Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIAESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIAPrograma de Pós-Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Avaliação da PCR, PCR multiplex e nested PCR no
diagnóstico de Theileria equi em eqüinos
DANIELLE CUSTÓDIO LEAL
ii
Salvador-Bahia2010
DANIELLE CUSTÓDIO LEAL
Avaliação da PCR, PCR multiplex e nested PCR no diagnóstico de Theileria equi em eqüinos
Dissertação apresentada à Escola de MedicinaVeterinária da Universidade Federal da Bahia,
como requisito para a obtenção do título deMestre em Ciência Animal nos Trópicos, na
área de Saúde Animal.
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Roberto MadrugaCo-orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Franke
Salvador – Bahia2010
iii
FICHA CATALOGRÁFICAELABORADA PELA BIBLIOTECA DA EMV – UFBA
Leal, DanielleAvaliação da PCR, PCR multiplex e nested PCR no diagnóstico de Theileria equi
em eqüinos. Danielle Leal. – Salvador-Bahia, 08 de fevereiro de 2010. 56p.
Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, 2010.
Professor Orientador: Prof. Dr. Cláudio Roberto MadrugaProfessor Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Franke
Palavras chaves: 1- Bahia, 2- Eqüinos, 3- PCR, 4- nested PCR, 5- Theileria equi
iv
AVALIAÇÃO DA PCR, PCR MULTIPLEX E NESTED PCR NO DIAGNÓSTICO DE THEILERIA EQUI EM EQÜINOS.
DANIELLE LEAL
Dissertação defendida e aprovada para a obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Salvador, 08 de fevereiro de 2010.
Comissão Examinadora:
_____________________________________________________________________Prof. Dr. Cláudio Roberto Madruga - UFBAOrientador
______________________________________________________________________Prof. Dra. Ana Paula Cardoso Peixoto - UFRB
_____________________________________________________________________Prof. Dr. Luís Fernando Pita Gondim - UFBA
v
Aos meus pais, meus orgulhos, que tornaram tudo possível.
vi
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Beto e Eliane pela minha formação e amor eterno, tudo que realizo é
pensando em vocês.
Aos meus irmãos Sheila e Junior pelo companheirismo e amor.
Ao Professor Dr. Cláudio Roberto Madruga pela orientação, pelo exemplo de dedicação
à pesquisa e pela amizade compartilhada durante a realização deste trabalho.
Ao Professor Dr. Carlos Roberto Franke pela amizade, colaboração e orientações no
desenvolvimento deste trabalho e durante toda vida acadêmica.
À minha amiga e companheira de trabalho, médica veterinária e pesquisadora dedicada
Bárbara Paraná pelo auxílio científico e emocional.
Aos colegas do Laboratório de Infectologia Veterinária: Sabrina, Lídia, Flávia, Cristiane
pela amizade.
Aos professores do mestrado pelos ensinamentos compartilhados.
A Eduardo e minha amigas do G9, meus suportes emocionais aqui em Salvador.
vii
ÍNDICE
1.INTRODUÇÃO..............................................................................................................1
2.REVISÃO DE LITERATURA......................................................................................4
1.1. ETIOLOGIA ............................................................................................................................. 4
1.1.1. CLASSIFICAÇÃO ................................................................................................................... 4
1.1.2. MORFOLOGIA ..................................................................................................................... 6
1.2. CICLO DE VIDA ....................................................................................................................... 7
1.3. TRANSMISSÃO ....................................................................................................................... 8
1.4. EPIDEMIOLOGIA .................................................................................................................. 10
1.5. ALTERAÇÕES CLÍNICAS E LABORATORIAIS ........................................................................... 16
1.6. DIAGNÓSTICO ...................................................................................................................... 19
1.6.1. DIAGNÓSTICO DIRETO ...................................................................................................... 19
1.6.1.1. EXAME MICROSCÓPICO ................................................................................................. 19
1.6.1.2. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ................................................................. 20
1.6.2. DIAGNÓSTICO INDIRETO ................................................................................................. 22
1.6.2.1. TESTE DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO ......................................................................... 22
1.6.2.2. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA ................................................................................ 23
1.6.2.3. ELISA 25
1.7. PREVENÇÃO ......................................................................................................................... 26
1.8. TRATAMENTO ...................................................................................................................... 27
3.OBJETIVO...................................................................................................................28
4.ARTIGO CIENTÍFICO................................................................................................29
viii
LISTA DE TABELAS Página
TABELA 1 - Determinação da sensibilidade da PCR (PCR-Teq), Nested PCR (NPCR-Teq) e PCR multiplex (M/PCR) para diagnóstico de Theileria equi por diluições múltiplas de DNA de equinos comprovadamente infectados por esse hemoparasito....................................................................................................................41
TABELA 2 - Número e percentagem de reações positivas e negativas da PCR-Teq, nested PCR (NPCR-Teq) e PCR multiplex (M/PCR) para diagnóstico de T. equi em DNA extraído do sangue de eqüinos sorologicamente positivos em teste ELISA .........................................................................................................................................42
TABELA 3 - Resultado da PCR (PCR-Teq), nested PCR (N/PCR-Teq) e PCR multiplex (M/PCR) para diagnóstico de T. equi dos animais provenientes de fazenda e cavalaria/haras do estado da Bahia..................................................................................43
ix
LISTA DE FIGURAS Página
FIGURA 1 - Gel de agarose 1,5% da PCR para T. equi (PCR-Teq) em amostras de estudo epidemiológico. 1. Marcador 100pb, 2. Controle negativo, 3. Controle positivo, 4, 6, 7, 10, 15, 16, 20 e 22. Amostras negativas, 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19 e 21. Amostras positivas.......................................................................................................... 40
x
LEAL, D. Avaliação da PCR, PCR multiplex e nested PCR no diagnóstico de Theileria equi em eqüinos. Salvador, Bahia, 2010, 56p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2010.
RESUMO
O presente trabalho avalia a sensibilidade, especificidade e desempenho da PCR de T. equi de seqüências do gene 18S rRNA no formato padrão e multiplex em relação a nested-PCR, através da aplicação das técnicas em amostra de sangue de eqüino sabidamente positivo para T. equi, em amostras de papas de hemáceas positivas (n=19) e negativas (n=30) em teste ELISA e em amostras de sangue de eqüinos (n=118) do estado da Bahia. A avaliação de PCR no seu formato padrão (PCR-Teq), PCR multiplex (M/PCR) e nested PCR (N/PCR), evidenciou sensibilidade idêntica entre primeira e terceira técnica de diagnóstico de T. equi na diluição de DNA de cavalo comprovadamente positivo para esse hemoparasito (1:128). A análise de concordância entre soros positivos de eqüinos no teste ELISA indicou uma concordância elevada entre esse teste e a PCR-Teq (κ =0,780) e moderada com N/PCR-Teq (κ = 0,562) e M/PCR (κ = 0,488). A freqüência de T. equi foi maior nos eqüinos de criação extensiva que nos de criação intensiva, e em ambos os sistemas a PCR-Teq determinou uma freqüência significativamente superior que as demais técnicas (p= 0,000), embora todas tenham indicado uma situação endêmica para T. equi no estado da Bahia. Portanto a PCR-Teq demonstrou desempenho apropriado para ser utilizada em estudos epidemiológicos e para detecção de eqüídeos portadores de T. equi.
Palavras-Chaves: Bahia, Equinos, PCR, Nested PCR, Theileria equi
xi
LEAL, D. Evaluation of PCR, multiplex PCR and nested PCR in the diagnosis of Theileria equi in horses. Salvador, Bahia, 2010, 56p. Dissertation (Master' Degree in Animal Science in the Tropics) – School of Veterinarian Medicine, Federal University of Bahia, 2010.
SUMMARY
The present study evaluates the sensitivity, specificity and performance of T. equi 18S rRNA gene PCR conventional and multiplex PCR against nested-PCR, by applying the techniques in blood samples of known equine positive for T. equi, in samples of mashed red cells positive (n = 19) and negative (n = 30) in ELISA and in blood samples from horses (n = 118) of the state of Bahia. PCR assessment of conventional PCR (PCR-Teq), multiplex PCR (M/PCR) and nested PCR (N/PCR), showed similar sensitivity between the first and third diagnostic technique for detection of T. equi in equivalent dilution of DNA of horse proved positive for this hemoparasite (1:128).The analysis of concordance between positive sera of horses in the ELISA showed a high correlation between these tests and PCR-Teq (κ = 0,780) and moderate with N/PCR-Teq (κ = 0,562) and M/PCR (κ = 0,488). T. equi frequency was higher in horses from extensive farming than in intensive farming system, and in both systems the PCR-Teq determined a significantly higher frequency than the other techniques (p = 0.000). The results indicated a endemic situation for T. equi in the state of Bahia. Therefore the PCR-Teq demonstrated suitable performance for use in epidemiological studies and for detection of T. equi carriers equine.
Keywords: Bahia, Horses, PCR, Nested PCR, Theileria equi
1
1. INTRODUÇÃO
A babesiose eqüina, também denominada de piroplasmose eqüina ou
nutaliose, está disseminada em áreas tropicais e subtropicais das Américas, Ásia,
África e Sudeste da Europa (FRIEDHOFF 1982, UILENBERG, 2006), sendo o
Brasil uma área endêmica com prevalências variáveis de 5,5 a 96,0%
(BATTSETSEG et al., 2002a; COSTA-PEREIRA et al., 2007; HEIM et al.,
2007). Essa doença é causada pela Theileria equi, que a semelhança de outros
organismos desse gênero, tem desenvolvimento inicial no interior de leucócitos
do hospedeiro antes dos merozoítos invadirem os eritrócitos, enquanto que, a
Babesia caballi faz ciclo no hospedeiro apenas invadindo os eritrócitos dos
eqüídeos (MEHLHORN & SCHEIN, 1998). Os vetores da babesiose eqüina
pertencem aos gêneros Anocentor, Amblyomma, Rhipicephalus e Boophilus
(BARBOSA et al., 1995; RIBEIRO et al., 1999) No Brasil, o B. microplus é
considerado o principal responsável pela transmissão da T. equi, como
evidenciado por Heuchert et al. (1999) e o A. nitens é indicado como principal
vetor da B. caballi (GUIMARÃES et al., 1998). A babesiose eqüina aguda, cuja
sintomatologia não tem especificidade, é rara nas áreas endêmicas, embora em
algumas circunstâncias possam ocorrer recidivas em animais cronicamente
infectados, decorrentes de estresse de treinamento, viagens ou de doenças
intercorrentes (NICOLAIEWSKY et al., 2001). A forma crônica, que se
estabelece após a primeira infecção, é a mais relevante, pois afeta a performance
dos animais e os torna reservatórios e fontes de infecção aos carrapatos
2
(PEREIRA, 1999; BOTTEON et al., 2005). A Organização Mundial de Saúde
Animal (OIE) inclui a piroplasmose eqüina na lista de doenças de notificação
obrigatória, e há restrições de trânsito internacional para cavalos infectados com
T. equi e B. caballi (OIE, 2008). Os países mais importantes da indústria eqüina
como Canadá, Estados Unidos e Austrália são livres desses hemoparasitos,
exceto o Japão, que teve o primeiro diagnóstico de T. equi e B. caballi (IKADAI
et al., 2002). Portanto, é imprescindível a vigilância epidemiológica para o
controle da piroplasmose eqüina em países endêmicos, para a manutenção do
mercado internacional, prevenção da entrada em países livres (CAMACHO et
al., 2005) e redução dos prejuízos conseqüentes da mortalidade, abortos, gastos
com tratamento e morbidade (ALLSOP et al., 2007). Nos estudos
epidemiológicos ou na detecção de animais com infecção crônica, o exame
parasitológico de esfregaço de sangue tem baixa sensibilidade, devido à baixa
parasitemia (CUNHA et al., 1998; ALHASSAN et al., 2005; BHOORA et al.,
2009). O teste ELISA competitivo (cELISA) recentemente substituiu a fixação
de complemento como método diagnóstico oficial da OIE para o transporte
internacional de eqüinos. As técnicas sorológicas têm algumas limitações,
porque apresentam reações positivas em animais que não são mais portadores
em virtude da persistência de anticorpos anti- T. equi e B. caballi por longos
períodos, possibilitando reações falso positivas. Outra desvantagem é a
possibilidade de ocorrer reações cruzadas entre as duas espécies de
hemoparasitos pela semelhança antigênica (XUAN et al., 2001; BALDANI et
al., 2004; BALDANI et al., 2008). A PCR, por ser um método de diagnóstico
direto de elevada sensibilidade, tornou-se uma técnica amplamente utilizada na
identificação de portadores, e que em conjunto com as provas sorológicas,
3
aumentam a capacidade de detecção de animais nessas condições de infecção,
tornando o controle da babesiose eqüina mais eficiente. Nos últimos anos a PCR
nos seus formatos padrão, nested ou multiplex para T. equi e B. caballi com
primers baseados nas seqüências dos genes 16S rRNA, EMA-1, BC48, 18S
rRNA tem sido vastamente avaliada quanto a sensibilidade e especificidade
(BASHIRUDDIN et al., 1999; BATTSETSEG et al., 2001; NICOLAIEWSKY
et al., 2001; ALHASSAN et al., 2005). Embora em geral a PCR nested seja
considerada a de maior sensibilidade (BALDANI et al., 2008) essa apresenta
desvantagens como o maior tempo de execução, custo e o aumento do risco de
contaminação das amostras (RAMPERSAD et al., 2003). Nos estudos
epidemiológicos populacionais são desejáveis técnicas simples, rápidas e de
menor custo. As PCR multiplex possuem essas características, por serem
capazes de detectar múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra
(ALHASSAN et al., 2005). O presente trabalho avalia a sensibilidade,
especificidade e desempenho em estudo epidemiológico de PCRs de T. equi de
sequências do gene 18S rRNA no formato padrão e multiplex em relação a
nested-PCR.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
1.1. ETIOLOGIA
1.1.1. CLASSIFICAÇÃO
Nantes e Zappa (2008) descrevem que a primeira descrição de um dos
parasitos causadores da babesiose eqüina foi feita por Guglielmi em 1899; e em
1901, Theiler observou parasitos intra-eritrocitários em amostras de sangue, que
ele atribuiu à malária eqüina, mas a determinação do mesmo foi feita por
Laveran (1901) que o denominou de Piroplasma equi. A Babesia caballi foi
descrita mais tarde por Nuttal e Strickland (1910, 1912) que a diferenciaram
morfologicamente da Theileria equi, descrevendo uma nova espécie envolvida
na epidemiologia da babesiose eqüina.
