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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
DOSAGEM DA IgA SÉRICA POR ELISA DE CAPTURA PARA O
DIAGNÓSTICO DE DENGUE
VIVIANE MARTHA SANTOS DE MORAIS
RECIFE-PE
2013
VIVIANE MARTHA SANTOS DE MORAIS
DOSAGEM DA IgA SÉRICA POR ELISA DE CAPTURA PARA O DIAGNÓSTICO
DE DENGUE
Orientadora: Profª Drª Marli Tenório Cordeiro
Coorientadora: Profª Drª Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
Recife- PE
2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina Tropical do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal de
Pernambuco, como parte dos requisitos para a
obtenção do Título de Mestre na área de
Concentração em Doenças Infecciosas e
Parasitárias.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Nicodemos Teles de Pontes Filho
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM MEDICINA TROPICAL
Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM MEDICINA TROPICAL
Valdênia Maria Oliveira de Souza
CORPO DOCENTE
Ana Lúcia Coutinho Domingues
Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Fábio André dos Santos Brayner
Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Maria Amélia Vieira Maciel
Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
Marli Tenório Cordeiro
Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Valdênia Maria Oliveira de Souza
Vera Magalhães de Silveira
Vláudia Maria Assis Costa
CORPO DOCENTE COLABORADOR
Ana Catarina de Souza Lopes
Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque
Dedico aos meus pais, Cicero João de Morais
e Marildes Maria dos Santos Morais,
pelo amor incondicional ofertado.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e a minha irmã, que com amor, paciência e dedicação
ensinaram-me a jamais desistir.
À minha orientadora Profª. Drª. Marli Tenório Cordeiro e à minha
coorientadora Profª. Drª. Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho, por toda paciência
e ensinamentos compartilhados.
Aos pacientes que aceitaram participar deste trabalho e contribuíram para sua
realização.
A todos do Setor de Virologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
(LIKA/UFPE), do Laborátorio de Virologia e Terapia Experimental
(LaViTE/CPqAM/FIOCRUZ) e da Pós-Graduação em Medicina Tropical que
contribuíram para a minha formação.
A Jéfferson Almeida, Joanne Ferraz, Evônio Campelo e Georgea Cahú, meus
grandes amigos e companheiros do Setor de Virologia do LIKA.
Aos amigos Washington Soares, Regina Cele, Bruna Melo, Phoeve Macário,
Edclécia Morais e Cristina Torres pela paciência, carinho e amizade.
À Deus.
Mais uma vez, os meus sinceros agradecimentos.
“Nunca deixe que lhe digam que não vale a pena
Acreditar no sonho que se tem
Ou que seus planos nunca vão dar certo
Ou que você nunca vai ser alguém
Tem gente que machuca os outros
Tem gente que não sabe amar
Mas eu sei que um dia a gente aprende
Se você quiser alguém em quem confiar
Confie em si mesmo
Quem acredita sempre alcança!”
Mais uma vez - Renato Russo
RESUMO
MORAIS, V.M.S. Dosagem da IgA sérica por ELISA de captura para o diagnóstico
de dengue.
Introdução: O diagnóstico rápido, simples e preciso para confirmar a infecção pelo
vírus dengue (DENV) é uma necessidade real, uma vez que a doença pode se
manifestar com um amplo espectro de sinais e sintomas, similares a outros quadros
febris agudos. Durante a infecção por dengue se verifica também a produção da
imunoglobulina A (IgA) específica, que aumenta ao mesmo tempo que a
imunoglobulina M (IgM), permanece positiva por um período de tempo mais curto e
se apresenta em níveis mais elevados na infecção secundária. Objetivo: O presente
estudo teve como objetivo investigar a presença de IgA no soro durante a infecção
primária e secundária (sequencial) pelo DENV. Metodologia: Foram avaliadas
amostras de soro por meio do teste imunoenzimático de captura da IgA (AAC-
ELISA) in house. Resultados: Avaliou-se um total de 445 amostras de soro, sendo
171 caracterizados como infecção primária e 194 secundária; 40 amostras de
indivíduos saudáveis negativos para dengue e 40 de vacinados contra febre
amarela. As amostras foram distribuídas em 13 grupos. A positividade da IgA foi de
42,2% (154/365), sendo 27,5% (47/171) na infecção primária e 55,2% (107/194) na
secundária. Na infecção secundária, a IgA foi detectada do 2º ao 4º dias de sintomas
(grupo 1), antes mesmo da IgM, assim como no grupo 11 no qual a IgM não havia
sido detectada (infecção secundária). Na infecção primária o maior valor da
sensibilidade foi de 60,0 (36,4 - 80,0) no grupo com 30-35 dias de sintomas e na
secundária foi de 87,5% (60,4 – 97,8), grupo com 8 dias de sintomas. A
especificidade foi de 100% nas duas infecções (94,3 – 100). Ao aplicar o teste em
paralelo para ambas técnicas observou-se um aumento global de 6,6% na
sensibilidade do diagnóstico; sendo 2,7% para a infecção primária e de 15,2% para
a secundária. A IgA não foi detectada nas amostras dos indivíduos saudáveis, nem
nas amostras dos indivíduos recentemente vacinados contra febre amarela.
Conclusões: A detecção da IgA demonstrou ser útil como forma de diagnóstico
sorológico e em conjunto com a detecção da IgM poderá auxiliar na confirmação de
casos agudos de dengue e na interpretação dos resultados de casos inconclusivos,
permitindo a adoção de medidas preventivas para evitar a ocorrência de epidemias e
ocorrência de casos graves e óbitos.
Palavras-chave: Dengue, IgA, IgM, ELISA, infecção primária, infecção secundária.
ABSTRACT
MORAIS, V.M.S. Determination of IgA capture ELISA for diagnosis of dengue.
Introduction: Diagnosis quick, simple and accurate to confirm infection by dengue
virus (DENV) is a real need, since the disease can manifest with a broad spectrum of
signs and symptoms similar to other acute febrile conditions. During dengue infection
is also seen production of immunoglobulin A (IgA)-specific, which enhances the
same time as immunoglobulin M (IgM) remains positive for a shorter time period and
performs at higher levels in secondary infection. Objective: This study aimed to
investigate the presence of serum IgA during primary infection and secondary
(sequential) by DENV. Methods: We evaluated serum samples using the enzyme
immunoassay capture of IgA (AAC-ELISA) in house. Results: We evaluated a total
of 445 serum samples characterized as being 171 primary and 194 secondary
infection; 40 samples were from healthy individuals negative for dengue and 40
vaccinated against yellow fever. The samples were divided into 13 groups. The
positivity of IgA was 42.2% (154/365) and 27.5% (47/171) in primary infection and
55.2% (107/194) in the secondary. In secondary infection, IgA was detected 2nd to
4th days of symptoms (group 1), even before the IgM, in the group 11 in which IgM
was not detected (secondary infection). In primary infection, the highest sensitivity
was 60.0 (36.4 to 80.0) in the group with 30-35 days of symptoms and the
secondary was 87.5% (60.4 to 97.8) group with 8 days of symptoms. The specificity
was 100% in both infections (94.3 - 100). In applying the test in parallel for both
techniques showed an overall increase of 6.6% in the sensitivity of diagnosis; being
2.7% for primary infection and 15.2% for secondary. IgA was not detected in samples
from healthy subjects, nor in samples of individuals recently immunized against
yellow fever. Conclusions: The detection of IgA proved to be a useful diagnostic
serology and in conjunction with the detection of IgM may assist in confirming acute
cases of dengue and interpretation of results inconclusive cases, allowing the
adoption of preventive measures to avoid the occurrence epidemics and severe
cases and deaths.
Keywords: Dengue, IgA, IgM, ELISA, primary infection, secondary infection.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática do genoma do vírus dengue................... 19
Figura 2 - Representação esquemática dos métodos empregados no
diagnóstico da dengue, conforme os dias de doença .........................................
23
Figura 3 - Representação esquemática da IgM e IgG conforme a infecção
primária e secundária..............................................................................................
25
ARTIGO
Fig. 1 - Detecção da IgA anti-DENV em casos de infecção primária (IP) e
infecção secundária (IS) de acordo com o número de dias após o início dos
sintomas.................................................................................................................
49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição das amostras de soro em grupos, de acordo com o
número de dias de sintomas e o tipo de infecção............................................
32, 43
Tabela 2 - Distribuição dos valores de sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo e negativo do AAC-ELISA na infecção primária e na
secundária pelo DENV ...................................................................................
50
Tabela 3 - Distribuição dos valores de sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo e negativo do AAC-ELISA na infecção primária em relação ao
número de dias após o inicio dos sintomas ........................................................
51
Tabela 4 - Distribuição dos valores de sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo e negativo do AAC-ELISA na infecção secundária em relação ao
número de dias após o inicio dos sintomas........................................................
52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAC-ELISA Ensaio imunoenzimático para captura de anticorpos IgA
BSA Albumina bovina fração V
cDNA DNA complementar
CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
DENV Vírus dengue
DNA Ácido desoxirribonucleico
DO Densidade óptica
E Especificidade
ELISA Ensaio imunoenzimático
FHD Febre hemorrágica da dengue
IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IP Infecção primária
IS Infecção secundária
LaViTE Laboratório de Virologia e Terapia Experimental
MAC-ELISA Ensaio imunoenzimático para captura de anticorpos IgM
NS1 Antígeno viral NS1
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Solução salina tamponada
RNA Àcido ribonucleico
RT-PCR Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase
S Sensibilidade
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TMB Substrato tetra-metil-benzidina
VPN Valor preditivo negativo
VPP Valor preditivo positivo
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 15
2 REVISAO DA LITERATURA.................................................................... 18
2.1 A dengue................................................................................................. 19
2.2 Manifestações clínicas ...................................................................... 19
2.3 Epidemiologia ..................................................................................... 20
2.4 Diagnóstico laboratorial..................................................................... 22
2.5 Resposta Imune.................................................................................. 24
2.6 Imunoglobulina A................................................................................. 25
3 OBJETIVOS............................................................................................. 28
3.1 Objetivo geral...................................................................................... 29
3.2 Objetivos específicos........................................................................ 29
4 METODOLOGIA....................................................................................... 30
4.1 Desenho do estudo ............................................................................ 31
4.2 População de estudo.................................................................................. 31
4.3 Definição do tamanho da amostra ......................................................... 31
4.4 Categorização das variáveis.............................................................. 32
4.5 Diagnóstico laboratorial para caracterização dos casos de
dengue .......................................................................................................
33
4.6 Caracterização das amostras usadas como controle negativo..... 34
4.7 Caracterização do controle positivo.................................................. 34
4.8 Ensaio imunoenzimático para detecção da IgA............................... 35
4.9 Análise estatística.............................................................................. 36
4.10 considerações éticas......................................................................... 37
5 RESULTADOS......................................................................................... 38
Artigo – Aplicação do ensaio imunoenzimático de captura da
imunoglobulina A (IgA) no diagnóstico sorológico da dengue...........
40
6 CONCLUSÕES DA DISSERTAÇÂO...................................................... 59
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................... 61
REFERÊNCIAS.......................................................................................... 63
APÊNDICES................................................................................................ 68
Apêndice A – Versão do artigo 1 em inglês
ANEXOS...................................................................................................... 88
Anexo A – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE
Anexo B - Normas para publicação da revista científica
15
1 INTRODUÇÃO
16
O diagnóstico rápido, simples e preciso para confirmar a infecção pelo vírus
dengue (DENV) é uma necessidade real, uma vez que a doença pode se manifestar
com um amplo espectro de sinais e sintomas, similares a outros quadros febris
agudos (OLIVEIRA et al., 2008). Os testes laboratoriais para diagnosticar infecções
virais geralmente são baseados em métodos sorológicos, virológicos e moleculares.
Embora mais sensíveis e precisos, os testes moleculares possuem custo mais
elevado e necessitam de laboratórios especializados, razão pela qual os testes
sorológicos são os mais utilizados na rotina (GUZMÁN et al., 2010). Para Blacksell et
al. (2008), o uso de um teste preciso tem o propósito de auxiliar no manejo clínico
dos pacientes, principalmente em regiões endêmicas, onde as infecções podem
ocorrer dentro de um curto período de tempo.
Entre os testes sorológicos disponíveis, o ensaio imunoenzimático (ELISA)
para captura de anticorpos IgM (MAC-ELISA) permite realizar o diagnóstico
presuntivo de infecção recente ou ativa, em amostra única de soro do paciente,
sendo assim o método de eleição para a vigilância epidemiológica da dengue, uma
vez que pode ser empregado durante um longo período, geralmente até 70-90 dias
após o inicio dos sintomas (KUNO, GÓMEZ, GUBLER, 1987; GUZMÁN et al., 2010).
A IgM, geralmente, pode ser detectada a partir do quarto dia dos sintomas e
nos casos de infecção primária a técnica é extremamente sensível. Entretanto, os
resultados desta técnica devem ser interpretados com cuidado, pois em casos de
infecção secundária (sequencial) a produção de anticorpos IgM ocorre em baixos
níveis e nem sempre são detectáveis (GUZMÁN, KOURI, 1996; BALMASEDA et
al.,2003).
O diagnóstico realizado apenas pelo MAC-ELISA tem limitações quando
utilizados em regiões endêmicas, nas quais há uma elevada prevalência de
anticorpos para dengue e circulação dos diversos sorotipos do vírus. Nessas
regiões, nem sempre o achado de IgM é um indicativo de infecção aguda e recente,
pois segundo alguns autores (CHEN, HWANG, FANG, 1991; GUZMÁN et al, 2010),
a IgM pode permanecer por mais de oito meses após o início da doença. Às vezes é
difícil interpretar um resultado positivo (IgM) para dengue em pacientes com doença
febril, pois a presença de IgM pode refletir uma infecção de até oito meses
anteriores. Nestes casos, é de fundamental importância a solicitação de uma
segunda amostra de sangue para avaliação por outras técnicas sorológicas, como
inibição da hemaglutinação e/ou teste de neutralização (GUZMÁN et al., 2010).
