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Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
EFEITO DA LAMININA POLIMERIZADA EM MATRIZES DE
DIFERENTES pHs NA REGENERAÇÃO DE NERVO CIÁTICO DE CAMUNDONGO APÓS TRANSECÇÃO E TUBULIZAÇÃO COM
TUBO DE COLÁGENO.
Renata Gorham Pitanga
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários ã obtenção do grau de mestre em Ciências Morfológicas.
Rio de Janeiro 2007
Livros Grátis
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Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
EFEITO DA LAMININA POLIMERIZADA EM MATRIZES DE DIFERENTES pHs NA REGENERAÇÃO DE NERVO CIÁTICO DE CAMUNDONGO APÓS TRANSECÇÃO E TUBULIZAÇÃO COM
TUBO DE COLÁGENO.
Renata Gorham Pitanga
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, desenvolvida no Laboratório de Neurohistologia e Ultra-estrutura do Sistema Nervoso no Departamento de Histologia e Embriologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
Orientadora: Profa . Ana Maria Blanco Martinez
Rio de Janeiro 2007
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EFEITO DA LAMININA POLIMERIZADA EM MATRIZES DE DIFERENTES pHs NA REGENERAÇÃO DE NERVO CIÁTICO DE CAMUNDONGO APÓS TRANSECÇÃO E TUBULIZAÇÃO
COM TUBO DE COLÁGENO.
Renata Gorham Pitanga
Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários ã obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.
Aprovada em______de_________________de 2007 pela banca examinadora.
Profa Dra. Ana Maria Blanco Martinez – Orientadora
Profa Dra.Nádia Campos de Oliveira Miguel - Revisora e Suplente
Profa Christina Takyia - Examinadora
Profa Tatiana Coelho-Sampaio – Examinadora
Profa Jan Nora Hokoç - Examinadora
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FICHA CATALOGRÁFICA
Gorham Pitanga, Renata Efeito da laminina polimerizada em matrizes de diferentes pHs na regeneração de nervo ciático de camundongo após transecção e tubulização com tubo de colágeno/ Renata Gorham Pitanga, Rio de Janeiro: UFRJ/PCM, 2007. Xvi/ 96 Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas – PCM, 2007. 1. Regeneração Nervosa. 2. Nervo Ciático. 3. Ultraestrutura. 4. Tubo de colágeno. 5. Laminina. 6. Laminina ácida. 7. Laminina Neutra. 8. Recuperação motora. 9. Neurobiologia. Tese (Mestr. – UFRJ/PCM). I. Título
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O encoberto
Triste de quem vive em casa, Contente com o seu lar,
Sem que um sonho, no erguer de asa Faça até mais rubra a brasa
Da lareira a abandonar!
Triste de quem é feliz! Vive porque a vida dura.
Nada na alma lhe diz Mais que a lição da raiz Ter por vida a sepultura.
Eras sobre eras se somem No tempo que em eras vem.
Ser descontente é ser homem. Que as forças cegas se domem
Pela visão que a alma tem!
E assim, passados os quatro Tempos do ser que sonhou,
A terra será teatro Do dia claro, que no atro Da erma noite começou.
Fernando Pessoa
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Soneto de Fidelidade
De tudo, ao meu amor serei atento Antes, e com tal zelo, e sempre, e tanto Que mesmo em face do maior encanto Dele se encante mais meu pensamento.
Quero vivê-lo em cada vão momento
E em louvor hei de espalhar meu canto E rir meu riso e derramar meu pranto Ao seu pesar ou seu contentamento.
E assim, quando mais tarde me procure
Quem sabe a morte, angústia de quem vive Quem sabe a solidão, fim de quem ama
Eu possa me dizer do amor (que tive):
Que não seja imortal, posto que é chama Mas que seja infinito enquanto dure.
Vinicius de Moraes
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AGRADECIMENTOS
A conclusão deste mestrado me traz muitas emoções. Primeiramente pelo
sonho realizado, pela experiência engrandecedora de conviver e aprender pessoas de
um meio que para mim era distante, o meio acadêmico. Além disso, as muitas
dificuldades que se apresentaram ao longo da jornada tornam essa conquista ainda
maior.
O aprendizado foi enorme, com relação à ciência, relações humanas, e
principalmente, foi uma experiência única para o meu auto-conhecimento.
Com isso, tenho muito à agradecer, aos que me ajudaram diretamente, aos
que me acolheram, aos que ao não me acolherem me ajudaram a crescer, e a todos
que, mesmo que indiretamente, participaram dessa experiência, e com isso a
enriqueceram de alguma forma.
À professora Dra. Ana Maria Blanco Martinez, minha orientadora, que, à
sua maneira, me mostrou caminhos que eu não conhecia, me ajudando a ser hoje
uma pessoa melhor.
À professora Dra. Nádia Miguel, revisora deste trabalho, obrigada pelo
acolhimento, compreensão, e por ter sempre uma palavra amigável, sua ajuda foi
essencial.
À Fatima Rosalina, que tem sido minha orientadora na vida. Você sempre
foi, e sempre será um exemplo para mim. Esse mestrado jamais teria acontecido
sem você! Obrigada por tudo! Você faz parte do que sou hoje!
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À Flavia, a Flavinha, sempre prestativa e carinhosa! Obrigada pela ajuda!
Sei que nossos caminhos não se separam aqui! Boa sorte!
Ao Bruno, que à sua forma também colaborou, ajudando a tornar esse sonho
possível.
À Suellen, que com sua sabedoria sempre me trouxe paz e confiança!
Obrigada pelo apoio!
À Madalena, sempre prestativa e disponível. Obrigada pela ajuda e apoio!
Você foi fundamental para esse trabalho!
À todos os colaboradores deste trabalho, que de alguma forma o tornaram
possível.
À todos os amigos que encontrei nesse laboratório, afinal, nem tudo foi tão
difícil! Inês, Deise, Clynton, Renata Nascimento, Michel, Abrahão (que mesmo de
loge ajudou bastante), Paula, Jorge, Fernanda, entre tantas outras pessoas que me
encontraram ao longo dessa jornada. Muito obrigada a todos, por tornarem esse
caminho mais fácil.
Ao Rony e sua família, que na reta final foram essenciais, dando força, apoio
e compreensão! Obrigada pela ajuda e pelo carinho!
À minha família, que mesmo sentindo com o afastamento, sempre me trouxe
força, estímulo e amor!
À minha mãe, obrigada pelo seu amor e compreensão!
Às minhas amigas, que acompanharam minha luta!
Aos meus pacientes, que copreenderam as ausências.
E principalmente à Deus, que me deu força, saúde e vida para aprender com
tudo e com todos nessa empreitada!
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANOVA – Análise de variância paramétrica BDNF – Fator neurotrófico derivado de cérebro CNTF – Fator de crescimento ciliar CA – Agente de ligação cruzada ETS – Experimental Toe Spread (Espalhamento de pegada experimental) EPL – Experimental Print Lenght (Comprimento de pegada experimental)
GAGs - Glicosaminoglicanas
GAP-43 – Proteína associada ao crescimento – 43 GMF-B – Fator B de maturação glial
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura MO – Microscopia Óptica N-CAM – Molécula de adesão celular neuronal NGF – Fator de crescimento neuronal NF-H – Neurofilamento de cadeia pesada NF-L – Neurofilamento de cadeia leve
11
NF-M – Neurofilamento de cadeia m NPL – Normal Print Lenght (Comprimento de Pegada Normal) NTS – Normal Toe Spread (Espalhamento de pegada normal) PL – Comprimento de pegada SFI – Sciatic Functional Índex (Índice de função do ciático) SN – Sistema nervoso SNC – Sistema nervoso central SNP – Sistema nervoso periférico TS – Espalhamento de pegada TC – Tubo de colágeno
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LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Esquema demonstrativo do nervo periférico........................................................4 Figura 2 – Esquema representativo de fibra nervosa.............................................................6 Figura 3 – Esquema de regeneração de um motoneurônio após lesão axonal.....................13 Figura 4 - Esquema de matriz extracelular..........................................................................21 Figura 5 - Esquema representativo de lâmina basal e seus principais elementos constitutivos..........................................................................................................................23 Figura 6 - Esquema representativo da estrutura da laminina...............................................26 . Figura 7 - Esquema representativo da interação entre lamininas e integrinas.....................28 Figura 8 - Esquema representativo da tubulização do nervo periférico...............................34 Figura 9 - Fotografia da visão superior do aparato utilizado das pegadas e realização do
teste funcional.......................................................................................................................40
Figura 10 - Eletromicrografia de varredura do tubo de colágeno não implantado.............42
Figura 11 - Eletromicrografia de varredura do tubo de colágeno não implantado..............43
Figura 12 - Eletromicrografia de varredura do tubo de colágeno não implantado..............44
13
Figura 13 – Análise qualitativa comparativa entre cortes transversais de nervo ciático de
camundongo 6 semanas após cirurgia...................................................................................47
Figura 14 – Eletromicrografia do corte transversal de nervo ciático seis semanas após
cirurgia do grupo laminina
ácida...........................................................................................50
Figura 15 – Eletromicrografia de corte transversal do nervo ciático seis semanas após
cirurgia do grupo laminina neutra.........................................................................................51
Figura 16 – Eletromicrografia de corte transversal do nervo ciático seis semanas após
cirurgia do grupo tampão
ácido.............................................................................................52
Figura 17 – Eletromicrografia de corte transversal do nervo ciático seis semanas após
cirurgia do grupo tubo
puro...................................................................................................53
Figura 18 - Imagem das pegadas de camundongo seis semanas após cirurgia, obtidas
através do teste funcional......................................................................................................63
14
LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Desenvolvimento do conceito de utilização de próteses tubulares na regeneração
do nervo periférico...............................................................................19
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LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Análise quantitativa das áreas da fibra nervosa dos quatro grupos...................56
Gráfico 2 – Análise quantitativa das áreas dos axônios dos quatro grupos.........................57
Gráfico 3 – Análise quantitativa das áreas de bainha de mielina dos quatro grupos...........58
Gráfico 4 – Análise quantitativa do G Ratio de cada
grupo.................................................59
Gráfico 5 – Histograma separando G Ratio dos diferentes grupos......................................60
Gráfico 6 - Análise quantitativa do número de axônios mielínicos encontrados em cada
grupo.....................................................................................................................................61
Gráfico 7 - quantitativa da diferença entre os IFC dos diferentes grupos ao longo das seis
semanas de regeneração após a
cirurgia................................................................................64
16
SUMÁRIO
Lista de
abreviações............................................................................................................................iX
Lista de Figuras.....................................................................................................................Xi
Lista de Tabelas...................................................................................................................Xii
Lista de gráficos..................................................................................................................Xiv
Sumário................................................................................................................................Xv
1 –
Introdução........................................................................................................................1
1.1 - Sistema Nervoso......................................................................................................1
1.2 – Sistema Nervoso Periférico......................................................................................2
1.3 – Os Nervos Periféricos..............................................................................................3
1.4 – Degeneração e regeneração do sistema nervoso periférico........................................9
1.5 - Próteses tubulares......................................................................................................17
1.6 - Matriz Extracelular....................................................................................................21
1.6.1 - Laminina..........................................................................................................24
2 -
Objetivos............................................................................................................................30
2.1 - Objetivos Gerais........................................................................................................30
2.2 - Objetivos Específicos................................................................................................30
3– Materiais e Métodos......................................................................................................31
3.1 - Animais.....................................................................................................................31
17
3.2 - Substância para preenchimento do intervalo do tubo de olágeno............................31
3.3 - Tubo de olágeno.......................................................................................................32
3.4 - Procedimento irúrgico..............................................................................................33
3.5 - Perfusão.....................................................................................................................34
3.6 - Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)..........................................................35
3.7 - Microscopia Eletrônica de Transmissão MET)........................................................36
3.8 - Morfometria..............................................................................................................38
3.9 - Avaliação Funcional..................................................................................................39
4 – Resultados.........................................................................................................................41
4.1 - Observações Gerais...................................................................................................41
4.2 - Análise do tubo de colágeno – Microscopia Eletrônica de Varredura(MEV)..........41
4.3 - Análise qualitativa do nervo ciático 6 semanas após cirurgia - (MO) e (MET)....45
4.3.1 - Análise histológica de nervo ciático seis semanas após cirurgia(MO).........45
4.3.2 - Análise ultraestrutural de nervo ciático seis semanas após cirurgia (MET)..49
4.4 - Análise quantitativa do nervo ciático 6 semanas após a cirurgia – MO.................54
4.5 - Análise funcional....................................................................................................62
5 – Discussão........................................................................................................................65
6 – Conclusões......................................................................................................................71
7 – Referências Bibliográficas............................................................................................72
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1. INTRODUÇÃO:
1.1 Sistema Nervoso
O sistema nervoso atua em todo o corpo, e suas estruturas estão em íntimo contato do
ponto de vista morfológico e funcional. Dessa forma, sua divisão em partes tem significado
didático, podendo ser feita com base em critérios anatômicos, embriológicos e funcionais.