A Babesia caballi e Theileria equi possuem a seguinte classificação
taxonômica:
Filo Protozoa
Subfilo Apicomplexa
5
Classe Aconoidasida
Ordem Piroplasmida
Famílias Babesiidae e Theileriidae
Gêneros Babesia e Theileria
Espécies Babesia caballi e Theileria equi
Esta taxonomia da T. equi é a mais atual e foi redescrita por Mehlhorn e
Schein (1998), já que diferente das espécies de Babesia, esta inicia seu ciclo
dentro de linfócitos antes de parasitar os eritrócitos e dividir-se em quatro
merozoítos, durante seu ciclo.
Na ordem Piroplasmida apenas duas famílias são consideradas, apesar de
alguns trabalhos indicarem a inclusão de novas famílias, como Allsopp et al.
(1994) que sugerem o surgimento da família Nicollidae que abrangeria as
espécies T. equi, Cytauxzoon felis e B. rodhaini, indicando que a T. equi poderia
representar um terceiro grupo diferente de Babesia e Theileria. Porém, segundo
Criado-Fornelio et al. (2003), as espécies C. felis e T. equi possuem ancestral
comum com a família Theileriidae, mas não pertencem a ela, o que levou Allsop
et al. (1994) a concluírem a formação da família Nicollidae. Entretanto, este
trabalho não concorda com o anterior, na proximidade da B. rodhaini com as
espécies C. felis e T. equi. Zhaler et al. (1998) propuseram a existência de três
grupos de piroplasmidas após análise de sequências do gene 18S rRNA, que são
B. microti, babesias e theilerias. Um quarto grupo foi descrito incluindo isolados
de ruminantes selvagens dos Estados Unidos (KJEMTRUP et al., 2000;
PENZHORN et al., 2001). Estes grupos propostos ainda não foram
estabelecidos, mas pode haver formação de novas famílias (CRIADO-
FORNELIO et al., 2003).
6
Bhoora et al. (2009) descrevem em seu estudo uma extensa variação na
seqüência do gene 18S rRNA dentro da T. equi, identificando a existência de três
grupos genéticos distintos de T. equi na África do Sul, sugerindo que ocorram
estudos das variantes do gene 18S rRNA de T. equi e B. caballi para o
desenvolvimento de testes de diagnóstico molecular para detectar estes parasitos
em equinos.
1.1.2. MORFOLOGIA
Os dois protozoários intra-eritrocitários causadores da babesiose eqüina em
cavalos, pôneis, zebras, asininos e muares, não produzem esporos, não têm
flagelos, cílios ou formam pseudópodes, sua locomoção ocorre por flexão ou
deslizamento. São caracterizados pela presença de complexo apical menos
desenvolvido e sua reprodução assexuada ocorre por fissão binária ou
esquizogonia em eritrócitos de mamíferos (HOMER et al., 2000; CHAUVIN et
al., 2009).
Inicialmente, espécies de Babesia foram identificadas com base em
parâmetros morfológicos das formas intra-eritrocitárias visíveis em esfregaços
de sangue de hospedeiros vertebrados infectados. B. caballi que está localizada
no grupo das grandes babesias, medindo dois a cinco micrômetros, e a T. equi do
grupo das pequenas babesias, medindo um a três micrômetros, são facilmente
confundidos com artefatos de técnica quando observados ao microscópio devido
ao seu pequeno tamanho. Em esfregaço sangüíneo corado com Romanowsky,
7
observa-se a T. equi como pequenas inclusões, com formas que variam de
esféricas, elípticas a ovóides que se dividem em quatro formas piriformes
caracterizadas como Cruz de Malta, enquanto que a B. caballi se apresenta como
pares piriformes juntos em ângulo agudo (HOMER et al., 2000; NIZOLI, 2005;
RONCATI, 2006; KUMAR et al., 2008).
1.2. CICLO DE VIDA
O ciclo da T. equi em eqüinos tem início com a inoculação da saliva do
carrapato com esporozoítos, os quais invadem os linfócitos do hospedeiro, onde
se desenvolvem em macro e micro esquizogontes, que ao originar merozoítos,
são liberados na circulação sanguínea. Ocorre, então, a penetração nos
eritrócitos transformando-se em trofozoítos, nestas células, os parasitos dividem-
se sucessivamente, por fissão binária ou esquizogonia, originando organismos
piriformes em forma de tétrade que caracteriza sua estrutura observada
microscopicamente, a chamada Cruz de Malta. Inicialmente estes trofozoítos
apresentam-se unidos e depois separados, eles destroem os eritrócitos
parasitados e ficam livres para penetrarem em outras hemácias (HOMER et al.,
2000; NIZOLI, 2005; RONCATI, 2006). A continuidade do ciclo ocorre quando
carrapatos, ao realizarem repasto sangüíneo, ingerem os organismos que se
reproduzem sexuadamente, no intestino deste hospedeiro invertebrado, e
transformam-se em esporozoítos que chegam às glândulas salivares via
hemolinfa (HOMER et al., 2000; NIZOLI, 2005).
O ciclo da B. caballi diferencia-se de espécies do gênero Theileria por
não haver um estágio pré-eritrocitário, onde há a invasão dos linfócitos,
ocorrendo a infecção direta dos esporozoítos nas células vermelhas do sangue.
8
Os esporozoítos inoculados transformam-se em trofozoítos que crescem e
dividem-se em dois merozoítos em forma de pêra unidos na sua parte posterior.
Estes se reproduzem até causar hemólise, ficando livres para invadir novas
células (MEHLHORN e SCHEIN, 1998; HOMER et al., 2000). Quando fêmeas
de carrapato se infectam, ocorre a penetração e multiplicação dos parasitos nas
células intestinais, passagem, através da hemocele, e multiplicação nos tubos de
Malpighi, ovários, oócitos e glândulas salivares, assim ocorre a transmissão
tanto para os ovos do hospedeiro invertebrado, chamada de transmissão
transovariana, quanto a transmissão aos hospedeiros vertebrados através da
saliva do carrapato infectado, chamada de transmissão transestadial
(MEHLHORN e SCHEIN, 1998; RONCATI, 2006).
1.3. TRANSMISSÃO
A babesiose eqüina é transmitida naturalmente através de ninfas e
adultos de carrapatos pertencentes à Subordem Ixodides e à família Ixodidae.
Estes vetores pertencem aos gêneros Anocentor, Amblyomma, Rhipicephalus,
Boophilus e Haemaphysalis (BARBOSA et al., 1995; RIBEIRO et al., 1999,
IKADAI et al.., 2007). Pelo menos três carrapatos são comumente encontrados
em cavalos no Brasil. O Anocentor nitens, monóxeno, é o carrapato de maior
difusão no país e tem o cavalo como seu principal hospedeiro, localizando-se
preferencialmente no pavilhão auricular e por isso, é conhecido como carrapato
de orelha. O Amblyomma cajannense (vermelhinho ou micuim) é bastante
difundido, exceto no extremo sul do país onde possivelmente as temperaturas
9
baixas limitam seu estabelecimento. Sua presença em fazendas de São Paulo
esteve associada à altura da pastagem, devido à maior parte de seu ciclo de vida
ocorrer no solo. Outro carrapato encontrado em cavalos no Brasil é o Boophilus
microplus, conhecido como carrapato do boi, também monóxeno, sendo a
infestação freqüente em equinos que compartilham o pasto com bovinos
(RIBEIRO et al. , 1999; LABRUNA et al., 2001).
No Brasil, o B. microplus é considerado o principal responsável pela
transmissão da T. equi, (HEUCHERT et al., 1999), e na manutenção da
estabilidade enzoótica, devido a grande parcela da população eqüina ser
composta por portadores (SOUZA et al., 2000). Em nosso país, BATTSETSEG
et al., (2002a) consideram esse carrapato vetor natural de T. equi e B. caballi,
sugerindo ocorrência de transmissão transestadial e transovariana, pois DNA
destes parasitos foi encontrado em ovos e larvas do B. microplus. Entretanto,
UETI et al., (2008) demonstraram que há uma eficiente transmissão
intraestadial, além da transestadial e que a transmissão transovariana da T. equi é
ineficiente apesar da contaminação dos ovos. Essa constatação é importante
porque a infecção de T. equi em ovos e larvas, além de ter sido detectada no B.
microplus, também foi verificada no Dermacentor nuttalli e Haemaphysalis
longicornus, o que possibilitou inferir que essa forma de infecção poderia ser
importante na transmissão deste hemoparasito para os eqüinos (BATTSETSEG
et al., 2002a, BATTSETSEG et al., 2002b, IKADAI et al., 2007).
Stiller e Coan (1995) afirmam que o A. nitens e o A. cajannense são as
principais espécies de carrapato que parasitam equinos, porém foram incapazes
de transmitir a T. equi para estes animais. O A. nitens é indicado como principal
vetor da B. caballi por vários autores (BARBOSA et al., 1995; GUIMARÃES et
al. , 1998). Segundo Fortes, 1987 apud (Roncati, 2006), o A. nitens adulto se
infecta, mas não transmite a doença, o que será feito pela geração seguinte. A
transmissão ocorre pela passagem transovariana, podendo manter-se por até
10
quatro gerações, o que faz desta espécie de carrapato um importante reservatório
da B. caballi.
A T. equi pode ser também transmitida por via transplacentária e a
infecção pode ocorrer no primeiro trimestre da prenhez, enquanto que na B.
caballi esta forma de transmissão não é observada (RONCATI, 2006; ALLSOP
et al., 2007). Até o momento, ainda são escassas explicações de como ou quando
ocorre a transmissão transplacentária. Sugere-se que esta transferência seja
resultante de placentação anormal, devido a danos na placenta, casos de
eritroblastose fetal reversa e casos de prenhez normal, ou seja, devido à
fisiologia da gestação específica de equinos (ALLSOP et al., 2007).
A babesiose também pode ser transmitida por sangue contaminado, logo
a infecção de animais saudáveis pode ocorrer acidentalmente ou
iatrogenicamente. Suspeita-se que através de picadas de insetos hematófagos
seja possível a transmissão (NANTES e ZAPPA, 2008), porém Phipps e Otter
(2004) não apontam tabanídeos e espécies de Stomoxys como vetores da doença,
devido ao fato da probóscide da maioria destes insetos não ser capaz de sugar e
manter hemácias parasitadas por T. equi e B. caballi até picar outro animal
sadio.
1.4. EPIDEMIOLOGIA
Ambas as espécies causadoras da piroplasmose eqüina se distribuem
largamente em áreas tropicais e subtropicais do globo, sendo a prevalência mais
alta nas primeiras (AVARZED et al., 1997; KERBER et al., 1999;
11
BOLDBAATAR et al., 2005). Boldbaatar et al. (2005) demonstraram em seu
estudo uma maior prevalência da doença em áreas semi-desérticas, onde sugere
que haja ótimas condições para o desenvolvimento da população de carrapato. A
prevalência da babesiose eqüina é um espelho da distribuição do carrapato vetor
e pode variar de acordo com as diversas populações e regiões. Quando o
controle do carrapato não é realizado numa área endêmica, aproximadamente
100% dos equinos se tornam expostos aos parasitos em algum momento de suas
vidas (PFEIFER BARBOSA et al., 1995; AVARZED et al., 1997).
Países como Canadá, Nova Zelândia, Austrália, Japão, Alemanha, Reino
Unido, Irlanda, Holanda e países Escandinavos são considerados livres dos
parasitos (NANTES E ZAPPA, 2008; OGUNREMI et al., 2008) e possuem uma
indústria eqüina importante. Cavalos positivos para piroplasmose estão
impedidos de entrar nestes países ou sofrem severas sanções como quarentena
prolongada ou isolamento. A Austrália é o único país onde a piroplasmose
eqüina não se estabeleceu apesar da T. equi ter sido introduzida, provavelmente
pela falta do carrapato vetor (BASHIRUDDIN et al., 1999). No norte da Europa
não existem relatos de Babesia, apesar de haver algumas das espécies vetoras
(NANTES E ZAPPA, 2008). O Japão é considerado livre da babesiose, apesar
do aumento do número de equinos importados, inclusive de países endêmicos
para os carrapatos R. sanguineus, H. longicornis e D. reticulatus (IKADAI et al.,
2002; IKADAI et al., 2007). Ikadai et al. (2002) sugeriram a existência da
babesiose eqüina neste país devido à detecção de anticorpos anti-B. caballi e
anti-T.equi em 5,4% e 2,2% dos equinos, respectivamente. Porém, casos
autóctones da infecção ainda não foram confirmados.
A B. caballi e a T. equi são endêmicas ou já foram relatadas no sudeste e
leste da Europa, na Ásia, na África, na Arábia, em Cuba, nas Américas do Sul e
Central, assim como, em partes do sudeste dos Estados Unidos (OGUNREMI et
al., 2008). Na Europa, a babesiose eqüina se estende pela Espanha, Portugal, sul
da França, Itália e em vários outros países. Em partes do Sudeste Europeu
12
infecções por T. equi são mais freqüentes que aquelas por B. caballi
(BASHIRUDDIN et al., 1999). Moretti et al. (2009) (in press) observaram na
Itália um alto nível de exposição dos equinos aos parasitos causadores da
babesiose, com prevalências atingindo até 50,4% para T. equi e 56,06% para B.
caballi. Na Espanha, soroprevalências de 40% e 28,3% foram observadas para
T. equi e B. caballi, respectivamente, sendo os carrapatos dos gêneros
Rhipicephalus e Dermacentor presentes no noroeste do país (CAMACHO et al.,
2005). Na África infecções por Babesia são relatadas, sendo considerada a
principal doença de equinos na África do Sul (POTGIETER et al., 1992;
OGUNREMI et al. 2008).
