EFEITO ANTI - INFLAMATÓRIO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Croton zehntneri PAX ET HOFMM E DO ANETOL.pdf

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR

EDSON LOPES DA PONTE

EFEITO ANTI - INFLAMATRIO DO LEO ESSENCIAL DE

Croton zehntneri PAX ET HOFMM E DO ANETOL

FORTALEZA

2009

1


EFEITO ANTI - INFLAMATRIO DO LEO ESSENCIAL DE Croton

zehntneri PAX ET HOFMM E DO ANETOL

Dissertao apresentada ao Curso de

Mestrado Acadmico em Cincias

Fisiolgicas do Centro de Cincias da

Sade da Universidade Estadual do Cear

como requisito para obteno do grau de

Mestre em Cincias Fisiolgicas.

Orientadora: Dra. Ana Maria Sampaio Assereuy

Co-orientadora: Dra. Andrelina Noronha Coelho

de Sousa

FORTALEZA

2009

2


EFEITO ANTI - INFLAMATRIO DO LEO ESSENCIAL DE Croton

zehntneri PAX ET HOFMM E DO ANETOL

Dissertao apresentada ao Curso de

Mestrado Acadmico em Cincias

Fisiolgicas do Centro de Cincias da

Sade da Universidade Estadual do Cear

como requisito para obteno do grau de

Mestre em Cincias Fisiolgicas.

_____/___________/______

Data

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy - Orientadora

Universidade Estadual do Cear - UECE

_______________________________________

Profo. Dr. Jos Henrique Leal Cardoso

Universidade Estadual do Cear - UECE

_______________________________________

Profo. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares

Universidade Federal do Cear - UFC

3

Deus, por sempre realizar a vontade

Dele em minha vida.

Dedico este Trabalho

4

AGRADECIMENTOS

Deus por permitir que eu viva a servir;

Aos meus pais por todo o esforo realizado para me ajudar a chegar at aqui;

Ao meu irmo Marcelo Lopes da Ponte por ter sido sempre minha referncia;

minha irm Cintia Lopes Ferreira da Ponte por sua doura e compreenso;

Ao meu irmo Matheus Lopes da Ponte que talvez hoje no entenda, mas que

daqui algum tempo ele vai ler isso e eu quero que ele saiba o quanto

importante para mim;

minha namorada Aline Oliveira Vitor por ser meu porto seguro;

Aos animais que doaram sua vida para o progresso da cincia;

Ao Colgio e Faculdade Christus por todo apoio concedido, em especial ao Dr.

Jos Rocha e Dr. Miguel Leito, que me incentivaram sempre a seguir a

docncia;

Profa. Dra Andrelina Noronha Coelho de Sousa por ser meu elo de ligao

com a cincia;

Profa Dra Ana Maria Sampaio Assreuy pelo exemplo de orientao,

perseverana, vontade, garra e dedicao;

Ao Dr. Jos Henrique Leal Cardoso por acreditar e confiar na vitria do nosso

mestrado e futuro doutorado;

Dr. Claudia Ferreira Santos, Ariclcio, Kildere, Adriano, rika, Natlia,

Giovanni, Luciano, Lorena Fidlis, Moabe, Carlos Eduardo, Cecla,

Hermgenes e todos que contriburam para a minha iniciao cincia;

5

Paloma Leo Sousa que em todos os momentos me ajudou sem vacilar;

Alana Freitas Pires que, alm de colega e amiga, uma pessoa exemplo de

prestatividade e humildade;

Gabriela que chegou ao LAFFIN e j deixa a sua marca de alegria, bondade

e doura;

Albertina, Lvia, Rmmulo, Natlia, Carol, Pmela, Felipe, Pedro e todos

aqueles que compem o LAFFIN;

A todos os meus colegas de mestrado: Fleury, Kerly, Camille, Paulo, Marco

Antonio, Liza, Rmulo, Jamile, Andr, Denise e tantos outros que o espao no

permite citar;

A todos os professores que me ensinaram at agora;

A todos que fazem parte do Instituto Superior em Cincias Biomdicas como: a

Ecila, Lindalva, Frank, Paulo Csar, a todos os guardas patrimoniais, Ccero, e

Cleidson;

Aos meus alunos e ex-alunos

FUNCAP pelo apoio financeiro

6

RESUMO

Os leos essenciais obtidos de plantas do gnero Croton

(Euphorbiaceae) possuem aroma agradvel e so fontes de molculas

biologicamente ativas, a partir das quais se obtm compostos quimicamente

distintos de elevado significado cientfico e amplo uso popular teraputico. O

leo essencial de Croton zehntneri (OECz), conhecido como Canela-de-

Cunh, apresenta como constituintes principais o anetol, estragol e o eugenol.

Baseado nas aes antiinflamatria in vitro, antioxidante e antinociceptiva do

OECz e/ou de seus principais constituintes, o objetivo desse trabalho foi

investigar a ao e o mecanismo anti-inflamatrio do OECz e do anetol, no

modelo de edema de pata em camundongos de origem no imune, induzido

por carragenina, e imune, induzido por ovalbumina em animais sensibilizados.

O tratamento sub-crnico dos animais com o OECz e o anetol tambm foi

realizado para avaliar possvel toxicidade sistmica.O OECz (10, 30 e 100

mg/kg; v.o.) e o anetol (3, 10 e 30 mg/kg; v.o.) inibiram o edema de pata

induzido por carragenina em cerca de 40 e 31%, respectivamente. Na

investigao do mecanismo da ao anti-inflamatria, o OECz (10mg/Kg) inibiu

os edemas induzidos por bradicinina (57%), histamina (54%), nitroprussiato de

sdio (45%) e substncia P (33%), mas no alterou aqueles induzidos por

serotonina, composto 48/80, cido araquidnico e prostaglandina E2. O anetol

inibiu os edemas induzidos por bradicinina (59%), serotonina (45%), substncia

P (36%) e histamina (30%), mas no alterou o edema induzido por

nitroprussiato de sdio. O efeito antiedematognico do OECz (35%) tambm foi

observado no modelo de inflamao imune. Os resultados do presente trabalho

mostram que o OECz e o anetol apresentam atividade antiedematognica em

modelo de inflamao aguda, cujo mecanismo envolve principalmente a

inibio de cininas, bem como do mediador de fase tardia, o xido ntrico. O

OECz e o anetol no apresentaram toxicidade sistmica, sendo esta uma

caracterstica promissora importante para uma futura utilizao como

fitoterpico.

Palavras-chave: leo essencial, anetol e Croton zehntneri

7

ABSTRACT

Essential oils from the gender Croton (Euphorbiaceae) are sources of bioactive

molecules, from which are obtained several compounds of diverse chemical

groups and great therapeutic potential in folk medicine. The essential oil of

Croton zehntneri (EOCz), popularly known as Canela-de-Cunh, possesses

anethole, estragole and eugenol as the main constituents. Based on the in vitro

antiinflammatory, antioxidant and antinociceptive properties of EOCz and/or its

main constituents, the aim of this study was to investigate the underlined

mechanism involved in the EOCz and anethole antiinflammatory action, using

models of mice paw edema of non immune and immune origin, induced by

carrageenin and ovalbumin (in desensitized animals), respectively. The animals

subchronic treatment with EOCz and anethole was also performed in order to

evaluate possible systemic toxicity. EOCz (10, 30, 100 mg/kg; p.o.) and

anethole (3, 10, 30 mg/kg; p.o.) inhibited the paw edema induced by

carrageenin about 40 and 31%, respectively. The investigation of the anti-

inflammatory mechanism showed that EOCz (10mg/Kg) inhibited the edema

induced by bradykinin (57%), histamine (54%), sodium nitroprusside (45%) and

substance P (33%), but did not alter those induced by serotonin, compound

48/80, arachidonic acid or prostaglandin E2. Anethole inhibited the edema

induced by bradykinin (59%), serotonin (45%), substance P (36%) and

histamine (30%) but did not interfere with the edema induced by sodium

nitroprusside. The EOCz antiedematogenic effect (35%) was also observed in a

model of immune inflammation. In summary, the present results show that

EOCz and anethole present antiedematogenic activity in a model of acute

inflammation, whose mechanism involves mainly their inhibitory action towards

kinins, but also upon the late phase mediator nitric oxide. EOCz and anethole

do not present systemic toxicity, being this important feature useful for future

phytotherapic application.

Key-words: essential oil, anethole, Croton zehntneri

8

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 Croton zehntneri Canela - de cunh 16

Figura 2 Estrutura molecular do anetol. 24

Figura 3 Efeito antiedematognico do OECz sobre o edema de pata

induzido por carragenina.

44

Figura 4 Efeito antiedematognico do anetol sobre o edema de pata

induzido por carragenina.

45

Figura 5 Efeito antiedematognico do OECz e anetol sobre o edema de

pata induzido por histamina.

47


pata induzido pelo composto 48/80.

48


pata induzido por bradicinina.

50


pata induzido pela substncia P.

51


pata induzido por serotonina.

53


pata induzido pelo nitroprussiato de sdio.

54


induzido por cido araquidnico e prostaglandina E2.

55


induzido por ovalbumina em animais sensibilizados.

57

Tabela 1 Constituintes qumicos do leo essencial de C. zehntneri 42

Tabela 2 Efeito inibitrio do OECz e do anetol sobre o curso temporal do

edema de pata induzido por carragenina.

46

Tabela 3 Resumo dos efeitos inibitrios do OECz e do anetol sobre o

curso temporal do edema de pata induzido por estmulos

inflamatrios.

56

Tabela 4 Tratamento sub-crnico com OECz e anetol no altera o peso

corporal dos animais nem o peso mido de seus rgos.

58

Tabela 5 Tratamento sub-crnico com OECz e anetol no altera os

parmetros bioqumicos de funo renal, heptica e cardaca.