Adotamos divisão anatômica, feita de acordo com sua divisão topográfica pelo corpo. Nessa
classificação, temos o Sistema Nervoso Central (SNC), compreendido por encéfalo e medula
espinhal, e o Sistema Nervoso Periférico (SNP) compreendido por nervos, gânglios
periféricos e terminações nervosas que conectam os gânglios com o SNC e os receptores e
efetores do corpo (Kierszenbaum, Histologia e Biologia Celular).
No SNC os neurônios formam agregados chamados núcleos. Entre os corpos
celulares desses neurônios pode ser encontrada uma área chamada neuropilo, com dendritos
muito próximos, ramificações axonais com abundância de sinapses e células gliais. Os
grupos de neurônios dispostos em camada formam uma lâmina (córtex cerebral), os grupos
dispostos longitudinalmente formam colunas. Os feixes de axônios do SNC são chamados de
tractos, fascículos ou lemniscos (Kierszenbaum, Histologia e Biologia Celular).
No SNP, um grupo de neurônios forma um gânglio, que pode ser sensitivo (gânglio
da raiz dorsal e gânglio do trigêmeo), ou motor (gânglio visceromotor ou autônomo). Os
axônios que se originam nos gânglios se organizam em nervos, ramos ou raízes
(Kierszenbaum, Histologia e Biologia Celular).
19
1.2 Sistema Nervoso Periférico
O Sistema Nervoso Periférico (SNP) encontra-se distribuído por todo o corpo, fora do
invólucro ósseo, onde se encontra o Sistema Nervoso Central – SNC. Os nervos
periféricos são os nervos cranianos e espinhais.
O Sistema Nervoso Periférico possui dois tipos de células de sustentação, as células
de Schwann (análogas aos oligodendrócitos no SNC) e as células satélites (que
circundam os corpos celulares nos gânglios sensitivos e autônomos (Kierszenbaum,
Histologia e Biologia Celular).
O SNP pode ser dividido em motor e sensorial. Neurônios sensoriais são pseudo
unipolares, com um prolongamento para o SNC e outro para a periferia, direcionado ao
órgão alvo. Neurônios motores são multipolares, estando seus corpos celulares
localizados no corno anterior da medula espinhal e seu prolongamento estendendo-se até
o órgão alvo (Junqueira & Carneiro, Histologia Básica).
20
1.3 Os Nervos Periféricos
Os nervos são feixes de fibras nervosas entremeadas por tecido conjuntivo propriamente
dito, que ligam o SNC aos órgãos alvo, podendo ter fibras aferentes (conduzem informações
da periferia para o SNC) ou eferentes (conduzem informações do SNC para a periferia). As
fibras aferentes são sensoriais e as eferentes são motoras. Nervos cranianos (quando se
originam no encéfalo), ou espinhais (quando se originam na medula espinhal). O sistema
nervoso autônomo está associado a ambos, porém com uma organização morfofuncional
distinta ((Junqueira & Carneiro, Histologia Básica).
O principal componente estrutural do nervo periférico é a fibra nervosa (um axônio com
célula de Schwann). Um nervo é constituído por numerosas fibras nervosas mielinizadas e
não-mielinizadas entremeadas, agrupadas em fascículos por bainhas de tecido conjuntivo
propriamente dito. Os axônios são mielinizados em segmentos (internodos) separados pelos
nodos de Ranvier. Uma única célula de Schwann supre a bainha de mielina de cada
internodo ( http://www.sistemanervoso.com, Liga de neurocirurgia).
21
Figura 1: Esquema representativo de fibra nervosa. Reproduzido a partir de
www.cmpa.tche.br. /educacional/secoes_ensino/site_sec_C/nervoso.ppt
Corpo celular
Dendritos
axônio
Bainha de mielina
Núcleo
Bainha de mielina
Nodo de Ranvier
Célula de Schawann
Axônio
22
Cada nervo possui três bainhas conjuntivas, como exemplificado na figura 2. O epineuro,
que é composto por fibras elásticas e de colágeno, vasos sanguíneos e fibroblastos, envolve
todo o nervo e emite septos para o seu interior. O perineuro é formado por fibras colágenas
dispersas entre células perineurais, envolve os feixes de fibras nervosas, é considerado o
maior sítio de permeabilidade seletiva do nervo periférico, funcionando como uma barreira
de difusão formada pelas junções oclusivas presentes entre as células perineurais das
camadas internas do perineuro (Olsson e Reese, 1971). O endoneuro envolve cada fibra
nervosa individualmente, é formado por tecido conjuntivo propriamente dito frouxo,
constituído por pequenas fibrilas colágenas, onde encontramos células de sustentação como
fibroblastos, adipócitos, matriz extracelular e elementos vasculares, promovendo força de
tensão e proteção para o nervo.
23
Figura 2: Esquema demonstrativo do nervo periférico com seus envólucros (epineuro,
perineuro e endoneuro), seus fascículos e axônios. Reproduzida a partir de
www.cndpa.comimagesnerve.gif.gif
Nervo oligofascicular
Nervo polifascicular
Endoneuro
Perineuro
Axônio mielinizado
Epineuro interno
Epineuro externo
24
O axônio e constituído pelo axoplasma (citoplasma axonal) e axolema (membrana celular
axonal), e possui propriedades importantes, como a transmissão de sinais elétricos e
químicos, além do transporte de material citoplasmático (transporte axoplasmático).
Além de axônios e tecido conjuntivo propriamente dito, podemos encontrar também no
nervo células correspondentes a glia periférica, a célula de Schwann (CS), que possui
características comuns com as células satélites que circundam o corpo celular dos neurônios
situados nos gânglios da raiz dorsal e nos gânglios autonômicos, como sua origem
embrionária e suas características citológicas. Apesar disso se distinguem destas por sua
relação espacial com o axônio e associação com a lâmina basal
(http://www.icb.ufmg.br/lpf/material/Como-as-celulas-se-comunicam,Katz.html).
As células de Schwann maduras são alongadas e estendem-se longitudinalmente ao longo
dos axônios, possuem núcleos ovais pálidos com uma distribuição homogênea de
heterocromatina. À microscopia eletrônica, as células de Schwann, ao contrário dos
fibroblastos e histiócitos endoneurais, têm uma membrana basal, e citoplasma eletrondenso.
Com a diferenciação do nervo periférico, projeções da membrana das células de Schwann
enrolam-se concentricamente em torno do axônio, dando origem à bainha de mielina, que é
composta por lipídios e proteínas, principalmente fosfolipídios, formando assim ao redor do
axônio uma capa isolante (http://www.sistemanervoso.com, Liga de neurocirurgia).
Ao enrolar-se em torno do axônio, cada célula de Schwann forma um segmento de
bainha de mielina medindo aproximadamente 1 mm de comprimento. No intervalo entre os
segmentos, o axolema fica exposto, formando uma região conhecida como nodo de Ranvier,
onde estão presentes canais iônicos dependentes de voltagem (Na+), responsáveis pela
despolarização da membrana e conseqüente condução do impulso nervoso. Nesse processo
as células de Schwann recebem sinalização dos componentes da matriz extracelular, como
25
lamininas e colágenos, presentes na lamina basal que circunda os axônios mielinizados no
sistema nervoso periférico, para mielinização(Martin e Peles, 2006).
Os internodos (segmentos de mielina) que atuam como isolantes elétricos e aumentam de
forma significativa a resistência ao fluxo iônico através das porções recobertas da membrana.
Já na região dos nodos de Ranvier, rica em canais de Na+, matém as propriedades elétricas
normais que permitem o fluxo iônico dependente de voltagem. Por essa razão, os potenciais
de ação não correm de forma igual nos segmentos de mielina e nos nodos, conferindo uma
característica de condução saltatória e em conseqüência, um aumento da velocidade de
condução do impulso nervoso (Eftekharpour et al., 2007).
As fibras nervosas podem ser caracterizadas como mielínicas e amielínicas, e estão
presentes tanto nos nervos sensoriais como nos motores. (Waxman et al., 1995). A espessura
da bainha de mielina é diretamente proporcional á velocidade de condução do impulso
nervoso, assim as fibras amielínicas são capazes de propagar o impulso elétrico numa
velocidade de 2 a 2,5 m/s, enquanto que nas fibras mielínicas o impulso se propaga numa
velocidade de 3 a 150 m/s (Watchmaker e Mackinnon, 1996).
Os nervos periféricos são frequentemente traumatizados, resultando principalmente em
esmagamentos ou secções, o que leva à perda ou diminuição da sensibilidade e motricidade
do local inervado pelo nervo afetado. Isso se deve principalmente pela distribuição
topográfica desses nervos, tornando-os mais vulneráveis às lesões (Refaeian et al., 2001;
Aktan et al., 2005).
26
1.4 Degeneração e Regeneração do Sistema Nervoso Periférico
Embora o Sistema Nervoso Central normalmente não se regenere, nervos
periféricos se regeneram espontaneamente após lesão, devido a um microambiente
permissivo e à ativação do crescimento e remielinização dos axônios em regeneração pelas
céluals de Schwann. Múltiplos fatores participam na desdiferenciação, proliferação e
remielinização das Células de Schwann, como fatores neurotróficos, proteínas da matriz
extracelular e hormônios (Chen et al., 2007). Apesar da permissividade do sistema nervoso
periférico à regeneração, uma completa recuperação após lesão traumática, com perda de
tecido neural, levando a formação de um grande intervalo entre os cotos, ainda não foi
alcançada (Lee e Wolfe, 2000; Gordon et al., 2007). Portanto, pesquisas contínuas buscam
desvendar mecanismos, técnicas ou fatores que possam ajudar na completa e rápida
regeneração do nervo periférico, principalmente em casos de grande perda de tecido neural
com formação de grandes intervalos entre os cotos proximal e distal do nervo, levando a
uma recuperação funcional efetiva e duradoura, como a utilização de fatores de
crescimento e/ou substâncias capazes de facilitar e guiar o crescimento e regeneração do
nervo periférico, como por exemplo a laminina (Dodla e Bellankonda., 2008).
