Ecologia química de machos de Aedes Stegomyia aegypti

KELLY DA SILVA PAIXÃO

Ecologia química de machos de Aedes (Stegomyia) aegypti Linnaeus, 1762

(Diptera: Culicidae) e identificação química de compostos presentes na

cutícula de adultos

Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Biológicas

Belo Horizonte, MG

2011

KELLY DA SILVA PAIXÃO

Ecologia química de machos de Aedes (Stegomyia) aegypti Linnaeus,

1762 (Diptera: Culicidae) e identificação química de compostos

presentes na cutícula de adultos

Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Biológicas

Belo Horizonte, MG

2011

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Parasitologia do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Minas Gerais, como requisito parcial para

obtenção do grau de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Entomologia

Orientador: Dr. Álvaro Eduardo Eiras

Co-orientador: Dr. Evaldo Ferreira Vilela

Trabalho desenvolvido no Laboratório de

Ecologia Química de Insetos Vetores

(LabEQ), Universidade Federal de Minas

Gerais com auxílio do CNPQ.

PESQUISADORES COLABORADORES

Dr. Klaus Carbonel. Jaffé – Laboratório de Comportamiento, Universidad Simón

Bolívar – Venezuela.

Dra. Daniela Maria do Amaral Ferraz Navarro – Laboratório de Ecologia Química,

Departamento de Química Fundamental – Universidade Federal de Pernambuco.

Dra. Luciane Gomes Batista-Pereira – Laboratório de Ecologia Química de Insetos

Vetores.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Parasitologia da UFMG pela

oportunidade de desenvolver este projeto.

Aos professores e funcionários do Departamento de Parasitologia da UFMG,

especialmente à Sumara Ferreira, secretária do programa de pós-graduação, um

verdadeiro anjo em nossas vidas que não mede esforços para ajudar.

Ao CNPQ pela concessão da bolsa de doutorado.

Ao Dr. Álvaro E. Eiras, meu orientador, pela oportunidade, pelo voto de

confiança ao iniciarmos este projeto e pelos ensinamentos ao longo de todos esses anos.

Ao Dr. Evaldo F. Vilela, co-orientador do projeto, por todo o apoio, todas as

contribuições e por me permitir aprender um pouco com ele.

Ao Dr. Klaus C. Jaffé pela colaboração e auxílio no preparo dos extratos.

À Dra. Daniela M. A. F. Navarro pela participação na identificação química,

trabalho realizado de maneira competente e impecável. Obrigada por me receber tão

bem em Recife e tornar prazerosa minha estadia.

À Dra. Luciane G. Batista- Pereira pela colaboração auxiliando na parte de

cromatografia, pelas revisões na tese e no artigo, pelo carinho e atenção, sempre.

Aos funcionários da central analítica do Departamento de Química Fundamental

da Universidade Federal de Pernambuco, em especial ao Sr. Lúcio, à Conceição e à

Eliete.

À técnica de nível superior Célia de Sá Sciavico por estar sempre disponível

para ajudar. É difícil imaginar como uma única pessoa possa ter tantas qualidades. Você

é um anjo que Deus colocou no LabEQ!

Aos voluntários nos experimentos com odor humano obrigada pela

disponibilidade em ajudar.

Aos muitos estagiários que passaram por atuaram neste trabalho e abraçaram um

projeto que começou do zero, mas com muito, muito trabalho: Ariana, Carla, Lucilene,

Marina. Especialmente ao Caio Leme e o Iuri Pereira que resistiram bravamente até o

fim ao calor da sala de machos ao separar pupas e o forno da sala de olfatometria.

Obrigada pela dedicação e compromisso, essa conquista também é de vocês!

À técnica Taís Ribeiro Guimarães, responsável pela manutenção da colônia de

insetos do laboratório. Querida Taís, obrigada por ser tão doce e se esforçar tanto para

cuidar dos meus mosquitos!

Aos amigos que fiz no LabEQ com os quais muito aprendi e hoje ensinam a

outros: Andrey, Claudinha, Ivi, Marcelo, Renatinha e Rose, que mesmo de longe torcem

e confortam nos momentos de desespero!

Aos amigos que ainda estão por aqui e tornam meus dias mais felizes. Ana Paula

Carrusca (que trouxe mais alegria ao lab), Andréia, Anna, Caio, Caro, Célia, Estefane,

Isadora, Iuri, Laila, Lú, Milton, Moreno, Priscila, Taís, Tati. Obrigada por tornarem o

LabEQ um lugar especial, obrigada pelas companhias em congressos, pelos ―ojos

grandes‖, pelos almoços, açaís, filmes, gargalhadas ... Que Deus abençoe imensamente

a cada um de vocês e retribua todo o bem que me fazem.

Aos amigos do Departamento de Parasitologia e da minha turma de mestrado.

Aos amigos e familiares que tanto oraram por mim! Aos tios, primos, amigos,

sogros e cunhados que estão sempre na torcida. À minha família pelo carinho, amor e

atenção: meus pais Edimar e Maria Raimunda, meus irmãos Keidson, Kenny e Camila e

minha cunhada Taís. Amo vocês!

.

Ao Bruno, meu marido e amigo de verdade, que acredita e confia em mim mais

que eu mesma. Que ao final disso tudo já virou Biólogo de tanto me ouvir falar!

Inclusive me dando idéias para os experimentos! Obrigada por deitar para dormir perto

de mim, enquanto eu virava noites trabalhando e dizer: ―se precisar de alguma coisa me

acorde‖! Você sabe que não dá pra escrever tudo aqui, senão seria outra tese. Amo

você! 3=1!

Agradeço a Deus, o principal responsável, por mais uma etapa concluída, por

mais uma conquista com a certeza de que Ele sempre esteve à frente.

“É preciso que eu suporte duas ou três

larvas se quiser conhecer as borboletas.”

Antoine Saint-Exupéry

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO GERAL 20

1.1 O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti 21

1.2 Aspectos da biologia de Aedes aegypti 21

1.3 Comportamento de alimentação e de localização de hospedeiros realizados pelo

Aedes aegypti

21

1.4 Importância do Aedes aegypti em Saúde Pública 24

1.5 Ecologia química de insetos 28

1.6 Feromônios sexuais em insetos 31

1.7 Orientação dos insetos 32

1.8 Bioensaios comportamentais 33

2 JUSTIFICATIVA 34

3 OBJETIVOS 36

3.1 Objetivo geral 36

3.2 Objetivos específicos 36

Capítulo I: Resposta de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) ao odor de

hospedeiros vertebrados em olfatômetro horizontal de dupla escolha 38

1 Introdução 39

2 Material e métodos 41

Página

2.1 Criação dos insetos

41

2.2 Bioensaios em olfatômetro horizontal de dupla escolha 43

2.3 Experimento 1. Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste 45

2.4 Experimento 2: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti de diferentes

idades ao odor humano 47

2.5 Experimento 3: Respostas de machos e fêmeas, virgens e copulados, ao odor de

diferentes hospedeiros humanos 48

2.6 Experimento 4: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de

diferentes hospedeiros vertebrados 49

2.7 Análise estatística 51

3 Resultados 52

3.1Experimento 1: Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste 52


idades ao odor humano

53


diferentes hospedeiros humanos

54

3.4 Experimento 4: Resposta de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de

diferentes hospedeiros vertebrados

57

4 Discussão

59

Capítulo II. Padronização da extração e identificação química dos compostos presentes

na cutícula de adultos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) 63

1 Introdução 64


2.1 Criação de Aedes aegypti para o preparo dos extratos 67

2.2 Extração do odor de adultos de Aedes aegypti 67

2.2.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti 67

2.2.2 Cromatografia a gás 69

2.2.3 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM) 69

3 Resultados 71

3.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti e análise

no cromatógrafo a gás 71

3.2 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM) 77

4 Discussão 80

Capítulo III: Atratividade de insetos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus

1762) ao odor de adultos co-específicos e a extratos hexânicos de adultos 82

1 Comportamento de cópula e reconhecimento intra-específico em Culicidae 83


2.1 Criação dos insetos 84

2.2. Olfatômetro 85

2.3 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos 86

2.4 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos 87

3 Resultados 88

3.1 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos 88

3.2 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos 88

A. Resposta de fêmeas virgens 88

B. Resposta de machos virgens 90

4 Discussão 92

CONCLUSÕES 96

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 98

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Número de casos e óbitos de Dengue e Dengue Hemorrágica no Brasil e nas

Américas durante os últimos cinco anos e percentual de casos brasileiros em

relação ao total de casos no continente americano. * Dados até a 17ª semana

epidemiológica (DADOS: OPAS 2010, SVS 2009, 2010).

27

Tabela 2 Quantidade de Aedes aegypti danificados após captura com

capturador manual de Castro e gaiola de seleção (n=30).

53

Tabela 3 Percentual médio de resposta (±e.p.) de adultos de Aedes aegypti ao odor de

diferentes hospedeiros humanos. ● Voluntários do sexo feminino. °

Voluntários do sexo masculino. *Significativamente atrativo comparado

com o controle (t-test ou Mann-Whitney, p<0.05).

56

Tabela 4 Percentual médio de resposta de machos de Aedes aegypti em olfatômetro

horizontal de dupla escolha a diferentes hospedeiros vertebrados e a

compostos de localização de hospedeiros. a Tubo de apresentação do

estímulo no olfatômetro. * Diferença significativa entre os estímulos

(p<0,05, Mann-Whitney) (n=15). b Os valores apresentados em ―Mosquitos

ativos‖ se referem à soma dos percentuais médios de mosquitos ativados,

mosquitos no Tubo A e mosquitos no Tubo B.

58

Tabela 5 Média de picos presentes em extratos hexânicos de adultos virgens de

Aedes aegypti (machos e fêmeas) filtrados e não-filtrados, seguindo

metodologia de Jaffé (comunicação pessoal 2009) (n=3).

77

Tabela 6 Compostos identificados em extratos hexânicos de machos e fêmeas

virgens de Aedes aegypti por cromatografia a gás acoplada à

espectrometria de massas (CG-EM).

79

Tabela 7 Percentual de resposta de fêmeas e machos virgens de Aedes aegypti ao

odor de insetos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.). ―*‖ Indica

diferença estatística (p<0,05 Kruskal Wallis) (n=15).

89

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Áreas com ocorrência de transmissão do vírus da febre amarela no

ano de 2009. (Fonte: CDC 2010). 25

Figura 2 Áreas endêmicas para dengue no ano de 2009 (Fonte: WHO 2010). 26

Figura 3 Áreas endêmicas para o vírus do Chikungunya (azul). (Fonte: CDC

2010). 28

Figura 4 O mundo químico dos insetos. As regiões vermelhas no corpo do

inseto indicam locais onde estão presentes as sensilas (Adaptado de:

Naters & Carlson 2006).

31

Figura 5 Separador de formas imaturas. (1) Larvas, (2) Pupas de machos

(menores), (3) Pupas de fêmeas (maiores) (Fotos: Capurro 2006). 43

Figura 6 Olfatômetro horizontal de dupla escolha. 1. A. Gaiola de liberação; B.

Tubo principal; C. Caixa de escolha; D. Tubo de escolha; E. Tubo de

liberação de estímulos. 2. a. Exaustor; b. Filtro de carvão ativado; c.

Banho-Maria (Fotos: Mota, 2003).

45

Figura 7 Representação da interpretação dos resultados ao final dos

experimentos de acordo com a localização dos insetos. A. Insetos

inativos; B+C+D. Insetos ativados; E. Insetos atraídos. B+C+D+E:

Insetos ativos (insetos que deixaram a gaiola de liberação); F. Local

de liberação do estímulo. A seta indica o sentido do fluxo de ar (Foto:

Leme 2010).

45

Figura 8 Esquema da gaiola de seleção de insetos. A. Ventilador para produção

do fluxo de ar, B. ―Gaiola de seleção‖, C. Gaiola de criação contendo

os insetos, D. Recipiente para captura dos insetos. A seta indica o

sentido do fluxo de ar.

46

Figura 9 Metodologias de seleção de insetos para teste em olfatômetro. A.

Seleção de insetos com o Capturador de manual de Castro, B. ―Gaiola

de seleção‖, C. Seleção de insetos com a ―Gaiola de seleção‖ (Fotos:

Leme 2010, Paixão 2010).

47

Figura 10 Sistema de obtenção de odor de hospedeiro. A. A seta aponta para o

filtro de carvão ativado. B. Recipiente onde era mantido o animal. 50

Figura 11 Inserção do odor dos hospedeiros no olfatômetro. A. Mangueiras de

polietileno provenientes do sistema de aeração. B. Papel de filtro

preso em clip metálico (Durante os testes a abertura para inserção do

estímulo era mantida fechada) (Fotos: Leme 2010).

50

Figura 12 Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti ao odor

humano separadas com ―Gaiola de seleção‖ e ―Capturador manual de

Castro‖ (% ± e.p.). Letras diferentes indicam diferença estatística

significativa (p<0,05 Teste t, n=15).

52

Figura 13 Percentual médio de respostas de machos virgens de Aedes aegypti de

diferentes idades ao odor humano em olfatômetro horizontal de dupla

escolha (n=15).

54

Figura 14 Percentual médio (± e.p.) de resposta de machos de Aedes aegypti,

virgens e copulados, ao odor de homens e mulheres em olfatômetro

horizontal de dupla escolha. Letras diferentes indicam diferença

estatística significativa (p<0,05 Kruskal-Wallis) (n=15).

55

Figura 15 Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti, virgens e

copuladas, ao odor de homens e mulheres (Porcentagem média ± e.p.)

(n=15). Letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05

teste t) (n=15).

57

Figura 16 Hexano (controle). 69

Figura 17 Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas de Aedes

aegypti realizados em diferentes tempos e filtrados. 72

Figura 18 Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de

Aedes aegypti em diferentes quantidades filtrados. 73

Figura 19 Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de

Aedes aegypti em diferentes quantidades sem filtração. 74

Figura 20 Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de

Aedes aegypti em diferentes quantidades filtrados. 75

Figura 21 Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de

Aedes aegypti em diferentes quantidades sem filtração. 76

Figura 22 Sobreposição dos cromatogramas de extratos de machos (preto) e

fêmeas (vermelho) destacando compostos em comum e compostos

exclusivos de um dos sexos (n=3). As informações sobre os

compostos indicados pelas letras estão contidas na Tabela 6.

78

Figura 23 Esquema do sistema de aeração utilizado nos testes com odor de

Aedes aegypti. A. Filtro de carvão ativado, B. Bifurcação para divisão

do fluxo de ar, C. Tubo de vidro com insetos (teste), D. Tubo de vidro

vazio (controle). E. Mangueira. A seta indica o sentido do fluxo de ar.

86

Figura 24 Apresentação dos estímulos no olfatômetro. A. Encaixe da mangueira

do sistema de aeração. B. Fixação do papel de filtro no tubo de

liberação de estímulo do olfatômetro com clipe de metálico (durante

os testes o tubo era fechado) (Fotos: Leme 2010).

87

Figura 25 Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a

extratos de fêmeas co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em

olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3) (p<0,05 Mann-

Whitney).

89

Figura 26 Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a

extratos de machos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em


Whitney).

90

Figura 27 Percentual de atividade de vôo de fêmeas virgens de Aedes aegypti a

extratos de insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro

horizontal de dupla escolha (Porcentagem média ± e.p.) (n=3)

(Spearman, p<0,05).

90

Figura 28 Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a

extratos de fêmeas co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em


Whitney).

91

Figura 29 Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a

extratos de machos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em


Whitney).

92

Figura 30 Percentual de atividade de vôo de machos virgens de Aedes aegypti a

extratos de insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro

horizontal de dupla escolha (Porcentagem média ± e.p.) (n=3)

(p>0,05 Mann-Whitney).