58

9

LISTA DE ABREVIATURAS

ALT - alanina aminotransferase

AMPc - adenosina monofosfato cclico

ASC - rea sob as curva

AST - aspartato aminotransferase

ATP - adenosina trifosfato

BH4 - tetrabiopterina

CD4 - Grupamento de diferenciao 4

CD8 - Grupamento de diferenciao 8

Cg - carragenina

CK - creatinoquinase total

cm - centmetro (s)

COX - ciclo-oxigenase

C5a - quinto componente do sistema complemento ativado

DAG - diacilglicerol

EDRFs - fatores de relaxamento vascular derivados do endotlio

EDTA K3 cido etilenodiaminotetractico tripotssico

ELAM-1 - molcula endotelial de adeso de leuccito

eNOS - xido ntrico sintase endotelial

FcRI - receptores na superfcie de suas membranas

fMLP - Peptdeo N-formil-metil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina

g - grama (s)

GTP - guanosina trifosfato

h - hora (s)

H1 - receptor de histamina

HE - hematoxilina-eosina

HA - Histamina

ICAM-1 - Molculas de Adeso Intercelular-1

IgE - imunoglobulina E

IL-1 - interleucina-1

INF- - interferon-

iNOS - xido ntrico sintase induzvel

10

i.p - intraperitoneal

IP3 - trifosfato de inositol

K+ - potssio

Kg - quilograma (s)

LAM-1 - molcula leucocitria do leuccito

L-NAME - L- NG nitro arginina metil Ester

LPS - lipopolissacardeo

LTB4 - leucotrieno do tipo B4

mg - miligrama (s)

min - minuto (s)

ml - mililitro (s)

mm - milmetro

NaCl - cloreto de sdio

NADPH - nicotinamida adenina dinucleotdeo associado ao grupo fosfato e

on hidrognio

NK1 - receptor para substncia P

NO - xido ntrico

NOS - xido ntrico sintase

nNOS - xido ntrico sintase neuronal

nmol - nanomol

ng - nanograma

OECz - leo Essencial do Croton zehntneri

PCAM-1 - molcula de adeso de clula endotelial e plaqueta

PADETEC - Parque de desenvolvimento tecnolgico do Cear

PAF - fator ativador de plaquetas

PG - prostaglandinas

PSP-I - subunidade I da espermadesina suna

s.c. - sub-cutnea

SNC - Sistema Nervoso Central

SP - Substncia P

VCAM-1 - Molcula de Adeso Vascular

v.o. - via oral

TNF- - fator de necrose tumoral alfa

5-HT - serotonina

11

5-HT1- receptor serotoninrgico

g - micrograma (s)

l - microlitro (s)

m - micrometro (s)

12

SUMRIO

1 INTRODUO 14

1.1 ASPECTOS BOTNICOS DAS PLANTAS AROMTICAS DA

FAMLIA Euphorbiaceae 14

1.2 LEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS E SEUS

PRINCIPAIS CONTITUINTES. 16

1.3 PROPRIEDADES BIOLGICAS DE ALGUNS LEOS

ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS 18

1.4 PROPRIEDADES BIOLGICAS DO GNERO Croton 20

1.5 EFEITOS BIOLGICOS E FARMACOLGICOS DO LEO

ESSENCIAL DO Croton zehntneri E DE SEUS PRINCIPAIS

CONSTITUINTES

21

1.5.1 Anetol o principal constituinte do leo Essencial de Croton

zehntineri 23

1.6 RESPOSTA INFLAMATRIA 24

1.6.1 Alteraes vasculares 25

1.6.2 Eventos celulares e papel de molculas de adeso 27

1.6.3 Clulas residentes e seus mediadores 30

2. JUSTIFICATIVA 34

3. OBJETIVOS 35

4. MATERIAIS E MTODOS 36

4.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS 36

4.2 LEO ESSENCIAL 36

4.3 DROGAS E REAGENTES: 36

4.4 DISSOLUO DAS DROGAS E LEO 37

4.5 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATRIA 37

4.6 MODELO DE EDEMA DE PATA INDUZIDO POR

OVALBUMINA 39

4.7 ESTUDO DA TOXICIDADE SUBAGUDA DO LEO

ESSENCIAL DE C. zehntneri E ANETOL 39

4.8 ANLISE ESTATSTICA 41

5. RESULTADOS 42

5.1 COMPOSIO QUMICA DO LEO ESSENCIAL DE C. 42

13

zehntneri

5.2 O LEO ESSENCIAL DE C. zehntneri E O ANETOL INIBEM O

EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA

43

5.3 EFEITOS DO LEO ESSENCIAL DE C. zehntneri E DO

ANETOL SOBRE ALGUNS MEDIADORES INFLAMATRIOS

ENVOLVIDOS NA FASE INICIAL DO EDEMA DE PATA

INDUZIDO POR CARRAGENINA

46

5.3.1 Efeitos do OECz e do anetol sobre o edema de pata induzido

por histamina e pelo composto 48/80 46

5.3.2 O OECz e o anetol inibem o edema de pata induzido por

bradicinina 49

5.3.3 O OECz e o anetol inibem o edema de pata induzido pela

substncia P 49

5.3.4 O anetol, mas no o OECz inibe o edema de pata induzido

por serotonina 52

5.4 EFEITOS DO LEO ESSENCIAL DE C. zehntneri E DO

ANETOL SOBRE ALGUNS MEDIADORES INFLAMATRIOS

ENVOLVIDOS NA FASE TARDIA DO EDEMA DE PATA

INDUZIDO POR CARRAGENINA

52

5.4.1 O OECz mas no o anetol, inibe o edema de pata induzido

pelo nitroprussiato de sdio 52

5.4.2 Ausncia de efeito inibitrio do OECz sobre o edema de pata

induzido por cido araquidnico e PGE2 55

5.5 O LEO ESSENCIAL DE C. zehntneri INIBE O EDEMA DE

PATA INDUZIDO POR OVALBUMINA EM CAMUNDONGOS

SENSIBILIZADOS

56

5.6 O LEO ESSENCIAL DE C. zehntneri E O ANETOL NO

APRESENTA TOXICIDADE SISTMICA 57

6 DISCUSSO 59

7 CONCLUSES 65

8 REFERNCIAS 66

14

1 INTRODUO

A investigao das propriedades qumicas e farmacolgicas de plantas

medicinais nativas deve ser vista como uma importante estratgia cientfica

e/ou econmica na busca de alternativas teraputicas, diagnsticas e/ou

biotecnolgicas. A utilizao indiscriminada destas plantas, sem a devida

validao experimental, pode trazer srias complicaes para a sade da

populao.

leos essenciais so misturas complexas, farmacologicamente ativas,

que conferem aromas e sabores caractersticos, conhecidos como leos

etreos ou leos volteis. temperatura ambiente, os leos essenciais (ou

volteis) apresentam-se como lquidos oleosos de alta volatilidade, o que os

diferencia dos leos fixos (MATOS; FERNANDES, 1978; SIMES et al., 1999).

1.1 ASPECTOS BOTNICOS DAS PLANTAS AROMTICAS DA

FAMLIA Euphorbiaceae

A famlia Euphorbiaceae uma das mais estudadas no Brasil,

apresentando substncias volteis distribudas por todos os rgos da planta,

que podem representar fonte renovvel de substratos (BRITO; BRITO, 1993).

Esta famlia possui cerca de 7.500 espcies reunidas em 290 gneros

(WEBSTER, 1993; BARROSO, 1991), dentre eles o gnero Croton com

espcies ocorrendo em abundncia no mundo inteiro, sendo mais evidentes

nas regies tropicais e temperadas (ALLEN, 1976; JOLLY, 1977; LAWRENCE,

1951).

O gnero Croton um dos maiores representantes da famlia

(WEBSTER, 1994), compreendendo cerca de 750 a 800 espcies de

distribuio neotropical (RANDAU et al., 2004) e segundo Craveiro et al. (1980)

o de maior disperso no Nordeste, onde se encontram as grandes

populaes vegetais de Marmeleiros e Velames na vegetao secundria.

15

Segundo estudos botnicos realizados por Souza e Lorenzi (2008), o gnero

Croton o mais comum em todos os ecossistemas terrestres brasileiros,

amplamente distribudo na flora nordestina brasileira, nas regies de cerrado,

matas dos tabuleiros litorneos, matas pluviais e, principalmente, nas caatingas

nordestinas, e de grande utilidade medicinal ao homem do campo (DUCKE,

1959; VILA VERDE, 2005). De acordo, com as denominaes populares, as

espcies de Croton nativas no Nordeste do Brasil, podem ser agrupadas nas

categorias: canelas silvestres, marmeleiros e velames (FERNANDES et al.,

1971).

O Croton zehntneri Pax et Hoffm, cujo leo essencial explorado nesse

trabalho, um arbusto delicado e muito aromtico, com ramos que so

revestidos de pelos estrelados. As inflorescncias apresentam-se em racenos

contnuos e desinfloras de 3 a 8 cm de comprimento. O fruto mostra cpsula

subglobosa, trilobulada, medindo de 4 a 5 mm de comprimento. A planta

produz quantidade razovel de leo essencial com rendimento de 1,5 - 3% do

peso de suas folhas (CRAVEIRO et al., 1980). Este vegetal caracterstico de

solo arenoso, branco e bem drenado, pode chegar a dois metros de altura,

apresenta caule com colorao avermelhada e folhas curto-pecioladas de at 5

centmetros de comprimento, um centmetro de largura (lanceoladas) e com

filotaxia helicoidal. As folhas so do tipo simples e alternadas, possuindo cerca

de 2 a 3,5 cm de comprimento e 1,5 a 3 cm de largura. No limbo h nervura

proeminente na face dorsal e sulco na face ventral. O pecolo foliar

pubescente de cerca de 2 mm.

O Croton zehntneri pertence categoria das canelas silvestres,

popularmente conhecido como canela de cunh. Possui como principal

caracterstica o aroma forte e adocicado, semelhante ao anis (Illicium verum),

ao cravo da ndia (Eugenia caryophyllata) ou mistura de ambos

(FERNANDES et al., 1971), que exalado por todas as partes da planta

(CRAVEIRO et al., 1980). usado popularmente por suas aes sedativa,

estimulante de apetite, anti-sptica e para distrbios gatrintestinais (MATOS,

1999).

16

1.2 LEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS E SEUS

PRINCIPAIS CONTITUINTES.

Os leos essenciais encontram-se na forma de pequenas gotas entre as

clulas, associadas a vrias funes necessrias sobrevivncia do vegetal

em seu ecossistema. Dentre essas funes, podemos destacar seu papel na

defesa contra microorganismos e predadores bem como na atrao de insetos

Figura 1 - Croton zehntineri - Canela - de - cunh

e outros agentes fecundadores (LAVABRE, 1993; SIQUI et al., 2000).

Representam fontes de molculas biologicamente ativas, a partir das quais se

tm produzido compostos com grande significado teraputico e cientfico

(TISSERAND; BALACS, 1995). Estima-se que exista cerca de 3000 leos

essenciais conhecidos, dos quais 300 so importantes comercialmente, pois

so destinados principalmente ao mercado de aromatizantes e perfumes (VAN

DE BRAAK; LEIJTEN, 1999).

Os leos essenciais apresentam composio lipoflica quimicamente

diferente da composio glicerdica dos verdadeiros leos e gorduras. So

geralmente incolores ou ligeiramente amarelados e pouco instveis em

17

presena de ar, luz, calor e umidade (MATOS; MATOS, 1989; TISSERAND;

BALACS, 1995).

Os leos essenciais so produtos de composio complexa extrados de

plantas por vrios processos, sendo o mais utilizado a destilao por arraste de

vapor dgua (CRAVEIRO et al., 1976; BRUNETON, 1995). Essas plantas tm

um contedo de leo essencial em torno de 0,1 a 0,5% e, raramente, de 1 a

5%, do peso verde (BRUNETON, 1995).

Um problema muito comum na pesquisa de atividade biolgica que

mesmo simples extratos ou outros produtos derivados de plantas podem conter

uma mistura de vrios compostos que esto sujeitos variao de

concentrao de acordo com mudanas ambientais (TAYLOR et al., 2001). A

composio qumica dos leos essenciais pode variar muito, incluindo

hidrocarbonetos terpnicos, alcois, cetonas, aldedos, teres, xidos, steres

entre outros. comum encontrarmos leos volteis contendo mais de 200

constituintes, sendo um predominante e os demais aparecendo como

elementos-trao. Esses componentes, incluindo-se os elementos-trao, tm

importncia fundamental no aroma. importante destacar que plantas de uma

mesma espcie, cultivadas em diferentes partes do mundo, apresentam via de

regra leos essenciais com a mesma composio qualitativa, porm diferindo

nas propores dos seus constituintes (ROBBERS, et al., 1996; MATOS;

FERNANDES, 1978; LAVABRE, 1993).

