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  • Metodologias de identificao e elucidao de genes em bibliotecas genmicas

    METODOLOGIAS DE IDENTIFICAO E ELUCIDAO

    DE GENES EM BIBLIOTECAS GENMICAS

    Maria de Lurdes Antunes Jorge

    Bragana, 2012

  • Lio a apresentar na Escola Superior Agrria do Instituto Politcnico de Bragana, para Provas Pblicas de Avaliao de Competncia Pedaggica e Tcnico-Cientfica, de acordo com o n 9 do artigo 6. e do n 5 do artigo 8.A do Decreto-Lei n. 207/2009, alterado e aditado pela Lei n. 7/2010.

  • Metodologias de identificao e elucidao de genes em bibliotecas genmicas

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    1 ENQUADRAMENTO

    1.1 Objectivos da Unidade Curricular de Biologia Molecular

    A lio a apresentar insere-se no contedo programtico da Unidade Curricular de

    Biologia Molecular do 2 ano do Curso de Engenharia Biotecnolgica da Escola Superior

    Agrria de Bragana.

    Um dos objectivos desta Unidade Curricular (UC) fornecer aos alunos conhecimentos

    que lhes permitam compreender as matrias leccionadas noutras UCs do curriculum do

    respectivo curso (Engenharia Gentica, Biotecnologia na Produo Animal e

    Biotecnologia Microbiana), para as quais os assuntos estudados nesta UC so

    fundamentais.

    Adicionalmente, os alunos do Curso de Engenharia Biotecnolgica devero ficar

    preparados para dar resposta a solicitaes de entidades empregadoras em que, directa

    ou indirectamente, tenham que fazer utilizao de conhecimentos na rea da Biologia

    Molecular.

    A UC de Biologia Molecular tem uma carga horria semanal de 2 horas de aulas tericas

    e de 2horas de aulas prticas, a que correspondem 6,0 ECTS.

    O contedo programtico das aulas tericas obedece seguinte distribuio:

    1. Introduo s bases genticas. Natureza qumica e estrutura do DNA

    2. Diferentes tipos de genoma. Genomas eucariotas, procariotas, virais, organelares e

    nucleares

    3. Replicao. Replicao em procariotas e eucariotas

    4. Transcrio. Etapas da transcrio: iniciao, alongamento e terminao

    5. Traduo e Cdigo Gentico. Sntese de protenas: fases, factores e enzimas

    6. Tcnicas bsicas de Biologia Molecular utilizadas na medicina

    7. Tecnologia de DNA Recombinante. Clonagem. Vectores e estratgia de Clonagem

    Em anexo apresenta-se o programa desta unidade curricular.

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    Na apresentao desta lio ser adoptada uma metodologia expositiva de matrias com

    recurso a meios didcticos diversificados, que iro desde a projeco de uma

    apresentao em PowerPoint, visualizao de animaes de carcter pedaggico e

    consulta de sites na Internet. Sempre que necessrio, recorrer-se- tambm escrita no

    quadro, de forma a facilitar a apreenso de contedos e a interligao entre conceitos.

    Ser privilegiada, sempre que possvel, a articulao entre os contedos tericos das

    matrias leccionadas e os trabalhos de natureza experimental executados nas aulas

    prticas.

    1.2 Objectivos da lio

    No mbito da unidade curricular de Biologia Molecular esta lio enquadra-se no ltimo

    captulo, sobre a Tecnologia do DNA recombinante. Pretende-se integrar conceitos

    previamente abordados noutras aulas tericas, com os desta lio, recorrendo

    exposio de um caso concreto: a construo e rastreio de bibliotecas de DNA.

    Pretende-se que os alunos consigam relacionar conhecimentos previamente adquiridos

    sobre:

    endonucleases de restrio (modo de aco, tipo de extremos gerados,

    compatibilidade entre extremos)

    vectores de clonagem

    caractersticas de polylinkers

    sondas de cidos nucleicos

    utilizao de oligonucletidos iniciadores especficos e degenerados

    modo de actuao de diversas polimerases: DNA polimerase, Klenow DNA

    polimerase

    modo de aco de outras enzimas usadas em biologia molecular: ribonucleases

    (RNases), ligases, nucleases, tranferase terminal, fosfatase alcalina

    seleco de transformantes

    transcrio e RNA splicing

    electroforese

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    com os conceitos a introduzir na presente lio:

    bibliotecas genmicas e de cDNA

    clones de DNA genmico e cDNA

    rastreio de bibliotecas (com sondas, anticorpos, actividade biolgica da protena,

    por PCR)

    Expressed Sequence Tags (ESTs)

    High-Efficiency Thermal Asymmetric Interlaced PCR (HE-TAIL PCR)