17
Durante a infecção aguda por dengue se verifica também a produção de IgA
específica, tendo sido demonstrado que essa imunoglobulina aumenta ao mesmo
tempo que a IgM, permanecendo positiva por um período de tempo mais curto e
apresenta níveis mais elevados em infecções secundárias (TALARMIN et al. 1998;
BALMASEDA et al. 2003; NAWA et al. 2005). Esse dado traz a possibilidade de que
a detecção sorológica da IgA poderia ser mais sensível que a da IgM, mostrando a
importância de sua detecção no diagnóstico de dengue (TALARMIN et al. 1998;
BALMASEDA et al. 2003; NAWA et al. 2005).
Existe um pequeno número de estudos sobre a detecção e cinética da IgA
como marcador sorológico na confirmação de casos de dengue. Além disso, não
existe um consenso sobre a possibilidade de se diagnosticar um caso de dengue,
por meio desta imunoglobulina. No entanto, por estudos já realizados, a detecção da
IgA poderá constituir um parâmetro para confirmação desta infecção, principalmente
nas infecções secundárias, uma vez que esta imunoglobulina aparece precocemente
e se apresenta em níveis mais elevados neste tipo de infecção (TALARMIN et al.
1998; BALMASEDA et al. 2003; NAWA et al. 2005).
No Brasil, ainda não há estudos sobre o diagnóstico sorológico de dengue
comparando a sensibilidade e especificidade da detecção da IgA e da IgM, por meio
do AAC-ELISA e MAC-ELISA, respectivamente. Acredita-se que o emprego dos dois
ensaios, em conjunto, poderá fornecer, além de informações úteis para a
interpretação dos resultados, permitirá a confirmação de casos agudos e/ou
recentes de dengue que poderão levar à adoção de condutas preventivas de modo a
evitar a ocorrência de epidemias e consequentemente, dos casos graves.
Assim, o presente estudo teve como objetivo verificar a utilidade da detecção
da IgA específica para o vírus dengue no soro, por meio ensaio imunoenzimático de
captura da IgA (AAC-ELISA), como forma de auxiliar no diagnóstico laboratorial, e
também avaliar se essa imunoglobulina representa um bom marcador para a
detecção de casos agudos e/ou recentes de dengue.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
19
2.1 A dengue
A dengue é uma infecção viral aguda de importância global em termos de
morbidade e mortalidade, transmitida por artrópodes, principalmente o mosquito
Aedes aegypti, infectado por um dos quatro sorotipos do vírus dengue (DENV)
(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4). Mundialmente, é a doença mais importante
causada por um arbovírus, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais
(PAULA, FONSECA, 2004).
O vírus dengue pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus,
apresentando-se como uma partícula esférica medindo 40-50 nm de diâmetro, com
um envelope lipídico e RNA de fita simples, com polaridade positiva, possui um
genoma de aproximadamente 11 kb que codifica três proteínas estruturais, o
capsídeo, a membrana e o envelope, e sete proteínas não estruturais, NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5, conforme a figura 1 (GUZMAN et al. 2010).
Figura 1- Representação esquemática do genoma do vírus dengue.
Fonte: Adaptado de GUZMAN et al. 2010.
Os quatro sorotipos do vírus são geneticamente relacionados, porém
antigenicamente distintos, causando manifestações clínicas similares, sendo
transmitido ao ser humano por meio da picada de um mosquito infectado do gênero
Aedes, sendo que o vetor mais importante nas epidemias é o Aedes aegypti
(ROTHMAN, 2011).
2.2 Manifestações clínicas
A dengue pode ocorrer de forma assintomática ou sintomática. Ela se
apresenta com uma grande variedade de sintomas, que vão desde a forma leve,
febre do dengue, também chamada de dengue clássica, até a febre hemorrágica da
20
dengue/síndrome de choque da dengue. Manifestações clínicas, não usuais,
também têm sido relatadas, como as manifestações neurológicas (ORGANIZAÇÃO
MUNDIAL DA SAÚDE, 2009).
A dengue em sua forma clássica é uma doença febril, não fatal, com duração
de 5 a 7 dias. O período de incubação do vírus no homem pode variar de 3 a 14
dias, mas usualmente é de 5 a 7 dias. Os principais sinais e sintomas consistem de
febre súbita, dor retro-orbitária associada com o movimento dos olhos e congestão
conjuntival, cefaleia, artralgia, mialgia, prostração, exantema máculo-papular
generalizado, prurido, astenia, náuseas, vômitos, dor abdominal, sabor metálico nos
alimentos, mudança no estado psicológico, podendo ocorrer depressão pós-doença.
Em alguns casos, ocorre um segundo pico de febre que pode durar dois a três dias,
desaparecendo em seguida (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 1995).
A grande maioria dos pacientes apresenta a forma leve da doença, a dengue
clássica que tem uma evolução benigna. Em uma proporção menor dos casos, a
doença apresenta evolução muito mais grave, como a febre hemorrágica da
dengue/síndrome de choque da dengue. Esta segunda forma da doença se
caracteriza pelo aumento da permeabilidade capilar, extravasamento de plasma e
anormalidades homeostáticas que podem evoluir para insuficiência circulatória e
choque hipovolêmico (KORAKA et al. 2001; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE,
2009).
2.3 Epidemiologia
A dengue é uma das doenças infecciosas mais frequentes no Brasil e um dos
principais problemas de saúde pública no mundo. A Organização Mundial da Saúde
(OMS) estima que cerca de 2,5 bilhões da população mundial estão em risco de
infecção, ocorrendo mais de 50 milhões de casos a cada ano (GUZMAN et al. 2010;
WHITEHORN, SIMMONS, 2011).
No Brasil, a incidência tem aumentado desde 1986 devido às sucessivas
epidemias (BARRETO et al. 2011) e no século XXI tornou-se, mundialmente, o país
com o maior número de casos de dengue notificados (TEIXEIRA et al. 2009), com
cerca de 6.642.936 casos notificados entre os anos de 1990 a 2011, destacando os
anos de 2002 (696.472 casos), 2010 (1.011.548 casos) e 2011 (764.032 casos),
21
quando ocorreram as maiores epidemias registradas no Brasil (PENNA et al. 2011;
BRASIL, 2013a).
Até 2009 circulavam no país os sorotipos 1, 2 e 3 do vírus, mas em 2010 o
DENV-4 foi reintroduzido no país, tendo sido isolado em 2010 em Boa Vista, a
capital do estado de Roraima (TEMPORÃO et al. 2011), com posterior disseminação
nos estados do Amazonas, Pará, Piauí, Pernambuco, Bahia, Ceará, Rio de Janeiro e
São Paulo (NOGUEIRA, EPPINGHAUS, 2011).
O primeiro surto de dengue em Pernambuco ocorreu em 1987 (DENV-1) com
mais de dois mil casos notificados, porém esse surto foi logo controlado e só em
1995 ocorreu uma nova epidemia com a introdução do sorotipo 2 (CORDEIRO et al.
2007a). A partir de 2002 os três sorotipos (DENV-1, -2, -3) circularam
simultaneamente, e nesse mesmo ano, o Estado de Pernambuco registou sua maior
epidemia de dengue (CORDEIRO et al. 2007b), com 99.652 casos, apresentando
uma incidência de 1.235,7/100.000 habitantes (BRASIL, 2013a; BRASIL, 2013b).
Em 2012 foi detectado o sorotipo 4 no estado de Pernambuco,
consequentemente, um novo surto foi verificado em consequência da falta de
imunidade da população para esse sorotipo, tendo sido notificados 12.236 casos na
cidade do Recife (BRASIL, 2013a).
A circulação simultânea dos vários sorotipos, de acordo com a teoria da
infecção sequencial, representa um fator de risco para a ocorrência da febre
hemorrágica da dengue (FHD), devido à formação de imunocomplexos resultantes
da presença de anticorpos heterólogos para dengue no indivíduo infectado por um
novo sorotipo (TEIXEIRA et al. 2009). Em consequência da circulação simultânea de
sorotipos do vírus foi registrado no Estado de Pernambuco, em 2002, o maior
número de óbitos (20 casos) por FHD, seguido de 13 casos em 2011 (BRASIL,
2013c).
O aumento do número de casos de dengue preocupa as autoridades de
saúde devido às dificuldades em controlar as epidemias e a necessidade de
expandir os serviços de saúde para tratar os pacientes (TEIXEIRA et al. 2009). Três
em cada quatro municípios brasileiros estão densamente povoados com o principal
vetor da dengue, o Aedes aegypti, tornando-se difícil o controle desse mosquito,
principalmente porque depende também da conscientização da população, para a
redução e/ou eliminação de potenciais criadouros, além da necessidade de políticas
públicas voltadas para as atividades de vigilância epidemiológica e vetorial, com
22
capacidade de monitoramento da circulação viral (GUBLER, 1998). Como não existe
ainda uma vacina disponível para a população até o momento, apesar de haver
algumas vacinas candidatas em fase de teste clinico, as pespectivas para o controle
efetivo do dengue não são animadoras, considerando a dificuldade em se controlar a
proliferação do vetor (BARRETO et al. 2011).
2.4 Diagnóstico laboratorial
A confirmação laboratorial da infecção pelo DENV é importante considerando
que muitos dos sintomas da dengue são comuns a outras viroses, fazendo-se
imprescindível o diagnóstico diferencial em muitos casos. Vários métodos podem ser
empregados para o diagnóstico (Figura 2), como o isolamento do vírus em cultura de
células, a detecção do RNA viral pela reação em cadeia da polimerase, associada à
transcrição reversa (RT-PCR), a detecção da proteína NS1 (antígeno viral) no
sangue e em tecidos (óbitos), além da detecção de anticorpos específicos no soro
(GUZMÁN et al., 2010).
O isolamento viral pode ser realizado por meio da inoculação da amostra de
sangue e/ou soro em culturas de células, principalmente as originadas de mosquito,
como o clone C6/36 de Aedes albopicuts (SHU, HUANG, 2004). Entretanto, essa
técnica não é usada como um procedimento de rotina de diagnóstico em virtude da
necessidade de pessoal e laboratório especializados e requer de uma a duas
semanas para se obter o resultado (DATTA, WATTAL, 2004). No Brasil, o
isolamento viral é realizado pelos Laboratórios de Saúde Pública de Referência em
dengue, pertencente à Rede Nacional de Laboratórios do Ministério da Saúde.
O diagnóstico molecular realizado pela RT-PCR tem um papel fundamental
porque é capaz de identificar de forma rápida a presença do vírus durante a fase
aguda da doença (YAP, SIL, NG, 2011). Entretanto, a exigência de uma equipe
treinada, a necessidade de vários equipamentos especiais, bem como o custo
elevado associado aos métodos moleculares tem limitado sua aplicação como
diagnóstico de rotina (DATTA, WATTAL, 2004).
O diagnóstico sorológico pode ser feito por meio de vários métodos (inibição
da hemaglutinação, teste de neutralização, etc), contudo, o ensaio imunoenzimático
(ELISA) é o método mais utilizado, sendo de grande utilidade devido a sua alta
23
sensibilidade e fácil execução, além de não exigir, necessariamente, duas amostras
de soro como nos demais métodos (PAULA, FONSECA, 2004).
O ELISA tem sido usado para detectar anticorpos IgM na fase aguda e na
convalescença, além dos anticorpos IgG anti-dengue. Entretanto, os anticorpos IgM
são melhores detectados a partir do quinto dia após o início da doença, tornando
essa técnica inviável para um diagnóstico precoce, ou seja, nos primeiros dias de
doença (PAULA, FONSECA, 2004), apresentando também limitações que consistem
nas variações da taxa de detecção durante a fase aguda da doença (LIMA et al .
2010).
A detecção do antígeno NS1, encontrado no soro ou plasma durante a fase
aguda da doença, tem oferecido um novo caminho para o diagnóstico precoce e
rápido ainda na fase aguda da infecção, podendo ser realizado pela maioria dos
laboratórios públicos ou privados. Atualmente sua maior desvantagem é o custo
mais elevado em relação aos testes para detecção de anticorpos (TRICOU et al.
2010).
Figura 2 - Representação esquemática dos métodos empregados no diagnóstico da dengue
conforme os dias de doença.
Fonte: Adaptado de HALSTEAD, 2007.
24
2.5 Resposta Imune
Durante a infecção o pico da viremia ocorre após o surgimento dos primeiros
sintomas, mesmo quando o paciente não apresenta manifestações clínicas que o
faça procurar atendimento médico. Os vírus circulantes permanecem detectáveis
geralmente até o quinto dia de doença, coincidindo com o período de elevação dos
níveis de anticorpos, porém, em muitos casos é possível detectar o vírus até o
sétimo dia de doença (GUBLER, 1998).
A resposta imune adquirida após a infecção pelo DENV consiste na produção
da IgM, IgG e IgA, que são específicas principalmente para a proteína do envelope
viral, e a intensidade da resposta varia dependendo do tipo de infecção (PEELING et
al., 2010).
Dois padrões de resposta imune podem ser observados nas infecções
agudas: a resposta primária, que ocorre em indivíduos que não são imunes ao vírus
e a resposta secundária, que ocorre em indivíduos com infecção aguda pelo DENV e
que já tiveram uma infecção anterior por outro sorotipo do vírus. Ressaltando que
um indivíduo infectado com um sorotipo apresenta imunidade permanente ao vírus
infectante, ou seja, não se infecta mais com o mesmo sorotipo do DENV
(HALSTEAD, 2007).