Embora a composio qumica dos leos essenciais de uma planta

determinada geneticamente, alguns fatores podem alterar esta composio,

tais como quimiotipo, ciclo vegetativo, rgo utilizado para extrao, poca do

ano, temperatura e horrio da coleta. Como exemplo, o leo essencial de

Ocimum gratissimum coletado em Fortaleza apresenta um teor de eugenol que

varia de 98,02% ao meio dia at 11,37% s 17h, enquanto o teor de 1,8 cineol

zero ao meio, mas se a coleta for s 17h, pode chegar at 75,5% (LAVABRE,

1993; MATOS et al. 1989; SILVA et al. 1992).

O leo essencial do Croton zehntneri (OECz) apresenta como principais

constituintes os derivados de fenilpropanos; anetol (principalmente o trans-

18

anetol), estragol e eugenol, tambm presentes com bastante frequncia nos

leos essenciais de outras plantas (CRAVEIRO et al., 1978; CRAVEIRO et al.,

1981). Foi verificado que o teor desses constituintes varia de acordo com a

localidade onde a planta coletada (CRAVEIRO et al., 1981). Desta forma,

classificou-se o Croton zehntneri em trs quimiotipos: quimiotipo anetol, aquele

que contm um considervel percentual de anetol, embora no seja o principal

constituinte (anetol 28% e estragol 75% do peso do leo); quimiotipo eugenol

(eugenol 68,5% do peso do leo) e estragol (estragol 80% do peso do leo)

onde o teor de anetol muito baixo. No entanto, encontrou-se na localidade de

Viosa do Cear uma amostra cujo leo contm cerca de 85% de anetol. Ainda

esto presentes nesta amostra o mirceno, o cariofileno, o -elemeno, o 1-8-

cineol e o -pineno (CRAVEIRO et al., 1981).

A canela de cunh bastante utilizada na medicina popular, na forma

de ch ou infuso, como sedativo, estomquico, antiespasmdico,

antianorexgeno e antidiarrico (CRAVEIRO et al., 1977, 1978, 1980; MATOS,

1999). Apesar do largo uso, pouco se tem investigado sobre os seus efeitos

farmacolgicos.

1.3 PROPRIEDADES BIOLGICAS DE ALGUNS LEOS

ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS

Os leos essenciais, em funo de sua complexa composio qumica,

apresentam uma diversidade de atividades biolgicas. Uma propriedade

amplamente descrita a antimicrobiana, que est presente na grande maioria

destes compostos (RAO; NIGAM, 1970; LIMBERGER et al., 1998; SANTOS et

al., 1998; GUENTHER, 1976; MILHAU et al., 1997, LOPES-LUTZ et al., 2008)

e representa de certa forma, uma extenso do prprio papel de proteo que

exercem nas plantas contra bactrias e fungos fitopatognicos (JANSSEN et

al., 1987). Esta propriedade foi demonstrada contra o Bacilus typhosus e

Klebsiella pneumoniae (GUENTHER, 1976). No leo extrado das folhas de

Eugenia jambola (jambolo) e E. bracteate, esta atividade foi demonstrada

contra o Vibrio cholerae e Salmonella typhi (RAO; NIGAM, 1970). Nos gneros

19

Psidium e Pilocarpus, contra Pseudomonas aeruginosa (SANTOS et al., 1998)

e recentemente, para vrias espcies do gnero Artemisia, contra Escherichia

coli, Staphylococcus aureus e S. epidermidis (LOPES-LUTZ et al., 2008). Em

2002, Holetz e colaboradores observaram que vrias plantas brasileiras de uso

popular possuem atividade antibacteriana com comprovao cientfica, e em

muitas delas este efeito se d atravs de seu leo essencial.

Outros leos essenciais foram efetivos contra Plasmodium falciparum in

vitro (MILHAU et al., 1997), Entamoeba histolytica (DE BLASI et al., 1990), a

cercria do Schistosoma mansoni (MENDES et al., 1990), alguns tipos de

vrus, incluindo herpes simplex tipo 1 e 2 (SIDDIQUI et al., 1996; KOCH et al.,

2008), influenza e HIV (HAYASHI et al., 1995, ASRES et al., 2005).

Pesquisas com leos essenciais tm revelado seu potencial como

agentes repelentes de insetos vetores de doenas como os mosquitos do

gnero Aedes, transmissores da dengue (MATSUDA et al., 1996) e da doena

de Chagas (FOURNET et al., 1996). H tambm a ao larvicida contra o

mosquito transmissor da dengue (MORAIS et al., 2006).

Alm das propriedades antimicrobianas dos leos essenciais, foram

evidenciados efeitos diurticos e hipotensores (CONSOLINI et al., 1999;

LAHLOU et al., 2000), anti-fngicos (LIMA et al., 2006), anticonvulsivantes

(FURTADO et al., 2000); antipirticos e depressores do sistema nervoso

central (MECKES et al., 1996). Merecem ser destacadas as atividades

miorrelaxante e antiespasmdica (COELHO-DE-SOUZA et al., 1997, 1998;

MAGALHES et al., 1998; BEZERRA et al., 2000; LIMA et al., 2000; PINTO et

al., 2009); anti-cncer (ASHOUR, 2008); gastroprotetora (PAULA et al., 2006);

antioxidante (MONTEIRO et al., 2007); analgsica e anti-inflamatria (LINO et

al., 2005; LIN et al., 2008)Para o leo essencial de Ocimum gratissimum foi

demonstrado o efeito relaxante sobre os msculos lisos de leo de cobaia

(MADEIRA et al., 2002, 2005) e aorta de ratos hipertensos (INTERAMINENSE

et al., 2007), bem como os efeitos anti-inflamatrio (RABELO et al., 2001) e

antinociceptivo (RABELO et al., 2003)

20

1.4 PROPRIEDADES BIOLGICAS DO GNERO Croton

Nas ltimas dcadas, nosso grupo vem estudando, do ponto de vista

farmacolgico e fisiolgico, os leos essenciais de plantas medicinais,

principalmente do gnero Croton, usadas na medicina popular nordestina, na

tentativa de caracterizar seus efeitos e verificar a contribuio de seus

constituintes isolados.

Dentre as plantas do gnero, esto sendo estudadas as do Croton

argyrophylloides, C. nepetaefolius, C. sonderianus e C. zehntneri, para as quais

foi demonstrada a atividade larvicida contra o Aedes aegypti (LIMA, 2006) e

para seus leos essenciais a atividade antioxidante (MORAIS et al., 2006).

Os leos essenciais de C. zehntneri, C. argyrophylloides e C.

nepetaefolius apresentaram atividade antifngica e potencialidade fitoterpica

para dermatofitoses (FONTENELLE et al., 2008). O leo essencial de C.

nepetaefolius (MAGALHES et al., 1998) e seus principais constituintes

(MAGALHES et al., 2004) apresentaram efeitos vasorelaxante, miorelaxante e

anti-espasmdico no msculo liso de aorta, traquea e intestino (MAGALHES

et al., 2003, 2008), atividade hipotensora em ratos hipertensos (LAHLOU et al.,

2000), bem como bloqueio da excitabilidade do nervo citico (LIMA-ACCIOLY

et al., 2006) e efeito antinociceptivo em camundongos (ABDON et al., 2002).

Foi verificada tambm a ao antinociceptiva para o leo essencial de C.

sonderianus (SANTOS et al., 2005). Alm destas, a atividade anti-inflamatria

foi demonstrada para os leos essenciais de C. celtidifolius (SUREZ et al.,

2003), C. cuneatus (SUREZ et al., 2006) e C. malambo (NARDI et al., 2007).

Esta atividade, assim como os efeitos antinociceptivo, antiulcerognico e

vasorelaxante, foram demonstrados em roedores para o leo essencial do C.

cajucara, popularmente conhecido como sacaca (CARVALHO et al., 1996;

CAMPOS et al., 2002; ALBINO DE ALMEIDA et al., 2003; BIGHETTI et al.,

1999; SILVA et al., 2005). O Croton flavens apresentou atividade

antineoplsica em tumores pulmonares e do clon (SYLVESTRE et al., 2006).

21

Do gnero Croton, uma das plantas cujo estudo do leo essencial nosso

grupo muito tem investido o Croton zehntneri.

1.5 EFEITOS BIOLGICOS E FARMACOLGICOS DO LEO

ESSENCIAL DO Croton zehntneri E DE SEUS PRINCIPAIS

CONSTITUINTES

Os efeitos do OECz j foram descritos em nervo isolado

(ALBUQUERQUE et al., 1981, 1984) e no msculo esqueltico

(ALBUQUERQUE et al., 1984). Alm disso, foi sugerido que este leo e seus

constituintes anetol e estragol, promovem relaxamento em msculo esqueltico

de sapo pelo bloqueio da transmisso neuromuscular e aumento da

concentrao citoplasmtica de clcio no retculo sarcoplasmtico

(ALBUQUERQUE et al., 1995). As aes do OECz e do estragol tambm foram

estudadas no msculo liso intestinal de cobaia (COELHO-DE-SOUZA et al.,

1997, 1998) e sobre alguns parmetros cardiovasculares (SIQUEIRA et al,

2006; 2006b). Foi demonstrada tambm atividade antinociceptiva na segunda

fase do teste de formalina (OLIVEIRA et al., 2001) e dados preliminares

apotaram uma baixa toxicidade aguda e sub-aguda em camundongos

(OLIVEIRA et al., 2004). Somado a esses efeitos, este leo essencial

apresenta atividade depressora sobre o sistema nervoso central, bem como as

aes antioxidantes e antihelmntica (BATATINHA; SOUZA-SPINOZA;

BERNADI, 1995; MORAIS et al., 2006; CAMURA-VASCONCELOS et al.,

2007).

Tem sido demonstrada uma diversidade de aes para os constituintes

majoritrios do OECz (anetol, estragol e eugenol) (CRAVEIRO et al., 1981).

O estragol, um ismero do anetol, possui ao depressora fulgaz sobre

o SNC, com alteraes de alguns reflexos comportamentais (LE BOURHIS;

SOENEN, 1973; CONSENTINO et al., 2004); discreta potencializao do

tempo de repouso promovido pelo pentobarbital (SETO; KEUP, 1969); efeito

22

anestsico, miorrelaxante e anticonvulsivante (DALLMEIR; CARLINI, 1981;

ALBUQUERQUE et al., 1981), bloqueio da excitabilidade do nervo citico de

rato (LEAL-CARDOSO et al, 2004), aumento da temperatura e da

aminotransferase sangunea em camundongos (KALEDIN et al., 2007).

O eugenol possui propriedades analgsica (GUENETTE et al., 2006),

anestsica local (DALLMEIR; CARLINI, 1981), anti-espasmdica (WAGNER et

al., 1979) e antibacteriana contra Helicobacter pylori (ALI et al., 2005). Em

tecido nervoso, o eugenol bloqueia tanto a conduo do potencial de ao em

nervo frnico como a juno neuromuscular (BRODIN; ROED, 1984; OZEKI et

al., 1975). Em neurnios do gnglio da raiz dorsal posterior o eugenol estimula

uma corrente inica dependente de Ca++ e de cloreto com caractersticas

semelhantes quelas promovidas pela capsaicina (OHKUBO; KITAMURA,

1997). De maneira semelhante ao anetol e ao estragol, o eugenol mostra

atividade depressora do SNC apresentando efeito anestsico geral e indutor de

hipotermia (DALLMEIR; CARLINI, 1981). Alm disso, o eugenol apresenta

efeito antinociceptivo em camundongos em vrios modelos (OHKUBO;

SHIBATA, 1997), provavelmente devido inibio de canais de clcio (CHUNG

et al., 2008).

