo em falta [46-48]. Apesar da sua utilidade para a análise, a extracção de mtDNA de cabelo, ossos e dentes é excepcionalmente difícil, e alguns procedimentos foram publicados. Em protocolos tradicionais, um dente ou um osso é lavada com uma solução aquosa de hipoclorito de sódio, água, e, em seguida, o etanol, para remover o contaminante ou aderentes a partir da superfície. Depois de serem secos e em pó, a amostra é descalcificados por uma solução aquosa contendo EDTA durante muitas horas e, em seguida, digerido por uma solução de enzima proteolítica. Depois disso, o ADN é extraído por PCIA e, em seguida, precipitado por etanol.

Os produtos comerciais de extracção de mtDNA são laborioso, dispendioso e pode requerer o uso de produtos químicos orgânicos tóxicos.

Um protocolo bem conhecido e amplamente utilizado para extrair o mtDNA de cabelo tem sido adotado pela Unidade de Análise de DNA do FBI II como padrão forense dos Estados Unidos. Este método começa com moagem do cabelo, seguido de uma incubação de 2-24 horas, com proteinase K, a extracção do ácido nucleico pela PKA, e a concentração do ADN em um micro-concentrador centrífugo. Tempo necessário para concluir uma extracção da amostra pode levar 2-3 dias [49,50]. Um procedimento modificado de extracção de tiocianato de guanidina em combinação com leite de vidro para extrair o mtDNA de cabelo e dentes foi publicada por Baker et al.

Um método de patente recente por Carlson et al. [52] combina o uso de um tampão de lise com um novo protocolo de ligação de sílica simplificada para extrair ADN a partir de tecidos, cabelo, dentes, ossos, material vegetal, matrizes sólidas e outras amostras de ADN a partir da qual a extracção é geralmente considerado como sendo difícil. O protocolo permite que o ADN a ser rapidamente extraído das amostras em apenas 5 minutos até 2 horas, dependendo do tipo de amostra e não requerer a utilização de digestão enzimática, ou produtos químicos orgânicos tóxicos, tais como fenol, clorofórmio, tiocianato de guanidina, ou 2-mercaptoetanol. Outra vantagem é a eliminação (ou a redução drasticamente) de amostra de trituração, antes da lise. Este método também permite extrair DNA de sangue manchado em papel FTA com resultados idênticos aos obtidos utilizando um kit comercial.

Além disso, os recentes avanços em dispositivos micro-fluídicos fabricados por sistemas mecânicos micro-eletro-tecnologia (MEMS) permitiram a automatização de muitos protocolos biomédicas. Tecnologia MEMS é capaz de integrar vários dispositivos micro num único chip com as vantagens do sistema de miniaturização, alta sensibilidade e análise rápida. Chang et ai. [53] demonstraram a eficácia de um dimensional (3-D) do sistema de micro-chip de três fluídico para extrair o mtDNA utilizando um protocolo de purificação esferas magnéticas. Micro-bombas, um micro-misturadores, e um módulo de controle de micro-temperatura estão integrados dentro de um único chip para executar todo o processo automaticamente. Com a incorporação de esferas magnéticas, extracção a partir de células de mtDNA pode ser executado automaticamente, e uma elevada concentração, o mtDNA purificada é obtida após a lise das células, num período de tempo mais curto.

Atual e desenvolvimentos futuros

Desde o primeiro isolamento de ADN foi realizado com sucesso por Friedrich Miescher, em 1869, e a extracção de ADN inicial desenvolvida a partir de gradiente de densidade por centrifugação estratégias Meselson e Stahl em 1958, tem sido desenvolvido muitas técnicas para a purificação de ADN.

No início do terceiro milênio, o DNA tem assumido um papel central na medicina com o advento da farmacogenômica e os testes genéticos baseados em preditivos para doenças complexas comuns. Consequentemente, os esforços atuais em medicina molecular e epidemiologia genética dependem cada vez mais disponíveis coortes com bio-bancos de amostras contendo ADN como a base de estudo. Neste contexto, a recolha e a extracção do ADN a partir de diferentes fontes de amostras biológicas (por exemplo, tecidos de autópsia arquivados fixados em formalina, manchas de sangue seco, congelado soro ou plasma, sangue total LTS) estão crescendo campos da medicina molecular. Assim, os cientistas são confrontados com o problema de escolher métodos que não só são capazes de recuperar grandes quantidades de ácidos nucleicos, mas também produzir cópias amplificáveis.

Apesar da maioria dos grupos de pesquisa em todo o mundo ainda realizadas extração de DNA usando protocolos tradicionais, como Proteinase K e métodos de salga-out, sistema de extracção de ácido nucleico automatizado foram desenvolvidos devido à influência de rápido crescimento da tecnologia de automação hoje em dia. A automatização processo de extracção de ácido nucleico é potencialmente vantajosa por uma série de razões, incluindo para reduzir o tempo de trabalho, diminuir os custos do trabalho, aumentar a segurança do trabalhador e ao mesmo tempo proporciona oportunidade para aumentar a reprodutibilidade e a qualidade dos resultados. Além disso, o emprego de análise genética baseada em contextos clínicos em chama em alta sensibilidade e especificidade. No entanto, a melhoria dos pontos fracos para alguns dos instrumentos precisa ser realizado todo o tempo. No tempo médio, um sistema tudo-em-um bio-moléculas de extracção, ou o invento de um sistema de extracção em miniatura e portátil pode tornar-se um potencial de desenvolvimento no futuro.

RECONHECIMENTO

Nenhum declarado.