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Efeito da salinidade na produção de
exopolissacarídeos pela microalga
Porphyridium cruentum
Inês Veríssimo Mendonça
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Química
Orientadores: Doutora Cláudia Sofia Cordeiro Nunes
Drª. Inês Filipa Neto Póvoa
Prof. Doutor Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho
Júri
Presidente: Prof. Doutor Sebastião Manuel Tavares Silva Alves
Orientadora: Doutora Cláudia Sofia Cordeiro Nunes
Vogal: Doutora Anabela Cristina da Silva Naret Moreira Raymundo
Novembro, 2016
A presente dissertação é o resultado de uma colaboração entre o Instituto Superior Técnico, a
Universidade de Aveiro e a empresa NECTON, S.A.
Orientadores:
Doutora Cláudia Sofia Cordeiro Nunes, Universidade de Aveiro
Prof. Doutor Arsénio do Carmo Lates Fialho, Instituto Superior Técnico
Drª. Inês Filipa Neto Póvoa, NECTON S.A.
v
Agradecimentos
A realização deste trabalho não teria sido possível sem o apoio e a colaboração de várias
pessoas e entidades, aos quais não poderia deixar de dirigir um especial agradecimento.
Agradeço, em primeiro lugar, à Engª. Victória del Pino e à Drª. Inês Póvoa da empresa
NECTON S.A. a concepção do tema do trabalho e a oportunidade de realizar o estágio curricular
em ambiente industrial. Um agradecimento especial a toda a equipa da unidade de microalgas
pelo apoio e partilha de conhecimentos. Agradeço também ao Jerónimo Guerra. À Ana
Compadre e Hélia Carvalho, um muito obrigada pelo acompanhamento diário.
Ao Doutor Manuel Coimbra, da Universidade de Aveiro, por me ter aceite sem hesitação
no seu grupo de investigação, ResPoStA@UA, e ter permitido a continuação e desenvolvimento
do meu trabalho.
À Doutora Claúdia Nunes, orientadora na Universidade de Aveiro, pela sua total
disponibilidade, acompanhamento, partilha de conhecimentos e visão.
Ao Professor Arsénio Fialho, orientador interno, por ter aceite o meu convite e pela sua
total disponibilidade.
A todos os colegas do ResPoStA@UA por toda a ajuda, apoio e companheirismo. Um
agradecimento especial à Ana Rocha e à Sónia Ferreira pela amizade, ajuda e paciência nos
três meses em que estive na Universidade de Aveiro.
Agradeço a todos os meus amigos do Instituto Superior Técnico, em especial à Ana Portela
e Margarida Barros todos os anos de amizade, momentos vividos e a toda a paciência. Aos meus
colegas de casa, destes últimos 5 anos, o apoio nos momentos altos e baixos da minha vida.
Às minhas amigas de sempre, Ana Isabel, Melissa Carneiro, Nadine Martins, Beatriz
Mendoza e Diana Cadete pela amizade insubstituível.
Um agradecimento muito especial à minha família, à minha mãe, irmão e avô, por todo o
apoio, amor e porque sem eles nada disto seria possível.
E por último ao meu companheiro de todas as horas, Mário, pelo apoio incondicional em
todas as minhas decisões e por estar sempre presente nos momentos bons e me ajudar a
superar os momentos menos bons.
Um agradecimento a todos os que de uma forma ou de outra passaram na minha vida
académica.
vii
Resumo
Atualmente as microalgas são consideradas uma fonte importante e promissora de
compostos de valor acrescentado, nomeadamente ácidos gordos, lípidos, aminoácidos
essenciais e polissacarídeos. A microalga Porphyridium cruentum é uma das microalgas que tem
suscitado particular interesse, principalmente pelo facto de excretar para o meio elevados teores
de polissacarídeos sulfatados. Estes polissacarídeos têm sido extensivamente estudados quanto
às suas propriedades reológicas e biológicas com potencial utilização nas indústrias alimentar,
farmacêutica e cosmética.
O principal objetivo do presente trabalho foi a produção da microalga P. cruentum em três
diferentes salinidades, nomeadamente 18, 32 e 50 g NaCl/L, com a finalidade de estudar a sua
influência no crescimento celular e na produção de polissacarídeos extracelulares. Desta forma,
procedeu-se à extração, quantificação e caracterização dos polissacarídeos.
As amostras produzidas em meios de salinidade igual a 18 e 32 g NaCl/L apresentaram
maior concentração de material polimérico, em relação à microalga que cresceu num meio com
salinidade superior, 50 g/L. A percentagem de açúcares totais no material polimérico obtido a
partir das amostras produzidas a diferentes salinidades varia entre 41 e 73% (m/m), sendo a
amostra cultivada no meio de salinidade igual a 32 g/L a que apresenta maior conteúdo em
açúcares totais. Contudo, o conteúdo em sulfato não apresentou diferenças significativas nas
amostras produzidas nas diferentes salinidades, tendo sido determinados teores entre 7,8 e 8,1%
(m/m). As amostras apresentam, também uma composição em cinzas entre 6 e 9% e em proteína
solúvel entre 1 e 3%.
Os polissacarídeos são constituídos maioritariamente por xilose, galactose, glucose e
ácidos urónicos, tendo sido também identificados resíduos de manose, ramnose, fucose e
arabinose. Verificou-se que a salinidade não influenciou a composição em monossacarídeos do
material polimérico. O tipo de ligações glicosídicas e a posição dos grupos sulfatos na estrutura
foram identificadas a partir de análises de metilação antes e após dessulfatação. Os
polissacarídeos são constituídos maioritariamente pelas ligações (1→3) e (1→4)-Xyl; (1→3,4) e
(1→2,3,4)-Gal e (1→3) e (1→3,6)-Glc. No entanto, foram também identificadas as ligações (1→3),
(1→4), (1→2,3) e (1→3,6)-Gal e (1→4)-Glc. Os grupos sulfato estão principalmente localizados
no carbono 6 da Glc. O scale-up permitiu a validação dos parâmetros para a produção de
biomassa em grande escala, assim como, a obtenção de polissacarídeos sulfatados, tendo-se
obtido uma quantidade de açúcares totais no material polimérico de 60% m/m.
O presente trabalho permitiu concluir que a salinidade do meio não influencia a produção
de polissacarídeos sulfatados, quer em quantidade quer na sua composição, podendo ser usada
a salinidade da Ria Formosa 32 g/L para a produção da microalga P. cruentum. Esta microalga
revelou potencialidade para ser explorada para a obtenção de polissacarídeos sulfatados.