Em msculo liso vascular, o eugenol promove vasodilatao de artrias

contradas com norepinefrina, por alta concentrao de K+ e estimulao

eltrica (STICHT; SMITH, 1971; HUME, 1983; NISHIJIMA et al., 1999).

O eugenol (ROMPELBERG et al., 1996) e o anetol (DRUKARCH et al.,

1997) mostraram efeito modulador das concentraes intracelulares de

substncias antioxidantes como o glutation e a enzima glutation-N-transferase

(BOUTHILLIER et al., 1996). Essas substncias, alm de antioxidantes,

tambm inibem a peroxidao lipdica (NAGABABU; LAKSMAIAH, 1994;

MANSUY et al., 1986) e atuam como removedores de radicais hidroxilas

(TAIRA et al., 1992). O eugenol reduz a concentrao intracelular de glutation e

Trifosfato de Adenosina (ATP) em fibroblastos da mucosa oral humana em

cultura, alm de inibir a peroxidao lipdica e o sistema xantina/oxidase (JENG

et al., 1994) e possuir atividade anticarcinognica (PISANO et al., 2007).

23

Tambm reduz a liberao de mediadores inflamatrios induzidos por

lipopolissacardeos (LPS) em macrfagos humanos (LEE et al., 2007).

1.5.1 Anetol, o principal constituinte do leo essencial de Croton

zehntineri

O anetol inibe de forma reversvel a formao de glicognio (COT;

OLENSON, 1951); apresenta ao estrognica em ratos (ZONDEK;

BERGMANN, 1938); ao depressora do sistema nervoso central (BOISSIER

et al., 1967); propriedades psicolpticas em camundongos (LE BOURHIS;

SOENEN, 1973); anticonvulsivante e hipntico (MARCUS; LICHTENSTEIN,

1979); inseticida e antimicrobicida (CHANG; CHO; LI, 2009; KARAPINAR,

1990) e efeito analgsico (MARCUS; LICHTENSTEIN, 1979) . Alm disso,

relaxa o msculo o isolado de aorta de ratos, envolvendo canais de clcio

dependentes de voltagem (SOARES et al., 2007). Sabe-se que o anetol um

terpenide (Fig.2), e pesquisas mostram que alguns possuem atividade anti-

inflamatrio in vitro (SALMINEN, et al., 2008). Alguns trabalhos tm atribudo

ao anetol as atividades anticarcinognica (CHAINY et al.,2000), antitrombtica

e gastroprotetora (TOGNOLINI et al., 2007), antigenotxica (ABRAHAM, 2001);

antioxidante (FREIRE et al., 2005) anti-inflamatria (CHAINY et al., 2000; YEA

et al., 2006).

O trans-anetol bastante utilizado como aromatizante na fabricao de

bebidas (licores, gins, aguardentes da cana etc.) e em formulaes

farmacuticas (LE BOURHIS; SOENEN, 1973). Quando administrado por via

endovenosa, se distribui irregularmente pelo organismo, se acumulando em

certos rgos como fgado, pulmes e crebro. Depois de absorvido por via

oral rapidamente metabolizado (LE BOURHIS, 1968; FRITSCH et al., 1975).

24

Figura 2 Estrutura molecular do anetol

1.6 RESPOSTA INFLAMATRIA

A inflamao uma resposta complexa de defesa de um tecido vivo em

especial de tecidos vascularizados contra estmulos agressores, na tentativa de

destruir, imobilizar ou diluir o agente lesivo. Essa reao envolve vrias

alteraes locais, como por exemplo: dilatao de arterolas, capilares e

vnulas, aumento do fluxo sanguneo acompanhado de alteraes na

permeabilidade vascular, exsudao de lquidos e protenas plasmticas para o

espao extravascular (eventos vasculares) e migrao de leuccitos para o

foco inflamatrio (eventos celulares) (ROCHA; SILVA, 1978; SEDGWICK;

WILLOUGHBY, 1985).

Alm das alteraes locais, a inflamao aguda se caracteriza por uma

srie de alteraes sistmicas como dor, febre, elevao nos nveis de

protenas, caracterizadas em conjunto como protenas de fase aguda (-2

macroglobulina, inibidor de C1- esterase, fibrinognio, haptoglobina,

componentes C3 e C5 do complemento, protena C-reativa) (BAUHMANN;

GAULDIE, 1994) alterao nos nveis de alguns ons e metais. Tem sido

demonstrado que a produo de IL-6 pelo fgado essencial para a induo da

expresso de protena C reativa, sugerindo que o aumento nos nveis desta

25

protena de fase aguda seja secundrio ao aumento da secreo de IL-6 (DAS,

2002).

A cintica do processo inflamatrio ocorre em dois momentos. O

primeiro, que desencadeado logo aps a infeco (inflamao aguda),

caracterizado por infiltrado predominantemente neutroflico; e outro, que

depende ou no da resoluo do processo na fase aguda (inflamao crnica),

caracterizado pela presena de macrfagos e linfcitos, alm de angiognese

e proliferao de tecido conjuntivo. Clinicamente, a inflamao aguda

apresenta algumas caractersticas especficas resultantes das alteraes

vasculares e celulares que o tecido sofre. Essas alteraes foram inicialmente

descritas por Cornelius Celsus, no incio da era crist como os quatro sinais

cardinais da inflamao: dor, calor, tumor e rubor. Mais tarde, no sculo XIX,

Virchow introduziu a perda de funo do rgo lesionado como sendo o quinto

sinal cardinal (SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1985).

Todos os eventos inflamatrios, em qualquer fase do processo, so

mediados por substncias qumicas advindas do plasma sanguneo ou de

clulas que se encontram no foco inflamatrio, sejam elas residentes ou no.

Essas substncias so chamadas de mediadores inflamatrios, e quando

inibidas ou estimuladas podem modular negativa ou positivamente a

inflamao. Em alguns casos, a modulao negativa se torna necessria, pois

quando o processo inflamatrio persiste, pode ocorrer um estado patolgico

com leso de clulas normais do hospedeiro (BAUHMANN; GAULDIE, 1994;

BROID, 1991).

1.6.1 Alteraes vasculares

Inicialmente, ocorre uma vasoconstrio transitria seguida de

vasodilatao, que responsvel pelo aumento do fluxo sanguneo, o que

provoca calor e eritema. Posteriormente, ocorre a estase sangunea advinda do

aumento de permeabilidade da microvasculatura, uma vez que o

extravasamento de lquidos e protenas para o interstcio provoca

26

hemoconcentao, aumentando a viscosidade sangunea e gerando o

alentecimento da circulao. Esses eventos so desencadeados por vrios

mediadores qumicos, incluindo-se a bradicinina, a serotonina (5-HT), a

histamina e as prostaglandinas da srie E e I (PGE e PGI). Estes dois ltimos

so metablitos do cido araquidnico, formados atravs da ativao da via

das ciclooxigenases (COX). Essas enzimas coexistem nas isoformas

constitutiva, que produzem prostaglandinas em quantidades fisiolgicas, e

induzida, que produzem prostaglandinas em grandes quantidades, sendo estas

ltimas as principais responsveis pelos eventos inflamatrios (BHANDARI et

al., 2005). Recentemente uma terceira forma de cicloxigenase foi descoberta e

sabe-se que expressa em humanos, pricipalmente no crtex cerebral e no

corao (CHANDRASEKHARAN et al., 2002). Alguns desses mediadores,

como a bradicinina, causam dilatao induzindo a liberao de fatores de

relaxamento vascular derivados do endotlio (EDRFs). J foi demonstrado que

o xido ntrico (NO) um dos EDRFs liberados pelas clulas endoteliais

(PALMER et al., 1987; MONCADA et al., 1991), que participa do controle do

fluxo sangneo (FORTES et al., 1994), da expresso de molculas de adeso

e do aumento da permeabilidade vascular induzida pelo fator ativador de

plaquetas (PAF) e pela prpria bradicinina (MAYHAN, 1992). O NO

sintetizado a partir da combinao da L-arginina e do oxignio molecular, tendo

como principais cofatores a nicotinamida adenina dinucleotdeo associado ao

grupo fosfato e on hidrognio (NADPH) e o tetrabiopterina (BH4), pela enzima

xido ntrico sintase (NOS). H trs diferentes isoformas de NOS, a endotelial

(eNOS) e a neuronal (nNOS), que so formas constitutivas e dependentes de

Ca++ para suas atividades, e a forma induzvel (iNOS), que no depende de

Ca++ e induzida por macrfagos ativados por citocinas pr-inflamatrias ou

por endotoxinas (NATHAN, 1997; THIEMERMAN, 1997; LUNDBERG et al.,

2008).

O aumento da permeabilidade vascular pode ocorrer por diferentes

mecanismos, dependendo dos receptores ativados na clula endotelial ou da

leso provocada no vaso sanguneo. Prope-se que a histamina e leucotrienos

causam contrao endotelial; interleucina-1 (IL-1) e fator de necrose tumoral

alfa (TNF-) participam da reorganizao citoesqueltica endotelial; leuccitos

27

ou agentes agressores provocam leso vascular direta e extravasamento de

fluidos; fator de crescimento endotelial vascular gera aumento da transcitose e

neovascularizao, que tambm provoca extravasamento de fluidos. O

exsudato contm vrios mediadores que influenciam as clulas adjacentes e os

prprios vasos sanguneos e incluem os produtos da ativao de quatro

cascatas enzimticas do plasma: sistema do complemento, sistema da

coagulao, sistema fibrinoltico e sistema das cininas (ROBBINS et al., 1994).

O edema causado por agentes flogsticos como a carragenina e a

dextrana, tem sido amplamente empregado como modelo experimental para o

estudo da inflamao (KATZ et al., 1984) e as substncias capazes de inibi-lo

tm sido consideradas, bons agentes anti-inflamatrios (GODHWANI et al.,

1987).

A resposta inflamatria possui caractersticas diferentes de acordo com

o tipo de estmulo. Por exemplo, a dextrana promove a liberao de

mediadores vasoativos, como histamina e serotonina, esse estmulo

caracteriza-se por produzir um edema osmtico sem infiltrado celular. J a

carragenina promove a liberao de uma srie de mediadores qumicos, como

histamina, serotonina, bradicinina numa fase inicial, e NO, prostaglandinas, IL-

1, TNF- numa fase tardia, induzindo um edema rico em infiltrado celular. Alm

disso, clulas inflamatrias residentes so essenciais no desencadeamento

dessas respostas (SALVEMINI et al., 1999; KATZ et al., 1984).

1.6.2 Eventos celulares e papel de molculas de adeso

Uma maneira eficiente de o hospedeiro defender-se contra agentes

agressores atravs da migrao de leuccitos, que ao alcanarem o foco da

infeco fagocitam, degradam e matam antgenos estranhos. Muitas vezes,

num processo inflamatrio prolongado estas clulas imunes podem agredir os

prprios tecidos do hospedeiro, lesionando clulas normais. Alm do que o

prprio infiltrado celular pode contribuir para a amplificao dos eventos

28

vasculares e celulares da resposta inflamatria, atravs da liberao de

mediadores vasoativos e quimiotticos (BEVILACQUA et al., 1994;

WEDMORE; WILLIAMS, 1981).