No sistema nervoso periférico, a lesão do axônio leva à interrupção na passagem de
estímulos, levando ao prejuízo das respostas sensoriais e/ou motoras. Como os neurônios
possuem axônios longos, e corpos celulares relativamente pequenos, a maior parte das
lesões dos sistemas nervosos central e periférico envolve danos aos axônios. Quando há
perda da integridade axonal em função de uma lesão (por esmagamento, isquemia,
processo inflamatório ou secção), o axônio é dividido em dois segmentos: o proximal, que
27
permanece em contato com o corpo celular; e o distal, que perde a ligação com o corpo
celular (Fansa e Keilhoff, 2003).
Como a capacidade de síntese protéica encontra-se praticamente restrita ao corpo
celular, o segmento distal do axônio tende a ser perdido. Com isso, as células de Schwann
que envolvem o segmento distal também são afetadas, a bainha de mielina torna-se
fragmentada, e é finalmente removida, junto com os restos axonais, por células
fagocitárias. Esse conjunto de mudanças é chamado degeneração Walleriana e foi descrito
por Waller em 1850.
O principal evento que envolve a degeneração do coto distal ocorre nas primeiras 24
à 48 horas, e é caracterizado pela degeneração do citoesqueleto e conseqüentemente do
axoplasma, que se converte em partículas amorfas. Esta desintegração está ligada ao
aumento na concentração de cálcio intracelular, que medeia a ativação de proteases cálcio-
dependentes (calpaínas), intrínsecas ao axônio (George et al., 1995; Martinez e Ribeiro,
1998).
A degeneração do axônio está diretamente relacionada com a perda da capacidade
de gerar e conduzir um potencial de ação. Logo nas primeiras 24 horas após a lesão é
possível constatar a perda da atividade de transmissão neuromuscular (Griffin e Hoffman,
1993). Neste mesmo período, as células de Schwann presentes no segmento distal
respondem prontamente sofrendo grandes modificações. Fragmentam a sua bainha de
mielina e fagocitam pequenos restos desta mielina, formando gotas de lipídio. Em seguida,
as células de Schwann, sem contato com o axônio, proliferam e se alinham no tubo
formado pela lâmina basal, formando uma coluna de células (Bandas de Büngner). Esta
coluna formada pelas células de Schwann irá posteriormente fornecer a sinalização que
28
guiará a regeneração da fibra nervosa a partir do coto proximal(George et al., 1995; Silva,
1995; Ramón-Cueto et al., 2000; Euler, 2002).
Durante este processo as células de Schwann diminuem a expressão de proteínas
que compõem a mielina, alteram seu fenótipo, e se transformam em células não-
mielinizantes com intensa atividade mitótica e produção de fatores de crescimento: fator de
crescimento nervoso (NGF), fator de crescimento nervoso derivado do cérebro (BDNF),
fator B de maturação glial (GMF-B) e fator de crescimento ciliar (CNTF) (Stoll e Müller,
1999).
A porção proximal do neurônio também sofre e em alguns casos os neurônios
morrem por apoptose, provavelmente pelo corte no suprimento de fatores tróficos
provenientes das células-alvo. Mesmo quando isso não ocorre o corpo celular passa por um
processo chamado reação cromatolítica, ou cromatólise. Ocorre a fragmentação da
substância de Nissl e dispersão dos ribossomas, tornando o pericário mais claro e cheio de
vacúolos, o corpo celular fica entumescido, o núcleo move-se para uma posição excêntrica;
o axônio se retrai e diminui seu calibre, além disso há mudanças metabólicas, como o
aumento na síntese de RNA, mudanças no padrão de genes expressos pelo neurônio,
aumento na expressão da proteína associada ao crescimento (GAP-43) e da periferina
(filamento intermediário neuronal), que participam do alongamento axonal. Há diminuição
da expressão de genes de proteínas de neurofilamento (NF-L, NF-M e NF-H) enquanto que
o conteúdo de mRNAs para B-tubulina fica aumentado (Griffin e Hoffman 1993).
Com a subseqüente recuperação do corpo celular, inicia-se então o processo
regenerativo, o qual está associado ao aumento da expressão de novos genes, incluindo
Pax-3, c-jun e diminuição da expressão de Krox-20 envolvidos no comportamento das
células de Schwann - diferenciação e desdiferenciação - (Stoll e Muller, 1999; Soares et al.,
29
2001; Navarro et al., 2007), o que levará a uma reorganização de todo o segmento proximal
para recompor o axônio lesado (Horner e Gage, 2000). No Sistema Nervoso Periférico
(SNP), a reparação nervosa é um processo combinado de alongamento axonal e
remielinização pelas células de Schwann (Akassoglou et al., 2003), como pode ser
observado na Figura 3.
Na extremidade do segmento proximal forma-se uma intumescência, em função do
acúmulo de organelas citoplasmáticas, denominada cone de crescimento, o qual entra pelo
tubo formado pelas células de Schwann (Bandas de Büngner), estabelecendo a via que
determinará a direção de crescimento do neurônio, de acordo com o microambiente e
estruturas do substrato (Brecknell e Fawcet, 1996; Dezawa, 2000). Durante seu
crescimento através das bandas de Büngner, o axônio em regeneração faz contato com a
célula de Schwann e a lâmina basal. Ocorre também um aumento nos componentes da
lâmina basal (laminina e fibronectina) e de moléculas de adesão como N-CAM (molécula
de adesão da célula nervosa), L1 (molécula de adesão celular), N-caderina e E-caderina,
que servirão de base para o alongamento do cone de crescimento. Esta intensa atividade das
células de Schwann é essencial para o sucesso da regeneração axonal (Maggi et al., 2003).
30
Figura 3: Esquema de regeneração de um motoneurônio após lesão axonal.
Reproduzida a partir de www.medscape.com/viewarticle/48007-4.
Para que a função normal seja restabelecida, é fundamental que os axônios em
crescimento atinjam seus alvos com o máximo de especificidade possível. Para isso as
sinalizações químicas e os componentes da matriz extracelular são essenciais.
Durante o início do processo de regeneração, uma célula de Schwann envolve
vários axônios, posteriormente esta relação se torna de 1:1 nos axônios de maior calibre
(uma célula de Schwann para cada axônio), quando se inicia então o processo de
remielinização (Fawcett e Keynes, 1990). A maior facilidade de regeneração e recuperação
Corpo celular do motoneurônio
Axônio Local da lesão
Células de Schwann Músculo esquelético
Porção distal da fibra nervosa se degenera
Coto proximal da fibra nervosa lesada em regeneração
Células de Schwann em proliferação
Crescimento axonal
Restabelecimento da junção mioneural
31
funcional do SNP em relação ao SNC provavelmente se deve ao microambiente onde
ocorreu a lesão, principalmente ao papel desempenhado pelos fatores neurotróficos (NGF e
BDNF), pelas células gliais (células de Schwann) e aos componentes da matriz extracelular
(laminina e fibronectina) e intracelular (GAP-43). Todos esses fatores são essenciais para
atrair e guiar o axônio em crescimento através do segmento distal.
A regeneração do SN requer um complexo encadeamento de etapas: da
sobrevivência neural à reinervação do órgão alvo; da remielinização axonal à formação de
sinapses funcionais. Nesse sentido várias estratégias de tratamento, atuando nas distintas
fases desse processo, têm sido extensivamente pesquisadas mostrando-se promissoras em
diferentes modelos experimentais animais e humanos (Horner e Gage, 2000).
Quando houver perda da solução de continuidade do nervo, há várias possibilidades
de intervalos e perda tecidual entre os cotos do nervo. Se nenhuma intervenção for feita, a
proliferação de colágeno na parte terminal do coto proximal estimulará o aparecimento de
tecido cicatricial e neuroma, o que impedirá o crescimento do nervo em regeneração,
fazendo, portanto, a fibra nervosa falhar em alcançar a posição normal, com conseqüente
perda definitiva da função (Chen, 2002).
Desta maneira, no sentido de prevenir a presença excessiva de tecido conjuntivo
propriamente dito, em crescimento entre os cotos do nervo, um segmento de nervo ou de
outros materiais deve ser usado para servir de ponte entre os cotos (Wiberg e Terenghi,
2003).
Há dois tipos de materiais, convencionalmente usados, para servir de ponte entre os
dois segmentos do nervo que perdeu sua solução de continuidade: os biológicos, e os não
biológicos. Os biológicos são: nervo autógeno, com ou sem vasos; músculo esquelético e
vaso sanguíneo, dentre outros. Embora estes materiais tenham boa compatibilidade com o
32
corpo humano, eles apresentam sérios problemas como colapso do tubo, pouca regeneração
e proliferação de tecido cicatricial (Chen et al., 2002). Já os materiais não biológicos como
tubos de fibras de nylon, de silicone, de poliuretano, etc., dão bom suporte tubular para a
regeneração do nervo, mas não são degradáveis ou absorvidos in vivo. Por estas razões,
após a regeneração do nervo eles se manterão incitando reações do organismo contra o
corpo estranho (Cheng e Chen, 2002). No decorrer da década de 80, estes dois materiais
foram largamente utilizados em trabalhos experimentais (Chen, 2002). No entanto, ainda
não foi alcançado um resultado satisfatório em relação à efetiva regeneração do nervo
periférico (Chen et al., 2006).
Com o desenvolvimento da bioengenharia, a reconstrução nervosa tornou-se
novamente foco de muitas pesquisas nos últimos anos. Os resultados obtidos na reparação
do nervo periférico, através do uso de tecidos biologicamente construídos, têm se mostrado
promissores quanto ao problema da recuperação funcional (Chen et al., 2002).
Em virtude da regeneração do nervo periférico e sua conseqüente recuperação
funcional serem como vimos um processo complexo, a utilização de métodos que apenas
preencham um intervalo existente, seja ele grande, ou pequeno, e que facilitem a orientação
e ligação entre os dois segmentos do nervo, está muito longe de ser satisfatória. O fato de a
regeneração nervosa ocorrer de forma lenta coloca em risco todo o processo regenerativo,
já que, mesmo na hipótese de uma total recuperação do nervo, a possibilidade de uma
atrofia irreversível do órgão alvo (o músculo esquelético, por exemplo), torna impossível a
recuperação da função, sendo este um obstáculo importante a ser ultrapassado. Quando a
regeneração possibilita o retorno dos neurônios aos seus alvos a tempo de uma recuperação
funcional, os axônios regenerados podem formar novas terminações nervosas funcionais.
33
Os axônios motores, por exemplo, podem formar novas junções neuromusculares,
sendo assim a perda funcional causada pela axotomia é reversível, ainda que a regeneração
não seja perfeita. Essa regeneração, como observado antes, exige um complexo
encadeamento de etapas, desde a sobrevivência neural até a reinervação do órgão alvo; da
remielinização do axônio à formação de sinapses funcionais. Dessa forma várias estratégias
de tratamento, atuando nas distintas fases da regeneração, têm sido pesquisadas,
mostrando-se promissoras em diferentes modelos experimentais animais e humanos
(Horner e Gage, 2000).