Na Ásia, a China é reconhecida como um país endêmico para babesiose
eqüina onde foram observadas uma soroprevalência de 34% e 32% para T. equi
e B. caballi, respectivamente, na província de Jilin localizada no nordeste da
China (XU et al., 2003). A Mongólia, localizada na Ásia Central, também possui
a piroplasmose disseminada em equinos da região central do país (AVARZED et
al., 1997; IKADAI et al., 2000; BOOLDBATAR et al., 2005; RÜEGG et al.,
2006), sendo transmitida pelos carrapatos D. nutalli, D. marginatus, D.
salivarum e H. dromedari (BOOLDBATAR et al., 2005; RÜEGG et al., 2006).
Em Trinidad casos de babesiose são periodicamente diagnosticados em
equinos de corrida, e das duas espécies associadas a esta doença, a T. equi
sempre esteve presente, contudo a B. caballi só foi detectada em 2003 por
Rampersad et al. Segundo estes autores, houve falhas no diagnóstico deste
parasito, provavelmente, devido às dificuldades na diferenciação entre as
espécies, e não devido à ausência da B. caballi. Em 2007, Asgarali et al.
observaram altas prevalências de anticorpos anti- B. caballi e T. equi em
Trinidad, sendo que a freqüência para B. caballi foi maior que para T. equi com
68,8% e 33,3%, respectivamente e os vetores associados foram o A. nitens, A.
cajannense e B. microplus. Prevalências de 12,8% a 25% para T. equi e 2,29% a
34,6% para B. caballi, utilizando testes sorológicos, foram observadas em
13
diferentes regiões da Turquia (ÖNCEL et al., 2007; ACICI et al., 2008; SEVINC
et al., 2008; KARATEPE et al., 2009). Dentre os carrapatos citados como
vetores no país, estão o R. tiranicus, o H. detritum, o D. marginatus e o R. bursa
(ÖNCEL et al., 2007; ACICI et al., 2008; SEVINC et al., 2008). Nos Estados
Unidos, ambas as espécies de babesia foram introduzidas através da importação
de equinos infectados de Cuba (NANTES e ZAPPA, 2008) e atualmente o país é
considerado área controlada, onde medidas sanitárias foram adotadas, entre as
quais a realização de teste sorológico dos animais importados, sendo que estes
ficam retidos nas unidades de quarentena, e se positivos, são enviados de volta
ao país de origem ou sacrificados (COSTA-PEREIRA et al., 2007).
A babesiose é enzoótica em toda a América Latina, com exceção do sul
do Chile e sul da Argentina, ocorrendo em todas as áreas de distribuição
geográfica do carrapato transmissor A. nitens (LINHARES et al., 1997;
AGUIRRE et al., 2004), sendo as prevalências de T. equi e B. caballi muito altas
em países como Colômbia e Brasil. Na Argentina, a babesiose eqüina é
endêmica na região nordeste e na região noroeste, onde foram descritos casos
clínicos causados por B. caballi (AGUIRRE et al., 2004). Este país, além do
Chile e do Uruguai, mantém, segundo Costa-Pereira et al. (2007), um rígido
controle de fronteira, impedindo a entrada de animais soropositivos para as duas
espécies.
Segundo Guimarães et al. (1998) e Battsetseg et al. (2002a), no Brasil, o
primeiro diagnóstico de B. caballi foi feito por Costa e Mello (1963) no estado
do Rio de Janeiro e outros registros foram feitos posteriormente por Lima et al.
(1976) em Minas Gerais e Rocha et al. (1988) em Pernambuco (LINHARES et
al., 1997). Os casos de babesiose estão associados à infestação pelos carrapatos
A. nitens no caso de infecção por B. caballi e por B. microplus na infecção por
T. equi.
14
Estudos epidemiológicos descrevem a prevalência da babesiose eqüina
nas diferentes regiões do Brasil. Na região Sul, estudo realizado por Cunha et al.
(1996) em equinos de haras e jóquei clube locais observaram soroprevalência
para T. equi de 57,89%, sendo que o principal vetor observado infestando
equinos na região foi o B. microplus. Resultado semelhante foi observado por
Souza et al. (2000) com prevalência de 50,38% de animais com anticorpo anti-
T. equi no Planalto Catarinense. Valor menor foi observado por Nizoli (2005)
com freqüência de 16,97% de equinos soropositivos para T. equi no Rio Grande
do Sul. A região centro-oeste apresentou sempre prevalências maiores como
observado por Battsetseg et al. (2002a) com freqüência de 96% para T. equi e
8,5% para B. caballi e 40-62,5% para os diversos estágios de B. microplus
coletados. Numa microrregião de Goiânia, a prevalência de anticorpos anti-B.
caballi foi de 90,8%, não havendo diferença significativa entre grupos de idades,
raças, espécies ou sexo (LINHARES et al., 1997).
Altas taxas de infecção também foram descritas por Xuan et al. (2001)
em equinos de diferentes fazendas dos estados de São Paulo e Mato grosso do
Sul, onde 81% e 90% dos animais apresentaram-se soropositivos para T. equi e
B. caballi, respectivamente. Taxas menores foram encontradas por Kerber et al.
(1999) nos mesmos estados com 37% e 27% de soroprevalência para T. equi e
B. caballi, respectivamente. Esses resultados distintos se devem provavelmente
aos diferentes testes utilizados, já que o primeiro estudo usou a fixação de
complemento (TFC) que é menos sensível que o ensaio imunoenzimático
(ELISA) e o teste de aglutinação em látex (LAT) que foram utilizados no
segundo estudo (XUAN et al., 2001).
Na região sudeste, no estado de Minas Gerais, a prevalência descrita foi
de 91% para T. equi e 83% para B. caballi utilizando o teste de
imunofluorescência indireta (IFI) e 59,7% e 12,5% utilizando a reação de
polimerase em cadeia (PCR) para T. equi e B. caballi, respectivamente (HEIM et
al., 2007). No mesmo estado, Ribeiro et al. (1999) encontraram uma
15
soroprevalência de anticorpos anti-T. equi de 60,45%. Em São Paulo, Labruna et
al. (2001) encontraram A. nitens, A. cajannense e B. microplus como as únicas
espécies de carrapatos parasitando equinos, sendo o A. nitens mais freqüente, em
concordância com dados do estudo de Heuchert et al. (1999), também realizado
em fazendas de São Paulo. Este último trabalho observou uma maior incidência
de B. caballi que de T. equi, o que se deve provavelmente à maior ocorrência do
A. nitens associado à transmissão de B. caballi na região em relação ao B.
microplus, considerado principal vetor da T. equi no Brasil. No estado do Rio de
Janeiro, estudos sorológicos demonstraram prevalências para T. equi de 5,5% a
21% e para B. caballi de 1,5% a 9,7%. Nestes estudos os carrapatos encontrados
foram A. nitens e A. cajannense (PEREIRA et al., 2004; COSTA-PEREIRA et
al., 2005; COSTA-PEREIRA et al., 2007).
Botteon et al. (2002) observaram soroprevalências para T. equi em
animais submetidos a diferentes manejos. No sistema de criação extensivo,
89,58% dos animais foram positivos, enquanto que em sistema de semi-
confinamento a freqüência foi de 87,89% e de apenas 45,24% em sistema
confinado, provavelmente, porque animais confinados possuem menos contato
com o vetor. O fator ambiental também é considerado fator de risco em outros
estudos, onde equinos de corrida apresentaram menor soropositividade em
relação a animais submetidos a outros manejos, provavelmente devido ao fato de
animais de corrida serem submetidos a um melhor manejo e programa de
controle vetorial (SEVINC et al., 2008; MORETTI et al., 2009).
A faixa etária é considerada por alguns autores um fator que afeta a taxa
de animais positivos para T. equi e B. caballi (CUNHA et al., 1996; ASGARALI
et al., 2007; SEVINC et al., 2008; KARATEPE et al., 2009). Asgarali et al.
(2007) obtiveram uma maior freqüência de anticorpos anti-T. equi em animais
mais velhos, enquanto que, anticorpos para B. caballi foram mais comuns em
equinos com dois a quatro anos de idade. Tais fatos podem estar relacionados
com a evidência que animais infectados por T. equi permanecem hospedeiros
16
por toda a vida, causando repetida estimulação antigênica e manutenção dos
níveis de anticorpos, e infecções por B. caballi persistem por um a quatro anos
antes de serem eliminados.
Entretanto, idade não foi observada como fator de risco em estudo no Rio
de Janeiro, onde não houve diferença significativa na prevalência de anticorpos
anti- T. equi entre animais de diferentes faixas etárias, concluindo que a região é
uma área de estabilidade enzoótica (BOTTEON et al., 2002). Assim como
observado por Xu et al. (2003), Acici et al. (2008) e Moretti et al. (2009).
Resultados semelhantes foram encontrados por outros pesquisadores, onde não
só o fator idade, mas também sexo, raça e espécie não atuaram como fatores de
risco para infecção por T. equi e B. caballi (LINHARES et al., 1997; SOUZA et
al., 2000; KARATEPE et al., 2009).
1.5. ALTERAÇÕES CLÍNICAS E LABORATORIAIS
Segundo Mehlhorn e Schein (1998), o período de incubação da infecção
por T. equi varia de 2 a 10 dias até 21 dias, dependendo do carrapato vetor. Dois
dias após a infecção os esquizogontes de T. equi ocorrem em linfócitos, e por
volta de 12 a 14 dias, os merozoítos são visualizados em eritrócitos através de
esfregaços sangüíneos. A parasitemia da T. equi é de aproximadamente 7% dos
eritrócitos, mas em animais imunodeprimidos ou sem qualquer contato prévio
que lhes garanta imunidade, a parasitemia pode chegar a 80%. No caso de B.
caballi, o período de incubação varia de 10 a 30 dias e a parasitemia é mais
baixa que a de T. equi podendo chegar a 1% dos eritrócitos (ALLSOPP et al.,
1994).
17
Os sinais clínicos da babesiose eqüina são variáveis e inespecíficos. Na
fase inicial os sintomas característicos são febre, normalmente excedendo 40°C,
em decorrência do aparecimento do parasito na corrente sangüínea, depressão,
inapetência, secreção nasal mucóide, dispnéia e aumento da freqüência
respiratória e cardíaca (NICOLAIEWSKY et al., 2001; ZOOBA et al., 2008). A
lise de eritrócitos leva a ocorrência de anemia, havendo liberação de
hemoglobina e acúmulo de bilirrubina nos tecidos, e hemoglobinúria
(RONCATI, 2006). Outros sinais observados são mucosas congestas,
hemorragias petequiais ou equimoses na conjuntiva e incoordenação. Segundo
Sakha (2007), a T. equi é considerada a mais patogênica das duas espécies, e a
B. caballi causa uma febre mais persistente e anemia.
Redução da performance é a principal queixa associada à babesiose
eqüina, principalmente em animais de competição (PEREIRA, 1999;
BOTTEON et al., 2005). Suspeitava-se da ocorrência de cólicas e mialgias em
animais com babesiose, mas esta suspeita não foi confirmada por Botteon et al.
(2005). Apesar de estes sinais clínicos terem sido freqüentes nos animais
avaliados, estatisticamente não houve interação entre a ocorrência de babesiose
clínica e cólica ou mialgia. Somente queda de performance e claudicação
apresentaram associação estatística com a ocorrência clínica de babesiose. Pode
ocorrer a morte do animal ainda nesta fase aguda ou a doença pode se tornar
crônica e persistir por meses sem que o animal apresente sinais clínicos,
tornando-se reservatório para os parasitos. Infecções crônicas podem resultar em
sinais variados, geralmente, envolvendo leve inapetência com perda de peso,
febre intermitente, pouca tolerância a exercício, fraqueza, anemia leve e
esplenomegalia (ZOOBA et al., 2008).
O recrudescimento da doença que estava em fase crônica é comum em
animais que sofrem situações que determinem a diminuição de anticorpos e
stress como treinamento, transporte, condições climáticas adversas ou prenhez
(NICOLAIEWSKY et al., 2001). Segundo Botteon et al. (2002), observações a
18
campo indicam que a forma aguda ocorre principalmente em animais mantidos
confinados, raramente afetando animais criados a campo, pois a baixa infestação
de carrapatos em cavalos confinados impede a manutenção da taxa de anticorpos
suficiente para manter a proteção destes animais. Os animais infectados por T.
equi permanecem infectados por anos, provavelmente por toda a vida
(RONCATI, 2006; RÜEGG et al., 2007), enquanto que infecções causadas por
B. caballi não são persistentes e são pouco estáveis, produzindo altos níveis de
anticorpos no organismo saudável (RONCATI, 2006).
Segundo Ribeiro et al. (1995), em áreas endêmicas, potros normalmente
adquirem infecção logo após o nascimento, sendo a parasitemia detectada antes
dos 42 dias de idade. Nestas condições, casos sintomáticos de babesiose não são
esperados com freqüência em adultos, já que estes normalmente apresentam
infecções subclínicas ou crônicas. A infecção de potros in utero leva ao
nascimento de animais normais que podem desenvolver sinais de infecção após
o nascimento (PHIPPS e OTTER, 2004). O resultado desta infecção, porém, vai
ser influenciado pelo número de parasitas infectando o feto, já que em infecção
causada por T. equi são observados abortos e casos de piroplasmose neonatal
quando a parasitemia excede 50%. Infecção por T. equi em éguas portadoras é
citada como a principal causa de abortos em equinos (ALLSOP et al., 2007).
As alterações laboratoriais mais comuns são redução do número de
eritrócitos, plaquetas e concentração de hemoglobina. Infecções agudas são
também caracterizadas por neutropenia, linfopenia, diminuição do fibrinogênio
plasmático e aumento da concentração de bilirrubina (ZOOBA et al., 2008). Tais
características que se assemelham àquelas encontradas por Camacho et al.