Os tipos celulares presentes no foco inflamatrio variam de acordo com

o estgio da leso e tipo de estmulo. Nas primeiras 24 horas predominante o

infiltrado neutroflico, sendo este mais tarde substitudo por clulas

mononucleares. Para os leuccitos alcanarem o local infectado necessrio

que passem por um processo complexo que envolve a adeso destes ao

endotlio vascular e componentes da matriz extracelular, bem como a

passagem destas clulas para o espao extravascular (McEVER, 1991). De um

modo geral, a migrao de leuccitos ocorre nas seguintes etapas: 1.

marginao; 2. rolamento (adeso fraca); 3. adeso firme; 4. diapedese e 5.

quimiotaxia.

Aps a alterao do fluxo laminar sanguneo provocado pelos eventos

vasculares, os leuccitos comeam a migrar para a regio vascular perifrica,

fenmeno chamado de marginao. Posteriormente, essas clulas interagem

com molculas de adeso (selectinas, integrinas e imunoglobulinas), que so

extremamente importantes para o trfego de leuccitos na corrente sangunea

e modulao da migrao, pois possibilitam sua adeso do leuccito ao

endotlio (McEVER,1992). Nesse sentido, demonstrou-se que populaes de

linfcitos derivados de um determinado stio linfide, quando removidas e

reinjetadas em animais, se deslocam para o local onde originalmente foram

encontradas. Mais tarde foi confirmado que a natureza bioqumica dessas

molculas de adeso era lectnica (LASKY, 1992).

As selectinas so formadas por trs sub-famlias: selectinaL (LAM-1),

encontrada constituitivamente na superfcie de leuccitos mediando o

rolamento de neutrfilos no endotlio e o movimento dos mesmos para os

tecidos linfides perifricos, uma vez que seus ligantes (mucinas) esto

presentes nesses locais; selectinaP, presente na superfcie de plaquetas,

sendo tambm expressas no endotlio vascular sob a ativao de citocinas,

trombina, histamina e outros e se liga a resduos silicos de oligossacardeos

29

dos leuccitos de maneira dependente de Ca++; selectina-E (ELAM-1),

expressa na superfcie do endotlio vascular em resposta a estmulos como IL-

1 e TNF-, que se liga a resduos silicos de oligossacardeos dos leuccitos

de maneira dependente de Ca++ (McEVER, 1991, 1992; VARKI, 1992;

EPPIHIMER et al., 1996; PAN et al., 1998).

Aps o rolamento, segue-se a adeso firme mediada por

imunoglobulinas e -2 integrinas. Essas ltimas so protenas presentes na

membrana dos leuccitos e que podem ter sua expresso aumentada aps a

ativao destas clulas por mediadores inflamatrios como o fator de

agregao plaquetria (PAF) ou citocinas. As imunoglobulinas de adeso,

molculas presentes no endotlio, mais ligadas ao processo de migrao so:

Molculas de Adeso Intercelular-1 (ICAM-1), Molculas de Adeso

Intercelular-2 (ICAM-2), Molcula de Adeso Vascular (VCAM-1) e molcula de

adeso de clula endotelial e plaqueta (PCAM-1). Mediadores inflamatrios

liberados por clulas residentes ativadas podem agir aumentando a avidez de

ligao entre as molculas de integrinas e imunoglobulinas, favorecendo a

adeso firme (CRONSTEIN; WEISSMAN, 1993; PANS, et al., 1999).

O leuccito, aps passar por esses processos adesivos sofre a

diapedese, que caracterizada pela sada desta clula do interior do vaso

sanguneo para o tecido inflamado por entre as junes endoteliais. Porm,

essa passagem controversa, pois alguns pesquisadores demonstraram que

neutrfilos podem migrar por via transendotelial em resposta a um agente

quimiottico direto como o peptdeo N-formil-metil-L-metionil-L-leucil-L-

fenilalanina (fMLP) (FENG et al.,1998).

No espao extravascular, os leuccitos podem sofrer quimiotaxia para o

foco da infeco. Esse processo controlado por agentes quimiotticos, tanto

de origem endgena, que so aqueles liberados pelas prprias clulas do

hospedeiro (componentes do sistema complemento, citocinas etc.), quanto

exgena, que so aqueles advindos do prprio agente agressor (produtos

bacterianos de origem lipdica e fMLP (RIBEIRO et al.,1991; 1996).

30

Os agentes quimiotticos tambm podem ser classificados como

agentes diretos, que agem atraindo diretamente a clula imune leucotrieno do

tipo B4 (LTB4), quinto componente do sistema complemento ativado (C5a),

fMLP, interleucina-8 (IL-8), subunidade I da espermadesina suna (PSP-I) ou

agentes indiretos (IL-1, TNF-) que agem estimulando as clulas residentes

(macrfagos, mastcitos, fibroblastos etc.) a liberar os agentes quimiotticos

diretos (RIBEIRO et al.,1991; 1996; ASSREUY et al., 2002; 2003).

Segundo Snyderman e Didsbury (1991) o agente quimiottico direto age

ligando-se a receptores de superfcie presente na membrana da clula imune.

Esses receptores so acoplados a protena G, e quando estimulados levam a

ativao da fosfolipase C que resulta na formao de trifosfato de inositol (IP3)

e diacilglicerol (DAG). Estes, por sua vez, aumentam os nveis intracelulares de

Ca++, tanto pela liberao de clcio do retculo sarcoplasmtico (receptores de

IP3), como pelo aumento do influxo deste on advindo do meio extracelular. Os

nveis de Ca++ aumentados levam a interao dos miofilamentos contrteis

fazendo com que a clula emita pseudpodes em direo ao estmulo.

1.6.3 Clulas residentes e seus mediadores

Clulas inflamatrias residentes so aquelas que habitam

originariamente determinados tecidos, incluindo macrfagos, mastcitos,

linfcitos, fibroblastos e clulas endoteliais, dentre outras. Duas das mais

importantes clulas residentes so os macrfagos e os mastcitos, que na

presena de um agente agressor, so ativadas e liberam mediadores qumicos

que desencadeam os eventos iniciais da resposta inflamatria. Esses

mediadores promovem tanto os eventos vasculares quanto os celulares, e

desta forma provocam migrao de outras clulas de defesa e amplificao

dessa resposta.

Macrfagos teciduais so clulas derivadas de moncitos sanguneos

durante o processo de migrao para o tecido (OGLE et al., 1994). Entretanto,

31

estas clulas apresentam diferenas bioqumicas e estruturais de acordo com o

local onde se implantam, recebendo inclusive nomenclaturas diferentes, como:

clulas de Kupfer (macrfagos hepticos), osteoclastos (macrfagos sseos),

histicitos (macrfagos do tecido conjuntivo) clulas de Langerhans

(macrfagos cutneos) e micrglias (macrfagos do sistema nervoso central).

Os macrfagos so as principais clulas responsveis por desencadear o

processo inflamatrio, no momento da leso, uma vez que aps ativao,

liberam um fator quimiottico para neutrfilos na presena de antgenos como o

LPS . Alm disso, a migrao neutroflica para cavidade peritoneal de ratos

induzida por estmulos como carragenina, zimosan e endotoxinas pode ser

potencializada por tioglicolato (que estimula o aumento da populao de

macrfagos) ou inibida por lavagem peritoneal, procedimento que reduz a

populao de macrfagos (CUNHA; FERREIRA, 1986; RIBEIRO et al., 1990).

A funo fisiolgica do macrfago est relacionada sua capacidade fagoctica

e a produo de enzimas hidrolticas e de radicais txicos derivados do

oxignio. Alm disso, o macrfago responsvel pela produo e liberao de

uma srie de interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) e outros mediadores, tais como

enzimas, protenas do sistema do complemento, TNF- e eicosanides, que

participam de vrios eventos do processo inflamatrio.

Mastcitos so derivados de clulas hematopoiticas pluripotentes da

medula ssea e apresentam diferenas morfofisiolgicas de acordo com o

tecido onde so encontrados. Entretanto, essas clulas possuem

caractersticas histolgicas semelhantes aos basfilos do sangue. Apesar

dessa similaridade, os mastcitos e os basfilos parecem possuir linhagens

diferentes (GALLI, 1990; WELLE, 1997). Os mastcitos de uma maneira geral

so essenciais para o desenvolvimento de uma resposta alrgica

(hipersensibilidade imediata). Essas clulas apresentam receptores na

superfcie de suas membranas (FcRI), que reconhecem a poro Fc da

imunoglobulina E (IgE), que capaz de se associar a antgenos e desta

maneira ativar os mastcitos. Uma vez ocorrido a ativao celular, esse sinal

se propaga nestas clulas e eleva os nveis intracelulares de Ca++, provocando

a exocitose de vesculas contendo mediadores bioativos que facilitam o

desenvolvimento da alergia. A ativao destas clulas tambm pode ocorrer

atravs de estmulos no imunolgicos, endgenos e exgenos: tais como o

32

composto 48/80, peptdeos de venenos, neuropeptdeos (substncia P),

peptdeos hormonais (peptdeo relacionado ao gene de calcitonina) e

anafilatoxinas que ativam a protena G independente de Ca++, e desta forma

promovem exocitose dos grnulos mastocitrios (GALLI, 1990; LAGUNOFF et

al., 1983; METCALFE et al., 1997). Os principais mediadores liberados pelos

grnulos de mastcitos so a histamina e a serotonina (esta segundo

PARRATT; WEST, 1958, somente em roedores), que so essenciais para o

desenvolvimento dos eventos vasculares (vasodilatao e aumento de

permeabilidade vascular) e celulares (expresso de molculas de adeso,

ativao de leuccitos etc) da resposta inflamatria (MARONE et al., 2002).

A histamina foi caracterizada em 1910, e somente em 1929, Dale fez

conexo entre a histamina e a reao anafiltica (BARGUER; DALE citado por

MARONE et al., 2002). Esta substncia amplamente encontrada em

mastcitos, basfilos, clulas gstricas enterocromafins e neurnios

histaminrgicos no crebro. A histamina uma amina formada pela

descarboxilao do aminocido histidina, que se encontra complexada com a

heparina e protenas cidas no interior granular, sendo suas atividades

biolgicas atribudas a ativao dos receptores H1, H2, H3 e H4 (MARONE et

al., 2002). Estes fazem parte do grupo de receptores que possuem sete

domnios transmembrana e interagem com protenas ligadoras de GTP

(guanosina trifosfato). O receptor H1 est relacionado com eventos que

promovem aumento da concentrao de Ca++ intracelular, enquanto que o

receptor H2 com respostas mediadas por elevao dos nveis intracelulares de

AMPc. J os receptores dos sub-tipos 3 e 4 operam como variaes dos dois

anteriores, porm, apresentam efeitos adicionais de reduo dos nveis de

AMPc (MACGLASHAN, 2003). O composto 48/80 um potente degranulador

de mastcitos e portanto um indutor de liberao de histamina e outros

mediadores (PATON, 1951).