Estratégias de indução através de fatores neurotróficos (Houweling et al., 1998;
Stichel e Muller, 1998), enxertos artificiais (Brook et al., 1994; Weidner et al., 1999),
transplante celular (Azizi et al., 1998; Gaiano e Fishell, 1998; McDonald et al., 1999;
PereiraLopes et al., 2006) indução através de elementos da matriz extracelular, entre outras,
têm sido utilizadas na busca da otimização da regeneração do sistema nervoso periférico,
embora nenhuma tenha demonstrado ainda a possibilidade de uma recuperação funcional
completa.
34
1.5 Próteses Tubulares
A interrupção total da continuidade do nervo é o tipo mais grave de lesão do nervo
periférico, tornando necessária a intervenção cirúrgica (Lundborg, 1988), que pode ser feita
através de sutura direta dos cotos do nervo.
Considerando o fato de que pode haver perda de tecido durante a lesão, muitas
vezes se faz necessária a utilização de guias, que coloquem os dois cotos do nervo em
contato, preenchendo o espaço deixado pela perda tecidual, e favorecendo a regeneração
das fibras nervosas (Chen et al., 2006).
O SNP possui a habilidade de se regenerar, porém essa regeneração depende de
muitos fatores, incluindo um substrato que forneça um microambiente favorável à
regeneração, além de uma via apropriada capaz de guiar o crescimento das fibras nervosas.
Apesar disso, em algumas situações, com a perda de tecido durante a lesão, ou
quando o tecido suturado encontra-se tensionado, a regeneração se torna difícil. Nesses
casos se faz necessária a utilização de enxertos autólogos, como o de nervos sensoriais, que
têm sido mais amplamente utilizados (Matsumoto et al., 2000; Cuevas et al., 2002; Gordon
et al., 2003; Murakami et al., 2003). Porém, essa utilização possui algumas desvantagens,
como por exemplo, fonte limitada de matéria prima, proliferação de tecido cicatricial com
formação de neuromas, gerando alteração na condução do impulso nervoso, além de
envolver mais de um processo cirúrgico, com conseqüente perda de função do nervo
doador (Sinis et al., 2007).
O uso de próteses tubulares na regeneração do nervo periférico vem sendo utilizado
há mais de um século. Desde então muitos materiais, além de diferentes substâncias para o
preenchimento do tubo, têm sido testadas em estudos experimentais com relação a sua
35
eficácia na regeneração do nervo periférico (Langone et al., 1995; Ansselin et al., 1997;
Yoshii & Oka, 2001; Ngo et al., 2003).
Há dois tipos de próteses tubulares: as de material biológico, como vasos,
segmentos de nervo, à base de colágeno, tecido acelular de vasos ou músculos (Archibald
et al., 1991; Fansa et al., 2001; Frerichs et al., 2002; Fansa et al., 2003); ou não biológico
como material sintético não reabsorvível, como silicone e polietileno (Madison et al., 1987;
Cordeiro et al., 1989; Lundborg et al., 1991).
O uso de tubos biodegradáveis tem sido defendido como a melhor possibilidade,
devido ao fato de que podem permanecer in vivo até sua degradação, além de favorecer e
direcionar o crescimento do nervo em regeneração (Aebischer et al., 1989; Langone et al.,
1995; Ceballos et al., 1999; Matsumoto et al., 2000; Wang et al., 2001).
A utilização de tubos confeccionados à base de colágeno tem se mostrado eficaz,
pois além de ser um componente de fácil obtenção e manipulação, já foi amplamente
utilizado com sucesso in vivo na regeneração do nervo periférico (Archibald et al., 1991;
Pereira Lopes et al., 2006).
Os colágenos são as mais importantes glicoproteínas da matriz extracelular, sendo
os maiores componentes desta, e já são muito utilizados como material biodegradável em
vários tipos de próteses cirúrgicas. Além disso, o colágeno contribui para proliferação
celular e facilita a regeneração tecidual, é uma substância abundante e de fácil obtenção.
Muitos pesquisadores sugeriram que o colágeno tem grandes propriedades biológicas para
auxiliar na regeneração do nervo periférico, quando são usados como um condutor para o
nervo (Archibald, et al., 1995; Kitahara, et al., 1999). Matsumoto e colaboradores, em
2000, utilizaram tubos de PLGA associado ao colágeno para avaliação de regeneração do
36
nervo periférico de cães, em “gap” de 80 mm preenchido com laminina, comprovando que
esse condutor é eficaz para guiar o crescimento axonal, e facilitar a recuperação funcional.
Por essa razão, em nosso estudo utilizamos tubos biodegradáveis de colágeno como
guia ligando os cotos proximal e distal, após transecção de nervo ciático de camundongos.
Na tabela 1 apresentamos alguns marcos no desenvolvimento do conceito de
utilização de próteses tubulares para reparo do nervo periférico, ocorridos nas duas últimas
décadas.
Prótese (material) Origem Sistema Referência
Polietileno Não biológico
Não degradável
rato Madison et al., 1987
Colágeno Biológico Rato
Rato
Camundongo
Archibald et al., 1991
Stang et al., 2005
Pereira Lopes et al.,
2006
Silicone Não biológico
Não degradável
rato Lundborg et al., 1991
Poli(organo)fosfazeno
(PEIP)
Não biológico
Biodegradável
rato Langone et al., 1995
37
Poli(DL-lactide-e—
caprolactone)
Não biológico
Biodegradável
rato Meek et al., 1996
Ácido poliglicólico-
colágeno
(PGA)-colágeno
Não biológico
Biodegradável
cachorro Matsumoto et al., 2000
Poli(fosfoester)
(PPE)
Não biológico
Biodegradável
rato Wang et al., 2001
Tecido “acelular” de
músculos e vasos
Biológico rato Fansa et al., 2001
MEC de amnion
humano (AMT)
Biológico rato Mligiliche et al., 2002
Poli(lactide)-co-
glicólico
Não biológico
Biodegradável
rato Schlosshauer et al.,
2003
Tubo de colágeno
poli(l-lactide-co-
glicolico)
Biológico Coelho Lee et al., 2006
Tabela 1: Desenvolvimento do conceito de utilização de próteses tubulares na
regeneração do nervo periférico.
38
1.6 Matriz Extracelular
Os tecidos não são constituídos apenas por células. Uma parte substancial do seu
volume é de espaço extracelular, que por sua vez, é preenchido por uma rede de
macromoléculas que constituem a matriz extracelular (Figura 4).
Figura 4: Esquema de matriz extracelular. Reproduzido a partir de
www.steve.gb.com...connective_tissue.png.png.
A matriz extracelular é produzida e orientada pelas próprias células dentro dela. Na
maioria dos tecidos conjuntivos propriamente ditos, a matriz extracelular é secretada por
células denominadas de fibroblastos. Em certos tipos de tecidos especializados, como por
exemplo, a cartilagem e tecido ósseo, as células que produzem a matriz extracelular são
Filamentos de actina
Integrinas
Proteoglicanas
Fibronectina
Fibras colágenas
Membrana Plásmatica
39
denominadas, respectivamente, de condroblastos e osteoblastos, já no tecido nervoso
periférico, esta matriz extracelular é produzida pelas células de Schwann e fibroblastos.
As principais classes de macromoléculas presentes na matriz extracelular são:
cadeias de polissacarídeos da classe dos glicosaminoglicanos (GAGs), encontrados
normalmente ligados a proteínas, formando proteoglicanos; glicoproteínas fibrosas de dois
tipos: do sistema colágeno e elástico e glicoproteínas de adesão como fibronectina e
laminina. A matriz extracelular do tecido conjuntivo propriamente dito é rica em fibras
colágenas, as quais suportam a maioria do estresse mecânico sofrido pelo tecido. A lâmina basal é uma cobertura flexível e delgada (40-120 nm) de matriz
especializada, a qual ancora o epitélio ao conjuntivo propriamente dito, pode estar também
envolvendo células musculares, células adiposas e células de Schwann (Figura 6).
Influencia na sobrevivência e proliferação celular, determina a polaridade celular, interfere
no metabolismo, organiza proteínas adjacentes à membrana plasmática, induz a
diferenciação e migração celular. Seus principais constituintes são: colágeno tipo IV,
laminina, heparansulfato, entactinas (nidogênio) e proteoglicanos (perlecan) (Colognato e
Yurchenco, 2000) (Figura 5).
40
Figura 5: Esquema representativo de lâmina basal e seus principais elementos
constitutivos. Reproduzido de www.upei.ca/pathclub/fig13.jpg.
Todos os componentes da lâmina basal são sintetizados pelas células que se relacionam
com ela. Estes componentes podem ser encontrados associados entre si, ou com outras
nidogênio
integrina
Membrana Plasmática
nidogenio
Perlecan
Laminina
Colágeno IV IVIV
41
macromoléculas, como fibulina-1, fibronectina e fatores de crescimento (Yurchenco, 1994;
Timpl e Brown, 1996;. Wu e Couchman, 1997; Groffen et al., 1998; Halfter et al., 1998).
A laminina faz a âncora através das integrinas da célula à lamina basal, onde é a
glicoproteína de ligação mais abundante. Possui múltiplos sítios de ligações, o que faz dela
o principal elemento de ancoragem entre a célula e a lâmina basal.
1.6.1 Laminina
A laminina é uma glicoproteína ubiquitária de alto peso molecular. Esta
glicoproteína, juntamente com fibronectina, colágenos, proteoglicanos, além de outras
proteínas, formam a lâmina basal, um tipo de matriz em forma de folha, que se organiza em
contato íntimo com uma camada celular e que tipicamente separa um epitélio do tecido
conjuntivo subjacente, sendo a laminina o principal componente desta em vertebrados e
invertebrados. Dessa forma, a laminina modula várias funções celulares, como adesão
celular, proliferação, e migração (Kleiman et al., 1993; Aumailley e Smith, 1998).
No período embrionário a laminina é encontrada tanto nas estruturas que darão
origem às lâminas basais do adulto, como em agregados dispersos na matriz extracelular,
especialmente no sistema nervoso central (Luckenbill-Edds, 1997).
A laminina tem forma de cruz, e é composta por três diferentes cadeias de
polipeptídeos, as cadeias α, β e γ (Figura 7). Até o momento cinco cadeias α, três β e três γ
são conhecidas para rato e humano (Miner e Yurchenco, 2004). ). A primeira isoforma de
laminina foi descoberta 28 anos atrás (Timpl et al., 1979). Lamininas também foram
caracterizadas em vermes, drosófilas e outros invertebrados, porém como essas espécies
42
apresentam apenas algumas isoformas de laminina, aplica-se a mesma nomenclatura já
existente (Aumailley et al., 2005).
As lamininas formam um polímero em forma de rede, se ligam a outras moléculas
de matriz e têm interações celulares únicas ou compartilhadas, mediadas por integrinas,
distroglicanos, e outros receptores. Através dessas interações, a laminina contribui
criticamente para a diferenciação, forma e movimento celular, manutenção dos fenótipos
teciduais e promoção da sobrevivência tecidual (Colognato e Yurchenco, 2000), além de
contribuir para a coesão da lâmina basal e a arquitetura molecular resultante desta
(Yurchenco, 1994; Yurchenco e O’Rear, 1994; Timpl e Brown, 1996).
A laminina tem sítios de ligação para entactina (nidogênio), proteoglicanos (em
particular o heparansulfato), distroglicano-α, e integrinas β1 e β4, tirosina fosfatase e outras
proteínas de membrana plasmática (Colognato e Yurchenco, 2000).
