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DOCKING MOLECULAR PARA DETERMINAÇÃO DE FÁRMACOS COM MAIOR AFINIDADE AOS ALVOS CANDIDATOS PARA O TRATAMENTO DE ADENOCARCINOMA GÁSTRICO Flávio Diniz Silva Belo Horizonte 2018

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DOCKING MOLECULAR PARA DETERMINAÇÃO DE FÁRMACOS COM MAIOR

AFINIDADE AOS ALVOS CANDIDATOS PARA O TRATAMENTO DE ADENOCARCINOMA

GÁSTRICO

Flávio Diniz Silva

Belo Horizonte

2018

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Flávio Diniz Silva

DOCKING MOLECULAR PARA DETERMINAÇÃO DE FÁRMACOS COM MAIOR

AFINIDADE AOS ALVOS CANDIDATOS PARA O TRATAMENTO DE ADENOCARCINOMA

GÁSTRICO

Dissertação apresentada às Faculdades

Promove como requisito para obtenção do

título de mestre em Tecnologia da informação

aplicada à biologia computacional

Área de concentração:

Orientador: Prof. PhD Fabiana Alves

Belo Horizonte

2018

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FOLHA DE APROVAÇÃO

DOCKING MOLECULAR PARA DETERMINAÇÃO DE FÁRMACOS COM MAIOR

AFINIDADE AOS ALVOS CANDIDATOS PARA O TRATAMENTO DE ADENOCARCINOMA

GÁSTRICO

Flávio Diniz Silva

Dissertação apresentada às Faculdades Promove

como requisito para obtenção do título de mestre

em Tecnologia da informação aplicada à biologia

computacional

Área de concentração:

Orientador: Prof. PhD Fabiana Alves

Aprovado em: ___/___/______

BANCA EXAMINADORA

1º EXAMINADOR: ____________________________________________________

2º EXAMINADOR: ____________________________________________________

3º EXAMINADOR: ____________________________________________________

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AGRADECIMENTOS

É uma longa jornada para o desenvolvimento de qualquer trabalho de pesquisa e,

mesmo que os créditos da autoria sejam meus, essa pesquisa não foi feita apenas por duas

mãos.

Além das referências utilizadas aqui, estão o apoio incondicional da minha

orientadora, família, amigos.

Muitos não participam diretamente da elaboração deste, mas são fundamentais

para esta conquista. Além de entenderam minha ausência, são fontes de alívio e ânimo para

os momentos nos quais as dúvidas são maiores que as certezas.

Primeiramente, agradeço a Deus por me ajudar a crer que seria possível e por ser

meu suporte, quando diante de tantos desafios e da incredulidade nas religiões, fez minha fé

maior que minhas próprias convicções.

Agradeço a minha prima pela sua luta e garra ao enfrentar a neoplasia descrita

aqui. Mesmo inconsciente, você foi meu estímulo na busca do conhecimento, entendimento

e aprendizado.

A minha família, meu total respeito e amor. Aos meus pais, me faltam palavras para

descrever o quão importante são em minha vida e as minhas irmãs, saibam que meu desejo

de proximidade é maior do que eu possa expressar.

Aos amigos e namorado, vocês foram essenciais para meu crescimento nessa

caminhada. Souberam entender minhas angústias e a suportar meus momentos de

ausência.

E por fim e não menos importante, minha orientadora Fabiana Alves. Mesmo que

eu não dissesse, você sabe que foi fundamental para o direcionamento do nosso trabalho.

Meu muito obrigado é muito pouco, portanto, meu eterno respeito e carinho.

Cada colaboração que recebi fez com que o produto final fosse melhor elaborado e

que o objetivo de contribuir com o meio acadêmico fosse possível.

Esse trabalho, nada mais é, que o resultado da união de esforços na busca de um

bem comum. Obrigado a todos!

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 3

2 CARACTERIZÇÃO DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO E A CONTRIBUIÇÃO DA

BIOTECNOLOGIA NO SEU TRATAMENTO ......................................................................... 7

2.1 Câncer Gástrico ....................................................................................................... 7

2.2 Adenocarcinoma gástrico ........................................................................................ 8

2.2.1 Classificação macroscópica dos cânceres gástricos ......................................... 9

2.2.2 Classificação microscópica dos cânceres gástricos ........................................ 11

2.3 Epidemiologia ........................................................................................................ 13

2.4 Etiologia ................................................................................................................. 15

2.5 Sintomatologia e diagnóstico ................................................................................. 17

2.6 Tratamento ............................................................................................................ 20

2.7 Fármacos mais utilizados no tratamento de adenocarcinoma gástrico .................. 22

2.7.1 Fluorouracil ..................................................................................................... 22

2.7.2 Cisplatina ........................................................................................................ 23

2.7.3 Docetaxel ....................................................................................................... 24

2.8 Docking molecular ................................................................................................. 25

2.9 Ferramentas de Bioinformática .............................................................................. 28

2.9.1 DrugBank ....................................................................................................... 28

2.9.2 STRING - Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins ........... 28

2.9.3 UniProt ........................................................................................................... 30

2.9.4 Protein BLAST ................................................................................................ 30

2.2.1 PDB - Protein Data Bank ................................................................................ 31

2.2.2 ADT - AutoDockTools ..................................................................................... 31

2.2.3 ADV - AutoDockVina ...................................................................................... 32

3 METODOLOGIA DA PESQUISA .................................................................................. 34

3.1 Caracterização da pesquisa .................................................................................. 34

3.2 Recursos computacionais ...................................................................................... 34

3.2.1 DrugBank ....................................................................................................... 34

3.2.2 STRING - Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins ........... 35

3.2.3 UniProt ........................................................................................................... 35

3.2.4 Protein BLAST ................................................................................................ 36

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3.2.5 PDB – Protein Data Bank ............................................................................... 36

3.2.6 AutoDockTools e AutoDockVina ..................................................................... 37

3.3 Organização da Pesquisa ...................................................................................... 42

3.4 Contribuições da Pesquisa .................................................................................... 44

4 RESULTADOS ............................................................................................................. 45

4.1 Seleção dos fármacos mais utilizadas no processo quimioterápico do

adenocarcinoma gástrico ................................................................................................. 45

4.2 Alvos dos fármacos ............................................................................................... 45

4.3 Mapeamento das interações entre as proteínas .................................................... 46

4.4 Identidade das Proteínas ....................................................................................... 50

4.5 Estruturas Cristalográficas ..................................................................................... 52

4.6 Simulação computacional entre os fármacos e alvos ............................................. 53

5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS APRESENTADOS ................................................. 59

6 CONCLUSÃO ............................................................................................................... 62

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RESUMO

Baseando-se na incidência alarmante do adenocarcinoma gástrico no Brasil e no mundo, é relevante a melhor compreensão dessa neoplasia afim de um diagnóstico precoce e que contemple a melhor técnica no tratamento. Na maioria dos acometidos com o adenocarcinoma gástrico, a cirurgia de ressecção gástrica não é indicada devido ao diagnóstico tardio. Com base nisso, aumenta a necessidade da utilização dos melhores fármacos no processo quimioterápico. O objetivo deste estudo foi analisar in silico as interações dos principais fármacos utilizados no tratamento do adenocarcinoma gástrico com os principais alvos desta neoplasia e verificar entre os fármacos avaliados, qual possui maior número de alvos de interesse. Para tanto, os seguintes procedimentos foram realizados: uma pesquisa exploratória para levantamento dos fármacos, pesquisas na base de dados DrugBank para consulta dos alvos de cada fármaco, mapeamento da rede de interações de cada alvo no software STRING, alinhamento das sequencias das proteínas presentes nas redes de interações no Protein BLAST, obtenção das estruturas cristalográficas das proteínas que apresentaram valores significativos no Protein Data Bank e por fim, o processo de docking molecular. A análise realizada permitiu identificar forte interação entre as proteínas e seu respectivo fármaco no tratamento de adenocarcinoma gástrico, sendo a proteína TUBA1A, o alvo a apresentar-se com os melhores valores de afinidade, tornando-se o melhor candidato na predição para o fármaco Docetaxel. Palavras-chave: Adenocarcinoma gástrico. Fármaco. Tratamento. Docking Molecular. Alvos. Biotecnologia.

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ABSTRACT

In view of the alarming incidence of gastric adenocarcinoma in Brazil and in the world, it is relevant the better understanding of this neoplasm in order to an early diagnosis and that contemplates the best technique in the treatment. For most patients with gastric adenocarcinoma, gastric resection surgery is not recommended due to late diagnosis. Based on this, the need to use the best drugs in the chemotherapy process increases. The objective of this study was to analyze in silico the interactions of the main drugs used in the treatment of gastric adenocarcinoma with the main targets of this neoplasm and to verify among the evaluated drugs, which one has the highest number of targets of interest. For this, the following procedures were carried out: exploratory research to survey the drugs, searches on the DrugBank database to check the targets of each drug, mapping of the network of interactions of each target on the STRING software, alignment of the sequences of the proteins in the networks of interactions on Protein BLAST, obtaining the crystallographic structures of the proteins which presented significant values in the Protein Data Bank and, finally, the molecular docking process. The analysis allowed the identification of a strong interaction between the proteins and their respective drug in the treatment of gastric adenocarcinoma, being the TUBA1A protein, the target to present the best affinity values, becoming the best candidate in the prediction for the drug Docetaxel.

Keywords: Gastric adenocarcinoma. Drug. Treatment. Molecular docking. Target. Biotechnology.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Anatomia gástrica .................................................................................................. 9

Figura 2: Formas de apresentação macroscópica dos tumores avançados segundo

Borrmann ............................................................................................................................. 10

Figura 3: Classificação macroscópica dos tumores precoces segundo a JGCA ................. 11

Figura 4: Gráfico em formato pizza demonstrando a incidência de neoplasias a nível

mundial. ............................................................................................................................... 14

Figura 5: Gráfico em formato pizza demonstrando a mortalidade/Incidência de neoplasias a

nível mundial ....................................................................................................................... 14

Figura 6: Etapas do mecanismo de desenvolvimento dos tumores denominado

carcinogênese ..................................................................................................................... 16

Figura 7: Algoritmo para determinação da extensão do adenocarcinoma gástrico –

Estadiamento. ...................................................................................................................... 19

Figura 8: Fórmula estrutural do Fluorouracil ....................................................................... 23

Figura 9: Fórmula estrutural da Cisplatina .......................................................................... 24

Figura 10: Fórmula estrutural do Docetaxel ........................................................................ 25

Figura 11: Interação entre receptor e fármaco realizada com a utilização de ferramenta de

bioinformática e que propicia o docking molecular. .............................................................. 27

Figura 12: Mapa de potenciais de afinidade atômicos determinado no AutoDockTools ...... 32

Figura 13: Alteração da cor da macromolécula para melhor identificação da mesma após o

docking molecular. ............................................................................................................... 39

Figura 14: Demonstração do espaço tridimensional delimitado para a macromolécula. Os

parâmetros são visualizados na sobreposição de telas. ...................................................... 41

Figura 15: Arquivo de configurações utilizado para realização do processo de docking no

AutoDockVina ...................................................................................................................... 41

Figura 16: Metodologia utilizada no desenvolvimento deste trabalho desde a obtenção dos

fármacos até a realização do processo de docking molecular entre o fármaco e seus

respectivos alvos ................................................................................................................. 43

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Figura 17: Rede de interações da proteína TYMS (Thymidylate synthase) que é alvo do

fármaco Fluorouracil. ........................................................................................................... 47

Figura 18: Rede de interações da proteína TUBB1 (Tubulin beta-1 chain) que é alvo do

fármaco Docetaxel. .............................................................................................................. 48

Figura 19: Rede de interações da proteína BCL2 (Apoptosis regulator Bcl-2) que é alvo do

fármaco Docetaxel. .............................................................................................................. 49

Figura 20: Resultados para as proteínas referentes a espécie humana não encontradas no

Protein Data Bank. ............................................................................................................... 53

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LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1: Frequência dos tumores gástricos ......................................................................... 8

Quadro 2: Classificação histológica dos adenocarcinomas gástricos - SBP (2002) ............ 12

Quadro 3: Classificação histológica dos adenocarcinomas gástricos – SBP (2005)............ 13

Quadro 4: Relação entre fármacos e alvos identificados no DrugBank. .............................. 45

Quadro 5: Relação entre fármacos e alvos identificados no DrugBank com respectivo

identificador no PDB ............................................................................................................ 46

Quadro 6: Proteínas presentes na rede de interação da proteína TYMS e o grau de

confiança correspondente. ................................................................................................... 48

Quadro 7: Genes presentes na rede de interação da proteína TUBB1 e o grau de confiança

correspondente .................................................................................................................... 49

Quadro 8: Genes presentes na rede de interação do gene BCL2 e o grau de confiança

correspondente .................................................................................................................... 50

Tabela 9: Sequências que produziram alinhamentos significativos realizados no software

Protein BLAST com as sequências da rede de interação da proteína TYMS e o

fármaco Fluorouracil...............................................................................................................51

Tabela 10: Sequências que produziram alinhamentos significativos realizados no software

Protein BLAST com as sequências da rede de interação da proteína TUBB1 e o fármaco

Docetaxel ............................................................................................................................. 51

Tabela 11: Sequências que produziram alinhamentos significativos realizados no software

Protein BLAST com as sequências da rede de interação da proteína BCL2 e o fármaco

Docetaxel ............................................................................................................................. 52

Quadro 12: Relação entre o fármaco, seus alvos, as proteínas que compõe a rede de

interação de cada alvo e o status do processo de docking para os fármacos Cisplatina e

Fluorouracil .......................................................................................................................... 54

Quadro 13: Relação entre o fármaco, seus alvos, as proteínas que compõe a rede de

interação de cada alvo e o status do processo de docking para o fármaco Docetaxel ......... 55

Tabela 14: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Fluorouracil e seu

alvo Thymidylate synthase (1HZW / TYMS). ........................................................................ 56

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Tabela 15: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Docetaxel e a

proteína Cryo EM density of microtubule assembled from human TUBB3 (5IJ0 / TUBA1B)

presente na rede de interações do alvo TUBB1. .................................................................. 57

Tabela 16: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Docetaxel e a

proteína Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal human tubulin

(5JCO / TUBA1A) presente na rede de interações do alvo TUBB1. ..................................... 57

Tabela 17: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Docetaxel e a

proteína alvo HUMAN BCL-2, ISOFORM 1 (1G5M / BCL2). ................................................ 58

Tabela 18: Melhores resultados apresentados no processo de docking molecular entre o

fármaco e seus respectivos alvos. ....................................................................................... 58