(2005) que observaram diminuição significativa da hematimetria,
hemoglobinometria e hematócrito em animais com babesiose eqüina, sendo a
anemia mais severa em animais infectados por T. equi que aqueles infectados
por B. caballi. Estes autores também observaram diminuição no número de
plaquetas e aumento nas concentrações de bilurrubina total, uréia, AST, γGT,
19
CK e LDH. Cunha et al. (1998) observaram em seu estudo que houve rápida
redução do hematócrito durante a fase aguda da infecção, porém este não
apresentou alterações significativas durante a fase crônica, enquanto o título de
anticorpos esteve relacionado diretamente com a multiplicação do parasito,
mesmo durante baixas parasitemias.
1.6. DIAGNÓSTICO
1.6.1. DIAGNÓSTICO DIRETO
1.6.1.1. EXAME MICROSCÓPICO
O diagnóstico direto mais comum na babesiose é a detecção de parasitos
em esfregaço sanguíneo corado com o Giemsa ou o corante de Wright. Segundo
MEHLHORN e SCHEIN (1998), após 14 a 16 dias da infecção em animais não
imunes, é possível observar, através da análise microscópica do esfregaço
sanguíneo corado com Giemsa, estágios típicos de T. equi (merozoítos em
formato piriforme, estágio caracterizado pela cruz de Malta e estágio ovóide)
dentro dos eritrócitos. Esta é uma técnica rápida, de fácil realização e possui alta
especificidade, sendo possível diferenciar morfologicamente as espécies
envolvidas (ALHASSAN et al., 2005; BALDANI et al., 2008). A principal
desvantagem dessa técnica é a baixa sensibilidade nas fases crônicas e
subclínicas da enfermidade, devido às baixas parasitemias nestas fases (CUNHA
20
et al., 1998; BALDANI et al., 2004; NAGORE et al., 2004; ALHASSAN et al.,
2005; OGUNREMI et al., 2008; BHOORA et al., 2009). CUNHA et al. (1996)
observaram uma baixa porcentagem de positivos no exame de esfregaço
sanguíneo (1,5%) em relação à IFI (57,8%) na detecção de T. equi. Outra
desvantagem desta técnica é que os agentes são facilmente confundidos com
artefatos da técnica (NANTES E ZAPPA, 2008).
1.6.1.2. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Consiste em amplificar um fragmento específico do DNA utilizando
primers específicos até que sua concentração possa ser detectável. A
multiplicação dos segmentos específicos ocorre alternando-se a temperatura do
ensaio para: desnaturação das cadeias do DNA genômico; anelamento dos
primers, usados para delimitar a seqüência a ser amplificada; extensão da
seqüência pela ligação dos desoxinucleotídeos pela ação da enzima e reinício do
ciclo.
Nos últimos anos, com o advento da reação em cadeia da polimerase
(PCR), o diagnóstico molecular tornou-se amplamente difundido. PCRs no seu
formato padrão, nested, multiplex e tempo real foram desenvolvidas ou
adaptadas para o diagnóstico de T. equi e B. caballi com primers baseados nas
seqüências dos genes 16S rRNA, (BASHIRUDDIN et al., 1999), EMA-1
(BATTSETSEG et al., 2001; NICOLAIEWSKY et al., 2001; FARAH et al.,
2003), BC48 (BATTSETSEG et al., 2001, GÜCLÜ & KARAER, 2007) e 18S
rRNA (RAMPERSAD et al., 2003, ALHASSAN et al., 2005; BHOORA et al.,
2009). Essas técnicas proporcionaram uma maior sensibilidade e especificidade
21
comparadas aos testes sorológicos e ao exame microscópico de esfregaço
sanguíneo (CANOLA et al., 2007; BHOORA et al., 2009). HEIM et al. (2007)
demonstraram a maior eficiência da PCR Multiplex Real-time em relação à
técnica de pesquisa de hematozoários em esfregaço sanguíneo. A técnica
molecular apresentou positividade de 59,7% para T. equi e 12,5% para B.
caballi, enquanto que o exame parasitológico obteve 7,2% para T. equi e 1%
para B. caballi. Através da PCR é possível realizar estudos de epidemiologia
molecular entre os diferentes isolados de T. equi e B. caballi. BHOORA et al.
(2009) foram capazes de observar variação na seqüência do gene 18S rRNA da
T. equi, o que possibilitou a identificação de três grupos genéticos distintos dessa
espécie de hemoparasito na África do Sul. A seqüência do gene 18S rRNA da B.
caballi apresentou menor polimorfismo genético, que permitiu a caracterização
de apenas dois grupos genéticos. A análise do gene que codifica o antígeno
EMA-1 não evidenciou polimorfismo genético entre isolados de T. equi do
Brasil ou com as sequências já disponíveis de outros isolados geográficos dessa
espécie de hemoparasito (HEIM et al., 2007).
A nested PCR ou a semi-nested PCR normalmente são utilizadas para
tornar a reação mais eficiente incrementando a sensibilidade principalmente. Na
primeira etapa da nested PCR um par de primers é utilizado para amplificar um
fragmento de DNA genômico, cujo amplicon é utilizado como molde para uma
segunda etapa de amplificação com outros dois primers (MOLINA e TOBO,
2004). Apesar da PCR, em geral, ser descrita como uma técnica de alta
sensibilidade, existe variações entre elas, e muitas vezes estas apresentam
desempenho inferior a outras técnicas de diagnóstico. Por exemplo, em estudo
comparativo entre cultivo in vitro, PCR e nested PCR para diagnóstico de T.
equi em 15 equinos portadores submetidos ao estresse induzido por exercícios
para provocar recidiva, a nested PCR apresentou 100% de sensibilidade, pois
identificou todos os animais como positivos, enquanto que o cultivo in vitro
detectou 14 animais positivos, e a PCR não diagnosticou nenhum animal como
positivo (BALDANI et al., 2008). RAMPERSAD et al. (2003) também
demonstraram que a nested PCR tem maior sensibilidade, pois esta detectou 3,6
22
vezes mais infecções de T. equi que o exame de esfregaço de sangue e 2,2 vezes
mais que a PCR. A sensibilidade superior da nested PCR em detectar infecções
crônicas está relacionada às duas etapas de amplificação (BALDANI et al.,
2008). Entretanto, este método demanda maior tempo de execução e custo, que
são características contrárias a de um teste diagnóstico ideal, que além de
sensibilidade e especificidade elevadas, deve ser simples e rápido. Nesse sentido,
a PCR no seu formato padrão e principalmente a PCR multiplex apresentam
vantagens. Essa última modalidade de PCR permite diagnosticar
simultaneamente dois ou mais agentes patogênicos utilizando pares de primers
específicos para cada um deles (MOLINA e TOBO, 2004), inclusive a PCR
multiplex para detecção de T. equi e B. caballi desenvolvida por ALHASSAN et
al., (2005) apresentou alta sensibilidade e especificidade.
1.6.2. DIAGNÓSTICO INDIRETO
1.6.2.1. TESTE DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO
Testes sorológicos ainda possuem um importante papel em estudos
epidemiológicos e no trânsito internacional de eqüinos, porque tem maior
probabilidade de detectar animais portadores que o exame de esfregaços de
sangue (MEHLHORN E SCHEIN, 1998). Em 1969, o teste de fixação de
complemento (TFC) foi aceito como oficial para diagnóstico de piroplasmose
eqüina pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA). Esse
teste foi reconhecido mundialmente para o transporte mundial de eqüinos
(PEREIRA et al., 2004; BALDANI et al., 2007; CANOLA et al., 2007; COSTA-
PEREIRA et al., 2007).
23
O TFC se baseia na pesquisa da imunoglobulina M (IgM). Essa
imunoglobulina tem uma concentração mais elevada que os demais isotipos na
resposta imune primária atingindo níveis detectáveis antes dos demais.
Entretanto, devido a modificação de isotipo de imunoglobulina no decorrer da
infecção com predominância da imunoglobulina G (IgG) e seus sub-isotipos
IgG2, IgG4 e IgG(T) que não são hábeis fixadoras de complemento e redução do
nível total das imunoglobulinas durante a cronicidade da infecção,
principalmente da IgM, a sensibilidade do TFC se reduz drasticamente, exceto
nos casos de recidivas e re-infecções (PEREIRA et al., 2004). Portanto, o TFC é
ineficiente em detectar eqüinos portadores assintomáticos, talvez devido as
características da IgM que é uma imunoglobulina que possui afinidade e avidez
por um espectro maior de epítopos B, resultados falso-positivos também foram
observados no TFC, por vários autores (IKADAI et al., 2002; BALDANI et al.,
2004; PEREIRA et al., 2004; COSTA-PEREIRA et al., 2005; HUANG et al.,
2006; CANOLA et al., 2007; COSTA-PEREIRA et al., 2007; OGUNREMI et
al., 2008). Outro aspecto negativo do TFC a ser considerado é que este teste
requer grandes quantidades de antígenos para a realização de estudos
epidemiológicos de grande escala (BALDANI et al., 2004; HUANG et al.,
2006).
Mesmo com baixa sensibilidade, o TFC se manteve como o teste padrão-
ouro, ou seja, o teste de escolha referendado pela OIE por mais de 30 anos.
BALDANI et al. (2007) consideram esta técnica para diagnóstico de T. equi
como um método que combina acurácia a sua fácil execução. Em seu estudo,
não foi observada reação cruzada com a B. caballi e não houve diferenças
significativas entre o TFC e outras técnicas sorológicas como ELISA e IFI.
1.6.2.2. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
24
A IFI é uma técnica bastante usada para diagnóstico de babesiose e
alguns pesquisadores consideram que ela tem uma sensibilidade até superior
àquela da TFC (PASSOS et al. , 1999). Como comprovam OGUNREMI et al.
(2008) no diagnóstico de B. caballi, a IFI apresentou sensibilidade de 92% e
especificidade de 95%, enquanto que, o TFC apresentou sensibilidade de 28% e
especificidade de 99%. ÖNCEL et al. (2007) demonstraram a maior
sensibilidade da IFI em relação ao TFC na detecção de anticorpos anti-T. equi,
com frequências de 25,7% e 19,7%, respectivamente.
Um estudo realizado em 1999, objetivou avaliar o uso de antígenos
homólogos (isolado da área de estudo) e heterólogos (cepa USDA) para a
detecção de anticorpos contra B. caballi e T. equi pela técnica de IFI. A IFI com
antígeno homólogo produziu títulos significativamente maiores que a IFI com
antígeno heterólogo, indicando que há diferenças antigênicas entre isolados de
diferentes regiões (HEUCHERT et al., 1999). Estes autores também confirmam
a melhor performance da IFI em relação ao TFC, que foi capaz identificar
apenas 45% e 59% dos animais positivos para B. caballi e T. equi pela técnica de
IFI, respectivamente.
As desvantagens da IFI são que a padronização da técnica é muito difícil
e as leituras das lâminas adquirem caráter subjetivo, de acordo com a
experiência do laboratorista, além da presença de reação cruzada entre T. equi e
B. caballi. Por essa razão, a IFI tem sido recomendada como um teste
complementar (HEUCHERT et al., 1999; BALDANI et al., 2004; HUANG et
al., 2006; BALDANI et al., 2007).
25
1.6.2.3. ELISA
O ELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção de
anticorpos específicos no plasma e soro sanguíneo. Somente em 2004, o ELISA
competitivo (cELISA) foi validado junto à OIE e aceito como teste oficial para a
permissão de transporte internacional de equinos para países livres de
piroplasmose eqüina (COSTA-PEREIRA et al., 2007; NANTES E ZAPPA,
2008; OGUNREMI et al., 2008). Esta técnica detecta IgG, imunoglobulina cuja
resposta ao antígeno é mais específica e duradoura. É possível que em casos
onde o animal seja um portador inaparente, o título de anticorpos do tipo IgG
contra a piroplasmose permaneça por toda a vida.
O teste ELISA é mais sensível que o TFC, sendo utilizado como
ferramenta para a detecção da doença aguda e latente, principalmente com o uso
de antígenos recombinantes (XUAN et al., 2001; IKADAI et al., 2002;
BALDANI et al., 2007; CANOLA et al., 2007). XUAN et al. (2001)
demonstraram que um ELISA com antígeno EMA-1 recombinante, expresso em
células de insetos por baculovírus, é uma boa opção para diagnóstico de T. equi.
BALDANI et al. (2004) citam a importância da qualidade do antígeno de
parasitos intracelulares, devido à presença de componentes contaminantes como
fragmentos de eritrócitos, o que torna a padronização de testes imunológicos um
passo crucial, já que os contaminantes aumentam a ocorrência de reação
cruzada. Daí a importância da utilização de antígenos recombinantes, facilitando
a padronização de testes, evitando a realização do cultivo in vitro dos parasitos,
que é duradouro, ou a infecção artificial de equinos para a produção de
antígenos. Entretanto, a despesa para produção de antígenos recombinantes
aumenta o custo do teste para piroplasmose eqüina em relação às preparações
antigênicas a partir de parasitos intracelulares.
26
1.7. PREVENÇÃO
Para o controle e prevenção da piroplasmose eqüina, a situação enzoótica
do país ou da região deve ser considerada. Em áreas livres, medidas que evitem
a entrada de animais infectados são fundamentais, enquanto que nas áreas
endêmicas, o objetivo da criação de eqüinos e o mercado de comercialização
determinam o sistema mais apropriado de controle. Em áreas enzoóticas é
conveniente manter a estabilidade, que está relacionada a níveis de infestação de
carrapatos que mantenham as taxas de inoculação de T. equi e B. caballi e
estimulem uma resposta imune que controle as infecções e mantenham o estado
de portador (COLETO, 1999). Nesta situação se enquadram eqüídeos de
trabalho de áreas urbanas e rurais, de animais criados para reprodução e lazer
que são comercializados nas áreas endêmicas. Nestes casos é recomendado
manter uma infestação de carrapatos que não cause um efeito espoliativo e que
não afete a saúde do animal. (COLETO, 1999; BOTTEON et al., 2002;
CAMACHO et al., 2005).