Palavras-chave: Porphyridium cruentum, polissacarídeos sulfatados, salinidade, análise
estrutural
ix
Abstract
Nowadays microalgae are considered an important and promising source of high -added
value compounds, namely fatty acids, lipids, essential amino acids and polysaccharides. The
microalgae Porphyridium cruentum have raised particular interest by researchers mainly because
of their ability to excrete into the medium high levels of sulfated polysaccharides. These
polysaccharides have been extensively studied because of their rheological and biological
properties due to their application in the food, pharmaceuticals and cosmetics industries.
The main objective of this work was the production of the microalgae P. cruentum in three
different salinities, namely 18, 32 and 50 g NaCl/L, with the purpose of studying the influence in
cell growth and production of extracellular polysaccharides. Consequently, the extraction,
quantification and characterization of the polysaccharides was performed.The samples produced
in salinity medium with 18 and 32 g NaCl/L had higher content of polymeric material, whereas
the quantity obtained for the samples at 50 g/L was significantly lower. The percentage of total
sugars in the polymeric material from samples at different salinities varying between 41 and 73%
(w/w). The sample grown in medium salinity equal to 32 g/L presented the highest content of total
sugars. However, the content of sulfate showed no significative differences in the samples
produced at different salinities with values between 7,8 and 8,1% (w/w).The polimeric material
also presents an ash content from 6 to 9% and soluble protein between 1 and 3%.
The main residues comprising the sulfated polysaccharides are xylose, galactose, glucose
and uronic acids, with mannose, rhamnose, fucose and arabinose as minor sugars. These results
lead to infer that salinity not influence the monosaccharide composition of the polimeric material.
The identification of glycosidic linkages and the position of the sulfate groups was studied by
methylation analysis before and after desulfation. The polysaccharides are composed mostly by
the linkages: (1→3) and (1→4)-Xyl, (1→3,4) and (1→2,3,4)-Gal and (1→3) and (1→3,6)-Glc.
However, were also identified the linkages (1→3), (1→4), (1→2,3) and (1→3,6)-Gal and (1→4)-
Glc. The sulfate groups were identified in the C-6 of glucose residues. The scale-up allowed the
validation of the parameters for biomass production at large scale, as well as to obtain sulfate
polysaccharides, yielding a quantity of total sugars in the polymeric material of 60% (w/w).
This study allowed to conclude that salinity of the medium does not influence the production
of sulfated polysaccharides, either in quantity or in composition, and may be used the salinity of
Ria Formosa (32 g/L) for the production of microalgae P. cruentum. This microalga revealed the
potential to be exploited for obtaining sulphated polysaccharides.
Key words: Porphyridium cruentum, sulfated polysaccharides, salinity, structural analysis
xi
Índice
Agradecimentos ........................................................................................................................ v
Resumo .................................................................................................................................. vii
Abstract ................................................................................................................................... ix
Índice de figuras..................................................................................................................... xiii
Índice de tabelas ..................................................................................................................... xv
Lista de Abreviaturas .............................................................................................................xvii
1. Introdução .......................................................................................................................... 1
2. Revisão Bibliográfica .......................................................................................................... 3
2.1. Microalgas no sector industrial e comercial ..................................................... 4
2.1.1 Sistemas de cultivo de microalgas .............................................................. 5
2.2. Porphyridium cruentum .................................................................................. 7
2.3. Polissacarídeos extracelulares ..................................................................... 11
2.3.1 Estrutura dos polissacarídeos extracelulares ............................................ 12
2.3.2 Extração de exopolissacarídeos ............................................................... 15
2.3.3 Potencial dos exopolissacarídeos sulfatados ............................................ 15
2.3.4 Viabilidade Económica ............................................................................. 17
2.4. Produtos no mercado derivados de EPS de Porphyridium spp. ..................... 17
2.5. Objetivos ...................................................................................................... 19
3. Material e Métodos ........................................................................................................... 21
3.1. Produção da Microalga Porphyridium cruentum ........................................... 21
3.2. Medição de parâmetros de crescimento ....................................................... 23
3.2.1. Densidade ótica........................................................................................ 23
3.2.1. Determinação do Peso Seco .................................................................... 24
3.2.2. Contagem de células ................................................................................ 25
3.3. Extração de exopolissacarídeos ................................................................... 26
3.4. Análise estrutural dos polissacarídeos .......................................................... 27
3.4.1. Análise de açúcares neutros ..................................................................... 27
3.4.2. Análise de açúcares neutros – hidrólise redutiva....................................... 28
3.4.3. Análise de ácidos urónicos ....................................................................... 29
3.4.4. Determinação de ésteres de sulfato .......................................................... 29
3.4.5. Análise de ligações por metilação ............................................................. 30
xii
3.4.6. Dessulfatação .......................................................................................... 31
3.4.7. Redução de grupos carboxílicos ............................................................... 31
3.5. Determinação de proteína ............................................................................ 32
3.6. Determinação da quantidade de matéria inorgânica ..................................... 32
3.7. Análise Estatística ........................................................................................ 32
4. Resultados e Discussão ................................................................................................... 33
4.1. Crescimento celular ...................................................................................... 33
4.2. Composição material polimérico ................................................................... 37
4.3. Polissacarídeos extracelulares ..................................................................... 39
4.3.1. Composição dos polissacarídeos da fração solúvel .................................. 39
4.3.2. Composição dos polissacarídeos da biomassa ......................................... 41
4.4. Análise de ligações glicosídicas ................................................................... 43
4.5. Scale-up ....................................................................................................... 45
4.5.1. Crescimento celular .................................................................................. 45
4.5.2. Análise de Açúcares Totais ...................................................................... 46
5. Conclusões ...................................................................................................................... 49
6. Bibliografia ....................................................................................................................... 51
Anexos ................................................................................................................................... 57
Anexo I – Protocolo de determinação de nitratos ....................................................... 57
Anexo II – Curva de Calibração de Albumina de Soro de Bovino ................................ 59
Anexo III – Determinação do fator de resposta para a determinação dos açúcares
neutros ................................................................................................................................ 61
Anexo IV – Gráficos Tempo vs Nº de células ............................................................. 63
Anexo V – Tabela Metilação vs Redução dos Grupos Carboxílicos ............................ 65
Anexo VI – Procedimento para determinação de açúcares neutros e ácidos urónicos por
GC-FID ................................................................................................................................ 67
xiii
Índice de figuras
Figura 1 – Sistemas abertos de cultivo de microalgas:(a) raceways, (b) tanques circulares com
agitação e (c) sistema de cultivo em cascata (Early, 2012; Masojídek & Torzillo, 2008;
Sieg,2016). ............................................................................................................................... 5
Figura 2 – Exemplos de sistemas fechados de cultivo de microalgas: (a) fotobioreatores
tubulares, (b) planos e (c e d) colunas de bolhas (Masojídek & Torzillo, 2008; Rault, Al-Balushi,
Panwar, Vaidya, & Shinde, 2015). ............................................................................................. 6
Figura 3 – Estrutura da microalga Porphyridium cruentum (Gantt & Conti, 1965). ..................... 7
Figura 4 – Colónias de células da microalga P. cruentum. ........................................................ 7
Figura 5 –(a) Reatores tubulares em Israel no deserto Arava e (b) mangas de polietileno
(Leichman, 2016; “Supreme Biotechnologies,” 2016). ................................................................ 9
Figura 6 – Estruturas dos dois oligossacarídeos obtidos após tratamento do polissacarídeo da
Porphyridium sp. com lítio em etilenodiamina (Gloaguen et al., 2004)...................................... 13
Figura 7 – Estrutura da cadeia principal (m=2 ou 3) da fração ácida obtida a partir do
polissacarídeo da microalga Porphyridium sp. (R=H; sulfato; t-Xyl ou t-Gal) (Geresh et al., 2009).