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

3D terceira dimensão

5-FU Fluorouracil

ADT Auto Dock Tools

ADV Auto Dock Vina

AG Adenocarcinoma Gástrico

BCL2 Apoptosis regulator

BLAST basic local alignment search tool

CADD Computer-Aided Drug Design

CagA cytotoxin associated gene A

DCTD dCMP deaminase

DHFR dihydrofolate reductase

DLG docking log file

DNA ácido desoxirribonucléico

DPF docking parameter file

DTYMK deoxythymidylate kinase

DUT deoxyuridine triphosphatase

EBI Instituto Europeu de Bioinformática

FDA Food and Drug Administration

GPF grid parameter file

H. pylori Helicobacter pylori

IARC International Agency for research on cancer

INCA Instituto Nacional de Câncer Gástrico

JGCA Japanese Gastric Center

MDR resistência multidroga

MTHFD1 methylenetetrahydrofolate dehydrogenase

MTHFR methylenetetrahydrofolate reductase

NCBI National Center for Biotechnology Information

OMS Organização Mundial de Saúde

PCNA Proliferating cell nuclear antigen

PD padrão difuso

PG padrão gástrico

PGC Projeto Genoma Clínico

PDB Protein Data Bank

PDBQT Protein Data Bank, Partial Charge (Q), Atom Type (T)

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PIR proteína de informação de recursos

PPD padrão pouco diferenciado

PGCH Projeto Genoma do Câncer Humano

PI padrão intestinal

RMSD root mean square deviation

RNA ácido ribonucleico

RRM2 ribonucleotide reductase regulatory subunit M2 (human)

SBP Sociedade Brasileira de Patologia

SHMT1 serine hydroxymethyltransferase 1

SIB Instituto Suíço de Bioinformática

STRING Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins

TC tomografia computadorizada

TI tecnologia da informação

TYMS thymidylate synthase

TUBA1A Tubulin alpha 1 a

TUBA1B Tubulin alpha 1 b

TUBB1 Tubulin beta 1 chain

TS timidilato sintase

VLP videolaparoscopia

USE ultrassonografia endoscópica

UniProt Universal Protein Resource

USP Universidade de São Paulo

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

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3

1 INTRODUÇÃO

Este trabalho tem visa fornecer dados para a melhor compreensão do

adenocarcinoma gástrico, pautado na qualidade da sobrevida do paciente, associado à

racionalização de meios e recursos para verificação de fármacos que possuam maior

quantidade de alvos no tratamento do adenocarcinoma gástrico e que, consequentemente,

possibilitem menores reações adversas no processo quimioterápico.

Desta forma, o objetivo geral é analisar in silico as interações dos principais

fármacos utilizados no tratamento do adenocarcinoma gástrico com os principais alvos desta

neoplasia e verificar entre os fármacos avaliados, qual possui maior número de alvos de

interesse. Tudo isso, partindo da hipótese básica que alguns fármacos disponíveis no

mercado possuem maior número de alvos para o tratamento do adenocarcinoma gástrico.

Conforme ressaltado por Compare, Rocco e Nardone (2010), o adenocarcinoma

gástrico é um dos maiores problemas atuais em relação à saúde pública no mundo e foi

uma das principais causas de morte no século XX devido à sua alta taxa de incidência,

dificuldades no diagnóstico e tratamento limitado.

As neoplasias malignas mais comuns têm como tecido de origem o epitélio

(carcinoma). Essas neoplasias se originam durante o processo irregular da replicação

celular. No processo homeostático, mecanismos reguladores propiciam o sucesso do ciclo

celular, o que não ocorre na proliferação de células cancerosas. Na neoplasia há perda do

controle da homeostasia de proliferação, diferenciação e morte celular (STEWART;

KLEIHUES, 2008).

No contexto mundial, foram estimados até 2030, mais de 27 milhões de pessoas

vivendo com câncer (excluindo câncer de pele não melanoma). Dessa estimativa, 952 mil

casos são referentes ao câncer de estômago, tornando este o quinto tipo de câncer mais

comum no mundo e a terceira causa de morte entre as neoplasias malignas. O número de

casos de adenocarcinoma gástrico, normalmente, varia em relação ao desenvolvimento

econômico do país. (STEWART e KLEIHUES, 2008; IARC, 2015).

No Brasil, o adenocarcinoma gástrico, desconsiderando os tumores de pele não

melanoma, entre as mulheres é o terceiro em incidência na região Norte, o quarto na região

Nordeste e o quinto nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Entre os homens, aparece

como o segundo tumor mais frequente nas regiões Norte e Nordeste, quarto nas regiões

Centro-Oeste e Sul e na quinta colocação na região Sudeste (IARC, 2015).

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4

O desenvolvimento de uma neoplasia pode estar relacionado a fatores ambientais

e/ou hereditários. Oitenta por cento dos casos de câncer gástrico está relacionado aos

fatores ambientais ligados aos hábitos alimentares, estilo de vida e a infecção pelo micro-

organismo Helycobacter pylori:

O câncer gástrico desenvolve-se através de várias etapas e os fatores etiológicos

são diversos. Lesões pré-cancerosas do estômago, tais como gastrite atrófica crônica,

metaplasia intestinal e displasia, precedem o desenvolvimento de câncer gástrico. A

inflamação crônica com a proliferação sustentada tem sido geralmente aceita como um fator

de risco para o câncer, incluindo câncer gástrico. É sabido que a infecção persistente por H.

pylori provoca inflamação (gastrite crônica), que progride para lesões pré-cancerosas, tais

como metaplasia intestinal e, finalmente, o câncer gástrico invasivo (KUMAR et al., 2015, p.

9).

Devido à alta incidência e grande variabilidade, o adenocarcinoma gástrico foi

classificado, ao decorrer dos anos e com a possibilidade de novos estudos, em várias

perspectivas. Dentre as mais relevantes, destacam-se a visão macroscópica da JGCA

(Japanese Gastric Center) e a visão microscópica da SBP (Sociedade Brasileira de

Patologia).

Dentre os meios de tratamento, a técnica mais comumente utilizada é a ressecção

gástrica acompanhada da quimioterapia ou não. O processo quimioterápico tem como

objetivo alcançar células em diferentes fases do ciclo celular e é utilizado conforme a

necessidade, podendo ser: curativa, adjuvante, neoadjuvante e paliativa no tratamento do

adenocarcinoma gástrico. A quimioterapia aparece como uma abordagem promissora em

casos onde a ressecção do tumor é contraindicada, além de ser uma abordagem tradicional

no pós-operatório. Tais fatos corroboram a gravidade desta patologia e a necessidade de

novos estudos que possam modificar esse cenário (ZILBERSTEIN et al., 2013).

Como menos da metade dos pacientes com a neoplasia em estágio avançado são

passíveis de ressecção cirúrgica, são necessárias drogas mais eficazes e estratégias de

tratamentos inovadoras (ZILBERSTEIN et al., 2013).

Destaca-se dos estudos de Toneto (2006) que um dos grandes problemas no

tratamento do câncer gástrico é o diagnóstico, muitas vezes, tardio e, quando descoberta a

neoplasia, ela se apresenta localmente avançada ou em estado metastático. Devido a esse

estadiamento do câncer gástrico, novas formas de intervenções na doença vêm sendo

discutidas continuamente, porém, o tratamento depende essencialmente de intervenção

cirúrgica que, frequentemente, acarreta complicações na sobrevida.

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5

A busca por novos tipos de tratamento, alternativas terapêuticas, novos marcadores

biológicos e melhor entendimento dos mecanismos moleculares para a compreensão dos

fenômenos envolvidos na gênese e desenvolvimento dessa neoplasia impulsionam novos

estudos que visam tanto um diagnóstico precoce quanto tratamento adequado para a

qualidade de vida do acometidos pelo adenocarcinoma gástrico.

Dentre esses estudos realizados, o Projeto Genoma Clínico (PGC) lançado em

1999 pelo Projeto Genoma do Câncer Humano (PGCH), visa o desenvolvimento de novos

mecanismos de diagnóstico e tratamento de câncer a partir do estudo dos genes expressos

em alguns tipos específicos de câncer. Além da expressão gênica, o projeto procura

entender melhor as características dos perfis de expressão que possam estar relacionadas

aos parâmetros clínicos e o comportamento biológico a fim de obter um prognóstico e

permitindo escolhas de terapias mais adequadas e eficientes ao tempo que sejam menos

invasivas. O PGC tem como base para esse estudo tumores do trato gastrintestinal.

Atualmente, existe uma grande quantidade de medicamentos utilizados no

tratamento do adenocarcinoma gástrico, cada qual sendo utilizado conforme diagnóstico e

estágio da neoplasia. Essas drogas participam do processo quimioterápico e são

manipuladas individualmente ou através da combinação de duas ou mais drogas. Tais

combinações podem apresentar mais efeitos colaterais, por isso são reservadas para

pacientes que apresentam um quadro clínico positivo e que podem ser acompanhados de

perto pelo seu médico. Contudo, entre as drogas utilizadas para o tratamento do

adenocarcinoma gástrico, há a necessidade de verificar se drogas que apresentem mais

sítios de ligação, possibilitam menos reações adversas.

Com base na gravidade e incidência apresentadas desta neoplasia, o diagnóstico

tardio e os mecanismos de tratamento utilizados atualmente, justifica-se o uso de técnicas

computacionais associadas à biotecnologia e utilizadas como alternativa no tratamento

desta neoplasia, além de funcionar como mecanismo de reconhecimento molecular ligante-

receptor no planejamento racional de fármacos, na redução de custo e tempo gasto no

processo de desenvolvimento de novas drogas e como ferramenta para a seleção, avaliação

e descoberta das melhores drogas a serem utilizadas no processo quimioterápico. Dentre

essas técnicas, destaca-se o docking molecular que verifica a afinidade de um ligante a

determinado sítio de ligação.

Nas seções que seguem, conceitua-se o adenocarcinoma gástrico, bem como as

causas, diagnóstico e mecanismos de tratamento desta neoplasia, relatando os alvos e as

drogas utilizadas no tratamento, com o objetivo de avaliar e explicitar, através do uso de

ferramentas de bioinformática, qual dessas drogas possui maior afinidade com os alvos

rosan
Nota
Acho que você poderia ter falado um pouco mais sobre o Projeto Genoma Clínico. É um estudo muito importante, pouco conhecido e com conteúdo muito útil no tratamento de câncer.
rosan
Nota
Explicar melhor.
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6

expostos. Tais ferramentas de bioinformática são apresentadas e mostrado o funcionamento

de cada uma delas. Relata-se, também, a necessidade de utilizar fármacos com alta

especificidade em relação aos alvos identificados na neoplasia para que o tratamento do

adenocarcinoma gástrico seja eficaz e cause o mínimo de transtornos ao paciente, pois só

desta forma se pode melhorar a técnica terapêutica adjuvante, caracterizar mais

rigorosamente a patologia e identificar marcadores prognósticos clinicamente úteis.

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7

2 CARACTERIZÇÃO DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO E A CONTRIBUIÇÃO DA

BIOTECNOLOGIA NO SEU TRATAMENTO

Para fundamentação teórica dessa pesquisa, teve-se como critério selecionar obras

contemporâneas para um debate que envolva o surgimento, desenvolvimento e tratamento

do adenocarcinoma gástrico (AG), bem como o levantamento dos principais alvos em

relação aos marcadores dessa neoplasia e as drogas para combater esses alvos.

Esta seção tem como objetivo introduzir o termo adenocarcinoma gástrico,

caracterizá-lo e definir o termo Bioinformática. Pretende-se ainda verificar a relação

entre tais elementos e clínica e os recursos da TI através da Biotecnologia.

2.1 Câncer Gástrico

A palavra câncer tem origem latina cancer que significa caranguejo e está

relacionada ao modo de crescimento infiltrante da neoplasia o que se compara ao fato do

animal introduzir suas pernas na areia dificultando sua retirada (SILVA, 2007).

Por envolver fatores moleculares, celulares e teciduais, o câncer é uma doença

complexa e apresenta indícios de origem mutagênica capaz de ocasionar metástases

(ROSADO, 2010).

Segundo a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer - IARC (2015), entre

as estatísticas de mortalidade por neoplasias, o câncer gástrico assume a quinta posição,

apresentando uma lesão, normalmente ulcerada, que em sua maioria ocorre em alguma

parte da mucosa do estômago.

O cancro desenvolve-se ao longo de um processo multifaseado que é definido por etapas histológicas e fisiopatológicas distintas. Várias alterações genéticas e epigenéticas medeiam a transição de uma fase para outra e estas incluem mutações em oncogenes, genes supressores tumorais e ciclo celular, alterações na reparação de gene e alterações microssatélites, como perda de heterozigotidade ou instabilidade microssatélite (BAPTISTA, 2008, p.12).

Mais de 90% dos tumores que acometem ao estômago são malignos, sendo o tipo

histológico mais comum de neoplasia, o adenocarcinoma (TONETO, 2006), como

representado na Tabela 1:

rosan
Nota
A frase ficou sem sentido.
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Tabela 1: Frequência dos tumores gástricos

Tipos de Tumores Percentual Tipos de Tumores Percentual

Tumores Malignos 93% Tumores Benignos 7%

Carcinoma 87,9% Pólipo 3,10%

Linfoma 3% Leiomioma 2%

Leiomiossarcoma 1,7% Lesões inflamatórias 0,7%

Carcinoide 0,3% Pâncreas heterotrópico 04%

Outros 0,1% Outros 0,8%

Fonte: Adaptado de: BAPTISTA, Maria Leonor Troni. Adenocarcinoma gástrico esporádico. Covilhã, 2008, p. 19.

2.2 Adenocarcinoma gástrico

Almeida (2009) e Valente (2014) afirmam que o adenocarcinoma gástrico, tumor

originado na mucosa, é o tipo de tumor mais frequente do trato gastrointestinal e possui

várias classificações, cada qual baseada em uma característica específica, como: tipo de

crescimento, histogênese e grau de diferenciação. Isso ocorre, pois o AG varia em sua

morfologia pela singularidade da composição celular da mucosa gástrica ou pelo processo

de diferenciação da célula-tronco.

Anatomicamente, o estômago é dividido em três partes principais: corpo, fundo e

antro e o câncer gástrico pode surgir em qualquer uma destas regiões (FERNANDES,

2011).

Correa (2003) e Fernandes (2011) enfatizam que os dois principais sítios tumorais

do adenocarcinoma gástrico são proximal e distal.

A região proximal do estômago (fundo) tem a função de acomodar e receber os

alimentos. A região distal (antro) é responsável por misturar e triturar o alimento em

partículas suficientemente pequenas para passarem através do piloro (Figura 1)

(ZIESSMAN, 2014).