A laminina é uma grande glicoproteína, que modula o comportamento celular,
através da promoção adesão, espalhamento e extensão de prolongamentos celulares, em
vários tipos de células (Brookey et al., 1993).
43
Figura 6: Esquema representativo da estrutura da laminina. Reproduzido a partir do
livro A Biologia Molecular da Célula – (Alberts; Johnson; Lewis; Raff; Roberts; Walter) –
Quarta edição.
A laminina foi encontrada na lâmina basal nas sinapses (Chiu e Sanes, 1984; Hunter
et al., 1989), e na matriz extracelular do cérebro embrionário (Luckenbill e Edds, 1997).
As lamininas que contêm a cadeia α2 são adesivas para mioblastos (Schuler e
Sorokin, 1995), e as que contêm a cadeia β2 regulam o crescimento de axônios motores
(Hunter et al., 1989; Poter et al., 1995), assim as cadeias α2 e β2 estão envolvidas na
miogênese e sinaptogênese respectivamente (Patton et al., 2007).
Cadeia alfa
Cadeia beta
Cadeia gama
Domínios globulares
Domínio alfa helicoidal
44
No sistema nervoso periférico a laminina é encontrada em dois tipos de lâmina
basal, a lâmina basal multilamelar perineural, derivada de fibroblastos, e a lâmina basal
endoneural, que envolve células de Schwann e axônios (Patton et al., 2007).
A laminina interage com a membrana plasmática através das integrinas (figura 7),
as quais são heterodímeros, formados por pelos menos 16 cadeias de α e 8 de β, e são os
principais receptores de sinalização das células nervosas, além do distroglican, importante
proteína transmembrana receptora para a laminina que se liga também à actina do
citoesqueleto. Pelo menos seis diferentes heterodímeros de integrinas se ligam as
lamininas. Juntos, a multiplicidade de integrinas, o distroglican e os componentes da matriz
extracelular fornecem o potencial para a considerável sutileza e especificidade nas
interações dos cones de crescimento com a matriz extracelular.
A morfogênese dos sistemas, em especial do sistema nervoso é fortemente
modulada pela laminina. No sistema nervoso, os axônios trafegam por caminhos
específicos, por vezes relativamente longos, até encontrar seus alvos. Na extremidade do
axônio há uma estrutura capaz de detectar e responder a informações extra-celulares
durante o processo de enlongação axonal, o cone de crescimento. A trajetória do cone de
crescimento é altamente regulada, aparentemente por interações entre as células neuronais,
outras células, e com a matriz extracelular (Goodman e Shatz, 1993). Sendo assim o cone
de crescimento é guiado por substâncias difusíveis, moléculas de superfície de outras
células e moléculas da matriz extracelular, como a laminina. De fato, vários estudos
mostram efeitos de glicosaminoglicanos e de proteínas da matriz extracelular, como
fibronectina, tenascina e laminina, no processo de orientação axonal (Bovolenta et al.,
1997; Cohen et al., 1987; Faissner-Kruse, 1990; Katoh-Semba et al., 1995; Maeda e Noda,
1996; McLoon et al., 1988; Snow et al., 1990).
45
O papel da laminina na morfogênese do sistema nervoso encontra suporte em
diversas evidências. Assim, o tempo e a localização da laminina no cérebro em
desenvolvimento indica um papel funcional na orientação axonal (Hunter et al., 1992;
Letourneau et al., 1988; Liesi, 1985). A laminina exógena tem papel de guia para o re-
enlongamento dos axônios lesados de nervos periféricos, contribuindo assim para o reparo
do sistema nervoso periférico (Wang et al., 1992). Além disso, mutações na cadeia α2 da
laminina levam ao aparecimento de distrofia muscular congênita e má formação dos
sistemas nervosos periférico e central (Mercuri et al., 1996; Sunada et al., 1995; Van der
Knaap et al., 1997).
46
Figura 7: Esquema representativo da interação entre lamininas e integrinas.
Reproduzido a partir do livro The Molecular Biology of The Cell – (Alberts; Johnson;
Lewis; Raff; Roberts; Walter) – Quarta edição.
Tem sido mostrado que a laminina in vitro promove o crescimento de neuritos
(Manthorpe et al., 1983; Adler et al., 1985; Edgar et al., 1988; Chamak e Prochiantz, 1988),
a orientação axonal (Cohen et al., 1987; Mcloon et al., 1988; Hammarback et al., 1988;
Turney e Brigman, 2005), a diferenciação (Cohen et al., 1986), a proliferação de linhagens
neuronais e de precursores neurais embrionários (Drago et al., 1991, Frade et al., 1996),
bem como a diferenciação, adesão e proliferação de células de Schwann, mielinização do
axônio e regeneração do nervo periférico (Chen e Strickland, 2003; Vleggeert-Lankamp et
al., 2004). Contudo, dentre os efeitos da laminina in vitro, o mais bem caracterizado é o de
promover a indução do crescimento neurítico (Armstrong et al., 2007; Deister et al., 2007;
Evans et al., 2007).
Como mencionamos anteriormente, a laminina tem participação evidente na
regeneração do sistema nervoso periférico. Os axônios realizam seu enlogamento na
interface entre as células de Schwann e sua respectiva lâmina basal (Martini, 1994). Sabe-
se que a laminina tem sua síntese bastante aumentada durante a regeneração no sistema
nervoso periférico (Martini, 1994), e se acumula justamente na interface entre o axônio
regenerado e a lâmina basal adjacente (Kuecherer-Ehret et al., 1990).
A laminina, quando polimerizada em condições neutra ou ácida, forma matrizes
estruturalmente distintas, que irão favorecer a neuritogênese ou a divisão celular através da
47
ativação de diferentes vias. A laminina polimerizada em pH 4,0 assume uma conformação
poligonal, diferente da laminina em pH 7,0, e também é capaz de promover adesão celular,
e promover maior neuritogênese no sistema nervoso central (Freire et al., 2002).
2. Objetivos
2.1 Objetivos Gerais
· Avaliar a influência da laminina polimerizada em matriz de diferentes pHs, na
regeneração do nervo ciático de camundongo, após lesão por transecção e
tubulização com tubo de colágeno.
2.2 Objetivos Específicos
· Avaliar qualitativamente a regeneração axonal através de microscopia óptica e
eletrônica de transmissão, comparando os diferentes tipos de laminina (ácida ou
neutra), veículo (pH ácido) e tubo puro.
· Avaliar quantitativamente a regeneração de fibras nervosas comparando os
diferentes tipos de laminina (ácida ou neutra), veículo (pH ácido) e tubo puro.
· Avaliar a recuperação da função motora, através de testes funcionais, analisando o
índice de função do ciático.
48
3. Materiais e Métodos
3.1 Animais:
Para este estudo foram utilizados 20 camundongos Balb-C fêmeas, com peso
variando de 18 a 25 g e idade de 2 meses. Esses animais foram submetidos à cirurgia para
transecção e tubulização do nervo ciático. Todos os procedimentos adotados estão de
acordo com as normas do comitê de ética em pesquisa com animais do Centro de Ciências
da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
3.2 Substância para preenchimento do intervalo do tubo de colágeno:
Os animais foram divididos em quatro grupos de acordo com diferentes
preenchimentos do tubo: Laminina em pH 4,0; laminina em pH 7,0; tampão (acetato de
sódio) em pH 4,0; tubo sem preenchimento por qualquer substância.
A laminina utilizada, foi obtida pelo isolamento de laminina de tumor de
“Engelbreth-Holm-Swarm” de camundongo, obtida da GIBCO BRL (Gaithersburg, MD),
diluída a uma concentração final de 50ug/mL, em acetato de sódio 20mM pH 4 (para
obtenção da laminina em pH 4), ou tris-HCl 20mM pH 7 (para obtenção de laminina em
49
pH 7), ambos contendo 1mM de CaCl2, e então polimerizada à 37° C. O tampão utilizado
para a avaliação da influência do meio ácido na regeneração foi o acetato de sódio 20mM
pH 4.
3.3 Tubo de colágeno:
Os tubos de colágeno utilizados nesse estudo foram confeccionados por Dr. Silvano
Lora (Universidade de Padova – Itália), seguindo o seguinte protocolo: o tubo
biodegradável foi obtido a partir do peritônio de bezerros de 18 meses de idade, logo após a
morte. A camada parietal do peritônio foi removida, lavada em álcool etílico, e seca em
temperatura ambiente. A camada parietal foi examinada para a seleção e eliminação de
regiões com características morfológicas macroscópicas irregulares. O material
remanescente foi comprimido até que a espessura regular e adequada fosse atingida. Depois
disso, fragmentos retangulares com uma superfície de 100 mm2 foram tratados com
enzimas proteolíticas, lavados em água destilada e enrolados ao redor de um bastão de aço
inoxidável de 1,0 mm de diâmetro. Este preparado foi imerso em solução aquosa com
reagente para ligação cruzada (crosslinking agent – CA) por duas horas. Os tubos foram
secos a 37°C, retirados dos bastões de aço, lavados em água para remover totalmente os
CA não reagentes, esterilizados por radiação gama e acondicionados em frascos
esterilizados. Foram realizados testes de biocompatibilidade e avaliada a efetividade do
tubo como guia do nervo (Langone et al., 1997; Lora et al., 1997).
50
3.4 Procedimento cirúrgico:
Os animais foram anestesiados, com injeção intraperitoneal de pentobarbital à 3%
(45 mg/Kg). Foi realizada a tricotomia da pata traseira esquerda, e em seguida foi feita uma
incisão na região posterior para expor o nervo ciático, que foi seccionado ao nível do terço
superior da coxa. Após a secção do nervo há uma retração do tecido seccionado, que é
reduzida a um intervalo de 3 mm, um tubo de colágeno medindo 6 mm de comprimento foi
utilizado para ligar o coto proximal ao coto distal, ocorrendo assim a tubulização (Figura
8). Os cotos foram inseridos no interior do tubo, 1,5 mm de cada lado, e o epineuro foi
suturado a este com monofilamento de nylon 10.0. Entre os cotos do nervo, no interior do
tubo, permaneceu um espaço de 3 mm, relativo ao espaço da retração do tecido nervoso
seccionado, formando o intervalo entre os cotos que será analisado posteriormente com
relação à regeneração. O tubo que é suturado aos cotos permanece a noite anterior ao
procedimento cirúrgico imerso na substância que será utilizada, para absorver totalmente a
substância e ter seu interior totalmente preenchido por esta, assim cada tubo já vem
preenchido com a substância de cada grupo, ou seja, 5 tubos com laminina ácida, cinco
tubos com laminina neutra, cinco tubos com tampão ácido e cinco tubos sem
preenchimento, apenas hidratados com água destilada. Foi utilizado um “n” de 5 animais
para cada grupo.
51
Figura 8: Esquema representativo da tubulização do nervo periférico.
Legenda: Os cotos proximal (P) e distal (D) do nervo periférico (NP), foram
inseridos 1,5 mm de cada lado do tubo de colágeno (TC), com o respectivo preenchimento
de cada grupo no interior do gap de 3,0 mm.