............................................................................................................................................... 14
Figura 8 – Meio de cultura utilizado e comercializado pela empresa Necton, S.A. – Nutribloom.
............................................................................................................................................... 21
Figura 9 - Esquema da posição intercalada dos garrafões com diferentes salinidades. .......... 22
Figura 10 – Garrafões inoculados com Porphyridium cruentum em meios de diferentes
salinidades. ............................................................................................................................. 22
Figura 11 – (a) Parede de polietileno (“green-wall”) com capacidade de 800 L e (b) fotobioreator
tubular com capacidade de 15m3, Necton, Portugal. ................................................................ 23
Figura 12 – (a) Sistema de filtração sob vácuo e (b) filtro Whatmman com cultura de P. cruentum
. .............................................................................................................................................. 24
Figura 13 - Curva de Calibração Peso Secos vs Densidade ótica. .......................................... 24
Figura 14 – Esquema de contagem celular. ............................................................................ 25
Figura 15 - Curva de Calibração Densidade celular vs Densidade ótica. ................................. 25
Figura 16 – (a) Manga de diálise com biomassa, (b) sobrenadante obtido após diálise liofilizado
e (c) biomassa liofilizada. ........................................................................................................ 27
Figura 17 – (a) Sistema de Ultrafiltração e (b) sobrenadante ultrafiltrado liofilizado. ................ 27
Figura 18 – Crescimento celular representado em termos de peso seco (g/L) das amostras de
diferentes salinidades referentes ao ensaio 1. Os dados apresentados correspondem à média de
triplicados. .............................................................................................................................. 34
Figura 19 – Crescimento celular representado em termos de peso seco (g/L) das amostras de
diferentes salinidades referentes ao ensaio 2. Os dados apresentados correspondem à média de
triplicados. .............................................................................................................................. 34
Figura 20 – Representação gráfica do peso seco (g/L) ao longo do tempo de produção, nas
paredes de polietileno com capacidade de 800 L. ................................................................... 46
xiv
Figura I – Curva e calibração da albumina de soro de bovino (BSA)………………………...........59
Figura II – Crescimento celular representado em termos de Nº de células das amostras de
diferentes salinidades referentes ao ensaio 1. Os dados apresentados correspondem à média de
triplicados………………………………………………………………………………………………...63
Figura III - Crescimento celular representado em termos de Nº de células das amostras de
diferentes salinidades referentes ao ensaio 2. Os dados apresentados correspondem à média de
triplicados………………………………………………………………………………………………...63
Figura IV– Cromatograma obtido após análise da amostra EN 1-1 segundo o procedimento para
determinação de açúcares neutros e urónicos por GC-FID. (ST = padrão interno)……………..68
xv
Índice de tabelas
Tabela 1 – Número de células de P. cruentum presentes por mL de cultura, no início e ao fim de
24 dias de crescimento. Os dados apresentados representam a média de três réplicas. ......... 35
Tabela 2 – Taxa específica de crescimento (μ), tempo de duplicação (g) e resumo dos dados
obtidos na representação gráfica Ln (Nt) em função do tempo. ............................................... 36
Tabela 3 – Produtividade obtida no cultivo da microalga Porphyridium cruentum a diferentes
salinidades. Os valores apresentados representam a média de três réplicas. .......................... 37
Tabela 4 – Rendimento do sobrenadante obtido nas amostras do ensaio 1 e 2. Média dos
triplicados de cada ensaio. ...................................................................................................... 37
Tabela 5 - Composição do material polimérico de três amostras de diferentes salinidades,
nomeadamente, EN 2-3, EN2-4 e EN 2-8. ............................................................................... 38
Tabela 6 - Composição dos polissacarídeos das amostras produzidas a diferentes salinidades.
Os dados apresentados são a média dos triplicados de cada ensaio. ...................................... 39
Tabela 7 – Composição em monossacarídeos da fração solúvel das amostras de meio de cultura.