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Figura 1: Anatomia gástrica

Fonte: ZIESSMAN, H. A.; O’MALLEY, J. P.; THRALL, J. H. Medicina Nuclear. 4ª Edição. São Paulo:

Elsevier Brasil, 2014. 464 p. p. 295.

Nos últimos anos a ocorrência de tumores distais diminuiu, em contrapartida, a

presença de tumores proximais aumentou, aparentemente relacionados com refluxo

gastresofágico (CORREA, 2013).

Valente (2014) afirma que entre os problemas mais graves a serem enfrentados na

presença de um adenocarcinoma gástrico, destaca-se a presença de metástase à distância

(quando o tumor se espalhar para outros órgãos do corpo), sobretudo a neoplasia sistêmica

disseminada vinculada a carcinomatose peritoneal.

2.2.1 Classificação macroscópica dos cânceres gástricos

O grau de invasão determina a classificação de câncer gástrico como precoce ou

avançado. Cancros precoces estão limitados à mucosa e submucosa. Quando

ultrapassadas essas camadas, os tumores são classificados como avançado (CORREA,

2013).

Data de 1926 umas das primeiras classificações dos cânceres gástricos. Borrmann

sugeriu uma classificação macroscópica que foi amplamente difundida e ainda é utilizada

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atualmente para neoplasias avançadas: tipo I: vegetante ou polipoide; tipo II: ulcerado; tipo

III: ulcero infiltrativo; tipo IV: infiltrativo ou difuso (TONETO, 2006; ALMEIDA, 2009) (Figura

2).

Figura 2: Formas de apresentação macroscópica dos tumores avançados segundo

Borrmann

Fonte: JAPANESE GASTRIC CENTER ASSOCIATION – JGCA. Japanese classification of Gastric

Carcinoma – 3rd English Edition. Gastric Center, 2011 p. 3.

Devido à alta incidência de câncer gástrico no Japão e o desenvolvimento

tecnológico óptico do país, em 1962, a Japanese Gastric Center Association instituiu uma

classificação macroscópica para os adenocarcinomas gástricos precoces dividindo-os em

três tipos: tipo I: protruso; tipo II: superficial: a. elevado, b. plano e c. deprimido; tipo III:

ulcerado ou escavado; tipos mistos: combinação entre os tipos anteriores (ALMEIDA, 2009)

(Figura 3).

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Figura 3: Classificação macroscópica dos tumores precoces segundo a JGCA

Fonte: JAPANESE GASTRIC CENTER ASSOCIATION – JGCA. Japanese classification of Gastric

Carcinoma – 3rd English Edition. Gastric Center, 2011 p. 3.

2.2.2 Classificação microscópica dos cânceres gástricos

Proposto por Lauren em 1965, a classificação microscopia é dividida em dois

padrões básicos: 1] Intestinal (PI): abrange tumores com formação glandular; e 2] Difuso

(PD): abrange todas as morfologias que não formam glândulas (tubulares e papilares) e

estão associadas a maior possibilidade metastático, com rápida progressão tumoral e pior

prognóstico (TONETO, 2006).

Nakamura, em 1968, dividiu os AG em dois tipos: 1] Diferenciados: neoplasias com

tendência a arranjos glandulares tubulares, acinares ou papilíferos que originam-se da

mucosa atrófica e intestinalizada; e 2] Indiferenciados: apresentam disposição em células

isoladas ou formando blocos sólidos, cordões ou trabéculas, demonstrando perda de

diferenciação originando-se da mucosa gástrica própria (ALMEIDA, 2009).

Baseando-se na classificação histogenética de Nakamura, em 1981, a Japanese

Gastric Center Association, propôs a divisão em cinco tipos histológicos: papilífero, tubular

(bem e moderadamente diferenciado), pouco diferenciado, de células em anel de sinete e

mucinoso (JGCA, 2011).

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Posteriormente, em 2000, a Organização Mundial de Saúde (OMS) propôs uma

classificação histológica em quatro tipos: papilífero, tubular, de células em anel e mucinoso.

Em 2002, o Dr. Kiyoshi Iriya do Departamento de Patologia da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), a convite da Sociedade Brasileira de

Patologia (SBP), propôs a classificação histológica baseado na morfologia da célula

neoplásica (Quadro 2) (ALMEIDA, 2009).

Quadro 2: Classificação histológica dos adenocarcinomas gástricos - SBP (2002)

Adenocarcinoma

gástrico

Padrão Intestinal

1. Papilífero / Túbulo papilífero;

2. Tubular bem diferenciado;

3. Tubular moderamente diferenciado.

Padrão Gástrico

1. Papilífero / Túbulo papilífero (padrão

foveolar);

2. Microtubular;

3. Mucinoso mucocelular (células em anel de

sinete);

4. Mucinoso muconodular (lagos mucosos).

Pouco Diferenciado

Carcinoma indiferenciado / anaplásico

Carcinoma neuroendócrino

Formas especiais (carcinoma hepatóide, adenoescamoso, etc.).

Fonte: ALMEIDA, Ricardo Camillo de. Adenocarcinoma do estômago: análise de aspectos

morfológicos e do perfil imunohistoquímico de mucinas dos tipos histológicos propostos na

classificação da Sociedade Brasileira de Patologia, 2005. 2009. São Paulo, 2009, p. 17.

Em 2005, a proposta referenciada no Quadro 2 foi reformulada sob o comando da

SBP dando origem a classificação exposta no Quadro 3, que também foi realizada pelo Dr.

Kiyoshi Iriya. Tais classificações foram realizadas tomando como característica fundamental

a morfologia da célula e secundariamente o seu arranjo (SBP, 2005).

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Quadro 3: Classificação histológica dos adenocarcinomas gástricos – SBP (2005)

Padrão Intestinal Adenocarcinoma tubular papilífero bem diferenciado;

Adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado;

Padrão Gástrico

Adenocarcinoma tubular-foveolar;

Adenocarcinoma túbulo-papilífero-foveolar;

Adenocarcinoma microtubular;

Adenocarcinoma mucinoso mucocelular (carcinoma de células

em anel de sinete);

Adenocarcinoma mucinoso muconodular (lagos mucoso).

Padrão Pouco

Diferenciado

Adenocarcinoma pouco diferenciado;

Carcinoma indiferenciado.

Formas Especiais Carcinoma neuroendócrino, carcinoma hepatóide,

adenoescamoso, etc.

Fonte: ALMEIDA, Ricardo Camillo de. Adenocarcinoma do estômago: análise de aspectos

morfológicos e do perfil imunohistoquímico de mucinas dos tipos histológicos propostos na

classificação da Sociedade Brasileira de Patologia, 2005. 2009. São Paulo, 2009, p. 17.

2.3 Epidemiologia

Segundo Toneto (2006), Sousa (2010) e INCA (2015), um dos principais marcos

epidemiológicos do câncer gástrico foi a diminuição progressiva da sua taxa de mortalidade

na maioria dos países nas últimas décadas. Tal fato se deve aos avanços dos métodos de

investigação que permitiram o diagnóstico e tratamento mais precoces. Mesmo com este

decréscimo, o câncer de estômago ainda é a terceira neoplasia que mais causa morte de

pacientes em todo o mundo.

Na população geral, em termos de incidência global, as neoplasias malignas mais

comuns, excluindo-se as de pele não melanoma, são: pulmão (13%), mama (11,9%),

colorretal (9,7%), próstata (7,8%) e estômago (6,8%) (IARC, 2015) (Figura 4).

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Figura 4: Gráfico em formato pizza demonstrando a incidência de neoplasias a nível

mundial.

Fonte: INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER – IARC. GLOBOCAN 2012:

Estimated Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012. 2015.

Em relação à mortalidade/incidência as três neoplasias mais letais são: pulmão

(19,4%), colo do útero (9,1%) e estômago (8,8%). Isto representa uma mudança substancial

desde as primeiras estimativas, em 1975, quando o câncer de estômago foi a neoplasia

mais comum no mundo (IARC, 2015) (Figura 5).

Figura 5: Gráfico em formato pizza demonstrando a mortalidade/Incidência de neoplasias a

nível mundial

Fonte: INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER – IARC. GLOBOCAN 2012:

Estimated Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012. 2015.

IARC (2015) relata que, assim como as diversas neoplasias, há variação geográfica

na incidência do câncer de estômago no mundo, sendo os países subdesenvolvidos a

apresentarem os números de incidência mais elevados, representado 70% dos casos totais.

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Com destaque para a Ásia Oriental (principalmente a China) que representa,

aproximadamente, a metade dos casos mundiais.

Ainda que alguns países subdesenvolvidos apresentem uma incidência maior do

câncer gástrico, não se pode tomar essa informação como um padrão apresentado pela

neoplasia. No continente asiático, Japão, Coreia e China apresentam populações com maior

incidência de câncer gástrico e outros países presentes no mesmo continente, possuem

taxas de incidência relativamente baixas, como é a ocorrência na Índia (FORMAN, 2006).

Mesmo nesse cenário, não há como excluir a causa para essa incidência relativamente

baixa do câncer gástrico, à hipótese da falta de recursos para diagnosticar a doença na

população presente nesses países (BAPTISTA, 2008).

Em relação à idade, a taxa de incidência do adenocarcinoma gástrico aumenta

conforme a progressão etária do indivíduo, sendo relativamente raro antes dos 45 anos. A

maioria dos afetados por tal neoplasia encontra-se entre 65 e 80 anos (BAPTISTA, 2008;

IARC, 2015; INCA, 2015).

No Brasil, o adenocarcinoma gástrico é o quinto em número de incidência e em

número de mortes (IARC, 2015). Em relação ao gênero, no sexo masculino, é o segundo

tumor mais frequente nas regiões Norte e Nordeste e o quarto nas regiões Centro-Oeste e

Sul e aparece na quinta colocação na região Sudeste. Entre as mulheres, é o terceiro mais

incidente na região Norte, o quarto na região Nordeste e o quinto nas demais regiões (INCA,

2015).

2.4 Etiologia

Não existe conhecimento de todos os fatores etiológicos dos adenocarcinomas

gástricos. Tais fatores são complexos e de origem exógena e endógena. Pesquisas

epidemiológicas ressaltam a influência dos fatores ambientais, sobretudo alimentares, na

patogenia do adenocarcinoma gástrico (THOMAZINI, 2006; TONETO, 2006). Correa (2003)

afirma que se trata de uma neoplasia multifatorial.

Diversas hipóteses relacionadas à etiologia dos AG são estudadas e uma das mais

relevantes é a formação de composto nitroso devido à ingestão de nitritos na alimentação

(KOUNTOURAS, 2005).

O termo carcinogênico é utilizado para identificar tudo àquilo que origina

carcinomas, ou seja, designa indutores de neoplasias de forma geral (CARNEIRO et al.,

2002).

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Corroborando com o descrito anteriormente, Carneiro et al. (2002) afirmam que a

carcinogênese é um processo altamente complexo do qual participam fatores de risco

herdados e fatores de risco ambientais, tais como a alimentação, tabagismo e a exposição à

radiação e a agentes químicos.

A carcinogênese consiste em três etapas distintas: a iniciação, a promoção e a

progressão (Figura 6). A iniciação ou conversão neoplásica acontece quando um evento

genético (mutações, inserções, rearranjos cromossômicos, amplificação ou exclusão de

genes) resulta na ativação de oncogênese, na falta de expressão ou na inativação de genes

supressores de tumores. A promoção engloba a expansão clonal das células geradas na

fase de iniciação e exige a proliferação celular. Nesta etapa não há modificação da estrutura

do DNA, pois as mudanças ocorrem na expressão genômica. A terceira etapa, a

progressão, caracteriza-se pela ocorrência de múltiplas alterações genéticas e pela

independência do processo proliferativo da persistência do estímulo. As células tornam-se

imortalizadas e há aumento progressivo da instabilidade genômica o que pode ser

observado no aparecimento de modificações cromossômicas nas células cancerígenas

(CARNEIRO et al., 2002).

Figura 6: Etapas do mecanismo de desenvolvimento dos tumores denominado

carcinogênese

Fonte: Adaptado de: INSTITUTO NACIONAL DO CANCER – INCA. A situação do câncer no Brasil.

2015.

Outro fator destacado por Cola (2005), Thomazini (2006), Toneto (2006) e Baptista

(2008), a infecção pela Helicobacter pylori favorece o surgimento do adenocarcinoma

gástrico, uma vez que causa a inflamação crônica atrófica da mucosa e aumenta a

infiltração de linfócitos, macrófagos e células de plasma na mucosa gástrica.

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O micro-organismo é capaz de induzir resposta inflamatória do tecido gástrico, em praticamente todos os hospedeiros humanos, dando origem a um risco de desenvolvimento de gastrite, metaplasia intestinal e adenocarcinoma no corpo gástrico e do antro (PEREIRA et al., 2001, p. 1).

H. pylori é uma bactéria gram-negativa capaz de colonizar a mucosa gástrica e

desencadear uma resposta imunitária no hospedeiro (ser humano). A infecção é adquirida

predominantemente na primeira infância e permanece presente por toda a vida caso não

seja tratada com antibióticos. A gastrite atrófica multifocal associada a H. pylori pode estar

ligada ao processo pré-canceroso (CORREA, 2013).

A H. pylori foi classificada como um carcinogênico de classe I há mais de 10 anos,

conforme evidências coletadas através de estudos que comprovam que a infecção por tal

bactéria aumenta o risco de câncer gástrico (IARC, 2015).

Estima-se que cerca de 50% da população mundial esteja infectada com essa

bactéria, sendo que, na maioria das pessoas ela age de forma assintomática e cerca de 1%

a 3% da população infectada, desenvolverá câncer de estômago (ZABALETA, 2012).

Zabaleta (2012) preconiza que após a infecção pela H. pilory, antígenios da

bactéria podem prejudicar a função de células-T (células do sistema imunitário) reduzindo a

proliferação de linfócitos e células Jurkat. Além da disfunção celular citada, antígenios

podem induzir múltiplas atividades celulares, incluindo vacuolização da célula, formação de

canais na membrana, interrupção das funções endossomais e lisossomais, apoptose e

imunomodulação (LIMA; ROBENHORST, 2009).

2.5 Sintomatologia e diagnóstico

O adenocarcinoma gástrico em seu estágio inicial, geralmente, não apresenta

sintomas aparentes, justificando o diagnóstico tardio e trazendo complicações para o

tratamento. Muitas vezes os sintomas iniciais são inespecíficos (anemia, saciedade precoce,

perda de peso e náuseas), no entanto, 30% dos pacientes diagnosticados com esta

neoplasia, apresentam um histórico de dispepsia que é indistinguível da úlcera peptídica

(SOUSA, 2010). Aproximadamente 80% dos pacientes são diagnosticados em estágios

avançados (CORREIA, 1997; CORREA, 2013).