A 5-HT um neuromediador encontrado no sistema nervoso central,

descoberta em 1868, que desempenha vrias funes relacionadas com

humor, sono, apetite, percepo da dor, reflexo de vmito, regulao da

temperatura e da presso arterial. Fora do sistema nervoso central, a

serotonina est presente em plaquetas, linfcitos, moncitos, macrfagos,

mastcitos, clulas neuroendcrinas pulmonares e clulas enterocromafins. J

33

foram identificados mais de 16 diferentes tipos e sub-tipos de receptores para a

serotonina, relacionados com as mais diferentes funes (MOSSNER; LESCH,

1998). Destaca-se sua atuao no sistema imune e na reposta inflamatria. A

5-HT em altas concentraes (superiores a 3 M) parece atuar nos receptores

5-HT1A e 5-HT2 facilitando a ativao de macrfagos, bem como a conseqente

proliferao de clulas T (YOUNG et al., 1993; YOUNG; MATTHEWS, 1995). A

serotonina tambm est relacionada com a melhora da imunidade natural, que

pode ser aferida pela medida de ons superxidos e produo de interferon-

(INF-). A 5-HT tambm essencial para o desenvolvimento de reaes de

hipersensibilidade tardias, pois esse mediador responsvel por induzir a

liberao de mediadores quimiotticos para linfcitos T CD4 e CD8 (IL-16), e

pelo recrutamento de leuccitos atravs da sua atuao em receptores 5-HT2

existentes no endotlio vascular. Desta forma, a serotonina essencial

tambm para o desenvolvimento dos eventos celulares do processo alrgico ou

inflamatrio, uma vez que essa substncia promove migrao celular atravs

da expresso de molculas de adeso (MOSSNER; LESCH, 1998).

A bradicinina, um outro mediador do processo inflamatrio, um

peptdeo vasoativo que provoca vasodilatao e aumento da permeabilidade

vascular, resultando sua ao vasodilatadora, em parte, pela produo de PGI2

e pela liberao de NO. Trata-se de um potente indutor de dor, ao que

potencializada pelas prostaglandinas (LOUREIRO-SILVA et al., 1999; LEEB-

LUNDBERG et al., 2005).

A substncia P age na periferia, promovendo inflamao por seus efeitos

sobre os vasos sanguneos, (vasodilatao e aumento da permeabilidade

vascular) clulas do sistema imune (atrao das clulas do sistema imune para

o local da leso e degranulao de mastcitos com liberao de diversos

neuromediadores) (DRESSLER et al., 2005; ROCHA et al. 2007) e no sistema

nervoso autnomo. A inibio da transmisso da substncia P e da emisso

perifrica podem aumentar o arsenal teraputico no controle da dor (ONETTA,

2005).

34

2 JUSTIFICATIVA

O C. zehntneri amplamente distribudo no Nordeste brasileiro onde, em

forma de chs e infusatos bastante utilizado como medicamento caseiro.

Apesar disso, pouco se conhece sobre os efeitos fisio-farmacolgicos de seu

leo essencial no processo inflamatrio.

Os leos essenciais obtidos de outras espcies do gnero Croton

mostram efeito anti-inflamatrio e antinociceptivo O leo essencial de C.

zehntneri (OECz) apresenta ainda efeito relaxante sobre a musculatura lisa

vascular in vitro e isso, de modo indireto, pode sugerir sua atividade nos

eventos vasculares da inflamao. Apresenta tambm significativa atividade

antinociceptiva na fase inflamatria do teste da formalina, efeito

antiedematognico em ratos e uma baixa toxicidade.

Tendo em vista que leos essenciais so misturas complexas, o

componente majoritrio do OECz foi tambm alvo de estudo, pois tem sido

demonstrado que seus principais constituintes (anetol, estragol e eugenol)

apresentam ao antinociceptiva em modelos experimentais. As atividades

anti-inflamatria (in vitro para o anetol), antioxidante e gastroprotetora tambm

foram descritas para o eugenol e o anetol. Todas essas propriedades em

conjunto fornecem evidncias e estimulam a investigao da potencial

atividade anti-inflamatria deste leo essencial e de seu principal constituinte

em modelo de inflamao in vivo.

35

3 OBJETIVOS

Avaliar o efeito anti-inflamatrio e o mecanismo de ao do OECz, em

modelos de inflamao imune e no-imune, e do anetol, sobre eventos da

inflamao no-imune.

Mais especificamente, pretende-se:

- Avaliar a atividade antiedematognica do OECz e do anetol no modelo de

edema de pata induzido por carragenina em camundongos;

- Investigar o mecanismo da atividade antiedematognica do OECz e do anetol

no modelo acima referido;

- Verificar a toxicidade sub-crnica do OECz e do anetol;

- Investigar a atividade antiedematognica do OECz no modelo de edema de

pata induzido por ovalbumina em animais sensibilizados.

36

4. MATERIAL E MTODOS

4.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Foram utilizados camundongos Swiss albinos (Mus musculus) adultos de

ambos os sexos pesando entre 25 e 35 g procedentes do biotrio da Faculdade

Christus e mantidos na Sala de Quarentena do Instituto Superior de Cincias

Biomdicas - Universidade Estadual do Cear (UECE). Os animais

permaneceram no laboratrio para adaptao por um perodo de pelo menos 1

hora (h) antes da realizao dos experimentos. Estes receberam rao e gua

ad libitum, foram mantidos sob condies adequadas de luz e temperatura, e

manipulados de acordo com os padres estabelecidos pelo Comit de tica da

Universidade Estadual do Cear (UECE-N 0559924-4).

4.2 LEO ESSENCIAL

As plantas utilizadas para extrao do leo essencial foram coletadas

em Viosa do Cear e identificadas atravs de excicatas que esto

depositadas no Herbrio Prisco Viana-UFC (# 27477 - indexado no Index

Herbariorum). O leo essencial do Croton zehntneri (OECz) foi extrado pelo

mtodo de destilao por arraste de vapor dgua (Laboratrio de

Eletrofisiologia - UECE) e analisado por cromatografia gasosa e espectrometria

de massa (PADETEC UFC), como descrito por CRAVEIRO e colaboradores

(1980, 1981).

4.3 DROGAS E REAGENTES:

- Carragenina lambda (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- Bradicinina (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

37

- Captopril (Neoqumica, BR)

- Histamina (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- cido araquidnico (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- Prostaglandina E2 (PGE2) (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- Substncia P (Alexis, Biochemicals, Sucia)

- Composto 48/80 (Alexis, Biochemicals, Sucia)

- L- NG nitro arginina metil Ester (L-NAME) (Chemicals & Co, EUA )

- Serotonina (5-HT) (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- Tween 80 (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- Anetol (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- Nitroprussiato de Sdio (Vetec, BR)

- Ovalbumina (Sigma, Chemicals & Co, EUA)

- Cloreto de Sdio (Frenesius e Kabi Brasil Ltda)

- Hidrxido de alumnio (Vetec, BR)

- Dexametasona (Eurofarma, BR)

Todos os demais sais e drogas utilizados foram de pureza analtica.

4.4 DISSOLUO DAS DROGAS E LEO

O OECz e o anetol foram diludos em soluo de Tween 80 1% e as

demais drogas em soluo fisiolgica de NaCl 0,9% estril (salina).

4.5 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATRIA

A atividade anti-inflamatria do OECz e do anetol foi testada em dois

modelos de edema de pata (imune e no imune) analisando:

a) o efeito inibitrio do OECz e anetol sobre a formao de edema

induzido por carragenina;

38

b) o efeito inibitrio do OECz sobre a formao de edema induzido por

ovalbumina em animais sensibilizados;

c) a mensurao do edema se foi feita em um Pletismmetro digital

(Panlab LE 7500) antes da injeo (s.c.) intraplantar dos estmulos

inflamatrios (tempo zero). Posteriormente, a medida de volume, dependendo

do protocolo, foi feita aos 30 min e 1, 2, 3 e 4 h aps a administrao dos

agentes inflamatrios. O edema foi calculado como a diferena entre o volume

de lquido deslocado pelas patas em um determinado tempo aps o estmulo e

antes do estmulo (tempo zero). Os resultados foram expressos como mdia

E.P.M do volume (L) deslocado pelas patas ou das reas sob as curvas (ASC)

calculadas utilizando-se o mtodo do trapzio (LANDUCCI et al., 1995) e

expressos em unidades arbitrrias. O controle positivo de edema foi o grupo

que recebeu aplicao local de carragenina e o controle negativo salina;

d) o estudo da atividade antiedematognica do OECz e anetol no modelo

de edema de pata induzido por carragenina foi feito pela administrao no

grupo controle, nas patas direitas, alquotas de 50 l de salina estril e nas

patas esquerdas, o mesmo volume (50 l) contendo o agente edematognico

carragenina (300 g/pata). Os animais foram tratados com OECz, por via oral,

atravs de uma cnula orogstrica (gavagem) nas doses de 1, 3, 10, 30 e 100

mg/kg e com anetol nas doses de 3, 10 e 30 mg/kg, 60 minutos antes das

aplicaes dos agentes edematognicos; para investigar o edema de origem

imunie os camundongos foram sensibilizados conforme protocolo previamente

descrito (CANETTI et al., 2001). Resumidamente, os animais receberam uma

emulso de 200 L contendo ovalbumina (20 g; s.c.) dispersa em 1mg de

hidrxido de alumnio. Aps 14 dias, foi feita nova administrao de ovalbumina

aos animais. Para os animais falso-imunizados (controle) foi realizado o mesmo

procedimento experimental, porm sem a presena de ovalbumina na emulso.

Decorridos 21 dias aps a primeira imunizao, os animais controles e

imunizados foram pr-tratados com o OECz (10 mg/Kg; v.o.), 1 hora antes do

desafio s.c. ovalbumina (6 g/pata) ou salina. Os grupos controles negativos e

39

positivos receberam salina ou dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.) 1h e 24h antes

da induo do edema.

e) Para investigar quais os mediadores inflamatrios estariam sendo

inibidos pelo OECz/anetol impedindo a formao de edema de pata induzido

por carragenina foram delineados os seguintes protocolos:

Os animais foram pr-tratados com OECz/anetol (v.o.), na melhor dose

inibitria, 60 min antes da induo do edema de pata por alguns mediadores

qumicos comuns a fase inicial e tardia do edema induzido por carragenina.

Assim utilizou-se: bradicinina (3 nmol; 50l), histamina (100 nmol/pata; 50l),

serotonina (100 g/pata; 50l), substncia P (20 nmol; 50l), nitroprussiato de

sdio (10 mol; 50l), composto 48/80 (100 ng/pata; 50l), cido araquidnico

(1,5 mg/pata; 50l), prostaglandina E2 (30 nmol/pata; 50l). O controle positivo

de edema foi o grupo que recebeu aplicao local do estmulo inflamatrio e o

controle negativo salina;

Nos experimentos em que foi utilizada a bradicinina, os animais

foram tratados 1 h antes, com o inibidor da cininase II, o captopril (5 mg/kg,

s.c.), a fim de prevenir a degradao do peptdeo (CORRA; CALIXTO, 1993).

