DOMINGOS, CátiaDOMINGOS, Cátia11; FARINHA, Diogo; FARINHA, Diogo22; FERREIRA, Mariana; FERREIRA, Mariana33; LAMY, Ana; LAMY, Ana11; CABRAL, Guadalupe; CABRAL, Guadalupe44; SILVA, Zélia; SILVA, Zélia44

11Escola Secundária da Amadora, Escola Secundária da Amadora, 22Colégio Sagrado Coração de Maria; Colégio Sagrado Coração de Maria; 33Escola Secundária José Gomes Ferreira; Escola Secundária José Gomes Ferreira; 44Universidade Nova de Lisboa , Centro de Estudos de Doenças Crónicas – CEDOC – Faculdade de Ciências MédicasUniversidade Nova de Lisboa , Centro de Estudos de Doenças Crónicas – CEDOC – Faculdade de Ciências Médicas

PROCEDIMENTO

1- ISOLAMENTO DE MONÓCITOS A PARTIR DE SANGUE PARA OBTENÇÃO DE DCs

MONITORIZAÇÃO DO ISOLAMENTO - RESULTADOS EXPERIMENTAISMétodo Utilizado – Citometria de Fluxo – Fenotipagem das DCs

Na última década, têm-se realizado inúmeros estudos na tentativa de manipular o sistema imunitário com o objectivo de produzir vacinas celulares para usar como terapia.

Neste sentido, tem-se estudado o potencial de um tipo de células do sistema imunitário – as Células Dendríticas (DCs, dendritic cells). As DCs são células com longas extensões membranares que têm elevada capacidade fagocítica no estado imaturo e capacidade profissional de apresentação de antigénios processados aos linfócitos T. A activação destes linfócitos é, por sua vez, essencial para uma resposta eficaz contra organismos invasores ou contra células cancerígenas.

O processo de produção de células dendríticas para utilizar em imunoterapia envolve o isolamento de monócitos do sangue periférico e sua diferenciação in vitro em células dendríticas. Estas células são designadas dendríticas derivadas de monócitos e são re-inoculadas no paciente após terem contactado com antigénios tumorais do mesmo.

Neste trabalho, procedeu-se ao isolamento de monócitos e induziu-se a sua diferenciação em células dendríticas por adição das citocinas IL4 e GMCSF ao meio de cultura. Seguidamente, induziu-se a maturação das DCs, por estimulação com LPS, e avaliou-se a eficácia desta estimulação.

OBJECTIVOS

• Contacto com o procedimento de obtenção de células dendríticas (DCs) a partir de monócitos – Isolamento de Monócitos;

• Familiarização com técnicas de laboratório normalmente utilizadas para o estudo das células;

• Caracterização fenotípica das células nas várias fases de isolamento – Monitorização do Isolamento.

A técnica de Citometria de Fluxo foi usada para:

• Monitorização de todas as fases do processo de isolamento de monócitos a partir de sangue periférico;• Avaliação da eficácia da estimulação das DCs pelo LPS.

2- SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA COM COLUNAS LS

3- CULTURA DE CÉLULAS COM INDUÇÃO DE DIFERENCIAÇÃO EM DCs

Amostra de Sangue

Centrifugação Plasma

Leucócitos

Eritrócitos

Amostra

Ficoll

• Remoção do plasma• Remoção do anel leucocitário• Adição de Ficoll

Centrifugação

Centrifugação em anel leucocitário descontínuo

Plasma

Anel Leucocitário

Eritrócitos e Granulócitos

Ficoll

• Remoção do anel leucocitário• Adição de PBS

Duas lavagens e centrifugação com PBS

Retirou-se uma alíquota para se

fazer a monitorização

“Tampão Beads” e marcação de monócitos com CD14 MicroBeads

Coluna Magnética

Recolha de amostra que não marca com CD14Recolha de amostra que marca com CD14

Retirou-se uma alíquota de cada tubo de ensaio para se fazer a monitorização

Agradecimentos: Universidade Nova de Lisboa, Universidade Nova de Lisboa, Centro de Estudos de Doenças Crónicas – CEDOC – Centro de Estudos de Doenças Crónicas – CEDOC – Faculdade de Ciências Médicas (Dra. Guadalupe Faculdade de Ciências Médicas (Dra. Guadalupe Cabral e Dra. Zélia Silva) e à CiCabral e Dra. Zélia Silva) e à Ciência Viva.