3.5 Perfusão:
52
Após uma sobrevida de seis semanas, os camundongos, sob anestesia, foram
operados novamente para a realização da perfusão por via intracardíaca. O procedimento
consiste em abrir a caixa torácica dos animais, a partir do processo xifóide, a fim de expor
o coração. Um escalpe é inserido no ventrículo esquerdo para a passagem de 50-100 mL de
solução fixadora contendo aldeídos (paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2,5 % em
tampão fosfato 0,1 M- pH 7,4). Concomitante ao início do fluxo da solução fixadora,
realiza-se uma pequena incisão no átrio direito para permitir o escoamento do sangue e da
solução fixadora da corrente circulatória do animal. Assim ao circular por entre os tecidos
imediatamente após a morte do animal, a solução fixadora promove a fixação das estruturas
in situ. O procedimento termina quando o animal fica rígido, os órgãos pálidos e livres de
sangue.
Ao final da perfusão, os animais foram dissecados, os nervos ciático esquerdos
novamente expostos e a porção média dos nervos em crescimento (área correspondente ao
intervalo entre os cotos proximal e distal do nervo) retirada e processada para microscopia
eletrônica de transmissão.
3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV):
Para microscopia eletrônica de varredura (MEV), os tubos de colágeno virgem
foram fixados em glutaraldeído a 3% e paraformaldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1M
(pH 7,2), pós-fixado com tetróxido de ósmio 1% por duas horas, lavados e desidratados em
séries de etanol. As amostras foram secas no ponto crítico (CPD 030, Balzers Instruments,
53
Liechtenstein) e metalizadas em ouro (FL- 9496 Balzers Union Coater). As micrografias
eletrônicas de varredura foram obtidas com microscópio de varredura JEOL JSM-5310.
3.7 Microscopia eletrônica de transmissão (MET):
Primeiro dia:
· Após a fixação por perfusão, os nervos foram imersos em solução fixadora
contendo glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) – 2 horas.
· Lavagem em tampão fosfato 0,1 M (pH7,4) – 3x5 minutos cada.
· Pós-fixação em tetróxido de ósmio a 1% + ferricianeto de potássio a 0,8% +
cloreto de cálcio 50nM em tampão cacodilato 0,1 M – 90 min.
· Lavagem em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,4) – 3x5 minutos cada.
· Solução aquosa de acetato de uranila a 1% na ausência de luz, durante a
noite.
Segundo dia:
· Lavagem em água destilada.
· Desidratação em concentrações crescentes de acetona a 30%, 50%, 70%,
80%, 90%- 2x7 min cada e a 100% - 2x5 min cada.
54
· Infiltração em mistura 1:1 de acetona 100% e resina Poly/Bed 812
(Polysciences, inc., Washington, Pa) – durante a noite no agitador.
Terceiro dia:
· Infiltração em resina pura – 8 à 12 horas.
· Colocação em moldes flexíveis para emblocar e orientar os cortes, utilizando
resina pura.
· Polimerização a 60°C – 48 horas.
Ultramicrotomia e contrastação
Trimagem
Após 48 horas, os blocos foram retirados da estufa e com auxílio de uma lâmina de
aço, foram aparados no próprio ultramicrótomo. A confecção do trapézio em torno do
material foi realizada manualmente.
Ultramicrotomia
Após a trimagem, através de ultramicrotomia, com faca de vidro, foram obtidos
cortes semifinos de 500 nm (verde e rosa), corados com azul de toluidina, para então serem
observados ao microscópio óptico. Em seguida, com faca de diamante, cortes ultra-finos de
80-60 nm (dourado/prateado) foram obtidos para observação ao microscópio eletrônico.
Estes cortes foram colhidos, com o auxílio de uma pinça fina, em grades de cobre 300
mesh previamente lavadas com ácido nítrico a 5%, água destilada, e secas com papel de
filtro.
55
Contrastação
Após serem colhidos, os cortes ultra-finos foram contrastados em acetato de uranila
a 5% por trinta minutos, na ausência de luz. Em seguida os cortes foram lavados em água
destilada, e contrastados em citrato de chumbo a 1%, por dez minutos. Para evitar que o
chumbo se precipite ao entrar em contato com o gás carbônico, devemos realizar este
procedimento em local contendo hidróxido de sódio 1M.
Novamente as grades foram lavadas em água destilada, secas em papel de filtro, e
devidamente armazenadas. Os cortes ultra-finos foram observados e fotografados ao
Microscópio Eletrônico de Transmissão (Zeiss EM -900) para avaliação qualitativa da
regeneração das fibras nervosas.
3.8 Morfometria
A morfometria foi feita utilizando cortes semi-finos e microscopia óptica. As
imagens dos cortes foram obtidas com um microscópio Zeiss Axioskop 2 Plus em um
aumento de 100X utilizando o software Axiovision Rel. 4.5 do mesmo fabricante. Para
cada nervo foi selecionado um corte que não apresentasse falha, dentes ou partes
amassadas e que estivesse corado de maneira homogênea. Foi obedecido o mesmo critério
de aquisição de imagens para todos os cortes, tais como tempo de exposição e condições de
brilho e contraste. Cinco campos diferentes de cada nervo foram fotografados em um
aumento de 100 vezes. As fibras mielinizadas de cada imagem foram contadas e as
respectivas áreas de fibra e do axônio medidas. Com esses dados calculamos a área da
mielina e o g-ratio (área do axônio / área da fibra). Os resultados destas quantificações
56
foram estatisticamente analisados pelo programa Prism (Grapg Pad Inc.) e utilizado o pós
teste de Mann-Whitney. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes
para valores de P<0,05.
3.9 Avaliação funcional
Na segunda, na quarta e na sexta semanas após a cirurgia todos os animais foram
submetidos a testes funcionais para a avaliação da marcha, baseado no protocolo descrito
por Inserra e colaboradores (1998). Para obtenção das pegadas, os animais têm suas patas
traseiras pintadas com tinta nanquim preta e deslocam-se livremente ao longo de um
corredor de madeira medindo 45 x 6,5 cm, sobre papel branco (Canson 140g/m2), como
mostrado na figura 9. As pegadas traseiras foram analisadas considerando-se a distância
entre o terceiro dedo e a região posterior do calcanhar – comprimento de pegada (PL –
print lenght), e a distância entre o primeiro e o quinto dedos (Toe spread - TS), para a
obtenção do índice de função do ciático (IFC). As medidas foram realizadas em animais
normais e nos animais operados. Para comparação das diferenças entre os grupos
utilizamos a análise paramétrica (ANOVA) seguindo do pós-teste de Kruskal-Wallis para
comparação intragrupo das medidas realizadas. Valores para p= 0,05 foram considerados
estatisticamente significantes.
57
Figura 9: Fotografia da visão superior do aparato utilizado para obtenção das pegadas e
realização do teste funcional. As patas traseiras do animal são pintadas e ele se desloca
livremente por um corredor de madeira, sobre papel branco apropriado, deixando impressas
suas pegadas. Podemos observar também na figura a impressão das pegadas da pata direita,
não lesionada (seta) e da pata esquerda, lesionada (seta cheia), deixando evidente a
diferença na mobilidade e distribuição de peso entre elas.
58
4. Resultados
4.1 Observações gerais
Dos vinte animais utilizados neste estudo nenhum apresentou qualquer tipo de
complicação cirúrgica no período de sobrevida. Todos apresentaram boa cicatrização e não
foi constatado o fenômeno de autotomia. O retorno da função motora ficou caracterizado
pela habilidade de suporte de peso na pata afetada durante o teste funcional de marcha.
4.2. Análise do tubo de colágeno – Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV)
Para análise do tubo de colágeno utilizamos a microscopia eletrônica de varredura,
demonstrando a partir desta a aparência geral do tubo e a disposição de suas fibras. Na
figura 10 observamos a estrutura do tubo em pequeno aumento, demonstrando seu aspecto
geral. Na figura 11 podemos observar em maior aumento a superfície externa do tubo,
exibindo aspecto em rede (detalhe em aumento maior na 11), além da composição das
paredes em camadas paralelas de fibras colágenas muito bem organizadas. Na figura 12
fica evidenciada a disposição das fibras colágenas em alinhamento longitudinal na parede
interna do tubo, demonstrando assim o aspecto da parede do tudo em sua face interna.
59
Figura 10: Eletromicrografia de varredura do tubo de colágeno não implantado. Aparência
do tubo de colágeno vazio mostrando a superfície externa (seta preta) e interna (seta
branca) da parede do tubo.
60
Figura 11: Eletromicrografia de varredura do tubo de colágeno não implantado. Superfície
externa da parede do tubo exibindo um aspecto de rede, visualizado em maior aumento no
detalhe da figura.
10 µm
61
Figura 12: Eletromicrografia de varredura do tubo de colágeno não implantado. Superfície
interna da parede do tubo, onde se pode observar um alinhamento longitudinal das fibras de
colágeno(setas).
62
4.3 Análise qualitativa do nervo ciático 6 semanas após cirurgia -
Microscopia Óptica (MO) e Microscopia Eletrônica de Transmissão
(MET)
4.3.1 Análise histológica de nervo ciático seis semanas após cirurgia – MO
Todos os animais estudados tiveram os seus nervos ciáticos esquerdos retirados.
Após a perfusão, os nervos foram dissecados para a remoção dos tecidos que os envolviam
e o segmento equivalente à porção média do intervalo deixado entre os cotos proximal e
distal (área correspondente aos nervos em regeneração) foram retirados para as análises
morfológicas e morfométricas. Assim analisamos vinte segmentos de nervos, 5 referentes
ao grupo laminina ácida, 5 relativos ao grupo laminina neutra, 5 referentes ao grupo
tampão ácido e 5 referentes ao grupo tubo puro.
Através da análise dos cortes semifinos podemos observar o aspecto geral da
organização tecidual em cada nervo regenerado de cada grupo. Na figura 13 observamos
fotomicrografias de cortes transversais da região central do tubo, com seis semanas de
regeneração do nervo. No grupo laminina ácida (A, B), os cortes revelam uma regeneração
extensa e bem organizada, com inúmeras ilhotas regenerativas, boa distribuição do tecido
conjuntivo, fascículos organizados e bem delimitados, melhor organização do colágeno da
matriz extracelular e o nervo calibroso ocupando praticamente toda a área interna do tubo
de colágeno, evidenciando um tecido morfologicamente mais organizado. No grupo de
laminina neutra (C, D), podemos observar o nervo também calibroso, porém com aspecto
menos organizado de fibras em regeneração e aparente maior preenchimento de tecido
conjuntivo entre as ilhotas regenerativas No grupo tampão ácido (E, F), os cortes
63
apresentam nervo em regeneração, porém com distribuição menos homogênea de tecido
conjuntivo. No grupo tubo puro (G, H), constatamos um nervo menos calibroso dentro do
tubo, com formação de tecido regenerativo consideravelmente menos organizado, com
distribuição heterogênea de tecido conjuntivo e ilhotas regenerativas dispersas,
evidenciando nesse grupo a pior organização tecidual dentre todos os grupos analisados.
64
Laminina ácida
Laminina Neutra
Tampão ácido
Tubo puro
A B
C
D
E
F
G H
65
Figura 13: Análise qualitativa comparativa entre cortes transversais de nervo ciático de
camundongo seis semanas após cirurgia. Em A, C, E e G aumentos de 20X e em B, D, F e
H aumentos de 100X. A e B são referentes ao grupo de laminina ácida, as setas brancas
indicam as ilhotas regenerativas. C e D são referentes aos grupos de laminina neutra, as
estrelas indicam o tecido conjuntivo propriamente dito. E e F são referentes ao grupo de
tampão ácido, as estrelas mostram o tecido conjuntivo propriamente dito e G e H são
referentes ao grupo de tubo puro, as cabeças de setas indicam o nervo no interior do tubo, e
as estrelas mostram o tecido conjuntivo propriamente dito.
66
4.3.2 Análise ultraestrutural de nervo ciático seis semanas após cirurgia –
MET
Nas figuras 14 à 17, a análise morfológica ultraestrutural de nervos ciáticos em
regeneração, seis semanas após a cirurgia revelam características teciduais de cada grupo.
Na figura 14 podemos observar a organização tecidual do grupo laminina ácida, com um
aparente maior número de axônios mielínicos, porém não muito calibrosos, com bainha de
mielina espessa e bem formada, além de numerosas fibrilas colágenas imersas na matriz
extracelular, que se mostra organizada e homogênea. É notável a boa distribuição dos
axônios mielínicos, amielínicos e em mielinização, que se encontram reunidos e envolvidos
por celulas de Schwann, formando as inúmeras ilhotas regenerativas. Na figura 15
analisamos a eletromicrografia o grupo de laminina neutra, com menor número de fibras
mielínicas e amielínicas em comparação à figura anterior, considerando inclusive o menor
aumento, onde é possível visualizar um maior campo do nervo analisado, porém essas
fibras se apresentam aparentemente mais calibrosas, com algumas ilhotas regenerativas e
bainha de mielina espessa. Na figura 16 observamos eletromicrografias do grupo tampão
ácido, observamos fibras mielínicas dispersas e com bainhas de mielinas finas, porém com
numerosas fibras amielínicas. Na figura 17 podemos observar a organização ultraestrutural
tecidual do grupo tubo puro com menor número de axônios tanto mielínicos quanto
amielínicos, em relação à figura 15 (laminina neutra), que se encontra sob o mesmo
aumento, porém é observado um campo da periferia do nervo, onde podemos assim
observar um perineuro compacto, além da matriz extracelular desorganizada e dispersa,
evidenciando a menor organização tecidual desse grupo em relação aos outros grupos
analisados.
67
Figura 14: Eletromicrografia do corte transversal de nervo ciático do grupo laminina ácida,
em processo de regeneração, seis semanas após a cirurgia. Observamos grande número de
fibras mielinizadas em regeneração (setas), além de axônios amielínicos (setas largas), e
fibras em processo de mielinização, como é possível observar a bainha de mielina fina em
processo de espessamento (cabeças de seta). Além disso observamos a matriz extracelular
do nervo homogênea e organizada. Barra = 1µm.
68
Figura 15: Eletromicrografia do corte transversal de nervo ciático do grupo laminina
neutra, seis semanas após a cirurgia. Observamos pequeno número de fibras mielinizadas
(setas) porém calibrosas, e algumas fibras amielínicas (setas largas) e grande quantidade de
colágeno (estrela). Barra = 1µm.
69
Figura 16: Eletromicrografia de corte transversal de nervo ciático do grupo tampão ácido,
seis semanas após a cirurgia. Observamos fibras nervosas mielínicas mais dispersas e
envolvidas por fina camada de mielina (setas), e numerosas fibras amielínicas (setas
largas), além de axônios destacados da bainha de mielina indicando possível processo
degenerativo (seta larga branca). Barra = 1µm.
70
Figura 17: Eletromicrografia de corte transversal de nervo ciático do grupo tubo puro, seis
semanas após a cirurgia. Podemos observar um axônio mielínico (seta), em matriz
desorganizada e dispersa (estrela branca), com perineuro pouco compacto (estrela preta)
com grande quantidade de colágeno. Barra = 1µm.
71
4.4 Análise quantitativa do nervo ciático 6 semanas após a cirurgia – MO
Os estudos morfométricos foram realizados a partir de cortes semifinos (MO), com
base na análise da área da fibra nervosa, área do axônio, área da bainha de mielina, número
de axônios mielínicos e G Ratio.
A análise das áreas das fibras (gráfico 1), mostrou que os grupos laminina ácida e
laminina neutra obtiveram os maiores valores, indicando uma possível melhor regeneração
para esses grupos, embora tenha sido estatísticamente significativo somente a diferença
entre os grupos laminina neutra e tubo puro (P = 0.05).
Com relação à área do axônio (gráfico 2), mais uma vez, os grupos laminina ácida
e laminina neutra obtiveram os maiores valores, sendo o maior valor obtido o da laminina
neutra. Com a comparação intergrupos, foi constatada significância estatística também
entre os gruposlaminina neutra e tubo puro (P = 0.05).
Ao analisrmos a área da bainha de mielina (gráfico 3), observamos os maiores
valores nos grupos laminina ácida e laminina neutra, porém sem resultados estatisticamente
significativos na comparação entre os grupos.
Com a análise do G Ratio (gráfico 4), que é a razão entre o diâmetro do axônio e da
fibra nervosa, pudemos observar menores diferenças entre os resultados dos grupos, sem
significância estatística. Os valores de G Ratio mais próximo de 0,5 indicam um fibra
saudável, alterações nesses valores indicam alterações na constituição do axônio ou da
bainha de mielina.
Quando analisamos os valores do G ratio separadamente (gráfico 5), comparando
em cada valor do G ratio os resultados dos números de fibras entre os grupos,encontramos
72
resultado significativo entre o grupo laminina neutra e tampão ácido (P = 0.02), sendo o
melhor resultado o do grupo tampão ácido.
Com a análise do número de axônios mielinizados (gráfico 6), observamos os
maiores valores no grupo laminina ácida, apesar disso não foram encontrados resultados
significativos estatisticamente para esse valores.
73
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
20.0
Laminina Ácida Laminina Neutra Tampão Ácido Tubo Puro
ÁR
EA
DA
FIB
RA
um
2
Gráfico1: Análise quantitativa das áreas da fibra nervosa dos quatro grupos (laminina
ácida, laminina neutra, tampão ácido e tubo puro). Os valores representam as médias de
cada grupo. P = 0.05.
74
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
20.0
Laminina Ácida Laminina Neutra Tampão Ácido Tubo Puro
ÁR
EA
DO
AX
ÔN
IO u
m2
Gráfico 2: Análise quantitativa das áreas dos axônios dos quatro grupos (laminina ácida,
laminina neutra, tampão ácido e tubo puro). P = 0.05.
75
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
20.0
Laminina Ácida LamininaNeutra
Tampão Ácido Tubo Puro
ÁR
EA
DA
BA
INH
A D
E M
IEL
INA
um
2
Gráfico 3: Análise quantitativa das áreas das bainhas de mielina dos quatro grupos
(laminina ácida, laminina neutra, tampão ácido e tubo puro). Os valores representam as
médias de cada grupo.
76
G Ratio
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
Laminina Ácida LamininaNeutra
Tampão Ácido Tubo Puro
G R
AT
IO
Gráfico 4: Análise quantitativa do G Ratio de cada grupo (laminina ácida, laminina neutra,
tampão ácido e tubo puro).
77
-5
0
5
10
15
20
25
0.1-0.2 0.2-0.3 0.3-0.4 0.4-0.5 0.5-0.6 0.6-0.7 0.7-0.8
G RATIO
NÚ
ME
RO
DE
FIB
RA
S
Laminina ÁcidaLaminina neutraTampão ÁcidoTubo Puro
Gráfico 5: Histograma separando os valores de G Ratio dos diferentes grupos. O gráfico
expressa a média dos quatro grupos (laminina ácida, laminina neutra, tampão ácido e tubo
puro) com seus respectivos erros. P = 0.02.
78
Lamin
ina
Ácida
Lamin
ina
Neutra
Tampão
Áci
do
Tubo Puro
0
1000
2000
Tampão ÁcidoTubo Puro
Laminina ÁcidaLaminina Neutra
axôn
ios
mie
línic
os
Gráfico 6: Análise quantitativa do número de axônios mielínicos encontrados em cada
grupo. É possível observar a diferença entre os grupos, porém essas diferenças não foram
consideradas significativas estatisticamente.
79
4.5 Análise Funcional
As pegadas foram obtidas, através de impressão em papel apropriado, ao final da
segunda, quarta e sexta semanas após a cirurgia. De maneira geral observamos que, desde a
segunda semana a locomoção ocorreu sem qualquer dificuldade. Apesar da diferença na
mobilidade e distribuição de peso entre as patas lesionada e não lesionada ficar evidente na
impressão das pegadas (figura 18), a dinâmica da marcha parecia normal em função das
compensações e substituições de padrões de movimento, realizadas pelos animais.
Um total de 360 pegadas foram mensuradas a partir de quatro grupos (laminina
ácida, laminina neutra, tampão ácido e tubo puro).
Analisando as pegadas observamos diferenças importantes tanto no comprimento de
pegada (Print Length – PL) quanto no espalhamento da pegada (Toe Spread – TS), medidas
que podem ser visualizadas na figura 18. Para comparação das diferenças entre os grupos
utilizamos a análise de variância paramétrica (ANOVA) seguido do pós-teste de Krustal
Wallis para comparação intragrupos. A análise quantitativa destes parâmetros, como
mostrado no gráfico 7, evidenciou uma recuperação melhor do grupo laminina ácida,
embora esse resultado não tenha apresentado significância estatística. A partir do momento
em que comparamos os grupos entre si, constatamos uma melhor recuperação funcional do
grupo laminina ácida em relação à todos os grupos, havendo uma diferença significativa
entre os grupos laminina ácida e tubo puro na quarta semana de recuperação.
80
Figura 18: Imagem das pegadas de camundongo seis semanas após cirurgia, obtidas
através do teste funcional. Podemos observar as medidas utilizadas para obtenção do IFC
(Toe spread - TS; print length – PL). A pegada da esquerda corresponde à pata operada, e a
da direita à pata normal.
TS
PL
TS
PL
81
Índice de Função do Ciático
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
semana 2 semana 4 semana 6
IFC
(%
) Laminina Ácida
Laminina Neutra
Tampão Ácido
Tubo Puro
Gráfico 7: Análise quantitativa da diferença entre os IFC dos diferentes grupos ao longo
das seis semanas de regeneração após a cirurgia. O grupo laminina neutra obteve melhor
resultado funcional, obtendo um IFC melhor em relação aos outros grupos, embora essa
diferença não tenha sido considerada significativa. Porém quando fizemos a comparação
entre os grupos, observamos uma diferença significativa entre os grupos laminina ácida e
tubo puro na quarta semana de regeneração, considerando P = 0.02.
O IFC foi obtido através da fórmula: SFI = 118.9 ETP - NTS - 51.2 EPL – NPL – 7.5 NTS NPL
Sendo SFI (Sciatic Functional Índex), ETC (Experimental Toe Spread), NTS (Normal Toe
Spread), EPL (Experimental Print Lenght), NPL (Normal Print Lenght).
82
5. Discussão
As lesões traumáticas no sistema nervoso são comuns, e apesar do grande potencial
regenerativo do SNP, ainda não foi descrito um tratamento satisfatório com relação à total
recuperação funcional após a lesão (Lee e Wolfe, 2000; Gordon et. Al, 2007). Quando há
transecção do nervo, com perda de tecido neural, se faz necessária a utilização de uma
ponte entre os cotos proximal e distal, sendo que quanto maior o intervalo entre os cotos,
maior a dificuldade no reparo do nervo. Neste estudo, buscando aperfeiçoar a regeneração
do nervo periférico e a recuperação funcional após transecção do nervo ciático, utilizamos
a tubulização com tubo biodegradável de colágeno (Pereira Lopes et. al, 2006), associado a
lamininas polimerizadas em diferentes pHs (Freire et. al, 2002; Freire et.al, 2004).