Média dos triplicados de cada ensaio. ..................................................................................... 40
Tabela 8 - Composição em monossacarídeos da biomassa. ................................................... 41
Tabela 9 – Análise de metilação e dessulfatação das amostras EN 2-3, EN 2-4 e EN 2-8. ...... 43
Tabela 10 – Composição em monossacarídeos da fração solúvel da amostra ENext. ............. 47
Tabela XI - Massa de açúcares totais por grama de amostra segundo a análise de açúcares por
método convencional e por hidrólise redutiva, diferença em percentagem destes valores. ....... 61
Tabela XII - Análise de metilação e redução de grupos carboxílicos das amostras EN 2-3, EN 2-
4 e EN 2-8. Valores apresentados em percentagem relativa.................................................... 65
xvii
Lista de Abreviaturas
ALR – reator airlift
BSA – Albumina de soro de bovino
DMSO - Dimetilsulfóxido
DO – Densidade ótica
DS – Dessulfatação
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
EN - Ensaio
EPS – Exopolissacarídeo
Gal - galactose
GC-MS – Cromatógrafia em fase gasosa com detetor de espectrometria de massa
GC-FID – Cromatógrafia em fase gasosa com detetor de ionização de chama
GlcA – Ácido glucurónico
GalA – Ácido Galacturónico
Glc – glucose
HFP – Promotor de fluxo helíaco
LiAlD4 – Deutério de alumínio e lítio
M - Metilação
Man – manose
MFF – m-Fenilfenol
MMB – Complexo borano-4-metilmorfolina
PrOH - Propanol
rpm – Rotações por minuto
RGC – Redução dos grupos carboxílicos
RMN - Ressonância Magnética Nuclear
TCA – Ácido tricloroacético
THF – Tetra-hidrofurano
TFA – Ácido trifluoroacético
Xyl – Xilose
1
1. Introdução
As microalgas são seres unicelulares com uma grande diversidade e que podem ser
encontradas em ambientes aquáticos de água salgada ou doce. Estas variam no seu tamanho,
desde alguns micrómetros até alguns milímetros (Venkatesan, Manivasagan, & Kim, 2015). O
interesse do cultivo e produção destes seres deve-se às suas características promissoras, como
serem uma fonte de compostos com propriedades biológicas, como péptidos, ácidos gordos,
carotenóides, esteróis, proteínas e polissacarídeos (Borowitzka, 1995; Venkatesan et al., 2015).
Nos dias de hoje, as microalgas são uma fonte importante no desenvolvimento de novas
e diferentes tecnologias. A evolução das espécies animais e vegetais em ecossistemas marinhos
permitiu a origem e desenvolvimento de uma extensa biblioteca de biomoléculas com grande
potencial para serem aplicadas e darem resposta às necessidades do ser humano (Silva et al.,
2012). As áreas de aplicação de biopolímeros produzidos por microalgas têm aumentado
constantemente podendo ser estes, atualmente, encontrados em segmentos de mercado muito
diversos. Biopolímeros como os polissacarídeos podem ser aplicados em diversos sectores, tais
como agricultura, pesca, indústria automóvel e electrónica, farmacêutica e medicinal, alimentar,
de embalamento e têxteis/fibras (Niaounakis, 2013).
A presente dissertação é o resultado de uma colaboração entre o Instituto Superior
Técnico, a Universidade de Aveiro e a empresa NECTON, S.A. A empresa NECTON, S.A. foi
fundada em 1997 por três estudantes da Universidade Católica do Porto que ambicionavam
produzir microalgas para serem introduzidas em protetores solares. Para tal os fundadores
precisavam de um local com as condições perfeitas para a produção das microalgas pelo que
decidiram estabelecer a empresa no Algarve, mais propriamente no Parque Natural da Ria
Formosa. Devido à localização escolhida rapidamente se aperceberam da possibilidade de criar
uma outra unidade de negócio, a produção de sal marinho tradicional. Atualmente a empresa
possui duas áreas de negócio, a de sal marinho tradicional e a de microalgas. Trata-se de uma
empresa dinâmica que aposta no desenvolvimento e na investigação tanto ao nível do cultivo de
microalgas como das suas aplicações. Os seus produtos são comercializados sob a marca
PhytoBloom e consistem em concentrados puros de microalga, cultivados segundo condições
fototróficas e em sistemas de produção fechados. Estes podem ser fornecidos sob a forma de
líquido, pasta ou pó.
Atualmente, na empresa NECTON S.A. é efetuada a produção da microalga Porphyridium
cruentum e é comercializada a biomassa recolhida após o processo de cultivo. No entanto, o
meio de cultura onde a alga cresce é descartado pois não é comercializado. Este trabalho foi
realizado com vista à valorização deste sub-produto obtido após a recolha da biomassa. Em
estudos anteriores, que verificaram a existência de compostos de alto valor comercial no meio
de cultura, nomeadamente polissacarídeos sulfatados, torna-se relevante a valorização deste
sub-produto. Os polissacarídeos sulfatados têm demonstrado atividade em diversos mecanismos
biológicos. As capacidades antioxidante, anti coagulante, antinflamatória e antitumoral permitem
que estas moléculas bioativas apresentem um grande potencial em aplicações médicas,
farmacêuticas e biotecnológicas. Desta forma, é do interesse da empresa perceber de que forma
2
se pode potenciar uma maior produção dos polissacarídeos com vista à sua extração a partir do
meio de cultura, para posterior comercialização.
O presente trabalho tem como objetivo principal o cultivo da microalga Porphyridium
cruentum em meios de cultura com três diferentes salinidades, de forma a determinar qual a
condição que incentiva o crescimento celular e a produção de polissacarídeos extracelulares.
Estes polissacarídeos foram caracterizados a nível estrutural para estudar a sua variabilidade
nas diferentes condições de crescimento.
.
3
2. Revisão Bibliográfica
As microalgas são microrganismos fotossintéticos, eucariontes e procariontes que
constituem a base e origem da cadeia alimentar. Estas são seres unicelulares que podem ser
encontradas em água salgada ou doce e, da mesma forma que as macroalgas, podem ser
agrupadas em seis grandes grupos, nomeadamente, Cyanophyta; Chlorophyta (verdes);
Euglenophyta; Chromophyta; Chrysophyta e Rhodophyta (vermelhas). As classes de microalgas
mais importantes em termos de abundância são as diatomáceas (Bacillariophycae) e as algas
douradas (Chrysophyceae), ambas inseridas na divisão Chrysophyta, e as algas verdes
(Chlorophyceae) que estão inseridas na divisão Chlorophyta. As cianobactérias ou as
designadas algas azul-verde (Cyanophyceae) também são consideradas microalgas, como é o
caso da Spirulina (Venkatesan et al., 2015).
Estes seres unicelulares possuem uma grande diversidade e tal pode ser comprovado
pela sua distribuição em toda a biosfera pois podem ser encontrados nos mais variados habitats.
Algumas das algas crescem em ambientes aquosos a poucos metros da superfície, outras em
ambientes remotos a centenas de metros da superfície, em areias do deserto, nas rochas e até
em terrenos com neve (J. Singh & Saxena, 2015).
Estes microrganismos são capazes de converter energia solar em energia química a partir
do processo de fotossíntese. O potencial deste processo para a produção de compostos de valor
acrescentado ou para uso energético tem sido reconhecido devido à utilização mais eficiente da
energia solar quando comparado com plantas superiores (Priyadarshani & Rath, 2012).