Toneto (2006) e Sousa (2010) ressaltam que os principais métodos de investigação

diagnóstica do adenocarcinoma gástrico são a radiologia e a endoscopia. A endoscopia

digestiva alta é um dos métodos mais utilizados, pois permite a visualização direta da

localização do tumor, a mensuração de sua extensão, além da remoção de tecidos para

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análise histológica, ou seja, visa fundamentalmente à definição das características

macroscópicas (DICKEN, 2005). A endoscopia permite, ainda, uma avaliação eficaz da

doença intraluminal, focal ou difusa, benigna ou maligna, apresentando uma sensibilidade

de 90% quando seguido de biópsia (SOUSA, 2010).

Combinando a endoscopia às modalidades de radiologia e ultrassom endoscópico,

é possível maximizar o estadiamento do tumor, fornecendo informações sobre a

profundidade de invasão tumoral e avaliação do grau de linfadenopatia perigástrica

(DICKEN, 2005).

A cromoendoscopia de ampliação tem sido alternativa no diagnóstico em indivíduos

que já apresentem lesão gástrica crônica atrófica, metaplasia intestinal ou displasia

gastrointestinal, uma vez que a técnica realça a mucosa através de colorações (DINIS et al.,

2003).

Alguns exames são de praxe para os doentes diagnosticados precocemente:

exame físico, raio X de tórax e endoscopia do trato gastrointestinal, além de hemograma

completo com plaquetas, análises bioquímicas séricas, estudo de coagulação e uma

tomografia computadorizada (ESMO, 2007). A tomografia pode delinear a dimensão do

tumor, bem como a presença de metástase ganglionar ou à distância (SILVA, 2007).

Uma abordagem ideal para o estadiamento pré-operatório é a endoscopia, seguida por tomografia computadorizada (TC) helicoidal e biópsia percutânea na suspeita de metástases (Figura 7). A ultrassonografia endoscópica (USE) e a videolaparoscopia (VLP) podem ajudar o cirurgião avaliar a ressecabilidade. Embora lesões T3/T4 ainda sejam convencionalmente tratadas por ressecção, os resultados a longo prazo permanecem insatisfatórios e estas lesões são candidatas a esquemas que incluam a quimioterapia (CORREIA, 1997, p. 55).

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Figura 7: Algoritmo para determinação da extensão do adenocarcinoma gástrico –

Estadiamento.

Fonte: CORREIA, M. M.; BRENNAN, M. F. Conduta terapêutica atual no adenocarcinoma da cárdia e

da junção esofagogástrica. Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões. 1997. vol. XXV, n.1, p.

55.

Nas últimas três décadas, a identificação das alterações genéticas em neoplasias

malignas ganhou destaque significativo. Dentre as alterações, estão as mutações para

ativação ou inativação, deleções e reagrupamentos de genes (AHLQUIST et al., 2000;

CHUNG et al., 2000).

O Projeto Genoma Clínico visa o desenvolvimento de novas maneiras de

diagnóstico através do estudo dos genes expressos e foca em quatro tipos de

manifestações do câncer: tumores gastrointestinais, tumores neurológicos, doenças

linfoproliferativas e tumores de cabeça e pescoço. A pesquisa inclui a análise da expressão

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gênica em neoplasias humanas e a identificação de diferenças nos perfis de expressão que

possam estar relacionadas aos parâmetros clínicos e ao comportamento biológico do

câncer. Essa análise possibilita a identificação de marcadores relacionados a diversas fases

da neoplasia (REVISTA PESQUISA FAPESP, 2000).

Um dos problemas ainda encontrados na especificação dos marcadores é quanto a

sua expressividade significativa ocorrer apenas nos casos de doença avançada, quando, em

muitos casos, já não é possível um tratamento adequado e eficiente (SOUSA, 2010).

O sistema de estadiamento descreve a gravidade do tumor e baseia-se na

extensão local e distal e avaliar a extensão do tumor é essencial para definir o melhor

tratamento com objetivo de alcançar a cura (FERNANDES, 2011).

2.6 Tratamento

Fernandes (2011) enfatiza que o resultado do tratamento do adenocarcinoma

gástrico depende, principalmente, do estadiamento da doença no diagnóstico.

O primeiro registro de uma intervenção bem sucedida em um adenocarcinoma de

estômago foi em 1881. Billroth, cirurgião austríaco, realizou uma ressecção do antro

gástrico, porém o paciente morreu três meses após a realização do procedimento. Era

necessária uma melhora no desenvolvimento da técnica cirúrgica, pois os resultados da

sobrevida em longo prazo não eram satisfatórios. A partir de então foram adotadas técnicas

de ressecção gástrica um pouco mais radicais para controlar a neoplasia o que resultou em

um aumento nas complicações e no número de mortes (RUTLEDGE, 1995).

Os avanços nos cuidados pré e pós-operatório alinhados ao desenvolvimento de

novos antibióticos e ao amparo das unidades de tratamento intensivo que ocorreram nas

últimas décadas fizeram a mortalidade atingir índices menores e mais satisfatórios,

passando de aproximadamente 50% para níveis abaixo de 1% no Japão (MARUYAMA,

1997).

Os três principais tipos de tratamento para o adenocarcinoma gástrico são: cirurgia,

quimioradioterapia e quimioterapia (SILVA, 2007; ALMEIDA, 2009).

Toneto (2006) afirma que o tratamento ideal para o AG é a ressecção cirúrgica com

margens de segurança adequadas, juntamente com o grande epíplon (membrana que liga o

estômago ao cólon) e linfonodos regionais.

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21

Para tumores distais, indica-se a gastrectomia subtotal e a gastrectomia total é

indicada para tumores de corpo, fundo e região da cárdia gástrico, com reconstrução pela

técnica denominada “Y de Roux” (ALCÂNTARA, 2008).

A ressecção gástrica é a pedra angular do tratamento com intenção curativa, mas em apenas 30% dos casos se obtém uma ressecção R0. Aqui a quimioterapia ou a quimioradioterapia, neo ou adjuvante assumem especial importância, estando atualmente em pleno debate, numa tentativa de melhorar o prognóstico destes doentes (FERNANDES, 2011, p. 2).

Toneto (2006) e Fernandes (2011) ressaltam que a detecção do adenocarcinoma

em estágio minimamente invasivo é algo incomum. Como o diagnóstico é apresentado

apenas nos casos em que a neoplasia se encontra avançada, menos de 30% dos doentes

alcançam a cura com a gastrectomia.

Os tumores apresentam diferentes características morfológicas, genotípicas,

fisiológicas e de invasão tecidual, por este motivo é necessária uma abordagem de

tratamento multidirecional, utilizando drogas quimioterápicas citotóxicas com diferentes

mecanismos de ação (ROSADO, 2010).

Até 2001 a utilização de quimioterapia e radioterapia como tratamento adjuvante à

ressecção não era consensual. A partir de estudos prospectivos realizados nos Estados

Unidos, a conduta começou a ser adotada no tratamento de adenocarcinomas gástrico

(TONETO, 2006).

Na evidência de metástase extensa, o tumor deve ser considerado irressecável,

cabendo à orientação para um tratamento paliativo. Nesses casos, a quimioterapia citotóxica

é a modalidade mais efetiva e indicada, sendo utilizada para aliviar disfagia, náuseas, dor,

sangramento e/ou obstrução. Por esse motivo, se faz necessário o estudo contínuo dos

genes expressos na identificação de alvos moleculares cada vez mais específicos e que

tenham uma relação mais próxima com as células neoplásicas, diferenciando-as das demais

células do organismo (TONETO, 2006; ALCÂNTARA, 2008; ROSADO, 2010).

O objetivo principal da quimioterapia é induzir a morte das células neoplásicas,

entretanto, pela similaridade entre células cancerosas e normais, os agentes antitumorais

estimulam respostas biológicas em ambas, como bloqueio do ciclo celular, reparação do

DNA ou o processo de morte celular por apoptose o que explica a maioria dos efeitos

colaterais causados pela quimioterapia (SILVA, 2007; ALMEIDA, 2009; ROSADO, 2010).

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22

2.7 Fármacos mais utilizados no tratamento de adenocarcinoma gástrico

Com a evolução dos quimioterápicos, estudos realizados na década de 90

deixaram claro o benefício quanto à quimioterapia paliativa (SOUZA et al., 2011).

A combinação de quimioterápicos em comparação ao uso isolado de drogas

antitumorais apresenta diversas vantagens no tratamento de câncer, principalmente

gástrico, pois utiliza diferentes mecanismos de ação, evitando assim, o desenvolvimento de

quimiorresistência (WAGNER et al., 2006; ROSADO, 2010).

Para que os fármacos façam de fato efeito na fisiologia do organismo, eles precisam interagir com áreas-alvo específicas, também denominadas alvos (ou receptores) terapêuticos. As moléculas dos fármacos formam ligações químicas (geralmente interações atômicas não-covalentes) com os receptores e a força dessas ligações é determinante para a afinidade do receptor pelo fármaco. Portanto, em suas conformações ativas, as moléculas do fármaco e do receptor exibem complementaridade geométrica e química, as quais são essenciais para o sucesso do tratamento (ALENCAR, 2010, p. 6).

Os agentes quimioterápicos empregados no tratamento de neoplasias apresentam

atividade citotóxica que podem ser classificadas em: I: agentes alquilantes; II:

antimetabólicos; III: inibidores de topoisomerase; IV: alcaloides da vinca e compostos

relacionados (MATUO, 2008).

2.7.1 Fluorouracil

O Fluorouracil (5-FU) foi o antineoplásico mais estudado para câncer gástrico

metastático sendo usado como monoterapia em 10 (dez) estudos e em 9 (nove) regimes de

quimioterapia combinada, conforme relata Wagner et al. (2006) em sua metanálise. A

fórmula estrutural do 5-FU pode ser observada na Figura 8.

Os agentes quimioterápicos do Fluorouracil pertencem a um dos principais grupos

de quimioterápicos empregados no tratamento do câncer: nucleotídeos análogos às

pirimidinas (ROSADO, 2010).

Estes compostos são capazes de bloquear a progressão do ciclo celular,

principalmente na síntese (fase S). A citotoxidade desta droga é atribuída a três diferentes

mecanismos: I: incorporação de fluonucleutídeos ao DNA; II: incorporação de

fluonucleutídeos ao RNA; III: inibição da enzima timidilato sintase (TS), uma das principais

enzimas que atuam na síntese de pirimidinas, agindo de forma essencial na replicação do

DNA (ROSADO, 2010).

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23

Dessa forma, o estresse genotóxico pode ativar vias de morte celular, resultando na

fragmentação do DNA. Adicionalmente, o 5-FU pode resultar na morte das células devido à

incorporação do metabólico na molécula de DNA e RNA. Tal incorporação resulta em

alterações no processo de replicação (inibição da síntese de DNA), de transcrição (inibição

da transcrição de RNA) e na inibição da tradução proteica (ROSADO, 2010).

Figura 8: Fórmula estrutural do Fluorouracil

Fonte: NCBI - National Center for Biotechnology Information. 2016.

2.7.2 Cisplatina

Trimmer (1999) e Wagner et al. (2006) destacam a Cisplatina como fármaco

amplamente utilizado e eficaz no tratamento de câncer. Conforme a meta análise realizada

por Wagner et al. (2006), a Cisplatina demonstrou benefício significativo como tratamento

adjuvante para o adenocarcinoma gástrico.

A estrutura da cisplatina é formada por um complexo planar da platina com dois

íons de cloreto e duas moléculas de amônia (Figura 9), sendo assim, um agente alquilante

platinado (ROSADO, 2010).

A cisplatina também inibe a síntese de DNA, como efeito seletivo sobre células que

se dividem rapidamente, tais como as tumorais, e inibe também a transcrição do RNA e em

termos farmacodinâmicos, é distribuído por todos os tecidos com alta concentração no

fígado e nos rins (ROSADO, 2010; TRIMMER, 1999).

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24

Figura 9: Fórmula estrutural da Cisplatina

Fonte: NCBI - National Center for Biotechnology Information. 2016.

2.7.3 Docetaxel

Souza (2011) afirma que o uso do docetaxel em primeira linha para câncer gástrico

avançado foi investigado em diversos estudos, bem como a combinação deste fármaco com

outros a fim de identificar o regime mais efetivo.

Este fármaco é um taxano semissintético (Figura 10) produzido a partir do texus

brevifolia, um teixo raro do Pacífico (ROSADO, 2010; WAGN, 2017).

Docetaxel é um composto que possui alta afinidade por microtúbulos estabilizando

a sua estrutura devido a um incremento na polimerização da tubulina o que provoca a

inibição da mitose no processo de divisão celular.

O Docetaxel é considerado um dos medicamentos mais eficaz utilizado no

tratamento do câncer pois atua, diretamente, no ciclo celular na fase S (síntese), bem como

o Fluorouracil (TABACZAR et al, 2010).

A distribuição do docetaxel é sistêmica com ligação extensa nas proteínas

plasmáticas. Seus principais mecanismos de resistência são: I) alterações na estrutura

tridimensional da tubulina com diminuição da afinidade pela droga; II) desenvolvimento do

fenótipo de resistência multidroga (MDR-1) e aumento do efluxo da droga; III) resistência

com outros produtos naturais, entre eles os alcaloides da vinca, antraciclinas, taxanos e

etoposídeos (ROSADO, 2010).

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25

Figura 10: Fórmula estrutural do Docetaxel

Fonte: DRUGBANK - Drug & Drug Target Database. 2016.

2.8 Docking molecular

Rosado (2010) ressalta que a aplicação do conhecimento relacionando a estrutura

química aos processos biológicos do adenocarcinoma gástrico, é fonte de inúmeros estudos

e um dos desafios é encontrar o melhor método para desenvolvimento de fármacos para

essa patologia minimizando efeitos colaterais e aumentando a pontualidade.

Desde a concepção do alvo biológico até a descoberta de um novo fármaco, um processo que pode levar em média 11 anos ou mais. A bioinformática, juntamente com a química computacional, vem oferecendo um excelente direcionamento no planejamento racional de fármacos, já com inúmeros casos de sucesso envolvendo o emprego de simulações computacionais (SILVA, 2007, p. 23).

Considerando tais pontos, a biologia de sistemas integra ferramentas

computacionais disponíveis para análises dos bancos de dados que contém as informações

a respeito das interações funcionais relacionado às principais macromoléculas (SILVA,

2007). E o auxílio dessas ferramentas (Computer-Aided Drug Design, CADD), promove

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maior eficiência no processo de descoberta, chegando a reduzir em até 50% o custo e

tempo de pesquisa por um novo fármaco (SOUZA, 2012).