De acordo com Halstead (2007), durante a infecção primária, a viremia
coincide mais ou menos com a febre e é caracterizada por uma resposta lenta e de
baixo título de anticorpos. A primeira imunoglobulina que surge é a IgM, enquanto
que a IgG aparece com títulos baixos no final da primeira semana da doença e
aumenta lentamente (Figura 3).
Já nas infecções secundárias, altos níveis de IgG são detectáveis, mesmo na
fase aguda e aumentam nas duas semanas seguintes. A cinética da resposta da IgM
é mais variada, aparecendo mais tarde durante a fase febril da infecção secundária
e é precedida por IgG, ressaltando-se que algumas sorologias negativas para IgM
são observadas nestas infecções (GUZMÁN, KOURÍ, 2004).
25
Figura 3 - Representação esquemática da IgM e IgG conforme a infecção primária e
secundária.
Fonte: Adaptado de PEELING et al., 2010.
Após a febre e mal-estar causados pelo DENV, geralmente os pacientes
procuram atendimento médico nos primeiros dias de febre e nesta fase o diagnóstico
só é possível por meio da detecção do vírus, do RNA viral ou da proteína não
estrutural NS1 (antígeno viral) presentes no sangue. O diagnóstico sorológico pela
detecção de IgM é difícil de ser feito até a redução da febre e quando realizado
neste período, se a IgM for negativa deve ser solicitada uma segunda amostra de
sangue, coletada após o término da febre, na fase convalescente. Outros testes
sorológicos, como o de inibição da hemaglutinação e o teste de neutralização
exigem amostras pareadas de soro, o que nem sempre é possível se obter
(GUZMÁN, KOURÍ, 2004; PEELING et al., 2010).
2.6 Imunoglobulina A
Na infecção pelo DENV a IgA é produzida quase ao mesmo tempo que a IgM
e pode ser igualmente detectada no sangue, podendo, portanto, ser empregada para
fins de diagnóstico.
4
26
Na Guiana Francesa, Talarmin et al. (1998), utilizando as técnicas do MAC-
ELISA e AAC-ELISA em 178 amostras de soros (37 infecção primária e 25 infecção
secundária) observaram que a positividade para IgA anti-DENV ocorreu em média
um dia após o aparecimento da IgM. Porém o tipo de infecção não foi estabelecido
para a maior parte das amostras (n = 116), conforme os critérios utilizados pelos
autores. Observaram o pico da produção da IgA no 8º dia, diminuindo mais rápido do
que o da IgM, não sendo encontrada após 40 dias do início dos sintomas. No
entanto, o valor preditivo positivo e a especificidade do AAC-ELISA foram de 100%
nos soros de referência, já a sensibilidade e o valor preditivo negativo foram de
100% apenas entre o 6º e 25º dia após o início da infecção, o que sugere que a
presença do IgA é um indicador de infecção ocorrida dentro deste período.
Posteriormente, Balmaseda et al. (2003) ao analisarem apenas as infecções
secundárias pelo DENV, na Nicaragua, verificaram que a detecção de IgA no soro
ocorre antes da IgM em relação ao início dos sintomas e em níveis mais elevados,
indicando que a pesquisa desta imunoglobulina pode ser útil na detecção de
infecção secundária. Também encontraram uma sensibilidade de 94,4%,
especificidade de 74,7%, valor preditivo positivo de 78.2% e valor preditivo negativo
de 93.3%. Todavia, indicaram que a detecção IgA no soro pode ser uma outra
alternativa viável para o diagnóstico de infecção por DENV.
Vázquez et al. (2005) também obtiveram um percentual de detecção da IgA
mais elevado nos casos secundários. Ao avaliarem 127 amostras de soro coletadas
entre o 5º e 7º dia após o início da febre, dos quais 42 foram classificados como
dengue primária, 48 como secundário de dengue clássico e 37 casos secundários
de FHD, obtiveram resultados positivos para IgA de: 23,8% (10/42), 85,4% (41/48) e
56,8% (21/37), respectivamente.
Ahmed et al. (2010) avaliando um teste rápido para IgA (ASSURE® Dengue
IgA Rapid Test) em 58 amostras de pacientes com infecção primária, 121 com
infecção secundária e 245 pacientes negativos para dengue, verificaram uma
sensibilidade total de 99,4% (178/179); 100% na infecção primária (58/58) e 99,2%
(120/121) na infecção secundária, sendo a especificidade de 99,2%.
Tan et al. (2011) utilizando o mesmo teste rápido obtiveram uma sensibilidade
e especificidade global de 86,70% (202/233) e 86,05% (586/681), respectivamente.
Por outro lado, encontraram uma sensibilidade de 77,42% (72/93), na infecção
primária e 92,86% (130/140) na secundária.
27
Hernández et al. (2012) uutilizando o teste rápido para IgA (ASSURE®) em
172 amostras de pacientes com dengue encontraram uma positividade de 61%.
Estes autores ao avaliarem a positividade após os dias de sintomas, encontraram os
valores de 33,3% (4/12) nos soros coletados no mesmo dia do início da febre e de
81,2% (23/28) nas amostras coletadas cinco dias após o início da febre.
Classificaram 143 casos como infecção primária e 29 secundária, dessa forma
encontraram uma sensibilidade e especificidade global de 85,1% e 61,0%,
respectivamente.
Da mesma forma, Hernández et al. (2012) analisaram 47 amostras de
doadores de sangue negativos para dengue e o teste rápido apresentou 7 (14,9%)
amostras positivas, uma especificidade de 85,1%. Por outro lado, ao avaliarem um
soro de paciente com febre amarela e cinco soros de vacinados contra febre
amarela obtiveram resultado negativo, sugerindo que os anticorpos contra a febre
amarela não são detectados pelo teste rápido.
As pesquisas até então realizadas utilizando a IgA como forma de confirmar
casos de dengue sugerem que o emprego das imunoglobulinas M e A, em conjunto,
poderão fornecer informações úteis no diagnóstico laboratorial da dengue.
28
3 OBJETIVOS
29
3.1 Objetivo geral
Estimar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo do
ensaio imunoenzimático de captura de IgA específica na infecção primária e
secundária pelo vírus dengue.
3.2 Objetivos específicos
Estimar a frequência da IgA no soro utilizando o AAC-ELISA durante a infecção
primária e secundária pelo DENV;
Estimar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo do
AAC-ELISA segundo os dias de sintomas na infecção primária e secundária;
Estimar a especificidade do AAC-ELISA frente às amostras negativas para
dengue e após a vacinação contra febre amarela;
Comparar a detecção da IgA e IgM segundo os dias de sintomas na infecção
primária e secundária;
Estimar a sensibilidade da aplicação em paralelo dos ensaios em conjunto para a
detecção da IgM e IgA na infecção primária e secundária.
30
4 METODOLOGIA
31
4.1 Desenho do estudo
Trata-se de um estudo observacional analítico do tipo transversal, utilizando
grupos de comparação.
4.2 População de estudo
Foram incluídas neste estudo 445 amostras de soro humano do banco de
amostras biológicas provenientes de projetos de pesquisas desenvolvidos no
Departamento de Virologia e Terapia Experimental (LaViTE), do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz. Sendo 365 amostras de casos confirmados de
dengue, 40 soros de indivíduos saudáveis negativos para dengue e 40 soros de
indivíduos saudáveis vacinados contra o vírus da febre amarela, com IgM anti-febre
amarela.
4.3 Definição do tamanho da amostra
Considerando que anticorpos IgM anti-dengue desenvolvem-se rapidamente,
podendo ser detectados em cerca de 80% dos pacientes com cinco dias de doença,
e tomando como base esta prevalência, com o erro aceitável de 5 % e o intervalo
de confiança de 95 %, a amostra foi determinada em 246 soros. Entretanto, devido à
disponibilidade do banco de amostras biológicas (previamente caracterizadas) do
LaViTE, optou-se por utilizar um total de 445 soros distribuídos em 13 grupos. As
365 amostras positivas para dengue foram divididas em 11 grupos, conforme
demonstrado na tabela 1.
32
Tabela 1 - Distribuição das amostras de soro em grupos, de acordo com o número de dias após o início da febre e o tipo de infecção.
Grupos
Dias após
o inicio dos sintomas
Presença
da IgM
Tipo de infecção
IP (N=171)
IS (N=194)
Total (N=365)
1# 2-4 Não 17 15 32
2 5 Sim 17 19 36
3 6 Sim 16 15 31
4 7 Sim 19 19 38
5 8 Sim 17 16 33
6 9 Sim 15 16 31
7 10 Sim 16 17 33
8 15-20 Sim 16 21 37
9 30-35 Sim 20 17 37
10 45-50 Sim 18 14 32
11# 10 - 21 Não - 25 25
#Casos de dengue com IgM negative, mas com isolamento do vírus e/ou RT-PCT positivo;
IP = infecção primária; IS = infecção secundária; N = número de soros testados.
Distribuição das amostras de soro em grupos, de acordo com o número de dias de sintomas e o tipo de infecção.
Adicionalmente, foram incluídos dois grupos como controles negativos para
comparação: o grupo 12, composto por amostras de 40 indivíduos saudáveis,
negativos para dengue e o grupo 13 formado por amostras dos mesmos indivíduos
coletadas após a vacinação contra febre amarela e que possuem IgM positiva para
este vírus, com a finalidade de avaliar a ocorrência de reação cruzada (falso positivo
para IgA anti-dengue). As amostras de soro encontravam-se estocadas a -20o C, em
pequenas alíquotas.
4.4 Categorização das variáveis
a) Dependente: IgA. Definição: detecção da IgA no soro. Categorização:
Presente/Ausente.
b) Independente: dias. Definição: dias após os sintomas. Categorização: de 02 a
50 dias.
33
4.5 Diagnóstico laboratorial para caracterização dos casos de dengue
Indivíduos com suspeita clínica de dengue atendidos em hospitais públicos e
privados da cidade do Recife tiveram amostras de sangue coletadas durante a fase
aguda da doença, na convalescença e após esse período, constituindo uma coorte
clínica de pacientes para pesquisas sobre a dengue, conforme descrito por Cordeiro
et al. (2007). De forma sucinta, o diagnóstico laboratorial para confirmação e
caracterização dos casos de dengue foi realizado conforme descrito a seguir:
Para o isolamento dos vírus foi utilizada a linhagem celular de mosquito Aedes
albopictus, clone C6/36 (IGARASHI, 1978), utilizando-se o meio Leibovitz L15 (GIBCO,
Invitrogen Co., Grand Island, New York), com 5% de soro fetal bovino para o meio de
crescimento e com 2% para o meio de manutenção. Os vírus isolados foram
identificados por meio da técnica de imunofluorescência indireta (HENCHAL et al.,
1982), utilizando-se anticorpos monoclonais para o quatro sorotipos do DENV (Bio-
Manguinhos/Fiocruz).
O diagnóstico molecular foi realizado por meio da reação em cadeia da
polimerase precedida pela transcrição reversa (RT-PCR). A extração do RNA viral
do soro foi feita utilizando-se o QIAmp Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, CA,
EUA). Para a detecção do RNA viral e identificação do vírus foi utilizado o protocolo
descrito por Lanciotti et al. (1992). Nesta técnica são utilizados iniciadores (primers)
universais do vírus dengue localizados nos genes C e prM e o sorotipo é identificado
mediante o uso de primers sorotipo-específico em um semi-nested PCR em uma
segunda amplificação.
Para a detecção de anticorpos IgM e IgG anti-dengue foram utilizados os kits
ELISA da PANBIO, captura de IgM anti-dengue e o ELISA IgG anti-dengue (PanBio,
Pty., Ltd., Brisbane, Australia) e os ensaios realizados e interpretados conforme
recomendado pelo fabricante.
A caracterização do tipo de resposta imune do paciente à infecção pelo vírus
dengue, em primária e secundária, foi feita baseada na cinética dos anticorpos das
classes IgM e IgG, de acordo com os seguintes critérios:
A) Infecção Primária foi definida pela ausência de anticorpos IgG anti-dengue na
amostra de soro coletada durante a fase aguda da doença, enquanto IgM estava
presente; e/ou isolamento de vírus e/ou RT-PCR positivos. Na segunda amostra
34
coletada na fase convalescente, anticorpos IgG anti-dengue eram detectados, sendo
observada conversão sorológica.
B) Infecção secundária foi definida pela detecção de anticorpos IgG anti-dengue na
amostra de soro coletada na fase aguda da doença e ausência de IgM anti-dengue,
associada (ou não) com isolamento de vírus e/ou RT-PCR positivos, em alguns
casos. Na amostra de soro coletada na fase convalescente eram detectados
anticorpos IgM específicos (CORDEIRO et al, 2007b).
4.6 Caracterização das amostras usadas como controles negativos
As amostras de soro utilizadas como grupo controle negativo foram obtidas de
indivíduos saudáveis antes de receberem a vacina contra febre amarela (n=40),
com nova coleta dos mesmos indivíduos 30 a 60 dias após a vacinação (n=40; IgM
e IgG positivos para febre amarela), e se encontram estocadas a -20o C no banco
de amostras biológicas do LaViTE. Essas amostras foram previamente testadas
para presença de anticorpos IgM anti-dengue; ELISA IgM e IgG para o vírus febre
amarela e ao teste de neutralização por redução de placas para febre amarela,
conforme descritos em Melo et al. (2011).