As microalgas foram usadas por populações indígenas durante séculos, sabe-se que os
chineses foram os primeiros a utilizá-las para sobreviver aos tempos de fome. Durante milhares
de anos microalgas como Nostoc, Arthrospira (Spirulina) e as espécies Aphanizomenon foram
utilizadas para a alimentação dos povos (Spolaore, Joannis-Cassan, Duran, & Isambert, 2006).
No entanto, a biotecnologia associada à produção de microalgas apenas se começou a
desenvolver a partir do século passado desde o reconhecimento das suas propriedades
nutricionais e biológicas com potencial económico.
Atualmente estima-se que existam cerca de 50 000 espécies de microalgas, no entanto
apenas têm sido estudadas e analisadas cerca de 30 000 (Ng, Ng, Shen, & Lee, 2015). As
espécies mais estudadas e comercializadas devido ao conteúdo em ácidos gordos
polinsaturados são as microalgas Isochrysis spp., Pavlova lutheri (Haptophycae), Phaeodactylum
tricornutum, Thalassiosira spp., Odontella autita (Bacillariophyceae), Crypthecodinium cohnii
(Dinophyceae) e Porphyridium cruentum (Rhodophyceae). São também extensivamente
comercializadas as espécies Dunaliella salina por ser uma fonte importante de β-caroteno, a
espécie Haematococcus pluvialis pelo interesse na comercialização de astaxantina e as
microalgas Chlorella e Spirulina pelos elevados teores em proteína. A microalga Nannochlorosis
é também bastante comercializada na indústria de aquacultura (Becker, 2004; Derner, Ohse,
Villela, Carvalho, & Fett, 2006).
4
2.1. Microalgas no sector industrial e comercial
Nos dias de hoje existem diversas aplicações comerciais para as microalgas pois desde o
século XX, com o aumento da população mundial e as previsões de insuficientes fontes de
proteína, tentou-se encontrar uma fonte alternativa desta. A biomassa das microalgas surge
assim como uma boa alternativa (Spolaore et al., 2006). Desde então estes microrganismos têm
despertado um grande interesse por parte dos investigadores e têm sido estudados
intensivamente devido à sua biomassa rica em nutrientes, ácidos gordos, como o ómega 3 e 6,
aminoácidos essenciais e caroteno (Sánchez Pérez, Rebolloso Fuentes, Acién Fernández, & Guil
Guerrero, 2000) que podem ser aplicados na alimentação animal e humana com o objetivo de
reforçar o conteúdo nutricional.
Um dos maiores mercados da biomassa das microalgas é a nutrição animal,
nomeadamente em aquacultura, na cultura de larvas de peixes ósseos, para consumo direto no
caso dos moluscos e camarões e indireto ao fornecer as microalgas através de artémias, rotíferos
e dáfnias (Priyadarshani & Rath, 2012; Pulz & Gross, 2004). Algumas microalgas são também
utilizadas como fonte de pigmentos naturais na cultura de camarões, peixes salmonídeos e
peixes ornamentais, como o peixe palhaço (Priyadarshani & Rath, 2012).
Dependendo da espécie e das condições de cultivo, que podem ser muito diferentes, sabe-
se que em média as microalgas (biomassa) contêm entre 30 a 40% de proteína, 10 a 20% de
lípidos e 5 a 15% de hidratos de carbono (Chauton, Reitan, Norsker, Tveteras, & Kleivdal, 2014).
Industrialmente, as microalgas também são utilizadas como biofertilizantes na agricultura
pelo facto de terem capacidade de fixar o azoto e produzirem vários compostos que promovem
o crescimento das plantas, como a vitamina B12. O seu potencial na produção de compostos
bioativos de valor acrescentado, como por exemplo a astanxatina, os ácidos gordos, os
polissacarídeos e o β-caroteno, que são difíceis de produzir a partir de síntese química, têm
especial interesse na indústria farmacêutica devido à sua atividade antimicrobiana, fungicida,
antiviral, entre outras (Borowitzka, 1995; Priyadarshani & Rath, 2012). A aplicação das
microalgas na cosmética tem recebido uma maior atenção nos últimos anos devido à sua
possível utilização na prevenção e protecção contra os raios UV e em tratamentos de problemas
de pele, como o envelhecimento e distúrbios na pigmentação. Algumas microalgas têm sido
utilizadas nas formulações cosméticas como agentes hidratantes e espessantes, no entanto a
utilização destas como principal ingrediente das formulações cosméticas ainda se encontra em
desenvolvimento (Wang, Chen, Huynh, & Chang, 2015).
O potencial comercial das microalgas depende atualmente, das investigações correntes
que têm como objetivo aumentar a produtividade e, adicionalmente melhorar as técnicas de
cultivo e custos operacionais. Um fator chave na economia deste tipo de indústria é a melhoria
na produção de determinados compostos com potencial de valorização, ou seja, biomoléculas
(Chauton et al., 2014).
A produção de moléculas de alto valor comercial permitiu um grande desenvolvimento da
biotecnologia associada, no entanto ainda existem algumas limitações na performance de
crescimento das microalgas em fotobioreactores industriais. Por esta razão, das milhares de
5
espécies que se acredita existirem, somente umas centenas são estudadas e apenas algumas
são cultivadas em quantidades industriais, como é o caso das microalgas Arthrospira, Chlorella,
Dunaliella salina, Aphanizomenon flos-aquae, Haematococcus pluvialis, Crypthecodinium cohnii
e da microalga Shizochytrium (Spolaore et al., 2006).
2.1.1 Sistemas de cultivo de microalgas
O interesse recorrente na biomassa das microalgas e os subprodutos de alto valor
comercial que estas possuem tem vindo a promover, cada vez mais, o aperfeiçoamento dos
sistemas de cultivo destas. Atualmente existem dois tipos de sistemas de cultivo para microalgas
fotoautotróficas: sistemas abertos e sistemas fechados.