A convergência de tecnologias genômicas e o desenvolvimento de fármacos

planejados contra alvos moleculares específicos provêm muitas oportunidades para o uso

da bioinformática. A aplicação da bioinformática pode ser realizada identificando genes que

possuem propriedades similares a alvos conhecidos por meio de pesquisas de similaridade

entre bibliotecas de diferentes origens (virtual screening). Essa pesquisa possibilita a

construção de modelos dos alvos receptores baseada em homologia sequencial e

similaridade estrutural (COHEN, 2005).

Dentre as técnicas computacionais disponíveis para o planejamento de fármacos,

destaca-se o docking molecular que propicia a investigação das estruturas químicas e as

possíveis orientações que determinada molécula pode assumir no interior do sítio ligante de

um biorreceptor ou entre duas macromoléculas (proteína-proteína ou proteína-DNA)

(ROSADO, 2010).

Ao processo de se posicionar o ligante em várias orientações no sítio ativo do receptor e, usualmente, em diferentes conformações, com o intuito de se obter a melhor interação, chama-se pela designação em inglês docking, que pode se traduzir como “docagem” ou “ancoragem”. Este procedimento permite o estabelecimento de uma classificação entre os compostos de maior e de menor afinidade a um determinado receptor (ALENCAR, 2010, p. 28).

É por complementaridade química que ocorre o reconhecimento molecular de um

ligante no sitio receptor de um alvo entre as estruturas em estudo. Este processo envolve

fatores entálpicos (energia máxima interna de um sistema) e entrópicos (energia

termodinâmica referente às reações químicas) considerando a flexibilidade do ligante e da

proteína, o efeito do ambiente proteico na distribuição de cargas do ligante, e possíveis

interações com moléculas de água presentes no meio, principalmente quando se refere ao

organismo humano (SOUZA, 2012).

De maneira macro, os softwares utilizados para o processo de docking molecular

associam dois componentes principais: algoritmo de busca e função de escore. O algoritmo

é responsável pela busca de possíveis combinações nas ligações, possibilitando a

exploração dos graus de liberdade rotacional, translacional e conformacional do ligante, bem

como das proteínas. Em seguida, a função de escore é utilizada para eleger os melhores

modos de ligação, aqueles que são mais próximos dos obtidos experimentalmente. Estas

funções de escore são obtidas de acordo com os campos de força de mecânica molecular e

parâmetros empíricos de cálculos de energia livre (VERDONK et al., 2003).

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27

Alencar (2010) ressalta que é possível, através do uso do docking molecular,

verificar qual fármaco é capaz de ajustar ao sítio ativo de um receptor tanto

geometricamente quanto quimicamente. A simulação computacional é dividida em duas

etapas: I: a busca conformacional por diferentes modos de ligação do ligante no sítio ativo

do receptor; II: a avaliação da afinidade de cada um destes modos de ligação usando uma

função de escore conforme demonstrado na Figura 11.

Figura 11: Interação entre receptor e fármaco realizada com a utilização de ferramenta de

bioinformática e que propicia o docking molecular.

Fonte: ALENCAR, Sérgio Amorim de. Utilização de ferramentas computacionais para o estudo do

impacto funcional e estrutural de nsSNPs em genes codificadores de proteínas. 2010. Tese

(Doutorado em Bioinformática) – Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,

2010. p. 28.

Através da modificação molecular, novos análogos planejados podem apresentar

perfil terapêutico superior, rota sintética viável e ainda, custo financeiro interessante

(DAMIÃO, 2014).

Dentre várias, uma das principais características no processo de docking, é a

capacidade de simular diversos modos de ligação que são observados experimentalmente

através das conformações aplicadas. Para realização deste tipo de teste, um ligante é

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28

extraído do seu complexo cristalográfico e submetido a simulações com o sítio ligante da

proteína. As ligações encontradas nessas comparações são ranqueadas conforme o escore

obtido nos testes (SILVA, 2007).

2.9 Ferramentas de Bioinformática

2.9.1 DrugBank

Drugbank é um banco de dados de anotações online que contém informações

sobre bioquímica, bioinformática e farmacologia. Esta ferramenta possibilita a análise de

drogas de forma detalhadas, informando os alvos abrangentes e informações sobre

interações medicamentosas, além de conter dados sobre o metabolismo de drogas,

absorção, distribuição, excreção, toxicidade e outros tipos de relações quantitativas

estrutura-atividade. O DrugBank é utilizado amplamente para facilitar testes in silico,

concepção de novas drogas, previsão de metabolismo da droga, previsão de interação

medicamentosa e educação farmacêutica em geral (WISHART, 2008; LAW, 2014).

O DrugBank contém 8206 tipos de drogas, incluindo 1991 medicamentos de

moléculas pequenas aprovadas pela FDA (Food and Drug Administration) e mais de 6000

drogas experimentais. Além disso, 4333 sequências de proteínas não redundantes (droga-

alvo, enzima, transportador) fazem parte destas entradas de fármacos (DrugBank, 2016).

As consultas podem ser realizadas através de texto simples, pois o banco de dados

oferece suporte à consulta de todos os elementos textuais do banco, permitindo assim que

médicos, farmacêuticos e biólogos usem a ferramenta, mesmo sem vasto conhecimento em

informática (DrugBank, 2016).

2.9.2 STRING - Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins

As proteínas podem formar uma variedade de ligações funcionais entre si, incluindo

complexos estáveis, vias metabólicas e uma enorme gama de interações reguladoras. Estas

ligações podem ser conceituadas como redes e o tamanho e a complexidade da

organização dessas redes apresentam uma oportunidade de visualização de determinado

genoma como algo além de uma coleção estática de funções genéticas distintas. O software

STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) é um banco de dados

dedicado ao tratamento dessas associações funcionais entre proteínas, que chamamos

comumente de redes (SZKLARCZYK, 2015).

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Os genes que repetidamente ocorrem nas proximidades um do outro no genoma

tendem a codificar proteínas que interagem funcionalmente. O STRING recupera de um

determinado gene consultado (nó) todos os genes associados através de informações

filogenéticas. Nas iterações subsequentes, a ferramenta repete este processo utilizando

como gene de pesquisa, os genes recuperados na iteração anterior, descobrindo desse

modo o conjunto de genes que estão indiretamente ligados ao gene dessa árvore de

interações (SNEL et al., 2000).

A rede de associações previstas para um determinado grupo de gene é composta

de nós. Os nós da rede são os genes e as arestas representam as associações funcionais

previstas. As conexões entre os nós podem ser representadas com até sete arestas de

cores diferentes, sendo que estas linhas indicam a existência dos tipos de testes utilizados

na previsão das associações, que podem ser indicar a existência de text mining (mineração

de texto), conserved neighborhood (vizinhança conservada), co-occurrence (co-ocorrência),

co-expression (co-expressão), experiments (experimentos) e databases (banco de dados)

(STRING, 2016).

As redes de interações presentes no software STRING estão cada vez mais

disseminadas em diversas áreas da biologia com o intuito de: I - aumentar o poder

estatístico de genética humana; II – auxiliar na descoberta de novas drogas; III – preencher

lacunas no conhecimento referente a enzimas metabólicas e IV – prever fenótipos e funções

dos genes (SZKLARCZYK, 2015).

Todas as informações da pesquisa são apresentadas de forma gráfica e com

informações sobre cada gene da árvore, além de uma lista informando o grau de associação

genômica. O número de ocorrência de dois genes no mesmo cluster é apresentado em uma

página que exibe apenas essa organização e destaca cada um dos genes específicos

(SNEL, 2000).

O objetivo principal do STRING é pesquisar e exibir a organização genômica

conservada de forma integral para um determinado gene pesquisado, fornecendo uma

plataforma de pesquisa e interpretação de padrões através de associações funcionais

encontradas. (SNEL, 2000).

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2.9.3 UniProt

O UniProt (Universal Protein Resource) é um dos principais recursos para

armazenar e interconectar grandes quantidades de informações, muitas vezes díspares de

sequências de proteínas e anotação funcional (THE UNIPROT CONSORTIUM, 2007).

As ferramentas utilizadas para comparação de sequências representam a

possibilidade de rápido acesso a estruturas primárias de proteínas e facilita a identificação

de regiões funcionais ou estruturalmente conservadas (SILVA, 2007).

O software é dividido em três componentes principais: base de conhecimento

(UniProtKB), repositório de sequências (UniParc) e combinação de sequenciamentos

(UniRef) (THE UNIPROT CONSORTIUM, 2007).

The UniProt Consortium (2007) ressalta que o software foi construído sobre ampla

infraestrutura bioinformática baseado na expertise do Instituto Europeu de Bioinformática

(EBI), Proteína de Informação de Recursos (PIR) e do Instituto Suíço de Bioinformática

(SIB). É de livre acesso, disponível online e de fácil utilização para pesquisadores permitindo

uma navegação interativa e customizada para análises de proteínas de interesse, facilitando

a geração de hipóteses e descoberta de conhecimento.

2.9.4 Protein BLAST

O software BLAST - Basic Local Alignment Search Tool, foi desenvolvido para

realizar buscas comparando sequências biológicas primárias, demonstrando a similaridade

e significância estatística entre as sequências informadas (LIFSCHITZ, 2007).

Ainda, conforme ressaltado por LIFSCHITZ (2007), através de heurísticas e

algoritmos de programação dinâmica, a ferramenta BLAST obtém os melhores alinhamentos

locais em uma base de dados crescente.

A busca realizada pela ferramenta BLAST identifica trechos de caracteres

pertencentes a uma sequência que são semelhantes entre a sequência informada na

consulta e as sequências cadastradas no banco de dados do software. A busca é estendida

em ambas as direções visando ampliar a região de similaridade. Para cada alinhamento

entre um trecho de caracteres é dado uma pontuação que no final corresponde a um score

para a parte da sequência considerada similar e identificado na ferramenta como e-value

(LIFSCHITZ, 2007).

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2.2.1 PDB - Protein Data Bank

O modo de acesso ao banco de dados PDB (Protein Data Bank) mudou com o

passar dos anos e o surgimento de novas tecnologias. Os bancos de dados deixaram de ser

disponíveis apenas por meios magnéticos e se tornaram acessíveis pela web (BERMAN,

2000).

O PDB é um repositório de dados de proteínas e suas estruturas tridimensionais.

Vários tipos de informações estão associados com cada entrada de arquivo PDB, incluindo

coordenadas atômicas do espaço tridimensional, sequência de polímeros e metadados.

Cabe ressaltar que o acesso a esses dados é gratuito e podem ser analisados e

visualizados usando o próprio PDB (BERMAN, 2000).

Berman (2000) enfatiza ainda que, inicialmente, o Protein Data Bank foi

estabelecido para um número restrito de usuários especialistas envolvidos com pesquisa

estrutural se estendo, nos dias atuais, a um grande número de usuários, das mais diversas

áreas e com diferentes finalidades.

2.2.2 ADT - AutoDockTools

AutoDockTools é um programa que realiza o processo de modelagem (docking) de

um ligante com o sítio receptor de uma macromolécula (proteína). Esta ferramenta que

realiza pesquisas do espaço conformacional disponível de um ligante em torno de uma

proteína com objetivo de prever as conformações de um ligante, pequeno e flexível, a um

alvo macromolecular de uma estrutura conhecida, além de verificar as energias dos ligantes

de forma rápida e precisa. É utilizado para descoberta de novos medicamentos, verificação

de encaixe molecular e triagem virtual (MORRIS et al., 2009; COSCONATI, 2010).

O docking molecular depende, basicamente, de dois métodos: I - um campo de

força para estimar a energia livre de ligação do complexo, conforme descrito na Figura 12; II

- um método de pesquisa para explorar o espaço conformacional disponível para o ligante e

o alvo (COSCONATI et al., 2010).

Conforme ressalta Alencar (2010), a parametrização dos mapas de energias

potenciais de afinidade atômica para cada átomo da molécula do ligante utilizando

bibliotecas pré-definidas é realizado no AutoGrid, presente no AutoDock. A energia da

região do sítio ativo é calculada para cada ponto da grade tridimensional. Isso ocorre

através do posicionamento de uma sonda do átomo do ligante em cada ponto e a energia de

interação entre este átomo (que está localizado em cada ponto da grade) e os átomos da

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proteína é calculada. O tempo para realização desses cálculos é proporcional, apenas, ao

número de átomos do ligante, independentemente da quantidade de átomos da proteína.

Figura 12: Mapa de potenciais de afinidade atômicos determinado no AutoDockTools

Fonte: MORRIS, GARRETT M. et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated Docking with

Selective Receptor Flexibility. Journal of computational chemistry 30.16 (2009): 2785–

2791. PMC.

2.2.3 ADV - AutoDockVina

Assim como descrito para o AutoDockTools, o AutoDockVina também é um software

para explorar os modos de interação dos ligantes com energia minimizada dentro do sítio da

enzima, utilizando uma função de classificação que considera as contribuições de energia

intra e intermolecular dos compostos e que tem como entrada arquivos na extensão PDBQT

(TROTT, 2010).

O AutoDockVina utiliza o algoritmo de Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS),

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muito parecido com método de Newton. Tal método, usa não só o valor da função de

pontuação, mas também sua variante, ou seja, as derivadas da função de pontuação em

relação aos argumentos. Os argumentos são a posição e a orientação do ligante e os

valores das torções para as ligações (TROTT, 2010).

Quanto ao aproveitamento do hardware onde o processo de docking é executado, o

AutoDockVina utiliza usando multithreading, o que permite tirar proveito do paralelismo de

hardware de memória compartilhada (TROTT, 2010).

A próxima seção discorre sobre a metodologia de pesquisa utilizada para o

desenvolvimento deste trabalho. Descreve-se o tipo de pesquisa utilizado e os métodos

para o seu desenvolvimento. Explicitam-se, ainda, as ferramentas e banco de dados

referentes a bioinformática que foram fontes para consulta de dados, alinhamento e para

verificação de interações entre os alvos e fármacos, bem como a integração desses

recursos computacionais e sua aplicabilidade.

rosan
Nota
Seria interessante falar um pouco sobre o Zinc Database que possui hoje 100 milhões de compostos.
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34

3 METODOLOGIA DA PESQUISA

3.1 Caracterização da pesquisa

A pesquisa realizada neste trabalho foi classificada como exploratória e teve como

objetivo reunir uma base conceitual a partir da leitura de artigos científicos, meta-análises,

teses e relatórios de caso publicados em português e inglês no período de 2000 a 2018,

propiciando maior familiaridade com o assunto proposto. Os descritores utilizados para a

pesquisa foram: adenocarcinoma gástrico, biomarcadores no câncer, alvos para

adenocarcinoma gástrico, diagnóstico e tratamento para adenocarcinoma gástrico.