A combinação dessas estratégias resultou em uma melhor regeneração, com melhor
organização tecidual, aumento nas áreas das fibras regeneradas e aumento nas áreas dos
axônios, além de maior número de axônios mielinizados. Além disso, o teste de função
motora, também foi possível constatar melhor recuperação funcional nos animais tratados
com laminina.
Atualmente a principal técnica para reconstrução de defeitos em nervos periféricos é
o enxerto de nervo autólogo. Porém essa técnica possui várias complicações e
desvantagens, como perda de função do nervo doador, com diminuição da sensibilidade
local, formação de neuroma e viabilidade limitada do material (Sinis et. al, 2006; Sinis
et.al, 2007). Outras estratégias têm sido desenvolvidas com o objetivo de sanar essas
83
limitações, assim, os tubos de materiais biológicos tem sido largamente utilizados. Estes
são capazes de dar suporte e servir como guia durante a regeneração do nervo, sem as
desvantagens dos materiais não biológicos, como tubos de nylon, silicone e poliuretano,
que podem levar à compressão do nervo, resposta inflamatória além de fazer necessária
uma segunda cirurgia para sua retirada, por não serem biodegradáveis (Lundberg et. al,
1997; Arai et. al, 2000). Com isso os materiais biológicos e biodegradáveis têm sido
amplamente estudados, aperfeiçoados e utilizados, alcançando resultados favoráveis à
regeneração do nervo periférico, não somente oferecendo sustentação, como direcionando
o crescimento do nervo, prevenindo contra a formação de neuroma e crescimento de tecido
cicatricial no interior do intervalo entre os cotos (Nakamura et al., 2004).
Avaliações funcionais mostraram que a regeneração de tecido nervoso após
transecção com formação de intervalo entre os cotos, é superior quando utilizamos um tubo
biodegradável em comparação com enxerto de nervo autólogo (Ijkema-Paassen, 2002).
Estudos clínicos utilizando tubos biodegradáveis, como tubo de ácido poliglicólico,
mostraram resultados favoráveis à regeneração do nervo periférico (Lee et al., 2006; Inada
et al., 2004). O colágeno é um dos melhores materiais utilizados para reconstrução de
intervalos entre cotos em nervos periféricos, graças à sua biocompatibilidade e adequada
força de tensão (Ahmed et al., 2005), além disso suas propriedades biológicas fazem dele
excelente escolha como tubo para guiar e promover o crescimento do nervo (Keilhoff et al.,
2003). Em acordo com a literatura, utilizamos nesse trabalho tubos de colágeno para
auxiliar o alongamento e a regeneração axonal.
Após a lesão traumática do nervo periférico, seja ela por esmagamento ou secção,
inicia-se um processo de degeneração Walleriana no segmento distal do nervo
comprometido. A cascata de eventos desencadeada pela lesão, na degeneração Walleriana,
84
leva à sinalização para as células de Schwann, que se desdiferenciam e proliferam,
formando as Bandas de Büngner. O processo de regeneração se inicia com o alongamento
axonal a partir do nodo de Ranvier mais próximo no segmento proximal do nervo (Stoll e
Müller, 1999). Esses alongamentos axonais alcançam a Banda de Büngner e são guiados ao
tecido alvo pela interação das células de Schwann com a lamina basal (Martini, 1994). As
moléculas da matriz extracelular estão envolvidas diretamente nos processos de
degeneração e regeneração do nervo, e a laminina é um dos principais componentes desta,
estando assim presente na lâmina basal, o que indica sua importância nas interações
neurônio-glia (Gantus et al., 2006). A laminina é permissiva à adesão das células de
Schwann durante esses processos, e foi provado que lamininas incorporadas à membrana
celular aumentam significantemente a adesão das células de Schwann e a afinidade para
direcionamento da regeneração do nervo periférico (Huanq et al., 2007). Além disso, a
laminina tem papel sinalizador para as células de Schwann iniciarem o processo de
mielinização dos axônios, para seu crescimento longitudinal durante o desenvolvimento, e
na organização dos nodos de Ranvier (Martin e Peles, 2006), promovendo também o
cresimento neurítico (Armstrong et al., 2007; Deister et al.,2007; Evans et al., 2007) e
orientação axonal (Turney e Brigman, 2005).
Com o objetivo de caracterizar de forma confiável a regeneração do nervo
periférico, utilizamos o número de fibras mielinizadas, o diâmentro da fibra nervosa e a
área da bainha de mielina como parâmetros (Savy et al., 1988). Em nosso trabalho foi
possível observar uma melhor organização tecidual nos grupos que receberam laminina,
além de encontrarmos no grupo laminina ácida o maior número de axônios mielinizados, e
no grupo laminina neutra os melhores resultados para área da fibra nervosa, maior área do
axônio e maior área da bainha de mielina. Provavelmente isso se deve à presença de
85
laminina. Algumas propostas podem ser levantadas para explicar o papel da laminina ácida
e neutra na regeneração do nervo periférico.
Sabemos que diante da acidificação da matriz extracelular astrócitos assumem
morfologia estrelada, o que seria indicativo de adesão, migração ou expansão celular
(Gottfried et al., 2003). Sabemos também que a laminina, principal glicoproteína da matriz
extracelular, quando em pH ácido se polimeriza, assumindo uma conformação que expõe
mais sítios de ligação, o que favorece a neuritogênese (Freire e Coelho-Sampaio, 2000;
Freire et al., 2002; Freire et al., 2004). Estes estudos mostram que a matriz de laminina
ácida polimerizada em pH ácido facilita a neuritogênese in vitro, tendo sido demonstrado
no sistema nervoso central. Em nossos resultados obtivemos um maior número de fibras
mielinizadas e um melhor desempenho funcional no teste de função motora no grupo de
laminina ácida, além de um aspecto tecidual mais organizado em relação aos outros grupos.
Isso poderia ser explicado pela influência positivo da laminina ácida na regeneração neural.
Apesar disso os resultados mais expressivos alcançados, com significância estatística,
foram em relação à laminina neutra, com as maiores áreas de fibra nervosa, axonal e da
bainha de mielina. O papel da laminina na adesão celular, proliferação, neuritogênese,
mielinização e na interação entre células de Schwann e axônios são amplamente estudados
tanto in vitro o quanto in vivo, e têm comprovação em vários modelos experimentais
(Wallguist et al., 2005; Tucker et al., 2006; Yu et al., 2007; Deister et al., 2007; Colognato
et al., 2007). Assim, como em nossos resultados observamos dados mais expressivos com
relação a atuação da laminina neutra em relação à regeneração do nervo periférico, é
possivel que in vivo, devido às condições favoráveis do microambiente regenerativo, a
atuação da laminina neutra tenha melhor desempenho em relação à laminina ácida.
86
Estudos recentes mostram que a associação de gradientes de concentração de
diferentes componentes da matriz extracelular associados a hidrogel, no interior de tubos
como ponte entre cotos de nervo periférico, são mais eficientes na regeneração nervosa em
relação a concentrações uniformes de um único componente, como a laminina (Dodla e
Bellamkonda, 2008), como também a utilização de Matrigel, gel composto pelos elementos
da matriz extracelular, com a laminina como o elemento mais abundante, mostrando
resultados significativos com relação a regeneração do nervo periférico (Donzelli et al.,
2006). Dessa forma, pode-se concluir que talvez a laminina tenha melhor atuação in vivo
em associação a outros componentes da matriz extracelular.
Como o G ratio é determinado pela razão entre o diâmentro do axônio e da fibra
nervosa, um G ratio maior pode ser esperado em uma neuropatia desmielinizante, já que a
remielinização leva a uma camada de mielina delgada, mas não altera o diâmetro do axônio
(Bosboon et al., 2001). Em nosso trabalho foi possível constatar valores de G ratio
próximos do normal para os grupos laminina ácida, laminina neutra e tubo puro, sendo que
o grupo tubo puro teve os valores mais alterados, abaixo do normal (0,50), embora não
tenha havido significância estatística.
Com isso concluímos que este resultado possa se dever ao valor da área do axônio
ter sido baixo, ou a área da fibra estar aumentada. Como observamos, o grupo tampão
ácido teve valores baixos para todos esses parâmetros. Com a análise morfológica
constatamos o aspecto desorganizado do tecido conjuntivo propriamente dito, com a
distribuição dispersa dos axônios. Com isso, podemos aventar a hipótese do valor do G
ratio se dever a um possível acúmulo de GAGs, o que levaria a um aumento na área da
fibra não acompanhado pelo aumento na área do axônio. Ao separarmos o G ratio por
faixas relativas aos seus valores, observamos que os grupos laminina ácida e laminina
87
neutra apresentam maiores números de fibras para valores de G ratio próximos do normal
(0,4 – 0,5 e 0,5 – 0,6), o que poderia explicar o melhor desempenho das fibras nervosas
desses grupos. Dentro desses resultados obtivemos significância estatística entre os
números de fibras dos grupos laminina neutra e tampão ácido, para valores de G ratio
inferiores ao normal (0.2 – 0.3), o que evidencia maior número de fibras do grupo tampão
ácido com sua organização tecidual comprometida.
Com a observação dos resultados funcionais da avaliação motora, obtivemos
resultados estatisticamente significativos na quarta semana de regeneração entre os grupos
laminina ácida e tubo puro, além disso o grupo laminina ácida mostrou uma recuperação
linear e progressiva ao longo das seis semanas. Levantamos então a hipótese de que com
um “n” maior, ou com maior tempo para avaliação da recuperação funcional, talvez fosse
melhor para obtermos mais resultados significativos, avaliando estes a longo prazo, e
verificando se a melhor organização tecidual teria maior influência na recuperação
funcional do grupo laminina ácida.
Assim concluímos, que o efeito da laminina polimerizada em diferentes pHs é
diverso, havendo resultados significativos tanto no grupo laminina ácida, na avaliação
funcional, quanto na laminina neutra, com relação as áreas da fibra e do axônio. Assim,
estes resultados indicam que o implante de tubo de colágeno preenchido com laminina
neutra e ácida potencializa a regeneração do nervo ciático após lesão por transecção, com
intervalo entre os cotos de 3 mm. Observamos resultados mais expressivos com relação à
laminina neutra. Porém se faz necessária uma melhor investigação, com aumento do “n” e
o tempo de regeneração após a cirurgia, para que possamos avaliar mais efetivamente o
quanto realmente a melhor organização do nervo alcançada com a laminina ácida
influenciaria na regeneração do nervo periférico e na recuperação funcional.
88
6. Conclusões
· O tubo de colágeno implantado serviu de guia para os axônios em
regeneração, de nervo ciático seccionado, de camundongos.
· A adição de laminina ácida no interior do tubo de colágeno não conferiu
resultados estatisticamente significativos, com relação à regeneração do
nervo periférico, porém evidenciou uma melhor organização tecidual.
· A adição de laminina neutra no interior do tubo de colágeno resultou
melhora estatisticamente significativa com relação a área da fibra regenerada
e área do axônio quando comparada ao grupo tubo puro com seis semanas.
Além do resultado significativo no G ratio em relação ao grupo tampão
ácido na quarta semana de regeneração.
· Os dois grupos que receberam laminina demonstraram melhor organização
tecidual em relação aos outros grupos.
· A análise funcional não mostrou resultados estatisticamente significativos,
embora o grupo laminina ácida tenha mostrado um melhor desempenho
funcional.
89
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