Além destas amostras foi utilizado como controle negativo do teste, em todos
os experimentos, um pool de soros negativos para dengue, febre amarela, rubéola,
sarampo e parvovírus.
4.7 Caracterização do controle positivo
Para obtenção das amostras de soros IgA positivas para o DENV, utilizadas
como controle positivo nos ensaios, foram triadas 20 amostras de soro IgM- positivas
para dengue por meio do teste rápido imunocromatográfico ASSURE® Dengue IgA
Rapid Test (MP Diagnostics). Obteve-se 11 amostras IgA positivas, das quais foi
feito um pool de seis soros e estocados à -20o C em pequenas alíquotas.
35
4.8 Ensaio imunoenzimático para detecção da IgA
O ensaio imunoenzimático para captura de IgA in house (AAC-ELISA) utilizado
no estudo baseou-se no protocolo do MAC-ELISA desenvolvido por Kuno, Gómez,
Gubler (1987), com algumas modificações.
Sensibilização da microplaca
Na primeira etapa do ensaio microplacas de poliestireno com 96 poços foram
lavadas com uma solução de salina tamponada (PBS) com 0,05% de Tween. Em
seguida foram sensibilizadas com 100µl de anti-IgA humana (SIGMA) diluída em
tampão carbonato pH 9.0, contendo 2µg/poço e incubadas por 24 horas a 4°C, em
câmara úmida. No dia seguinte realizou-se cinco lavagens com PBS/0,05% Tween.
Bloqueio dos sítios inespecíficos
A segunda etapa consistiu no bloqueio de sítios inespecíficos com a adição
de 200 µl da solução de PBS com 4% de albumina bovina fração V (BSA)-(INLAB)
nas microplacas e incubação à temperatura ambiente, em câmara úmida, por 30
minutos, sendo em seguida lavadas quatro vezes com PBS/0,05% Tween.
Adição das amostras
Amostras de soro, controle positivo e negativo foram diluídos 1:10 em PBS pH
7.4 com 1% BSA (diluente do teste) e 50l dessas amostras foram dispensadas na
microplaca, em duplicata. Dois orifícios foram destinados ao branco contendo 50l
do diluente, em seguida a microplaca foi incubada por 1 h a 37ºC, em câmara
úmida, com posterior lavagem.
Adição dos antígenos
Foram utilizados antígenos para cada sorotipo do DENV produzidos em
cérebro de camundongos (extraídos por acetona), pelo Serviço de Arbovirologia do
Instituto Evandro Chagas (Ministério da Saúde), em Belém (PA), gentilmente
cedidos por Dr. Pedro Vasconcelos. Os antígenos foram previamente titulados,
individualmente, para determinar a diluição ótima dos mesmos. Na reação foi
utilizado um pool dos quatro antígenos diluídos (1/30) em PBS/1% BSA e
36
dispensados 50l por poço, incubação por 1 h a 37°C, em câmara úmida, seguida
de cinco lavagens.
Adição do anticorpo secundário (conjugado à peroxidade)
Foram dispensados 25l (por poço) do anticorpo secundário anti-flavivírus
(MAB 6B6C-1), (CDC, Estados Unidos), previamente titulado, diluído 1/13.000 em
PBS /1% BSA, seguida de incubação por 1 h a 37°C e cinco lavagens após esse
tempo.
Adição do substrato
Foram adicionados à microplaca 100l do substrato tetra-metil-benzidina
(TMB Substrate Reagent Set, BD Biosciences) e incubadas por 30 minutos à
temperatura ambiente, protegido da luz. Após esse tempo a reação foi parada com a
adição de 100l / poço de uma solução de H2SO4 a 12,5%. A leitura da densidade
óptica (DO) das amostras foi realizada em espectrofotômetro (Bio-Rad Laboratories,
Inc.), utilizando filtro de 450 nm.
Interpretação dos resultados
Para a interpretação dos resultados foi calculado um valor de index com base
no seguinte cálculo: média da absorbância do soro-teste / média da absorbância do
controle negativo. Foram consideradas positivas (reagentes) as amostras que
apresentaram o valor do índex maior que dois e negativas (não reagentes) aquelas
com valor de index igual ou menor que dois. As amostras com resultado
indeterminado foram repetidas.
4.9 Análise estatística
Os resultados das leituras obtidas no AAC-ELISA foram armazenados numa
planilha Excel. A análise estatística foi realizada no software Epi-Info 6.04d. Foi
aplicado o teste qui-quadrado, admitindo um p < 0,05 para avaliar a significância da
detecção da IgA na infecção primária e secundária. Adicionalmente foi aplicado o
teste em paralelo para estimar a sensibilidade do MAC e AAC-ELISA em conjunto.
37
4.10 considerações éticas
As amostras de soro utilizadas nesta pesquisa pertencem ao banco de
amostras biológicas do LaViTE/CPqAM, provenientes de pacientes com diagnóstico
de dengue utilizados em projetos de pesquisa desse departamento, não havendo
necessidade de coletar novas amostras.
Os integrantes do banco de amostras biológicas haviam assinado o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) com aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa do CPqAM/Fiocruz. Porém, para a realização do presente estudo, foi
submetido também ao Comitê de ética da UFPE e aprovado sob o Nº 510/11 (Anexo
A).
38
5 RESULTADOS
39
Os resultados da pesquisa serão apresentados na forma de artigo
científico que será submetido ao periódico Diagnostic Microbiology and
infectious Disease, qualis B1. Medicina II.
40
Artigo
Aplicação do ensaio imunoenzimático de captura da
imunoglobulina A (IgA) no diagnóstico sorológico da dengue
Viviane Martha Santos de Moraisa,b, Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlhob,c, Ana
Isabel Vieira Fernandesd, Jéfferson Luis de Almeida Silvaa,b, Verônica Gomes da
Silvae, Marli Tenório Cordeiroe, f
aPrograma de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-
PE Brasil; bSetor de Virologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade
Federal de Pernambuco, Recife-PE Brasil; cDepartamento de Fisiologia e Farmacologia do Centro de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil; dDepartamento de
Promoção da Saúde do Centro de Ciências Médicas da Universidade Federal da Paraíba;
eLaboratório de Virologia e Terapia Experimental do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Fundação Oswaldo Cruz, Recife-PE Brasil; fLaboratório Central de Saúde Pública, Secretaria de
Saúde do Estado de Pernambuco, Recife-Pe, Brasil.
Resumo
Pesquisou-se a IgA anti-DENV pelo ELISA de captura de IgA (AAC-ELISA) in
house, em 171 soros de casos de infecção primária (IP) e 194 de secundária (IS),
distribuídos de acordo com dias de sintomas. A sensibilidade geral do teste foi de
42,2% (154/365), com maior positividade na IS em relação à IP (55,2% vs. 27,5%; p
= 0,000); e especificidade de 100%. Na infecção secundária a IgA foi detectada 2 a 4
dias após o inicio dos sintomas, antes da IgM, assim como em amostras com 10 a
21 dias, sem IgM. Observou-se maior sensibilidade na IP (60,0%) 30-35 dias após o
inicio dos sintomas e na IS com 8 dias (87,5%). A detecção de IgM e IgA em
41
paralelo aumentou a sensibilidade do diagnóstico sorológico, em particular na IS, de
79,4% para 94,6%. Não se observou resultado falso-positivo. O AAC-ELISA
demonstrou ser útil para confirmar casos de dengue e utilizada em paralelo com a
IgM aumentou a sensibilidade do diagnóstico sorológico, de 84,4% (IgM) para 91,0%
(IgM + IgA).
1. Introdução
A dengue é uma doença viral aguda, causada por um dos quatro sorotipos do
vírus dengue (DENV), que pode se manifestar com um amplo espectro de sinais e
sintomas, similares a outros quadros febris agudos (Oliveira et al., 2008).
Na dengue podem ser observados dois padrões de resposta imune: a
infecção primária, que ocorre em indivíduos que não são imunes a nenhum dos
quatro sorotipos do vírus e a infecção secundária, quando o indivíduo foi re-infectado
por um sorotipo do DENV diferente do da infecção anterior (Halstead, 2007).
De acordo com Halstead (2007), durante a infecção primária a viremia
coincide com a febre, sendo caracterizada por uma resposta lenta e com baixo título
de anticorpos. A primeira imunoglobulina que surge é a IgM, enquanto que a IgG
aparece em títulos baixos no final da primeira semana da doença e aumenta
lentamente. Já nas infecções secundárias, são detectáveis altos níveis de IgG,
mesmo na fase aguda e aumentam nas duas semanas consecutivas.
Na fase aguda da infecção a dengue pode ser diagnosticada pela detecção
do RNA viral por meio da reação em cadeia da polimerase associada à
transcriptase reversa (RT-PCR), pelo isolamento do vírus, ou pela detecção do
antígeno NS1. Entretanto, o ensaio imunoenzimático de captura de anticorpos IgM
(MAC-ELISA) é o mais comumente utilizado e permite realizar o diagnóstico
42
presuntivo de infecção recente ou ativa. Utiliza-se uma amostra única de soro do
paciente e pode ser empregado até 70 a 90 dias após o inicio dos sintomas
(Guzmán et al., 2010; Kuno, Gómez, Gubler, 1987).
O diagnóstico de dengue realizado apenas pela detecção da imunoglobulina
M (IgM) apresenta limitações quando utilizado em regiões endêmicas, nas quais há
elevada prevalência e circulação dos diversos sorotipos do vírus, e, nem sempre, a
detecção da IgM indica uma infecção aguda e recente. Por outro lado, os resultados
desta técnica devem ser interpretados com cautela, pois a presença de IgM pode
refletir uma infecção ocorrida até oito meses anteriores (Chen, Hwang, Fang, 1991)
e em alguns casos de infecção secundária (sequencial), a produção da IgM
encontra-se em baixos níveis e às vezes não detectáveis (Balmaseda et al., 2003;
Guzmán, Kouri, 1996).
Na infecção pelo vírus dengue a imunoglobulina A (IgA) é produzida
simultaneamente à IgM e pode ser igualmente detectada no sangue, podendo,
portanto, ser empregada para fins de diagnóstico. Segundo alguns estudos, a
detecção da IgA anti-DENV pode ocorrer antes da IgM e decresce mais rápido que a
IgM, não sendo encontrada após 40 dias do início dos sintomas (Balmaseda et al.,
2003; Talarmin et al., 1998).
Portanto, o presente estudo teve como objetivo estimar a sensibilidade e
especificidade do AAC-ELISA na detecção da IgA anti-DENV, assim como avaliar se
essa imunoglobulina representa um bom marcador para auxiliar no diagnóstico
laboratorial da doença.
43
2. Material e Métodos
2.1. População de estudo e tamanho da amostra
Foram incluídas neste estudo 445 amostras de soro do banco de amostras
biológicas do Departamento de Virologia e Terapia Experimental (LaViTE), do
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz, Recife-PE, Brasil. Foram avaliadas
365 amostras de indivíduos com suspeita clínica de dengue atendidos em hospitais
públicos e privados da cidade do Recife, confirmados como dengue, conforme
descrito por Cordeiro et al. (2007), distribuídas em 11 grupos, de acordo com o
número de dias de sintomas, como demonstrado na tabela 1.
Tabela 1 Distribuição das amostras de soro em grupos, de acordo com o número de dias após o início da febre e o tipo de infecção
Grupos
Dias após
o inicio dos sintomas
Presença
da IgM
Tipo de infecção
IP (N=171)
IS (N=194)
Total (N=365)
1# 2-4 Não 17 15 32
2 5 Sim 17 19 36
3 6 Sim 16 15 31
4 7 Sim 19 19 38
5 8 Sim 17 16 33
6 9 Sim 15 16 31
7 10 Sim 16 17 33
8 15-20 Sim 16 21 37
9 30-35 Sim 20 17 37
10 45-50 Sim 18 14 32
11# 10 - 21 Não - 25 25
#Casos de dengue com IgM negative, mas com isolamento do vírus e/ou RT-PCT positivo;
IP = infecção primária; IS = infecção secundária; N = número de soros testados.
44
Adicionalmente, foram incluídos dois grupos de controles negativos para
comparação: o grupo 12, composto por amostras de 40 indivíduos saudáveis,
negativos para dengue e o grupo 13 composto por amostras dos mesmos indivíduos
coletadas após a vacinação contra febre amarela, com IgM positiva para esse vírus,
com a finalidade de avaliar a ocorrência de reação cruzada. As amostras de soro
encontravam-se estocadas a -20o C, em pequenas alíquotas.
2.2. Caracterização das amostras dos casos de dengue
De forma sucinta, o diagnóstico laboratorial para confirmação e
caracterização dos casos de dengue foi realizado conforme descrito a seguir:
Para o isolamento dos vírus foi utilizada a linhagem celular de mosquito Aedes
albopictus, clone C6/36 (Igarashi, 1978), utilizando-se o meio Leibovitz L15 (GIBCO,
Invitrogen Co., Grand Island, New York), com 5% de soro fetal bovino para o meio de
crescimento e com 2% para o meio de manutenção. Os vírus isolados foram
identificados por meio da técnica de imunofluorescência indireta (Henchal et al., 1982),
utilizando-se anticorpos monoclonais para o quatro sorotipos do DENV (Bio-
Manguinhos/Fiocruz).
O diagnóstico molecular foi realizado por meio da reação em cadeia da
polimerase precedida pela transcrição reversa (RT-PCR). A extração do RNA viral
do soro foi feita utilizando-se o QIAmp Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, CA,
EUA). Para a detecção do RNA viral e identificação do vírus foi utilizado o protocolo
descrito por Lanciotti et al. (1992). Nesta técnica são utilizados iniciadores (primers)
universais do vírus dengue localizados nos genes C e prM e o sorotipo é identificado
mediante o uso de primers sorotipo-específico em um semi-nested PCR em uma
segunda amplificação.