Enquanto procedimento, este trabalho foi realizado por meio de observação indireta

quanto à observação literária e culminou-se em um levantamento documental das drogas

mais utilizadas no tratamento do adenocarcinoma gástrico em sites de entidades, tais como:

NCBI, biblioteca digital de teses e dissertações da Universidade de São Paulo (USP) e

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), INCA, GLOBOCAN, dentre outros.

3.2 Recursos computacionais

Os demais procedimentos foram realizados in silico. Tal processo estabelece o uso

de recursos computacionais como suporte para simulações de sistemas biológicos. Nos

estudos in silico, tanto os participantes (alvos e fármacos) quanto os ambientes (corpo

humano) são simulados. Nesse processo, destacam-se os sistemas utilizados: DrugBank,

Protein Data Bank, UniProt, BLAST Protein, STRING, AutoDockTools e AutoDockVina.

3.2.1 DrugBank

Após a identificação na literatura pertinente dos principais fármacos utilizados, foi

realizada uma pesquisa no banco de dados DrugBank 4.0 (http://www.drugbank.ca) que

possibilitou uma análise detalhada dos alvos e interações medicamentosas das drogas

selecionadas.

A realização da pesquisa no DrugBank ocorreu de maneira intuitiva devido a

usabilidade do sistema de banco de dados online. Ao informar o nome do fármaco

selecionado, foi identificado seus alvos (target) representados por seu respectivo código de

identificação no UniProt - Universal Protein Resource (http://www.uniprot.org/), bem como o

rosan
Nota
Um software de docking muito interessante para docking direto e dockin inverso é o LigandScout. Apesar de ser pago é possível conseguir uma licença de demonstração totalmente funcional para pesquisadores e estudantes, sem fins comerciais.
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35

identificador do próprio fármaco no UnitProt.

Neste projeto, foram mapeados apenas os alvos não complexados ou associados a

outras proteínas, os demais foram descartados.

A estrutura do arquivo que se refere ao fármaco foi encontrada nas definições do

fármaco no DrugBank, na opção PDB. Os dados foram coletados e salvos em um arquivo

texto. Após a edição do arquivo, a extensão do mesmo foi alterada de txt para pdb.

3.2.2 STRING - Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins

A partir da identificação dos alvos de cada fármaco, as redes de interações foram

mapeadas utilizando o banco de dados STRING - Search Tool for the Retrieval of Interacting

Genes/Proteins (http://string-db.org/) na versão 10.0.

Para realização da consulta, foi informado o identificador do alvo localizado no

DrugBank e aplicado um filtro selecionando a opção Homo Sapiens para que os resultados

exibidos correspondessem apenas à espécie humana.

No software foi verificada a pontuação referente a cada interação entre a proteína

pesquisada e as demais proteínas presentes na rede, permitindo assim, a classificação

destes.

Para continuidade da pesquisa, foram consideradas apenas as interações de

primeiro grau com valor de confiança acima de 0.9 (o valor de confiança no software

STRING varia entre 0 e 0.99, sendo 0.99 a confiança mais alta).

Concluída essa etapa, foi gerada uma lista de proteínas, potencialmente candidatas,

relacionadas aos fármacos para o tratamento do adenocarcinoma gástrico e construído um

mapa proteico com as proteínas identificadas.

3.2.3 UniProt

Após elencar a lista de todas as proteínas com grau de confiança acima de 0.9, foi

acessado o banco de dados UniProt (http://www.uniprot.org/) pra obtenção das sequencias

de cada uma das proteínas elencadas.

Na página inicial do UniProt foi apresentada uma área de pesquisa na qual foi

informado o identificador da proteína e realizado o download do arquivo fasta com a

sequência.

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Outra opção utilizada, foi acessando a proteína na rede de interações no STRING e

ao clicar na proteína presente na rede foi aberta uma tela que possuía o link direto para o

UniProt e o processo de download do arquivo, foi o mesmo descrito no parágrafo anterior.

A opção de download realizada foi do arquivo do tipo FASTA (canonical –

representação exclusiva em relação a outras representações), que se refere a sequência de

todos os peptídeos presentes na proteína.

3.2.4 Protein BLAST

Utilizou-se a ferramenta BLAST, que está disponível no endereço

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, para alinhamento local das sequências proteicas.

Como parâmetro para o alinhamento, o BLAST solicita, primeiramente que seja

informado o arquivo que contenha o código FASTA referente ao alvo identificado para o

fármaco. Em seguida, é necessário informar o arquivo contendo o código FASTA de todas

as proteínas que integram a rede de interações deste alvo (primeiro arquivo informado).

Para os demais parâmetros, foram utilizados os valores padrão da ferramenta.

O valor utilizado para qualificação e significância do alinhamento foi o e-value e o

score. A identidade determina a similaridade entre as sequencias comparadas e o e-value

certifica que a pontuação identificada para o score não ocorreu aleatoriamente. O e-value

corresponde a probabilidade de se obter em uma outra sequência aleatória e de composição

e tamanho idênticos, outro alinhamento com score igual ou superior ao encontrado. Logo,

quanto mais próximo de zero é o valor do e-value, mais confiável foi o resultado obtido

(LIFSCHITZ, 2010). Neste trabalho, foi utilizado o valor de corte como 10-20.

Os procedimentos descritos até aqui foram realizados para cada um dos fármacos

identificados na literatura e na rede de interação STRING; e todo o levantamento de

informações foi mantido, de forma estruturada, em planilhas eletrônicas criadas no Microsoft

Excel (Microsoft, USA) para posteriormente iniciar o docking molecular.

3.2.5 PDB – Protein Data Bank

No PDB - Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) foi obtido as

estruturas cristalográficas das proteínas no formato PDB.

As estruturas selecionadas correspondem a proteína alvo e as demais proteínas da

rede de interação que tiveram grau de confiança maior que 0.9 e score menor que 10-20 no

alinhamento local realizado no Protein BLAST.

Para obtenção das estruturas, foi utilizado o campo de pesquisa do banco de dados

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37

e informado o identificador consultado no UniProt.

Como a quantidade resultados na pesquisa para cada identificador informado foi

grande, foi necessária a utilização de filtros disponíveis. A opção utilizada foi, novamente, os

resultados referentes a Homo sapiens. Ainda assim, foi preciso verificar a nomenclatura dos

resultados buscando identificar apenas a proteína nativa, sem a presença de complexos, em

sua forma ativa ou não.

O PDB, na opção Downloads Files, permite baixar a estrutura da proteína em vários

formatos, porém o formato escolhido foi PDB, uma vez que é esta a extensão de arquivo

exigida pelo AutoDockToos e AutoDockVina para realização do processo de docking

molecular.

3.2.6 AutoDockTools e AutoDockVina

O docking molecular entre as drogas e os alvos foi realizado utilizando o

AutoDockTools, versão 4.2 e disponível no endereço http://autodock.scripps.edu/ para

download gratuito. Também foi utilizado o programa AutoDockVina versão 1.1.2 e disponível

em http://vina.scripps.edu/download.html.

O AutoDockTools foi utilizado para preparar os arquivos referente ao ligante e ao

receptor e simulação dos valores para cálculos do Grid. O AutoDockVina foi utilizado para

realização dos cálculos do Grid baseados nos valores verificados no AutoDockTools e para

realização do docking molecular, afim de verificar quais drogas apresentaram maior

afinidade com os alvos encontrados.

Para realização da análise da interação entre o fármaco e os alvos, foram mantidas

as moléculas de água (H2O) nos alvos, criando assim um ambiente mais parecido com o do

corpo humano.

Para realização de cada processo de docking são necessários dois arquivos: um

referente ao ligante (fármaco) e outro referente à proteína. Foi realizado o processo

completo de docking entre o ligante e cada um dos seus alvos presentes na rede de

interação gerada no item 3.2.2 obedecendo aos itens de exclusão detalhados no decorrer do

desenvolvimento deste trabalho.

O processo de docking molecular no software AutoDockTools envolveu quatro

etapas:

rosan
Nota
Abordagem interessante. Geralmente as moléculas de água são retiradas.
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38

3.2.6.1 Preparação dos Arquivos

Nesta etapa, foi necessário preparar os arquivos referentes ao ligante e ao

receptor. Os arquivos foram baixados, previamente, no PDB (descrito na seção 3.2.5 deste

trabalho) e selecionados conforme os critérios informados. Para estes arquivos, foi

necessário remover a parte que não codificava a proteína e as cadeias repetidas, bem como

as cargas para a realização do docking molecular.

Essas alterações foram feitas com o objetivo de gerar arquivos com a extensão

PDBQT, que se referem ao tipo de arquivo necessário para os cálculos do AutoGrid e para

realização do docking que contenha as cargas parciais e o tipo de átomo. A primeira

estrutura trabalhada foi a proteína.

Utilizando o AutoDockTools, o primeiro passo foi realizar a abertura do arquivo com

extensão PDB referente a proteína.

A proteína foi colorida de amarelo (Figura 13) com o objetivo de diferenciá-la do

ligante, quando este for aberto no software.

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39

Figura 13: Alteração da cor da macromolécula para melhor identificação da mesma após o

docking molecular.

Fonte: dados da pesquisa (2017).

Em seguida, foi realizada a exclusão das cadeias repetidas e adicionada as

moléculas de hidrogênio polares.

Foi necessário, adicionar também, as cargas de todos os átomos presentes na

estrutura para que fosse possível a realização da ancoragem entre a proteína e o ligante.

Isso foi feito utilizando o recurso Compute Gasteiger e Assign AD4 type.

Após essas alterações, o arquivo foi escrito com os parâmetros referentes na

extensão PDBQT na opção Write PDBQT.

Feita a preparação da proteína, o ligante foi aberto utilizando no mesmo software e

gravado na extensão PDQT na opção Save as PDBQT.

A preparação dos arquivos foi realizada para cada arquivo com a extensão PDB

que fez parte do processo de docagem. Para melhor aproveitamento de recursos e tempo,

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40

tal processo foi realizado aos pares. Iniciando com o arquivo referente à proteína alvo e na

sequência, o ligante.

3.2.6.2 Cálculos do AutoGrid

A segunda etapa realizada para o processo de docking molecular foi a

parametrização para realização dos cálculos através do AutoGrid. Esta etapa foi simulada

utilizando a ferramenta AutoDockTools.

Com o arquivo do ligante e da proteína abertos e já parametrizados, o AutoGrid foi

iniciado no AutoDockTools utilizando o menu Grid e selecionando o identificador da

macromolécula que em seguida foi salva na extensão PDBQT.

Na sequência, foi definido o espaço tridimensional de procura dentro do qual o

ligante tenta ligar-se à estrutura da proteína (Figura 14). Este espaço foi definido para

englobar toda a zona catalítica da molécula. O espaço não pode ocupar uma área muito

maior que o tamanho da molécula, pois neste caso, o docking poderia não encontrar, dentro

da área de procura, as zonas de ligação. O valor definido nas opções do Grid Box para as

coordenadas x, y e z dependeu do tamanho da molécula apresentada, seguindo as

definições informadas sobre a o espaço tridimensional.

Esses valores foram anotados em um arquivo de configurações para ser utilizado

no processo de docking no software AutoDockVina (Figura 15).

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41

Figura 14: Demonstração do espaço tridimensional delimitado para a macromolécula. Os

parâmetros são visualizados na sobreposição de telas.

Fonte: dados da pesquisa (2017).

Figura 15: Arquivo de configurações utilizado para realização do processo de docking no

AutoDockVina

Fonte: dados da pesquisa (2017).

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42

3.2.6.3 Docking molecular

Os processos da terceira etapa foram realizados no software AutoDockVina.

Como seria necessária a execução deste processo repetidas vezes e com tempo

desconhecido, foi criada uma rotina para a execução automática conforme arquivos

configurados para tal função.

Foram usados os arquivos preparados na seção 3.2.6.1 referente a proteína e ao

ligante e o arquivo com os parâmetros do grid preparado na seção anterior.

Além desses, foi criado um arquivo com o nome de todas as proteínas separadas

por vírgula e um arquivo com a extensão bat para execução autônoma dos cálculos do grid

e do docking molecular.

O arquivo com a extensão bat (executarDocking.bat) faz a leitura do arquivo com a

listagem das proteínas (listaProteínas.txt) e executa o programa AutoDockVina passando

como parâmetro para execução o nome da proteína que se refere ao nome do arquivo com

os parâmetros para os cálculos do Grid, no qual contém a informação do nome do arquivo

com os dados do ligante e da proteína, ambos na extensão PDBQT. Como saída, é definido

um arquivo de log no qual serão informados os valores encontrados no docking. Tal arquivo

tem o nome da proteína seguido da extensão txt.

Após ter todos os arquivos de proteínas e ligante preparados e para cada par

desse, o arquivo com os dados do Grid parametrizados, o arquivo com extensão bat foi

executado.

3.2.6.4 Análise de resultados

Para analisar os resultados, o arquivo de log gerado na seção anterior foi aberto, e

uma tabela com as forças de ligação referente a afinidade de cada ligante com seu

respectivo receptor, analisada.

3.3 Organização da Pesquisa

Para melhor observação, os conhecimentos envolvidos neste processo

metodológico estão descritos na Figura 16 levando em consideração o caminho percorrido

para cada fármaco identificado na literatura.

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43

Figura 16: Metodologia utilizada no desenvolvimento deste trabalho desde a obtenção dos

fármacos até a realização do processo de docking molecular entre o fármaco e

seus respectivos alvos

Fonte: dados da pesquisa (2017).

Neste trabalho, optou-se por realizar o processo completo para cada par

encontrado em relação ao fármaco: alvo e ligante. Para o fármaco que foi identificado mais

de um alvo, foi realizado o processo completo entre o ligante e cada um dos alvos

identificados.

Para cada par de arquivos processados os dados foram mantidos em pastas

identificadas pelo nome do fármaco para não causar confusão no processo como um todo.

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3.4 Contribuições da Pesquisa

A principal contribuição desta pesquisa é apresentar uma melhor compreensão

sobre o adenocarcinoma gástrico ao avaliar os fármacos utilizados no tratamento e fazer

um comparativo entre eles utilizando ferramentas disponíveis na bioinformática

A seção a seguir, demonstra os resultados encontrados ao aplicar a metodologia

aqui apresentada. A distribuição dos resultados foi realizada, baseado na ordem de

aplicação da metodologia descrita, buscando atender aos objetivos propostos.

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4 RESULTADOS

4.1 Seleção dos fármacos mais utilizadas no processo quimioterápico do

adenocarcinoma gástrico

Após a leitura de artigos e meta análises sobre o tratamento do adenocarcinoma

gástrico, bem como os fármacos mais utilizados nesse processo, foi observado

criteriosamente, que os fármacos que estão em maior evidência no tratamento são:

Fluorouracil, Docetaxel e Cisplatina.