Os sistemas abertos são os mais antigos e podem ser representados na forma de lagoas
naturais, tanques circulares, raceways e em cascata (i.e, sistemas com superfícies inclinadas)
(Figura 1). Todavia, este tipo de sistemas requer grandes áreas para a sua construção e não
permitem o controlo das condições de cultivo, como a temperatura, pelo que são adequados para
espécies com crescimentos rápidos (Masojídek & Torzillo, 2008). O cultivo de microalgas a partir
deste tipo de sistemas é tecnologicamente simples, no entanto não é necessariamente barato
devido aos grandes custos de processamento a jusante. Pois, por exemplo, no caso dos
raceways já foram anteriormente reportadas concentrações celulares de 0,5 g/L e produtividades
de 25 g m-2 d-1, no entanto os custos de produção da biomassa encontram-se entre oito e quinze
dólares por quilograma de peso seco. Estes valores são incrivelmente altos quando comparados
com o custo de outros produtos, como a farinha de soja (1$/kg), também vendida para a indústria
da aquacultura (Lee, 2001).
Figura 1 – Sistemas abertos de cultivo de microalgas:(a) raceways, (b) tanques circulares com agitação e (c) sistema de cultivo em cascata (Early, 2012; Masojídek & Torzillo, 2008; Sieg,2016).
(a) (b)
(c)
6
Com o objetivo de se atingir maiores produtividades e controlar as condições de
crecimento existiu a necessidade de desenvolver sistemas de cultivo fechados, sob a forma de
fotobioreatores tubulares, placas planas e colunas de bolhas (Figura 2) (Ugwu & Aoyagi, 2012).
Este tipo de bioreatores permite uma maior flexibilidade no controlo das condições de cultivo e,
também, a sua otimização de acordo com as características biológicas e fisiológicas das
espécies envolvidas. Os sistemas fechados possuem menor risco de contaminação e menores
perdas de dióxido de carbono, no entanto, o tipo de material com que são feitos pode reduzir a
penetração da luz solar (Masojídek & Torzillo, 2008). Estes sistemas têm também a vantagem
de não necessitarem de grandes áreas para a sua implementação e são, também, bastante
versáteis podendo ser colocados no interior com luz artificial ou no exterior com luz natural.
Contudo, o investimento na sua construção é elevado comparado com os sistemas abertos
(Gross, 2013).
Atualmente os sistemas de cultivo mais utilizados para produção de microalgas em larga
escala são efetivamente os sistemas fechados devido essencialmente às elevadas
produtividades que são atingidas.
Figura 2 – Exemplos de sistemas fechados de cultivo de microalgas: (a) fotobioreatores tubulares, (b) planos e (c e d) colunas de bolhas (Masojídek & Torzillo, 2008; Rault, Al-Balushi, Panwar, Vaidya, &
Shinde, 2015).
(a) (b)
(c) (d)
7
2.2. Porphyridium cruentum
A microalga Porphyridium cruentum é uma das formas unicelulares da filo Rodophyta.
Pode ser encontrada em água salgada ou em solos húmidos. Esta é caracterizada pela sua
forma esférica e diâmetro entre 4 e 6 μm (Dermoun, Chaumont, Thebault, & Dauta, 1992), centro
excêntrico, pelo enorme cloroplasto vermelho e pirenóide que se encontra na parte central
(Figura 3) (Gantt & Conti, 1965). As células da microalga podem encontrar-se sozinhas ou
reunidas em colónias irregulares unidas por uma mucilagem, constituída por polissacarídeos que
são excretados constantemente pelas células (Figura 4) (You & Barnett, 2004).
Figura 4 – Colónias de células da microalga P. cruentum.
Figura 3 – Estrutura da microalga Porphyridium cruentum (Gantt & Conti, 1965).
8
2.2.1. Interesse comercial
O interesse comercial na microalga Porphyridium tem vindo a crescer consideravelmente
pelo facto de esta ser uma fonte de diversos compostos com relevante valor nutricional e
biológico, como os carotenóides (zeaxantina e β-caroteno), ficobiliproteínas fluorescentes, ácidos
gordos polinsaturados de cadeia longa e polissacarídeos (J. Wang, Chen, Rao, Huang, & Li,
2007).
A coloração vermelha da P. cruentum deve-se à ficobiliproteína maioritária presente na
microalga, nomeadamente a ficoeritrina. Esta proteína desempenha um papel bastante
importante em conjunto com outras ficobiliproteínas, como um pigmento fotossintético (Safi,
Charton, Pignolet, Pontalier, & Vaca-Garcia, 2012). A importância destes pigmentos, tal como
dos carotenóides, tem vindo a crescer exponencialmente devido à necessidade da utilização de
pigmentos naturais e biológicos na indústria alimentar, cosmética e farmacêutica substituindo o
uso de pigmentos sintéticos. No entanto, as ficobiliproteínas possuem outras características,
como a fluorescência a comprimentos de onda conhecidos, pelo que podem ser aplicadas em
imunologia enquanto marcadores para fins de investigação (Carvalho, 2013).Os carotenóides
são o pigmento minoritário presente na microalga P. cruentum, apresentando em média um valor
igual a 102 mg/g peso seco (Sánchez Pérez et al., 2000). Os carotenóides têm aplicações como
aditivos na alimentação animal e em cosmética. O facto de possuírem a capacidade de actuar
como provitamina A, i.e. podem ser convertidos em vitamina A, aumenta o seu interesse e a sua
importância ao nível nutricional e terapêutico. Além disso, são conhecidas as propriedas anti-
inflamatórias intrínsecas destas moléculas (Spolaore et al., 2006).
A P. cruentum é rica em lípidos, nomeadamente ácidos gordos polinsaturados. O ácido
gordo maioritário presente é o ácido palmítico (1,6% m/m; 16:0), seguido do ácido araquidónico
(1,3% m/m; 20:4ω6), do ácido eicosapentaenóico (1,3% m/m; 20:5ω3) e finalmente do ácido
linoleico (0,4% m/m;18:2ω6). Têm sido reportados vários estudos que revelam os benefícios
destes ácidos gordos para a saúde como a redução do risco de doenças cardiovasculares,
diminuição dos níveis de colesterol (Dvir, Stark, Chayoth, Madar, & Arad, 2009) e também devido
à sua atividade antitumoral (Gardeva, Toshkova, Minkova, & Gigova, 2009). Estes estudos
suportam o potencial desta microalga vermelha como fonte de novos nutracêuticos.
O elevado teor em polissacarídeos, entre 60 e 80% (Percival & Foyle, 1979), produzido
pela microalga tem particular interesse pelo facto de serem polissacarídeos extracelulares, o que
facilita a sua extracção, e pelo facto de estes serem sulfatados, o que possibilita uma grande
variedade de aplicações devido às suas propriedades biológicas .