Algumas medidas de manejo animal e das pastagens podem reduzir
significativamente a população de carrapatos. A separação da criação de eqüinos
e bovinos evita a infestação de B. microplus nos cavalos, assim como a
infestação por A. cajannense pode ser controlada sem o uso de acaricidas,
mantendo os pastos uniformes e limpos (LABRUNA et al., 2001). O uso de
acaricidas em intervalos corretos controla a infestação de todos os carrapatos
transmissores de T. equi e B. caballi. Entretanto, essa estratégia é
particularmente importante para controle de A. nitens, que quando utilizada por
longo tempo elimina o A. nitens da área, caso não haja outros hospedeiros para
esta espécie de carrapato além dos eqüinos (LABRUNA et al., 2001).
27
Criações de eqüinos com mercado de exportação e os equinos de alto
valor genético, criados para esporte de alta performance devem ser livres da
infecção, portanto sem exposição aos carrapatos transmissores de T. equi e B.
caballi (COLETO, 1999; BOTTEON et al., 2002).
1.8. TRATAMENTO
O tratamento das infecções por T. equi e B. caballi na fase aguda com
dipropionato de imidocarb (IMIZOL®) (VIAL e GORENFLOT et al., 2006) e
parvaquone (CEXON®) (MEHLHORN E SCHEIN, 1998) apresentam bons
resultados, pois elimina a sintomatologia clínica. O dipropionato de imidocarb
(IMIZOL®) é a principal droga utilizada para o tratamento da babesiose eqüina.
Nas infecções por B. caballi, a dose recomendada é de 2,2mg/Kg, por via
intramuscular, e que deve ser repetida após 24 horas. Enquanto que, nas
infecções por T. equi a dose recomendada é de quatro aplicações de 4mg/Kg,
repetida a cada 72 horas (VIAL e GORENFLOT et al., 2006; HARTWIG et al.,
2008). Após a aplicação dessa droga, é recomendado o uso do sulfato de
atropina para prevenir o aparecimento de sintomas colinérgicos como salivação,
cólica leve e hipermotilidade intestinal, causados pelo dipropionato de
imidocarb. Existem outros esquemas de tratamento bem sucedidos, como a
aplicação de Imizol (4mg/kg, IM, sid) por três dias e com tratamento adicional
de catosal (phosphorus) 10 ml por três dias, vitamina B12 e dois litros de
parafina para aliviar a cólica causada pelo medicamento (SAKHA, 2007).
Segundo Mehlhorn e Schein (1998), a parvaquone (CEXON®) apresenta o
mesmo efeito do imidocarb contra T. equi, com redução de sua atividade, mas
não eliminação, porém é altamente efetivo contra outras theilerias.
28
Nas situações em que há desidratação, a reposição de fluidos
(fluidoterapia endovenosa) é indicada, assim como as transfusões sanguíneas,
naqueles animais com anemia severa ou hemorragia. Nos casos de infecções
bacterianas secundárias, o uso de antibiótico eficaz contra o agente oportunista é
recomendado (NANTES E ZAPPA, 2008).
Devido às restrições de comércio internacional de eqüídeos de T. equi e
B. caballi, é também preconizado tratamento para a eliminação do estado de
portador a esses hemoparasitos. Os resultados obtidos até o presente indicam que
não há uma droga capaz de eliminar o estado de portador dos eqüídeos para T.
equi (BUTLER et al., 2008) e os resultados para B. caballi são contraditórios.
De acordo com os resultados obtidos por BUTLER et al. (2008), o imidocarb,
mesmo em altas doses, (4.7 mg/kg P.V. IM a cada 72 h 5 vezes) não foi capaz de
eliminar a infecção por B. caballi, pois na PCR de blot hibridização reversa
(PCR-reverse line blot hybridization), todos os animais foram positivos. Ao
contrário, SCHWINT et al., (2009) executaram o tratamento com altas doses de
Imidocarb em eqüinos portadores de B. caballi e obtiveram resultados que
indicaram a eliminação da infecção, porque os resultados nas PCRs quantitativa,
semi-nested foram negativos, não houve infectividade do sangue dos eqüinos
tratados aos animais susceptíveis após tratamento e houve conversão dos
animais portadores de soropositivos para soronegativos.
3. OBJETIVO
O presente trabalho avalia a sensibilidade, especificidade e desempenho em
estudo epidemiológico de PCRs de T. equi de sequências do gene 18S rRNA no
formato padrão e multiplex em relação a nested-PCR.
29
4. ARTIGO CIENTÍFICO
Avaliação da PCR, PCR multiplex e nested PCR no diagnóstico de Theileria
equi em equinos
LEAL, Danielle Custódio 1, MATOS, Paulo Ferreira de 1, SOUZA, Bárbara Maria Paraná da Silva 1, FRANKE, Carlos Roberto 1, MADRUGA, Cláudio
Roberto 2
1. Universidade Federal da Bahia- Escola de Medicina Veterinária - Salvador, Bahia, Brasil;
2. Pesquisador Visitante Fundação de Amparo à Pesquisa do estado da Bahia - Salvador, Bahia, Brasil
Autor correspondente: Danielle Leal - E-mail: [email protected]
RESUMO
O presente trabalho avalia a sensibilidade, especificidade e desempenho da PCR de T. equi de seqüências do gene 18S rRNA no formato padrão e multiplex em relação a nested-PCR, através da aplicação das técnicas em amostra de sangue de eqüino sabidamente positivo para T. equi, em amostras de papas de hemáceas positivas (n=19) e negativas (n=30) em teste ELISA e em amostras de sangue de eqüinos (n=118) do estado da Bahia. A avaliação de PCR no seu formato padrão (PCR-Teq), PCR multiplex (M/PCR) e nested PCR (N/PCR), evidenciou sensibilidade idêntica entre primeira e terceira técnica de diagnóstico de T. equi na diluição de DNA de cavalo comprovadamente positivo para esse hemoparasito (1:128). A análise de concordância entre soros positivos de eqüinos no teste ELISA indicou uma concordância elevada entre esse teste e a PCR-Teq (κ =0,780) e moderada com N/PCR-Teq (κ = 0,562) e M/PCR (κ = 0,488). A freqüência de T. equi foi maior nos eqüinos de criação extensiva que nos de criação intensiva, e em ambos os sistemas a PCR-Teq determinou uma freqüência significativamente superior que as demais técnicas (p= 0,000), embora todas tenham indicado uma situação endêmica para T. equi no estado da Bahia. Portanto a PCR-Teq demonstrou desempenho apropriado para ser utilizada em estudos epidemiológicos e para detecção de eqüídeos portadores de T. equi.
30
Palavras-Chaves: Bahia, Equinos, PCR, Nested PCR, Theileria equi
SUMMARY
The present study evaluates the sensitivity, specificity and performance of T. equi 18S rRNA gene PCR conventional and multiplex PCR against nested-PCR, by applying the techniques in blood samples of known equine positive for T. equi, in samples of mashed red cells positive (n = 19) and negative (n = 30) in ELISA and in blood samples from horses (n = 118) of the state of Bahia. PCR assessment of conventional PCR (PCR-Teq), multiplex PCR (M/PCR) and nested PCR (N/PCR), showed similar sensitivity between the first and third diagnostic technique for detection of T. equi in equivalent dilution of DNA of horse proved positive for this hemoparasite (1:128).The analysis of concordance between positive sera of horses in the ELISA showed a high correlation between these tests and PCR-Teq (κ = 0,780) and moderate with N/PCR-Teq (κ = 0,562) and M/PCR (κ = 0,488). T. equi frequency was higher in horses from extensive farming than in intensive farming system, and in both systems the PCR-Teq determined a significantly higher frequency than the other techniques (p = 0.000). The results indicated a endemic situation for T. equi in the state of Bahia. Therefore the PCR-Teq demonstrated suitable performance for use in epidemiological studies and for detection of T. equi carriers equine.
Keywords: Bahia, Horses, PCR, Nested PCR, Theileria equi
INTRODUÇÃO
A babesiose eqüina é causada pelos protozoários Babesia caballi e
Theileria equi, este último considerado até 1998 como pertencendo ao gênero
Babesia (MEHLHORN E SCHEIN, 1998). A distribuição geográfica desses
31
hemoparasitos está diretamente associada à presença dos carrapatos vetores,
entre os quais se destacam os gêneros Anocentor, Amblyomma e Rhipicephalus,
particularmente o subgênero Boophilus, os quais ocorrem com freqüência nas
zonas tropicais e subtropicais, por isso os eqüídeos estão mais expostos a
infecção por esses hemoparasitos quando criados em climas correspondentes
nos continentes Asiático, Africano, Americano e parte do Continente Europeu
(UILENBERG, 2006). A piroplasmose eqüina causa prejuízos decorrentes da
morbidade e mortalidade, além daqueles oriundos dos gastos com o tratamento
e da restrição do comércio internacional porque os animais infectados por T.
equi e B. caballi tornam-se reservatórios e fonte de infecção especialmente
para animais de regiões indenes ou àquelas parcialmente livres desses
hemoparasitos. Por essa razão, o tratamento é uma estratégia utilizada na
tentativa de eliminar o estado de portador (BUTLER et al., 2008) e, com o
passar do tempo, obter resultados soronegativos para T. equi e B. caballi.
Entretanto, esse procedimento não é eficiente, pois até o momento não há
droga capaz de eliminar o estado de portador dos eqüídeos infectados por T.
equi, e os resultados para B. caballi são contraditórios (BUTLER et al., 2008;
SCHWINT et al., 2009). Portanto, enquanto não houver um método seguro de
eliminação do estado de portador dos eqüinos, estes devem ser submetidos a
um monitoramento que assegure uma elevada probabilidade que os animais
estejam livres da infecção por hemoparasitos. Uma alternativa é a utilização do
teste de imunoadsorção enzimática (ELISAc), considerado oficial pela OIE
(NANTES E ZAPPA, 2008), associado a um diagnóstico direto, uma vez que
testes imunológicos têm limitações como: a detecção de anticorpos por longo
tempo após a eliminação do agente etiológico e a não detecção de infecções
32
recentes, além da ocorrência de reações cruzadas (BALDANI et al., 2008). O
cultivo in vitro é uma técnica com elevada sensibilidade e especificidade, mas
de custo elevado e realização demorada, quando comparado às técnicas
moleculares baseadas na amplificação in vitro de DNA. Várias modalidades de
PCR para diagnóstico de T. equi e B. caballi foram desenvolvidas
(NICOLAIEWSKY et al., 2001; RAMPERSAD et al., 2003; HEIM et al.,
2007). As PCRs no seu formato padrão e multiplex têm a vantagem da rapidez
do diagnóstico com relação a nested PCR, mas essa última é considerada de
maior sensibilidade, embora haja maior probabilidade de contaminação das
amostras (BALDANI et al., 2008). Todas essas modalidades podem ser
adaptadas para PCR tempo real, entretanto nem todos os laboratórios de
regiões endêmicas possuem o equipamento devido ao custo elevado. O
presente trabalho avalia a sensibilidade, especificidade e desempenho em
estudo epidemiológico de PCRs de T. equi de sequências do gene 18S rRNA
no formato padrão e multiplex em relação a nested-PCR.
MATERIAL E MÉTODOS
As amostras de sangue foram colhidas por punção de capilares da orelha
dos equinos em frascos com EDTA, e mantidos sob refrigeração para o
transporte até o Laboratório de Infectologia Veterinária da Universidade Federal
33
da Bahia, onde permaneceram a -20ºC e até sua utilização. A extração de DNA
das amostras de sangue foi realizada com o kit comercial PurelinkTM Genomic
DNA MiniKit (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA
purificado foi eluido num volume de 100 µl de tampão de eluição.
A PCR multiplex (M/PCR) utilizou primers desenhados com base nas
seqüências do gene 18SsrRNA de T. equi (Teq) e B. caballi (Bc). As seqüências
destes foram as seguintes: TeqF forward 5’-ATGCCCTTCAGTTCG- 3’ e TeqR
reverso 5’-ACCTCCCTGTGTCAGGATTG- 3’. Enquanto para B. caballi: BcF
forward 5’-GAGGGACTTTGGGTCATAA-3’ e BcR reverso q5’-
GGTACTCGATCGGTAGGA-3’. Em volumes de 50 μL, as reações foram
realizadas com 3mM de MgCl2, 0,2mM de dNTPs, 2U de Taq platinum
polimerase (Invitrogen), BSA (10mg/ml), 1 pmol de primers TeqF e TeqR e 100
pmol de cada BcF e BcR e 1 μl de DNA genômico. A reação foi executada a
94°C por 2 minutos, seguida de 40 ciclos de 94°C por 1 minuto, 58°C por 1
minuto e 72°C por 1 minuto, com uma extensão final a 72°C por 5 minutos. A
PCR no seu formato padrão para T. equi (PCR-Teq) foi executada com os
primers Teq empregados na PCR multiplex em volume de 50 μL com 2mM de
MgCl2, 0,2mM de dNTPs, 2,5 pmol de cada primer TeqF e TeqR, 2 U da Taq
platinum polimerase e 1 μL de DNA genômico. A termociclagem foi de 94°C
por 2 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30
segundos e 72°C por 30 segundos, com uma extensão final a 72°C por 5
minutos.
34
A nested PCR para a detecção da T. equi, (N/PCR-T. equi) foi executada
de acordo com a técnica descrita por Nicolaiewsky et al. (2001). Os DNAs que
constituíram os controles positivos de T. equi foram gentilmente cedidos pelos
doutores Carlos Massard da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e
Guido Linhares da Universidade Federal de Goiás. Os produtos das PCRs foram
corados com solução de Sybr Gold (Invitrogen) e submetidos à corrida
eletroforética horizontal em gel de agarose 1,5%, em tampão Tris borato EDTA
(TBE), juntamente com o marcador de peso molecular 100pb (Invitrogen). Os
resultados foram visualizados num transiluminador e fotodocumentados
(Biometra).