92

LISTA DE ABREVIATURAS

CDC Centers of disease control and prevention

CG Cromatografia a gás

CG-EM Cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas

HC Hidrocarboneto cuticular

FDH Febre da dengue hemorrágica

ICB Instituto de Ciências Biológicas

LabEQ Laboratório de Ecologia Química de Insetos Vetores

OMS Organização Mundial de Saúde

OPAS Organização Panamericana de Saúde

RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction

SCD Síndrome de choque da dengue

SVS Secretaria de vigilância em saúde

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

WHO World Health Organization

RESUMO

O presente trabalho demonstrou que o comportamento dos machos de Aedes

aegypti na presença de odor humano variou de acordo com a idade dos insetos. Assim,

machos com 24h de idade foram inativos (48%), enquanto aqueles com idade entre três

e 10 dias foram ativos (>85%). A resposta de A. aegypti, virgens e copulados, ao odor

humano (homens e mulheres) mostrou que a cópula foi importante para a atração.

Machos copulados foram atraídos tanto por odor de homens quanto de mulheres e

apresentaram atividade de vôo de 50%. Enquanto os machos virgens não foram atraídos,

mas apresentaram atividade de vôo superior a 70%. As fêmeas, virgens e copuladas,

foram atraídas por odor de homens e mulheres, porém, apenas 32% das fêmeas virgens

foram atraídas por odor de mulheres.

A caracterização química dos compostos presentes na cutícula de A. aegypti da

população brasileira permitiu identificar ácidos, aldeídos e hidrocarbonetos. Foram

identificados 28 compostos, 25 das fêmeas e 23 dos machos, sendo 5 exclusivos de

fêmeas (4-metil-3-penten-2-one/ 2-pentenal,2-metil/ 2-pentanone,4-mercapto-4-metil/

benzaldeído e triacontano) e 3 de machos (ciclohexene,1-metil-4-(1-metiletenil)/

tridecano e eicosano).

Em testes avaliando a resposta dos mosquitos ao odor de insetos co-específicos

foi demonstrado que os machos foram atraídos por odor de machos virgens vivos. As

fêmeas não foram atraídas pelo odor dos insetos vivos, entretanto, o odor de machos

virgens foi importante para a ativação do vôo (54%). Testes avaliando a resposta de A.

aegypti a extratos de insetos co-específicos demonstraram que os extratos de machos e

fêmeas foram atrativos para ambos os sexos. Entretanto, tal atratividade, assim como a

atividade de vôo, foi dependente da quantidade de insetos nos extratos.

ABSTRACT

This work demonstrated, that the behavior of Aedes aegypti males in the

presence of human odor varied according to the insects’ age. Males aged 24 hours were

inactive (48%), while those aged between three and 10 days were active (> 85%). The

response of virgin and mated A. aegypti to the odor of humans (men and women)

showed that mating was important for attraction. Copulated males were attracted to the

odor of men and women and showed flight activity of 50%, while virgin males were not

attracted but showed flight activity of over 70%. Virgin and copulated females were

attracted by the odor of men and women, but only 32% of virgin females were attracted

to the odor of women. Acids, aldehydes and hydrocarbons were identified from

brazilian A. aegypti cuticles. 28 compounds, 25 of females and 23 of males were

identified. 5 of them were exclusive for females (4-methyl-3-penten-2-one/ 2-

pentenal,2-methyl/ 2-pentanone,4-mercapto-4-methyl/ benzaldehyde e triacontane) and

3 of them exclusive for males (ciclohexene,1-methyl-4-(1-methylethenil)/ tridecane e

eicosane).

Tests evaluating the mosquitoes response to the odor of conspecific insects

showed, that males were attracted to the odor of virgin males. Females were not

attracted to the insects’ odor, however, the odor of virgin males was important for flight

activation (54%). Tests evaluating the response of A. aegypti to extracts of conspecific

insects showed that extracts of males and females were attractive to both sexes.

However, this attractiveness as well as flight activity was dependent on the amount of

insects in extracts.

20

1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1 .O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti

O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti (Diptera, Culicidae) destaca-se pelo

volume de estudos devido à sua importância em saúde pública (WHO 2001). Descrito

originalmente no Egito, o que deu origem ao nome da espécie, esse vetor tem

populações selvagens e domésticas (Belkin 1962). Cosmopolita, o mosquito apresenta

distribuição em focos delimitados, a qual se relaciona com a ocorrência de transporte

acidental e está em constante expansão territorial (Forattini 2002, Lozovei 2001, OPAS

1995). A ampla distribuição de A. aegypti, bem como sua rápida expansão, está

relacionada com a ocorrência de transporte acidental o que, provavelmente, permitiu

que o inseto chegasse às Américas no período colonial (séculos XVI e XIX) durante a

ocorrência do tráfico de escravos (Forattini 2002, Lozovei 2001).

O A. aegypti é considerado um mosquito tropical e subtropical com distribuição

entre os paralelos de 35º de latitude Norte e 35º de latitude Sul, que correspondem à

isoterma de inverno de 10°C (Forattini 2002, Reiter 2010). Caracterizado como um

inseto de regiões quentes, o mosquito foi registrado em 21 estados nos Estados Unidos,

muitos dos quais podem apresentar temperaturas abaixo de -20°C. Como esses insetos

não sobrevivem em ambientes muito frios, provavelmente devem permanecer em locais

protegidos durante períodos com temperaturas muito baixas (Reiter 2010).

Esse vetor é conhecido nas Américas por seu alto grau de antropofilia e

normalmente está associado à presença humana (Forattini 2002), pois nas habitações

humanas, ou próximo a elas, as fêmeas do mosquito podem encontrar abrigo e

hospedeiros para o repasto sanguíneo (Forattini 2002).

21

1.2 Aspectos da biologia de Aedes aegypti

O A. aegypti possui um ciclo de vida do tipo holometábolo, ou seja, durante seu

desenvolvimento o inseto passa por quatro estágios (ovo, quatro ínstares larvais, pupa e

adulto) com forma de alimentação e habitat distintos (Lozovei 2001).

A oviposição acontece no período diurno com um pico matutino (6h às 8h) e outro

vespertino (16h às 18h) (Cobert & Chadee 1992, Gomes et al. 2006). O número médio

de ovos por postura é 120, o qual depende da quantidade de sangue ingerido durante o

repasto sangüíneo (Forattini 2002). A eclosão das larvas ocorre cerca de dois dias após a

oviposição, caso as condições ambientais sejam favoráveis, e tem como principal

estímulo o contato com a água do criadouro (Forattini 2002). As formas imaturas se

desenvolvem em água doce e parada, com pouca matéria orgânica em decomposição

(Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira 1998).

Os adultos são alados com corpo coberto por escamas escuras e prateadas e

possuem hábitos diurnos com pico da atividade de hematofagia durante os períodos

matutino (6h e 7h) e vespertino (17h, 18h e 19h) (Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira

1998, Forattini 2002, WHO 1969).

1.3 Comportamento de alimentação e de localização de hospedeiros realizados pelo

Aedes aegypti

Tanto os machos quanto as fêmeas de mosquitos se alimentam de néctar de plantas

(Bidlingmayer & Hem 1973, Clements 1999, Foster & Takken 2004, Forattini 2002,

Healy & Jepson 1988, Jepson & Healy 1988, Mauer & Rowley 1999, Thorsteinson &

Brust 1962). A alimentação açucarada é importante fonte de energia para o vôo dos

22

mosquitos, sendo mais disponível que a alimentação sanguínea e capaz de conferir

maior longevidade (Jepson & Healy 1988, 1971, Tsunoda et al. 2010). Além disso, a

busca por alimentação açucarada é considerada como o principal fator para dispersão e

migração desses insetos (Hocking 1953). As plantas e os animais produzem compostos

voláteis como consequência de suas atividades metabólicas, os quais podem ser

utilizados por muitos insetos para a localização de fontes alimentares e sítios de

oviposição (Chapman 1988). Os voláteis de plantas aos quais os mosquitos respondem

incluem os monoterpenos cíclicos ou bicíclicos e óleos essenciais de plantas (Takken &

Knols 1999).

Os machos de A. aegypti se alimentam exclusivamente de néctar de plantas, tendo

preferência por néctares ricos em sacarose (Prasad & Daniel 1988). Estes insetos,

independente da sua idade ou estado fisiológico, são atraídos pelos voláteis emanados

das plantas, (Clements 1999, Forattini 2002, Healy & Jepson 1988, Hocking 1953,

Mauer & Rowley 1999, Thorsteinson & Brust 1962). As fêmeas respondem aos voláteis

das plantas tanto quanto os machos, contudo preferem néctares ricos em glucose

(Clements 1999, Jepson & Healy 1988, Prasad & Daniel 1988, Thorsteinson & Brust

1962, Vargo & Foster 1982). Além disso, as fêmeas realizam a hematofagia, pois é pela

alimentação sanguínea que o inseto obtém os aminoácidos que serão utilizados na

maturação dos ovos (Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira 1998, Forattini 2002, Klowden &

Briegel 1994).

As fêmeas do mosquito podem se alimentar tanto em humanos quanto em animais,

porém, exibem um comportamento altamente antropofílico (Barata et al. 2001, Forattini

2002). A importância do hospedeiro vertebrado para as fêmeas permitiu que as mesmas

utilizassem uma série de estratégias para localização de tal fonte alimentar (Clements

1999, Dekker et al. 2005, Kline et al. 2006).

23

A atratividade das fêmeas a hospedeiros vertebrados já é bastante conhecida

devido à importância da alimentação sanguínea para a manutenção do ciclo do inseto,

bem como de seu papel na transmissão de patógenos (Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira

1998, Forattini 1996, Steib et al. 2001, Taken 1991, Takken & Knols 2010), e seu

estudo vem permitindo o avanço no monitoramento do vetor com o uso de atraentes

sintéticos de odor humano em armadilhas específicas para sua captura (Kröeckel et al.

2006, Maciel-de-Freitas 2006, Paixão 2007).

Apesar dos machos de mosquitos responderem principalmente ao odor de plantas,

algumas espécies de Aedes e Mansonia respondem ao odor de hospedeiros vertebrados,

sendo normalmente encontrados próximos a eles (Hartberg 1971, Jaenson 1985, McIver

et al. 1980, Takken & Knols 2010). Acredita-se que esse comportamento ocorra com o

objetivo de encontrar fêmeas à procura de repasto sanguíneo, o que facilitaria o

encontro de fêmeas para realização da cópula (Clements 1999, Hartberg 1971, Jaenson

1985, McIver et al. 1980).

O uso de armadilhas iscadas com compostos atrativos para coleta de fêmeas de

A. aegypti é bastante conhecido (Eiras & Geier 2002, Geier & Eiras 2003, Irish et al.

2008). Tanto as armadilhas iscadas com compostos sintéticos de voláteis de plantas

quanto aquelas com compostos sintéticos de odor humano são específicas para a coleta

de fêmeas, No entanto, elas também capturam grandes quantidades de machos de

culicídeos (Ázara 2009, Gama 2006, Kröeckel et al. 2006, Maciel-de-Freitas et al. 2006,

Paixão 2007).

24

1.4 Importância do Aedes aegypti em Saúde Pública

As fêmeas de A. aegypti apresentam um comportamento conhecido como

―persistência na atividade de sugar‖, ou seja, uma vez interrompidas durante a

hematofagia, retornam para picar o hospedeiro, ou procuram outro hospedeiro para

completar o repasto sanguíneo (Forattini 2002). Tal comportamento faz com que as

mesmas sejam vetores de grande eficiência, pois a capacidade de transmissão de

patógenos de um indivíduo para outro é aumentada. Outro fator importante é o aumento

da resposta a estímulos dos hospedeiros pelas fêmeas que já completaram pelo menos

um ciclo gonotrófico. Essa característica permite que fêmeas mais velhas e

epidemiologicamente mais importantes na transmissão de patógenos localizem o

hospedeiro com mais facilidade (Klowden & Fernandez 1995, Forattini 2002).

Além de provocarem grande desconforto ao hospedeiro devido à picada, as fêmeas

de A. aegypti podem transmitir uma série de patógenos ao homem e a outros animais,

principalmente viroses como: a febre amarela urbana, o vírus do chikungunya, a dengue

e a febre hemorrágica da dengue (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND

PREVENTION – CDC 2010, Lozovei 2001, Reiter 2010).

A febre amarela é uma doença causada por um arbovírus da família Flaviviridae,

gênero Flavivirus, e se mantém nos ciclos silvestres em primatas não-humanos

(Vasconcelos 2003, OPAS 2010). O A. aegypti atua como vetor do vírus no ambiente

urbano e, apesar de não serem relatados surtos urbanos nas Américas desde 1954, a

presença do mosquito mantém o risco de epidemia. Na região africana é comum a

ocorrência de surtos urbanos e rurais, podendo causar milhares de mortes por ano

(WHO 1997, CDC 2010) (FIG. 1).

25

Figura 1. Áreas com ocorrência de transmissão do vírus da febre amarela no ano de

2009. (Fonte: CDC 2010).

A dengue, também causada por um Flavivirus, é a arbovirose de maior importância

atualmente e se destaca como um dos principais problemas de saúde pública mundial

(WHO 2001). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 2,5 a 3,0

bilhões de pessoas vivem em áreas com risco de transmissão (WHO 2001), dessas 50 a

100 milhões se infectam por ano, em mais de 100 países (FIG. 2). A doença pode se

manifestar de diversas formas, entre elas a Febre da Dengue, a Febre da Dengue

Hemorrágica (FDH) e a Síndrome de Choque da Dengue (SCD). Esta última pode levar

até 50% dos doentes não tratados ao óbito (WHO 1997, WHO 2001). Do total de

doentes, cerca de 550 mil são hospitalizados e 20 mil morrem em consequência da

doença, em sua maioria crianças (WHO 2001). Estudos soroepidemiológicos no Brasil

demonstraram que mais de 70% da população urbana do país já contraiu a doença e que

atualmente os 4 sorotipos existentes circulam em 22 dos 27 Estados brasileiros

(Siqueira et al. 2005, SVS 2010). Siqueira et al.(2005) verificaram que 70% dos casos

de dengue descritos nas Américas entre os anos 2000 e 2005 ocorreram no Brasil.

26

Conforme a Tabela 1, pode ser verificado que após cinco anos, o número de casos

brasileiros ainda se destaca no continente americano (SVS 2009, 2010, OPAS 2010).

Apesar de não realizarem alimentação sanguínea, o papel dos machos de Aedes na

manutenção da circulação viral é de grande importância devido às formas de

transmissão vertical e venérea (Kow et al. 2001, Tu et al.1998).

Figura 2. Áreas endêmicas para dengue no ano de 2009 (Fonte: WHO 2010).

27

Tabela 1. Número de casos e óbitos de Dengue e Dengue Hemorrágica no Brasil e nas Américas durante os últimos cinco anos e percentual de casos

brasileiros em relação ao total de casos no continente americano. * Dados até a 17ª semana epidemiológica (DADOS: OPAS 2010, SVS 2009, 2010).

2006

2007 2008 2009 2010 * Total

Brasil Américas Brasil Américas Brasil Américas Brasil Américas Brasil Américas Brasil Américas

Dengue

clássica

346.550

(62,8%) 552.141

559.954

(62,2%) 900.782

734.384

(80,8%) 908.926

406.883

(44,4%) 917.311

730.587

(80%) 913.530

2.778.358

(66,3%) 4.192.690

Dengue

Hemorrágica

628

(4,3%) 14.453

1.541

(5,8%) 26.413

9.957

(30,7%) 25.696

4.281

(16,9%) 25.268

6.438

(34,8%) 18.516

22.845

(20,7%) 110.346

Óbitos 67

(34,7%) 193

158

(49,8%) 317

212

(69,3%) 306

166

(44,7%) 371

321

(72%) 446

924

(56,6%) 1.633

28

A febre do chikungynya é uma doença viral causada por um vírus do gênero

Alphavirus, família Togaviridae, e foi isolada pela primeira vez na Tanzânia em 1953

(Simon 2007). Desde então, foram relatadas epidemias em várias áreas da África e da

Ásia (FIG. 3). Recentemente, foram relatados casos em áreas da Europa, Estados

Unidos, Canadá e Guiana Francesa o que tem caracterizado a doença como re-

emergente e em constante expansão (CDC 2010, Simon 2007). Raros pacientes

desenvolvem uma forma mais grave da doença, normalmente ocorre em pessoas mais

velhas, porém, existe a preocupação da ocorrência da doença em viajantes, uma vez que

eles podem transportar o vírus para regiões não endêmicas (CDC 2006).

Figura 3. Áreas endêmicas para o vírus do Chikungunya (azul). (Fonte: CDC 2010).

1.5 Ecologia química de insetos

A comunicação é de fundamental importância no comportamento animal e é

definida como um processo que envolve a transmissão de sinais entre organismos

(Cardé & Bell 1995). O termo normalmente utilizado para denominar as substâncias

químicas envolvidas na comunicação entre os seres vivos é semioquímicos (Nordlund &

Lewis 1976, Mori 1998, Prasad & Daniel 1988), porém, Dicke & Sabelis (1988)

propuseram o uso do termo infoquímicos considerando a possibilidade do composto ser

29

benéfico ou prejudicial do ponto de vista evolutivo (Nascimento & Sant’Ana 2001).

Dentro dos infoquímicos existem duas categorias de substâncias: (1) feromônios:

substâncias que mediam interações entre organismos da mesma espécie, e podem ser

classificados como feromônios sexuais, de defesa, de recrutamento, de trilha e outros

(Vander Meer et al. 1998, Wilson & Hooldobler 1990); (2) aleloquímicos: substâncias

que mediam interações entre indivíduos de espécies distintas, sendo classificados de

acordo com o tipo de organismo que está sendo beneficiado na comunicação. Quando é

benéfica apenas para a espécie emissora (alomônio), quando benéfica para a espécie

receptora (cairomônio) ou benéfica para ambas as espécies (sinomônios) (Vilela &

Della-Lucia 2001).

Ecologia Química, portanto, é a ciência que permite o estudo dos infoquímicos,

procurando identificar e sintetizar substâncias que possam levar informações entre os

organismos e investigando o papel desses compostos no comportamento e na ecologia

dos seres vivos (Aldrich 2008).

Os seres vivos que mais utilizam compostos voláteis para desempenhar suas

funções vitais (localização e seleção de hospedeiros vertebrados e plantas nas quais se

alimentam, além da identificação e localização de parceiros para a cópula) são os

insetos e as principais ferramentas utilizadas para isso são o olfato e o paladar (Bohbot

et al. 2010, Naters & Carlson 2006, Prasad & Daniel 1988, Vilela & Della-Lucia 2001).

Devido à sua importância em agricultura e saúde pública os insetos são intensamente

estudados em Ecologia Química e um grande número de compostos atrativos é

conhecido atualmente para esses organismos (Naters & Carlson 2006) (FIG. 4).

Tanto adultos quanto formas imaturas de mosquitos respondem a uma grande

variedade de estímulos de natureza química. O conhecimento desses compostos é de

30

extrema importância para entender melhor a biologia, a ecologia e o comportamento dos

mosquitos (Bohbot et al. 2010, Mulla 1979).

O estímulo químico nos insetos é percebido por células receptoras

(quimioreceptores) localizadas em sensilas olfativas. Estas sensilas são responsáveis

pela conversão dos estímulos químicos (odores) em potenciais elétricos, originando uma

resposta motora (Bohbot et al. 2010). As sensilas estão presentes principalmente nas

antenas, podendo ocorrer em mandíbulas, palpos, tarsos e outros apêndices, inclusive

em ovipositor. Elas podem ser generalistas, quando respondem a uma grande variedade

de odores, normalmente voláteis de plantas, ou especialistas quando respondem a uma

ou poucas substâncias, normalmente feromônios (Sutcliffe 1994).

A seletividade e a sensibilidade da antena a um determinado odor estão

diretamente relacionadas à concentração do estímulo químico, ao tamanho e a forma da

antena, assim como ao número, tipo e localização das sensilas olfativas presentes em

determinada espécie (Birch & Haynes 1982).

De acordo com Mclver (1982) na antena de A. aegypti ocorrem cinco tipos de

sensilas tais como: pequenas celônicas, largas celônicas, ampuláceas, tricóideas e

basicônicas. Baseando nas informações ultraestruturais e na contagem cuidadosa de

tipos de sensilas, Mclver (1982) calculou que 93% dos neurônios dos nervos flagelares

de A. aegypti carregam informações olfativas (odores).

31

Figura 4. O mundo químico dos insetos. As regiões vermelhas no corpo do inseto indicam

locais onde estão presentes as sensilas (Adaptado de Naters & Carlson 2006).

1.6 Feromônios sexuais em insetos

Os feromônios sexuais aumentam a probabilidade de sucesso no encontro de

parceiros para a cópula (Justum & Gordon 1989). O primeiro estudo que sugeriu a

presença de feromônio sexual na ordem Diptera foi realizado em Drosophila

(Sturtevandt 1915). Posteriormente, o bombykol, produzido por fêmeas da mariposa do

bicho-da-seda (Bombyx mori), foi o primeiro feromônio sexual demonstrado (Rogoff et

al.1964) e identificado em insetos (Carlson et al. 1971). A partir de tal descoberta,

houve um grande avanço no estudo e identificação de tais compostos em outras espécies

de insetos (Cardé & Minks 1997, Justum & Gordon 1989, Wicker-Thomas 2007).

Dentro da ordem Diptera foram identificados feromônios sexuais para membros

das subordens Nematocera e Brachycera – Cyclorrapha (Wicker-Thomas 2007). Dentre

os Nematocera já foram identificados feromônios para as famílias: (1) Cecidomyiidae,

32

(2) Sciaridae, ambas com uma série de feromônios produzidos pelas fêmeas e (3)

Psychodidae, com o feromônio 9-metilgermacreno-B e um terpeno produzidos pelos

machos (Wicker-Thomas 2007). Na subordem Brachycera – Cyclorrapha foram

identificados feromônios das famílias: (1) Tephritidae, produzidos por machos (exceto

em Batrocera oleae), (2) Agromyzidae e (3) Glossinidae, produzidos pelas fêmeas, (4)

Calliphoridae, produzidos pelos machos, (5) Faniidae, (6) Muscidae e (7)

Drosophilidae, produzidos tanto por machos quanto por fêmeas (Antony & Jallon 1982,

Blomquist et al. 1987, Carlson et al. 1971, Carriere & McNeil, 1990, Davis & Carlson

1989, Headrick & Goeden 1994, Mazomenos & Haniotakis 1981, Pomonis et al. 1993,

Wall 1989).

A existência de feromônios sexuais ainda não foi comprovada para nenhum

representante da família Culicidae (Wicker-Thomas 2007), entretanto, Cabrera & Jaffé

(2007) evidenciaram, em estudos comportamentais com A. aegypti, a existência de um

feromônio produzido pelas fêmeas que seria capaz de atrair machos e fêmeas da

espécie, além de um provável feromônio de agregação produzido pelos machos e que

também atuaria na atratividade de fêmeas.

1.7 Orientação dos insetos

A resposta dos insetos a determinado estímulo presente no ambiente é

caracterizada de acordo com o tipo de movimento, ou mesmo sua ausência, sua direção

e sentido e a natureza do estímulo (Matthews & Matthews 1988). Em geral, a resposta

dos insetos pode ser direcionada (taxia) ou não direcionada (quinese). No primeiro tipo

podem ocorrer respostas locomotoras orientadas em direção à fonte do estímulo

(positiva), caracterizando a atração, ou em direção contrária à fonte de estímulo

33

(negativa), nesse caso demonstrando o potencial de repelência de um composto

(Fraenkel & Gunn 1961). São tipos de taxia: (1) quimiotaxia, orientação frente a um

agente químico, (2) anemotaxia, orientação em resposta ao vento e (3) fototaxia,

resposta de acordo com a luz. Dentre os tipos de quineses podemos citar (1) a

ortoquinese, movimento randômico de um organismo em reposta a um estímulo e a (2)

clinoquinese, mudança aleatória na taxa ou freqüência de giro durante o vôo (Fraenkel

& Gunn 1961, Matthews & Matthews 1988).

1.8 Bioensaios comportamentais

A realização de bioensaios comportamentais é importante para o estudo da função

dos odores na comunicação química de insetos, pois permite qualificar e quantificar a

resposta motora do inseto estudado a determinado estímulo. Os bioensaios realizados

com aparelhos de olfatometria são de grande valor no estudo do comportamento de

insetos anemotáxicos (que utilizam o fluxo de ar para orientação), como o A. aegypti.

Nesses organismos o comportamento de busca da fonte do estímulo químico é realizado

por meio de uma pluma de odor que tem a função de guiar os insetos até a fonte

(Sant’Ana & Stein 2007).

Os olfatômetros são aparelhos construídos com material inerte para odor, como:

vidro, acrílico e alumínio, e possuem um ponto de liberação do estímulo e um ponto de

liberação do organismo a ser testado, cujo comportamento pode ser monitorado

diretamente por um observador, ou indiretamente, através de filmagem e análise de

vídeo. O modelo do olfatômetro pode variar baseado em características do organismo-

alvo e nas questões a serem avaliadas no estudo (Eiras & Mafra-Neto 2001). Um fluxo

de ar filtrado, umidificado e com velocidade controlada, passa pela fonte do estímulo

34

formando uma pluma retilínea em direção ao inseto e levando os compostos químicos

até eles (Sant’Ana & Stein 2007, Eiras & Mafra-Neto 2001). Nos bioensaios realizados

com olfatômetro devem ser consideradas tanto as variáveis endógenas (sexo, idade,

estado nutricional, fecundação, etc.) quanto as exógenas (temperatura, horário da

avaliação, luminosidade, umidade relativa, etc.) para que a confiabilidade dos resultados

obtidos não seja comprometida (Eiras & Mafra-Neto 2001).

2. JUSTIFICATIVA

Os machos de culicídeos, apesar de não realizarem repasto sangüíneo, ficam

próximos ao hospedeiro vertebrado possivelmente para encontrar fêmeas para a cópula

(Hartberg 1971, Jaenson 1985). Entretanto, a maioria das informações relacionadas a tal

comportamento é resultado de trabalhos realizados com fêmeas, existindo poucos

trabalhos específicos para machos (Hartberg 1971, Jaenson 1985, McIver et al. 1980,

Takken & Knols 2010) a despeito de sua importância e capacidade de alterar o

comportamento e a fisiologia das fêmeas, responsáveis pela transmissão dos agentes

etiológicos de diversas patologias (Klowden 1995, Polestrock et al. 2002). Além disso,

a significância dos machos infectados com o vírus da dengue na transmissão da doença

não pode ser subestimada, uma vez que a ocorrência de transmissão viral de machos

infectados com vírus da dengue para fêmeas durante a cópula é de grande importância

para a manutenção da circulação viral (Kow et al. 2001, Rosen 1987a, Rosen 1987b, Tu

et al.1998).

Trabalhos pioneiros relatam que machos são atraídos para cópula pelo som

produzido pelo batimento de asas de fêmeas co-específicas e que esse tipo de estímulo é

eficiente a curtas distâncias (McIver et al. 1980, Nijhout & Sheffield 1979, Roth 1948).

35

Desta maneira, a atratividade dos machos às fêmeas, realizada a longas distâncias, seria

dependente, provavelmente, do feromônio sexual. Sabe-se que fêmeas de A. aegypti

produzem uma substância não-volátil, provavelmente um feromônio de contato, que

permanece ativa até três semanas após a morte do inseto e que atuaria no

reconhecimento de fêmeas co-específicas (Clements 1963), entretanto, ainda não foi

descrito um feromônio que possa atuar a longas distâncias, exercendo o papel de

feromônio sexual.

Os hidrocarbonetos cuticulares podem exercer papel de feromônio sexual e/ou

de agregação em dípteros, incluindo espécies dos gêneros Aedes (Priestman & Horne

2002, Kruger & Pappas 1991, Kruger & Pappas 1993, Pappas et al. 1994), Anopheles

(Phillips et al. 1990, Millligan et al. 1986,), Culex (Chen et al. 1990), Culicoides (Linley

& Carlson 1983, Kremer et al. 1979), Culiseta (Lang 1977, Lang & Foster 1976),

Dermatobia (Gulias-Gomes et al. 2008), Glossina (Langley et al. 1981, Nelson &

Carlson 1986), Lutzomyia e Phlebotomus (Gebre-Maciel et al. 1994, Lane et al. 1985,

Mahamat & Hassanali 1998), Musca (Chaudhury et al. 1972), Simulium (Phillips et al.

1986, Millest 1992), Stomoxys (Meola et al. 1977) e Tabanus (Hoppe et al. 1990).

Polestrock et al. (2002) descreveram alterações nas proporções de alguns

hidrocarbonetos cuticulares de fêmeas de A. aegypti após a cópula (n-heptadecano, n-

pentacosano e n-hexacosano), apontando um potencial como compostos que interferem

na atratividade/reconhecimento das fêmeas. Ahmadi e McClelland (1985) verificaram o

aumento na atratividade das fêmeas de A. aegypti ao hospedeiro associado à presença de

fêmeas co-específicas em testes de olfatômeto. Posteriormente, Cabrera e Jaffé (2007)

descreveram a existência de um possível composto volátil, produzido por fêmeas de A.

aegypti e a existência de um feromônio de agregação produzido por machos que

aparentemente atua na atração de fêmeas e machos co-específicos.

36

A resposta de machos de A. aegypti a estímulos olfativos de localização de

hospedeiros e sua relação com o encontro de fêmeas para a cópula e a existência de

feromônios sexuais para a espécie são dois assuntos pouco estudados, apesar de sua

relevância para a biologia e o comportamento desse vetor. Portanto, o presente trabalho

teve o objetivo de avaliar as respostas olfativas de machos de A. aegypti ao odor de

diferentes hospedeiros vertebrados e a atratividade de machos e fêmeas aos seus

respectivos extratos, visando investigar a existência de feromônios sexuais e/ou de

agregação e sua identificação química. O conhecimento da capacidade reprodutiva do

mosquito, da existência de feromônios e da resposta de machos ao hospedeiro

vertebrado pode auxiliar em programas de controle do vetor, além de fornecer

informações sobre sua ecologia e a relação entre a captura de machos por armadilhas

iscadas e a presença de fêmeas no ambiente.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar a resposta olfativa de machos de A. aegypti ao odor de hospedeiros

vertebrados e de insetos co-específicos e investigar a existência de feromônios nessa

espécie.

3.2 Objetivos específicos

- Quantificar a resposta olfativa de machos virgens de A. aegypti de diferentes idades ao

odor humano (1-10 dias).

37

- Comparar a resposta olfativa de machos e fêmeas de A. aegypti, virgens ou não, ao

odor humano.

- Avaliar o comportamento de machos de A. aegypti frente ao odor de diferentes

hospedeiros vertebrados.

- Avaliar a resposta comportamental de machos de A. aegypti a cairomônios sintéticos.

- Verificar a presença de hidrocarbonetos cuticulares em machos e fêmeas de A. aegypti

através da técnica de Cromatografia à Gás (CG).

- Avaliar a resposta de machos e fêmeas de A. aegypti ao odor de insetos co-específicos

vivos.

- Avaliar a resposta de machos e fêmeas de A. aegypti a extratos hexânicos de insetos

co-específicos.

38

Capítulo I

Resposta de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) ao odor de hospedeiros

vertebrados em olfatômetro horizontal de dupla escolha

39

1. Introdução

Os estímulos químicos desempenham um importante papel no comportamento

dos mosquitos e são as substâncias de maior importância na comunicação desses

indivíduos (Takken & Knols 2010). Os cairomônios são utilizados por insetos

hematófagos no processo de localização do hospedeiro e podem ser muito (CO2,

acetona, etc.) ou pouco voláteis (ácido lático, ácidos graxos, etc.) (Takken & Knols

2010). A detecção dos cairomônios de seus hospedeiros preferenciais pelas fêmeas torna

a busca e o encontro da fonte alimentar mais eficiente (Reiter 2010).

Muitos cairomônios humanos já foram identificados e tiveram seu papel na

atratividade de fêmeas de A. aegypti demonstrado (Acree et al. 1968, Eiras & Jepson

1991, Geier & Boeckh 1999, Smith et al. 1970). Dentre eles podemos citar: (1) o CO2,

com eficiente papel no desencadeamento do comportamento de vôo de mosquitos

(Dekker et al. 2005, Eiras & Jepson 1991, Geier et al.1996), (2) o ácido lático, atrativo

apenas na presença de amônia, CO2 ou ácidos graxos, como o ácido capróico (Acree et

al. 1968, Eiras & Jepson 1991, Geier & Boeckh 1999, Smith et al. 1970), (3) a amônia

(Geier et al.1999) e (4) a acetona, atrativa quando associada ao ácido lático (Bernier et

al. 2003, Geier et al.1999). Alguns compostos como as aminas, os aminoácidos e os

alcoóis foram descritos como atraentes de mosquitos, entretanto os resultados dos

estudos referentes a tais compostos permanecem contraditórios (Geier & Boeckh 1999).

A armadilha BG-Sentinel® é específica para fêmeas de A. aegypti e Aedes

albopictus à procura de hospedeiro vertebrado para realização de repasto sanguíneo e

utiliza o atraente sintético de odor humano BG-Lure® como estímulo químico. Esse

atraente é composto por três cairomônios: ácido lático, ácido capróico e amônia,

utilizados pelas fêmeas para localização de hospedeiros (Eiras & Geier 2002, Geier &

40

Eiras 2003). Em testes de laboratório com liberação e recaptura de fêmeas de A. aegypti

a armadilha BG-Sentinel® capturou 90% dos insetos liberados em apenas 10 minutos

(Geier & Eiras 2003). Posteriormente, estudo realizado por Kröeckel et al. (2006) em

área urbana contendo muitos hospedeiros humanos comprovou que não há diferença

significativa entre a armadilha BG-Sentinel®

e a isca-humana no que diz respeito à

atração de fêmeas do mosquito. Apesar de específica para fêmeas, alguns trabalhos

relatam a coleta de grande quantidade de machos de culicídeos pela armadilha e

relacionam tal captura à provável busca de hospedeiro, apesar de não realizarem

alimentação sanguínea (Ázara 2009, Kröeckel et al. 2006, Maciel-de-Freitas 2006,

Paixão 2007).

Hartberg (1971) descreveu pela primeira vez o encontro de machos de A. aegypti

próximos a hospedeiros vertebrados. Posteriormente, estudos realizados para captura de

fêmeas de mosquitos utilizando hospedeiros vertebrados, em isca humana ou em

armadilhas iscadas, relataram a coleta de grande número de machos e demonstraram a

existência de algum tipo de resposta desses insetos aos hospedeiros vertebrados

utilizados pelas fêmeas como fonte de alimentação sanguínea (Jaenson 1985, McIver et

al. 1980, Takken & Knols 2010). Em estudo de captura de fêmeas com armadilhas de

sucção usando isca animal, McIver et al. (1980) verificaram a atração de machos de

Mansonia sp. aos hospedeiros vertebrados, mas não puderam afirmar se tal atração era

dependente de estímulos químicos. Jaenson (1985) observou grande captura de machos

de Aedes dianteus (57%) em armadilhas de sucção iscadas com diferentes hospedeiros

vertebrados, utilizadas com o propósito de capturar fêmeas. Apesar do estímulo sonoro

produzido pelo batimento das asas de fêmeas de A. aegypti ser considerado como o

responsável pela atração de machos (Roth 1948), a cópula em laboratório ocorre mais

freqüentemente na presença de um hospedeiro vertebrado, além disso, a presença desse

41

hospedeiro tornaria os machos mais ativos aumentando a formação de ―enxames‖

(Cabrera & Jaffé 2007).

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a resposta olfativa de adultos de A.

aegypti, virgens e copulados, a cairomônios de diferentes hospedeiros vertebrados.

2 Material e métodos


Os ovos que deram origem à colônia de A. aegypti do insetário do Laboratório

de Ecologia Química de Insetos Vetores (LabEQ) foram coletados no Campus

Pampulha da UFMG (Belo Horizonte - MG) com armadilhas de oviposição

(ovitrampas). Posteriormente, pools de larvas foram submetidos a testes (RT-PCR) no

Laboratório de Virologia (Departamento de Microbiologia – ICB/UFMG) para verificar

a presença de vírus da dengue. O insetário foi mantido a 27,0 2 ºC, 70,0 10% de

umidade relativa e 12L:12E de fotoperíodo.

Os ovos foram colocados em cubas plásticas, com aproximadamente cinco cm

de profundidade, contendo água desclorada e ração de réptil (Reptolife®) para a eclosão

e desenvolvimento das larvas até atingirem o estádio de pupa. Para a manutenção da

colônia as pupas foram separadas diariamente e colocadas em potes plásticos, os quais

foram colocados em gaiolas de tela fina (30x30x30cm, Bug-Dorm®) para emergência

dos adultos, que foram aí mantidos e alimentados com solução açucarada (10%). Para a

manutenção da colônia, as fêmeas receberam repasto sanguíneo em alimentador

artificial adaptado de Ahmed (1999 apud Roque 2002), duas vezes por semana. Cones

42

de papel de filtro foram colocados dentro das gaiolas para serem utilizados como

substrato de oviposição (Eiras & Jepson 1991).

Os insetos utilizados nos experimentos foram separados por sexo ainda no

estágio de pupa para garantir que todos fossem virgens. As pupas foram separadas de

acordo com seu tamanho utilizando um separador de formas imaturas (FIG. 5). Em

geral, pupas menores são de machos, enquanto as maiores são de fêmeas (Cônsoli &

Lourenço-de-Oliveira 1994). Após a separação, os recipientes com pupas foram

colocados em diferentes gaiolas teladas (30x30x30cm, Bug-Dorm®) e, para controle da

idade, esses recipientes foram trocados de gaiola diariamente. Para evitar o contato dos

insetos com o odor do sexo oposto as gaiolas eram mantidas em salas separadas e

verificadas diariamente para que, caso houvesse algum inseto do sexo oposto na gaiola,

esse fosse descartado. Como não existem na literatura relatos sobre a mudança de

comportamento de insetos mantidos em laboratório por longos períodos, optou-se por

utilizar adultos de A. aegypti das gerações F70 a F90, colônia é mantida no insetário do

LabEQ por cinco anos.

Para os testes com insetos copulados era mantida uma gaiola de criação

(30x30x30cm, Bug-Dorm®) contendo machos e fêmeas de A. aegypti, os quais eram

utilizados a partir do terceiro dia após a emergência do adulto. Devido à presença de

ambos os sexos nas mesmas gaiolas e a idade cronológica dos mosquitos pressupõe-se

que os mesmos eram copulados. Portanto, será usado o termo de insetos copulados nesta

situação. Não foi confirmado se as fêmeas estavam copuladas devido ao grande número

de insetos utilizados nos testes comportamentais.

43

Figura 5. Separador de formas imaturas. (1) Larvas, (2) Pupas de machos (menores), (3) Pupas

de fêmeas (maiores) (Fotos: Capurro 2006).

2.2 Bioensaios em olfatômetro horizontal de dupla escolha

Foram realizados 15 bioensaios por estímulo avaliado de acordo com Geier et al.

(1996), utilizando aproximadamente 10 insetos/ teste, com o objetivo de quantificar a

resposta olfativa dos insetos frente à fonte de estímulo. A quantificação da resposta foi

medida pelo número de insetos testados que responderam ao estímulo (Geier et al.

1996).

Olfatômetro horizontal de dupla escolha: consiste de uma arena experimental

em acrílico transparente composta por um tubo principal (90 cm de comprimento x 12

cm de diâmetro) e dois tubos de escolha (36,5 cm de comprimento e 12 cm de

diâmetro), conectados em laterais opostas de uma caixa de escolha (FIG.6). O fluxo de

ar que passava pelo olfatômetro, velocidade de 0,32 m/s, foi gerado por um exaustor

(Qualitas ®, CQ1T4 SC - Motor WEG, potência: 0,5 HP) e em seguida era filtrado em

um filtro de carvão ativado e aquecido/ umidificado em um banho-maria adaptado

(Mota 2003).

1

32

44

Antes do início de cada teste, os insetos permaneceram nas gaiolas de liberação

por um período de 15 minutos para a sua aclimatização, recebendo apenas o ar

purificado. O estímulo foi apresentado no olfatômetro cinco segundos antes do início

dos testes por meio de um fluxo de ar em sentido horizontal. Após esse período, o

compartimento da gaiola de liberação foi aberto permitindo que os mosquitos voassem

contra o vento e dentro da pluma de odor para a caixa de escolha. Os primeiros testes

realizados com machos tiveram a duração de três minutos, os demais tiveram a duração

de um minuto. A resposta obtida foi avaliada pela diferença entre o número de insetos

encontrados nos diferentes compartimentos em um determinado período de tempo (FIG.

5) (Geier et al. 1996, 1999, Mota 2003).

O comportamento exibido foi interpretado de acordo com a localização dos

mosquitos no interior da arena logo após o encerramento do teste. Foram considerados:

(1) inativos: os mosquitos que não deixaram a gaiola de liberação; (2) ativados: aqueles

insetos que permaneceram no tubo principal, na caixa de escolha e nos tubos de escolha;

(3) atraídos: os insetos que permaneceram no interior de um tubo de escolha (Mota

2003) e (4) ativos: todos os insetos que deixaram a gaiola de liberação voando contra o

fluxo de ar no interior da arena, ou seja, aqueles insetos que apresentaram “atividade de

vôo” durante os experimentos. Nesse caso, os percentuais de insetos ativados e insetos

atraídos foram somados ao final dos experimentos (Geier e Boeckh 1999, Mota 2003)

(FIG. 7).

45

Figura 6. Olfatômetro horizontal de dupla escolha. 1. A. Gaiola de liberação; B. Tubo

principal; C. Caixa de escolha; D. Tubo de escolha; E. Tubo de liberação de estímulos. 2. a.

Exaustor; b. Filtro de carvão ativado; c. Banho-Maria (Fotos: Mota, 2003).

Figura 7. Representação da interpretação dos resultados ao final dos experimentos de acordo

com a localização dos insetos. A. Insetos inativos; B+C+D. Insetos ativados; E. Insetos atraídos.

B+C+D+E: Insetos ativos (insetos que deixaram a gaiola de liberação); F. Local de liberação do

estímulo. A seta indica o sentido do fluxo de ar (Foto: Leme 2010).

2.3 Experimento 1. Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste

As fêmeas de A. aegypti utilizadas nos testes de olfatometria são capturadas com

o uso de um aparato que utiliza o comportamento das fêmeas de procura por hospedeiro

para realização de repasto sanguíneo como princípio básico. Um sistema de exaustão

1 2 c

a

C

B

A

b D

D E E

46

permite que o odor de uma mão humana, posicionada no recipiente para captura dos

insetos, seja levado até os insetos condicionados em uma gaiola de criação

(30x30x30cm, Bugdorm) no interior da ―gaiola de seleção‖ (50x50x50cm). Assim, as

fêmeas à procura de alimentação sanguínea, voam ativamente para dentro do recipiente

para captura (Posey & Schrek 1981) (FIG. 8).

Figura 8. Esquema da gaiola de seleção de insetos. A. Exaustor para produção do fluxo de ar,

B. ―Gaiola de seleção‖, C. Gaiola de criação contendo os insetos, D. Recipiente para captura dos

insetos. A seta indica o sentido do fluxo de ar.

A captura de machos utilizando a ―Gaiola de seleção‖ não é eficiente. Desta

maneira, fazia-se necessário buscar uma metodologia que fosse eficaz para capturar os

insetos e que não os danificassem, principalmente nas antenas, pois isso poderia

prejudicar as respostas.

Foram realizados testes no olfatômetro utilizando 10 fêmeas de A. aegypti com

idade entre cinco e 10 dias e em condições fisiológicas para a busca por hospedeiro

vertebrado e a realização de alimentação sanguínea. As fêmeas foram mantidas em

jejum, sem alimentação açucarada e água, por 24h antes do experimento e foram

separadas utilizando duas metodologias: (1) ―Capturador manual de Castro‖ (Buxton

1928) e (2) ―Gaiola de seleção‖ (FIG. 9). Foram realizadas 15 repetições utilizando

A

B

C

D

47

como estímulo o odor humano pela inserção dos dedos da mão diretamente no

olfatômetro, o controle foi apenas com ar.

Figura 9. Metodologias de seleção de insetos para teste em olfatômetro. A. Seleção de insetos

com o Capturador manual de Castro, B. ―Gaiola de seleção‖, C. Seleção de insetos com a

―Gaiola de seleção‖ (Fotos: Leme 2010, Paixão 2010).

Trinta insetos de ambos os sexos foram separados pelas duas metodologias,

anestesiados em freezer (-20ºC) e, posteriormente observados em um

estereomicroscópio para verificar se a morfologia externa foi alterada, (ex: perda de

antena, pata e asas).



Os testes foram realizados com a liberação de grupos de aproximadamente 10

machos virgens de mesma idade a cada bioensaio (idade entre um a 10 dias). Um

voluntário (sexo feminino, 28 anos, não fumante) inseria os dedos da mão no tubo de

liberação do estímulo, enquanto o tubo controle estava vazio, contendo apenas o ar

purificado. A posição dos estímulos foi invertida a cada repetição para evitar tendência

A B C

48

de respostas (Mota 2003). Foram realizadas 15 repetições, cada uma com três minutos

de duração.



Os bioensaios foram realizados com machos e fêmeas, virgens e copulados, com

idade entre três e 10 dias, coletados com um capturador manual de Castro. Foram

utilizadas fêmeas sem repasto sangüíneo e em jejum por 24 horas. A escolha da idade

dos machos utilizados foi baseada nos resultados do experimento 2.

O odor de cinco voluntários do sexo feminino e cinco do sexo masculino foi

avaliado em olfatômetro horizontal de dupla escolha a partir da inserção dos dedos da

mão direita do voluntário diretamente no tubo de liberação do estímulo (Geier &

Boeckh 1999, Geier et al. 1999). Entre os voluntários não havia nenhum fumante e suas

idades eram as seguintes: (1) Mulheres: KP 28, LH 23, LL 25, RC 19 e TR 19 anos

(média de idade 22,8 anos), (2) Homens: BP 19, CL 20, CG 19, GO 20, IC 18 anos

(média de idade 19,2 anos). Quinze minutos antes do início dos testes os voluntários

lavavam as mãos com detergente neutro e água de torneira e houve o cuidado de evitar

qualquer contato com produtos cosméticos ou perfumes antes dos testes (Geier e

Boeckh 1999, Geier et al. 1999).

49

2.6 Experimento 4: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de


Foi avaliada a resposta de machos virgens de A. aegypti ao odor de diferentes

hospedeiros vertebrados: codorna (Coturnix coturnix) e camundongo (Mus musculus),

comparando-os ao odor humano, e a alguns compostos utilizados na localização de

hospedeiros ( ácido lático e o atraente sintético de odor humano: BG-Lure®

) (QUADRO

1). Foram utilizados aproximadamente 10 machos virgens com idade entre três e 10 dias

por bioensaio.

Quadro 1. Forma de apresentação dos estímulos avaliados em olfatômetro para machos de

Aedes aegypti.

Obtenção de odor dos hospedeiros: foi realizada através de um sistema de lavagem de

gás (FIG. 10) que permitia que um fluxo de ar passasse pelo corpo do hospedeiro

vertebrado. Um compressor (1/5Hp Piston Mini Air Compressor for Airbrush/ TC-20B)

gerava um fluxo de ar, que era purificado em um filtro de carvão ativado, e depois

direcionado para dentro de um recipiente plástico devidamente vedado contendo o

animal (camundongo Mus musculus e codorna Coturnix coturnix). Mangueiras de

Estímulo Apresentação do estímulo

Odor de camundongo Aeração

Odor de codorna Aeração

Odor humano Inserção dos dedos da mão

BG-Lure®

Papel de filtro

Ácido lático 50 µL (85%) em papel de filtro

50

polietileno de mesmo tamanho (90 cm) foram utilizadas para interligar todos os

componentes do sistema. Ao sair do recipiente, o fluxo de ar estava carregado com

estímulos olfativos dos hospedeiros, os quais foram apresentados no olfatômetro por

orifícios para o encaixe de mangueiras (FIG. 11). O controle dos testes com

camundongo e codorna foi realizado com um fluxo de ar proveniente do sistema de

aeração que passava por um recipiente plástico nas mesmas condições daquele que

continha o animal, porém vazio (FIG. 11). A apresentação do odor humano ocorreu

como no experimento 2 e, neste caso, o controle foi realizado apenas com o ar do

olfatômetro.

Figura 10. Sistema de obtenção de odor de hospedeiro. A. A seta aponta para o filtro de carvão

ativado. B. Recipiente onde era mantido o animal.

Figura 11. Inserção do odor dos hospedeiros no olfatômetro. A. Mangueiras de polietileno

provenientes do sistema de aeração. B. Papel de filtro preso em clip metálico (Durante os testes

a abertura para inserção do estímulo era mantida fechada) (Fotos: Leme 2010).

A

A B

B

51

A. Apresentação de cairomônios liberados pelos hospedeiros

BG-Lure®: o odor do atraente sintético BG-Lure

® foi transferido para um papel

de filtro limpo (1cm2, J. Prolab

® 40) esfregando-o por cinco minutos, no atraente,

segundo a metodologia de Schreck et al. (1990). Posteriormente, o papel de filtro foi

fixado no tubo de apresentação do estímulo do olfatômetro com um clip metálico (FIG.

11B). O controle foi realizado apenas com papel de filtro limpo.

Ácido lático: Os testes com ácido lático (85% de pureza e forma L, Synth®,

Alemanha) foram realizados com 50µL de uma solução do composto diluído em

metanol (85%) em papel de filtro. O controle foi realizado com 50µL de metanol em

papel de filtro (Geier & Boechk 1999).

2.7 Análise estatística

O número dos insetos que responderam aos estímulos avaliados foi convertido

em percentagem e, posteriormente, foram calculados os percentuais médios (± e.p.). Os

dados sofreram transformação do tipo arco-seno (transformação angular) (Sokal &

Rolhlf 1981) e foram analisados quanto à normalidade usando o teste Lilliefors. Quando

os dados eram normais foram utilizados: teste t para comparar os valores de atratividade

entre o estímulo testado e o controle, e ANOVA, seguido pelo teste de Tukey, para

comparação entre diferentes tratamentos. Os testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis

foram utilizados para dados não-paramétricos avaliando a resposta dentro de um mesmo

tratamento e entre diferentes tratamentos, respectivamente. A correlação de Spearman

foi utilizada para avaliar a correlação entre idade e resposta dos machos e entre o

número de insetos nos extratos e a resposta dos mosquitos avaliados nos testes em

olfatômetro. As análise foram realizadas utilizando o programa estatístico BioEstat 5.0

(Ayres et al. 2005).

52

3 Resultados

3.1 Experimento 1: Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste

As fêmeas foram atraídas pelo odor humano no olfatômetro nos dois testes

realizados (FIG. 12) (p<0,05, teste t). O percentual de mosquitos ativos (atividade de

vôo durante os experimentos) foi superior a 70% nos dois casos (FIG. 12). Esses

resultados demonstraram que a resposta dos mosquitos selecionados pelas duas

metodologias foi semelhante (p>0,05, ANOVA).

Figura 12. Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti ao odor humano separadas

com ―Gaiola de seleção‖ e ―Capturador manual de Castro‖ (% ± e.p.) (p>0,05 ANOVA). Letras

diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05 Teste t, n=15).

A partir da análise da morfologia externa dos mosquitos após a captura

observou-se que a integridade física da maioria dos insetos foi mantida com o uso do

capturador manual de Castro (TAB. 2). Um total de cinco insetos capturados com a

gaiola de seleção (uma fêmea e quatro machos) estava com as pernas danificadas.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Gaiola de seleção Capturador manual

Res

post

a (

%)

Mão Controle Mosquitos ativos

a

b

a

b

53

Tabela 2. Quantidade de Aedes aegypti danificados após captura com capturador manual de

Castro e gaiola de seleção (n=30).

Capturador manual de

Castro

Gaiola de Seleção

♀(n=30) ♂(n=30) ♀(n=30) ♂(n=30)

Asas

0 0 0 0

Antenas

0 1 1 0

Pernas

1 0 0 4

Total 1 1 1 4

Foi possível verificar que não houve diferença entre as respostas das fêmeas

separadas pelas duas metodologias e que o ―Capturador manual de Castro‖ se mostrou

tão eficiente quanto a ―Gaiola de seleção‖, no que diz respeito à integridade física dos

insetos e resposta em olfatômetro. Portanto, os testes seguintes foram realizados

utilizando insetos capturados com o capturador manual de Castro.



O percentual de machos inativos com um dia de vida foi 54% e, a partir do

segundo dia de idade até o terceiro, observou-se o aumento do percentual de insetos

ativos (68,4% e 87%, respectivamente) (FIG. 13). Observou-se que os insetos ativos

demonstraram uma resposta dependente da idade dos insetos com até três dias

(coeficiente de Spearman = 1,0, p<0,0001), porém para as demais idades não foi

observada diferença significativa (coeficiente de Spearman = -0,14, p>0,05).

Machos de A. aegypti não foram atraídos para o odor humano, pois observou-se

uma resposta maior para o controle por mosquitos de cinco a 10 dias de idade (p<0,05

Mann-Whitney). Entretanto, a maior parte dos machos com idade superior a dois dias

54

permaneceu ativa, ou seja, sobrevoando o tubo principal, a caixa de escolha e os tubos

de escolha (>60%) (FIG. 13). Observou-se que os mosquitos atraídos responderam nos

primeiros segundos após o início do experimento, saindo da gaiola de liberação e

voando em direção aos tubos de escolha. Por esse motivo, os experimentos seguintes

tiveram apenas um minuto de duração.

Figura 13. Percentual médio de respostas de machos virgens de Aedes aegypti de diferentes

idades ao odor humano em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=15) (Spearman =1,0,

p<0,01).



As respostas de machos e fêmeas de A. aegypti, virgens e copulados, nos testes

com voluntários humanos variaram de acordo com o sexo do voluntário e com o

hospedeiro avaliado (TAB. 3). Os voluntários do sexo masculino foram mais atrativos

que os voluntários do sexo feminino (p<0,05; Kruskal-Wallis) e, dentro do mesmo sexo,

foram encontrados voluntários mais atrativos que outros, caracterizando a variação na

atratividade individual (p<0,05; Kruskall-Wallis) (TAB. 3).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Resp

osta

(%

)

Idade

Mão Controle Mosquitos ativos

55

Os resultados obtidos nos testes com machos copulados mostrou atratividade

desses insetos ao odor de voluntários do sexo masculino (p<0,0001 Mann-Whitney) e

feminino (p<0,05 Teste t) (FIG. 14). Entretanto, foi observado que machos virgens,

apesar de não serem atraídos pelo odor humano, apresentaram um comportamento de

vôo (percentual de mosquitos ativos) maior que dos machos copulados (FIG. 14).

Figura 14. Percentual médio (± e.p.) de resposta de machos de Aedes aegypti, virgens e

copulados, ao odor de homens e mulheres em olfatômetro horizontal de dupla escolha. Letras

diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05 Kruskal-Wallis) (n=15).

Nos testes com fêmeas, tanto os insetos virgens quanto os copulados, foram

atraídos pelo odor de voluntários de ambos os sexos (p<0,05 - teste t), porém, a

atratividade das fêmeas virgens para o odor de mulheres foi inferior a 50%. Mais de

60% dos insetos testados foram ativos, ou seja, apresentaram atividade de vôo, frente ao

odor dos voluntários (FIG. 15).

56

Tabela 3. Percentual médio de resposta (±e.p.) de adultos de Aedes aegypti ao odor de diferentes hospedeiros humanos. ● Voluntários do sexo feminino. °

Voluntários do sexo masculino. * Significativamente atrativo comparado com o controle (t-test ou Mann-Whitney, p<0.05).

Fêmeas Machos

Virgem Copulado Virgem Copulado

Voluntários Mão Controle Mão Controle Mão Controle Mão Controle

1● 9,7±2,8 16,0±2,9 (p>0,05) 57,3±4,9 13,2±3,0 (p<0,05) 28,7±4,1 31,0±4,2 (p>0,05) 23,0±2,7 26,8±2,9 (p>0,05)

2● 18,2±6,9 13,3±3,9 (p>0,05) 53,3±3,5 9,2±1,9 (p<0,05) 11,8±2,9 26,4±3,45 (p>0,05) 7,7±5,3 2,7±4,0 (p>0,05)

3● 31,3±6,1 22,2±2,3 (p<0,05) 71,3±3,7 1,8±0,9 (p<0,01) 18,6±3,9 25,2±3,65 (p>0,05) 14,7±3,4 11,9±3,6 (p>0,05)

4● 58,0±5,5 6,0±4,7 (p<0,01) 67,3±5,5 4,2±1,7 (p<0,01) 15,9±3,8 20,0±4,0 (p>0,05) 18,2±4,3 4,1±3,9 (p<0,05)

5● 36,8±2,1 19,0±4,1 (p<0,05) 58,7±6,2 9,9±3,8 (p<0,05) 22,0±1,4 29,9±1,7 (p>0,05) 29,4±3,0 15,0±2,8 (p<0,05)

6° 54,5±9,2 14,0±3,9 (p<0,05) 73,4±2,6 9,1±3,5 (p<0,01) 19,0±3,4 20,0±3,4 (p>0,05) 31,2±4,2 18,2±3,1 (p<0,05)

7° 73,4±4,2 5,6±2,3 (p<0,01) 74,3±3,7 6,4±1,8 (p<0,01) 30,3±4,5 25,4±5,4 (p>0,05) 33,0±5,8 18,0±3,9 (p<0,05)

8° 60,2±6,9 5,2±1,7 (p<0,01) 90,5±2,2 1,5±0,8 (p<0,01) 22,6±2,9 24,2±4,8 (p>0,05) 13,3±3,4 4,3±1,7 (p<0,05)

9° 66,0±6,3 11,0±3,1 (p<0,01) 72,5±3,3 1,8±0,9 (p<0,01) 18,9±4,4 24,0±2,7 (p>0,05) 32,3±5,5 16,4±3,44 (p<0,05)

10°

71,0±6,0

7,4±2,8 (p<0,01)

67,4±4,5

11,2±3,9 (p<0,05)

24,5±4,3

21,0±4,9 (p>0,05)

26,4±4,4

12,4±3,02 (p<0,05)

57

Figura 15. Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti, virgens e copuladas, ao

odor de homens e mulheres (Porcentagem média ± e.p.) (n=15). Letras diferentes indicam

diferença estatística significativa (p<0,05 teste t) (n=15).

3.4 Experimento 4: Resposta de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de


O camundongo e a codorna não foram atrativos para machos de A. aegypti,

porém, foram importantes para o desencadeamento do comportamento de vôo dos

insetos (>60%) (TAB. 4). Nos testes em que houve competição entre odor animal e odor

humano, houve diferença entre mão humana e codorna, sendo a mão mais atrativa que a

codorna (p<0,05 ANOVA) (TAB. 4).

Nos testes com cairomônios sintéticos, foi observada atratividade apenas para o

atraente sintético BG-Lure® (p<0,05 – Mann-Whitney), porém a resposta foi inferior a

40%. Assim como nos demais testes empregando odor de hospedeiro vertebrado, o

estímulo desencadeou a atividade de vôo da maioria dos machos avaliados (>80%)

(TAB. 4).

58

Tabela 4. Percentual médio de resposta de machos de Aedes aegypti em olfatômetro horizontal

de dupla escolha a diferentes hospedeiros vertebrados e a compostos de localização de

hospedeiros. a Tubo de apresentação do estímulo no olfatômetro. * Diferença significativa entre

os estímulos (p<0,05, Mann-Whitney) (n=15). b Os valores apresentados em ―Mosquitos ativos‖

se referem à soma dos percentuais médios de mosquitos ativados, mosquitos no Tubo A e

mosquitos no Tubo B.

Experimento Tubo A

a

Tubo B

a

Mosquitos

ativosb

Estímulo

%

(e.p.)

Estímulo % (e.p.)

% (e.p.)

1

Ar 10,7 (8,2)

Ar 13,0 (9,9)

58,7 (15,0)

2

Mão 28,7 (16,2)

Ar 31,0 (17,0)

76,7 (19,0)

3

Camundongo

15,0 (9,2)

Ar 23,0 (10,8)

61,0 (12,5)

4

Codorna

37,0 (15,2)

Ar 53,0 (14,9)

94,0 (5,6)

5

Codorna

39,0 (12,2)

Camundongo 51,0 (10,2)

95,0 (4,2)

6

Codorna *

28,0 (10,2)

Mão * 48,0 (7,8)

93,0 (6,4)

7

Camundongo

25,0 (13,7)

Mão 33,0 (10,2)

72,0 (12,7)

8

BG-Lure®

*

33,7 (13,6)

Papel de *

filtro limpo 27,7 (11,7)

82,6 (13,7)

9

Ác. Lático

12,5 (9,7)

Solvente

(metanol) 10,4 (10,2)

73,4 (23,0)

59

4 Discussão

O funcionamento da ―Gaiola de seleção‖ é baseado na resposta dos insetos ao odor

humano, pois eles devem ser atraídos pela mão até o recipiente que os acondicionará

(Posey & Schrek 1981), assim os machos não são capturados de maneira eficiente. Os

estímulos químicos são detectados por células receptoras presentes nas sensilas

olfativas, as quais estão localizadas nas mandíbulas, palpos, tarsos e, principalmente,

nas antenas (Lews 1984, Matthews & Matthews 1988). Assim, a integridade física dos

insetos é importante para a detecção de tais estímulos, bem como por seu

comportamento (Clements 1999, Sant’Ana & Stein 2007). Por esse motivo, a escolha da

metodologia de seleção é tão importante, pois poderia comprometer os resultados caso

danificasse os insetos. Os resultados apresentados demonstraram que a coleta de insetos

com o ―Capturador manual de Castro‖ não influenciou na resposta dos mesmos.

Portanto, este método foi usado para coletar os mosquitos utilizados nos demais

experimentos.

O comportamento dos machos de permanecerem próximos ao hospedeiro vertebrado

é algo bastante curioso devido ao fato dos machos não necessitarem de alimentação

sanguínea (Hartberg 1971). Muitos autores já observaram tal fenômeno e sugerem que

ele é devido à necessidade desses insetos de encontrarem fêmeas para a cópula

(Clements 1999, Hartberg 1971, Jaenson 1985, McIver et al. 1980, Takken & Knols

2010). O fato de machos com idade inferior a dois dias serem inativos frente ao odor

humano aponta para a necessidade de desenvolvimento das sensilas olfativas

responsáveis pela detecção dos voláteis do hospedeiro (Clements 1999, Davis 1984),

como ocorre com as fêmeas do mosquito (Davis 1984). Entretanto, esse comportamento

também pode indicar a importância da localização dos cairomônios de hospedeiros

vertebrados por machos de mosquitos para auxiliar no encontro de fêmeas para a

60

cópula. As respostas obtidas nos insetos com idade superior a dois dias demonstraram

que, apesar da atratividade dos machos ter sido inferior a 40%, o odor humano foi um

estímulo importante para o desencadeamento do comportamento de vôo dos machos e,

provavelmente possui um papel determinante na formação de enxames por esses insetos

(Cabrera & Jaffé 2007). Além disso, poucos segundos após o início dos testes

comportamentais em olfatômetro, já foram observadas respostas como início do vôo e

atratividade ao odor humano, como acontece para fêmeas (Geier & Boeckh 1999).

A diferença de atratividade entre voluntários dos sexos maculino e feminino

observada durante esse estudo corrobora com o encontrado na literatura para fêmeas de

A. aegypti (Geier et al 1996) e outros insetos hematófagos, sendo o sexo masculino mais

atrativo que o sexo feminino, provavelmente, devido às diferenças hormonais entre

homens e mulheres (Brady 1997, Brouwer 1960, Lindsay et al. 1993, Schofield &

Sutcliffe 1996, Schreck et al. 1990). Da mesma maneira, a diferença de atratividade

apresentada por voluntários de um mesmo sexo demonstraram uma variação individual

na atratividade que é devida às diferentes concentrações dos cairomônios utilizados

pelos insetos para localização do hospedeiro (ácido lático, amônia, etc) e à combinação

de tais compostos (Chapman 1988, Dekker et al. 2005, Eiras & Jepson 1994, Geier et al.

1996, Geier et al. 1999, Geier & Boeckh 1999, Smallegange et al. 2005, Steib et al.

2001).

Fêmeas de A. aegypti podem realizar o repasto sanguíneo mesmo antes de copular,

entretanto, sabe-se que a cópula é um estímulo de grande importância para o início da

atividade hematofágica (Clements 1999, Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira 1994,

Forattini 2002), por esse motivo, a atratividade de fêmeas que já copularam foi superior

a resposta das fêmeas virgens. A diferença de resposta entre machos virgens e

copulados demonstra uma relação entre a busca por hospedeiro e a realização de cópula

61

uma vez que machos virgens, apesar de não responderem ao odor humano,

apresentaram atividade de vôo elevada, provavelmente formando um enxame, ao

contrário do que foi observado para os machos que já haviam copulado (Ferguson et al.

2005, Klowden 1995, Nijhout & Sheffield 1979). Entretanto, nos testes com o atraente

sintético BG-Lure®, os machos virgens não apenas apresentaram atividade de vôo

elevada como foram atraídos pelo estímulo avaliado, o que explicaria a captura de

machos em armadilhas iscadas com tal atraente (Kröeckel et al. 2006, Maciel-de-Freitas

2006, Paixão 2007, Ázara 2009). Cabrera & Jaffé (2007) descreveram o aumento do

comportamento de enxame de machos virgens de A. aegypti na presença de um

hospedeiro vertebrado, mostrando a importância do hospedeiro para o vôo desses

insetos. Como os machos não realizam atividade hematofágica, sua resposta frente ao

odor do hospedeiro, provavelmente, é diferente da resposta apresentada pelas fêmeas.

Nos testes de competição entre odores de diferentes hospedeiros vertebrados

(codorna e camundongo) e odor humano foi possível observar maior resposta dos

machos frente ao odor humano, caracterizando o comportamento antropofílico já

descrito para fêmeas do inseto (Dekker et al. 2005, Forattini 2002, Mukwaya 1976). Ao

testar a preferência dos machos de A. aegypti para camundongo ou codorna, foi

observado que o camundongo foi mais atrativo, entretanto a atividade de vôo dos

insetos foi maior nos testes com codorna. Tanto a amônia quanto a uréia, podem atuar

sinergisticamente com os demais cairomônios do hospedeiro. Assim, como o

camundongo urinou durante os testes, a presença de amônia e uréia pode ter aumentado

a atividade de vôo dos mosquitos (Braks et al. 2001, Geier et al.1999). É possível que a

liberação de CO2 pelos animais testados, associada aos demais cairomônios, tenha

influenciado as respostas obtidas, pois esse é um cairômonio bastante utilizado pelas

fêmeas de A. aegypti para localização do hospedeiro (Takken & Knols 2010). A

62

quantidade de CO2 liberada depende do metabolismo e da atividade do animal, assim, a

diferença de tamanho entre os hospedeiros indica que a quantidade de CO2 liberada pela

codorna seja maior que a liberada pelo camundongo, o que sugere que a presença desse

composto exerça um papel de menor importância na atratividade dos mosquitos

machos. Kröckel et al. (2006) observaram em estudo realizado com armadilhas BG -

Sentinel®

contendo atraente sintético de odor humano (BG - Lure®) que a presença de

CO2 nas armadilhas não influenciava a quantidade de machos capturados, indicando que

tal composto não é um fator crucial para atração de machos. Desta maneira, outros

fatores podem estar relacionados à atratividade desses insetos para os hospedeiros

vertebrados.

O estudo do comportamento dos machos de A. aegypti frente a hospedeiros

vertebrados vem sendo negligenciado devido ao seu pequeno papel na transmissão de

patógenos, sendo este o primeiro trabalho realizado com o objetivo de avaliar as

respostas olfativas desses mosquitos à cairomônios de hospedeiros vertebrados.

Entretanto, a importância de tais insetos na manutenção da circulação de viral na

natureza, não deve ser esquecida, pois as formas de transmissão vertical e venérea são

uma realidade (Kow et al. 2001, Tu et al. 1998). O presente estudo esclarece

características importantes do comportamento dos machos para localização de

hospedeiros vertebrados e aponta para a necessidade de mais estudos sobre o tema.

63

Capítulo II

Padronização da extração e identificação química dos compostos presentes na

cutícula de adultos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762)

64

1 Introdução

Os hidrocarbonetos cuticulares (HCs) presentes nos insetos são importantes por

conferirem permeabilidade, protegendo contra a dessecação e a penetração de

microrganismos e produtos químicos (Blomquist & Jackson 1979). Sintetizados pelos

próprios insetos, sua composição química é uma expressão do genótipo desses

organismos, ocorrendo, por esse motivo, uma grande variação em sua produção (Havert

et al. 1991, Phillips et al. 1988). Tal variação permitiu que a identificação dos HCs fosse

utilizada como importante característica taxonômica em insetos (Havert et al. 1991,

Kremer et al. 1979, Lang 1977, Langley et al. 1981, Linley & Carlson 1983, Meola et

al. 1977, Milligan et al. 1986, 1988, Phillips et al. 1988, Steiner et al. 2007) uma vez

que seu estudo permite a determinação de diferenças espécie-específicas (Phillips et al.

1988), caracterizada pela presença de determinado composto, bem como sua

quantidade, podendo variar de acordo com a espécie, idade, localização geográfica ou

mesmo sexo (Lockey 1991).

Além da importância taxonômica, os HCs também exercem um papel relevante na

comunicação química dos insetos, podendo atuar como feromônios sexuais e/ ou de

agregação, feromônios de alarme, cairomônios, secreções de defesa, reconhecimento de

castas e marcadores territoriais (Gulias-Gomes et al. 2008, Batista-Pereira et al. 2004,

Kremer et al. 1979, Lang 1977, Langley et al. 1981, Linley et al. 1983, Meola et al.

1977, Phillips et al. 1988, Steiner et al. 2007), o que sugere que sua produção seja

precisamente controlada (Phillips et al. 1988).

O avanço na análise de hidrocarbonetos cuticulares ocorreu nos anos 1970 com

o surgimento de técnicas sensíveis como a cromatografia gasosa (CG) (Phillips et al.

1988), que permite analisar os padrões de hidrocarbonetos de determinado inseto e

65

calcular suas concentrações (Collins et al. 1993, Phillips et al. 1988, Priestman & Horne

2002). A CG é uma metodologia utilizada para separar substâncias de uma amostra

podendo ser utilizada para identificação de compostos a partir da comparação entre o

tempo de retenção de uma amostra padrão e da amostra que se deseja avaliar (Collins et

al. 1993, Jones & Oldham 1999). Essa técnica envolve uma série de processos físico-

químicos de separação dos compostos de uma mistura em função de suas características

moleculares e se destaca pela facilidade em efetuar não apenas a separação, mas

também a quantificação das espécies químicas. O primeiro estudo empregando a CG em

dípteros foi realizado por Carlson & Service (1979) e permitiu distinguir adultos do

complexo Anopheles gambiae diferenciando An. gambiae s.s de An. arabiensis.

A cromatografia a gás acoplada a espectometria de massas (CG-EM) permite a

identificação dos compostos presentes em uma amostra. Nessa técnica, o composto é

bombardeado no espectrômetro de massas por um feixe de elétrons, obtendo assim

espectro de fragmentos iônicos. A partir da análise do espectro é possível identificar os

diferentes compostos através da comparação com espectros existentes na literatura e do

cálculo dos índices de retenção (IR) ou Kovats (IK). O cálculo desses índices é

realizado a partir da injeção da amostra e de uma mistura de hidrocarbonetos com tempo

de retenção conhecidos (Adams 2007, Silverstein et al. 2007).

A identificação de HCs de formas imaturas e adultos de A. aegypti foi realizada

para a cepa Rockefeller (Cabrera & Jaffé 2007, Mendki et al. 2000, Priestman & Horne

2002, Seenivasagan et al. 2009). Através do estudo dos HCs de larvas de A. aegypti foi

possível identificar e caracterizar o feromônio de oviposição n-heneicosano (C21H44)

(Mendki et al. 2000, Seenivasagan et al. 2009), encontrado em larvas, água de

criadouros (Seenivasagan et al. 2009) e adultos (Priestman & Horne 2002). Priestman e

Horne (2002) identificaram 42 hidrocarbonetos cuticulares em extratos de adultos do

66

mosquito. Cabrera e Jaffé (dados não publicados) identificaram HCs de machos e

fêmeas de A. aegypti da cepa Rockfeller encontrando seis compostos exclusivos do sexo

masculino: os ésteres etanoato de 1-etildecila e E-9-octadecen-12-inoato de metil, o

ácido Z-8,11,14-eicosatrienoico, o aldeído undecanal, o acilglicerídeo 1,3-diacetil-

9,12,15-octadecatrienoilglicerídeo e o alceno Z,Z-3-metil-4,6-hexadecadieno. Essa

diferença na composição química dos HCs entre os sexos pode indicar que esses

compostos sejam utilizados para o reconhecimento de parceiros para a cópula, descrito

para dípteros do gênero Drosophila (Blows et al. 2004, Hine et al. 2004, Petfield et al.

2005) e para Dermatobia hominis (Gulias-Gomes et al. 2008). Sabe-se que cada espécie

de inseto possui seu próprio código de comunicação química baseado nas diferenças

estruturais dos compostos feromonais. Diversas pesquisas foram realizadas com insetos

e demonstraram que a composição do feromônio pode variar dependendo da sua região

de origem (Hadley 1977). Essas diferenças podem influenciar diretamente na eficiência

da comunicação interespecífica. A variação da composição química de feromônios,

muitas vezes representados por HC, também foi descrita na literatura para insetos de

diferentes ordens, sendo bastante conhecido em Lepidoptera (Batista-Pereira et al.

2006), Isoptera (Batista-Pereira et al. 2004) e em dípteros dos gêneros Phlebotomus e

Lutzomyia (Araki et al., 2009, Bauzer et al., 2007, Hamilton et al. 2005).

A identificação dos HCs para adultos de A. aegypti da população brasileira ainda

não foi realizada e, como sua composição pode variar de acordo com a localização

geográfica dos insetos, tal análise é de grande importância. Estudos detalhados a

respeito dos HCs de adultos de A. aegypti, sua identificação, bem como a realização de

testes comportamentais, podem esclarecer o papel desses compostos na comunicação

química de adultos de A. aegypti.

67

O objetivo deste capítulo foi padronizar a metodologia de extração de compostos

presentes na cutícula de adultos de A.aegypti de população brasileira e realizar a

identificação química dos mesmos.


2.1 Criação de Aedes aegypti para o preparo dos extratos

Os insetos utilizados para preparo dos extratos foram criados como descrito no

capítulo I, entretanto, todos os mosquitos utilizados foram alimentados com solução de

sacarose (10%) (Syntech 99% de pureza) com a finalidade de evitar variações nos

padrões de HCs devido à alimentação (Jaffé K., comunicação pessoal).

2.2 Extração do odor de adultos de Aedes aegypti

Foram realizadas extrações do corpo de adultos virgens de A. aegypti, machos e

fêmeas, utilizando diferentes parâmetros.

2.2.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti

Foram preparados extratos hexânicos de adultos virgens de A. aegypti,

totalizando três repetições por metodologia avaliada.

(1) Os primeiros extratos foram realizados com insetos virgens, machos e

fêmeas, com sete dias de idade, de acordo com Priestman e Horne (2002). Um pool de

25 insetos virgens foi colocado em um frasco de vidro (Supelco, Clear Screw Top Vial,

68

2 ml) e, após serem anestesiados em freezer, foi imerso em 1ml de n-hexano (Merck,

99% de pureza) e agitado por cinco minutos (Priestman & Horne 2002). O extrato foi

filtrado em pipeta de Pasteur, contendo lã de vidro por duas vezes e, em seguida, foi

concentrado com um leve fluxo de gás nitrogênio (N2) e armazenado em freezer para

posterior análise por CG.

(2) Posteriormente foi realizada nova extração com 25 fêmeas virgens, de sete

dias de idade, entretanto, os insetos não foram agitados, permanecendo no n-hexano em

diferentes tempos no freezer: 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 240 min. Os extratos

foram filtrados em pipeta de Pasteur contendo algodão previamente lavado com n-

hexano, concentrados com N2 e armazenados em freezer.

(3) Em seguida, foram realizados extratos com machos e fêmeas de A. aegypti

virgens de 5-6 dias de idade após a emergência do adulto. Os insetos foram anestesiados

em freezer e, posteriormente, foi adicionada quantidade de hexano suficiente para cobri-

los (Jaffé, K. comunicação pessoal) em frasco de vidro (Supelco, Clear Screw Top Vial,

2 ml) mantido em freezer durante o período de extração. Foram realizados extratos de

20, 50, 100, 200, 300 e 400 insetos adultos para cada um dos sexos com tempo de

extração de 30 min para todas as amostras e sem agitação. Foram preparados extratos

filtrados e extratos sem filtração, neste caso, o sobrenadante foi retirado após o período

de extração e concentrado com N2. Posteriormente, foi realizada a comparação entre a

quantidade de compostos extraídos nos extratos filtrados com algodão e nos extratos

que não passaram pelo processo de filtragem.

Os extratos utilizados para análise no CG-EM foram preparados com 200 insetos

virgens de acordo com o item 3 sendo, posteriormente, filtrados e concentrados com N2

e acondicionados em frascos âmbar (Supelco, Clear Screw Top Vial, 2 ml) em freezer.

69

Todos os controles foram realizados com 1µl de n-hexano (Merck, 99% de pureza)

(FIG. 16).

Figura 16. Padrão cromatográfico do hexano (controle).

2.2.2 Cromatografia a gás (CG)

Para análise por CG os extratos de machos e fêmeas de A. aegypti foram re-

suspendidos em 20 μl de n-hexano, dos quais 1μl foi injetado diretamente no

cromatógrafo (Priestman & Horne, 2002) utilizando uma seringa de vidro (Hamilton,

10μl, Nevada) no modo Splitless (pressão da coluna: 130 KPa) . Os extratos foram

analisados em CG Shimadzu 17-A equipado com uma coluna DB-1 (100%

dimetilpolisiloxano) (30m x 0,25mm I.D., 0,25 µm de espessura do filme, J & W

Scientific), usando hélio como gás de arraste. A temperatura do injetor foi 315oC e do

detector 320ºC (FID). O programa de corrida teve 50 min. de duração e foi iniciado com

a temperatura de 100o C, aumentando para 230

o em uma taxa de 10

o C a cada 2 min e,

posteriormente 5o C/min até 300

o C (Mahamat & Hassanali 1998).

2.2.3 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM)

A cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG - EM) foi

utilizada para identificar os compostos PR esentes nos extratos dos dois sexos de acordo

70

com sua composição. Os testes de CG – EM foram realizados no laboratório de

Ecologia Química, no departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de

Pernambuco (Recife).

Foram analisadas amostras preparadas com 200 insetos virgens com o emprego

de um cromatógrafo a gás (Hewlett-Packard 5890, Series II) acoplado a um

espectrômetro de massa (MSD 5971). Foi utilizada uma coluna DB-5 (sílica fundida)

(30m x 0,25mm i.d. J&W Scientific) com temperatura inicial de 35°C por 2 min,

aumentando para 220°C a 10°C/min. O hélio (He) foi utilizado como gás de arraste com

fluxo de 1mL/min. Para injeção no CG-EM os extratos foram re-suspendidos em 20µl

de hexano e filtrados em pipeta de Pasteur contendo algodão previamente lavado

(Autran et al. 2009, Navarro-Silva et al. 2009). Foi injetado um volume de 1µL do

extrato no modo splitless e os espectros foram obtidos com uso de um feixe eletrônico

de 70 eV e gravados na faixa m/z 40 – 550 a uma velocidade de 0,5 scan/s. Foram

realizadas três repetições e inicialmente, a identificação dos compostos presentes nos

extratos foi realizada pela comparação entre seus índices de retenção (IR) ou de Kovats

(IK) com índices descritos na literatura para os prováveis compostos (Adams 2007,

Silverstein et al. 2007). Esses índices foram calculados de acordo com a equação de Van

den Dool e Kratz (1963) ou Kovats a partir da co-injeção dos extratos (0,8µL) e padrões

de hidrocarbonetos (C11 – C36) (0,2µL), totalizando 1µL (Adams 2007).

Posteriormente, os espectros obtidos foram comparados com aqueles presentes na

biblioteca do sistema CG-EM (Lab Solutions - GCMS Solutions - Shimadzu), da

biblioteca digital NIST MS Search 2.0 (NIST 2005) e com dados reportados na

literatura (Adams 2007, Silverstein et al. 2007).

71

3. Resultados

3.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti e

análise no cromatógrafo a gás

Devido ao processo de agitação do frasco contendo os insetos, os extratos

preparados apresentaram um grande número de escamas. Por esse motivo, foi

necessário filtrá-los duas vezes para a remoção das escamas antes da injeção no CG. A

necessidade de filtrar o extrato mais de uma vez, bem como o uso da lã de vidro, pode

prejudicar a extração devido à retenção de alguns compostos (Trigo, J.R. 2008

comunicação pessoal) e interferir na quantidade de compostos extraídos, por isso, os

extratos realizados posteriormente foram preparados sem agitar e filtrados com algodão

lavado em n-hexano.

Os extratos realizados sem agitar e filtrados com algodão em diferentes tempos

apresentaram uma grande quantidade de picos (FIG. 17) e permitiu observar que quanto

maior o período de extração, maior a concentração das substâncias extraídas.

72

Figura 17. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas de Aedes aegypti

realizados em diferentes tempos de extração e filtrados.

As extrações com diferentes quantidades de insetos foram realizadas para auxiliar na

escolha dos extratos que posteriormente seriam utilizados em testes comportamentais,

em olfatômetro horizontal de dupla escolha. A comparação entre a quantidade de

compostos presentes nos extratos filtrados e sem filtração permitiu observar que no

processo de filtração alguns compostos foram retidos (TAB. 5) (FIG. 18 a FIG. 21). Foi

observada maior quantidade de picos nos extratos quando preparados sem filtração

5min 15min

30min

1h

4h

73

(FIG. 19 e 21) (TAB. 5). À medida que aumentava a quantidade de insetos nos extratos,

tanto de machos quanto de fêmeas, o número de picos obtidos também aumentou (FIG.

18 a FIG. 21).

Figura 18. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de Aedes

aegypti em diferentes quantidades filtrados.

20 50

200

300 400

100

74

Figura 19. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de Aedes

aegypti em diferentes quantidades sem filtragem.

20 50

200

300 400

100

75

Figura 20. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de Aedes

aegypti em diferentes quantidades filtrados.

20 50

200

300 400

100

76

Figura 21. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de Aedes

aegypti em diferentes quantidades sem filtragem.

20 50

200

300 400

100

77

Tabela 5. Média de picos presentes em extratos hexânicos de adultos virgens de Aedes

aegypti (machos e fêmeas) filtrados e sem filtragem, seguindo metodologia de Jaffé

(comunicação pessoal 2009) (n=3).

N. °

insetos

Extratos ♀ Extratos ♂

Filtrado Sem filtragem Filtrado Sem filtragem

20 3 7 2 4

50 4 12 3 14

100 50 63 5 15

200 21 71 9 16

300 28 59 11 22

400 62 83 52 73

3.2 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM)

A análise por CG-EM permitiu identificar 50,18% dos compostos presentes nos

extratos de fêmeas e 62,76% daqueles presentes nos extratos de machos virgens (TAB.

6). Alguns dos compostos identificados eram exclusivos de um dos sexos. Os

compostos 4-metil-3-penten-2-ona, 2-pentenal,2-metil, 2-pentanona,4-mercapto-4-metil,

benzaldeído e tridecano, foram encontrados apenas em fêmeas, e ciclohexene,1-metil-4-

(1-metiletenil), tridecano e eicosano, apenas em machos (FIG. 22). Os demais

compostos identificados eram comuns a ambos os sexos, entretanto, apresentando

quantidades diferentes (TAB. 6).

78

Figura 22. Sobreposição dos cromatogramas de extratos de machos (preto) e fêmeas

(vermelho) destacando compostos em comum e compostos exclusivos de um dos sexos

(n=3). As informações sobre os compostos indicados pelos números encontram-se na

Tabela 6.

2 1

3 4 5

6

7

8

9 10

13 14

15 16

11

17 18

19 20

28

24

16

15

25

26

22 23

21

27

12

79

Tabela 6. Compostos identificados em extratos hexânicos de machos e fêmeas virgens

de Aedes aegypti por cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-

EM). (L) literatura, (C) calculado.

Composto Nome do composto

Kovats

(L)

Kovats

(C) % (♀)

% (♂)

1 Octano 800 - 5.33 6.06

2 4-metil-3-penten-2-one 838 838 1.18 -

3 2-pentenal, 2 metil 896 889 2.23 -

4 Nonano 900 - 2.64 0.91

5 2-pentanone, 4-mercapto-4-metil 934 925 1.47 -

6 Benzaldeído 962 963 9.11

7 Decano 1000 - 0.20 0.68

8

Ciclohexene, 1-metil-4-(1-

metilethenil) 1033 1034 - 0.13

9 Undecano 1100 - 0.08 0.37

10 Dodecano 1200 - 0.11 0.22

11 Tridecano 1300 - - 0.17

12 Tetradecano 1400 - 0.03 0.68

13 Pentadecano 1500 - 0.07 1.49

14 Hexadecano 1600 - 0.04 1.99

15 Heptadecano 1700 - 1.68 4.20

16 Octadecano 1800 - 0.08 3.46

17 Nonadecano 1900 - 0.29 4.70

18 Eicosano 2000 - - 3.65

19 Heneicosano 2100 - 0.42 3.23

20 Docosano 2200 - 0.09 3.01

21 Tricosano 2300 - 0.52 2.83

22 Tetracosano 2400 - 0.62 20.7

23 Pentacosano 2500 - 3.83 3.08

24 Hexacosano 2600 - 1.80 1.65

25 Heptacosano 2700 - 14.75 5.40

26 Octacosano 2800 - 0.90 0.61

27 Nonacosano 2900 - 2.60 0.51

28 Triacontano 3000 - 0.11 -

Total 50.18 62.76

80

4 Discussão

As análises realizadas por CG permitiram selecionar a melhor forma de extração

dos HC de A. aegypti. A partir dos resultados obtidos optou-se por trabalhar com

amostras extraídas em freezer por 30 min e sem filtragem, realizadas a partir de grupos

de 200 insetos. Observou-se nos cromatogramas que, à medida que aumentava o

número de insetos, obtinha-se uma maior concentração dos compostos presentes nos

extratos. De acordo com Phillips et al. (1990) é possível realizar a comparação de

cromatogramas obtidos de extrações com diferentes quantidades de insetos, entretanto,

os resultados obtidos no presente trabalho demonstram a importância de padronização

de tal fator. De acordo com Priestman & Horne (2002), a quantidade de HCs presente

nos extratos de machos de A. aegypti foi menor que a encontrada nos extratos de

fêmeas. Esses autores relataram que essa diferença (em média 25%) provavelmente se

deva ao menor tamanho corporal dos machos, o que corrobora com os resultados

observados.

A análise dos extratos por CG-EM permitiu a identificação de compostos ainda

não descritos para A. aegypti (Priestman & Horne 2002). Provavelmente, a forma de

extração dos compostos da cutícula dos insetos foi fundamental, pois permitiu a

preservação de compostos extremamente voláteis. Entre eles, os hidrocarbonetos C8 –

C15, o benzaldeído e o ciclohexene,1-metil-4-(1-metiletenil). Em trabalho realizado em

2002, Priestman e Horne identificaram os hidrocarbonetos C16 a C31 em adultos de A.

aegypti das cepas Rockefeller e de Porto Rico, sem a menção de compostos muito

voláteis. No presente trabalho, o C20 foi detectado apenas em machos, enquanto no

trabalho desses autores não há especificação de presença do composto em apenas um

sexo. Além disso, Priestman e Horne (2002) identificaram traços de C30 em machos, ao

81

contrário do observado, uma vez que tal composto foi detectado apenas em extratos de

fêmeas. A diferença na composição química dos compostos cuticulares dos sexos pode

indicar que os mesmos sejam utilizados para o reconhecimento de parceiros para a

cópula, como descrito para dípteros do gênero Drosophila (Hine et al. 2004, Petfield et

al. 2005) e para Dermatobia hominis (Gulias-Gomes et al. 2008).

O HC n-heneicosano (C21) foi identificado inicialmente na Índia em larvas e

extratos de água de larvas do mosquito A. aegypti e foi classificado como um

importante feromônio de oviposição (Ganesan et al. 2006, Navarro-Silva et al. 2009,

Sharma et al. 2008, Seenivasagan et al. 2009), seu papel em machos de A. aegypti ainda

é incerto. Deste modo, a identificação do HC, n-heneicosano, oriundo da população

brasileira de A. aegypti tanto em machos quanto em fêmeas poderá fornecer importantes

informações a respeito da sua ecologia e isolamento comportamental e/ou reprodutivo,

além de permitir a comparação com o perfil químico de populações de Aedes de outras

localidades.

Testes comportamentais estão sendo realizados para verificar a resposta olfativa

de machos e fêmeas de A. aegypti aos compostos identificados em olfatômetro o que

pode fornecer mais informações sobre o papel da comunicação química no

comportamento desses insetos.

82

Capítulo III

Atratividade de insetos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) ao

odor de adultos co-específicos e a extratos hexânicos de adultos

83

1 Comportamento de cópula e reconhecimento intra-específico em Culicidae

As fêmeas recém-emergidas de culicídeos podem copular logo após o

endurecimento do tegumento corporal, ao contrário dos machos, que somente se tornam

aptos após a genitália externa sofrer uma rotação de 180º, o que ocorre em média 24

horas após a emergência (Clements 1963). Assim, a idade dos machos é um fator

determinante para a ocorrência de cópula e fertilização das fêmeas (Hausermann &

Nijhout 1975, Mahmood & Reisen 1982, 1994, Ponlawat & Harrington 2007),

ocorrendo uma redução na taxa de fecundidade e na produção de gametas à medida que

a idade dos insetos aumenta (Hausermann & Nijhout 1975, Ponlawat & Harrington

2007).

Em várias espécies de mosquitos a cópula ocorre em enxames (erigamia) formados

por machos próximos à vegetação ou aos hospedeiros vertebrados e, por um fator ainda

desconhecido, as fêmeas são atraídas para esses locais (Ferguson et al. 2005, Klowden

1995, Nijhout & Sheffield 1979, Sullivan 1981). Provavelmente, o deslocamento das

fêmeas até os enxames é desencadeado por estímulos visuais (Downes 1969),

entretanto, alguns autores acreditam na existência de um feromônio sexual que poderia

atuar juntamente com tais estímulos (Cabrera & Jaffé 2007, Gomulski 1988, Takken &

Knols 2010, Polerstock 2002). Uma vez dentro do enxame, os machos detectam a

freqüência do batimento de asas das fêmeas para reconhecer parceiras co-específicas

(Roth 1948, Polerstock 2002). Essa detecção é realizada pelo órgão de Johnston,

presente apenas nos machos, e destaca-se como um importante estímulo para a

localização de fêmeas a curtas distâncias (Johnston 1955, McIver et al. 1980, Nijhout &

Sheffield 1979, Roth 1948).

84

Apesar de refratárias a mais de uma cópula (Gwadz et al. 1971), as fêmeas podem

copular várias vezes, porém, são fecundadas apenas uma vez (Gwadz et al. 1971,

Hickey & Craig 1966), sendo uma única cópula suficiente para a realização da

oviposição (Roth 1948). Os machos são capazes de copular várias vezes (Roth 1948),

podendo fertilizar diferentes fêmeas (Jones & Pilitt 1973). Durante a cópula, os machos

não apenas transferem o esperma, mas também proteínas da glândula acessória que

alteram o comportamento da fêmea (Klowden 1995). Tais proteínas impedem que a

fêmea copule novamente (Craig 1967), removem o bloqueio fisiológico que evita a

realização da oviposição (Fuchs & Kang 1978), alteram seu ritmo circadiano (Jones &

Gubbins 1977) e reduzem a busca por hospedeiro vertebrado em fêmeas com ovos. A

ausência de tais proteínas faz com que fêmeas de A. aegypti com ovos, mas sem

copular, continuem procurando por hospedeiros, o que aumentaria a possibilidade de

encontrar machos para a cópula (Klowden 1995).

O objetivo deste capítulo foi invetigar a existência de feromônios sexuais em A.

aegypti através das respostas olfativas a insetos co-específicos e a extratos do corpo de

insetos adultos.



Os mosquitos foram criados e mantidos em insetário a 27,0 2 ºC, 70,0 10%

de umidade relativa e 12L:12E de fotoperíodo. Os ovos foram colocados em cubas

plásticas com água desclorada e ração de réptil (Reptolife®) para a eclosão e

desenvolvimento das larvas até o estádio de pupa (10%) (Eiras & Jepson 1991). Para

85

garantir que os insetos utilizados nos experimentos fossem virgens eles foram separados

por sexo de acordo com seu tamanho ainda no estágio de pupa. Posteriormente, os

recipientes com pupas foram colocados em diferentes gaiolas teladas (30x30x30cm,

Bug-Dorm®) e, para controle da idade, foram trocados de gaiola diariamente. As gaiolas

dos diferentes sexos foram mantidas em salas distintas e verificadas diariamente, caso

houvesse algum inseto do sexo oposto, esse era descartado. Os adultos foram

alimentados com solução açucarada (10%) e todos os bioensaios foram realizados com

insetos das gerações F70 a F90.

2.2. Olfatômetro

Foram realizados testes comportamentais para avaliar as respostas olfativas de

machos e fêmeas virgens de A. aegypti (três e 10 dias) ao odor de insetos co-específicos

(machos ou fêmeas) em um sistema de aeração e a extratos de insetos co-específicos

(Geier et al. 1996, Mota 2003). Para os testes, foi utilizado um olfatômetro horizontal de

dupla escolha de acrílico, composto por um tubo principal (90cm de comprimento x 12

cm de diâmetro) e dois tubos de escolha (36,5 cm de comprimento e 12 cm de

diâmetro), conectados em uma caixa de acrílico. Foram realizados 15 bioensaios por

estímulo avaliado, utilizando aproximadamente 10 insetos/ teste (Geier et al. 1996).

Antes do início dos testes, os insetos permaneceram por 15 min nas gaiolas de

liberação para climatização. Após a apresentação do estímulo o compartimento da

gaiola de liberação foi aberto e os testes iniciado. A resposta obtida foi avaliada pela

diferença entre o número de insetos encontrados nos diferentes compartimentos em um

determinado período de tempo, como descrito no capítulo I (Geier et al. 1996, 1999,

Mota 2003).

86

2.3 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos

Um fluxo de ar (200 ml/L) gerado por um compressor (1/5Hp Piston Mini Air

Compressor for Airbrush/ TC-20B) e filtrado em filtro de carvão ativado foi

direcionado para dois recipientes cilíndricos de vidro limpos (14cm de comprimento x

4cm de diâmetro) (teste e controle), carregando os odores neles contidos (FIG. 23). No

recipiente teste foram colocados aproximadamente 30 adultos de A. aegypti virgens do

mesmo sexo, enquanto o recipiente controle estava vazio (FIG. 23). O fluxo de ar foi

levado ao olfatômetro através de mangueiras de polietileno de mesmo comprimento

(90cm) (FIG. 24a) que tinham sua posição invertida no braço do olfatômetro a cada

repetição. Foram realizadas 15 repetições para avaliar as respostas olfativas de machos e

fêmeas virgens de A. aegypti aos odores de insetos co-específicos de ambos os sexos.

Figura 23. Esquema do sistema de aeração utilizado nos testes com odor de Aedes aegypti. A.

Filtro de carvão ativado, B. Bifurcação para divisão do fluxo de ar, C. Tubo de vidro com

insetos (teste), D. Tubo de vidro vazio (controle). E. Mangueira. A seta indica o sentido do

fluxo de ar.

A B

C

D

E

E

87

2.4 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos

Foi avaliada a resposta olfativa de A. aegypti a extratos contendo diferentes

quantidades de insetos adultos: 20, 50, 100, 200, 300 e 400. Os extratos foram

preparados como descrito no capítulo II e concentrados em fluxo de N2, posteriormente,

foram ressuspendidos em 50 µl de hexano (Merck 99%) e colocados em papel de filtro

de 1cm2. Após a evaporação do solvente o papel de filtro era preso no olfatômetro com

um clipe metálico no tubo de liberação do estímulo, que era fechado após a fixação do

papel (FIG.24b). O controle foi realizado com 50 µl de hexano em papel de filtro e a

análise estatística foi realizada como descrito no capítulo I.

Figura 24. Apresentação dos estímulos no olfatômetro. A. Encaixe da mangueira do sistema de

aeração. B. Fixação do papel de filtro no tubo de liberação de estímulo do olfatômetro com clipe

metálico (durante os testes o tubo era fechado) (Fotos: Leme 2010).

Foram avaliadas: (1) respostas olfativas de machos e fêmeas virgens de A.

aegypti, sem repasto sanguíneo, aos extratos de insetos co-específicos de ambos os

sexos em diferentes quantidades (20, 50, 100, 200, 300 e 400 insetos) e (2) respostas

olfativas de fêmeas virgens com repasto sanguíneo a extratos de 400 machos e 400

fêmeas. As fêmeas com seis dias de idade cronológica realizaram repasto sanguíneo em

A B

88

camundongos (Mus musculus) e foram utilizadas três dias após o repasto (Gomes et al.

2006). Foram realizadas três repetições por tratamento, utilizando o mesmo extrato para

todas elas. Posteriormente, foram realizadas 15 repetições com extratos de 200 insetos

virgens para machos e fêmeas virgens.

3 Resultados

3.1 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos

As fêmeas virgens não foram atraídas para nenhum dos estímulos avaliados. Nos

testes com odor de fêmeas, apenas 24% dos insetos avaliados apresentaram atividade de

vôo. O odor dos machos, apesar de não ter sido atrativo (p>0,05 teste t), foi mais

eficiente para desencadear a atividade de vôo das fêmeas avaliadas (54%) (p<0,05

Kruskal-Wallis) (TAB. 7).

Os machos virgens foram significativamente atraídos para odor de insetos do

mesmo sexo (p<0,05 Kruskal-Wallis) (TAB. 7), mas não foi observada diferença

significativa na atividade de vôo desses insetos para os dois estímulos avaliados (odor

de fêmeas e odor de machos) (p>0,05 Kruskal-Wallis).

3.2 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos

A. Resposta de fêmeas virgens

Nos testes com extratos de fêmeas virgens, as fêmeas foram atraídas apenas por

extratos de 100 e 400 insetos (p<0,05 Mann-Whitney) (FIG. 25). Nos testes com

extratos de machos, as fêmeas virgens foram atraídas apenas por extratos de 100

machos (p<0,05 Mann-Whitney) (FIG. 26). A atividade de vôo das fêmeas aumentou, à

89

medida em que aumentou a quantidade de insetos nos extratos (coeficiente de Spearman

= 0,9, p<0,05) (FIG.27). Não houve diferença significativa entre os compartimentos

teste e o controle nos experimentos realizados com extratos de 200 insetos virgens

(p>0,05, Kruskal-Wallis) quando o número de repetições foi aumentado.

Tabela 7. Percentual de resposta de fêmeas e machos virgens de Aedes aegypti ao odor de

insetos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.). ―*‖ Indica diferença estatística (p<0,05

Kruskal Wallis) (n=15).

Insetos

testados

Estímulo

(♂)

Controle

Atividade

de vôo

Estímulo

(♀)

Controle

Atividade

de vôo

♂

15 ± 1,4

3,6 ± 0,7 *

38%

6,5 ± 0,9

9 ± 1,2

33%

♀

11,9 ± 2,0

16,2 ± 2,0

54%

6,6 ± 1,1

6 ± 0,79

24%

Figura 25. Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a extratos de fêmeas

co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3)

(p<0,05 Mann-Whitney).

90

Figura 26. Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a extratos de machos

co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3)


Figura 27. Percentual de atividade de vôo de fêmeas virgens de Aedes aegypti a extratos de

insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro horizontal de dupla escolha

(Porcentagem média ± e.p.) (n=3) (Spearman, p<0,05).

B Resposta de machos virgens

Os machos virgens foram atraídos apenas pelos extratos de 300 fêmeas (FIG. 28)

(p<0,05, Mann-Whitney). Houve forte correlação positiva (coeficiente de Spearman =

% d

e atr

ati

vid

ad

e

Quantidade de insetos nos extratos

Teste

Controle

Res

post

a %

Quantidade de insetos no extrato

Fêmeas Machos

91

1,0) entre o número de insetos nos extratos e a atratividade dos machos (p<0,0001).

Quanto à atividade de vôo dos insetos avaliados, não houve diferença para os extratos

de 100, 200, 300 e 400 fêmeas (p>0,05 Mann-Whitney) (FIG. 30).

Nos testes com extratos de machos co-específicos, houve atratividade para o extrato

de 400 insetos (p<0,05, Mann-Whitney) (FIG.29), com 95% dos mosquitos avaliados

apresentando atividade de vôo (FIG. 30). O extrato de 100 machos desencadeou a

atividade de vôo em 80% dos insetos testados (FIG. 30). Nos testes realizados com

aumento do número de repetições (n=15) para avaliar a resposta dos mosquitos a

extratos de 200 insetos não foi observada diferença significativa (p>0,05, Kruskal-

Wallis).

Figura 28. Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a extratos de fêmeas

co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3)


92

Figura 29. Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a extratos de

machos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha

(n=3) (p<0,05 Mann-Whitney).

Figura 30. Percentual de atividade de vôo de machos virgens de Aedes aegypti a extratos de

insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro horizontal de dupla escolha

(Porcentagem média ± e.p.) (n=3) (p>0,05 Mann-Whitney).

4 Discussão

O estudo dos feromônios de insetos, além de fornecer muitas informações sobre

o comportamento desses organismos, auxilia em programas de controle e combate de

insetos-praga (Campion et al. 1989, Jutsum & Gordon 1989, Seabrook & Dyer 1983).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

20 50 100 200 300 400

Res

post

a %

Quantidade de insetos no extrato

Fêmeas Machos

93

Muitos representantes da ordem Diptera possuem feromônios sexuais conhecidos, os

quais desempenham um papel importante no comportamento de corte desses insetos

(Lane et al. 1985, Ponlawat & Harrington 2007, Wicker-Thomas 2007). O uso do

feromônio sexual bombykol no controle da mariposa do bicho da seda (Bombyx mori) é

um dos exemplos mais conhecidos e, desde sua descoberta por Rogoff et al. em 1964,

vem sendo amplamente estudado (Groot et al. 2009, Roelofs et al. 2002), assim como os

feromônios de Drosophila melanogaster (Antony et al. 1985, Davis & Carlson 1989),

Haematobia irritans (Bolton et al. 1980), Musca domestica (Carlson et al. 1971, Uebel

et al. 1976), Stomoxys calcitrans (Sonnet et al. 1977, 1979). Em A. aegypti a única

maneira atualmente conhecida para o reconhecimento intra-específico e utilizada para

busca de parceiros para a cópula é a detecção do som do batimento de asas das fêmeas

pelos machos (Roth 1948). Entretanto, Cabrera & Jaffé (2007) observaram em testes

comportamentais indícios do possível reconhecimento de machos e fêmeas de A.

aegypti pela detecção de substâncias químicas específicas, provavelmente um

feromônio sexual e/ou de agregação, com aumento da atividade de vôo dos mosquitos

na presença de insetos co-específicos e formação de enxames pelos machos.

A atratividade dos machos de A. aegypti para insetos do mesmo sexo no sistema

de aeração e também a atratividade de machos e fêmeas aos extratos dos dois sexos

sugere a existência de feromônios nessa espécie. Trabalhos semelhantes em olfatometria

foram capazes de demonstrar a existência de feromônios sexuais em diferentes espécies

de Diptera. Lang e Foster (1976) demonstraram a existência de feromônio sexual em

Culiseta inornata em trabalho que avaliou a resposta de mosquitos adultos a insetos

vivos ou mortos em olfatômetro. Chaudhury et al. (1972) e Gulias-Gomes et al. (2008)

demonstraram a existência de feromônios sexuais, em Musca autumnalis e Dermatobia

94

hominis, respectivamente, pela atratividade de moscas adultas a extratos corporais de

insetos co-específicos em olfatômetro.

O aumento da atividade de vôo dos mosquitos, como descrito por Cabrera &

Jaffé (2007) também representa um comportamento importante para o encontro de

parceiros para a cópula. O aumento de vôo dos machos na presença do odor de fêmeas,

assim como sua atratividade, aponta para existência de feromônios sexuais produzidos

pelas fêmeas e reconhecidos por eles como descrito por Cabrera e Jaffé (2007). A

presença de indivíduos do sexo masculino e feminino foi um fator determinante para o

aumento da atividade de vôo dos machos. O aumento do vôo de machos na presença de

insetos do mesmo sexo demonstra um reconhecimento intra-específico que seria

responsável pelo comportamento de formação de enxames (Ferguson et al. 2005,

Klowden 1995, Nijhout & Sheffield 1979, Sullivan 1981). É provável que um

feromônio de agregação possa atuar nesse momento, atraindo mais machos para o

enxame (Klowden 1995, Justum & Gordon 1989). Cabrera e Jaffé (2007) obtiveram

resultados semelhantes em estudo que indicou a existência desses compostos em A.

aegypti devido ao aumento de insetos voando em enxames.

O aumento da atividade de vôo das fêmeas na presença de machos, assim como

a atração aos extratos, indica a existência de um composto químico de reconhecimento

sexual. Sabe-se que machos de algumas espécies de mosquitos voam formando

enxames e que as fêmeas são atraídas para esses locais, comportamento sugestivo para a

existência de um feromônio de agregação que também atue como feromônio sexual

(Klowden 1995). Em Nematocera da família Psychodidae, gênero Lutzomyia sp., foi

comprovada a existência de um feromônio de agregação produzido pelos machos

(terpeno) que também atua na atratividade das fêmeas (Hamilton et al. 1996, Spiegel et

al. 2005).

95

Apesar de todos os avanços no estudo de feromônios de insetos e a despeito da

importância do mosquito A. aegypti em saúde pública, ainda não foi descrito nenhum

feromônio sexual e/ ou de agregação para esse inseto, ou mesmo para outro

representante da família Culicidae. No presente trabalho foi observada pela primeira vez

a evidência de feromônios sexuais e/ou de agregação em extratos de adultos de A.

aegypti, com indícios da ocorrência de comunicação química entre esses insetos. Os

resultados sugerem que a investigação de feromônios em A. aegypti é promissora e

aponta para a possibilidade de utilização dos mesmos em armadilhas para controle do

vetor. O uso de feromônios no controle de insetos já está bem estabelecido na

agricultura, seja em armadilhas iscadas ou com o uso de técnicas como a interrupção da

cópula (confundimento) (Campion et al. 1989), essa última se destaca como a forma de

emprego de feromônios mais utilizada no controle de pragas. O emprego desses

compostos apresenta uma série de vantagens, como, por exemplo, não ser tóxico nem

poluir o ambiente. Além disso, como são semioquímicos espécie-específicos, sua

especificidade é elevada (Justum & Gordon 1989). A identificação de compostos que

possam atuar como feromônios em A. aegypti está em andamento e, posteriormente,

serão realizados testes comportamentais utilizando-os.

96

CONCLUSÕES

- O capturador de Castro é uma ferramenta útil para a separação de insetos para testes

em olfatômetro, sem danificá-los.

- Assim como observado para fêmeas de A. aegypti, grande parte dos machos com idade

inferior a 72 horas foram inativos frente ao odor do hospedeiro vertebrado, fato que

pode estar relacionado com o desenvolvimento das sensilas olfativas e/ou o a rotação da

genitália externa para a cópula.

- Machos com idade a partir de 72 horas têm o comportamento de vôo estimulado pela

presença de odor humano.

- Ao contrário do observado para os machos virgens, machos copulados foram atraídos

pelo odor humano, porém essa atratividade foi inferior àquela observada para fêmeas de

A. aegypti.

- O odor dos voluntários do sexo masculino foi mais atrativo que o dos voluntários de

sexo feminino tanto para mosquitos machos quanto para fêmeas, havendo também uma

variação individual na atratividade.

- Fêmeas virgens também são atraídas pelo odor humano, tal atração é maior para o

odor de voluntários do sexo masculino.

- O atraente sintético BG-Lure foi atrativo para os machos virgens

97

- Os odores da codorna e do camundongo foram importantes para estimular o

comportamento de vôo de machos virgens, o que permite concluir que os machos são

capazes de detectar cairomônios dos hospedeiros vertebrados que seriam importantes

para a formação de enxames.

- A manutenção das amostras em freezer durante o período de preparação dos extratos

foi importante para preservar compostos com volatilidade alta, o que permitiu que

novos compostos fossem identificados em A. aegypti.

- Os machos virgens de A. aegypti foram atraídos por odor de machos virgens vivos.

- A quantidade de insetos nos extratos foi determinante para o aumento da atividade de

vôo das fêmeas e a atração dos machos.

- Voláteis presentes nos extratos de machos e fêmeas virgens foram capazes de atrair

insetos co-específicos de ambos os sexos, além de estimular o comportamento de vôo.

98

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Documents

Ecologia química de machos de Aedes Stegomyia aegypti