45
Para a detecção de anticorpos IgM e IgG anti-dengue foram utilizados os kits
ELISA da PANBIO, captura de IgM anti-dengue e o ELISA IgG anti-dengue (PanBio,
Pty., Ltd., Brisbane, Australia) e os ensaios realizados e interpretados conforme
recomendado pelo fabricante.
A caracterização do tipo de resposta imune do paciente à infecção pelo vírus
dengue, em primária e secundária, foi feita baseada na cinética dos anticorpos das
classes IgM e IgG, de acordo com os seguintes critérios: A) Infecção Primária foi
definida pela ausência de anticorpos IgG anti-dengue na amostra de soro coletada
durante a fase aguda da doença, enquanto IgM estava presente; e/ou isolamento de
vírus e/ou RT-PCR positivos. Na segunda amostra coletada na fase convalescente,
anticorpos IgG anti-dengue eram detectados, sendo observada conversão
sorológica. B) Infecção secundária foi definida pela detecção de anticorpos IgG anti-
dengue na amostra de soro coletada na fase aguda da doença e ausência de IgM
anti-dengue, associada (ou não) com isolamento de vírus e/ou RT-PCR positivos,
em alguns casos. Na amostra de soro coletada na fase convalescente eram
detectados anticorpos IgM específicos (CORDEIRO et al, 2007).
2.3. Caracterização dos controles negativos
As amostras de soro utilizadas como grupo controle negativo foram obtidas de
indivíduos saudáveis antes de receberem a vacina contra febre amarela (n=40),
com nova coleta dos mesmos indivíduos 30 a 60 dias após a vacinação (n=40; com
IgM e IgG positivos para febre amarela). Essas foram submetidas a ensaios para
detecção de anticorpos IgM anti-dengue; ELISA IgM e IgG para o vírus febre
amarela e ao teste de neutralização por redução de placas para febre amarela,
conforme descritos em Melo et al. (2011). Além dessas amostras foi utilizado como
46
controle negativo do teste, em todos os experimentos, um pool de soros negativos
para dengue, febre amarela, rubéola, sarampo e parvovírus.
2.4. Caracterização do controle positivo
Para obtenção de amostras de soros IgA positivas para dengue, utilizadas
como controle positivo nos ensaios, foram triadas 40 amostras de soro IgM positivas
para dengue por meio do teste rápido imunocromatográfico ASSURE® Dengue IgA
Rapid Test (MP Diagnostics), das quais 13 amostras foram positivas, foi feito um
pool de seis soros e estocados à -20o C em pequenas alíquotas.
2.5. Ensaio imunoenzimático para detecção da IgA
O ensaio imunoenzimático para captura de IgA in house (AAC-ELISA)
utilizado no estudo baseou-se no protocolo do MAC-ELISA desenvolvido por Kuno,
Gómez, Gubler (1987), com algumas modificações.
Sensibilização da microplaca - Na primeira etapa do ensaio microplacas de
poliestireno com 96 poços foram lavadas com uma solução de salina tamponada
(PBS) com 0,05% de Tween. Em seguida foram sensibilizadas com 100µl de anti-
IgA humana (SIGMA) diluída em tampão carbonato pH 9.0, contendo 2µg/poço e
incubadas por 24 horas a 4°C, em câmara úmida. No dia seguinte realizou-se cinco
lavagens com PBS/0,05% Tween.
Bloqueio dos sítios inespecíficos - A segunda etapa consistiu no bloqueio de sítios
inespecíficos com a adição de 200 µl da solução de PBS com 4% de albumina
bovina fração V (BSA)-(INLAB) nas microplacas e incubação à temperatura
47
ambiente, em câmara úmida, por 30 minutos, sendo em seguida lavadas quatro
vezes com PBS/0,05% Tween.
Adição das amostras - Amostras de soro, controle positivo e negativo foram diluídos
1:10 em PBS pH 7.4 com 1% BSA (diluente do teste) e 50l dessas amostras foram
dispensadas na microplaca, em duplicata. Dois orifícios foram destinados ao branco
contendo 50l do diluente, em seguida a microplaca foi incubada por 1 h a 37ºC, em
câmara úmida, com posterior lavagem.
Adição dos antígenos - Foram utilizados antígenos para cada sorotipo do DENV
produzidos em cérebro de camundongos (extraídos por acetona), pelo Serviço de
Arbovirologia do Instituto Evandro Chagas (Ministério da Saúde), em Belém (PA),
gentilmente cedidos por Dr. Pedro Vasconcelos. Os antígenos foram previamente
titulados, individualmente, para determinar a diluição ótima dos mesmos. Na reação
foi utilizado um pool dos quatro antígenos diluídos (1/30) em PBS/1% BSA e
dispensados 50l por poço, incubação por 1 h a 37°C, em câmara úmida, seguida
de cinco lavagens.
Adição do anticorpo secundário - Foram dispensados 25l (por poço) do anticorpo
secundário anti-flavivírus (MAB 6B6C-1), conjugado à peroxidase (CDC, Estados
Unidos), previamente titulado, diluído 1/13.000 em PBS /1% BSA, seguida de
incubação por 1 h a 37°C e cinco lavagens após esse tempo.
Adição do substrato - Foram adicionados à microplaca 100l do substrato tetra-metil-
benzidina (TMB Substrate Reagent Set, BD Biosciences) e incubadas por 30
48
minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Após esse tempo a reação foi
parada com a adição de 100l / poço de uma solução de H2SO4 a 12,5%. A leitura
da densidade óptica (DO) das amostras foi realizada em espectrofotômetro (Bio-Rad
Laboratories, Inc.), utilizando filtro de 450 nm.
Interpretação dos resultados - Para a interpretação dos resultados foi calculado um
valor de index com base no seguinte cálculo: média da absorbância do soro-teste /
média da absorbância do controle negativo. Foram consideradas positivas
(reagentes) as amostras que apresentaram o valor do índex maior que dois e
negativas (não reagentes) aquelas com valor de index igual ou menor que dois. As
amostras com resultado indeterminado foram repetidas.
2.6. Análise estatística
Os resultados das leituras obtidas no AAC-ELISA foram armazenados numa
planilha Excel. A análise estatística foi realizada no software Epi-Info 6.04d. Foi
aplicado o teste qui-quadrado, admitindo um p < 0,05 para avaliar a significância da
detecção da IgA na infecção primária e secundária. Adicionalmente foi aplicado o
teste em paralelo para estimar a sensibilidade da detecção da IgM e IgA em
conjunto.
3. Resultados
As 365 amostras dos casos confirmados de dengue (por isolamento viral, RT-
PCR e/ou detecção da IgM/IgG), incluídas neste estudo apresentaram uma
positividade global para IgA de 42,2% (154/365) com maior frequência na infecção
secundária quando comparada à infecção primária (55,2% (107/194) vs. 27,5%
49
(47/171); p = 0,000). Em adição, o AAC-ELISA foi 2 vezes (55,2/27,5) mais sensível
na infecção secundária quando comparada à primária. A positividade para a IgM foi
de 84,38% (308/365).
A figura 1 apresenta a distribuição dos casos positivos para IgA de acordo
com dias de sintomas, na infecção primária e na secundária. O maior percentual de
positividade da IgA na infecção primária ocorreu entre o 30º e 35º dias de sintomas,
enquanto que na infecção secundária se verificou no 8º dia de sintomas. A partir do
45º dia de sintomas (grupo 10) a IgA não foi mais detectada, apenas uma amostra
foi positiva (1/18) na infecção primária.
Fig. 1. Detecção da IgA anti-DENV em casos de infecção primária (IP) e infecção secundária
(IS) de acordo com o número de dias após o início dos sintomas.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
3 . 4 5 6 7 8 9 10 15-20 30-35 45-50
% P
ositiv
ida
de
Dias após o início dos sintomas
Primary SecondaryIP IS
50
Observa-se que na infecção secundária os valores estimados para a
sensibilidade e valor preditivo negativo do AAC-ELISA foram maiores do que na
infecção primária (Tabela 2).
Tabela 2
Distribuição dos valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo
do AAC-ELISA na infecção primária e na secundária pelo DENV
Tipo de
infecção
S
(95% IC)
E
(95% IC)
VPP
(95% IC)
VPN
(95% IC)
Infecção primária 27,5
(21,1-34,9)
100
(94,3-100)
100
(90,6-100)
39,2
(32,5-46,3)
Infecção secundária 55,2
(47,9-62,2)
100
(94,3-100)
100
(95,7-100)
47,9
(40,2-55,7)
S = sensibilidade; E = especificidade; VPP = valor preditivo positivo; VPN = valor preditivo
negativo; IC = intervalo de confiança.
Nas tabelas 3 e 4 estão demonstrados os valores de sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo e negativo para todos os grupos analisados,
distribuídos de acordo com dias de sintomas, na infecção primária e secundária,
respectivamente.
Na infecção primária o AAC-ELISA apresentou uma maior sensibilidade
(60,0%; 12/20) nas amostras coletadas com 30 a 35 dias de sintomas (grupo 9);
enquanto nas amostras da infeção secundária a maior sensibilidade (87,5%; 14/16)
foi observada no grupo 5, coletadas no oitavo dia de sintomas. Independentemente
dos dias de sintomas, a especificidade do AAC-ELISA foi de 100% (94,3 – 100) nos
dois tipos de infecção.
51
Tabela 3
Distribuição dos valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo
do AAC-ELISA na infecção primária em relação ao número de dias após o inicio dos
sintomas
Grupos
(Dias*)
S, % [N]
(IC)
E, %
(IC)
VPP
(IC)
VPN
(IC)
1 (2-4) - (0/17) 100 (94,3-100) - 82,5 (73,1-89,5)
2 (5) 17,6 [3/17] (4,7-44,2) 100 (94,3-100) 100 (31-100) 85,1 (75,9-91,3)
3 (6) 18,7 [3/16] (5-46,3) 100 (94,3-100) 100 (31-100) 86,0 (76,9-92,1)
4 (7) 21,1 [4/19] (7-46,1) 100 (94,3-100) 100 (39,6-100) 84,2 (75,0-90,6)
5 (8) 23,5 [4/17] (7,8-50,2) 100 (94,3-100) 100 (39,6-100) 86,0 (76,9-92,1)
6 (9) 26,6 [4/15] (8,9-55,2) 100 (94,3-100) 100 (39,6-100) 87,9 (79,0-93,5)
7 (10) 50,0 [8/16] (25,5-74,5) 100 (94,3-100) 100 (59,8-100) 90,9 (82,4-95,7)
8 (15-20) 50,0 [8/16] (25,5-74,5) 100 (94,3-100) 100 (59,8-100) 90,9 (82,4-95,7)
9 (30-35) 60,0 [12/20] (36,4-80,0) 100 (94,3-100) 100 (69,9-100) 90,9 (82,4-95,7)
10 (40-45) 5,6 [1/18] (0,3-29,4) 100 (94,3-100) 100 (5,5-100) 82,5 (73,1-89,2)
*Dias após o início dos dintomas; S = sensibilidade; E = especificidade; VPP = valor
preditivo positivo; VPN = valor preditivo negativo; N = número da amostra; IC = intervalo de
confiança.
Observou-se um percentual de positividade para a IgA de 56% (14/25) para
as amostras do grupo 11 (Tabela 4), coletadas entre 10 e 21 dias de sintomas,
correspondente aos casos de infecção secundária pelo DENV, onde não houve
detecção de IgM.
O AAC-ELISA apresentou especificidade de 100% nas amostras negativas
para dengue (grupo 12) e nas amostras coletadas após a vacinação contra o vírus
da febre amarela (grupo 13), demonstrando ausência de reação cruzada entre
dengue e febre amarela.
52
Tabela 4
Distribuição dos valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo
do AAC-ELISA na infecção secundária em relação ao número de dias após o inicio dos
sintomas
Grupos
(Dias*)
S, % [N]
(IC)
E, %
(IC)
VPP
(IC)
VPN
(IC)
1 (2-4) 26,7 [4/15] (8,9-55,2) 100 (94,3-100) 100 (39,6-100) 87,9 (79,0-93,5)
2 (5) 73,7 [14/19] (48,6-89,9) 100 (94,3-100) 100 (73,2-100) 94,1 (86,2-97,8)
3 (6) 66,7 [10/15] (38,7-87) 100 (94,3-100) 100 (65,5-100) 94,1 (86,2-97,8)
4 (7) 84,2 [16/19] (59,5-95,8) 100 (94,3-100) 100 (75,9-100) 96,4 (89,1-99,1)
5 (8) 87,5 [14/16] (60,4-97,8) 100 (94,3-100) 100 (73,2-100) 97,6 (90,6-99,6)
6 (9) 56,3 [9/16] (30,6-79,2) 100 (94,3-100) 100 (62,9-100) 92,0 (83,6-96,4)
7 (10) 70,6 [12/17] (44,0-88,6) 100 (94,3-100) 100 (69,9-100) 94,1 (86,2-97,8)
8 (15-20) 47,6 [10/21] (26,4-69,7) 100 (94,3-100) 100 (65,5-100) 87,9 (79,0-93,5)
9 (30-35) 23,5 [4/17] (7,8-50,2) 100 (94,3-100) 100 (39,6-100) 86,0 (76,9-92,1)
10 (40-45) 0 [0/14] 100 (94,3-100) - 85,1 (75,9-91,3)
11 (10-21) 56 [14/25] (35,3-75) 100 (94,3-100) 100 (73,2-100) 87,9 (79,0-93,5)
*Dias após o início dos dintomas; S = sensibilidade; E = especificidade; VPP = valor
preditivo positivo; VPN = valor preditivo negativo; N = número da amostra; IC = intervalo de
confiança.