Os amplicons foram purificados do gel agarose com kit comercial
PureLink™ Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) e os fragmentos clonados
foram seqüenciados em seqüenciador automático capilar ABI 3100 (Applied
Biosystems), no Laboratório de Regulação e Expressão Gênica do Instituto de
Biologia Molecular do Paraná (IBMP). As seqüências dos clones da porção final
dos genes de T. equi e B. caballi foram comparadas com seqüências dos genes
18S rRNA destes microorganismos presentes no GENBANK, usando o
algorítimo BLASTX, a partir do site do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
As seqüências dos clones de T. equi também foram comparadas com cada uma
delas individualmente usando o programa MEGALIGN (Lasergene/DNASTAR
INC.).
35
As especificidades das PCR-Teq, M/PCR e N/PCR-Teq foram analisadas
com DNA extraído de papa de hemácias de eqüinos criados em haras do extremo
sul do Brasil (município de Bagé, estado do Rio Grande do Sul) que
apresentaram sorologia negativa no teste ELISA com antígeno recombinante
EMA-1 desenvolvido na Universidade Federal de Pelotas pelo Dr. Sérgio da
Silva (informação pessoal). A relação dos resultados positivos do ELISA com as
PCRs foi determinada com DNA proveniente de 19 eqüinos positivos nessa
prova sorológica utilizando o teste kappa. Adicionalmente para avaliar a
sensibilidade, o DNA de eqüino comprovadamente positivo para T. equi cuja
concentração foi determinada por fluorímetro (Qubit® - Invitrogen) foi diluído
de forma múltipla de 1:2 até 1: 512. Nessa avaliação foi empregado teste de
significância.
As PCR-Teq, M/PCR N/PCR-Teq também foram avaliadas através de
suas aplicações nos 118 eqüinos do estado da Bahia, sendo 62 de haras e
criatório da polícia militar que possuem controle de carrapato (sistema de
criação intensivo) e 56 de fazendas comerciais sem controle de ixodídeos
(sistema de criação extensivo). As diferenças foram avaliadas por testes de
significância. Dos eqüinos avaliados 15 possuíam carrapatos no momento da
coleta e uma amostragem destes carrapatos foi obtida para caracterização de
gêneros e espécies que infestam os eqüinos nas áreas abrangidas pelo estudo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
36
As reações da PCR-Teq produziram amplicons de 283pb (Figura 1), cujo
seqüenciamento do produto evidenciou 100% de identidade com as respectivas
sequências de T. equi existentes no Genbank (AY50063.2; EU 888902.1;
EU888906.1) e de B. caballi (U46551.1; AB017700.1; AF092736.1).,
confirmando a especificidade destes produtos amplificados.
As sensibilidades da PCR-Teq, M/PCR e N/PCR-Teq, avaliadas por
diluição do DNA extraído obtido, podem ser observadas na Tabela 1. A PCR-
Teq e a N/PCR-Teq apresentaram sensibilidades idênticas, pois detectaram DNA
de T. equi até a diluição 1:128 e superiores a M/PCR. Esse resultado demonstra
que a PCR-Teq possui elevada eficiência em relação a outros protocolos de PCR
descritos na literatura, os quais consideram que a nested PCR aumenta em geral
cerca de duas vezes a sensibilidade com relação à PCR no seu formato padrão, o
que foi verificado na identificação de cavalos infectados com T. equi
(RAMPERSAD et al. 2003). Baldani et al (2008) relatam que a nested PCR foi
capaz de identificar 100% de animais portadores de T. equi, em relação à PCR
no seu formato padrão que não diagnosticou nenhum destes eqüinos como
positivo. A eficiência do protocolo da N/PCR-Teq foi demonstrada
anteriormente por Battsetseg et al. (2002a), pois esta modalidade de PCR foi
capaz de detectar DNA de T. equi em 95,7% dos equinos criados em área
endêmica. Outros protocolos de PCR no seu formato padrão também
37
demonstraram menores níveis de detecção de parasitemia (8 x10-5%) em eqüinos
naturalmente infectados (BASHIRUDDIN et al., 1999; BALDANI et al., 2008)
em relação aos protocolos de nested PCR, que detectou parasitemias de 6 x10-6%
a 8x10-6% (NICOLAIWSKY et al., 2001; BALDANI et al., 2008). Kim et al.
(2007) demonstraram que uma técnica com um passo de amplificação, como a
PCR tempo real, pode ser tão eficiente quanto uma nested PCR que emprega
dois passos de amplificação. A menor sensibilidade da M/PCR pode estar
relacionada a inibição na reação decorrente de padronização inapropriada ou a
denominada inibição competitiva que ocorre nessa modalidade de PCR em
algumas ocasiões, particularmente quando as amostras são positivas para mais
de um organismo (WHILEY E SLOOTS, 2005).
A análise de sensibilidade através das amostras testadas pelo ELISA
(Tabela 2) demonstrou que a diferença de sensibilidade da PCR-Teq, e da
N/PCR-Teq em relação a M/PCR não foi influenciada pelas especificidades de
cada uma delas, já que estas não diferiram significativamente, pois as
percentagens de reações positivas foram 93,6% (2/30), 90,0% (3/30) e 96,7%
(1/30), para PCR-Teq, N/PCR-T. equi e M/PCR, respectivamente. A análise de
relação com o teste ELISA evidenciou uma concordância substancial desta
prova sorológica com a PCR-Teq, conforme indicado pelo coeficiente Kappa de
0,78 (0,61-0,80) (Tabela 2), enquanto que a N/PCR-Teq apresentou índice κ =
0.562 que apesar de ser maior que da M/PCR (κ = 0.488) ambos apresentaram
concordância moderada com o ELISA. Inclusive, a concordância da PCR-Teq
pode ainda ser maior, pois há a possibilidade de reações sorológicas
38
permanecerem positivas, mesmo quando os eqüinos não são mais portadores,
devido à persistência de anticorpos. Este fato torna freqüente relatos de maior
número de animais positivos na sorologia quando comparada a técnicas de
detecção de DNA. Em estudo na Mongólia, Rüegg et al., (2007) identificaram
78,8% dos eqüinos com anticorpos contra T. equi, enquanto que o DNA deste
piroplasma na PCR foi encontrado em 66,5% das amostras. Jaffer et al. (2009)
também encontraram maior número de eqüinos reagentes no teste sorológico
(36,2%) e menor na PCR (31,4%).
A PCR-Teq também mostrou menor número de reações falso-positivas o
que sugere maior especificidade que a N/PCR-Teq e a M/PCR, embora esta
reação positiva possa indicar uma infecção recente não detectada no ELISA,
pois os anticorpos em geral atingem níveis detectáveis pelas provas sorológicas
apenas 10 a 14 dias após a infecção (NANTES e ZAPPA, 2008). Esse seria um
fator favorável a PCR que diagnosticaria a infecção de T. equi precocemente, o
que pode ocorrer em recidivas de animais exportados de países endêmicos após
tratamento. Além disto, a possibilidade de que haja falsos negativos na prova
sorológica, ou seja, as reações positivas nas PCRs possam ser verdadeiros
positivos não alteraria a significância dos resultados. Estes resultados
credenciam a PCR-Teq como uma prova de diagnóstico direto apropriada para
detecção de portadores, porque a nested PCR tem sensibilidade que possibilita
detecção de 100% de animais infectados com T. equi como foi verificado por
BALDANI et al. (2008).
39
Em ambos os sistemas de criação as maiores freqüências de T. equi
foram determinadas pela PCR-Teq em relação a N/PCR-Teq e M/PCR (Tabela
3). Com base nos dados anteriores de avaliação de sensibilidade e
especificidade, há confirmação da maior capacidade da PCR-Teq em
diagnosticar cavalos portadores deste hemoparasito. A maior freqüência de T.
equi em animais criados extensivamente em relação aos cavalos criados de
forma mais intensiva e com controle de carrapato já havia sido constatada
anteriormente por Botteon et al. (2002) que encontraram 89,58% animais
positivos no sistema extensivo, 87,89% em animais semi-confinados e de apenas
45,24% nos cavalos de sistema confinado. Esses resultados refletem a menor
taxa de inoculação deste hemoparasito em animais criados em sistema intensivo,
devido a menor infestação de carrapatos vetores de áreas endêmicas como o
estado da Bahia, em que a amostragem de ixodídeos dos eqüinos identificou a
maioria do gênero Anocentor, e Amblyomma cajannense infestando um eqüino.
A predominância desses carrapatos e freqüência elevada de T. equi foi também
verificada no estado do Rio de Janeiro (PEREIRA et al., 2004; COSTA-
PEREIRA et al., 2007), embora alguns investigadores considerem estes
ixodídeos incapazes de transmitir a T. equi (STILLER e COAN, 1995), e no
Brasil o Rhipicephalus B. microplus é considerado principal vetor desse
hemoparasito (BATTSETSEG et al., 2002a), particularmente quando há
compartilhamento de pasto com bovinos (LABRUNA et al., 2001).
Ainda que seja subjetivo comparar situações epidemiológicas mesmo que
sejam endêmicas, devido aos vários fatores que afetam a transmissão de T. equi
40
aos cavalos como sistema de manejo dos animais, populações e espécies de
carrapato, condições climáticas e as suas variações sazonais. O resultado da
avaliação epidemiológica, com a PCR-Teq (Tabela 3), caracteriza uma situação
endêmica comparável às observadas em levantamento realizado com eqüinos de
Minas Gerais, Goiás, São Paulo pela técnica de PCR (HEIM et al., 2007). Em
Mato Grosso do Sul a prevalência encontrada foi maior, 85,7% determinada por
PCR tempo real (KIM et al., 2007). Mesmo em outros países, situações
endêmicas com freqüências semelhantes, foram encontradas por PCR (RÜEGG
et al. 2007, JAFFER et al 2009).
Com base nos dados apresentados, conclui-se que a PCR-Teq apresenta
elevada sensibilidade e especificidade, o que a torna apropriada para estudos
epidemiológicos e detecção de portadores, com as vantagens de maior rapidez na
execução e menor custo em relação à nested PCR. A situação epidemiológica da
T. equi nas regiões estudadas se caracteriza como endêmica, inclusive para
eqüinos criados de forma intensiva.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado concedida; a Fundação de Amparo à
Pesquisa do estado da Bahia (FAPESB) pela concessão de financiamento do
projeto; e a Fundação Alexander von Humboldt pela doação dos equipamentos
41
de biologia molecular, ao Prof. Dr. Carlos Roberto Franke (III-ERSX-
BRA/1067633).
42
Figura 1. Gel de agarose 1,5% da PCR para T. equi (PCR-Teq) em amostras de estudo epidemiológico. 1. Marcador 100pb, 2. Controle negativo, 3. Controle positivo, 4, 6, 7, 10, 15, 16, 20 e 22. Amostras negativas, 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19 e 21. Amostras positivas
43
Tabela 1. Determinação da sensibilidade da PCR (PCR-Teq), Nested PCR (N/PCR-Teq) e PCR multiplex (M/PCR) para diagnóstico de Theileria equi por diluições múltiplas de DNA de equinos comprovadamente infectados por esse hemoparasito
DNA de eqüino infectado por T. equi
Diluições PCR-Teq N/PCR-Teq M/PCR
1:2 + + +
1:4 + + +
1:8 + + +
1:16 + + -
1:32 + + -
1:64 + + -
1:128 + + -
1:256 - - -
1:512 - - -
44
Tabela 2. Número e percentagem de reações positivas e negativas da PCR-Teq, nested PCR (NPCR-Teq) e PCR multiplex (M/PCR) para diagnóstico de T. equi em DNA extraído do sangue de eqüinos sorologicamente positivos em teste ELISA competitivo (ELISAc)
Resultado
ELISAc
PCR-Teq (a) NPCR-Teq (b) M/PCR(c)
Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo
Positivo (%) 16 (84,2) 3 (15,8) 12 (62,3) 7 (36,8) 8 (42,1) 11 (57,9)
Negativo (%) 2 (6,7) 28 (93,3) 3 (10) 27(90) 1 (3,3) 29 (96,7)
Total (%) 18 (36,7) 31 (63,3) 15 (30,6) 34 (69,4) 9 (18,4) 40 (81,6)
(a) k= 0,784; (b) k= 0,562; (c) k= 0,488
45
Tabela 3. Resultado da PCR (PCR-Teq), nested PCR (N/PCR-Teq) e PCR multiplex (M/PCR) para diagnóstico de T. equi dos animais provenientes de fazenda e cavalaria/haras do estado da Bahia
Origem PCR-Teq(a) N/PCR-Teq (b) M/PCR (c)
Positivo (%) Negativo (%) Positivo (%) Negativo (%) Positivo (%) Negativo (%)
Extensivo 46 (82,1) 10 (17,9) 33 (58,9) 23 (41,1) 25 (44,6) 31 (55,4)Intensivo 32 (51,6) 30 (48,4) 10 (16,1) 52 (83,9) 14 (22,6) 48 (77,4)
(a) p = 0,000 (b) p = 0,000 (c) p= 0,011
46
Referências Bibliográficas:
BALDANI C.D., CANOLA, P. A., NETO J. C. L., MACHADO R.Z. In vitro culture, PCR, and nested PCR for the detection of Theileria equi in horses submitted to exercise. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 60, n. 3, p. 550-558, 2008.
BASHIRUDDIN J.B., CAMMÀ C., REBÊLO E. Molecular detection of Babesia equi and Babesia caballi in horse blood by PCR amplification of part of the 16S rRNA gene. Veterinary Parasitology, v. 84, p. 75-83, 1999.
BATTSETSEG B., LUCERO S., XUAN X., CLAVERIA F.G., INOUE N., ALHASSAN A., KANNO T., IGARASHI I., NAGASAWA H., MIKAMI T., FUJISAKI K. Detection of natural infection of Boophilus microplus with Babesia equi and Babesia caballi in Brazilian horses using nested polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, v. 107, p. 351-357, 2002a.