4.6 ESTUDO DA TOXICIDADE SUB-CRNICO DO LEO ESSENCIAL

DE Croton zehntneri E ANETOL

Foram utilizados trs grupos de 8 animais cada. Um grupo recebeu o

OECz, o segundo recebeu anetol e o terceiro Tween 80 (1%) (controle) durante

quatorze dias por via oral, obedecendo a posologia de dose nica diria de

10mg/kg contido em 0,1mL/10g de peso corporal. O grupo controle recebeu o

mesmo volume de Tween 80 1% pela mesma via. Aps o tratamento, foi feita a

avaliao dos parmetros abaixo descritos:

40

Peso corporal e de rgos do sistema imune: os animais foram

pesados antes e aps o tratamento com o OECz, anetol ou twenn 80. Aps o

sacrifcio foi feita a exciso do fgado, bao, rim e corao e a pesagem dos

mesmos ainda midos.

Anlise macroscpica: possveis alteraes macroscpicas

(vermelhido, esteatose, ndulos, focos hemorrgicos) foram avaliadas nos

rgos observados.

Testes bioqumicos: amostras de sangue foram coletadas do plexo

infra orbital. O sangue foi coletado em tubos contendo gel separador para

anlise bioqumica e EDTA K3 ou heparina para evitar coagulao. Aps a

coleta de sangue e ainda sobre efeito anestsico, foi feito o sacrifcio dos

animais por deslocamento cervical. Foram empregados Kits comerciais com

tcnicas padronizadas, baseados em mtodos cinticos, enzimticos e

colorimtricos atravs de aparelho automatizado (LABMAX 240 - LABTEST).

Foi utilizada a metodologia micro devido pequena quantidade de soro obtido.

Estas dosagens so utilizadas na clnica mdica para avaliao da funo

destes rgos

Para avaliar os efeitos hepatotxicos:

- foram realizadas as dosagens de alanina aminotransferase

(ALT), aspartato aminotransferase (AST);

Para avaliaes da nefrotoxicidade

- foram determinados os nveis plasmticos de uria e creatinina

(parmetros bioqumicos teis na avaliao da funo renal,

particularmente nas funes tubulares e glomerulares, assim como no

metabolismo das protenas e aminocidos);

Para avaliar a funo cardaca;

- foram determinados os nveis de creatinoquina total (CK-total),

como indicador de funo cardaca..

41

4.7 ANLISE ESTATSTICA

De todos os experimentos foram calculadas as Mdias Erro Padro da

Mdia (EPM) para um certo nmero de eventos (n) em cada grupo. As

diferenas estatsticas foram obtidas atravs da anlise de varincia (ANOVA)

e teste de Ducan ou teste t de Student para dados pareados ou no-pareados

e p

42

5 RESULTADOS

5.1 COMPOSIO QUMICA DO LEO ESSENCIAL DE Croton

zehntneri

O leo essencial de Croton zehntneri (OECz) foi extrado pelo mtodo de

destilao por arraste por vapor dgua (Laboratrio de Eletrofisiologia - UECE)

e analisado por cromatografia gasosa e espectrometria de massa no Parque de

Desenvolvimento Tecnolgico da Universidade Federal do Cear (PADETEC

UFC). O resultado da anlise est na Tabela 1.

Tabela 1 Constituintes qumicos do leo essencial de Croton zehntneri

Constituintes Teor (%)

Anetol 77,6

Estragol 9,3

Anisaldedo 4,7

Mirceno 1,4

Espatulenol 1,2

- Elemeno 1,1

1,8 cineol 0,6

Metil farnesoato 0,1

Elementos traos ou

indeterminados

5,1

43

5.2 O LEO ESSENCIAL DE Croton zehntneri E O ANETOL INIBEM O

EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA

O pr-tratamento de camundongos com o OECz (1, 3, 10, 30 e 100

mg/kg) por via oral (gavagem), 1 hora antes da aplicao local (s.c.)

intraplantar do estmulo inflamatrio carragenina, produziu efeito

antiedematognico. Este efeito para o OECz foi significativo nas doses de 1

mg/kg (33,7 3,1 l) e 3 mg/kg (37,5 3,8 l) a partir da terceira hora, em

relao ao controle (52,8 5,2 l). Na medida em que se aumentava a dose do

OECz, a resposta antiedematognica era antecipada. Na dose de 30 mg/kg o

efeito inibitrio se apresentava a partir da segunda hora (24,5 3,3 l) e nas

doses de 10 mg/kg (35,7 2,0 l) e 100 mg/kg (23,3 2,1 l) a resposta j era

detectada desde a primeira hora, quando comparado ao grupo controle (52,8

6,4 l; 58,5 7,3 l) (Fig. 3A). O OECz apresentou efeito inibitrio significativo

em todos os tempos a partir da dose de 10mg/kg (ASC: 5485,7 447,4),

reduzindo em 40% o edema promovido pela carragenina (ASC: 11271,4

1224,4). Alm disso, as respostas obtidas nas doses de 10, 30 e 100mg/kg

foram estatisticamente diferentes daquelas nas doses de 1 e 3 mg/kg (Fig. 3B).

O anetol, testado oralmente em trs doses (3, 10 e 30 mg/kg), 1 hora

antes do estmulo, tambm apresentou efeito antiedematognico em torno de

31% em relao ao controle de carragenina. Em todas as doses, a resposta

antiedematognica do anetol foi significativa a partir da primeira hora: 3 mg/kg

(55,0 12,0 l), 10 mg/kg (60,8 3,2 l) e 30 mg/kg (51,6 6 l) em relao a

carragenina (88,3 9,8 l) (Fig. 4A), mas no foram estatisticamente

diferentes entre si (Fig. 4B).

Observa-se pela anlise da Tabela 2 que a menor dose inibitria efetiva

do OECz sobre o edema induzido por carragenina a de 10 mg/kg, e que o

anetol possui efeito semelhante nas trs doses testadas, incluindo-se a dose

de 10mg/kg. Assim, determinou-se que esta dose seria utilizada para investigar

o mecanismo dos efeitos antiedematognicos do leo e do anetol.

44

0 60 120 180 240

0

10

20

30

40

50

60

70

**

**

**

*

*

*

ED

EM

A (l)

TEMPO (min)

Salina 0,9% ( s.c.)

Carragenina 1% ( s.c.)

OECz 1mg/kg (v.o.)

OECz 3mg/kg (v.o.)

OECz 10mg/kg (v.o.)

OECz 30mg/kg(v.o.)

OECz 100mg/kg(v.o.)

* ***

***

A)

SALINA CARRAGENINA OECz 1 OECz 3 OECz 10 OECz 30 OECz 1000

2

4

6

8

10

12

14

*

*

*

#

&

AS

C (U

nida

des

Arb

itrr

ias

x 10

3)

1 3 10 30

OECz

100 mg/kgSALINA CARRAGENINA OECz 1 OECz 3 OECz 10 OECz 30 OECz 1000

2

4

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10

12

14

*

*

*

#

&

AS

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Arb

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1 3 10 30

OECz

SALINA CARRAGENINA OECz 1 OECz 3 OECz 10 OECz 30 OECz 1000

2

4

6

8

10

12

14

*

*

*

#

&

AS

C (U

nida

des

Arb

itrr

ias

x 10

3)

1 3 10 30

OECz

100 mg/kg

B)

Figura 3 - Efeito antiedematognico do OECz sobre o edema de pata induzido por carragenina. O OECz (1, 3, 10, 30 e 100 mg/kg) ou Tween 80 (1%) foram administrados v.o., 1h antes da induo do edema de pata por carragenina (1%; s.c.). O controle negativo recebeu salina

estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A) O edema foi medido antes (tempo zero) e aps

60, 120, 180 e 240 min de sua induo e calculado pela variao dos volumes das patas (L) entre os vrios tempos e o tempo zero. (B) As reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n=8). * p

45

0 60 120 180 240

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

***

*

*

*

**

Carragenina 1% (s.c.)

Salina 0,9 % (s.c.)

Anetol 3 mg/kg (v.o.)



ED

EM

A (l)

TEMPO (min)

**

**

A)

Figura 4 - Efeito antiedematognico do anetol sobre o edema de pata induzido por carragenina. O anetol (3, 10 e 30 mg/kg) ou Tween 80 (1%) foram administrados v.o., 1h antes da induo do edema de pata por carragenina (Cg; 1%; s.c.). O controle negativo recebeu salina

estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A) O edema foi medido antes (tempo zero) e aps

60, 120, 180 e 240 min de sua induo e calculado pela variao dos volumes das patas (L) entre os vrios tempos e o tempo zero. (B) As reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n=8), *p

46

Tabela 2 Efeito inibitrio do OECz e do anetol sobre o curso temporal do edema de pata induzido por carragenina

5.3 EFEITOS DO LEO ESSENCIAL DE Croton zehntneri E DO

ANETOL SOBRE ALGUNS MEDIADORES INFLAMATRIOS ENVOLVIDOS

NA FASE INICIAL DO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA

5.3.1 Efeitos do OECz e do anetol sobre o edema de pata

induzido por histamina e pelo composto 48/80

A histamina um dos principais mediadores de fase inicial do teste de

edema de pata induzido por carragenina. Nos tempos de 30, 60 e 120 min, o

edema de pata produzido pela histamina (40,0 4,4; 32,2 3,7; 32 3,7) foi

respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos animais com o OECz (20,5

4,5; 18,3 4,0; 15,0 2,2) (Fig.5A), o que resultou em uma inibio de 54%

(Fig. 5c) pela anlise da rea sob a curva (Histamina: ASC: 5076,0 443,0

versus OECz: ASC: 2775,0 343,7). Da forma semelhante nos tempos de 30,

60 e 120 min, o edema induzido pela histamina (43,3 3,3; 37,1 4,0; 38,3

4,7), foi respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos animais com o anetol

(25,6 3,6; 26,5 2,0; 20 5,1) (Fig. 5B), o que promove uma inibio de 30%

(Fig. 6D) na anlise da rea sob a curva (Histamina: ASC 5622,5 569,0

versus anetol: ASC: 3462,5 358,46).

Dose

Tempo

1 3 10 30 100

OECz OECz ANETOL OECz ANETOL OECz ANETOL OECz

60 min 22 7 37* 39* 31* 38* 42* 60*

120 min 19 15 51* 57* 39* 53* 45* 61*

180 min 36* 28* 39* 59* 25* 55* 35* 55*

240 min 35* 38* 40* 53* 23* 55* 43* 57*

n= 6 - 8 camundongos; valores expressos em percentagem; * p < 0,05 em relao carragenina; o anetol nas doses de 1 e 100 mg/kg, no foi avaliado.

47

SALINA HISTAMINA ANETOL

0

2

4

6

8

*30%

AS

C (

Un

ida

de

s A

rb

itr

ria

s

x 1

03)

D)

0

2

4

6

8

*

54%

AS

C (

Un

ida

de

s A

rb

itr

ria

s x

10

3)

SALINA HISTAMINA OECz

C)

Figura 5 - Efeito antiedematognico do OECz e anetol sobre edema de pata induzido por histamina. O OECz e o anetol (10 mg/kg) ou Tween 80 (1%) foram administrados v.o., 1 h antes da

induo do edema de pata por histamina (100 nmol/pata; s.c.; 50 l ). O controle negativo recebeu

salina estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A e B) o edema foi medido antes (tempo zero) e

aps 30, 60, 120, e 180 min de sua induo e calculado pela variao dos volumes das patas (l) entre os vrios tempos e o tempo zero. (C e D) as reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n=8), *p

48

Para verificar se a ao do OECz/anetol sobre o edema induzido pela

histamina est envolvida com a sua liberao partir de mastcitos, utilizou-se

o composto 48/80, sabidamente um degranulador mastocitrio, como estmulo

para induo de edema de pata. Somente no tempo 120 min., o edema de pata

produzido pelo composto 48/80 (96,0 9,7) foi inibido pelo pr-tratamento dos

animais com o OECz (70,0 5,16398), o que no resultou em uma inibio

sgnificativa (Fig. 6A) pela anlise da rea sob a curva (48/80: ASC 19458

1620,4 versus OECz: ASC: 15725 996,8074). De forma semelhante o edema

induzido pelo composto 48/80, no foi inibido pelo anetol em nenhum tempo e

esta inibio (Fig. 6B) se reflete na anlise da rea sob a curva (48/80: ASC:

19458 1620,4 versus anetol: ASC 17858,3 848,8).