Analisando os dois ensaios em conjunto, para a detecção da IgM e IgA,
observou-se um aumento da sensibilidade do diagnóstico, de 84,4% para 91%
(6,6%) para o total das amostras dos casos de dengue; na infecção primária passou
de 90,1% para 92,8%; entretanto, na infecção secundária houve um aumento
significativo (15,2), de 79,4% quando usamos apenas a IgM para 94,6% quando
usamos os ensaios em paralelo.
53
4. Discussão
Na infecção pelo DENV a imunoglobulina A é sintetizada simultaneamente à
IgM, podendo ser igualmente detectada no sangue (Balmaseda et al., 2003;
Talarmin et al., 1998), consequentemente, a IgA também poderia ser empregada
para fins de diagnóstico dessa infecção.
No presente estudo observou-se uma sensibilidade do ELISA para IgA de
42,2% (154/365), na IgM a positividade foi de 84,4% para as mesmas amostras. Em
outros estudos foram encontrados percentuais de positividade da IgA semelhantes
aos nossos: Talarmin et al. (1998) encontraram 47,75% (85/178) e Nawa et al.
(2005) 24,47% (23/94), enquanto Hernández et al. (2012) utilizando o teste
cromatográfico “Dengue IgA Rapid test” (ASSURE® ) detectaram a IgA em 61%
(105/172) das amostras testadas. Convém ressaltar que nesses estudos foi
analisado um menor número de amostras, além do que, em nossa casuística, levou-
se em conta a data da coleta da amostra em relação ao número de dias após o
início dos sintomas, bem como o tipo de infecção dos casos: 46,8% (171 amostras)
eram de casos de infecção primária e 53,2% de secundária (194 amostras).
A presença de IgA foi detectada em maior frequência nas amostras dos casos
de infecção secundária (55,2%), em contraste com 27,5% da infecção primária,
corroborando com os dados de Vázquez et al. (2005), que utilizando o AAC-ELISA
detectaram a IgA em 17% dos casos na infecção primária e em 62% na secundária.
Em oposição a esses resultados, Ahmed et al. (2010), obtiveram uma
sensibilidade de 100% na infecção primária e 99,2% na secundária, porém
empregando um teste rápido. Geralmente são encontrados resultados falsos
positivos em testes rápidos, o que em tese, poderia explicar os altos percentuais
encontrados. Outros estudos também observaram valores de sensibilidade mais
54
elevados quando aplicaram o teste rápido (ASSURE® Dengue IgA Rapid Test) para
detecção de IgA sérica (Hernández et al., 2012; Tan et al., 2011). No entanto,
Hernández et al. (2012) identificaram 14,9% (7/47) de reações positivas em
amostras de doadores de sangue negativos para dengue. Em nosso estudo, ao
utilizarmos esse mesmo kit para selecionar amostras de soro IgA positivas, a
sensibilidade encontrada foi de apenas 32,5% (13/40).
Diferenças na sensibilidade também podem ser explicadas pelo tipo de
infecção analisada, diferentes metodologias empregadas para detecção de IgA anti-
DENV e pela prevalência da infecção nas diferentes áreas geográficas. Nas regiões
onde o DENV é endêmico ocorrem mais casos de infecção secundária.
Em concordância com os resultados obtidos por Talarmin et al. (1998), não se
detectou a IgA em amostras coletadas após o 45º dia do inicio da infecção, apenas
uma única amostra de infecção primária foi reagente. Para Nawa et al. (2005), a IgA
permanece positiva por um menor período de tempo quando comparada com a IgM,
o que representa uma vantagem no seu emprego como diagnóstico. A presença de
IgM pode não indicar uma doença em curso, essa imunoglobulina pode permanecer
no sangue por três meses ou mais, após a infecção (Chen, Hwang, Fang, 1991;
Peeling et al., 2010).
Por outro lado, estudos têm demonstrado a ocorrência de sorologias
negativas para IgM em casos de infecções secundárias pelo DENV, mesmo em
amostras da fase convalescente (Guzmán e Kourí, 2004; Cordeiro et al, 2007). Esta
pesquisa mostrou que o AAC-ELISA foi capaz de detectar a IgA em 56% (14/25) das
amostras do grupo 11, cujo resultado de IgM foi negativo, tanto nas amostras de
soro coletadas na fase aguda quanto na convalescença e que foram confirmados
como dengue, clinicamente, por isolamento viral e por RT-PCR. Dessa forma, o
55
AAC-ELISA identificou a infecção em amostras que na prática clínica seriam
consideradas inconclusivas. Também nas amostras de infecção secundária a IgA foi
detectada antes da IgM, nas amostras coletadas 2 a 4 dias após o início dos
sintomas. Geralmente a IgA aparece um dia após a IgM (Balmaseda et al., 2003;
Talarmin et al., 1998).
Peeling et al. (2010) detectaram a IgM entre o 3º e o 5º dias após o início da
febre em cerca de 50% dos pacientes hospitalizados, apresentando uma
sensibilidade de 90% e especificidade de 98% quando os ensaios foram realizados
em cinco dias ou mais após o início da febre. Contudo, vários estudos
demonstraram que esses dados podem variar dependendo do tipo de infecção.
No estudo de Talarmin et al. (1998) o pico da IgA ocorreu no 8º dia após o
início da febre, contudo o tipo de infecção não foi estabelecido para a maioria das
amostras; para Balmaseda et al.; (2003) observou-se no 5º dia, já em nossa
casuística, para o grupo das amostras de infecção secundária, o maior percentual de
positividade também foi observado no 8º dia, diferentemente dos casos de infecção
primária que ocorreu no grupo com 30-35 dias do inicio dos sintomas.
Com relação à especificidade, o AAC-ELISA se mostrou muito eficiente, a IgA
não foi detectada nas amostras negativas para dengue e nem naquelas com IgM
positiva para o vírus febre amarela vacinal, indicando ausência de reação cruzada.
A fim de estimar o aumento na sensibilidade do diagnóstico avaliou-se a
aplicação em paralelo dos ensaios em conjunto para a detecção da IgM e IgA,
observando-se um aumento de 6,6% da sensibilidade, em relação à pesquisa da
IgM isoladamente, e nas infecções primária e secundária de 2,7% e 15,2%,
respectivamente. Ressaltando-se a importância de utilizar a pesquisa da IgM e IgA
em paralelo (Balmaseda et al., 2003; Nawa et al., 2005; Vázquez et al., 2007).
56
Apesar de apresentar-se menos sensível que a detecção da IgM, o AAC-
ELISA demonstrou ser uma importante ferramenta diagnóstica na infecção
secundária, onde há maior probabilidade da IgM não ser detectada. Além disso, o
AAC-ELISA mostrou-se especifico frente às amostras negativas para dengue e após
a vacinação contra febre amarela. A detecção em paralelo de IgM e IgA em casos
suspeitos de dengue aumentaria, significativamente, a sensibilidade do diagnóstico
sorológico.
Referências
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59
6 CONCLUSÕES DA
DISSERTAÇÃO
60
Foi detectada uma maior frequência de IgA na infecção secundária, assim como
a sensibilidade, valor preditivo positivo e negativo do AAC-ELISA;
Houve uma maior sensibilidade para detecção da IgA na infecção primaria entre
o 30º e 35º dias após o início dos sintomas e na infecção secundária no 8º dia,
indicando que a infecção pode ter ocorrido neste período.
A especificidade e o valor preditivo positivo foram similares em ambos os tipos
de infecções conforme os dias se sintomas;
O AAC-ELISA apresentou boa especificidade frente às amostras negativas para
dengue e após a vacinação contra o vírus da febre amarela;
A IgA foi detectada entre o 2º e 4º dias de sintomas, enquanto que a IgM estava
presente somente após o 5º dia após o inicio dos sintomas;
Após a aplicação em paralelo para detecção da IgM e IgA, foi observado um
maior ganho de sensibilidade na infecção secundária.
61
7 CONSIDERAÇÕES
FINAIS
62
Apesar de apresentar-se menos sensível que a detecção da IgM, o AAC-
ELISA demonstrou ser importante na infecção secundária, principalmente nos casos
onde a IgM não foi detectada. A aplicação do teste em paralelo aumentou a
sensibilidade do diagnóstico sorológico, além disso, o AAC-ELISA mostrou-se
especifico frente às amostras negativas para dengue e após a vacinação contra o
vírus da febre amarela.
O emprego dos dois ensaios pode fornecer informações úteis para a
interpretação dos resultados e, consequentemente, para a detecção de casos
recentes de dengue, auxiliando na adoção de medidas preventivas de modo a evitar
a ocorrência dos casos graves.
63
REFERÊNCIAS
64
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Referências elaboradas de acordo com
as normas da ABNT (NBR 6023).
68
APÊNDICES
69
APÊNDICE A
VERSÃO DO ARTIGO EM INGLÊS
Application of enzyme immunoassay capture of immunoglobulin A
(IgA) in the serological diagnosis of dengue
Viviane Martha Santos de Moraisa,b, Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlhob,c, Ana
Isabel Vieira Fernandesd, Jéfferson Luis de Almeida Silvaa,b, Verônica Gomes da
Silvae, Marli Tenório Cordeiroe
aPrograma de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-
PE Brasil; bSetor de Virologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade
Federal de Pernambuco, Recife-PE Brasil; cDepartamento de Fisiologia e Farmacologia do Centro de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil; dDepartamento de
Promoção da Saúde do Centro de Ciências Médicas da Universidade Federal da Paraíba;
eLaboratório de Virologia e Terapia Experimental do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FioCruz,
Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE Brasil
Abstract
Anti-dengue IgA was investigated by capture ELISA (AAcELISA) in sera of 365
dengue cases, being 171 primary (PI) and 194 secondary infections (SI), distributed
according to days of symptoms. The overall sensitivity was 42.2% (154/365) with
higher positivity in SI compared to PI (55.2% vs. 27.5%, p = 0.000); and 100%
specificity. In SI IgA was detected before IgM, 2-4 days after symptoms onset and in
10-21 days samples (without IgM). In PI, the highest sensitivity was 60.0% in
samples 30-35 days and in SI was 87.5% in 8 days samples. In SI cases without IgM
(group 11) IgA was detected in 56.0% of cases. Detection of IgM and IgA in parallel
70
increased the sensitivity, especially in SI (79.4% to 94.6%.). IgA ELISA used in
parallel with IgM ELISA increased the sensitivity of the diagnosis from 84.4% (IgM) to
91% (IgM and IgA), and would help in serological dengue diagnosis.
1. Introduction
Dengue is an acute viral disease caused by one of four serotypes of dengue
virus (DENV), which may manifest with a broad spectrum of signs and symptoms
similar to other acute febrile conditions (Oliveira et al., 2008).
Dengue can be observed in two patterns of immune response: the primary
infection that occurs in individuals who are not immune to any of the four serotypes of
the virus and secondary infection when the subject was re-infected with a different
serotype of DENV infection Previous (Halstead, 2007).
According to Halstead (2007), during primary infection viremia coincides with
the foot, characterized by a slow response with low antibody titers. The first arises
immunoglobulin is IgM, while IgG appears in low titers after the first week of the
disease, and increases slowly. Already in secondary infections are detected high
levels of IgG, even in the acute phase and increase in two consecutive weeks.
In the acute phase of dengue infection can be diagnosed by detection of viral
RNA by polymerase chain reaction associated reverse transcriptase (RT-PCR), by
isolating the virus, or by detection of antigen NS1. However, the enzyme
immunoassay for IgM antibody capture (MAC-ELISA) is the most commonly used
and allows for the presumptive diagnosis of active or recent infection. Uses a single
sample of patient serum and can be used until 70 to 90 days after the onset of
symptoms (Guzman et al. 2,010; Kuno, Gómez, Gubler, 1987).
71
The diagnosis of dengue performed only by the detection of immunoglobulin M
(IgM) has limitations when used in endemic regions, where there is a high prevalence
and movement of various serotypes, and not always the detection of IgM indicates an
acute and recent infection. Moreover, the results of this technique must be
interpreted cautiously because IgM may reflect an infection occurred up to eight
months (Chen, Hwang, Fang, 1991) and in some cases secondary infection
(sequential), production IgM is found at low levels and sometimes undetectable
(Balmaseda et al. 2003; Guzman, Kouri, 1996).
In dengue infection immunoglobulin A (IgA) is produced simultaneously with
IgM and can also be detected in the blood, could therefore be employed for
diagnostic purposes. According to some studies, detection of IgA anti-dengue IgM
may occur before and decreases faster than IgM was not found after 40 days of
onset of symptoms (Balmaseda et al. 2003; Talarmin et al. 1998).
Therefore, this study aimed to estimate the sensitivity and specificity of AAC-
ELISA for the detection of IgA anti-DENV, and assess whether this immunoglobulin is
a good marker to aid in the laboratory diagnosis of the disease.
2. Materials and Methods
2.1. Study population and sample size
Were included in this study 445 serum samples bank of biological samples at
the Department of Virology and Experimental Therapy (LaViTE), Research Center
Aggeu Magalhães/Fiocruz, Recife-PE, Brazil. We evaluated 365 samples from
patients with clinical suspicion of dengue enrolled in public and private hospitals in
the city of Recife confirmed as dengue, as described by Lamb et al. (2007),
72
distributed into 11 groups according to the number of days of symptoms as shown in
Table 1.