Dimensão e nível de complexidade das células

1.1.Observou-se a presença de duas populações: Linfócitos e Monócitos.

Gráfico 1.1.: Linfócitos – pequenas dimensões;Monócitos – maiores dimensões.

Gráfico 1.2.: Linfócitos – CD14- e CD3+;Monócitos – CD14+ e CD3-.

Nível de expressão de CD3 nas células

Nível de expressão de CD14 nas células

Observou-se que as células desta alíquota:

Gráfico 2.1.:Expressavam CD3.

Gráfico 2.2.:Não expressavam CD14 .

Foram removidos os linfócitos da amostra (CD3+ e CD14-).

2.1.2.2.

2.3. 2.4.

Nível de expressão de CD3 nas células

Nível de expressão de CD14 nas células

Observou-se que:

Gráfico 2.3.:89,13% das células não expressavam CD3;1,52% das células expressavam CD3.

Gráfico 2.4.:89,13% das células expressavam CD14;1,52% das células não expressavam CD3.

9,53% das células são contaminantes (granulócitos).Ou seja, 89,13% das células são monócitos, não expressavam CD3 e expressavam CD14 e 1,52% das células são linfócitos, expressavam CD3 e não expressavam CD14.

Nível de expressão de CD14 nas células

1.2.

t = [1;5[ dias

Maturação das DCs induzida no 5º dia de diferenciação das células

Monócito DC imatura DC matura

Diferenciação de monócitos em células DCs

t = [5;6[ diasCD14-

HLA-DR++

CD83-

CCR7-

CD14-

HLA-DR+++

CD83+

CCR7+

Estímulo LPSCitocinas IL4 e GMLCSF

3.1.

Nível de expressão de HLA-DR nas DCs

3.2.

Nível de expressão de CCR7 nas DCs

Observou-se um aumento na expressão dos marcadores HLA-DR e CD83( gráficos 3.1. e 3.2., respectivamente).

Nível de expressão de CD83 nas DCs

3.3.

Média Geométrica da Intensidade de Fluorescência (3.1, 3.2, 3.3)

DC não estimuladas DC estimuladas

HLA-DR 219,16 358,10

CD83 8,93 29,16

CCR7 8,46 3,47

DC não estimuladas HLA-DR, CD83, CD45, CCR7DC não estimuladas CD45DC estimuladas com LPS HLA-DR, CD83, CD45, CCR7DC estimuladas com LPS CD45

Legenda gráficos 3.1, 3.2. e 3.3.:

LinfócitosMonócitosContaminantes

Legenda gráficos 1.1, 1.2., 2.1., 2.2, 2.3.,2.4.:

CONCLUSÕES

A Citometria de Fluxo é uma técnica comummente utilizada na fenotipagem e contagem de células, dado que avalia vários parâmetros como o volume, a complexidade morfológica e fluorescência da célula.

Para a monitorização do isolamento de monócitos, utilizaram-se os anticorpos anti-CD3, que marcaram os linfócitos, e anti-CD14, que marcaram os monócitos. Antes de aplicar a amostra na coluna, esta continha monócitos e linfócitos. Após aplicação da amostra na coluna, obteve-se duas fracções: a CD3+; CD14-, maioritariamente com linfócitos, e a CD3-;CD14+, maioritariamente com monócitos. A segunda fracção tinha um grau de pureza de 89%, pelo que se conclui que o processo de isolamento foi bem sucedido.

O LPS foi eficaz na indução da maturação das DCs, aumentando a expressão dos marcadores HLA-DR e CD83. Observou-se, no entanto, que algumas das DCs diferenciadas tinham iniciado o processo de maturação na ausência de estímulo (LPS), daí a presença de dois picos nos níveis de expressão de HLA-DR nas DCs não estimuladas.