4.2 Alvos dos fármacos

A partir dos fármacos selecionados, a pesquisa realizada no DrugBank apresentou

os alvos e foram selecionados àqueles que identificam a proteína no organismo humano

(Quadro 4):

Quadro 4: Relação entre fármacos e alvos identificados no DrugBank.

Fármaco Identificador Proteínas-alvo

Fluorouracil P04818 Thymidylate synthase

Docetaxel Q9H4B7 Tubulin beta-1 chain

P10415 Apoptosis regulator Bcl-2

P11137 Microtubule-associated protein 2

P27816 Microtubule-associated protein 4

P10636 Microtubule-associated protein tau

O75469 Nuclear receptor subfamily 1 group I member 2

Cisplatina - -

Fonte: dados da pesquisa (2017).

O número de cada alvo refere-se ao identificador do fármaco utilizado no banco de

dados UniProt que também é reconhecido ao realizar a pesquisa no PDB.

O processo de pesquisa e testes com o fármaco Cisplatina foi finalizado no

DrugBank, pois o mesmo não retornou proteínas como alvos, apenas o DNA e o RNA e,

rosan
Nota
Não tem alvo para a cisplatina?
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conforme ressaltado por SANTOS (2006), PERES et al. (2013) e (PUC-RIO, 2017), a

atuação biológica da cisplatina está relacionada com o DNA e o RNA. No DNA, age inibindo

sua replicação. Enquanto no RNA, ocorre o bloqueio da replicação da polimerase II (agente

reparador do DNA) no processo de transcrição. Esse processo, tanto no DNA quanto no

RNA desencadeia a apoptose (morte das células).

No Quadro 5 é possível visualizar a relação entre o identificador da proteína no

DrugBank e no PDB, bem como os alvos descartados por estarem complexados com outras

proteínas. A informação quanto a complexidade da proteína foi coletada no PDB (Protein

Data Bank).

Quadro 5: Relação entre fármacos e alvos identificados no DrugBank com respectivo

identificador no PDB

Identificador da

estrutura do fármaco

no DrugBank

Identificador

do alvo

STRING

Descrição

P04818 TYMS Thymidylate synthase

Q9H4B7 TUBB1 Tubulin beta-1 chain

P10415 BCL2 Apoptosis regulator Bcl-2

P11137 Descartado Microtubule-associated protein 2

P27816 Descartado Microtubule-associated protein 4

P10636 Descartado Microtubule-associated protein tau

O75469 Descartado Nuclear receptor subfamily 1 group I member 2

Fonte: dados da pesquisa (2017).

4.3 Mapeamento das interações entre as proteínas

A rede de interação foi gerada utilizando o software STRING. Nesse sistema, cada

nó presente na rede de interações representa todas as proteínas produzidas por um único

locus do gene que codifica a proteína da qual é conhecida ou prevista na estrutura 3D

(STRING, 2017).

As proteínas (nós) apresentados em vermelho identificam interações de primeiro

nível enquanto os demais nós, outros níveis de interação (STRING, 2017).

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47

As associações (arestas) são destinadas a ser específicas e significativas, isto é, as

proteínas contribuem conjuntamente para uma função compartilhada e isso não significa,

necessariamente, que elas estejam fisicamente ligadas uma as outras (STRING, 2017).

A seguir, são apresentadas as redes de interações de cada gene, bem como o

score definido para cada um dos genes presente na rede.

Para cada rede de interação, foram selecionados apenas as proteínas que

possuem grau de confiabilidade maior que 0.9, conforme descrito na metodologia desta

pesquisa. A sequência de imagens e quadros corresponde a mesma sequência apresentada

no Quadro 5, que demonstra a relação entre fármacos e alvos.

A Figura 17 e o Quadro 6 correspondem à rede de interação da proteína TYMS e

as proteínas presentes nessa rede, bem como o grau de confiança de cada um conforme o

software STRING.

Figura 17: Rede de interações da proteína TYMS (Thymidylate synthase) que é alvo do

fármaco Fluorouracil.

Fonte: STRING - Known and Predicted Protein-Protein Interactions (2017).

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Quadro 6: Proteínas presentes na rede de interação da proteína TYMS e o grau de

confiança correspondente.

Proteína Descrição Grau de

Confiança

DHFR Dihydrofolate reductase 0.999

DUT Deoxyuridine triphosphatase 0.997

DTYMK Deoxythymidylate kinase (thymidylate kinase) 0.994

DCTD dCMP deaminase 0.992

DHFRL1 Dihydrofolate reductase-like 1 0.992

SHMT1 Serine hydroxymethyltransferase 1 (soluble) 0.990

MTHFD1 Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+ dependent) 1 0.988

FPGS Folylpolyglutamate synthase 0.987

TK1 Thymidine kinase 1 0.986

RRM2 Ribonucleotide reductase M2 0.984

Fonte: STRING - Known and Predicted Protein-Protein Interactions (2017).

A Figura 18 e o Quadro 7 correspondem à rede de interação da proteína TUBB1 e

as proteínas presentes nessa rede, bem como o grau de confiança de cada um conforme o

software STRING.

Figura 18: Rede de interações da proteína TUBB1 (Tubulin beta-1 chain) que é alvo do

fármaco Docetaxel.

Fonte: STRING - Known and Predicted Protein-Protein Interactions (2017).

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Quadro 7: Genes presentes na rede de interação da proteína TUBB1 e o grau de confiança

correspondente

Proteína Descrição Grau de Confiança

TUBA1B Tubulin, alpha 1b 0.989

TUBA1C Tubulin, alpha 1c 0.987

TUBA1A Tubulin, alpha 1a 0.985

TUBA3E Tubulin, alpha 3e 0.985

TUBA4A Tubulin, alpha 4a 0.985

TUBA8 Tubulin, alpha 8 0.985

TUBAL3 Tubulin, alpha-like 3 0.985

TBCA Tubulin folding cofactor A 0.975

TUBA3C Tubulin, alpha 3c 0.971

TBCD Tubulin folding cofactor D 0.971

Fonte: STRING - Known and Predicted Protein-Protein Interactions (2017).

A Figura 19 e o Quadro 8 correspondem à rede de interação da proteína BLC2 e as

proteínas presentes nessa rede, bem como o grau de confiança de cada um conforme o

software STRING.

Figura 19: Rede de interações da proteína BCL2 (Apoptosis regulator Bcl-2) que é alvo do

fármaco Docetaxel.

Fonte: STRING - Known and Predicted Protein-Protein Interactions (2017).

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50

Quadro 8: Genes presentes na rede de interação do gene BCL2 e o grau de confiança

correspondente

Proteína Descrição Grau de Confiança

BCL2L11 BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) 0.999

TP53 Tumor protein p53 0.998

APAF1 Apoptotic peptidase activating factor 1 0.998

CYCS Cytochrome c, somatic 0.995

MYC V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) 0.995

MAPK8 Mitogen-activated protein kinase 8 0.994

AKT1 V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 0.994

PMAIP1 Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 0.992

BBC3 BCL2 binding component 3 0.991

MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 0.990

Fonte: STRING - Known and Predicted Protein-Protein Interactions (2017).

4.4 Identidade das Proteínas

Utilizando o software Protein BLAST, foi realizado o alinhamento local das

sequências de cada alvo identificado e da sua rede de interação, buscando a similaridade

entre eles.

Cabe ressaltar que para o desenvolvimento deste trabalho, o alinhamento não tem

objetivo filogenético, não busca encontrar homólogos, parólogos ou ortólogos, apenas a

similaridade entre os genes que compõe as redes de interações.

Foi executado o alinhamento entre as proteínas DHFR, DUT, DTYMK, DCTD,

DHFRL1, SHMT1, MTHFD1, FPGS, TK1 e RRM2 que compõem a rede da proteína TYMS

que é alvo do fármaco Fluorouracil.

Para estes, foi encontrado o resultado demonstrado na Tabela 9 e como dito, o

parâmetro avaliado no alinhamento foi o e-value.

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51

Tabela 9: Sequências que produziram alinhamentos significativos realizados no software

Protein BLAST com as sequências da rede de interação da proteína TYMS e o

fármaco Fluorouracil

Identificador

no BLAST

Identificador no

UniProt e STRING Proteína TYMS Score e-value Ident.

P11586 MTHFD1 C-1-tetrahydrofolate synthase 19.6 1.2 24%

Q86XF0 DHFR2 Dihydrofolate reductase 2 35.8 2.6 32%

Q05932 FGPS Folylpolyglutamate synthase 35 4.9 32%

P00374 DHFR Dihydrofolate reductase 17.3 5.3 36%

Fonte: Adaptado de BLAST - Tool. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).

Na sequência, foi executado o alinhamento entre as proteínas TUBA1B, TUBA1C,

TUBA1A, TUBA3E, TUBA4A, TUBA8, TUBA1C, TUBAL3, TBCA, TUBA3C, TBCD que

compõem a rede do gene TUBB1 que é alvo do fármaco Docetaxel. Os dados referentes a

este alinhamento constam na Tabela 10.

Tabela 10: Sequências que produziram alinhamentos significativos realizados no software

Protein BLAST com as sequências da rede de interação da proteína TUBB1 e o

fármaco Docetaxel

Identificador

no BLAST

Identificador no

UniProt e STRING Proteína TUBB1 Score e-value Ident.

P68363 TUBA1B Tubulin alpha-1B chain

342 1.0 e-117 40%

P68366 TUBA4A Tubulin alpha-4A chain

342 3.0 e-117 40%

Q9NY65 TUBA8 Tubulin alpha-8 chain

342 3.0 e-117 40%

Q9BQE3 TUBA1C Tubulin alpha-1C chain 340 8.0 e-116 40%

Q71U36 TUBA1A Tubulin alpha-1A chain

340 2.0 e-116 40%

Q13748 TUBA3C Tubulin alpha-3C/D chain 339 3.0 e-116 40%

Q6PEY2 TUBA3E Tubulin alpha-3E chain 332 1.0 e-113 40%

A6NHL2 TUBAL3 Tubulin alpha chain-like 3 327 1.0 e-111 39%

Q9BTW9 TBCD Tubulin-specific chaperone D 62 0.26 33%

Fonte: Adaptado de BLAST - Tool. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).

Ainda trabalhando com os alvos do docetaxel, foi executado o alinhamento entre as

proteínas BCL2L11, TP53, APAF1, CYCS, MYC, MAPK8, AKT1, PMAIP1, BBC3 e MAPK1

rosan
Nota
Identidade próxima do ponto de corte de 40%.
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52

que compõem a rede do gene BCL2. Os dados referentes a este alinhamento constam na

Tabela 11.

Tabela 11: Sequências que produziram alinhamentos significativos realizados no software

Protein BLAST com as sequências da rede de interação da proteína BCL2 e o

fármaco Docetaxel

Identificador

no BLAST

Identificador no

UniProt e STRING Proteína BCL2 Score e-value Ident.

O43521 BCL2L11 Bcl-2-like protein 11 18.1 2.2

50%

P04637 TP53 Cellular tumor antigen p53 16.5 5.4 56%

Fonte: Adaptado de BLAST - Tool. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).

Como dito na seção 3.2.5, o score representa a fidelidade do alinhamento realizado

e é certificado pelo valor do e-value. Este valor mede a probabilidade do alinhamento ter

ocorrido ao acaso. Quando o valor para o e-value é zero (0.0), isso significa que a

possibilidade de ocorrer outro alinhamento conforme o encontrado é nula, ou seja, quanto

mais próximo de zero for o valor do score, maior confiabilidade possui o resultado

encontrado. Considera-se um alinhamento significativo quando o e-value é menor que 10-20

(LIFSCHITZ, 2010; NCBI, 2017).

4.5 Estruturas Cristalográficas

No Protein Data Bank foi realizado o download das estruturas cristalográficas

apenas das proteínas que corresponderam aos parâmetros definidos na metodologia para a

rede de interação e para o alinhamento.

A pesquisa foi realizada para as seguintes proteínas: P04818, Q9H4B7, P68363,

Q9BQE3, Q71U36, Q6PEY2, P68366, Q9NY65, A6NHL2, Q13748 e P01045. Porém a

estrutura cristalográfica para a espécie Homo Sapiens foi encontrada apenas para as

proteínas: P04818, P68363, Q71U36 e P01045. Para as demais, não foram encontrados

resultados compatíveis (Figura 20).

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Figura 20: Resultados para as proteínas referentes a espécie humana não encontradas no

Protein Data Bank.

Fonte: PDB – Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/protein/Q9H4B7) (2017).

4.6 Simulação computacional entre os fármacos e alvos

O processo de docking molecular evidencia a predição de afinidade de ligação e o

modo de ligação da estrutura do ligante no sítio ativo do receptor. Existem atualmente

poucos estudos comparativos entre modos de ligação de ligantes em complexos

cristalizados e modos de ligação preditos pelo método de docking molecular (ALENCAR,

2010).

Para a realização deste processo, foram utilizados apenas os genes que obtiveram

e-value menor que 10-20 no alinhamento realizado no BLAST.

Considerando tais informações, a rede de interações do gene TYMS foi descartada

sendo utilizado para realização do docking apenas o próprio gene (TYMS) que é alvo do

fármaco Fluorouracil (Quadro 13).

Como explicado na seção 4.2, a Cisplatina também não participou do processo de

docking (Quadro 12).

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54

Quadro 12: Relação entre o fármaco, seus alvos, as proteínas que compõe a rede de

interação de cada alvo e o status do processo de docking para os fármacos

Cisplatina e Fluorouracil

Fármaco Alvo Rede de

Interações PDB UniProt

Docking Realizado

Observação

Cisplatina DNA e RNA - - - Não Induz apoptose

Fluorouracil

TYMS - 1HZW P04818 Sim Docking executado

TYMS

DHFR - - Não

Descartado no alinhamento

DUT - - Não

Descartado no alinhamento

DTYMK - - Não

Descartado no alinhamento

DCTD - - Não

Descartado no alinhamento

DHFRL1 - - Não

Descartado no alinhamento

SHMT1 - - Não

Descartado no alinhamento

MTHFD1 - - Não

Descartado no alinhamento

FPGS - - Não

Descartado no alinhamento

TK1 - - Não

Descartado no alinhamento

RRM2 - - Não

Descartado no alinhamento

Fonte: dados da pesquisa (2017).

Na rede de interações do gene TUBB1, o docking deveria ser realizado para os

genes TUBA1B, TUBA1C, TUBA1A, TUBA3E, TUBA4A, TUBA8, TUBA1C, TUBAL3, TBCA,

TUBA3C e TBCD. Porém, conforme alinhamento realizado, as proteínas candidatas a

realização do docking seriam: TUBA1B, TUBA1C, TUBA1A, TUBA3E, TUBA4A, TUBA8,

TUBA1C, TUBAL3, TBCA e TUBA3C, mas as proteínas TUBA1C, TUBA3E, TUBA4A,

TUBA8, TUBAL3 e TUBA3C não estavam disponíveis no PDB (Quadro 13).