    No final da lio, os alunos devero ser capazes de:

    distinguir bibliotecas de genmico e de cDNA

    entender as utilizaes de bibliotecas de genmico e de cDNA, bem como

    vantagens e inconvenientes de cada uma

    escolher os vectores de clonagem em funo dos objectivos de utilizao

    compreender as diferenas de actuao de diversas enzimas usadas no

    laboratrio de biologia molecular

    referir diferentes mtodos de rastreio de bibliotecas de DNA

    indicar vantagens e inconvenientes de cada mtodo

    2 SUMRIO

    Metodologias de identificao e elucidao de genes em bibliotecas genmicas

    1. Bibliotecas de DNA

    2. Obteno de uma biblioteca de DNA genmico

    2.1 Preparao do DNA

    2.2 Escolha dos vectores de clonagem

    2.3 Preparao do vector

    3. Obteno de bibliotecas de cDNA

    4. Rastreio de bibliotecas de DNA

    4. 1 Rastreio por hibridao de DNA

    4.1.1 Obteno de Expressed Sequence Tags - ESTs

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    4.2 Rastreio por ensaio imunolgico

    4. 3 Rastreio da actividade da protena

    4. 4 Rastreio baseado em tcnicas de PCR

    5. Exemplo de aplicao: Metodologias usadas na pesquisa da sequncia

    nucleotdica de novos genes em Trichoderma harzianum.

    BIBLIOGRAFIA ACONSELHADA

    Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P.

    (2002). Essential Cell Biology- An Introduction to the Molecular Biology of the Cell. New

    York & London: Garland Publishing, Inc. 630pp. ISBN 0-8153-2971-7.

    Correia, I., Moreira, L., & Fialho, A. (2003). Engenharia Gentica. In N. Lima, & M. Mota,

    Biotecnologia. Fundamentos e aplicaes: 125-161. LIDEL - Edies Tcnicas, Lda.

    ISBN-978-972-757-197-0.

    Hartl, D., & Jones, E. (1998). Genetics. Principles and Analysis (4th edition ed.).

    Sudbury, Massachussets: Jones and Bartlett Publishers. 840pp. ISBN 0-7637-0489-X.

    http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/project/benefits.shtml.

    King, M. (2011). Molecular Tools of Medicine.

    http://themedicalbiochemistrypage.org/molecular-medicine.html#genomic.

    Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P., Baltimore, D., & Darnell, J.

    (2000). Molecular Cell Biology. (4th edition ed.). New York: W. H. Freeman and Company.

    1084pp. ISBN 0-7167-3706-X.

    Nicholl, D. (2008). An Introduction to Genetic Engineering (Third Edition ed.). Hong Kong:

    Cambridge University Press. ISBN 978-0-521-850063.

    Primrose, S., & Twiman, R. (2006). Principles of Gene Manipulation and Genomics (7th

    Edition ed.). Blackwell Publishing.

    Videira, A. (2001). Engenharia Gentica. Princpios e aplicaes. Lidel - edies

    tcnicas, lda. 168pp. ISBN 978-972-757-163-8.

  • Unidade Curricular Biologia Molecular rea Cientfica Biologia e Bioqumica

    Licenciatura em Engenharia Biotecnolgica Escola Escola Superior Agrria de Bragana

    Ano Lectivo 2011/2012 Ano Curricular 2 Nvel 1-2 Crditos ECTS 6.0

    Tipo Semestral Semestre 1 Cdigo 9088-310-2101-00-11

    Horas totais de trabalho 162 Horas de Contacto T 30 TP - PL 30 TC - S - E - OT 20 O -

    T - Ensino Terico; TP - Terico Prtico; PL - Prtico e Laboratorial; TC - Trabalho de Campo; S - Seminrio; E - Estgio; OT - Orientao Tutrica; O - Outra

    Nome(s) do(s) docente(s) Altino Branco Choupina

    Resultados da aprendizagem e competncias

    No fim da unidade curricular o aluno deve ser capaz de:Adquirir slidos conhecimentos sobre a estrutura e propriedades dos cidos nucleicos.1.Conhecer a funo do ADN e os mecanismos genticos fundamentais.2.Identificar o dogma central da biologia molecular.3.Compreender a estrutura do genoma.4.Interpretar os diferentes mecanismos da expresso gentica.5.Compreender os processos que permitem o estabelecimento de mutaes e recombinaes genticas.6.Estabelecer uma viso geral das tcnicas do ADN recombinante a partir de conhecimentos adquiridos.7.Tomar conscincia das implicaes sociais das aplicaes da Biologia Molecular8.

    Pr-requisitos

    Antes da unidade curricular o aluno deve ser capaz de:Possuir conhecimentos, gerais, da Biologia, Bioqumica, Gentica e Microbiologia.1.Recomenda-se ainda que possuam conhecimentos de Ingls.2.

    Contedo da unidade curricular

    Estrutura e funo dos cidos nucleicos, expresso gentica, recombinao gentica e tecnologia do DNA recombinante.

    Contedo da unidade curricular (verso detalhada)

    Tericos:1.A estrutura dos cidos nucleicos;-a natureza dos genes e funo do ADN;-controlo da expresso gentica;-mutaes e recombinao genticas;-ADN recombinante: Viso geral;-

    Prticos:2.electroforese em gis de agarose;-anlise de restrio com endonucleases-extraco purificao e quantificao de cidos nucleicos-Reaco em cadeia da polimerase (PCR);-preparao de clulas competentes e transformao com plasmdeos autnomos;-

    Bibliografia recomendada

    Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed. Lewin, B. (2000)1.Genes VII, 7th ed, Oxford University Press. Sambrook J et al (1989)2.Sambrook J et al (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator