Efecto de hemocianinas de moluscos en la maduración de células

dendríticas murinas

Memoria para optar al Título de Bioquímico

Miguel Ignacio del Campo Zaldívar

Departamento de Investigación y Desarrollo, Biosonda S.A.

Fundación Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Profesor Patrocinante: Director de Tesis: Javier Puente Ph.D. María Inés Becker Ph.D.

Santiago de Chile, Noviembre 2007

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

ii

A mis padres, Rafael y Margarita.

iii

AGRADECIMIENTOS

Quisiera agradecer a la doctora María Inés Becker por haberme aceptado como su

alumno en este proyecto, por ser un ejemplo de amor por la ciencia y sus esfuerzo por

contagiarme con ello, por su apoyo y ayuda no sólo en lo académico, sino también por ser una

maestra en todo ámbito; por su voluntad, trabajo y dedicación por esta tesis.

Agradezco al doctor Alfredo de Ioannes por permitirme desarrollar la tesis en Biosonda

S.A., a toda la gente del laboratorio que aportó en este trabajo, a Augusto Manubens, Esteban

Nova, Francisco Vargas, Alejandra Fuentes, Cecilia Espinoza, Andrea Gonzalez y en especial a

Leidy Lagos, por su ayuda incondicional como compañera y como amiga; y a todo el grupo

humano que conforma Biosonda S.A., a Marcela Cabezas, Lorena Macaya y don José Peña.

Gracias a todos quienes me ayudaron en el desarrollo experimental de esta tesis, al

profesor Alejandro Munizaga y Ximena Vergés por su aporte en las Microscopías, a Valeska

Simons y a la doctora María Rosa Bono por ayudarme en el análisis de las citometrías de flujo,

y a Bruno Moltedo por sus aportes en reactivos y en la discusión de este trabajo. Agradezco

también al doctor Javier Puente, por haber aceptado patrocinar esta tesis.

Gracias a mis padres, Rafael y Margarita, a mis hermanos, Rafael, Javiera y Gabriel, por

haberme dado todo para desarrollarme como persona; a mis amigos, Xavier, José Luis y

Ricardo; a mis compañeros de colegio y de universidad, y a todos a quienes de alguna u otra

forma ayudaron en el desarrollo de este trabajo.

iv

Esta Tesis forma parte del proyecto FONDECYT 105-0150 titulado “Estudio de la

estructura de la hemocianina de moluscos en relación a sus mecanismos de inmunoestimulación en

mamíferos” y percibió apoyo parcial de la Fundación COPEC-PUC proyecto SC0014 titulado

“Desarrollo de productos inmunoestimulantes en base a hemocianina de C. concholepas”

Los resultados obtenidos han sido presentados en los siguientes congresos y seminarios:

• Immunomodulatory effect of CCH and KLH, members of the hemocyanin family, on the

maturation of dendritic cells. Becker MI, Del Campo M, Lagos L, Fuentes A, Manubens A,

De Ioannes AE, Moltedo B, 9th International Conference on Dendritic Cells. September 16-

20 2006. Edinburgh, England. Abstract P3.103, pp: 84.

• Efecto de la hemocianina de C. Concholepas (CCH) en la maduración de células

dendríticas. Del Campo M., Moltedo B., De Ioannes A. E., Becker, M. I. XLIX Reunión

Anual de la Sociedad de Biología de Chile. 22-25 de Noviembre 2006. Pucón, Chile.

Abstract R-134, pp. R-1-158.

• Efecto de la hemocianina de C. Concholepas (CCH) en la maduración de células

dendríticas. Del Campo M., Moltedo B., De Ioannes A. E., Becker, Seminario de

Ingeniería en Biotecnología: Aplicaciones Industriales de procesos biotecnológicos. 12-13

de Abril 2007. Universidad de Viña del Mar. Viña del Mar, Chile.

• Efecto de la hemocianina de C. Concholepas (CCH) en la maduración de células

dendríticas. Del Campo M, Lagos L, Manubens A, Ioannes A, Moltedo B, Becker MI.

XXX Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile. 25-28

de Septiembre 2007. Termas de Chillán, Chile. Libro de Resúmenes, Pág. 64, Resumen 77.

• Participación de células natural killer en el efecto inmunoestimulante de hemocianinas.

Lagos L, Del Campo M, Manubens A, Moltedo B, De Ioannes A, Puente J, Becker MI.

XXX Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile. 25-28

de Septiembre 2007. Termas de Chillán, Chile. Libro de Resúmenes, Pág. 42.

v

ÍNDICE

Página

ABREVIATURAS 1

RESUMEN 3

SUMMARY 5

INTRODUCCIÓN 7

• Estructura de las hemocianinas de moluscos 7

• Mecanismos de inmunoestimulación de hemocianinas 8

• Las células dendríticas y su rol en la presentación de antígenos 10

HIPÓTESIS 13

OBJETIVO GENERAL 14

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14

MATERIALES 15

1. Animales de experimentación 15

2. Reactivos 15

3. Soluciones 16

4. Material plástico y otros 18

vi

5. Equipos 18

MÉTODOS 19

1. Aislamiento y cultivo de DCs 19

2. Aislamiento y cultivo de células NK 20

3. Análisis por microscopía de luz con contraste de fase 20

4. Análisis por microscopía confocal 21

5. Análisis por microscopía electrónica de transmisión 21

6. Marcación de proteínas con Alexa488 21

7. Tinción negativa de proteínas 22

8. Análisis por citometría de flujo 22

9. Análisis por ELISA para medición de citoquinas 23

10. Análisis por Westernblot (WB) para determinar degradación de CCH 24

11. Desglicosilación de CCH e inmunización para evaluar título de Ac 24

RESULTADOS 27

1. Caracterización de cultivos de DCs murinas a partir de células precursoras de

médula ósea 27

vii

2. Determinación de la incorporación de CCH por DCs in vitro e in vivo 27

3. Efecto de CCH sobre la maduración de DCs 30

4. Capacidad proteolítica de las DCs frente a CCH 35 5. Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC 38 6. Inmunogenicidad de CCH y sus subunidades desglicosiladas, in vivo

e in vitro 41

DISCUSIÓN 46

CONCLUSIONES 53

BIBLIOGRAFÍA 54

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Fig 1 : Esquema de la organización general de hemocianinas de molusco 9

Fig 2 : Mecanismo de inmunoestimulación de CCH y maduración de DCs 11

Fig 3 : Establecimiento y caracterización de la población DC 28

Fig 4 : Análisis de la incorporación de CCH por DCs 29

Fig 5 : Análisis de la incorporación de CCH por DCs 31

Fig 6 : Efecto de CCH sobre la maduración de DCs 33

Fig 7 : Efecto de CCH sobre la maduración de DCs: Expresión de marcadores de

maduración evaluados por citometría de flujo 34

Fig 8 : Análisis de la pérdida de la capacidad fagocítica 36

Fig 9 : Capacidad proteolítica de DCs sobre CCH 37

Fig 10 : Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC 39

Fig 11 : Efecto de CCH sobre la secreción de interleuquinas en cocultivos NK/DC 40

Fig 12 : Tratamiento de desglicosilación química y enzimática de CCH y sus

subunidades 42

Fig 13 : Inmunogenicidad de CCH y sus subunidades desglicosiladas , in vivo 44

ix

Fig 14 :Secreción de IL12 por efecto de CCH y sus subunidades desglicosiladas, en

cultivos DCs in vitro 45

x

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Respuesta inmune humoral de ratones contra CCH y sus subunidades

Desglicosiladas 44

1

ABREVIATURAS

Ac : Anticuerpo.

ATP : Adenosin trifosfato

APC : Antigen presentation cell, célula presentadora de antígeno

BCR : B cell receptor, receptor de antígeno de célula B

BSA : Bovine serum albumin, albumina sérica bovina.

CCH : C. concholepas hemocyanin, hemocianina de C. concholepas.

CD : Cluster of diferentiation, grupos de diferenciación.

D-MEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium, medio Eagle modificado de

Dulbecco

DCs : Células Dendriticas

ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay, ensayo inmuno enzimático

en fase sólida.

FAL : Fosfatasa alcalina

FITC : Fluorescein isothiocyanate, Isotiocianato de fluoresceina

FUs : Unidades funcionales

GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, factor estimulante

de colonias de monocitos y granulocitos

HPC : Hematopoietic progenitor cell, célula progenitora hematopoyética

ILs : Interleuquinas

INFγ : Interferón γ

KLH : Key hole limpet hemocyanin, hemocianina de Key hole limpet

Lamp : Lisosomal associated membrane protein, proteína de membrana

asociada a lisosoma

LB : Linfocitos B

LPS Lipopolisacárido

LT : Linfocitos T

MET : Microscopia electrónica de transmisión

MHCI y MHCII : Mayor histocompatibility complex class I and II, complejo mayor de

histocompatibilidad de clase I y II.

MLCF : Microscopía de luz con contraste de fase

NK : Natural Killer, células asesinas naturales

OVO : Ovoalbúmina

PE : Phycoeritrin, Ficoeritrina

PBS : Phosphate buffer saline, tampón fosfato salino

2

PHA : Phytohemaglutinine, fitohemaglutinina

PMSF : Phenylmethylsulphonyl fluoride, fenilmetil sulfoniflúoruro

PNGasa F : N-glicosidasa F

Respuesta Th1 Respuesta de Linfocito T helper de tipo 1, caracterizada por un aumento

en la expresión de INFγ

RPMI-1640 : Medio formulado en Roswell Park Memorial Institute.

SFB : Suero fetal bovino

SSC y FSC : Size scatter y Forward scatter, dispersión de tamaño y dispersión de

granulosidad.

TCR : T cell receptor, receptor de antígeno de célula T

TLR : Toll like receptor, receptores de tipo Toll

TNF α : Tumoral necrosis factor α, factor de necrosis tumoral α

WB : Westernblot

3

RESUMEN

Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno presentes en algunos

moluscos y artrópodos. Son conocidas por su poderosa inmunogenicidad en mamíferos, siendo

utilizadas como proteínas transportadoras de haptenos para obtener anticuerpos contra haptenos,

en vacunas y como inmunoestimulante no específico en el tratamiento de algunos tipos de cáncer.

Para estas aplicaciones la hemocianina más utilizada proviene de la lapa Californiana M. crenulata

(KLH). Hemos demostrado que la hemocianina del gastrópodo Chileno C. concholepas (CCH), si

bien difiere de KLH en su origen y estructura, posee cualidades inmunomoduladoras equivalentes,

incrementando la actividad de células NK, e induciendo respuestas inmunes de tipo Th1.

En este trabajo, se estudió el efecto de CCH sobre células dendríticas (DCs) murinas,

consideradas las células presentadoras de antígeno por excelencia, y por tanto, las células

moduladoras de la respuesta inmune. Postulamos que CCH induce la maduración de DCs,

activando la inmunidad innata y adaptativa, vía procesamiento y presentación de CCH a células T

naive, generando un ambiente de interleuquinas inmunoestimulante en los tejidos linfoides.

En primer lugar, se estudió la cinética de incorporación de CCH in vitro, en DCs aisladas

por selección magnética a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6.

Para el análisis, se emplearon diversas técnicas microscópicas de luz y electrónica, y de citometría

de flujo; así como CCH marcada con fluorocromos o anticuerpos específicos contra ella. Se

encontró que CCH fue incorporada rápidamente por DCs (CD11c+) vía endocitosis mediada por

vesículas con clatrina, localizándose posteriormente en lisosomas secundarios. Se determinó el

efecto de CCH sobre la maduración de DCs cultivadas in vitro, mediante la expresión de los

marcadores de superficie MHCI, MHCII y CD86, y también mediante la secreción de IL12 y la

pérdida de la capacidad fagocítica. Como control positivo se utilizó LPS, el cual produjo un

aumento significativo de todos los marcadores a las 24 h. Las DCs tratadas con CCH no mostraron

diferencias con las DCs control hasta las 72h de cultivo. Sin embargo, a este tiempo, se encontró

que por efecto de CCH, las DCs aumentaron la expresión del marcador lisosomal Lamp,

sugiriendo que dicha proteína se procesa lentamente. Evidencia adicional mediante Western blot,

mostró fragmentos de hemocianina en torno a 50 kDa hasta las 54 h de incubación, no siendo

detectados a las 72 h.

Resultados diferentes se encontraron cuando las DCs fueron cocultivadas con células NK

purificadas, aumentó la expresión de MHCII y CD86 como asimismo, la secreción de IL12 e INFγ

por efecto de CCH en asociación al contacto entre las células, confirmando una modulación

positiva de la hemocianina en la interacción NK/DC.

4

Al estudiar la importancia del tamaño de CCH y la presencia de azúcares en su estructura

sobre su inmunogenicidad, evaluando la respuesta inmune humoral de ratones de dos cepas

diferentes (C57BL/6 y C3H/HeJ), se encontró que, ni la pérdida de su estructura cuaternaria ni de

sus azúcares disminuyeron la inmunogenicidad de la proteína, por el contrario, se observó que el

título de anticuerpos se mantuvo similar o aumentó al inmunizar los ratones con las proteínas

desglicosiladas en comparación a las nativas. Sin embargo, estas moléculas no aumentaron la

secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro, señalando nuevamente la importancia de las células

del sistema inmune innato, como las células NK, en la vía de acción de las hemocianinas.

Finalmente, este es el primer trabajo donde se aborda experimentalmente el mecanismo de

inmunoestimulación de hemocianinas, estableciéndose que la proteína es procesada lentamente por

parte de las DCs, y que en la respuesta de tipo Th1 que ellas modulan, la comunicación NK/DC es

fundamental.

5

ABSTRACT

EFFECT OF MOLLUSK HEMOCYANINS ON THE MATURATION OF MURINE DENDRITIC CELLS

Hemocyanins are glycoproteins that function as oxygen transporters in some mollusks and

arthropods. They are known by their powerful immunogenicity in mammals, and therefore are

widely used as hapten-carrier to produce antibodies, in vaccine development, and as non specific

inmunoestimulant for the treatment of some types of cancer. The hemocyanin known as KLH

obtained from the Californian limpet M. crenulata has been exclusively used for the above

purposes. We demonstrated that CCH, the hemocyanin from the Chilean gastropod C.

concholepas, although differ in origin and structure; have similar immunomodulatory properties,

increasing the activity of NK cells, and inducing a type Th1 immune response.

Considering the pivotal role of dendritic cells (DCs) in the modulation of immunity, it is of

interest to determine the relationship among the structural features of hemocyanins and their effect

on DCs maturation and how they specifically modulate their functions. We postulated that CCH

induce DC maturation by activating the innate and adaptive immunity, trough CCH processing and

presentation, to specific naïve T lymphocyte, leading to an immunostimulant interleukin

environment in lymphoid tissues.

First, we analyzed the kinetics of CCH uptake by DCs obtained from bone marrow

precursors of C57BL mice, isolated by magnetic sorting and cultured in vitro. The uptake of CCH

was studied using diverse microscopic techniques and flow cytometry. To track the protein, we

used fluorescent conjugates of CCH and specific anti CCH antibodies. We found that CCH is

quickly internalized by clathrin-mediated endocytosis vesicles, and after that, it was localized in

secondary lysosomes. The effect of CCH on DC maturation, was investigated by the analyses of

the expression of surface molecules as MHCI, MHCII and CD86, as well as by IL12 secretion and

the lost of fagocitic activity. As a positive control we used DCs treated with LPS, which modify

these parameters after 24h of culture. DCs treated with CCH did not show differences up to 72 h

with respect to the control DCs. At this time, an increased of the expression of the lysosome

membrane glycoprotein Lamp was observed, suggesting that CCH is gradually processed. We

found additional evidence for a slow processing by DCs, since, fragments of size around 50 kDa,

were detected by Western blot up to 54 h, and disappears at the 72h.

In contrast to these results, when DCs were cocultured with purified NK cells in the

presence of CCH, an increase in the expression of MHCII and CD86 surface molecules and

6

secretion of IL12 and INFγ was observed. The above effects of CCH were boosted when both

cellular types were put in contact, indicating that the NK and DCs contact is necessary for the

modulation of DCs by CCH.

Next, we studied the influence of the size and the sugar moieties of CCH in their

immunostimulatory effect, trough the study of the humoral immune response against

deglicosilated subunits of CCH, and native subunits as control. The results showed that the

inmunoestimulant capacity was not decreased; on the contrary, the titers of antibodies were higher

against the deglicosilated proteins than the native ones. However, the increased immunogenicity of

the deglicosilated CCH did not correlate with the secretion of IL12 in isolated DCs cultured in

vitro, suggesting again, the importance of cells of the innate immune cells, as NK, in the

mechanisms of action of the hemocyanins.

In conclusion, this work is the first experimental approached to get inside the fine

immunomodulatory mechanism of mollusk hemocyanins, using CCH as model. The main

conclusions that can be drawn from this work are that CCH is slowly processed by the DCs, and

that the NK/DC interaction is required for the effect on DCs in vitro and in vivo.

7

INTRODUCCIÓN

Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno, presentes en la hemolinfa

de una gran variedad de moluscos y artrópodos. En estos phylum, dichas proteínas difieren

considerablemente en la secuencia primaria, en el peso y en la organización de sus subunidades, así

como también en su capacidad de unir oxígeno (van Holde et al.,1995), siendo de interés en este

trabajo, las hemocianinas de moluscos, por su importancia en el campo de la inmunología.

Las hemocianinas han sido modelos de estudio en bioquímica principalmente por su gran

tamaño, por ser metaloproteínas, por tener una cinética alostérica en la unión de O2 y por su

compleja estructura cuaternaria. A estas proteínas se les descubrió una capacidad inmunogénica

notable en vertebrados, debido, en parte, a su carácter xenogénico, a su gran tamaño (4- 9 MDa),

por tener una estructura cercana a una simetría D5, en que los epítopos pueden estar repetidos hasta

60 veces, y por poseer un alto porcentaje de azúcares en su estructura (2 a 4% de su peso). Las

hemocianinas han sido utilizadas como antígeno experimental, como proteínas transportadoras para

producir anticuerpos contra haptenos y péptidos; se han usado, también, en el desarrollo de vacunas

contra patógenos y algunos tipos de cáncer; como adyuvantes en la presentación antigénica de

células dendríticas (DCs) pulsadas con lisados de melanoma y como inmunoestimulante en la

terapia del cáncer superficial de vejiga (Harris et al., 1999; Markl et al, 2001). La hemocianina de la

lapa californiana Megathura crenulata (cuyo nombre vulgar es keyhole limpet, KLH), ha sido la

única utilizada con tales propósitos por los últimos 30 años. Sin embargo, en el último tiempo, se ha

comenzado a estudiar la hemocianina del molusco chileno Concholepas concholepas (cuyo nombre

vulgar es Loco), y se la ha denominado CCH. La hemocianina de Concholepas, ha demostrado ser

una alternativa a KLH, tanto en su capacidad transportadora de haptenos y péptidos para producir

anticuerpos (Manosalva et al., 2004), así como también en su efecto antitumoral no específico en la

terapia del cáncer superficial de vejiga (Moltedo et al., 2006); aun cuando difiere con KLH en su

origen y en su estructura cuaternaria.

Estructura de las hemocianinas de moluscos

Las hemocianinas tienen un tamaño que les permite ser fácilmente reconocidas por

microscopia electrónica de transmisión (MET) usando tinción negativa. Presentan una forma de

cilindro hueco de 300 a 400 Å de diámetro, compuesto por 10 subunidades de 400 KDa

aproximadamente, que se organizan en una estructura básica conocida como decámero, que puede

8

alcanzar una masa molecular de 3,5 a 4,5 MDa. Dentro de la clase de los bivalvos y los

gastrópodos, estos decámeros pueden asociarse como dímeros estables gracias a una interacción

cara-cara asimétrica entre ellos, dando por resultado estructuras enormes que alcanzan pesos

moleculares entre 8 a 9 MDa. Las subunidades están formadas por 7 u 8 dominios globulares

denominados unidades funcionales (FUs) de 50 KDa aproximadamente, las cuales se encuentran

ordenadas como en un collar de perlas y unidas covalentemente por pequeñas regiones flexibles

denominadas linkers constituidos por 10 a 15 aminoácidos (Fig. 1A). En cada FU se encuentran dos

centros binucleares de cobre donde se coordina reversiblemente la unión de una molécula de

oxígeno, lo que le da el color azul característico a la proteína (De Ioannes P., et al., 2004)

Gracias a profusos estudios usando diferentes condiciones experimentales que permiten

disociar y reasociar las subunidades de diferentes hemocianinas de moluscos, se ha podido dilucidar

la composición y la estructura de las subunidades en la proteína, llegando a la conclusión que tanto

KLH como CCH poseen 2 subunidades denominadas KLH1 (390 KDa) y KLH2 (350 KDa), y

CCHA (405 KDa) y CCHB (350 KDa) respectivamente, que coexisten en la circulación de los

animales. Sin embargo, en KLH las subunidades se organizan formando homodecámeros, mientras

que en CCH forman heterodidecámeros (De Ioannes P. et al., 2004) (Fig. 1C y 1D ).

Mecanismos de inmunoestimulación de hemocianinas.

El uso de KLH como un antígeno proteico modelo, debido a su poderosa inmunogenicidad

en comparación a otras proteínas como Ovalbumina, por ejemplo, ha contribuido a la comprensión

de la respuesta inmune timo dependiente y al rol que los linfocitos T (LT) CD4+ juegan en ella. Sin

embargo, el mecanismo por el cual realizan su acción inmunoestimulante es aún poco claro. No

obstante, se ha especulado que dicho efecto sería distinto a la acción linfoproliferativa producida

por fitohemaglutinina (PHA) sobre los linfocitos T, o a la proliferación de linfocitos B (LB)

inducida por el Lipopolisacarido bacteriano (LPS). Se ha postulado que la inmunogenicidad

intrínseca de estas proteínas podría relacionarse con la existencia de LB de memoria, generados por

una previa estimulación con xenoantígenos que contienen epítopos peptídicos y/o carbohidratos

similares a hemocianina, los cuales podrían ser reconocidos por una reacción cruzada, o deberse a

alguna característica fundamental de KLH desconocida hasta ahora (Harris et al., 1999).

Nuestro laboratorio ha demostrado que CCH al igual que KLH, por si sola, es decir, sin

necesidad de adyuvantes, puede prevenir el crecimiento de tumores, utilizando un modelo murino

9

Fig 1. Esquema de la organización general de hemocianinas de molusco. A. Hemocianina de gastropodo y sus componentes. B Esquema de Didecámero de hemocianina con microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa donde se aprecia la forma de cilindro hueco (Markl, 2001, con modificaciones) C. Esquema comparativo entre la estructura de KLH y la CCH, donde se representan sus organizaciones homodidecamérica y heterodidecamerica, respectivamente. D. Análisis electroforético de KLH y CCH en condiciones nativas, SDS no reductoras y SDS reductoras. Se observan las dos subunidades de KLH y CCH y se demuestra que la interacción entre ellas no involucra uniones covalentes (De Ioannes, et al., 2004, con modificaciones)

Decámero Subunidades Subunidad Didecámero

B

C

OrganizaciOrganizacióón de KLH y CCHn de KLH y CCHSUBUNITS DECAMER DIDECAMER

Homogeneous

SUBUNIDADES DECAMERO DIDECAMERO

Homodecámeros

Heterodecámeros

KLHKLH

CCHCCH

OrganizaciOrganizacióón de KLH y CCHn de KLH y CCHSUBUNITS DECAMER DIDECAMER

Homogeneous

SUBUNIDADES DECAMERO DIDECAMERO

Homodecámeros

Heterodecámeros

OrganizaciOrganizacióón de KLH y CCHn de KLH y CCHSUBUNITS DECAMER DIDECAMER

Homogeneous

SUBUNIDADES DECAMERO DIDECAMERO

Homodecámeros

Heterodecámeros

KLHKLH

CCHCCH

D

A

10

de cáncer de vejiga, disminuyendo el tamaño tumoral en ratones sensibilizados además de aumentar

su sobrevida. A su vez, se ha determinado un aumento en la actividad lítica de células Natural

Killers (NK) por efecto de dichas hemocianinas, induciendo también un patrón de interleuquinas de

respuesta de tipo Th1, caracterizado por un aumento en la expresión de INFγ (Moltedo et al., 2006).

Estos antecedentes nos han llevado a postular un mecanismo de inmunoestimulación de

hemocianinas en el cual las células dendríticas (DCs) jugarían un rol pivotal, al ser las mediadoras

de la inmunidad innata y la adaptativa, vía secreción de IL-12. Esta interleuquina induciría la

activación de las células NK, con la consiguiente secreción de INFγ, configurando una respuesta de

tipo Th1 (Fig. 2A). Para validar este mecanismo, resulta indispensable, entonces, establecer el

efecto que producen dichas hemocianinas sobre la activación y maduración de las DCs y, como

consecuencia, sobre la presentación antigénica a los linfocitos o dando señales a las células NK, o

ambas.

Las células dendríticas y su rol en la presentación de antígenos

Las DCs son conocidas como las células presentadoras de antígeno profesionales, ya que

juegan un rol clave en la iniciación y modulación de las respuestas inmunes. Fueron visualizadas

por primera vez en 1868 en la piel, siendo conocidas como células de Langerhans; sin embargo,

hace sólo 35 años, fueron reconocidas en todos los epitelios y órganos del sistema inmune,

caracterizándolas como DCs (Steinman 1991). Las DCs son capaces de activar tanto linfocitos B

como linfocitos T. Los LB son capaces de reconocer directamente el antígeno nativo a través de

inmunoglobulinas de membrana (B cell receptor, BCR); en cambio, los LT, reconocen al antígeno a

través de sus receptores (T Cell Receptor, TCR), previo procesamiento y presentación de una célula

presentadora de antígeno (antigen presentation cell, APC), en el marco de una molécula del

complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o II, (Mayor Histocompatibility Complex, MHCI

y MHCII), fenómeno conocido como restricción MHC (Banchereau y Steinman, 1998).

Las DCs pueden ser aisladas y cultivadas in vitro. Dependiendo de su origen, las DCs

humanas pueden clasificarse en, al menos, cuatro subclases: DCs derivadas de monocitos

sanguíneos CD14+, DCs intersticiales o dérmicas derivadas de células progenitoras hematopoyéticas

(hematopoietic progenitor cell, HPC) CD34+, células de Langerhans derivadas de HPCs CD34+ y

DCs plasmocitoideas (Ratzinger et al., 2004). En cambio, las DCs murinas se clasifican

dependiendo de su localización y función en: DCs mieloides y linfoides, que se distinguen por la

expresión de CD8α. Las DCs mieloides, CD8 α-, obtenidas desde células precursoras de medula

11

Fig 2. Mecanismo de inmunoestimulación de CCH y maduración de DCs. A. Mecanismos propuesto por nuestro equipo de investigación sobre la inmunoestimulación de hemocianinas. B: Comparación entre DC en estado inmaduro y DC en estado maduro, donde se mencionan las principales diferencias; de Banchereau y Steinman, 1998, modificada.

A

B

Linfocitos T

Inmunidad innata Inmunidad adaptativa

Respuesta primaria

Respuesta secundariaRespuesta secundaria

IFNγ

Células NK

TumorTumor

Células dendríticas

IL12

IFNγ

IFNγ

IL2

Linfocitos B

Respuesta tipo Th1

ADCCADCC

Linfocitos T

Inmunidad innata Inmunidad adaptativa

Respuesta primaria

Respuesta secundariaRespuesta secundaria

IFNγ

Células NK

TumorTumor

Células dendríticas

IL12

IFNγ

IFNγ

IL2

Linfocitos B

Respuesta tipo Th1

Inmunidad innata Inmunidad adaptativa

Respuesta primaria

Respuesta secundariaRespuesta secundaria

IFNγ

Células NK

TumorTumor

Células dendríticas

IL12

IFNγ

IFNγ

IL2

Linfocitos B

Respuesta tipo Th1

ADCCADCC

12

ósea, pueden pertenecer al subtipo CD4+ o CD4-, expresan CD11b+, CD11c+ y MHCII en la

superficie celular, se localizan en las zonas marginales del bazo y los nódulos linfáticos y pueden

migrar al sistema linfático periarteriolar bajo estimulación de señales inflamatorias como LPS, por

ejemplo (Banchereau, et al., 2000). El factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos

(GM-CSF) e IL3, son interleuquinas capaces de generar diferenciación de los precursores a DCs

mieloides y DC linfoides respectivamente, siendo indispensables para su sobrevida (Inaba et al.,

1992; Saunders, et al.,1996). En este trabajo, se utilizó células CD11c+, molécula que participa en la

adhesión al endotelio vascular, y que se ha establecido como el marcador general para DCs.

Las DCs inmaduras capturan y procesan antígenos en tejidos periféricos, lo que induce su

activación, migrando a los órganos linfoides secundarios, donde van a estimular a los LT naive que

poseen un TCR capaz de reconocer al antígeno presentado. Durante este proceso, las DCs aumentan

la expresión de moléculas de MHC II (señal de presentación antigénica), destinadas a interactuar

con los TCRs, y sobre expresan una serie de moléculas coestimulatorias, como CD40, CD80 y

CD86; que tienen ligandos específicos de activación en LT. También aumentan la secreción de

interleuquinas como IL12 e IL18, capaces de gatillar una respuesta celular de tipo Th1 en los LT

helper. In vitro e in vivo, sólo unas pocas DCs son necesarias para provocar una fuerte respuesta en

LT. La duración del proceso depende de la localización de las DCs y de la naturaleza del antígeno.

La presentación antigénica de las DCs es un proceso dependiente de ATP y requiere,

inequívocamente, la incorporación del antígeno y su debido procesamiento (Banchereau y

Steinman, 1998). Delamarre et al. (2005) determinaron que las DCs poseen un potencial

proteolítico limitado, lo cual aumenta la capacidad de diseminar los antígenos a través del sistema

inmune, reduciendo al mínimo la destrucción de antígenos internalizados, lo que permite que la

presentación antigénica pueda ocurrir en los nódulos linfaticos días después de haber sido

incorporados los antígenos.

La maduración de las DCs involucra una serie de eventos coordinados a nivel funcional,

fenotípico y génico. Estas modificaciones se pueden resumir en: pérdida de receptores de

endocitosis y fagocitosis, cambios en la morfología celular (aumento en la relación

superficie/volumen, por la aparición de largos procesos de membrana), cambios en los

compartimentos del MHC II, aumento en la expresión de las moléculas coestimulatorias,

modificaciones en los compartimentos lisosomales y cambios en la expresión de moléculas de

adhesión. Entre los agentes que pueden inducir maduración se encuentran el LPS, citoquinas como

TNF α y GM-CSF, y ligandos de LT como CD40L. IL10 inhibe la maduración (Banchereau y

13

Steinman, 1998). Estos cambios que se producen en las DCs pueden ser utilizados como

marcadores de maduración, por lo tanto, son herramientas que permiten evaluar la respuesta frente a

un antígeno en estudio, como en el caso de este trabajo, donde se estudió el efecto de CCH.

Sabiendo entonces que las hemocianinas son capaces de generar inmunoestimulación sin

necesidad de adyuvantes, ya que tienen una adyuvanticidad intrínseca (Frost y Lance, 1978) que

potencian respuestas de tipo Th1, nos hemos abocado a estudiar el efecto de estas proteínas sobre la

activación, maduración y su consiguiente presentación por parte de las DCs, tanto in vivo como in

vitro.

HIPÓTESIS

Las hemocianinas de gastrópodos, por sí solas, son capaces de inducir la activación y

maduración en DCs, lo cual permite activar la inmunidad innata (NK) y adaptativa, vía

procesamiento y presentación a células T naive, para generar un ambiente de citoquinas

inmunoestimulantes.

14

OBJETIVO GENERAL

Determinar la capacidad que tienen las hemocianinas en modular la maduración de las DCs,

para generar una respuesta inmunoestimulante, ya sea por un aumento en la expresión de MHC II o

por un aumento de las moléculas coestimulatorias o ambas, tanto in vitro como in vivo.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Caracterizar un cultivo de DCs murinas a partir de células precursoras de médula ósea.

2. Determinar incorporación de CCH por DCs, tanto in vitro como in vivo.

3. Estudiar el efecto de CCH completa o de sus subunidades aisladas, sobre la maduración de

DCs.

4. Estudiar la inmunogenicidad tanto in vitro e in vivo generada por CCH y sus subunidades,

deglicosiladas, generando tales condiciones en la proteina.

5. Determinar la capacidad proteolítica de las DCs, estudiando el estado de procesamiento de

CCH a diferentes tiempos de incubación.

6. Estudiar el efecto de CCH sobre las DCs a nivel de inmunidad innata, realizando co

cultivos con células NK.

15

MATERIALES

1. Animales de experimentación

Ratones C57BL/6 y C3H/HeJ, fueron adquiridos en Jackson Laboratory (Bar Harbor

USA), o en el Departamento de Biología Celular, Facultad de Odontología, Universidad

de Chile, y fueron mantenidos en el bioterio de Biosonda S.A, Chile, en un área

restringida que se mantiene a 22-24ºC, con ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, con

agua y alimento ad libitum. Los ratones utilizados tenían 2 a 4 meses de edad.

2. Reactivos

2.1. Cultivo celular.

Medio de cultivo D-MEM y RPMI 1640; Aminoácidos no esenciales (MEM NEAA,

11140); Penicilina 1x104 U/ml (100x); Streptomicina 1x104 ug/ml ; L-Glutamina

200mM (100x); Piruvato de Sodio 100mM (100X) de Gibco, USA; Suero fetal de

bovino (SFB) de Hyclon, USA; IL-2 1x104 U/ml de BD Pharmingen, USA; GM-CSF de

sobrenadante de la línea celular secretora J558L de GM-CSF (J558L-GM-CSF) donado

por el Laboratorio de Inmunología de la Facultad de Ciencias, Universidad de Santiago,

dirigido por la Dra Mónica Imarai.

2.2.1 Proteínas y compuestos biológicos.

Hemocianina de Concholepas concholepas y sus subunidades (CCH A y CCH B) de

Biosonda S. A.; Conjugados anti IGg de conejo y ratón, marcados con Isotiocianato de

Fluoresceína (FITC) y Fosfatasa alcalina (FAL), respectivamente; Ovoalbumina (OVO),

Albúmina de suero de bovino (BSA) de Pierce, USA, PNGasa F de Elizabethkingia

meningsepticum, 50U; LPS de E.coli tipo 0111.B4 de Sigma-Aldrich, USA , donado por

el Laboratorio de Inmunología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, dirigido por

María Rosa Bono.

2.3 Reactivos inmunológicos

2.3.1 Aislamiento Celular

Kit aislamiento células CD11c+, Kit aislamiento células NK, Columnas magnéticas

(MACS, magnetic cell sorting) de Miltenyi Biotec, Alemania.

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2.3.2. Determinación citoquinas

Mouse Total IL-12 ELISA Kit (Endogen, USA). Mouse IFNγ Screening Set y Mouse

TNFα ELISA de Pierce, USA.

2.3.3. Marcación de proteínas

Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (Molecular Probes, USA), CCH-Alexa 647 donada

por Bruno Moltedo, del Departamento de Microbiología, The Mount Sinai School of

Medicine, New York, USA .

2.3.4. Anticuerpos Marcados

Marcadores de superficie asociados a fluoróforos, anti-CD11c-PE (Ficoeritrina), anti-

CD11c-FITC, anti IAb-FITC, Lamp-FITC, Anti H-2Kb-PE, anti-CD49b-PE; anti-CD19-

PE; anti-CD14-PE; anti- CD3-PE de BD (Biosciences Pharmingen).

PE: Espectro de absorción de 566 nm (luz verde) y espectro de emisión de 575 nm (luz

roja).

FITC: Espectro de absorción de 488 nm y espectro de emisión de 530 nm.

3. Soluciones

3.1. Medios de cultivo y soluciones estériles

Medio de cultivo: D-MEM y RPMI 1640, Gibco, Medios de cultivo complementados

con 10% SFB; 1% aminoácidos no esenciales; 1% Glutamina; 1% antibióticos. Solución

lisis de glóbulos Rojos: NH4Cl (0.15M); KHCO3 (10Mm); NaEDTA (0.1Mm). Tampón

fosfato salino: Fosfato de sodio 0,1M, Cloruro de Sodio 0,15M pH 7,2, de Pierce. PBS-

SFB 2%.

3.1.2. Soluciones de reacción deglicosilación química

Tampón acetato 0,1M, Peryodato de sodio 15mM, pH5,5. Etilenglicol puro.

3.1.3. Soluciones de reacción deglicosilación enzimática

Solución de reacción para PNGasa en condiciones nativas (según instrucciones del

fabricante): KH2PO4 40mM, EDTA 10mM, pH 6,2.

3.2. Soluciones no estériles

Tampón fosfato salino pH 7.2, Triton X-100, Nonidet NP-40, Tween 20, SuperBlockR

de Pierce. Tampón FAL (carbonato-bicarbonato 0,2 M, MgCl2, 1mM a pH 9,64), PMSF

1mM (100x).

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3.3. Soluciones de montaje para diversos experimentos que usan células fijadas.

3.3.1. Citometría de flujo

PBS-SFB 2%; PBS-Paraformaldehído 3.7%, PBS-Tween 0,02%.

3.3.2. Inmunofluorescencia

Medio DABCO:1,4-diazobiciclo[2.2.2]octano 0,1g/ml; glicerol 90%; PBS 10%, pH 7.2,

azida 0,4mg/ml

3.3.3. Microscopía electrónicade transmisión.

Acetato de uranilo 4% en metanol 50%; Citrato de plomo 0,1% en H2O, Glutaraldehído

2% en tampón Cacodilato de Sodio 0,1 M, pH 7.4.

3.4. Soluciones de electroforesis.

3.4.1. Geles SDS PAGE en gradiente 5-15%, en condiciones reductoras.

Tampón de corrida: SDS 1 ug/ml, Tris 25mM, Glicina 192mM, pH 8,3.

Tampón de carga 4X: SDS 0,08 g/ml, Tris/HCl 50%, Glicerol anhidro 40%, β-

mercaptoetanol 4%, en PBS, pH 6,8.

3.4.2. Geles nativos de agarosa 1,5%

Tampón de corrida: Tris 100mM, Ácido Bórico 500 mM, pH 7,4

Tampón de carga 2x: Glicerol anhidro con azul de bromofenol.

3.4.3. Tinción geles

Solución de fijación: Metanol 50% y Ácido Acético 10% en H2O.

Solución de tinción: Metanol 50%, Ácido Acético 10% y 0,1% Coomasie en H2O.

Solución de decoloración: Metanol 5% y Ácido Acético 7%, en H2O.

3.5. Soluciones de inmunowesternblot

Tampón de transferencia: Tris base 25mM, Glicina 192 mM, Metanol 20%.

Solución bloqueadora de membrana: PBS-Caseína 1%.

Solución de revelado: 1 StepTM NBT/BCIP, de Pierce.

3.6. Cuantificación de proteínas

Reactivo Coomasie (Coomasie Plus Protein Reagent,), BSA stock de Pierce.

18

4. Materiales plásticos y otros

Tubos cónicos de 15 y 50 ml (Axygen, USA); pipetas de 1, 2, 5, 10 y 25 ml; placas de

Petri; tubos Eppendorf; botellas 50, 75, 200 ml; placas 24 pocillos; Filtros Millex GV

0,22 µm; Millicell de 0,4um (Transwell), Stericup de 250, 500 y 1000 ml, 0,22µm

(Millipore); placas de ELISA de 96 pocillos de poliestireno fondo plano; Cámara de

Neubauer; Jeringas de 1,5 y 10 ml de Terumo, USA. Tubos Khan. Porta y cubre objetos.

5. Equipos

Lector ELISA 7520 con filtros de absorción a 405 nm, 450 nm, 490 nm y 600 nm

(Cambridge Technology, Inc). Estufa de cultivo de células, con regulación de CO2 y

temperatura (Nuaire). Campana de flujo laminar (Clean Room Procusts, Inc). Baño

termoregulado (Lab-Line). Microscopio de contraste de fase (Nikon). pH metro (Orion 3

Star). Balanza analítica; Balanza granataria electrónica (Sartorius). Microcentrifuga

(Ependorff). Citómetro de flujo laminar (Beckton Dickinson, Facultad de Ciencias,

Universidad de Chile). Microscopio de barrido láser confocal Olympus Fluoview FV-

1000 (Japan). Microscopio Electrónico de Transmisión (Phillips Tecnai 12, Servicio

Microscopía Electrónica Pontificia Universidad Católica). Lavador de placas ELISA

(Bio-Tek). Separador Magnético (MACS); Microscopio de luz invertido; Agitador de

células (Labnet, USA); Amicon (Millipore).

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MÉTODOS

1. Aislamiento y cultivo de DCs.

1.1. Extracción de precursores de médula ósea murina y diferenciación a DCs.

El aislamiento celular se realizó según Inaba et al., 1992, con modificaciones. Ratones

de la cepa C57BL/6 de alrededor dos meses de edad, fueron sacrificados por dislocación

cervical, para luego extraerles la tibia y el fémur quirúrgicamente y bajo el ambiente de

una campana de flujo laminar, removiendo el músculo y colocándolos en una solución

de etanol 70% por 1 min. Luego, cortando las puntas de los huesos con tijeras, se

perfundió la médula ósea con una jeringa de 2,5 ml con medio de cultivo RPMI 1640.

Una vez colectada la médula, se centrifugó a 1.600 rpm por 8 min Se eliminó el

sobrenadante y se resuspendieron las células en 1 a 2 ml de solución de lisis de glóbulos

rojos durante 2 min, deteniendo su efecto mediante la adición de 3 veces el volumen de

medio. Se centrifugó nuevamente a 1.600 rpm por 8 min. Se eliminó el sobrenadante y

se resuspendieron las células en medio RPMI 1640 complementado con suero fetal

bovino 10% (SFB), aminoácidos no esenciales 1%, glutamina 1% y antibióticos 1%

(Penicilina y Estreptomicina) y además factor estimulante de colonias de monocitos y

granulocitos (GMCSF) diluido 1:30. Se contaron las células en un microscopio de luz

con una cámara de Neubauer y se sembraron en placas de 24 pocillos 1x106 células por

ml. El cultivo se mantuvo en una estufa a 37ºC y en un ambiente al 10% de CO2 y 100%

de humedad. El medio de cultivo fue removido completamente a los 2 y 4 días y se

reemplazó por medio fresco.

1.2. Enriquecimiento de DCs.

El protocolo de aislamiento corresponde al indicado por el proveedor del Kit de

aislamiento CD11c+ de Miltenyi. Al quinto día de haber extraído los precursores de

médula ósea del ratón, las células fueron recolectadas y contadas, y luego fueron

centrifugadas a 1.000 rpm por 10 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron

las células en una relación de 400 ul de tampón de columna para 1x108 células. Las

células fueron incubadas con un anticuerpo anti-CD11c+ que tiene unido esferas

magnéticas a razón de 100ul para 1x108 células por 15 min a 4ºC. Luego se hicieron

pasar por una columna imantada, realizándose de esta forma una selección positiva al

retener la columna a las células CD11c+, eluyendo el resto. Luego, sacando la columna

del campo imantado se eluyeron las DCs.

20

1.3. Cultivo de DCs.

Las células aisladas fueron contadas y se sembraron entre 0,5 a 1x106 células por ml, en

placas de 24 pocillos, en medio RPMI 1640 complementado, listas para ser estudiadas.

2. Aislamiento y cultivo de células NK

2.1. Extracción de células mononucleares y aislamiento de NK.

Ratones de la cepa C57BL/6 de alrededor dos meses de edad, fueron sacrificados por

dislocación cervical, se les extrajo quirúrgicamente el bazo bajo campana de flujo

laminar y se depositó sobre una placa de Petri con 5 ml de medio D-MEM. Se

perfundieron cuidadosamente y se colectó las células con pipeta Pasteur, luego se

centrifugó por 20 min a 1.800 rpm. Los glóbulos rojos fueron lisados agregando a cada

bazo 1 ml de solución de lisis de glóbulos rojos durante 2 min y luego se agregó 10 ml

de medio D-MEM completo y se centrifugó nuevamente por 20 min a 1.800 rpm. Se

eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio D-MEM completo. Se

contaron las células y luego se centrifugaron durante 10 min a 1.200 rpm y se prosiguió

al aislamiento de las células NK según las indicaciones del Kit de aislamiento de células

NK de Miltenyi Biotec. Este kit realiza una selección negativa de NKs, ya que no las

retiene al hacerlas pasar por un campo magnético, previo marcaje del resto de las

células con antiCDs específicos, unidos a esferas mágneticas, las cuales quedan pegadas

al iman. Con este procedimiento se obtuvo un 70% aprox. de células NK.

2.2. Cultivo de células NK

Se cultivaron 5x105 células por ml en placas de 24 pozos, solas o en co-cultivo con DCs

y NKs de 2 días (relación 1:1), con contacto celular o con sistema de placas de cultivo

transwell, en medio D-MEM completo suplementado con IL-2 (1x104 U/ml) y 2-β ME

(2x10-5 M), en una estufa a 37ºC y en un ambiente 10% CO2 y 100% humedad.

3. Análisis por microscopía de luz con contraste de fase (MLCF)

Los cultivos DC o cocultivos NK/DC fueron fotografiados directamente en los pozos,

durante los tiempos indicados, tratados o no con 100 ug/ml de CCH o 100 ng/ml de

LPS. Se utilizó para ello un microscopio de luz equipado con contraste de fase del

21

Servicio de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Católica de Chile, dirigido

por Alejandro Munizaga

4. Análisis por microscopía confocal

5x105 a 1x106 células fueron incubadas en un pozo que contiene un cubre objeto

circular, donde se adhieren las células. El sobrenadante fue retirado y se fijaron las

células en el mismo pozo con 500 ul de PBS-Paraformaldehído 3.7%, por 20 min a

25ºC. Luego se retiró el cubre objeto y se montaron con una gota de DABCO en un

portaobjeto para ser analizados por el Servicio de Microscopía Electrónica, Pontificia

Universidad Católica de Chile, dirigido por Alejandro Munizaga.

5. Análisis por microscopía electrónica de transmisión

Los cultivos DC o cocultivos NK/DC fueron tratados según el método general descrito

por Luft, 1961. Se centrifugaron y fijaron en un pellet de 5x105-1x106 con

glutaraldehído al 2 % en tampón cacodilato de sodio 0.1 M, pH 7.4 y luego fueron

postfijados con OsO4, deshidratados y embebidos en Epon (Poliscience). La resina se

polimerizó a 60ºC durante 48 hr y luego se realizaron cortes finos de 400-500 Å de

grosor en un ultramicrótomo. Los cortes se recogieron en grillas de cobre y se tiñeron

con acetato de uranilo al 4% en 50% metanol durante 1-5 min, se lavaron con 50%

etanol frío, y luego se tiñeron con citrato de plomo de acuerdo al método descrito por

Reynolds, 1963. Finalmente se lavaron con agua destilada y se observaron al

microscopio electrónico a 80 KV. Este protocolo fue realizado por el Servicio de

Microscopía, Pontificia Universidad Católica de Chile, dirigido por Alejandro

Munizaga.

6. Marcación de proteínas con Alexa488

Se utilizó el procedimiento descrito por el fabricante. A 1ml de CCH (10mg/ml) se

agregó 100 µl de Bicarbonato de Sodio. Paralelamente se disolvió un vial del fluoróforo

en Dimetilformamida y se dejó agitando por 1 hr. Se neutralizó por 30 min con 100 µl

de Hidroxilamina y se dializó para eliminar el exceso de reactivo. Se usó un sistema

Amicon Ultra Free para eliminar los agregados y esterilizar la preparación. CCH-

Alexa647 fue donada por Bruno Moltedo, del Departamento de Microbiología, The

Mount Sinai School of Medicine, New York, USA.

22

7. Tinción negativa de proteínas.

Las proteínas fueron teñidas también según el método de Fernández-Morán et al., en

1966, con modificaciones según De Ioannes P., et al., 2004. Distintas concentraciones

de muestra se colocaron en grillas de cobre recubiertas por Parlodion al 3% en acetato

de amilo. Luego las muestras fueron teñidas por 1 min con 10 ul de acetato de uranilo al

2%. Las grillas fueron secadas en una pieza libre de humedad y observadas en un

microscopio electrónico Phillips Tecnai 12, en el servicio de Microscopía Electrónica,

Pontificia Universidad Católica de Chile, dirigido por Alejandro Munizaga.

8. Análisis por citometría de flujo.

8.1. Preparación de muestras.

Cultivos DCs o co cultivos NK/DC, tratados con diferentes concentraciones de CCH,

CCH-Alexa488, CCH-Alexa647, OVO y/o LPS, a los tiempos indicados, se

resuspendieron las células del pozo por suave pipeteo y se recolectaron en tubos

Ependorff. Se centrifugaron a 6.000 rpm por 3 min, eliminándose el sobrenadante y

resuspendiendo en 200 ul de PBS-SFB 2%. Luego se agregó 1,5 ul del Ac de interés

asociado a un fluoróforo (antiCD11c+-PE o FITC, anti IAb-FITC, anti H-Kb-PE, anti

Cd86-FITC, anti-CD49b-PE; anti-CD19-PE; anti-CD14-PE; anti-CD3-PE) por 20 min.

a 4ºC. Se centrifugó a 6.000 rpm por 3 min, se eliminó el sobrenadante y se lavaron las

células con 250 ul de PBS-SFB 2%. Se centrifugó nuevamente y se eliminó el

sobrenadante. Para fijar las células, se resuspendieron en 200 ul de PBS-

Paraformaldehído 3.7% a 25ºC por 30 min. Se centrifugó, se eliminó el sobrenadante y

se resuspendieron las células en 300 ul de PBS-SFB 2%.

Para los experimentos con células permeabilizadas, luego de ser fijadas, las células se

resuspendieron en 200 ul de PBS-Triton 0,5%, por 20 min, a 25 ºC. Se lavaron y se

eliminó el sobrenadante. Para analizar incorporación de CCH en DCs permeabilizadas,

se incubaron las células en 200ul de suero de ratón pre inmune (1:125) por 24 hrs, a

4ºC. Luego se centrifugaron las células, y resuspendieron en 200 ul de suero anti-CCH

policlonal de conejo (1:250) por 1 h a 25ºC. Se centrifugó, se lavó y se resuspendió con

un conjugado Anti IgG de conejo marcado con FITC (1:250), por 1 h a 25ºC. Se

centrifugó, se lavó y se resuspendió en 300ul de PBS-SFB 2%.

Para analizar la expresión de Lamp en DCs permeabilizadas, se incubó en 200 ul de

23

PBS-SFB 2%-Triton 0.05%, con 1,5 ul anti Lamp-FITC por 20 min a 25ºC. Se

centrifugó, lavó y resuspendió en 300 ul de PBS-SFB 2%. Las células, listas para ser

analizadas por citometría de flujo, se traspasaron a tubos Khan, y fueron analizadas en

el laboratorio de Inmunología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, dirigido por

María Rosa Bono.

Los controles usados fueron: a cada tiempo de análisis, DCs no tratadas, como control

de autoflorecencia, DCs marcadas sólo con CD11c para establecer la población DC+,

DCs incubadas sólo con CCH-alexa488 o CCH-Alexa647 para el análisis de la perdida

de capacidad fagocítica y DCs incubadas sólo con el conjugado Anti-IgG de conejo

marcado con FITC, para el análisis de incorporación de CCH.

8.2. Criterio para la determinación de la población de DC por citometría de flujo.

Los resultados de la citometría fueron analizados por el programa computacional

WINMDI. En este programa se trabajaron los datos con gráficos del tipo densidad de

puntos e histogramas. En el primero de estos gráficos se determinó una población de un

cierto tamaño y granulosidad (size scatter v/s forward scatter, SSC v/s FSC)

característico para DCs. Esta población se analizó para establecer que porcentaje

presenta el marcador CD11c+, el cual es el marcador específico más utilizado en la

literatura para reconocer una población de las DCs. Se analizó entonces en FSC v/s FL1

o FL2 (canales en los cuales se lee la fluorescencia de FITC o PE, respectivamente) y se

estableció la población positiva para el marcador, como se muestra en la figura 3C La

intensidad de esta marca se analizó luego con el gráfico de histograma.

9. Análisis por ELISA para medición de citoquinas.

Para medir las citoquinas IL12, TNF α y INF γ, se tomó 125 ul de sobrenadante de

medio de cultivo de DCs o cocultivos NK/DC, a diferentes tiempos. Se guardaron los

sobrenadantes a -20ºC hasta su uso (aprox. 3 semanas) La concentración de citoquinas

se midió por un test de ELISA de captura con kit comerciales, según los protocolos del

fabricante, los cuales tienen incorporados estándares de concentración conocida. La

lectura de la reacción se realizó a 450 nm.

Como controles se usaron suero de ratones no inmunizados, medios de cultivo

complementados sin células y medios de cultivo de DC complementados y con IL-2.

24

10. Análisis por Westernblot (WB) para determinar degradación de CCH.

Para determinar si las DCs eran capaces de degradar CCH a diferentes tiempos, se

realizó IMB con extractos de 2x106 DC, siguiendo el protocolo descrito por Towbin, et

al., en 1979, con modificaciones. Se incubó con CCH a diferentes tiempos y las células

fueron lavadas y resuspendidas en Suero Fisiológico (0,9% NaCl), 0,5%Nonidet P-40 y

10uM de PMSF (inhibidor de serina-proteasas) por 20 min. Luego se agregó tampón de

carga de electroforesis 4x en condiciones reductoras y se calentó a 100ºC por 5 min. Las

muestras fueron corridas en un gel de gradiente del 5-15% SDS-PAGE y transferidas a

una membrana de Nitrocelulosa por 4hr a 100 miliAmp. La membrana se bloqueó con

PBS-1% Caseína toda la noche, y fue incubada con suero antiCCH policlonal de conejo

(1:2000) por 3 hrs, a 25ºC. Se lavó la membrana con PBS-0,02% Tween dos veces por

10 min, y se incubaron con Anti IgG de conejo marcado con FAL, por 1hr a 25ºC.

Luego se lavó nuevamente y se incubó con el reactivo 1-StepTM NBT/BCIP, hasta la

aparición de las bandas. Como control se usaron extractos sin CCH y extractos a los

cuales se les agregó CCH al momento de realizarlos.

11. Desglicosilación de CCH e Inmunización para evaluar título de Ac.

11.1. Desglicosilación química

11.1.1. Preparación de la proteína

El protocolo empleado se obtuvo de “The protein protocols, Handbook”, de Walker

JM, (1996). Se dejó incubando 0.5 mg/ml de CCH, CCH A y CCH B en una solución

con tampón acetato 0,1M y Peryodato de sodio 15mM (concentración para

desglicosilación completa), por 1 h en oscuridad, a 25ºC. Luego el exceso de peryodato

se eliminó agregando 25 ul de etilenglicol puro y se dejó reposar las muestras a 4ºC

toda la noche. Las muestras se concentraron con el sistema Amicon ultra-15, hasta

alcanzar un volumen de 3 a 4 ml. Luego fueron dializadas toda la noche contra PBS

para eliminar el tampón acetato.

11.1.2. Análisis electroforéticos de proteínas desglicosiladas químicamente.

Las proteínas nativas y desglicosiladas se analizaron por electroforesis en geles nativos

de agarosa 1,5%, según el procedimiento de Becker et al., 2007, y por geles en

gradiente del 5-12% SDS-PAGE en condiciones reductoras, según el procedimiento

25

general descrito por Laemmli en 1970, con modificaciones. Los geles nativos fueron

corridos por 4 hrs a 20 volt. Se cargó 2,5 ug de proteína por pozo. Las proteínas fueron

diluidas en el tampón de corrida y tampón de carga 1:1. El gel fue teñido con Azul de

Coomasie. Geles en gradiente del 5-12% SDS-PAGE en condiciones reductoras fueron

cargados con 5 ug de proteína, tampón carga 4x y corridos por 12 hrs a 40 volt y teñidos

con Azul de Coomasie.

11.2 Desglicosilación enzimática.

11.2.1. Preparación de la proteína

Para la desglicosilación enzimática se utilizó la enzima Peptide-N-glycosidase F

(PNGasa F, Sigma), la cual corta las uniones de Asparragina con el oligosacarido. El

protocolo que se siguió fue desglicosilación en condiciones nativas, según el

procedimiento del producto, con variaciones. Brevemente, 1 mg/ml de proteína (CCH,

subunidades de CCH y Fetuína como control positivo) se incubaron con 10 unidades de

enzima (20 ul) a 37ºC por 6 días. Luego las muestras se dejaron a 4ºC. Por

electroforesis se comprobó la desglicosilación.

11.2.2. Análisis en geles SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Geles en gradiente 5-12% SDS-PAGE en condiciones reductoras, fueron cargados con 5

ug de proteína, salvo la fetuína (control positivo) que se cargó 7,5 ug en tampón de

carga 4x, y fue corrido por 12 hrs a 40 volt y teñido con reactivo Coomasie.

11.3. Inmunización de animales de experimentación.

2 ratones de las cepas C57BL/6 y C3H/HeJ, fueron inmunizados vía intraperitoneal, dos

veces cada 14 días con 150 ug de proteína (CCH, CCH A, CCH B, nativas y

desglicosiladas, tanto de forma química, como enzimática) y sangrados 28 días después

de la primera inmunización. Se obtuvieron los sueros y se midió el título de Ac. contra

el antígeno homólogo y heterólogo para determinar el grado de reacción cruzada.

11.4. Cuantificación de título de Anticuerpos contra CCH o sus subunidades mediante

ELISA.

Se utilizó el procedimiento general descrito por Crowther y Abu-Elzeein., en 1980, con

26

modificaciones. Placas para ELISA de 96 pocillos, fueron activadas durante toda la

noche a 4ºC con 100ml/pozo de una solución del antígeno (CCH o sus subunidades, con

y sin tratamiento de desglicosilación), a una concentración de 10mg/ml. Posteriormente,

se realizaron 3 lavados con 250ml/pozo de PBS-0,02% Tween y se procedió a bloquear

los sitios reactivos remanentes de la placa con 250 ml/pozo de SuperBlock (Pierce), por

1 h a 25°C. Se realizaron 3 lavados de 250 ml/pozo con PBS-0,02% Tween. Luego se

incubaron los sueros en diluciones seriadas con un factor de 2 (de 1:10 a 1:1280). Las

diluciones de los sueros se realizaron con SuperBlock y se dejó incubando por 3 h a

37°C. Se realizaron 3 lavados, de 250 ml/pozo con PBS-Tween 0.02% y se agregó

100ml/pozo de SuperBlock con anti IgG de ratón marcado con FAL, y se incubo por 1 h

a 37ºC. Se hicieron 3 lavados de 250ml/pozo con PBS-Tween 0,02 %.Luego se colocó

100 ml/pozo de una solución 1 mg/ml de pNPP en tampón FAL (carbonato-bicarbonato

0,2 M, MgCl2 1mM a pH 9,64) y se dejó incubando durante 15 a 30 min a 37°C. La

reacción fue detenida con 100ml/pozo de NaOH 3N y se leyó la DO a 405 nm.

El título de Ac se estableció como la dilución en que la absorbancia máxima obtenida

decae a la mitad. Las mediciones se realizaron tres veces, y se empleó para su análisis

estadístico ANOVA de dos vías, del programa computacional GraphPad Prism 4.

27

RESULTADOS

1. Caracterización de cultivos de DCs murinas a partir de células precursoras de médula

ósea.

Para la obtención del cultivo de DCs a partir de precursores de médula ósea, se siguió el

protocolo descrito por Inaba et al. (1992), en ratones de la cepa C57BL/6. Al quinto día de

extraídas las células, se estableció como tiempo cero. Durante la primera etapa de trabajo,

dedicada a establecer la incorporación de CCH por DCs, no se trabajó con cultivos enriquecidos

en dichas células. Sin embargo, debido a la heterogeneidad morfológica del cultivo, observadas

por MLCF, fue necesario enriquecerlos en DCs para descartar efectos de otros tipos celulares

como macrófagos y fibroblastos. El cultivo, entonces, fue enriquecido con el Kit de aislamiento

CD11c+ de Miltenyi. La caracterización de la población DC, se llevó a cabo por diversas

metodologías que permitieron analizar sus características morfológicas y también la expresión

de los antígenos CD (cluster of diferentiation, grupos de diferenciación) propios de esta

población de células. Por MLCF se observó una población relativamente homogénea,

destacándose células de gran tamaño adheridas al sustrato y con procesos de membrana que

incrementaron en número y longitud en el transcurso del tiempo (Fig 3A). Por MET se analizó

con mayor detalle el fenotipo celular, destacándose la presencia de numerosos organelos,

grandes vacuolas, vesículas y lisosomas primarios, propios de este tipo celular (Fig 3B).

Al analizar por citometría de flujo cultivos no enriquecidos, se encontró que un 15-38%

de la población expresaba el marcador CD11c+, específico de DCs y sus subclases. En cambio,

en cultivos enriquecidos, fue de un 60-75% (Fig 3C). En estos últimos, se determinó el

porcentaje de otros tipos celulares contaminantes, encontrándose en un experimento

representativo que el 1% correspondía a linfocitos T (CD3+), 0,6% a linfocitos B (CD19+),

2,25% a células NK (CD49b+) y 1,25% a macrófagos (CD14+). Por el tamaño y la granulosidad

de la población que no presentó marca se asumió que se trataba de células muertas.

2. Determinación de la incorporación de CCH por DCs in vitro e in vivo.

Para determinar si las DCs incorporan CCH, en primer lugar, se incubó 1x106 células

con CCH-Alexa488 (100 ug/ml). Por microscopía confocal, se observó que existe

colocalización entre las células marcadas con CD11c+-PE y las que presentaron la marca del

fluoróforo (Fig 4A). Sin embargo, esto no indicaba si la proteína estaba ingresando a la célula o

si sólo estaba asociada a la membrana. Para determinar si efectivamente CCH estaba al interior

28

Fig 3. Establecimiento y caracterización de la población DC. A. MLCF de un cultivo DC de 8 días, donde se aprecia un cultivo relativamente homogéneo, con células adheridas al sustrato, y aspecto fusiformes. B. MET de DC de 5 días, donde se observa su enorme tamaño y morfología característica: gran número de organelos y vesículas, procesos membranosos y una alta relación citoplasma/núcleo. C. Caracterización de la población DC por citometría de flujo en un cultivo enriquecido. Se indica el porcentaje de células CD11c+, que varió entre 52%-70%.

C

B

A

R1: 87,36% R2: 62,19% R1: 87,36% R2: 62,19%

29

0 50 100 150 2000

25

50

75

100

Células no permeabilizadas

Células permeabilizadas

Tiempo (min)

% C

D11c+

con C

CH

50 u

g/m

l

DCs permeabilizadas

15,29% 19,72% 25,02% 31,27%

Sin CCH >30 min 60 min 180 min

Anti-IgG de conejo-FITC

CD

11

c+P

E c

élu

las

DCs no permeabilizadas

15,33% 18,80% 55,64% 78,33%

0 50 100 150 2000

25

50

75

100

Células no permeabilizadas

Células permeabilizadas

Tiempo (min)

% C

D11c+

con C

CH

50 u

g/m

l

0 50 100 150 2000

25

50

75

100

Células no permeabilizadas

Células permeabilizadas

Tiempo (min)

% C

D11c+

con C

CH

50 u

g/m

l

DCs permeabilizadas

15,29% 19,72% 25,02% 31,27%

Sin CCH >30 min 60 min 180 min

Anti-IgG de conejo-FITC

CD

11

c+P

E c

élu

las

DCs no permeabilizadas

15,33% 18,80% 55,64% 78,33%

DCs permeabilizadas

15,29% 19,72% 25,02% 31,27%

Sin CCH >30 min 60 min 180 min

Anti-IgG de conejo-FITC

CD

11

c+P

E c

élu

las

DCs no permeabilizadas

15,33% 18,80% 55,64% 78,33%

Células CD11c+ CCH-AlexaFluor 488 ColocalizaciónCélulas CD11c+ CCH-AlexaFluor 488 ColocalizaciónA

B

Fig 4. Análisis de la incorporación de CCH por DCs. A. Microscopía confocal de DCs de 5 días, incubadas con CCH-Alexa488 (100 ug), a tiempos <30min. En color rojo se aprecia la marca del Ac anti-CD11c+, en verde la marca del fluoróforo, y luego, al sobreponerlas, se aprecia en amarillo las zonas de probable colocalización. B. Análisis de incorporación de CCH por citometría de flujo en DCs permeabilizadas y no permeabilizadas, a diferentes tiempos, incubando con CCH (50 ug), y revelado con suero anti-CCH de conejo y anti-IgG de conejo conjugado con FITC. Se observa el rápido aumento de las DCs-CCH+, al permeabilizó, en comparación a las no permeabilizadas.

30

de las DCs, realizamos un análisis por citometría de flujo de DCs incubadas con CCH (50

ug/ml) a diferentes tiempos (>30, 60, 180 min), tanto en células permeabilizadas como no

permeabilizadas (ver Métodos 8.1). La presencia de CCH se reveló a través de un suero anti-

CCH de conejo y de una incubación posterior con un conjugado anti-IgG de conejo marcado

con FITC. En las DCs permeabilizadas, donde los Ac anti-CCH pueden detectar a la proteína en

el interior de la célula, obtuvimos un aumento de la población DC-CCH+ en el tiempo, que

alcanzó un 78,33% a los 180 min. Sin embargo, en DCs no permeabilizadas, es decir, donde los

Ac anti-CCH sólo se unen a CCH localizada en la membrana plasmática de la célula,

encontramos un aumento menor de esta población, llegando a un 31,27% en el mismo tiempo de

análisis (Fig 4B).

Al analizar por MET las DCs incubadas en forma permanente con CCH, se encontró

que la proteína es incorporada por un proceso de endocitosis vía vesículas de clatrina,

observándose la formación de una vesícula rodeada por el “canastillo” característico que forma

esta proteína (Fig 5A). Luego, a 1 h y 24 h de incubación, se observó moléculas intactas de

CCH en vesículas de un contenido claro y con membranas similares a las de vacuolas y

lisosomas, lisas y menos electrón densas, en comparación a las con clatrina, como se muestra en

la Fig 5B. Por el contrario, al realizar incubaciones de pulsos de CCH durante 24 h, y

observando a las 48 h, no encontramos moléculas de hemocianinas en dichas vesículas. Estos

resultados fueron corroborados por estudios in vivo, en donde se inyectó vía intraperitoneal

CCH-Alexa 488 (100 µg) y CCH (100 µg), como control negativo, en ratones C57BL/6, y

luego, analizando en exudado peritoneal a diferentes tiempos, se encontró presencia de la marca

fluorescente de un 15,3% a las 72 h, en la población CD11c+ (Fig 5 C).

Del conjunto de estos resultados, concluimos que CCH fue incorporada por DCs

rápidamente (<30 min), localizándose también en la membrana plasmática, sin ingresar a la

célula, hasta 180 min. In vivo, se detectó CCH en DCs hasta 72 h después de haber sido

inyectados los ratones.

3. Efecto de CCH sobre la maduración de DCs

Dado que determinamos que CCH es incorporada por DCs a tiempos tempranos de

incubación, el paso siguiente fue conocer si CCH tenía efecto sobre su maduración. Para ello,

evaluamos diversos parámetros que diferencian una DC inmadura de una madura, tales como

cambios en su morfología, y también cambios funcionales, como una mayor expresión de

MHCII y moléculas coestimulatorias, aumento en la secreción de IL12 y pérdida de la

capacidad fagocítica. Este conjunto de parámetros fueron evaluados y nos permitieron

establecer si tal condición era inducida por CCH. Hay que hacer notar, que la hemocianina

31

Control DCs 1 h con CCH 24h con CCH 48h con pulso 24hB

C

A

FL1-Height

FSC-Height

Tiempo 24 h 48 h 72 h

CCH-Alexa 488

CC

H-A

lexa

C

on

tol,

CC

H 94% 3,4% 97,3% 0,3% 95,6% 2,3%

81,2% 16,1% 85,3% 12,3% 83,2% 15,3%

FL1-Height

FSC-Height

Tiempo 24 h 48 h 72 h

CCH-Alexa 488

CC

H-A

lexa

C

on

tol,

CC

H 94% 3,4% 97,3% 0,3% 95,6% 2,3%

81,2% 16,1% 85,3% 12,3% 83,2% 15,3%

Fig 5. Análisis de la incorporación de CCH por DCs. A. MET, DCs incubadas con CCH (100 ug) a diferentes tiempos. Se observa la endocitosis de la proteína vía vesículas de clatrina en tiempos tempranos de incubación. B. CCH muestra una localización en vesículas y/o lisosomas secundarios. A las 48 h de incubación, luego de un pulso de 24 h, ya no se observan moléculas intactas. C. Incorporación in vivo de CCH, inyectando CCH-Alexa488 (100 ug) y CCH (100 ug) como control, intraperitonealmente. Se detectó presencia de CCH hasta las 72 h, en un 15% de la población DC.

32

utilizada en estos experimentos es libre de LPS, lo cual fue certificado a través de un ELISA

comercial específico para LPS realizado por Biosonda S.A., y mediante bioensayos en ratón,

realizados por el Departamento de Microbiología, de la Escuela de Medicina de The Mount

Sinai, New York, USA.

En primer lugar, por MLCF y MET, observamos cultivos de DCs de 8 días, incubados

con pulsos de 24 h de CCH (100 ug/ml) y de LPS (100 ng/ml), no detectándose diferencias

entre los cultivos control y los experimentales, tanto en su distribución como en su morfología;

tampoco se observó cambios morfológicos al comparar células con y sin CCH, no

encontrándose moléculas de CCH íntegras en el interior de vesículas. En cambio, al observar los

cultivos incubados con LPS, si se observaron diferencias notables en el aspecto del cultivo, las

células presentaron una apariencia más redondeada, con pérdida de los procesos de membrana y

claros indicios de haber entrado en apoptosis: presencia de cuerpos electrón densos, vesículas

multilaminares y pérdida de la integridad de mitocondrias, reflejada en la ruptura o ausencia de

las crestas mitocondriales (Fig 6A).

Al medir la secreción de IL12 se encontró un aumento significativa a las 72 h con

respecto al control, por efecto de CCH (p≤0,05). En las DCs incubadas con LPS (control

positivo), se detectó un notable aumento a las 24 h que se mantuvo en el tiempo (Fig 6B). De

igual forma, se midió la secreción de TNF α y INF γ hasta las 72 h, y de acuerdo a lo esperado,

no se encontró dichas citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos de DCs (datos no

mostrados).

Posteriormente, por citometría de flujo, evaluamos la expresión temporal de MHCII y

de la molécula coestimulatoria CD86, inducidas por CCH (100 ug/ml) y LPS (10 y 100 ng/ml)

como control positivo, encontrando que no hay cambios hasta las 72 h en ninguna de las

condiciones respecto a las células control no tratadas, lo cual se corroboró por la intensidad de

la fluorescencia de estas poblaciones (Fig 7A y 7B). Para determinar si CCH podría presentarse

en forma cruzada, es decir, que pudiera ser vista como un antígeno propio, se evaluó la

expresión de MHCI en el tiempo. No se encontró diferencias hasta las 72 h, al comparar con el

control sin tratamiento. Sin embargo, fue llamativo el aumento encontrado con una proteína no

relacionada como Ovoalbumina (OVO), tanto en el porcentaje de la población MHCI como en

la intensidad de la fluorecencia, fenómeno que atribuimos a una contaminación con LPS

presente en esta proteína (datos no mostrados).

Al medir la expresión de Lamp (proteína asociada a membrana lisosomal) en DCs

permeabilizadas, encontramos un aumento del 67,11% de la población Lamp+, a las 72 h de

33

DCs Control DCs CCH DCs LPS

Mic

rosc

opia

ele

ctro

nica

Mic

rosc

opía

de

luz

DCs Control DCs CCH DCs LPS

Mic

rosc

opia

ele

ctro

nica

Mic

rosc

opía

de

luz

A

IL 12

DC DC CCH DC LPS0

5000

10000

1500024 h48 h72 h

1* P< 0,05 DC CCH v/s DC, a 72 h2*** P< 0.0001 DC LPS v/s DC, DC CCH a 24 h3** P<0.01 DC LPS v/s DC CCH a 48 h y 72 h

1*

2***3**

pg/m

l IL1

2

B

Fig 6. Efecto de CCH sobre la maduración de DCs. A. Microscopia de luz con contraste de fase y MET, en DCs de 8 días, incubadas durante 48 h con CCH (100 ug) y LPS (100 ng), con un pulso de 24 h. No se observan diferencias entre las DC tratadas con CCH y las células no tratadas. Las flechas indican presencia de cuerpos multilaminares y pérdida de la integridad de mitocondrias en DCs tratadas con LPS. B. Secreción de IL12 determinado por ELISA. Los resultados representan 5 experimentos independientes, en que 1x106 cél/ml fueron incubadas con CCH o LPS a distintos tiempos.

34

Población CD86

DC DC CCH DC LPS0.0

2.5

5.0

7.5

10.024 h48 h72 h

%

Intensidad CD86

DC DC CCH DC LPS1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.024 h48 h72 h

vece

s de

aum

ento

Intensidad MHC II

Contro

lCCH

LPS 10

ng

LPS 10

0 ng

0

1

2

3

4

524 h48 h72 h

vece

s de

aum

ento

Población MHCII

Contro

lCCH

LPS 10 ng

LPS 100 n

g05

1015202530354045

24 h48 h72 h

%

Población Lamp

Control

CCH

LPS 10 ng

LPS 100 n

g0

10

20

30

40

50

60

7024 h48 h72 h

%

Intensidad Lamp

Control

CCH

LPS 10 ng

LPS 100 ng

0.0

2.5

5.0

7.524 h48 h72 h

vece

s de

aum

ento

A

B

C

Fig 7. Efecto de CCH sobre la maduración de DCs: Expresión de marcadores de maduración evaluados por citometria de flujo. A. La expresión de MHCII, no aumentó por efecto de CCH ni LPS en el tiempo, tanto en el porcentaje como en la intensidad de la marca fluorecente. Resultado representativo de 4 experimentos independientes. B. La expresión de la molécula coestimulatoria CD86, tampoco aumento por efecto de CCH en el tiempo, y sólo lo hizo por efecto de LPS a las 24 h, usado como control positivo. Resultado preliminar de un solo experimento. C. CCH aumento la expresión de Lamp a las 72 h de incubación, en comparación a las células no tratadas. Resultado representativo de 3 experimentos independientes.

35

haber incubado CCH con respecto a las no tratadas, lo cual se refleja también, en un aumento en

la intensidad de la fluorescencia de 1.88 veces; aumento 7.5 veces en las incubadas con CCH y

4 veces en las no tratadas(Fig 7C).

Finalmente, también se evaluó la pérdida de la capacidad fagocítica de las DCs frente a

CCH marcada con dos fluoróforos diferentes y agregadas en forma diferida. Se observó que,

tanto a las 30 h como a las 78 h de haber incubado con CCH-Alexa488 (verde), sólo un 10% de

la población deja de incorporar CCH-Alexa647 (rojo), cuando se agregó en un pulso de 6 h , lo

cual señaló que el haber incorporado CCH no generó una pérdida en la capacidad fagocítica de

las células (Fig 8A).

Al incubar CCH-Alexa488 con LPS para obtener un fenotipo maduro en DC, y luego

incubar CCH-Alexa647, contrariamente a lo esperado, se observó que las DCs incorporaban

más CCH que cuando no fueron tratadas con LPS, es decir, no hubo pérdida en la capacidad

fagocítica de estas células, a los tiempos analizados y en nuestras condiciones de estudio. Esto

lo interpretamos como que las DCs entraron a un proceso apoptótico, que daría cuenta de este

fenómeno (Fig 8B).

4. Capacidad proteolítica de las DCs frente a CCH.

Por Westernblot analizamos si las DCs, son capaces de degradar CCH luego de haber

sido incorporada. Para ello, se incubó CCH en cultivos de DCs durantes diferentes tiempos,

realizando luego extractos celulares (2x106 células). Se observó que CCH ya se encuentra

degradada por las DCs a las 7 h, en fragmentos de tamaño entre 80 KDa y 40 KDa, siendo la

banda más intensa una de aprox 45 KDa, que disminuye en tiempos sucesivos (Fig 9B). Las

bandas detectables por WB desaparecen casi por completo a las 52 h, y no se detectan a las 72 h

(datos no mostrados), señalando que a este tiempo CCH fue totalmente procesada. No se

evidenció diferencias en el procesamiento de CCH en DCs incubadas con LPS (100 ng). Como

control, se agregó CCH en un extracto celular sin PMSF (inhibidor de serina proteasas), con lo

que se comprobó que el procesamiento de CCH en fragmentos de tamaño cada vez menor, se

debe a un efecto de su incorporación en la célula y no a la proteólisis por efecto de la

preparación del extracto; observándose las bandas características de CCH: CCHA (400 KDa) y

CCHB (350 KDa); y los productos del autoclivaje de CCHA: CCHA1 (300 KDa) y CCHA2

(100 KDa), como fuera reportado por De Ioannes et al (2004). Este mismo extracto no mostró

bandas en los tamaños antes descritos, descartándose una marca inespecífica. En un gel en

gradiente del 5-15% SDS-PAGE en condiciones reductoras se realizó la prueba de carga, cuyos

resultados se muestran en la Fig 9A .

36

30 h 78 h

Fig 8. Análisis de la pérdida de la capacidad fagocítica. A. DCs de 5 días fueron incubadas con CCH-Alexa488 (100 ug, verde) por 24 h, luego fueron lavadas e incubadas con CCH-Alexa647 (100 ug, rojo), con pulso de 6 h y analizadas por citometría de flujo. Se encontró que sólo un 10% de las DCs pierden la capacidad de incorporar la proteína marcada, independientemente del tiempo de incubación. B. DCs incubadas con LPS (100 ng), aumentaron a los tiempos señalados, la incorporación de CCH.

A

B

37

Fig 9. Capacidad proteolítica de DCs sobre CCH. A. WB de extractos de DCs incubados a distintos tiempos con CCH. B. Gel SDS-PAGE de extractos de DCs como control de carga, donde se destaca el perfil de corrida de las sub unidades de CCH: CCHA, (400 KDa), CCHB (350 KDa) y CCH A1 (300 KDa) y CCH A2 (100 KDa) Carril 1: Extracto DC con CCH s/PMSF (control negativo). Carril 2: Extracto DC incubado 7 h con CCH. Carril 3: Extracto DC incubado 7 h con CCH y LPS. Carril 4: Extracto DC incubado 24 h con CCH. Carril 5: Extracto DC incubado 24 h con CCH y LPS. Carril 6: Extracto DC incubado 31 h con CCH. Carril 7: Extracto DC incubado 52 h con CCH.

180

45

65

82

115

37

180

45

65

82

115

37

Gel SDS PAGE1 2 3 4 5 6 7

Suero Anti CCH1 2 3 4 5 6 7

180

45

65

82

115

37

180

45

65

82

115

37

CCHACCHBCCHA1

CCHA2

A

B

38

5. Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC.

Para validar el mecanismo de inmunoestimulación de CCH propuesto en esta tesis,

consideramos fundamental analizar su efecto sobre cocultivos NK/DCs, es decir, determinar si

tiene un efecto activador sobre la inmunidad innata. Con este propósito, se realizaron cocultivos

de dichas células en una relación de las poblaciones celulares de 1:1, estudiándose parámetros

similares de maduración evaluados para los cultivos de DCs aisladas, previamente descritos.

Los cocultivos se dejaron por 48 h, correspondiendo a DCs de 6 días y NKs de 2 días, incubadas

con CCH (100 ug/ml) o LPS (100 ng/ml) al momento de juntarlas, y pretratando ambos grupos

celulares previamente por 24 h con CCH (100 ug/ml).

Por MLCF, se apreciaron cambios notables en el aspecto del cocultivo que fueron

pretratados con CCH, observándose una morfología madura por parte de las DCs: células de

gran tamaño con múltiples procesos de membrana, rodeadas por varias NKs mucho más

pequeñas. Mediante MET se apreció una clara asociación entre las células NKs y DCs, reflejada

en la complementariedad de los procesos de membrana y en múltiples sitios de contacto celular

en que no se observa espacio entre ellas, aunque no pudimos definir un tipo de unión específica

como por ejemplo gap juntion. Este interacción de membrana, si bien existe en los cocultivos

incubados con CCH y sin tratamientos, nos pareció menos numeroso que en los casos que se

pretrató con CCH (Fig 10A).

En los cocultivos también se analizó por citometría de flujo la expresión de MHCII y de

CD86 en DCs a las 48 h, encontrándose aumentos de ambos marcadores de maduración en

todas las condiciones de incubación con CCH, al comparar con cocultivos no tratados, tanto en

la población como en la intensidad de la marca fluorescente (Fig 10B y 10C). Al medir la

secreción de IL12 e INFγ, por ELISA, en los sobrenadantes de los cocultivos con contacto

celular y sin contacto celular, separados por el sistema transwell (sólo permite el intercambio de

sustancias solubles), a los tiempos de 24 h y 48 h, se encontró que existe una mayor secreción

de estas citoquinas en los cocultivos pretratados con CCH, comparando con las DCs solas, en

cocultivos NK/DC con y sin CCH, que no mostraron diferencias a estos tiempos (Fig 11A y

11B). Se midió también la secreción de TNFα, obteniéndose un nivel basal entre 100 y 400

pg/ml para los pozos controles e incubados con CCH, y en torno al doble de concentración para

los pozos incubados con LPS (datos no mostrados). Como control positivo se usó LPS (100

ng/ml), el cual produjo una fuerte secreción de IL12 e INFγ a las 24 h, manteniéndose en el

tiempo hasta las 72 h de análisis.

39

NK/DC

NK/DC C

CH

NK/DC LP

S

NK (CCH)/D

C

DC (CCH)/N

K0

10

20

30

40

50

60

Población CD 86+

%

NK/DC

NK/DC C

CH

NK/DC LP

S

NK (CCH)/D

C

DC (CCH)/N

K0

1

2

3

4

5

6

Intensidad CD86+

vece

s de

aum

ento

A

B

C

Población MHCII

NK/DC

NK/DC C

CH

NK/DC LPS

NK (CCH)/D

C

DC (CCH)/N

K0

10

20

30

40

50

60

%

In tensidad MHC II

NK/DC

NK/DC C

CH

NK/DC LPS

NK (CCH)/D

C

DC (CCH)/N

K0

1

2

3

4

5

6

vece

s de

aum

ento

Fig 10. Efecto de CCH sobre cocultivos NK/DC. A. Microscopia de luz con contraste de fase y MET, de cocultivos NK/DCs de 48 h, con CCH (100 ug/ml) o LPS (100 ng/ml). Se destaca la morfología celular y con mayor aumento el detalle del contacto entre las células. B y C. Expresión de marcadores de maduración evaluados por citometría de flujo. Se muestra un aumento en la expresión de MHCII y CD86 por efecto de CCH, tanto en la población positiva para el marcador, como en su intensidad de fluorecencia, al comparar con el control sin tratamiento. Los datos corresponden a resultados preliminares de un sólo experimento.

40

IFNγ

DC

DC

-CC

H

DC

-LPS NK

NK-

CC

H

NK-

LPS

NK-

DC

C

NK-

DC

T

NK-

DC

/CC

H C

NK-

DC

/CC

H T

NK-

CC

H/D

C C

NK-

CC

H/D

C T

DC

-CC

H/N

K C

DC

-CC

H/N

K T

NK-

DC

/LPS

C

NK-

DC

/LPS

T

0

2500

5000

7500

10000 24 h 48 h

DC NK Cocultivo NK-DC

pg/m

l IFN

γ

IL- 12

DC

DC

-CC

H

DC

-LPS NK

NK

-CC

H

NK

-LPS

NK

-DC

C

NK

-DC

T

NK

-DC

/CC

H C

NK

-DC

/CC

H T

NK

-CC

H/D

C C

NK

-CC

H/D

C T

DC

-CC

H/N

K C

DC

-CC

H/N

K T

NK

-DC

/LPS

C

NK

-DC

/LPS

T

0

2500

5000

7500

10000 24 h

48 h

DC NK Cocultivo NK-DC

*** ***

*

*** p<0,001* p<0,05*

pg/m

l IL-

12***

Fig 11. Efecto de CCH sobre la secreción de interleuquinas en cocultivos NK/DC. Secreción de IL12 e INFγ determinada por ELISA, en cocultivos NK/DC, incubados y preincubados con CCH (100 ug/ml) o LPS (100 ng/ml). A. La secreción de IL12 muestra una tendencia al aumento en los cocultivos pretratados con CCH, siendo significativo a las 24 h con contacto celular (C) y a las 48 h sin contacto celular (T), en comparación a los controles. Datos obtenidos de 3 experimentos independientes B. La secreción de INFγ muestra un comportamiento similar al observado para IL12. Datos obtenidos de 2 experimentos independientes. En ambos casos el LPS gatilla una fuerte secreción antes de las 24 h, que se mantiene en el tiempo. IL12 es secretada sólo por las DCs e INFγ es secretado sólo por las células NK, de acuerdo a lo descrito en la literatura.

A

B

41

6. Inmunogenicidad de CCH y sus subunidades desglicosiladas, in vivo e in vitro.

Para determinar si la extrema inmunogenicidad de CCH se debe a su gran tamaño y/o a

la presencia de azúcares en su estructura, se analizó la respuesta inmune humoral de ratones

contra la proteína y sus subunidades desglicosiladas (denotadas como CCH-D, CCHA-D y

CCHB-D), y también se midió su efecto sobre la secreción la IL12 en cultivos de DCs in vitro .

Como control se usaron las mismas proteínas en forma nativa.

Las proteínas fueron desglicosiladas mediante un protocolo químico, usando Peryodato

de sodio, y otro enzimático, usando PNGasa F (ver Métodos 11.1 y 11.2), porque cortan en

diferentes sitios las cadenas de oligosacáridos. Posteriormente, las proteínas tratadas se

analizaron mediante geles de diversa naturaleza y también se observó su estructura mediante

MET utilizando tinción negativa.

Al analizar las proteínas desglicosiladas químicamente mediante electroforesis en geles

nativos de agarosa al 1,5%, se observó que este tratamiento produce cambios en su migración,

pero aparentemente estas conservan su estructura cuaternaria. Al realizar geles SDS-PAGE en

condiciones reductoras, las proteínas desglicosiladas no entraron al gel, sugiriendo su

agregación. Sin embargo, esto no fue corroborado al observar las proteínas por MET con tinción

negativa, porque no se observó diferencias entre las desglicosiladas y los controles. (Fig 12A y

12C).

En el caso de la desglicosilación enzimática, para confirmar si el tratamiento enzimático

con PNGasa fue efectivo, realizamos el análisis en geles SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Una pérdida de azúcares se refleja en una pérdida de masa y por tanto, en una diferencia de la

migración. Sin embargo, debido al gran tamaño de CCH, esta diferencia en la migración fue

difícil de visualizar. Por esta razón, se usó como control positivo fetuína, glicoproteína que tiene

una masa de azúcares en torno al 20% (Spiro y Bhoyroo, 1974). La mayor migración

electroforética de la fetuína indica que la reacción enzimática de desglicosilación ha ocurrido.

Por MET, se observó que, por efecto del protocolo nativo seguido para generar la

desglicosilación enzimática, no se produjeron diferencias para CCH-D con respecto a CCH; en

CCHA y CCHA-D se observó un cierto grado de polimerización, encontrándose moléculas que

emulan la estructura de CCH parcialmente; en CCHB y CCHB-D, en cambió, se vio una

polimerización lineal, que describen filamentos con forma de cinta en espiral. Estas

polimerizaciones se apreciaron también en los controles, sugiriendo que ocurren en el tiempo, a

partir del momento en que las subunidades fueron disociadas y aisladas hace más de 1 año (Fig

12B y 12C).

42

C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 CCHB-D CCHB CCHA-D CCHA CCH-D CCH Fet D Fet STD

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9CCH CCH-D CCHA CCHA-D CCHB CCHB-D CCHA CCHA-D CCH CCH-D CCHA CCHA-D CCHB CCHB-D CCHA CCHA-D STD

+ + + +CCHB CCHB-D CCHB CCHB-D

A

B

TratamientoControl

CCH

CCHA

CCHB

TratamientoControl

CCH

CCHA

CCHB

Fig 12. Tratamiento de desglicosilación química y enzimática de CCH y sus subunidades. A. Desglicosilación química, gel nativo de agarosa al 1,5% (Izquierda), donde se aprecian cambios en la migración de las proteínas desglicosiladas. Gel SDS-PAGE en gradiente del 5-15%, en condiciones reductoras (Derecha), mostrando que las proteínas desglicosiladas no ingresaron al gel. B. Desglicosilación enzimática, gel SDS-PAGE en gradiente del 5-15%, en condiciones reductoras, donde la mayor migración de fetuína indica que la reacción de desglicosilación ocurrió. C. Microscopia electrónica de proteínas desglicosiladas y sus controles. Se observa que no hubo formación de agregados entre las proteínas por efecto del tratamiento. Las subunidades almacenadas en el tiempo (más de un año, a 4ºC) forman polímeros, de forma notable en CCHB.

43

Posteriormente, se evaluó la inmunogenicidad in vivo, de las proteínas desglicosiladas,

en ratones de las cepas C57BL/6 y C3H/HeJ. Se determinó el título de Ac séricos en la

respuesta inmune humoral secundaria mediante ELISA, con el antígeno homólogo, es decir el

mismo antígeno usado para inmunizar. En la cepa C57BL/6, se encontró que todas las proteínas

desglicosiladas químicamente tenían títulos más altos en relación a los controles, y que CCHB-

D, era más inmunogénica que las demás. En la cepa C3H/HeJ, CCHB-D tiene un título

significativamente mayor que CCH y que CCHB. En las proteínas desglicosiladas

enzimáticamente, no se encontró diferencias significativas en ninguna de las dos cepas, y

nuevamente CCHB-D mostró un mayor título de Ac sérico que CCH y CCHB. En la Tabla 1 y

en la Fig 13A se muestran estos resultados.

Al medir la secreción de IL12 en DCs incubadas con estas proteínas tratadas por ambos

métodos de desglicosilación, se encontró que en general, hubo leves diferencias entre las

proteínas desglicosiladas y sus controles, salvo CCHA, donde la secreción de IL12 fue superior

a los 7500 pg/ml, en todos los tiempos y condiciones, no así con LPS usado como control

positivo (Fig 14A y 14B). Debido a que se usaron distintas diluciones para cuantificar los

sobrenadantes de las proteínas en evaluación y del LPS, las DO máx obtenidas en el ELISA

para determinar IL12 sobrepasaron el límite de lectura del equipo, lo cual afecto las DO máx en

el caso de LPS y CCH A y CCHA-D.

44

Fig 12. Tratamiento de desglicosilación química y enzimática de CCH y sus subunidades. A. Desglicosilación química, gel nativo de agarosa al 1,5% (Izquierda), donde se aprecian cambios en la migración de las proteínas desglicosiladas. Gel SDS-PAGE en gradiente del 5-15%, en condiciones reductoras (Derecha), mostrando que las proteínas desglicosiladas no ingresaron al gel. B. Desglicosilación enzimática, gel SDS-PAGE en gradiente del 5-15%, en condiciones reductoras, donde la mayor migración de fetuína indica que la reacción de desglicosilación ocurrió. C. Microscopia electrónica de proteínas desglicosiladas y sus controles. Se observa que no hubo formación de agregados entre las proteínas por efecto del tratamiento. Las subunidades almacenadas en el tiempo (más de un año, a 4ºC) forman polímeros, de forma notable en CCHB.

Fig 13. Inmunogenicidad de CCH y sus subunidades desglicosiladas in vivo. Tabla 1 y A. Títulos de Anticuerpos séricos anti-CCH o sus subunidades desglicosiladas en dos cepas de ratón inyectados con 150 ug de proteína. Como control se usaron las proteínas nativas. Fueron inyectados dos ratones por grupo, y las mediciones se realizaron 3 veces, en duplicado.

A

TABLA 1

Respuesta inmune humoral de ratones contra CCH y sus subunidades desglicosiladas

Cepa Antígeno Desglicosidación Química

Desglicosidación Enzimática

Título de anticuerposa

Título de anticuerpos

C57BL/6 CCH 27,5 ± 2,8 50 ± 10 CCH-D 520 ± 153,2 100 ± 23,1 CCH A 200 ± 46,2 130 ± 88,7 CCH A-D 640 105 ± 64 CCH B 30 45 ± 17,3 CCH B-D 400 ± 92,3 17,5 ± 20,6 C3H/HeJ CCH 293,3 ± 41,3 140 ± 23,1 CCH-D 303,3 ± 279 170 ± 115 CCH A 65 ± 32,1 115 ± 52,6 CCH A-D 123,3 ± 67,4 180 ± 120 CCH B 27,5 ± 8,8 130 ± 38,3 CCH B-D 613,3 ± 65,3 360 ± 80 a El título de anticuerpos séricos se definió como la dilución a la cual se alcanza la mitad de la DO máxima

C epa C 3H/HeJ

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000 *1

*2

*1 P< 0 .0 5 C C H BD v/s C C H B *2 P< 0 .0 5 C CH BD v/s C CH

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

C e p a C 5 7 B L / B 6

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

1 0

1 0 0

1 0 0 0

Tít

ulo

de

an

ticu

erp

os

séri

cos

Cepa C3H/HeJ

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000**1

***2

**1 P < 0 .01 C C H B D v/s CC H ***2 P< 0 .00 1 CC H B D v/s CCH B

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

Cepa C57BL/B6

CCH

CCH DCCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000*** ***

***

*** P< 0.001 CCH D, A D, B D v/s CCH , A , B respectivamente

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

T ratam iento quím ico

Tratam iento enzim ático

C epa C 3H/HeJ

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000 *1

*2

*1 P< 0 .0 5 C C H BD v/s C C H B *2 P< 0 .0 5 C CH BD v/s C CH

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

C e p a C 5 7 B L / B 6

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

1 0

1 0 0

1 0 0 0

Tít

ulo

de

an

ticu

erp

os

séri

cos

Cepa C3H/HeJ

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000**1

***2

**1 P < 0 .01 C C H B D v/s CC H ***2 P< 0 .00 1 CC H B D v/s CCH B

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

Cepa C57BL/B6

CCH

CCH DCCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000*** ***

***

*** P< 0.001 CCH D, A D, B D v/s CCH , A , B respectivamente

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

T ratam iento quím ico

Tratam iento enzim ático

C e p a C 5 7 B L / B 6

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

1 0

1 0 0

1 0 0 0

Tít

ulo

de

an

ticu

erp

os

séri

cos

Cepa C3H/HeJ

CCH

CCH D

CCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000**1

***2

**1 P < 0 .01 C C H B D v/s CC H ***2 P< 0 .00 1 CC H B D v/s CCH B

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

Cepa C57BL/B6

CCH

CCH DCCH A

CCH A D

CCH B

CCH B D

10

100

1000*** ***

***

*** P< 0.001 CCH D, A D, B D v/s CCH , A , B respectivamente

Títu

lo d

e an

ticue

rpos

sér

icos

T ratam iento quím ico

Tratam iento enzim ático

45

A IL 12 Desglicosilación química

Control CCH CCH-D CCH A CCH A-D CCH B CCH B-D LPS0

5000

10000

1500024 h48 h72 h96 h

> 7500

>15000

pg/m

l IL1

2

Fig 14. Secreción de IL12 por efecto de CCH y sus subunidades desglicosiladas, en cultivos DCs in vitro. A y B. Tratamiento químico y enzimático, respectivamente. Se observa que la secreción de IL12 inducida por CCH-D y CCHB-D es similar a la de los controles (proteínas nativas) y al control de DCs en medio de cultivo, en ambos tratamientos. Sólo CCHA-D mostró una disminución en el tratamiento químico.

B IL 12 Desglicosilación enzimatica

Control CCH CCH-D CCH A CCH A-D CCH B CCH B-D LPS0

5000

10000

1500024 h48 h72 h96 h

> 15000

> 7500

pg/m

l IL1

2

46

DISCUSIÓN

En este trabajo, el propósito central ha sido estudiar el efecto que tienen las

hemocianinas de moluscos, tomando como modelo la hemocianina del gastrópodo chileno C.

concholepas, sobre las células dendríticas. Considerando el rol fundamental de dichas células en

la presentación del antígeno a linfocitos T y que se trata, por tanto, de un antígeno timo

dependiente, concluimos que esta no es una explicación suficiente para comprender los

mecanismos inmunológicos involucrados en su poderoso efecto inmunoestimulante, frente a

otras proteínas. Es así, que para enfrentar este problema, se consideró indispensable disponer de

un cultivo in vitro de DCs obtenidas de una cepa modelo en inmunología como son los ratones

C57BL/6, no sólo por la abundante información y disponibilidad de marcadores anti-CDs, si no

que también, por la posibilidad de estudiar a futuro receptores para hemocianina, putativos o

específicos si los hubiera, y también, para determinar posibles vías de transducción de señales

que ellas pudieran activar. No obstante, también se realizaron estudios in vivo, para abordar una

consecuencia funcional del procesamiento de CCH por células dendríticas, como fue la

evaluación de la respuesta inmune humoral contra la proteína completa y sus partes (sub

unidades aisladas) y el efecto que en ellas tienen los azúcares, en relación a su capacidad de

unirse a un receptor de tipo Toll (Medzhitov y Janeway, 1997), lo cual quedó descartado en este

trabajo, como se analizara más adelante

Se estableció y caracterizó un cultivo de DCs enriquecido entre un 60-75% de células

CD11c+, y con escasa presencia de otros grupos celulares que pudieran interferir en los

resultados. Es importante decir que el marcador CD11c, corresponde a la cadena αx de

integrinas cuya función es participar en la adhesión al endotelio vascular y ser receptor del

complemento, y es el marcador más utilizado en la literatura para discriminar una población de

DCs murina de otras poblaciones linfoides (Steinman, 1991). Sin embargo, este marcador se

encuentra presente también en células NK, granulocitos, monocitos y macrófagos, pero en

menor cuantía, y no discrimina entre las subclases de DCs. En nuestro caso, la intensidad del

marcador CD11c+ en citometría de flujo fue bastante baja en comparación a los cultivos no

enriquecidos, debido, probablemente, a que el enriquecimiento del cultivo utiliza Ac con esferas

magnéticas anti-CD11c+, por lo cual, 24 h después de marcadas las células, se reconocen sólo

los receptores CD11c que han sido reciclados o formados de novo. Es por esto que la

identificación de la población en estos casos, se realizó guiándonos por la población que

aumentó levemente la intensidad de la fluorescencia del marcador, con un tamaño y

granulosidad especificos para DCs (Fig 3C).

47

Al analizar la incorporación de CCH en DCs, se evidenció por diversas técnicas

(microscópicas y de citometría de flujo), que es efectivamente incorporada a tiempos tempranos

de incubación. Sin embargo, una porción de ella queda asociada a la superficie celular. Los

antígenos exógenos, destinados a ser presentados por las moléculas de MHCII, son

incorporados a través de fagocitosis, macropinocitosis, endocitosis mediada por receptores u

otros mecanismos (Jensen, 2007). Se desconoce si existen receptores, putativos o específicos,

involucrados en la incorporación de hemocianinas. Las DCs expresan un gran número de

receptores que pueden reconocer específicamente moléculas relacionadas con patógenos, como

algunos miembros de la familia de receptores Toll, quienes reconocen un amplio rango de

moléculas incluidas lipoproteínas de procariontes, glicoproteínas, flagelina y LPS. A su vez,

también expresan una serie de receptores C-tipo lectina, de manosa, DEC205 y DC-SIGN, que

reconocen estructuras de carbohidratos y patógenos (Akira, et al., 2001; Sallusto, et al.,

1995). Tomando en consideración que la estructura de las hemocianinas de gastrópodos es

similar a una simetría D5, asemejando una cápside viral eicosahédrico, y sabiendo que posee un

alto porcentaje de azúcares, suponemos que estas proteínas pueden ser reconocidas por alguno

de los receptores antes descritos, y ejercer su función vía transducción de señales o directamente

a través del procesamiento antigénico.

Gracias a su gran tamaño y a su estructura peculiar, las hemocianinas pueden ser

fácilmente reconocidas por MET, lo cual permitió observar el proceso de incorporación de CCH

y su posterior localización intracelular. Se determinó que CCH ingresa vía vesículas de clatrina

(endosomas tempranos con membrana electrón densa y gruesa) y posteriormente se encuentra

en vesículas de membrana lisa, que probablemente corresponden a endosomas tardíos, vacuolas

o lisosomas. Esto último se analizó mediante la determinación de aumentos en la expresión de

Lamp, datos que discutiremos más adelante. En los cultivos que se dejó permanentemente CCH,

se apreciaron moléculas intactas hasta las 24 h, lo cual nos lleva a suponer que ingresaron a la

célula minutos antes de realizar la preparación para MET, ya que, al observar las DCs incubadas

24 h con CCH, y miradas a las 48 h, no mostraron moléculas intactas en vesículas similares (Fig

4B).

Luego, quisimos saber si este hecho tiene un efecto sobre la maduración de las DCs. Se

ha demostrado que la mayor parte de los coadyuvantes específicos recientemente desarrollados,

como agonistas de receptores tipo Toll, como el LPS, por ejemplo, son capaces de generar la

activación de DC, y de forma indirecta, desencadenar la expresión de moléculas

coestimulatorias (Guy, 2007). Tomando en cuenta lo anterior, y sabiendo que la hemocianina

posee una extrema inmunogenicidad, nos pareció que el LPS era un buen control positivo para

evaluar maduración de DCs, por la abundante información al respecto. Delamarre et al. (2003),

48

concluyeron que el LPS es capaz de aumentar los niveles de expresión tanto de MHCI como de

MHCII en DCs murinas. Al observar células tratadas con CCH por MLCF y MET, no se

encontraron diferencias con respecto a las no tratadas, sin embargo, mostraron una morfología

muy distinta a las tratadas con LPS, las cuales presentaron signos morfológicos de haber entrado

en un proceso de apoptosis (Edwards, et al., 1999). Al evaluar la expresión de MHCII y de

CD86, encontramos que no hay un aumento de estos marcadores por efecto de CCH hasta las 72

h con respecto a las células no tratadas, pero tampoco encontramos que el LPS aumentara su

expresión (excepto CD86 a las 24 h). Esto nos llevó a pensar que la vía de activación que ejerce

el LPS sobre las DCs, es distinta de la vía que podría inducir CCH. El LPS activa totalmente a

las DCs antes de las 24 h, culminando con la muerte de la célula, en cambio, la activación

ejercida por CCH es posterior a las 48 h. Estos resultados concuerdan con lo descrito por De

Smedt et al. (1998), quienes al inyectar LPS en ratones, observaron que se genera una fuerte

migración de DCs esplénicas a las áreas ricas en LT en los ganglios perifericos, pero que a su

vez, mostraron un aumento de muerte celular por apoptosis. Estos resultados se refrendan al

analizar la secreción de IL12, ya que se obtuvo un aumento significativo a las 72 h por efecto de

CCH con respecto a las DCs no tratadas. Este resultado reafirma lo observado in vivo, por

Moltedo et al (2006), y sustenta lo planteado en la hipótesis de esta Tesis, en el sentido que

CCH direcciona la respuesta inmune hacia una regulación de tipo Th1, mediada por IL12 y

secreción de Ac de isotipo IgG2a, característicos de este tipo de respuesta. El LPS, en cambio,

genera un aumento significativo de IL12 a las 24 h, que se mantiene en el tiempo.

Últimamente se ha descrito una serie de antígenos extracelulares que se presentan en

moléculas MHCI, es decir, por la vía de presentación de los antígenos virales o propios;

fenómeno conocido como presentación cruzada, el cual ha cobrado importancia debido a que

una de las limitaciones de las vacunas es que, generalmente, carecen de eficiencia en la

protección contra enfermedades donde se requiere activación de LT CD8+, es decir, que

necesitan inmunidad mediada por CTLs, como es el caso de ciertas infecciones virales o

cánceres (Rock y Shen , 2005). Por tanto, quisimos saber si CCH tiene la capacidad de activar

tanto a LT CD4+ como a LT CD8+. Para ello, evaluamos la expresión de MHCI por efecto de

CCH, encontrando que prácticamente no hubo efecto en comparación a las DCs no tratadas, y

fue menor al efecto producido por una proteína no relacionada ampliamente utilizada como

modelo, como OVO contaminada con LPS. Nuestros resultados descartan, entonces, que CCH

tenga una presentación cruzada en el marco de las moléculas de MHCI en nuestras condiciones

experimentales.

Al medir si existía una pérdida en la capacidad fagocítica por efecto de CCH en DCs,

encontramos que alrededor de un 10% de ellas lo hicieron, lo cual sugiere que CCH no induce

49

pérdida de los factores de endocitosis hasta las 78 h. Como control positivo, nuevamente se

utilizó LPS, sin embargo, se encontró que la incorporación de CCH en células tratadas con LPS

fue aún mayor, a las 30 h y 78 h, en comparación a las células no tratadas. Esto reafirma lo

discutido anteriormente, donde el tipo de LPS, la concentración y/o el tiempo de incubación

fueron suficientes como para llevar a las células a apoptosis, y, de esta forma, es posible que las

proteínas difundan al interior de las células, al perderse la permeabilidad selectiva de la

membrana plasmática.

Un antígeno extracelular, que es incorporado por una célula presentadora como son las

DCs, para ser cargado en una molécula de MHCII, debe pasar por una serie de procesos. Al ser

incorporado por un endosoma temprano, comienza una primera etapa de degradación del

antígeno, con la acidificación del medio de la vesícula, hasta transformarse en un endosoma

tardío. En este proceso se van adhiriendo un grupo de proteínas, denominadas Lamp, en la

membrana de la vesícula. Estos endosomas luego se fusionan con vacuolas provenientes del

aparato de Golgi, que poseen precursores de moléculas de MHCII. Por esta razón, se analizó la

expresión de Lamp por efecto de CCH. Se encontró que a las 72 h de incubación, hay un

aumento en la expresión de Lamp por efecto de CCH, comparado con las células control sin

tratamiento. Sin embargo, a las 24 h y 48 h no se observó cambios. Es decir, hasta las 48 h no

hay un aumento en la formación de lisosoma tardío por efecto de CCH, donde el antígeno se

degrada en péptidos capaces de ser cargados en una molécula de MHCII. Se debe mencionar

que la proteólisis del antígeno esta íntimamente relacionada con su presentación en el marco de

una molécula de MHCII, ya que en ellas sólo pueden ser cargados péptidos de entre 15 a 20

aminoácidos (Jensen, 2007).

Es sabido que las DCs tienen un potencial proteolítico limitado, porque tienen una

menor expresión de proteasas en sus lisosomas, en comparación con los macrófagos, y que esta

limitada proteólisis lisosomal en DCs, favorece la sobrevida de los antígenos, independiente del

tipo de antígeno y de la vía de administración (Delamarre et al., 2005). Al estudiar la

degradación de CCH incorporada por DCs, vimos que este proceso es paulatino y seriado, ya

que se encontraron fragmentos de tamaños específicos, entre los 120 y 40 KDa, donde la banda

más intensa corresponde a una banda de aproximadamente 45 KDa, lo cual nos hace pensar que

la primera etapa de degradación llega hasta una FU, cuyo peso oscila entre 45 KDa y 50 KDa

(De Ioannes, et al., 2004). En el tiempo, esta banda pierde intensidad y prácticamente no se

observa a las 52 h, perdiéndose completamente a las 72 h (datos no mostrados). Concluimos que

los péptidos generados poseen un tamaño pequeño, que no les permite ser detectados por la

técnica de WB. Por otra parte, se debe señalar que el perfil de degradación no depende de la

activación con LPS ya que se detectaron las mismas bandas.

50

Por tanto, en cultivos DCs, CCH no ejerce un efecto en su maduración, antes de las 72 h,

ya que no gatilla cambios morfológicos y no aumenta los niveles de expresión de MHC I, MHC

II y CD86, y tampoco genera pérdida de la capacidad fagocítica. Sólo se observó que aumenta la

secreción de IL12 significativamente con respecto al control no tratado, a las 72 h. Sin embargo,

se observó que aumenta la expresión de Lamp, y la degradación de CCH en fragmentos menores

a 45 KDa, a las 72 h, lo cual daría cuenta de un procesamiento y activación tardía de DCs por

efecto de esta proteína. Es importante señalar que una DC que incorpora un antígeno, debe

desplazarse desde su ubicación, en la piel, por ejemplo, como célula de Langerhans, hasta

ejercer su función presentadora en un ganglio linfático. Este trayecto requiere un tiempo, en el

cual no se puede degradar por completo el antígeno. En estudios donde se incubó DCs con

Rnasa A y Rnasa S (mutante de Rasa A, escindida de los aminoácidos Ala 21 y Ser 22, lo cual

la hace más susceptible a la proteólisis) se observó que las DCs cargadas con Rnasa A

generaban mayor proliferación en LT que la mutante Rnasa S, lo cual indica que mientras más

estable es el antígeno en una DC, mayor será el efecto presentador, y por ende, más poderosa

será la respuesta desencadenada por el antígeno en los LT (Delamarre et al., 2005).

En la última década, se ha visto la importancia de analizar la “comunicación” existente

entre los grupos celulares del sistema inmune, lo cual ha llevado a crear sistemas de cultivo in

vitro más cercanos a un modelo in vivo, para estudiar los fenómenos inmunológicos. Una

interacción cada vez más relevante es la que se establece entre las DCs, como moduladoras del

sistema inmune, y las células NKs, conocidas por su rol en la inmunidad innata, en el ataque

contra virus, bacterias y tumores, donde tienen una potente actividad citotóxica y una rápida

producción de interleuquinas, especialmente INFγ (Trinchieri, 1989; Smyth et al., 2005).

Recientemente, se ha descubierto que la interacción NK/DC es reciproca, las células NK pueden

inducir maduración y activación funcional en DCs derivadas de monocitos, lo que indica una

compleja ¨conversación cruzada¨ entre estas células, que puede estar jugando un rol regulador

entre la inmunidad innata y la adaptativa (Gerosa et al., 2005). Se ha visto, por ejemplo, que la

interacción entre las DCs y las NKs es un hecho fundamental en la activación efectiva de la

inmunidad antiviral (Andoniou, et al., 2005).

Al estudiar cocultivos NK/DC, por MLCF y MET, se observó que existe asociación

entre estos dos grupos celulares, la cual se ve aumentada cuando las células se preincubaron con

CCH durante 24 h. La importancia del contacto celular se vio refrendada al estudiar la secreción

de IL12 e INFγ, ya que el mayor aumento en la secreción de estas interleuquinas se obtuvo

cuando existió contacto directo entre ellas. El nivel basal de TNFα, de alrededor de 100 a 400

51

pg/ml obtenido en nuestras condiciones de estudio, podría deberse a la presencia de macrófagos

contaminantes del cultivo (datos no mostrados).

También, se encontró un aumento en la expresión de MHCII y de CD86 en las DCs

tratadas y pretratadas con CCH con respecto al control no tratado, a las 48 h de cocultivo, lo

cual nos llevó a pensar que su activación depende de un ambiente de interleuquinas adecuado y

de un contacto celular propicio. Es decir, en el mecanismo de inmunomodulación de

hemocianinas propuesto en esta tesis, la interacción NK/DC sería un paso clave para gatillar

luego la maduración de DCs y su consiguiente procesamiento y presentación antigénica a LT

CD4+.

Por último, tomando en cuenta la importancia de los azúcares en la interacción con los

receptores de membrana de activación de DCs, y por tanto, el posible rol inmunológico que

podrían tener los azúcares en la estructura de CCH, se desglicosiló la proteína por dos

tratamientos distintas (químico y enzimático), encontrando que la pérdida de estos azúcares no

se condice con una pérdida en la capacidad inmunoestimulante de estas proteínas, al contrario y

sorprendentemente, dependiendo de la cepa de ratón inmunizado, algunas proteínas

desglicosiladas mostraron un mayor título de Ac, como es el caso de CCHB-D, la cual, en

condiciones nativas, era la subunidad menos inmunogénica. Hay que hacer notar, eso sí, que

con el tratamiento químico, las proteínas sufrieron cambios estructurales, los cuales se

tradujeron en que la proteína no entró en el gel SDS-PAGE al 5%, a diferencia de los controles,

aunque no se observó agregada al observar por MET. Asumimos entonces que ocurrieron

reacciones intramoleculares en la proteína, similares a los que ocurren con los agentes utilizados

para fijar proteínas.

En el caso de las proteínas desglicosiladas químicamente, para determinar si los títulos

de Ac séricos se debían efectivamente a un mayor número de Ac (inmunogenicidad) y no a que

la afinidad del Ac por el antígeno era mayor (antigenicidad), se realizaron estudios de reacción

cruzada. En este caso, se evaluó el título de los sueros frente a las proteínas heterólogas. Se

encontró en estas condiciones que los títulos no cambiaron, lo cual significa que no hubo

modificaciones debidas a la afinidad del Ac. por el antígeno.

Al estudiar la secreción de IL12 inducida por CCH y sus subunidades desglicosiladas,

concluimos que los altos títulos de Ac obtenidos in vivo, no se correlacionan con la secreción de

IL12 in vitro, en cultivos DCs, hasta las 96 h. Esto puede deberse a que el sistema de

inmunomodulación necesita inequívocamente las señales de una célula NK para activar a las

DCs, o que las proteínas que generan mayor título de anticuerpos son menos susceptibles al

52

procesamiento de las DCs, por tanto, estarían ejerciendo su acción inmunoestimulante por

mayor tiempo, aumentando la presentación antigénica y generando mayor proliferación en LT.

Finalmente, entre las proyecciones de este trabajo, creemos que resultaría interesante

estudiar a mayores tiempos el efecto en la maduración de DCs inducida por CCH in vitro,

analizar el perfil de degradación de CCH por acción de DCs cocultivadas con NKs y realizar

estudios de proliferación de LT inducida por DCs cargadas con CCH, para observar un efecto

funcional de esta proteína, completando de esta forma el mecanismo de inmunomodulación

propuesto en esta tesis. Un aporte importante sería llegar a encontrar el péptido, la secuencia o

“el qué estructural” de las hemocianinas de molusco que las hacen tan inmunoestimulantes.

53

CONCLUSIONES

• CCH es incorporada por endocitosis en DCs murinas cultivadas in vitro antes de

los 30 min; localizándose también en la superficie celular. Luego, se reconoce

intacta en vacuolas y lisosomas tardíos, fenómeno que se correlaciona con un

aumento en la expresión de Lamp a las 72 h. Su incorporación en DCs también

ocurre in vivo.

• CCH no induce maduración en DCs cultivadas in vitro hasta las 72 h: no genera

cambios morfológicos evidentes, no aumenta la expresión de moléculas de

MHCI, MHCII y CD86, y tampoco disminuye su capacidad fagocítica.

• CCH produce un aumento en la secreción de IL12 luego de 72 h, indicando un

efecto tardío sobre DCs si se compara con LPS, que produjo un aumento

significativo a las 24 h, sugiriendo que CCH tiene una vía distinta al LPS en la

activación de DCs, es decir, no se une a receptores de tipo Toll.

• Las células dendríticas procesan CCH de forma secuencial, sugiriendo sitios de

corte en regiones específicas de la molécula.

• En cocultivos NK/DC, CCH genera cambios morfológicos en las DCs, aumento

en la expresión de MHCII y CD86, y en la secreción de IL12 e INFγ, ambiente

de interleuquinas que corresponde a una respuesta tipo Th1.

• La desglicosilación química de CCH y sus subunidades aumentó su

inmunogenicidad en la cepa C57BL/6, a diferencia de las mismas proteínas

desglicosiladas enzimáticamente, salvo para CCHB-D. Sin embargo, estas

moléculas no aumentaron la secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro.

• Finalmente, este es el primer trabajo que describe el efecto de una hemocianina

de moluscos sobre las células dendríticas murinas y sienta las bases para llegar a

comprender porqué estas proteínas son tan poderosos inmunoestimulantes.

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