Table 1
Serum samples used in this study distributed in groups according to the number of days after
the onset of fever and status of infection
Groups
Days after
symptoms
onset
Presence
of
IgM
*Type of Infection
PI
(N=171)
SI
(N=194)
Total
(N=365)
1#
2-4 No 17 15 32
2 5 Yes 17 19 36
3 6 Yes 16 15 31
4 7 Yes 19 19 38
5 8 Yes 17 16 33
6 9 Yes 15 16 31
7 10 Yes 16 17 33
8 15-20 Yes 16 21 37
9 30-35 Yes 20 17 37
10 45-50 Yes 18 14 32
11#
10 - 21 No - 25 25
*Type of dengue infection is indicated as all types (Total), primary infection (PI), secondary
infection (SI); (N=) number of sera tested; #Samples from dengue cases with IgM negative,
but with virus isolation and/or RT-PCR positive.
Additionally, we included two groups of negative controls for comparison:
group 12, composed of samples from 40 healthy individuals were negative for
dengue and the group composed of 13 samples collected from the same individuals
after vaccination against yellow fever IgM positive for this virus for the purpose of
evaluating the occurrence of cross-reactivity. Serum samples were stored at -20 ° C
73
in small aliquots.
2.2. Characterization of samples of cases of dengue
Briefly, the diagnostic laboratory for confirmation and characterization of
dengue cases was performed as described below:
For the isolation of the virus was used cell line mosquito Aedes albopictus,
clone C6/36 (Igarashi, 1978), using the L15 Leibovitz medium (GIBCO, Invitrogen
Co., Grand Island, New York) with 5% fetal bovine serum in the growth medium and
2% for maintenance medium. The virus isolates were identified by indirect
immunofluorescence (Henchal et al., 1982), using monoclonal antibodies to the four
serotypes of DENV (Bio-Manguinhos/Fiocruz).
The molecular diagnosis was made by polymerase chain reaction preceded by
reverse transcription (RT-PCR). The extraction of viral RNA from serum was
performed using the QIAmp Viral Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). For the
detection and identification of viral RNA virus was used protocol described by
Lanciotti et al. (1992). In this technique, primers are used (primers) universal dengue
virus genes located in the C and prM and serotype is identified by using serotype-
specific primers in a semi-nested PCR in a second amplification.
For detection of IgM and IgG anti-dengue ELISA kits were used PanBio of
capture, anti-dengue IgM and IgG anti-dengue ELISA (PanBio, Pty. Ltd., Brisbane,
Australia) and tests performed and interpreted as recommended by the
manufacturer.
The characterization of the patient's immune response to infection with dengue
virus in primary and secondary been made based on the kinetics of antibody IgM and
IgG, according to the following criteria: A) Primary Infection was defined as the
absence of antibodies IgG anti-dengue in the serum sample collected during the
74
acute phase of disease, while IgM was present, and / or virus isolation and / or RT-
PCR positive. In the second sample collected in the convalescent phase, IgG
antibodies to dengue were detected, being observed serologic conversion. B)
Secondary Infection was defined by the detection of IgG anti-dengue antibodies in
the serum sample collected during the acute phase of the disease and the absence
of anti-dengue IgM associated (or not) with virus isolation and / or RT-PCR positive,
some cases. In serum sample collected during convalescent specific IgM antibodies
were detected (Lamb et al, 2007b).
2.3. Characterization of the negative controls
Serum samples used as negative controls were obtained from healthy
individuals before receiving the yellow fever vaccine (n = 40), with a new collection of
the same individuals 30 to 60 days after vaccination (n = 40; with IgM and IgG
positive for yellow fever). These were subjected to tests for detection of anti-dengue
IgM, IgG and IgM ELISA for yellow fever virus and the neutralization test plaque
reduction to yellow fever, as described in Melo et al. (2011). Besides these samples
was used as a negative control test in all experiments, a pool of sera negative for
dengue, yellow fever, rubella, measles and parvovirus.
2.4. Characterization of the positive control
To obtain samples of serum IgA positive for dengue, used as positive control
in the assays, were screened 40 serum samples positive for dengue IgM by the rapid
immunochromatographic test ASSURE ® Dengue IgA Rapid Test (MP Diagnostics),
of which 13 samples were positive pool was made a six sera and stored at -20 ° C in
small aliquots.
75
2.5. Enzyme immunoassay for detection of IgA
The capture enzyme immunoassay for IgA in house (AAC-ELISA) used in the
study was based on the protocol of the MAC-ELISA developed by Kuno, Gómez,
Gubler (1987), with some modifications.
Sensitization of the microplate - In the first step of the assay polystyrene microplates
with 96 wells were washed with a solution buffered saline (PBS) with 0.05% Tween.
Then 100µL were sensitized with anti-human IgA (SIGMA) diluted in carbonate buffer
pH 9.0, containing 2μg/poço and incubated for 24 hours at 4 ° C in a moist chamber.
The next day was carried out five washes with PBS/0,05% Tween.
Blocking of nonspecific sites - the second stage in blocking nonspecific sites with the
addition of 200 µL of PBS solution containing 4% bovine albumin fraction V (BSA) -
(INLAB) in microplates and incubation at room temperature in a moist chamber for 30
minutes, then washed four times with PBS/0,05% Tween.
Addition of samples - Samples of serum, positive and negative control were diluted
1:10 in PBS pH 7.4 with 1% BSA (assay diluent) and 50 l these samples were
dispensed in microplate wells in duplicate. Two holes were intended for white
containing 50µL of diluent, then the plate was incubated for 1 h at 37 ° C in a humid
chamber, with subsequent washing.
Addition of antigens - antigens were used for each serotype of DENV produced in
mouse brain (extracted by acetone), the Service Arbovirology the Evandro Chagas
76
Institute (Ministry of Health), Bethlehem (PA), kindly provided by Dr. Pedro
Vasconcelos . The antigens were previously titrated individually to determine the
optimal dilution thereof. Reaction was used in a pool of four antigens diluted (1/30) in
PBS/1% BSA and dispensed 50µL per well, incubation for 1 h at 37 ° C in a moist
chamber, followed by five washes.
Addition of secondary antibody - 25 were dispensed l (per well) of anti-flavivirus
secondary antibody (MAB 6B6C-1), conjugated to peroxidase (CDC, USA),
previously titrated, 1/13.000 diluted in PBS / 1% BSA , followed by incubation for 1 h
at 37 ° C and five washings after this time.
Addition of substrate - microplate were added to 100µL of the substrate tetramethyl-
benzidine (TMB Substrate Reagent Set, BD Biosciences) and incubated for 30
minutes at room temperature, protected from light. After this time the reaction was
stopped by adding 100 µL/well of a solution of H2SO4 12.5%. The reading of the
optical density (OD) of samples was performed on a spectrophotometer (Bio-Rad
Laboratories, Inc.) using 450 nm filter.
Interpretation of results - For the interpretation of the results we calculated an index
value based on the following calculation: mean absorbance of test serum / mean
absorbance of the negative control. Were considered positive (reactive) samples
showed that the value of the index greater than two and negative (non-reactive)
those with index value equal to or less than two. The samples with indeterminate
results were repeated.
77
2.6. Statistical Analysis
The results of the readings obtained at the AAC-ELISA were stored in an
Excel spreadsheet. Statistical analysis was performed using Epi-Info 6.04d. We
applied the chi-square test, assuming a p <0.05 to evaluate the significance of the
detection of IgA in primary and secondary infection. Additionally was applied the
detection of IgM and IgA in parallel to estimate the sensitivity of both tests.
3. Results
The sample of 365 confirmed cases of dengue (by virus isolation, RT-PCR
and/or detection of IgM/IgG), included in this study had a positive overall IgA 42.2%
(154/365) with increased frequency in infection secondary compared to primary
infection (55.2% (107/194) vs. 27.5% (47/171), p = 0.000). In addition, the AAC-
ELISA was 2 times (55.2/27.5) more sensitive for secondary infection when
compared to the primary. The positivity for IgM was 84.38% (308/365).
Figure 1 shows the distribution of IgA-positive cases according days of
symptoms, primary and secondary infection. The highest percentage of positive IgA
in primary infection occurred between the 30th and 35th days of symptoms, while in
secondary infection occurred on the 8th day of symptoms. From the 45th day of
symptoms (group 10) IgA was no longer detected, only one sample was positive
(1/18) in the primary infection.
78
Fig. 1. Detection of DENV IgA antibodies in primary and secondary dengue infections cases
according to the number of days after the onset of symptoms.
It is observed that the secondary infection estimated values for sensitivity and
negative predictive value of AAC-ELISA were higher than in the primary infection
(Table 2).
Table 2
Distribution of sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of AAC-ELISA in
primary and secondary infection by DENV
Type of
infection
S
(95% CI)
E
(95% CI)
PPV
(95% CI)
PNV
(95% CI)
Primary Infection 27.5
(21.1-34.9)
100
(94.3-100)
100
(90.6-100)
39.2
(32.5-46.3)
Secondary Infection 55.2
(47.9-62.2)
100
(94.3-100)
100
(95.7-100)
47.9
(40.2-55.7)
S = sensitivity, specificity = E; PPV = positive predictive value, NPV = negative
predictive value, CI = confidence interval.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
3 . 4 5 6 7 8 9 10 15-20 30-35 45-50
% P
ositiv
ity
Days after Symptoms onset
Primary Secondary
79
Tables 3 and 4 are shown the values of sensitivity, specificity, positive
predictive value and negative for all groups, distributed according to days of
symptoms in primary and secondary infection, respectively.
In primary infection AAC-ELISA showed higher sensitivity (60.0%, 12/20) in
samples collected at 30 to 35 days of symptoms (group 9), while the samples of
infection secondary to higher sensitivity (87.5% , 14/16) was observed in group 5,
collected on the eighth day of symptoms. Regardless of days of symptoms, the
specificity of AAC-ELISA was 100% (94.3 - 100) in both types of infection.
80
Table 3
Distribution of sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of AAC-ELISA in
primary infection cases in relation to the number of days since symptoms onset
Groups
(Days*)
Sensitivity, % [N]
(CI)
Specificity, %
(CI)
PPV
(CI)
NPV
(CI)
1 (2-4) - (0/17) 100 (94.3-100) - 82.5 (73.1-89.5)
2 (5) 17.6 [3/17] (4.7-44.2) 100 (94.3-100) 100 (31-100) 85.1 (75.9-91.3)
3 (6) 18.7 [3/16] (5-46.3) 100 (94.3-100) 100 (31-100) 86.0 (76.9-92.1)
4 (7) 21.1 [4/19] (7-46.1) 100 (94.3-100) 100 (39.6-100) 84.2 (75.0-90.6)
5 (8) 23.5 [4/17] (7.8-50.2) 100 (94.3-100) 100 (39.6-100) 86.0 (76.9-92.1)
6 (9) 26.6 [4/15] (8.9-55.2) 100 (94.3-100) 100 (39.6-100) 87.9 (79.0-93.5)
7 (10) 50.0 [8/16] (25.5-74.5) 100 (94.3-100) 100 (59.8-100) 90.9 (82.4-95.7)
8 (15-20) 50.0 [8/16] (25.5-74.5) 100 (94.3-100) 100 (59.8-100) 90.9 (82.4-95.7)
9 (30-35) 60.0 [12/20] (36.4-80.0) 100 (94.3-100) 100 (69.9-100) 90.9 (82.4-95.7)
10 (40-45) 5.6 [1/18] (0.3-29.4) 100 (94.3-100) 100 (5.5-100) 82.5 (73.1-89.2)
*Days refer to the day since symptoms onset; [N] = number of positive samples/total samples
tested; (CI) = 95% confidence interval; PPV = positive predictive value; NPV = negative
predictive value.
We observed a percentage of positive IgA 56% (14/25) for the samples of
group 11 (Table 4) were collected between 10 and 21 days of symptoms
corresponding to cases of secondary infection by DENV, where no IgM detection.
The AAC-ELISA had a specificity of 100% in samples negative for dengue (group 12)
and the samples collected after vaccination against yellow fever virus (group 13),
demonstrating the absence of cross-reactivity between dengue and yellow fever.
81
Table 4
Distribution of sensitivity, specificity, positive predictive value and negative secondary
infection cases in relation to the number of days since symptoms onset
Groups
(Days*)
Sensitivity, % [N]
(CI)
Specificity, %
(CI)
PPV
(CI)
NPV
(CI)
1 (2-4) 26.7 [4/15] (8.9-55.2) 100 (94.3-100) 100 (39.6-100) 87.9 (79.0-93.5)
2 (5) 73.7 [14/19] (48.6-89.9) 100 (94.3-100) 100 (73.2-100) 94.1 (86.2-97.8)
3 (6) 66.7 [10/15] (38.7-87) 100 (94.3-100) 100 (65.5-100) 94.1 (86.2-97.8)
4 (7) 84.2 [16/19] (59.5-95.8) 100 (94.3-100) 100 (75.9-100) 96.4 (89.1-99.1)
5 (8) 87.5 [14/16] (60.4-97.8) 100 (94.3-100) 100 (73.2-100) 97.6 (90.6-99.6)
6 (9) 56.3 [9/16] (30.6-79.2) 100 (94.3-100) 100 (62.9-100) 92.0 (83.6-96.4)
7 (10) 70.6 [12/17] (44.0-88.6) 100 (94.3-100) 100 (69.9-100) 94.1 (86.2-97.8)
8 (15-20) 47.6 [10/21] (26.4-69.7) 100 (94.3-100) 100 (65.5-100) 87.9 (79.0-93.5)
9 (30-35) 23.5 [4/17] (7.8-50.2) 100 (94.3-100) 100 (39.6-100) 86.0 (76.9-92.1)
10 (40-45) 0 [0/14] 100 (94.3-100) - 85.1 (75.9-91.3)
11 (10-21) 56 [14/25] (35.3-75) 100 (94.3-100) 100 (73.2-100) 87.9 (79.0-93.5)
*Days refer to the day since symptoms onset; [N] = number of positive samples/total samples
tested; (CI) = 95% confidence interval; PPV = positive predictive value; NPV = negative
predictive value.