BOTTEON P.T.L., MASSARD C.L., BOTTEON R.C.C.M., LOSS Z.G., LINHARES G.F.C. Seroprevalencia de Babesia equi en três diferentes sistemas de crianza de eqüinos. Rio de Janeiro- Brasil. Parasitología Latinoamericana, v. 57, p.141-145, 2002.
BUTLER C.M., NIJHOF A.M., VAN DER KOLK J.H., DE HASETH O.B., TAOUFIK A., JONGEJAN F., HOUWERS D.J. Repeated high dose imidocarb dipropionate treatment did not eliminate Babesia caballi from naturally infected horses as determined by PCR-reverse line blot hybridization. Veterinary Parasitology, v. 151, p. 320–322, 2008.
COSTA PEREIRA M.A.V., MASSARD C.L., VITA G.F. Babesiose eqüina: Enzootia em Nova Friburgo, Rio de Janeiro, Brasil. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, v. 102, n.561-562, p. 165-167, 2007.
HEIM A., PASSOS L.M.F., RIBEIRO M.F.B., COSTA-JUNIOR L.M., BASTOS C.V., CABRAL D.D., HIRZMANN J., PFISTER K. Detection and molecular characterization of Babesia caballi and Theileria equi isolates from endemic areas of Brazil. Parasitology Research, v.102, p. 63-68, 2007.
47
JAFFER O., ABDISHAKUR F., HAKIMUDDIN F., RIYA A., WERNERY U., SCHUSTER R. K. A comparative study of serological tests and PCR for the diagnosis of equine piroplasmosis. Parasitology Research. 2009. doi 10.1007/s00436-009-1669-5.
LABRUNA M.B., KERBER C.E., FERREIRA F., FACCINI J.L.H., DE WAAL D.T., GENNARI S.M. Risk factors to tick infestations and their ocurrence on horses in the state of São Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 97, p. 1-14, 2001.
MEHLHORN H., SCHEIN E. Redescription of Babesia equi Laveran, 1901, as Theileria equi Mehlhorn, Schein, 1998. Parasitology Research, v. 84, p. 467-475, 1998.
NANTES J.H., ZAPPA V. Nutaliose- Revisão de Literatura. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária, ISSN: 1679-7353, n. 10, 2008.
NICOLAIEWSKY T.B., RICHTER M.F., LUNGE V.R., CUNHA C.W., DELAGOSTIN O., IKUTA N., FONSECA A.S., SILVA S.S., OZAKI L.S. Detection of Babesia equi (Laveran, 1901) by nested polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, v. 101, p. 9-21, 2001.
PEREIRA M.A.V., MASSARD C.L., FACCINI J.L.H, SIQUEIRA L.F.G. Ocorrência de Babesia equi (LAVERAN, 1901) e Babesia caballi (NUTALL & STRICKLAND, 1912) em equinos de raça puro sangue inglês de pequenos estabelecimentos equëstres. Arquivos do Instituto Biológico, v. 71, n. 4, p. 405-409, 2004.
RAMPERSAD J., CESAR E., CAMPBELL M.D., SAMLAL M., AMMONS D. A field evaluation of PCR for the routine detection of Babesia equi in horses. Veterinary Parasitology, v. 114, p. 81-87, 2003.
RÜEGG S.R., TORGERSON P., DEPLAZES P., MATHIS A. Age-dependent dynamics of Theileria equi and Babesia caballi infections in southwest Mongolia based on IFAT and/or PCR prevalence data from domestic horses and ticks. Parasitology, v. 134, p. 939-47, 2007.
SCHWINT O.N., UETI M.W., PALMER G.H., KAPPMEYER L.S., HINES M.T., CORDES R.T., KNOWLES D.P., SCOLES G.A. Imidocarb Dipropionate Clears Persistent Babesia caballi Infection with Elimination of Transmission Potential. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 53, n. 10, p. 4327-4332, 2009.
48
UILENBERG G. Babesia--a historical overview. Veterinary Parasitology, v. 31, n. 138(1-2), p.3-10, 2006.
49
5. Considerações Finais:
A técnica de PCR para o diagnóstico de T. equi é apropriada para estudos
epidemiológicos e detecção de equinos portadores, devido ao seu desempenho e
com as vantagens de maior rapidez na execução e menor custo em relação à
nested PCR.
Esta parasitose está presente com alta freqüência em eqüinos no estado da Bahia,
principalmente em animais de fazenda, embora presente também em animais de
cavalaria e haras, sendo importante a intensificação do controle de vetores e
monitoramento da doença nos rebanhos equinos do estado.
50
6. Referências Bibliográficas
ABOULAILA M., YOKOYAMA N., IGARASHI I. Development and evaluation of a nested PCR based on spherical body protein 2 gene for the diagnosis of Babesia bovis infection.Veterinary Parasitology. 2009doi:10.1016/j.vetpar.2009.12.013.
ACICCI M., UMUR S., GUVENC T., ARSLAN H.H., KURT M. Seroprevalence of equine babesiosis in the Black Sea region of Turkey. Parasitology International, v. 57, p. 198-200, 2008.
AGUIRRE D.H., CAFRUNE M.M., RADA M., ECHAIDE T. Babesiosis Clínica em eqüinos de Cerrillos, Salta, Argentina. Revista de Investigaciones Agropecuarias, v. 33, n. 3, p. 123-133, 2004.
ALHASSAN A., PUMIDONMING W., OKAMURA M., HIRATA H., BATTSETSEG B., FUJISAKI K., YOKOYAMA N., IGARASHI I. Development of a single round and multiplex PCR method for the simultaneous detection of Babesia caballi and Babesia equi in horse blood. Veterinary Parasitology, v. 129, p. 43-49, 2005.
ALLSOPP M.T., CAVALIER-SMITH T., DE WAAL D.T., ALLSOPP B.A. Phylogeny and evolution of the piroplasms. Parasitology, v. 108 ( Pt 2), p. 147-52, 1994.
ALLSOPP M.T.E.P., LEWIS B.D., PENZHORN B.L.Molecular evidence for transplacental transmission of Theileria equi from carrier mares to their apparently healthy foals. Veterinary Parasitology, v. 148, p. 130-136, 2007.
ASGARALI Z., COOMBS D.K., MOHAMMED F., CAMPBELL M.D., CAESAR E. A serological study of Babesia caballi and Theileria equi in Thoroughbreds in Trinidad. Veterinary Parasitology, v. 144, p. 167-171, 2007.
AVARZED A., DE WAAL D.T., IGARASHI I., SAITO A., OYAMADA T., TOYODA Y., SUZUKI N.. Prevalence of equine piroplasmosis in Central Mongolia. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v. 64, n. 2, p. 141-145, 1997.
51
BALDANI C.D., MACHADO R.Z., BOTTEON P.T.L., TAKAKURA F.S., MASSARD C.L. An Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of IgG antibodies against Babesia equi in horses. Ciência Rural, v. 34, n. 5, p. 1525-1529, 2004.
BALDANI C.D., MACHADO R.Z., RASO T. F., PINTO A.A. Serodiagnosis of Babesia equi in horses submitted to exercise stress. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 27, n. 4, p. 179-183, 2007.
BALDANI C.D., CANOLA, P. A., NETO J. C. L., MACHADO R.Z. In vitro culture, PCR, and nested PCR for the detection of Theileria equi in horses submitted to exercise. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 60, n. 3, p. 550-558, 2008.
BARBOSA, I.P., BÖSE, R., PEYMANN, B. Epidemiological aspects of equine babesiosis in a herd of horses in Brazil. Veterinary Parasitology, v. 58, p. 1-8, 1995.
BASHIRUDDIN J.B., CAMMÀ C., REBÊLO E. Molecular detection of Babesia equi and Babesia caballi in horse blood by PCR amplification of part of the 16S rRNA gene. Veterinary Parasitology, v. 84, p. 75-83, 1999.
BATTSETSEG B., XUAN X., IKADAI H., BAUTISTA J.L., BYAMBAA B., BOLDBAATAR D., BATTUR B., BATTSETSEG G., BATSUKH Z., IGARASHI I., NAGASAWA H., MIKAMI T., FUJISAKI K. Detection of Babesia caballi and Babesia equi in Dermacentor nuttalli adult ticks. International Journal for Parasitology, v. 31, n. 4, p. 384-386, 2001.
BATTSETSEG B., LUCERO S., XUAN X., CLAVERIA F.G., INOUE N., ALHASSAN A., KANNO T., IGARASHI I., NAGASAWA H., MIKAMI T., FUJISAKI K. Detection of natural infection of Boophilus microplus with Babesia equi and Babesia caballi in Brazilian horses using nested polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, v. 107, p. 351-357, 2002a.
BATTSETSEG B., LUCERO S., XUAN X., CLAVERIA F., BYAMBAA B., BATTUR B., BOLDBAATAR D., BATSUKH Z., KHALIUNAA T., BATTSETSEG G., IGARASHI I., NAGASAWA H., FUJISAKI K. Detection of equine Babesia spp. gene fragments in Dermacentor nutalli (Olenev 1929) infesting Mongolian horses, and their amplification in egg and larval progenies. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 64, n. 8, p. 727-730, 2002b.
52
BHOORA R., FRANSSEN L., OOSTHUIZEN M.C., GUTHRIE A.J., ZWEYGARTH E., PENZHORN B.L., JONGEJAN F., COLLINS N.E. Sequence heterogeneity in the 18S rRNA gene within Theileria equi and Babesia caballi from horses in South Africa.Veterinary Parasitology, v. 159, p. 112-120, 2009.
BOLDBAATAR D., XUAN X., BATTSETSEG B., IGARASHI I., BATTUR B., BATSUKH Z., BAYAMBAA B., FUJISAK K. Epidemiological study of equine piroplasmosis in Mongolia. Veterinary Parasitology, v. 127, p. 29-32, 2005.
BOTTEON P.T.L., MASSARD C.L., BOTTEON R.C.C.M., LOSS Z.G., LINHARES G.F.C. Seroprevalencia de Babesia equi en três diferentes sistemas de crianza de eqüinos. Rio de Janeiro- Brasil. Parasitología Latinoamericana, v. 57, p.141-145, 2002.
BOTTEON P.T.L., BOTTEON R.C.C.M., REIS T.P., MASSARD C.L. Babesiose em cavalos atletas portadores. Ciência Rural, v. 35, n. 5, p. 1136-1140, 2005.
BUTLER C.M., NIJHOF A.M., VAN DER KOLK J.H., DE HASETH O.B., TAOUFIK A., JONGEJAN F., HOUWERS D.J. Repeated high dose imidocarb dipropionate treatment did not eliminate Babesia caballi from naturally infected horses as determined by PCR-reverse line blot hybridization. Veterinary Parasitology, v. 151, p. 320–322, 2008.
CAMACHO A.T., GUITIAN F.J., PALLAS E., GESTAL J.J., OLMEDA A.S., HABELA M.A., TELFORD III S.R., SPIELMAN A. Theileria (Babesia) equi and Babesia caballi infections in horses in Galicia, Spain. Tropical Animal Health and Production, v. 37, p. 293-302, 2005.
CANOLA, P. A., OLIVEIRA R., BALDANI C.D., MACHADO R.Z. Estudo Comparativo entre técnicas de extração de DNA e realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para o diagnóstico de Theileria equi e Babesia caballi. ARS Veterinária, v. 23, n. 3, p. 165-171, 2007.
CHAUVIN A., MOREAU E., BONNET S., PLANTARD O., MALANDRIN L. Babesia and its hosts: adaptation to long-lasting interactions as a way to achieve efficient transmission. Veterinary Research, v. 40, n. 2, p. 37, 2009.
53
COLETO L. Equine Babesiosis: A disease linked to the extensive horse raising in the pasture land of Extremadura (“dehesa”). Cahiers options Mediterraneennes, v. 39, p. 273-276, 1999.
COSTA PEREIRA M.A.V., MASSARD C.L., FACCINI J.L.H., SIQUEIRA L.F.G. Variação da sorotitulação ao teste de fixação de complemento para Babesia equi e Babesia caballi em equinos da região serrana do Rio de Janeiro. ARS Veterinária, v. 21, n. 3, p. 338-343, 2005.
COSTA PEREIRA M.A.V., MASSARD C.L., VITA G.F. Babesiose eqüina: Enzootia em Nova Friburgo, Rio de Janeiro, Brasil. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, v. 102, n.561-562, p. 165-167, 2007.
CRIADO-FORNELIO A., MARTINEZ-MARCOS A., BULING-SARAÑA A., BARBA-CARRETERO. Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern Europe Part II. Philogenetic analisys and evolutionary history. Veterinary Parasitology, v. 114, p. 173-194, 2003.
CUNHA, C. W.; SILVA, S. S.; PIMENTEL, C. A.; DAPPER, E. Avaliação da freqüência de eqüinos soropositivos a Babesia equi no Jóquei Clube de Pelotas e em dois haras da zona sul do Rio Grande do Sul. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.5, p.119-122, 1996.
CUNHA C.W., SILVA S.S., OSÓRIO B.L., DUTRA C.L. Alterações hematológicas em equinos experimentalmente infectados com Babesia equi. Ciência Rural, v. 28, p. 283-286, 1998.
DE WALL D.T. Equine piroplasmosis: a review. British Veterinary Journal, v. 148, p. 6-13, 1992.
FARAH AW, HEGAZY NA, ROMANY MM, SOLIMAN YA, DAOUD AM. Molecular detection of Babesia equi in infected and carrier horses by polymerase chain reaction. Egyptian Journal for Immunology, v. 10, n. 2, p.73-79, 2003.
FRIEDHOFF KT. Piroplasmas of horses--impact on the international horse trade. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, v. 95, n. 19, p. 368-374, 1982.
GÜÇLÜ H.Z., KARAER K.Z. Detection of Babesia caballi (Nuttall, 1910) and Theileria equi (Syn. Babesia equi , Laveran, 1901) by the polymerase chain
54
reaction (PCR) in show and sport horses in the region of Ankara. Turkiye Parazitoloji Dergisi, v. 31, n. 2, p. 89-93, 2007.