2.2.2. Condições ótimas de cultivo
O facto destas microalgas produzirem compostos com elevado interesse comercial é da
maior importância para o desenvolvimento indústrial um cultivo em larga escala mais económico
(Singh, Arad, & Richmond, 2000). A produção em larga escala de microalgas vermelhas,
principalmente a Porphyridium, tem sido realizada em diferentes sistemas de cultivo como
9
bioreatores tubulares sob determinadas condições, lagoas ao ar livre e mangas de polietileno
(Figura 5). Num estudo onde compararam o crescimento e a produção de polissacarídeos da
microalga Porphyridium cruentum e Porphyridium aerugineum em sistemas fechados de mangas
de polietileno e em lagoas abertas (open ponds), mostraram que ambas as espécies tiveram
entre 60 a 300% maior produção de biomassa nos sistemas fechados (Cohen & Arad, 1989).
Este aumento da produtividade deveu-se, provavelmente, a uma maior disponibilidade de luz, a
uma melhoria da turbulência, à diminuição da contaminação, à prevenção da evaporação e
consequentemente à estabilidade da salinidade do meio.
Num estudo onde comparam três fotobioreatores para o cultivo da microalga vermelha
Porphyridium sp., nomeadamente uma coluna de bolhas, um reator airlift (ALR) e um reator airlift
com promotor de fluxo helíaco (ALR-HFP), foi verificado que o reator ALR+HFP teve maior
performance em relação à produção de biomassa (Merchuk, Gluz & Mukmenev, 2000). Devido
à promoção de um fluxo dinâmico na coluna foi possível realizar a operação a fluxos de gás
inferiores o que diminui os custos e melhora a eficiência do CO2 absorvido. No entanto, outros
investigadores estudaram diferentes equipamentos e técnicas de cultivo tendo sido a mais
inovadora o sistema modular semelhante a um painel solar, com um fotodetector que permitia o
ajuste angular da superfície do vidro (Chaumont, 1993).
A otimização dos processos de cultivo é sempre necessária visto que as condições de
cultivo afetam a produção de biomassa da microalga Porphyridium, assim como a composição
dos EPS e a qualidade da ficoeritrina produzida (J. Wang et al., 2007). As condições de cultivo
mais relevantes são a intensidade da luz, o pH, a agitação e o arejamento, a salinidade, a taxa
de renovação dos volumes de cultura e os macronutrientes como o azoto e o fósforo (Razaghi,
Godhe, & Albers, 2014; J. Wang et al., 2007)
Figura 5 –(a) Reatores tubulares em Israel no deserto Arava e (b) mangas de polietileno (Leichman, 2016; “Supreme Biotechnologies,” 2016).
(a) (b)
10
2.2.3.Influência das condições de cultivo no crescimento
O crescimento das microalgas é principalmente afetado por fatores ambientais abióticos e
é também estimulado por compostos orgânicos biologicamente ativos, nomeadamente
vitaminas, ácidos nucléicos, matéria orgânica como extrato de solo e substâncias húmicas,
nomeadamente o ácido húmico e o ácido fúlvico (Ivanova, Kabaivanova, Petrov & Yankova,
2015). Com o objetivo de desenvolver um sistema economicamente viável para a produção de
biomassa é necessário alcançar maiores taxas de crescimento e produtividades, desta forma
alguns estudos sugerem condições ótimas de cultivo.
No caso específico da P. cruentum a temperatura ótima de crescimento encontra-se entre
os 21 e os 26 ℃. Foi reportado que a temperaturas inferiores a 13 ℃ o crescimento foi retardado
e inibido a temperaturas acima de 31 ℃ (Golueke & Oswald, 1962). A taxa de crescimento da
microalga também pode ser melhorada através do aumento da intensidade de luz, no entanto
acima do ponto de saturação o crescimento é inibido. A luz vermelha e azul são mais adequadas
que a luz branca para o crescimento de células e produção de polissacarídeos em água salgada
artificial (You & Barnett 2004). No entanto, segundo J. Wang et al. (2007) a alga deve encontrar-
se exposta constantemente a uma luz fluorescente com intensidades entre os 1 000 e os 5 000 𝑙𝑥,
num agitador recíproco a 90 𝑟𝑝𝑚 para um óptimo crescimento. Da mesma forma, as culturas
produzidas no estudo efetuado por Eteshola et al. (1998) foram continuamente iluminadas por
lâmpadas brancas fluorescentes com uma irradiação igual a 150 𝜇𝐸 𝑚−2𝑠−1 e o meio foi arejado
com ar esterilizado com 3% de 𝐶𝑂2.
Outros estudos sugerem que a utilização de extrato de solo no meio de cultura permite o
aumento do crescimento das algas e a produção de polissacarídeos (Golueke & Oswald, 1962;
Pulz & Gross, 2004). Dois dos compostos presentes no extrato de solo são a tiamina e os ácidos
húmicos e representam cerca de 30% do teor de carbono orgânico do solo, pelo que estes
parecem desempenhar um papel importante no crescimento das algas como constituintes
orgânicos (Ivanova et al., 2015).
O efeito da concentração de nitratos no crescimento celular também tem sido testado por
alguns investigadores. Um teste efetuado com diferentes concentrações de nitrato de sódio no
meio de cultivo (0,075; 0,3; 0,5 e 0,7 g/L) indicou um maior crescimento no meio com 0,075 g/L
de NaNO3 com uma taxa específica de crescimento igual a 0,22 dia-1, tendo-se verificado também
que a taxa específica mínima de crescimento (0,14 dia-1) foi obtida para o meio com 0,5 g
NaNO3/L. No meio de cultivo com 0,7 g/L de nitratos foi verificada uma taxa de crescimento igual
a 0,17 dia-1, maior que a taxa obtida num meio com 0,5 g/L de nitratos (Asgharpour, Rodgers, &
Hestekin, 2015). No mesmo estudo obteve-se maiores densidades celulares, nas culturas em
que foi fornecido CO2 puro em comparação com o fornecimento de 5% de CO2.