E por fim, a rede de interação da proteína BCL2 também não apresentou

candidatas para a realização do docking. Sendo a própria proteína (BCL2), a única elencada

para realização do docking molecular (Quadro 14).

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55

Quadro 13: Relação entre o fármaco, seus alvos, as proteínas que compõe a rede de

interação de cada alvo e o status do processo de docking para o fármaco

Docetaxel

Fármaco Alvo Rede de

Interações PDB UniProt

Docking Realizado

Observação

Docetaxel

TUBB1 - 2FV7 Q9H4B7 Não Arquivo PDB não disponível

TUBB1

TUBA1B 5IJ0 P68363 Sim Docking executado

TUBA1C - Q9BQE3 Não Arquivo PDB não disponível

TUBA1A 5JCO Q71U36 Sim Docking executado

TUBA3E - Q6PEY2 Não Arquivo PDB não disponível

TUBA4A - P68366 Não Arquivo PDB não disponível

TUBA8 - Q9NY65 Não Arquivo PDB não disponível

TUBAL3 - A6NHL2 Não Arquivo PDB não disponível

TBCA - - Não Descartado no alinhamento

TUBA3C - Q13748 Não Arquivo PDB não disponível

TBCD - - Não Descartado no alinhamento

BCL2 - 1G5M P01045 Sim Docking executado

BCL2

BCL2L11 - - Não Descartado no alinhamento

TP53 - - Não Descartado no alinhamento

APAF1 - - Não Descartado no alinhamento

CYCS - - Não Descartado no alinhamento

MYC - - Não Descartado no alinhamento

MAPK8 - - Não Descartado no alinhamento

AKT1 - - Não Descartado no alinhamento

PMAIP1 - - Não Descartado no alinhamento

BBC3 - - Não Descartado no alinhamento

MAPK1 - - Não Descartado no alinhamento

Fonte: dados da pesquisa (2017).

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56

Considerando os resultados apresentados, verifica-se que o docking molecular foi

realizado apenas para as proteínas 1HZW que é alvo do fármaco Fluorouracil e 5IJ0, 5JCO

e 1G5M que são alvos do fármaco Docetaxel e os resultados podem ser observados nas

Tabelas 14, 15, 16 e 17.

Tabela 14: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Fluorouracil e seu

alvo Thymidylate synthase (1HZW / TYMS).

Mode Affinity (kcal/mol) Dist from

Rmsb l.b. rmsb u.b

1 -4.2 0 0

2 -4.1 27.583 28.487

3 -4.1 2.558 2.869

4 -4.0 23.585 24.675

5 -4.0 26.920 28.135

6 -3.9 25.198 25.849

7 -3.8 22.596 22.826

8 -3.8 11.833 12.749

9 -3.8 27.040 27.665

Fonte: dados da pesquisa (2017).

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Tabela 15: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Docetaxel e a

proteína Cryo EM density of microtubule assembled from human TUBB3 (5IJ0 /

TUBA1B) presente na rede de interações do alvo TUBB1.

Mode Affinity (kcal/mol) Dist from

RMSD l.b. RMSD u.b

1 0.0 0.000 0.000

2 0.0 11.803 15.219

3 0.0 11.048 16.074

4 0.0 22.822 28.686

5 0.0 20.364 23.600

6 0.0 11.293 16.429

7 0.0 15.979 20.006

8 0.0 18.704 23.097

9 0.0 5.269 10.597

Fonte: dados da pesquisa (2017).

Tabela 16: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Docetaxel e a

proteína Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal human

tubulin (5JCO / TUBA1A) presente na rede de interações do alvo TUBB1.

Mode Affinity (kcal/mol) Dist from

RMSD l.b. RMSD u.b

1 -12.5 0.000 0.000

2 -12.0 1.324 2.965

3 -11.9 5.072 12.896

4 -11.6 2.315 3.523

5 -11.1 4.687 13.297

6 -11.0 54.108 56.724

7 -10.8 4.882 13.804

8 -10.8 55.179 58.262

9 -10.8 93.421 99.150

Fonte: dados da pesquisa (2017).

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Tabela 17: Resultado do processo de docking molecular entre o fármaco Docetaxel e a

proteína alvo HUMAN BCL-2, ISOFORM 1 (1G5M / BCL2).

Mode Affinity (kcal/mol) Dist from

RMSD l.b. RMSD u.b

1 -8.8 0.000 0.000

2 -8.4 14.232 19.223

3 -8.3 20.435 23.745

4 -8.3 1.510 3.165

5 -8.3 20.419 24.366

6 -8.2 14.751 20.683

7 -8.1 20.415 22.656

8 -8.0 18.959 25.616

9 -8.0 20.440 22.951

Fonte: dados da pesquisa (2017).

Tabela 18: Melhores resultados apresentados no processo de docking molecular entre o

fármaco e seus respectivos alvos.

Fármaco Alvo Affinity RMSD l.b. RMSD u.b.

Docetaxel TUBA1A -12,5 0 0

BCL2 -8,8 0 0

Fluorouracil TYMS -4,2 0 0

Fonte: dados da pesquisa (2017).

A seção a seguir discute os alvos selecionados para verificar se os resultados

obtidos no processo de docking molecular contemplam a base teórica selecionada para o

estudo, a metodologia adotada e a hipótese básica orientadora do estudo: entre os fármacos

disponíveis no mercado e utilizados para o tratamento de adenocarcinoma gástrico, alguns

apresentam maior número de alvos no tratamento

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5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS APRESENTADOS

Observou-se no presente estudo que dentre os resultados apresentados, destaca-

se a proteína TUBA1A, identificada na rede de interações do alvo TUBB1, alvo do fármaco

Docetaxel.

A proteína TUBA1A não estava presente como alvo definido no banco de

dados DrugBank para o fármaco Docetaxel, porém apresentou melhor afinidade dentre os

alvos selecionados.TUBA1A apresentou afinidade de ligação de -12.5 kcal/mol e RMSD de

0 angstrons (Tabela 18).

A pose do ligante é selecionada baseada em cálculos que são classificados

conforme score de encaixe que representa a afinidade da ligação entre o alvo e o receptor e

é expresso em kcal/mol (Lee et al, 2012). Outro parâmetro relevante para análise é o RMSD

(root mean square deviation) que identifica o limite superior e inferior das conformações

realizadas e é expresso em ångström (Å) (TROTT, 2010; QUIROGA, 2016). Para o RMSD,

o valor de tolerância respeitado é no máximo 2 ångströms (Lee et al, 2010).

A afinidade (affinity) da conformação apresenta a energia de ligação entre o

receptor e o ligante e como padrão, atribui-se a este parâmetro significância para valores

inferiores a -6 (seis negativos) kcal/mol (SHITYAKOV; FORSTER, 2010). E Raschka

(2014) deixa claro que os valores para a afinidade no processo de docking molecular são

favoráveis apenas quando representado negativamente, ou seja, quando menor for o valor,

mais significância ele apresentará à ligação encontrada.

Gravalos e Jimeno (2008) afirmam que o câncer gástrico é a segunda principal

causa de morte no mundo e o tratamento para o mesmo evoluiu pouco, sendo necessário

mais estudos sobre alvos que auxiliem no tratamento e prognóstico da doença. Greten e

Karin (2004), investigando a via IKK (I kappa β kinase) / NF-kappaβ (Nuclear factor-kappa B)

no tratamento do câncer relataram a importância de se avaliar melhores alvos e estratégias

terapêuticas.

A proteína alvo TUBA1A, que apresentou afinidade significante, é uma isoforma da

tubulina (Tabaczar, 2010), presente na rede de interações do alvo TUBB1. Tabaczar (2010)

afirma que o fármaco Docetaxel é caracterizado por uma maior afinidade para realizar

ligações com tubulinas, ou seja, atua principalmente em microtúbulos (α-tubulina e β-

tubulina).

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Segundo Sun et al (207), as tubulinas TUBB1, TUBA1A e TUBA4A são alvos

conhecidos no tratamento de linfoma, câncer testicular, de mama, coriocarcinoma e

leucemia com terapia baseada nos fármacos Vinblastine sulfate e Vincristine sulfate. Este

estudo, no entanto, ressalta a relevância da proteína alvo TUBA1A no tratamento do

adenocarcinoma gástrico baseado em terapia com o fármaco Docetaxel.

Ainda para o fármaco Docetaxel, outro alvo apresentado no DrugBank e que

apresentou valores significativos de afinidade no processo de docking molecular foi a

proteína BCL2 (Apoptosis regulator Bcl-2). A proteína apresentou valor de afinidade de

ligação de -8.8 kcal/mol e RMSD de 0 angstrons (Tabela 18).

Vários membros pro-apoptóticos e anti-apoptóticos da família BCL2 possuem

interação direta com as tubulinas (KNIPLING; WOLFF, 2006), visto que a tubulina TUBB1

também foi um alvo identificado no DrugBank para o fármaco Docetaxel, porém, para esta

proteína o docking não foi realizado pela indisponibilidade do arquivo PDB no banco de

dados.

Ainda segundo Knipling e Wolff (2006), tais associações diretas com as tubulinas

são o mecanismo regulatório para a apoptose resultante de distúrbios na função de

microtúbulos, embora não se descarte outras vias.

A rede de interações entre as proteínas da família BCL2 (Figura 19) pró e anti-

apoptótica rege a regra da resposta apoptótica mitocondrial, permitindo uma resposta rápida

a estímulos específicos, evitando a morte celular indesejada durante o funcionamento

celular normal. A complexidade dessa rede de interações é tão grande que ainda apresenta

desafios distintos na elucidação dos papéis exatos de cada uma das proteínas presentes na

família BCL2 e que agem na regulação da apoptose em diferentes tipos de câncer, mas

também sugere que pode haver um alto grau de especificidade para as modalidades

terapêuticas quando direcionadas diretamente a essas proteínas (HATA et al, 2015).

Corroborando com o descrito, David (2010), Hata et al (2015) e Ogura (2016)

afirmam que a capacidade das células cancerosas para suprimirem a apoptose é crítica

para a carcinogênese e que a proteína BCL2, é um importante regulador da apoptose. Nas

células cancerígenas há expressão anormal dessa proteína que protege as células

cancerosas da apoptose induzida pelo processo quimioterápico, tornando as células

cancerígenas resistentes à quimioterapia.

Para o fármaco Fluorouracil, o alvo que apresentou os melhores valores no

processo de docking molecular foi a proteína TYMS. Os modos de ligação e afinidade entre

o fármaco Fluorouracil e o alvo Thymidylate synthase (Tabela 14), apresentaram afinidade

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relevante expressa nos parâmetros RMSD e Affinity. Afinidade de -4.2 kcal/mol e RMSD de

0 angstrons (Tabela 18).

Conforme apresentada a proteína alvo TYMS, Lecomte et al (2004) e Gotanda et al

(2013) ressaltam que a expressão de Thymidylate synthase prevê resposta quimioterápica

ao Fluorouracil e a expressão é determinada pelo promotor do gene TYMS.

A proteína alvo identificada TYMS (Thymidylate Synthetase) suprime o crescimento

e leva à morte celular. Devido a esta função, a TYMS tem sido um dos principais objetivos

das drogas anticancerígenas nos últimos 50 anos e o fármaco Fluorouracil (5-FU), que age

como inibidor da TYMS, tem sido utilizado para induzir regressão temporária de tumores e

melhorar a sobrevida, principalmente para canceres do trato gastrointestinal (GOTANDA,

2013).

Shebzukhov et al (2005) afirma que a Thymidylate Synthetase, enzima crítica para

a síntese de DNA e alvo para quimioterapia, foi recentemente caracterizada como um

oncogene e um alvo potencial para imunoterapia específica.

A TYMS pode servir como um biomarcador serológico útil para monitorar o curso da

doença e o tratamento em pacientes com câncer (Shebzukhov, 2005).

Jaghoori; Bleijlevens; Olabarriaga (2016) relataram que as tecnologias de

computação em larga escala permitem o rastreio virtual de alto rendimento envolvendo de

milhares a milhões de candidatos a medicamentos e alvos. E Lee et al (2012) ressaltaram

que quando a estrutura de um alvo de proteína está disponível, o docking molecular é uma

escolha típica para prever a conformação de uma determinada molécula pequena ao alvo.

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6 CONCLUSÃO

A metodologia aplicada permitiu identificar, dentre os alvos encontrados no

DrugBank e na rede de interações gerada no software STRING, os alvos que apresentaram

maior afinidade com o fármaco. Sendo eles: TYMS para o fármaco Fluorouracil e TUBA1A e

BCL2 para o fármaco Docetaxel.

As proteínas alvo com melhor afinidade no tratamento do adenocarcinoma gástrico

possuem uma forte influência no desenvolvimento e evolução dos mecanismos de

tratamento, podendo ser utilizados como parâmetro para estudos experimentais.

A análise realizada permitiu identificar forte interação entre as proteínas e seu

respectivo fármaco no tratamento de adenocarcinoma gástrico, sendo a proteína TUBA1A, o

alvo a apresentar-se com os melhores valores de afinidade, tornando-se o melhor candidato

na predição para o fármaco Docetaxel.

Cabe ressaltar que para o primor da pesquisa realizada, deve-se realizar mais

estudos em relação aos alvos cuja estruturas cristalográficas ainda não estão disponíveis no

Protein Data Bank e para as quais não foi realizado o processo de docking molecular.

Os resultados identificados no presente trabalho reforçam que a bioinformática

oferece excelente direcionamento na busca e validação de alvos no tratamento das mais

diversas enfermidades, pois se apresentada como ponto de partida para aprimorar os

conhecimentos que envolvam interações entre proteína-fármaco. A bioinformática também

promove redução de custos e tempo quando comparada aos métodos tradicionais de

pesquisa que não aplicam estas ferramentas, tampouco esse tipo de conhecimento.

A proteína TUBA1A foi identificada utilizando tais recursos, o que deixa evidente a

importância das técnicas apresentadas para que tratamentos que envolvam processos

quimioterápicos deixem de ser tão invasivos e tenham seus efeitos colaterais minimizados,

tornando-se cada vez mais direcionados a essas proteínas alvo.

Contudo, os processos aqui demonstrados utilizando as ferramentas de

bioinformática não descartam testes in vitro e in vivo. O alvo identificado, TUBA1A, que não

consta na base de dados DrugBank, é um alvo candidato com maior significância e para

confirmação da sua efetiva predição ao fármaco, é necessária ampla pesquisa.

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