GUIMARÃES A.M., LIMA J.D., RIBEIRO M.F. Sporogony and experimental transmission of Babesia equi by Boophilus microplus. Parasitology Research, v. 84, n. 4, p. 323-327, 1998.
HANAFUSA Y., CHO K., KANEMARU T., WADA R., SUGIMOTO C., ONUMA M. Pathogenesis of Babesia caballi infection in experimental horses. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 60, n. 10, p. 1127-1132, 1998.
HARTWIG, F. P.; TORRES, A. J.; NIZOLI, L. Q.; CORREA, M. N.; SILVA, S. S.; NOGUEIRA, C. E. W. Efeitos do dipropionato de imidocarb no metabolismo de eqüinos com Babesiose crônica. XVII Congresso de Iniciação Científica. Novembro de 2008.
HEIM A., PASSOS L.M.F., RIBEIRO M.F.B., COSTA-JUNIOR L.M., BASTOS C.V., CABRAL D.D., HIRZMANN J., PFISTER K. Detection and molecular characterization of Babesia caballi and Theileria equi isolates from endemic areas of Brazil. Parasitology Research, v.102, p. 63-68, 2007.
HEUCHERT C.M.S., GIULLI JR V., ATHAIDE D.F., FIELDHOFF K.T. Seroepidemiologic studies on Babesia equi and Babesia caballi infections in Brazil. Veterinary Parasitology, v. 85, p. 1-11, 1999.
HOMER M.J., DELFIN I. A., TELFORD S.R., KRAUSE P.J.,PERSING D.H. Babesiosis. Clinical Microbiology Reviews, v. 13, n. 3, p. 451-469, 2000.
HUANG X., XUAN X., YOKOYAMA N., KATAYAMA Y., ANZAI T.,IGARASHI I. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays with recombinant antigens for the serodiagnosis of equine Babesia infections. Veterinary Parasitology, v. 140, p. 158-161, 2006.
IKADAI H., OSORIO C.R., XUAN X., IGARASHI I., KANEMARU T., NAGASAWA H., FUJISAKI K., SUZUKI N., MIKAMI T. Detection of Babesia caballi infection by enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant 48-kDa merozoite rhoptry protein. International Journal for Parasitology, v. 30, n. 5, p. 633-635, 2000.
IKADAI H., NAGAI A., XUAN X., IGARASHI I., KAMIO T., TSUJI N., OYAMADA T., SUZUKI N., FUJISAKI K. Seroepidemologic studies on
55
Babesia caballi and Babesia equi infections in Japan. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 64, n. 4, p. 325-328, 2002.
IKADAI H., SASAKI M., ISHIDA H., MATSUU A., IGARASHI I., FUJISAKI K., OYAMADA T.. Molecular evidence of Babesia equi transmission in Haemaphysalis longicornis. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 76, n. 4, p. 694–697, 2007.
KARATEPE B., KARATEPE M., ÇAKMAK A., KARAER Z., ERGÜN G. Investigation of seroprevalence of Theileria equi and Babesia caballi in horses in Nigde province, Turkey. Tropical Animal Health Production, v. 41, p. 109-113, 2009.
KERBER C.E., FERREIRA F., PEREIRA M.C. Control of equine piroplasmosis in Brazil. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v. 66, n. 2, p. 123-127, 1999
KJEMTRUP, A.M.; KOCAN, A.A.; WHITWORTH, L.; MEINKOTH, J.; BIRKENHEUER, A.J.; CUMMINGS, J.; BOUDREAUX, M.K.; STOCKHAM, S.L.; IRIZARRY-ROVIRA, A.; CONRAD, P.A. There are at leaste three genetically distinct small piroplasms from dogs. International Journal for Parasitology, v.30, p.1501-1505, 2000.
KUMAR S., KUMAR R., GUPTA A.K., DWIVEDI S.K. Passive transfer of Theileria equi antibodies to neonate foals of immune tolerant mares. Veterinary Parasitology, v. 151, p. 80-85, 2008.
LABRUNA M.B., KERBER C.E., FERREIRA F., FACCINI J.L.H., DE WAAL D.T., GENNARI S.M. Risk factors to tick infestations and their ocurrence on horses in the state of São Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 97, p. 1-14, 2001.
LINHARES G. F. C., MASSARD C.L., ARAUJO J.L.B. Estudos sobre a epizootiologia de Babesia caballi (Nuttall e Strickland, 1910) na microrregião de Goiânia, Estado de Goiás. Anais da Escola de Agronomia e Veterinária, v. 27, n. 2, p. 27-33, 1997.
MEHLHORN H., SCHEIN E. Redescription of Babesia equi Laveran, 1901, as Theileria equi Mehlhorn, Schein, 1998. Parasitology Research, v. 84, p. 467-475, 1998.
56
MOLINA, A.L. TOBO, P.R. Série - Biologia molecular, Atualização, Parte 2 – Uso das técnicas de biologia molecular par diagnóstico. Eistein, v 2, n. 2, p.139, 2004.
MORETTI A., MANGILI V., SALVATORI R., MARESCA C., SCOCCIA E., TORINA A., MORETTA I., GABRIELLI S., TAMPIERI M.P., PIETROBELLI M. Prevalence and diagnosis of Babesia and Theileria infections in horses in Italy: A preliminary study. The Veterinary Journal. 2009.doi:10.1016/j.tvjl.2009.03.021.
NAGORE D., GARCÍA-SANMARTÍN J., GARCÍA-PÉREZ A.L., JUSTE R.A., HURTADO A. Detection and identification of equine Theileria and Babesia species by reverse line blotting: epidemiological survey and philogenetic analysis. Veterinary Parasitology, v. 123, p. 41-54, 2004.
NANTES J.H., ZAPPA V. Nutaliose- Revisão de Literatura. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária, ISSN: 1679-7353, n. 10, 2008.
NICOLAIEWSKY T.B., RICHTER M.F., LUNGE V.R., CUNHA C.W., DELAGOSTIN O., IKUTA N., FONSECA A.S., SILVA S.S., OZAKI L.S. Detection of Babesia equi (Laveran, 1901) by nested polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, v. 101, p. 9-21, 2001.
NIZOLI, Leandro Quintana. Alterações hematológicas e humorais de eqüinos expostos á infecção por Babesia equi, na região sul do Rio Grande do Sul. 39f. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Medicina Veterinária. Pelotas, 2005.
OGUNREMI O, HALBERT G, MAINAR-JAIME R, BENJAMIN J, PFISTER K, LOPEZ-REBOLLAR L, GEORGIADIS MP. Accuracy of an indirect fluorescent-antibody test and of a complement-fixation test for the diagnosis of Babesia caballi in field samples from horses. Preventive Veterinary Medicine, v.1, n. 83, p.41-51, 2008.
OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals: Equine Piroplasmosis, 2008
ÖNCEL T., VURAL G., GICIK Y., ARSLAN M. Ö. Detection of Babesia (Theileria) equi (Laveran, 1901) in Horses in the Kars Province of Turkey. Türkiye Parazitoloji Dergisi, v. 31, n. 3, p. 170-172, 2007.
57
PASSOS L.M.F., RIBEIRO M.F.B., ANDEREGG P.I., BÖSE R. Serological diagnosis of Babesia equi and Babesia caballi in pregnant mares. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 51, n. 6, 1999.
PENZHORN, B. L., A. M. KJEMTRUP, L. M. LOPEZ-REBOLLAR, AND P. A. CONRAD. Babesia leo n. sp. from lions in the Kruger National Park, South Africa, and its relation to other small piroplasms. Journal of Parasitology, v. 87, p. 681–685, 2001.
PEREIRA, M.A.V.C. Situação do parasitismo por Babesia equi (Laveran, 1901) e Babesia caballi (Nuttall & Strickland, 1912) em eqüinos da raça PSI, nos diferentes sistemas de manejo, no Estado do Rio de Janeiro. 1999. 119f. Tese (Doutorado em Parasitologia Veterinária) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
PEREIRA M.A.V., MASSARD C.L., FACCINI J.L.H, SIQUEIRA L.F.G. Ocorrência de Babesia equi (LAVERAN, 1901) e Babesia caballi (NUTALL & STRICKLAND, 1912) em equinos de raça puro sangue inglês de pequenos estabelecimentos equëstres. Arquivos do Instituto Biológico, v. 71, n. 4, p. 405-409, 2004.
PFEIFER BARBOSA, I., BÖSE, R., PEYMANN, B. et al.. Epidemiological aspects of equine babesioses in a herd of horses in Brazil. Veterinary Parasitology, v.58, p.1-8, 1995.
PHIPPS L.P., OTTER A. Transplacental transmission of Theileria equi in two foals born and reared in the United Kingdom. The Veterinary Record, v. 27, n. 154(13), p. 406-408. 2004.
PORTZ C., ALMEIDA F.Q., MASSARD C.L., BOTTEON P.F.L. Avaliação da Vitamina E como imunomodulador e infecção intrauterina por Theileria equi em potro. Parasitologia Latinoamericana, v. 62, n. 1-2, p. 16 - 22, 2007.
POTGIETER F.T., DE WAAL D.T., POSNETT E.S. Transmission and diagnosis of equine babesiosis in South Africa. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 87, Suppl 3, p. 139-142,1992.
RAMPERSAD J., CESAR E., CAMPBELL M.D., SAMLAL M., AMMONS D. A field evaluation of PCR for the routine detection of Babesia equi in horses. Veterinary Parasitology, v. 114, p. 81-87, 2003.
58
RIBEIRO, M.F.B., SAITO, J.F., PIMENTEL, P.V. Babesiose equina. I. Primo-infecção de potros em área endêmica. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.47, p.641-647, 1995.
RIBEIRO M.F., COSTA J.O., GUIMARÃES A.M. Epidemiological Aspects of Babesia equi in Horses in Minas Gerais, Brazil. Veterinary Research Communications, v. 23, n. 6, p. 385-390, 1999.
RONCATI, Neimar Vanderlei. Ocorrência de Theileria equi congênita em potros puro sangue lusitano no Brasil, diagnosticada através da técnica de RT-PCR. 69f. Tese (doutorado) – Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Clínica Médica. São Paulo, 2006.
RÜEGG S.R., TORGERSON P.R., DOHERR M.G., DEPLAZES P., BÖSE R., ROBERT N., WALZER C. Equine Piroplasmosis at the reintroduction site of the Przewalski’s horse (EQUUS FERUS PRZEWALSKII) in Mongolia. Journal of Wildlife Diseases, v. 42, n. 3, p. 515-526, 2006.
RÜEGG S.R., TORGERSON P., DEPLAZES P., MATHIS A. Age-dependent dynamics of Theileria equi and Babesia caballi infections in southwest Mongolia based on IFAT and/or PCR prevalence data from domestic horses and ticks. Parasitology, v. 134, p. 939-47, 2007.
RÜEGG S.R., HEINZMANN D., DARBOUR A.D., TORGERSON P. Estimation of the transmission dynamics of Theileria equi and Babesia caballi in horses. Parasitology, v. 135, p. 555-565, 2008.
SAKHA, M. Successful treatment of babesiosis in a horse. Journal Veterinary Research, v. 62, n. 4, p. 155-157, 2007.
SCHWINT O.N., UETI M.W., PALMER G.H., KAPPMEYER L.S., HINES M.T., CORDES R.T., KNOWLES D.P., SCOLES G.A. Imidocarb Dipropionate Clears Persistent Babesia caballi Infection with Elimination of Transmission Potential. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 53, n. 10, p. 4327-4332, 2009.
SEVINC F., MADEN M., KUMAS C., SEVINC M., EKICI O.D.A comparative study on the prevalence of Theileria equi and Babesia caballi infections in horse sub-populations in Turkey. Veterinary Parasitology, v. 156, p. 173-177, 2008.
59
SOUZA A.P., BELLATO V., SARTOR A.A., Silva A.B. Prevalência de anticorpos anti-Babesia equi em eqüinos no Planalto Catarinense. Ciência Rural, v. 30, n. 1, p. 119-121, 2000.
STILLER, D., COAN, M.E. Recent developments in elucidating tick vector relationships for anaplasmosis and equine piroplasmosis. Vetrinary Parasitology, v. 57, p. 97-108, 1995.
UETI M.W., PALMER G.H., SCOLES G.A., KAPPMEYER L.S., KNOWLES D.P. Persistently infected horses are reservoirs for intrastadial tick-borne transmission of the Apicomplexan parasite Babesia equi. Infection and Immunity, v. 76, n. 8, p. 3525-3529, 2008.
UILENBERG G. Babesia--a historical overview. Veterinary Parasitology, v. 31, n. 138(1-2), p.3-10, 2006.
VIAL H.J., GORENFLOT A. Veterinary Chemotherapy against babesiosis. Parasitology, v.138, p. 147–160, 2006.
XU Y., ZHANG S., HUANG X., BAYIN C., XUAN X., IGARASHI I., FUJISAKI K., KABEYA H., MARUYAMA S., MIKAMI T. Seroepidemiologic studies on Babesia equi and Babesia caballi infections in horses in Jilin Providence of China. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 65, n. 9, p. 1015-1017, 2003.
XUAN X., NAGAI A., BATTSETSEG B., FUKUMOTO S., MAKALA L.H., INOUE N., IGARASHI I., MIKAMI T., FUJISAKI K. Diagnosis of equine piroplasmosis in Brazil by serodiagnostic methods with recombinant antigens. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 63, n. 10, p. 1159-1160, 2001.
ZAHLER, M.; SCHEIN, E.; RINDER, H.; GOTHE, R. Taxonomic evaluation of Babesia canis isolates with different pathogenicity to dogs. Parasitology International, v.47, p.139, 1998.
ZOOBA R., ARDU M., NICCOLINI S., CHESSA B., MANNA L., COCCO R., PARPAGLIA M.L.P. Clinical and Laboratory Findings in Equine Piroplasmosis. Journal of Equine Veterinary Science, v. 28, n.5, p. 301-308, 2008.