Figura 6 - Efeito antiedematognico do OECz e anetol sobre o edema de pata induzido pelo composto 48/80. O OECz e o anetol (10 mg/kg) ou Tween 80 (1%) foram administrados

v.o., 1 h antes da induo do edema de pata por composto 48/80 (100 ng/pata; s.c.; 50 l). O

controle negativo recebeu salina estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A e B) o edema foi medido antes (tempo zero) e aps 30, 60, 120, 180 e 240 min de sua induo e calculado

pela variao dos volumes das patas (L) entre os vrios tempos e o tempo zero. (C e D) as reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n=8), *p

49

5.3.2 O OECz e o anetol inibem o edema de pata induzido por

bradicinina

A bradicinina um peptdeo vasodilatdor e participa da fase inicial do

edema induzido pela carragenina. Nos tempos de 30 e 60 , o edema de pata

produzido pela bradicinina (35 2,8; 12,5 2,5) foi respectivamente inibido

pelo pr-tratamento dos animais com o OECz (8,75 2,26582; 1,25 1,25)

(Fig.7A), o que resultou em uma inibio de 57% (Fig. 7C) pela anlise da rea

sob a curva (Bradcinina: ASC: 1762,5 223,9 versus OECz: ASC: 750,0

164,3). De forma semelhante nos tempos de 30 e 60 min, o edema induzido

pela bradicinina (31,25 3,98098; 21,25 4,7949), foi respectivamente inibido

pelo pr-tratamento dos animais com o anetol (15 2,6; 7,5 1,6) (Fig. 7B), o

que gera uma inibio de 30% (Fig. 7D) na anlise da rea sob a curva

(Bradicinina: ASC 2231,2 364,0 versus anetol: ASC: 900 157,8).

5.3.3 O OECz e o anetol inibem o edema de pata induzido pela

substncia P

A substncia P uma neurocinina, que est envolvido com vrios

eventos fisiolgicos e participa tambm do processo inflamatrio. Nos tempos

de 60 e 120 min, o edema de pata produzido pela substncia P (74,2 5,2;

84,8 4,4) foi respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos animais com o

OECz (41,4 5,9; 50,0 5,7) (Fig. 8A), o que resultou em uma inibio de 33%

(Fig. 8C) pela anlise da rea sob a curva (SP: ASC: 15257,1 1027,1 versus

OECz: ASC: 10521,4 894,8). Antecipando o efeito o sobre a substncia P,

nos tempos de 30; 60 e 120 min (54,2 4,8; 74,2 5,2; 84,8 4,0), o edema

foi respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos animais com o anetol (35,0

6,5; 38,7 7,6; 55 9,0) (Fig. 8B), o que gera uma inibio de 36% (Fig. 8D)

na anlise da rea sob a curva (Substncia P: ASC 15257,1 1027,1 versus

anetol: ASC: 9993,7 1606,8).

50

0 30 60 90 120

0

10

20

30

40 Bradicinina

Salina

OECz

ED

EM

A (

l)

TEMPO (min)

*

*

A)

0 30 60 90 120

0

10

20

30

40

ED

EM

A (

l)

TEMPO (min)

Bradicinina

Salina

Anetol

*

*

*

B)

SALINA BRADICININA ANETOL0

1

2

3

AS

C (

Un

ida

de

s A

rb

itr

ria

s x

10

3)

59%

*

D)

Figura 7 - Efeito antiedematognico do OECz e anetol sobre o edema de pata induzido por bradicinina. OECz e anetol (10 mg/kg; v.o.); Tween 80 (1%; v.o.); captopril (5 mg/kg; s.c.) foram

administrados, 1 h antes da induo do edema de pata por bradicinina (3 nmol/pata; s.c.; 50 l). O controle negativo recebeu salina estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A e B) o edema foi medido antes (tempo zero) e aps 30, 60, 120, 180 e 240 min de sua induo e calculado pela

variao dos volumes das patas (L) entre os vrios tempos e o tempo zero. (C e D) as reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n=6-8), *p

51

Figura 8 - Efeito antiedematognico do OECz e anetol sobre o edema de pata induzido pela substncia P. OECz e anetol (10 mg/kg) ou Tween 80 (1%) foram administrados v.o., 1 h antes da

induo do edema de pata pela substncia P (3nmolar; s.c.; 50 l). O controle negativo recebeu

salina estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A e B) o edema foi medido antes (tempo zero)

e aps 60, 120, 180 e 240 min de sua induo e calculado pela variao dos volumes das patas (l) entre os vrios tempos e o tempo zero. (C) as reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n= 8), *p

52

5.3.4 O anetol, mas no o OECz inibe o edema de pata induzido por

serotonina

A serotonina uma amina que pode se encontrar armazenada nas

vesculas mastocitrias e atuar como mediador inflamatrio, Em todos os

tempos medidos (30, 60, 120, 180 e 240 min), o edema de pata produzido pela

serotonina (101,25 6,3; 77,5 6,1; 70 7,5; 66,2 4,6; 66,2 5,6) no foi

respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos animais com o OECz (85,0

8,0; 63,7 8,0; 48,7 7,6; 52,5 5,2; 52,5 4,9) (Fig.9A), o que se reflete pela

anlise da rea sob a curva (Fig. 9C). Por outro lado, nos tempos de 30, 60,

180 e 240min, o edema induzido pela serotonina (101,25 6,3; 77,5 6,1; 70

7,5; 66,2 4,6; 66,2 5,6), foi respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos

animais com o anetol (75,0 2,6 ; 47,5 4,1; 28,75 2,9; 30,0 6,8; 41,2

8,1) (Fig. 9B), promovendo uma inibio de 45% (Fig. 9D) na anlise da rea

sob a curva (HT: ASC 5622,5 569,0 versus anetol: ASC: 3462,5 358,46).

5.4 EFEITOS DO LEO ESSENCIAL DE Croton zehntneri E DO

ANETOL SOBRE ALGUNS MEDIADORES INFLAMATRIOS ENVOLVIDOS

NA FASE TARDIA DO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA

5.4.1 O OECz mas no o anetol, inibe o edema de pata induzido

pelo nitroprussiato de sdio

O nitroprussiato de sdio um doador de xido ntrico, que por sua vez

possui atividade vasodilatadora no processo inflamatrio. Nos tempos de 60,

120 e 180 min, o edema de pata produzido pelo nitroprussiato de sdio (52,8

5,2; 50 6,1; 35,7 3,6) foi respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos

animais com o OECz (33,75 4,6; 23,7 7,3; 12,5 4,9) (Fig. 10A), o que

resultou em uma inibio de 35% (Fig. 10C) pela anlise da rea sob a curva

(NTPS: ASC: 8785,7 865,3 versus OECz: 4762,5 853,1). Entretanto, o

53

edema induzido pelo nitroprussiato de sdio nos tempos de 60, 120, 180 e 240

min (52,8 5,2; 50 6,1; 35,7 3,6; 17,1 1,8), no foi respectivamente

inibido pelo pr-tratamento dos animais com o anetol (62,8 5,2; 32,8 7,1;

28,5 7,6; 18,5 5,9) (Fig. 8B), o que se reflete na anlise da rea sob a curva

(Fig. 10B).

0 60 120 180 240

0

20

40

60

80

100

120

*

*

**

*

*

ED

EM

A (

l)

TEMPO (min)

Serotonina

Salina

Anetol

*

30

B)

0 60 120 180 240

0

20

40

60

80

100

120

ED

EM

A (

l)

TEMPO (min)

Serotonina

Salina

OECz

30

A)

Figura 9 - Efeito antiedematognico do OECz e anetol sobre o edema de pata induzido por serotonina. OECz e anetol (10 mg/kg) ou Tween 80 (1%) foram administrados v.o. ,1 h antes da

induo do edema de pata por serotonina (100 g/pata; s.c.; 50 l ). O controle negativo recebeu

salina estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A e B) o edema foi medido antes (tempo zero) e aps 30, 60, 120, 180 e 240min de sua induo e calculado pela variao dos volumes

das patas (l) entre os vrios tempos e o tempo zero. (C) as reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n=8), *p

54

SALINA NITROPRUSSIATO OECz ANETOL0

2

4

6

8

10

ASC

(Uni

dade

s Ar

bitr

rias x 10

3 )

45%

*

c)

0 60 120 180 240

0

10

20

30

40

50

60

ED

EM

A (

l)

TEMPO (min)

Nitroprussiato de Sdio

Salina

OECz

*

*

*

A)

0 60 120 180 240

0

10

20

30

40

50

60

70

ED

EM

A (

l)

TEMPO(min)

Nitroprussiato de Sdio

Salina

Anetol

B)

Figura 10 - Efeito antiedematognico do OECz e anetol sobre o edema de pata induzido pelo nitroprussiato de sdio. OECz e anetol (10 mg/kg) ou Tween 80 (1%) foram administrados v.o.,1 h

antes da induo do edema de pata por nitroprussiato de sdio (10 molar; s.c.; 50 l ). O controle

negativo recebeu salina estril (0,9%; 50 l; s.c.) na pata contralateral. (A e B) o edema foi medido antes (tempo zero) e aps 60, 120, 180 e 240 min de sua induo e calculado pela variao dos

volumes das patas (L) entre os vrios tempos e o tempo zero. (C) as reas sob as curvas (ASC) foram determinadas pelo mtodo do trapzio. Mdia E.P.M. (n= 8); * p < 0,05 em relao ao nitroprussiato de sdio.

55

5.4.2 Ausncia de efeito inibitrio do OECz sobre o edema de pata

induzido por cido araquidnico e prostaglandina E2

O cido araquidnico e a prostaglandina E2 so molculas que derivam

de lipdios e fazem parte de uma cascata de reaes que produzem vrios

mediadores inflamatrios. Nos tempos de 15, 30, 60 e 120 min, o edema de

pata produzido pelo cido araquidnico (74 6,7; 58 5,8; 58 8,6; 50 5,4)

no foi respectivamente inibido pelo pr-tratamento dos animais com o OECz

(70 6,3; 52 3,7; 54 6,0; 48,0 7,3) (Fig. 11A). No edema induzida pela

prostaglndina E2,, nos tempos 30, 60, 120 e 240 min (77,5 6,2; 82,5 11,0 ;

65 6,4; 55 5,0), tambm, no foi respectivamente inib

Documents

EFEITO ANTI - INFLAMATÓRIO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Croton zehntneri PAX ET HOFMM E DO ANETOL.pdf