Analyzing the two tests together for detection of IgM and IgA, we observed an
increase in diagnostic sensitivity from 84.4% to 91% (6.6%) to the total sample of
cases of dengue; primary infection increased from 90.1% to 92.8%, although in
secondary infection there was a significant increase (15.2%), 79.4% when using only
IgM to 94.6% when we use the testing in parallel.
82
4. Discussion
DENV infection in immunoglobulin A IgM is synthesized simultaneously with,
and may also be detected in the blood (Balmaseda et al. 2003; Talarmin et al. 1 998)
thus IgA could also be used for diagnostic purposes such infection.
In the present study we observed a sensitivity of ELISA for IgA 42.2%
(154/365) in IgM positivity was 84.4% for the same samples. In other studies found
the percentage of positive IgA similar to ours: Talarmin et al. (1998) found 47.75%
(85/178) and Nawa et al. (2005) 24.47% (23/94), while Hernandez et al. (2012) using
the chromatographic test "Dengue IgA Rapid test" (ASSURE ®) IgA detected in 61%
(105/172) of specimens tested. It is worth noting that these studies was analyzed a
smaller number of samples, in addition to that in our study, we took into account the
date of sample collection in relation to the number of days after onset of symptoms
as well as the type of infection cases: 46.8% (171 samples) were cases of primary
infection and 53.2% of secondary (194 samples).
The presence of IgA was detected in samples more frequently in cases of
secondary infection (55.2%), in contrast to 27.5% of primary infection, corroborating
data Vázquez et al. (2005), that using the AAC-ELISA IgA detected in 17% of cases
the primary infection and 62% in secondary.
In contrast to these results, Ahmed et al. (2010) obtained a sensitivity of 100%
in primary infection and 99.2% in secondary, but using a rapid test. They are usually
found in false positive rapid tests, which in theory could explain the high percentage
found. Other studies have also observed higher sensitivity when applied the rapid
test (ASSURE ® Dengue IgA Rapid Test) for detection of serum IgA (Hernández et
al., 2012; Tan et al., 2011). However, Hernandez et al. (2012) identified 14.9% (7/47)
of positive reactions in samples of blood donors negative for dengue. In our study,
83
we used this same kit to select samples of serum IgA positive, the sensitivity was
only 32.5% (13/40).
Differences in sensitivity can also be explained by the type of infection
analyzed, different methodologies used for detection of IgA anti-DENV and the
prevalence of infection in different geographical areas. In areas where DENV is
endemic occur most cases of secondary infection.
In agreement with the results obtained by Talarmin et al. (1998), IgA was not
detected in samples collected after the 45th day from the beginning of infection, only a
single sample of primary infection was positive. For Nawa et al. (2005), IgA remains
positive for a shorter time when compared with the IgM, which represents an
advantage in their use as diagnostics. The presence of IgM may not indicate a
disease in progress, this immunoglobulin may remain in the blood for three months or
more after infection (Chen, Hwang, Fang, 1991; Peeling et al., 2010).
Furthermore, studies have demonstrated the occurrence of negative for IgM
serology in cases of secondary infection by DENV, even in convalescent phase
samples (Guzman and Kouri, 2004, Lamb et al, 2007). This study showed that the
AAC-ELISA was able to detect IgA in 56% (14/25) samples of group 11, whose result
IgM was negative in both the serum samples collected during acute and
convalescent and were confirmed as dengue clinically by virus isolation and RT-
PCR. Thus, the AAC-ELISA identified infection in samples which in clinical practice
would be considered inconclusive. Also in samples of secondary infection IgA IgM
was detected before, in samples collected 2-4 days after the onset of symptoms.
Generally IgA appears one day after IgM (Balmaseda et al. 2003; Talarmin et al.
1998).
84
Peeling et al. (2010) detected IgM between the 3rd and 5th days after the onset
of fever in approximately 50% of hospitalized patients with a sensitivity of 90% and
specificity of 98% when the tests were performed in five days or more after initiation
fever. However, several studies have shown that these data may vary depending on
the type of infection.
In the study of Talarmin et al. (1998) peak of IgA occurred on the 8 th day after
the onset of fever, however the type of infection has not been established for most of
the samples for Balmaseda et al.; (2003) was observed on day 5, as in our series, for
the group of samples from secondary infection, the highest percentage of positivity
was also observed on the 8th day, unlike the cases of primary infection that occurred
in the group with 30-35 days of onset of symptoms.
Regarding specificity, the AAC-ELISA proved to be very efficient, IgA was not
detected in samples negative for dengue, nor those with IgM positive for yellow fever
virus vaccine, indicating no cross-reaction.
In order to estimate the increase in diagnostic sensitivity was assessed
parallel implementation of testing kit for the detection of IgM and IgA, observing a
6.68% increase in sensitivity compared to the research of IgM alone and in primary
and secondary infections of 2.7% and 15.2%, respectively. Underscoring the
importance of using research IgM and IgA in parallel (Balmaseda et al., 2003; Nawa
et al., 2005; Vázquez et al., 2007).
Despite presenting themselves less sensitive than detection of IgM, the AAC-
ELISA is an important diagnostic tool in secondary infection, where there is a higher
probability of not being detected IgM. Moreover, the AAC-ELISA was shown to be
specific face of negative samples after dengue and yellow fever vaccination. The
85
parallel detection of IgM and IgA in suspected dengue cases increase significantly
the sensitivity of serological diagnosis.
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88
ANEXOS
89
ANEXO A Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE
90
ANEXO B Normas para Publicação da revista
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease
Instructions to Authors
As of 01 June 2005, all new manuscripts must be submitted through the Diagnostic
Microbiology and Infectious Disease online submission and review Web site (
http://ees.elsevier.com/dmid/ ). Authors are requested to submit the text, tables, and
artwork in electronic form (not as a PDF ) to this address. In an accompanying letter,
authors should state that the manuscript, or parts of it, have not been and will not be
submitted elsewhere for publication. Authors are highly encouraged to include a list
of three or more potential reviewers for their manuscript, with complete contact
information.
Submission items include a cover letter (save as a separate file for upload),
suggested reviewers, the manuscript (including title page, abstract, manuscript text,
references, and table/figure legends), tables, and figures. Revised manuscripts
should also be accompanied by a unique file (separate from the covering letter) with
responses to reviewers' comments. The preferred order of files is as follows: cover
letter, suggested reviewers, response to reviews (revised manuscripts only),
manuscript file(s), table(s), figure(s). Files should be labeled with appropriate and
descriptive file names (e.g., SmithText.doc, Fig1.eps, Tables3.doc). Upload text,
tables and graphics as separate files. (You can compress multiple figure files into a
Zip file and upload that in one step; the system will then unpack the files and prompt
you to name each figure.) Do not import figures or tables into the text document and
do not upload your text as a PDF. Complete instructions for electronic artwork
submission can be found on the Author Gateway, accessible through the journal
home page. Your figures will be tested by an artwork quality check tool; you will be
91
asked to view the results before you can complete your submission. Your figures can
move into review if not up to production standards, but you should be prepared to
provide better quality figures should we express interest in your manuscript.
Authors who are unable to provide an electronic version or have other circumstances
that prevent online submission must contact the Editors prior to submission to
discuss alternate options. The Publisher and Editors regret that they are not able to
consider submissions that do not follow these procedures.
Please note, although the Elsevier Editorial System Registration page asks if you are
available for reviews, we are not currently seeking new reviewers as members of the
Editorial Board. All other correspondence should be addressed to the Editor in Chief:
Ronald N. Jones, M.D., Editorial Office, Diagnostic Microbiology and Infectious
Disease, Suite A, 345 Beaver Kreek Centre, North Liberty, Iowa 52317, USA.
Manuscripts
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articles), or short notes. Manuscripts are accepted with the understanding that they
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indicating that they have read and are familiar with the current "Instructions to
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conditions. The letter should indicate that all of the named authors and
acknowledged parties have agreed to the submitted draft of the paper or, as
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the content/submission is original/unpublished and has not been simultaneously
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proceedings, letters, and brief communications) must be declared on the title page.
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92
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Manuscripts should be submitted via the Elsevier Editorial System, in English,
double-spaced, and, where appropriate, divided into Introduction; Materials and
Methods, which should include sufficient technical information so that experiments
can be repeated and which should give sources of unusual chemicals, reagents,
equipment, or microbial strains; Results, which should describe the design of the
experiments as well as the results using text, tables, or figures; and Discussion,
which should provide an interpretation of the results in relation to previously
published work. An abstract is required for all papers; it should be 150 words or less
for full-length papers and 50 words or less for notes. Papers for the Notes category,
which is intended for the presentation of brief observations (including instructive case
reports), that do not warrant full-length papers, should not contain any section
heading and should not exceed 1,000 words.
The first page of the manuscript should include: title, running title of not more than 45
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the work was performed, and the corresponding author's full address, telephone
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be noted. Any footnotes to the text should be numbered using Arabic numerals and
should be typed on the page of the manuscript on which they are referred to.
Tables
Tables should be on separate files and numbered using Arabic numerals. Each table
should have a brief title with detailed information appearing as footnotes bearing
superscript, lower-case letters. Vertical rules should be avoided.
References
Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference
list (and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full.
Unpublished results and personal communications should not be in the reference list,
but may be mentioned in the text. Citation of a reference as 'in press' implies that the
93
item has been accepted for publication. Diagnostic Microbiology and Infectious
Disease uses the standard 'Vancouver' system with name and year in the text.
Text: All citations in the text should refer to:
1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity) and
the year of publication;
2. Two authors: both authors' names and the year of publication;
3. Three or more authors: first author's name followed by 'et al.' and the year of
publication.
Citations may be made directly (or parenthetically). Groups of references should be
listed first alphabetically, then chronologically.
Examples: "as demonstrated in wheat (Allan, 1996a, 1996b, 1999; Allan and Jones,
1995). Kramer et al. (2000) have recently shown ...."
List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted
chronologically if necessary. More than one reference from the same author(s) in the
same year must be identified by the letters "a", "b", "c", etc., placed after the year of
publication.
Examples:
Reference to a journal publication: Van der Geer J, Hanraads JAJ, Lupton RA. The
art of writing a scientific article. J Sci Commun 2000;163:51-9.
Reference to a book: Strunk Jr W, White EB. The elements of style. 3rd ed. New
York: Macmillan, 1979.
Reference to a chapter in an edited book: Mettam GR, Adams LB. How to prepare an
electronic version of your article. In: Jones BS, Smith RZ, editors. Introduction to the
electronic age. New York: E-Publishing Inc.; 1994. p. 281-304.
Note shortened form for last page number. e.g., 51-9, and that for more than 6
authors the first 6 should be listed followed by 'et al.' For further details you are
referred to "Uniform Requirements for Manuscripts submitted to Biomedical Journals"
(J Am Med Assoc 1997;277:927-34), see also
http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/terms_cond.html
94
Figures
All manuscripts must be accompanied by complete artwork. Each figure must be on a
separate file. Electron micrographs should be of sufficient contrast to withstand
reduction and printing at the journal page size. The cost of printing color photographs
must be borne by the author. Any graphs, charts, or diagrams should be finished
drawings, using type size large enough to be read easily when reduced to page size.
Proofs and Reprints
The corresponding author will receive page proofs, which should be corrected and
returned within 48 hours of receipt. Corrections are limited to printer's errors and no
substantial author's changes will be made. Reprints may be ordered at the price
listed on the order form accompanying the proofs.
Style and Nomenclature
Authors should use the CBE (Council of Biology Editors) Style Manual, 5th ed., as a
general guide for style. The names of chemical compounds should conform with
Chemical Abstracts and its indexes or The Merck Index, 11th ed. Enzymes and
biochemical terms should bear the recommended, trivial name listed in the latest
edition of Enzyme Nomenclature. Whenever possible, use generic drug names.
Binary names consisting of a generic name and a species name must be used for all
microorganisms. Names of general and higher categories may be used alone.
However, a species name must be preceded by the complete generic name the first
time that it is used in the manuscript. Following this, the generic name should be
abbreviated to the initial capital letter (for example, S. aureus), provided there can be
no confusion with other genera of organisms used in the paper. The nomenclature for
bacteria should follow well-established references such as Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology (current edition) or the Manual of Clinical Microbiology,
8th ed., or validation lists and specific articles published in the International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology since January 1, 1989. Informative web
sites are available as well ( http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm and
95
http://www.bacterio.cict.fr ).
Nomenclature and classifications of fungi and yeasts are the responsibility of the
manuscript authors as guided by published sources such as Ainsworth and Bisby's
Dictionary of the Fungi, 9th ed. (2001) and The Yeasts: A Taxonomic Study, 4th ed.
(1998).
Names used for viruses should be those listed in the International Committee on
Taxonomy of Viruses publication (Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature
of Viruses: Seventh Report of the International Committee of Taxonomy and Viruses,
2000). Synonyms may be used in parentheses when the name is first used in
conjunction with the approved generic (or group) and family names.
Copyright
Upon acceptance of an article by the journal, the author(s) will be asked to transfer
copyright of the article to the publisher. This transfer will insure the widest possible
dissemination of information under the US copyright law. Unless this agreement is
executed, the journal will not publish the manuscript.