Diferentes estudos sobre o efeito do fornecimento de azoto no crescimento da microalga
e na produção dos polissacarídeos comprovaram que um deficiente fornecimento deste
composto inibe o crescimento e o processo de fotossíntese das microalgas. No entanto foi
verificado que apesar da inibição no crescimento a síntese de amido e de polissacarídeos
extracelulares continuou a ocorrer. O fornecimento de azoto afeta a distribuição dos
11
polissacarídeos, nomeadamente das frações solúveis e frações que se encontram ligadas à
célula, tendo-se verificado que a fracção de polissacarídeos ligada à célula é sempre muito maior
que a fracção solúvel. No caso de um deficiente fornecimento de azoto verificou-se que as
fracções eram muito pequenas e que a fração ligada á célula não aumentava ao longo da
experiência (Arad, Friedman, & Rotem, 1988). Por outro lado, o aumento considerável do nível
de azoto pode também causar a limitação de outros nutrientes, como o fósforo, as vitaminas e
os metais residuais, pelo que crescimento celular será negativamente afetado (Razaghi et al.,
2014).
Da mesma forma tem sido estudada a influência da concentração de dióxido de carbono
na produção de polissacarídeos sulfatados. Segundo Shi-yan, et al. (2000), o aumento da
concentração de 𝐶𝑂2 afeta a composição dos polissacarídeos sulfatados, verificando-se um
aumento na quantidade relativa de xilose e uma diminuição da quantidade de galactose. As
microalgas num ambiente com maior percentagem de 𝐶𝑂2 (5 %) produzem maior quantidade de
polissacarídeos ligados à célula e num ambiente com menores concentrações produzem mais
polissacarídeos solúveis.
Segundo Raposo et al. (2014) a microalga P. cruentum cultivada num meio de cultura
enriquecido com 0,021 M MgSO4 produz duas a três vezes mais polissacarídeos extracelulares.
No entanto, quando cultivada com um enriquecimento de 0,104 M MgSO4 produz
polissacarídeos com maior concentração em sulfato.
Os diversos estudos intensivos na optimização das condições óptimas de cultivo da
microalga Porphyridium cruentum têm particular interesse devido ao facto das condições de
crescimento influenciarem tanto a produção como também a composição dos polissacarídeos
extracelulares excretados pela microalga.
2.3. Polissacarídeos extracelulares
O potencial dos polissacarídeos tem vindo a ganhar uma importância crescente à
tendência global dos mercados trocarem os produtos sintéticos por naturais e ao aumento do
conhecimento das suas estruturas e funções (S. Arad & Levy-Ontman, 2010).
Os polissacarídeos representam a maior parte dos hidratos de carbono estruturais e de
reserva energética encontrados na natureza. Estes diferem em tamanho, complexidade
estrutural e composição em monossacarídeos, pelo que até aos dias de hoje já foram
identificados centenas de polissacarídeos diferentes (Davidson, 2014). Os polissacarídeos
produzidos por microrganismos podem ainda ser classificados segundo a sua localização na
célula pelo que são usualmente divididos em três grupos, polissacarídeos que fazem parte da
parede celular, polissacarídeos intracelulares, os quais são uma fonte de carbono e de energia
para a célula, e polissacarídeos extracelulares. Estes podem ainda dividir-se em dois outros
grupos, homopolissacarídeos, constituídos apenas por um tipo de resíduo de açúcar, e
heteropolissacarídeos, constituídos por mais do que um tipo de açúcar (Donot, Fontana, Baccou,
& Schorr-Galindo, 2012). A acumulação dos polissacarídeos extracelulares e a sua biossíntese
tem lugar após a fase exponencial de crescimento dos microrganismos.
12
Os exopolissacarídeos (EPS) são definidos como polissacarídeos extracelulares que
formam cápsulas à superfície das células ou são excretados para o meio extracelular na forma
de líquido viscoso amorfo (Sutherland, 1998). As células da microalga P. cruentum, assim como
as de todas as microalgas vermelhas, encontram-se encapsuladas por um polissacarídeo
amorfo, solúvel em água, polianiónico de elevado peso molecular (Ramus, 1972) que se dissolve
(fração solúvel) no meio de cultura durante o seu crescimento. No entanto, a maior parte dos
polissacarídeos (50 a 70%) permanecem agregados à célula (Arad & Levy-Ontman, 2010). A
espessura desta cápsula varia de acordo com a fase e condições de crescimento (You & Barnett,
2004). A nível molecular, nas microalgas vermelhas, os EPS’s proporcionam um mecanismo de
proteção: a estrutura de gel protege contra a dessecação, permite a estabilização da
temperatura, pH e salinidade e protege a célula das condições ambientais extremas (Arad &
Levy-Ontman, 2010).
Estes polissacarídeos extracelulares são constituídos por vários açúcares como xilose,
glucose, galactose, ácido glucurónico, metil hexoses e ésteres de sulfatado em diferentes
quantidades e proporções consoante as condições de crescimento (Chafman & Heaney-Kieras,
1976; Percival & Foyle, 1979; You & Barnett, 2004). Estes polímeros são carregados
negativamente devido à presença do ácido glucurónico e dos grupos sulfato que se encontram
ligados aos resíduos de glucose e galactose (Lapidot, Shrestha, Weinstein, & Arad, 2010). Os
polissacarídeos excretados pela microalga P. cruentum possuem um peso molecular elevado,
com valores descritos entre os 3 e 5 x 106 Da (Arad et al., 2006; Tannin-Spitz, Bergman, Van-
Moppes, Grossman, & Arad, 2005).
Uma das principais características dos exopolissacarídeos é o seu comportamento fluído
e dinâmico que tem particular interesse pelo facto de permitir obter soluções altamente viscosas,
com propriedades reológicas únicas, a partir de concentrações relativamente baixas do polímero
(Eteshola, Gottlieb, & Arad, 1996; Patel et al., 2013).
2.3.1 Estrutura dos polissacarídeos extracelulares
Devido à complexidade dos polissacarídeos presentes no meio, a informação que se
encontra disponível sobre a sua estrutura é bastante limitada. Alguns estudos de caracterização
dos exopolissacarídeos da P. cruentum revelaram a existência de resíduos de xilose e galactose
com ligação (1→4) e ramificações no C-3 da xilose e no C-3 e C-6 do resíduo de galactose. Os
resíduos de glucose e ácido glucurónico encontram-se ligados pela ligação (1→3) e verificou-se
ainda a existência de algumas ramificações no C-6 da glucose. Foi também reportada a
existência de D- e L-galactose, D-glucose, xilose, ácido D-glucurónico metilado no C-2 e ésteres
de sulfatos no polissacarídeo. Determinou-se, também, que os resíduos de glucose e galactose,
ácido urónico e cerca de metade dos de xilose também se encontravam ligados por uma ligação
(1→3) (Percival & Foyle, 1979). A partir do fracionamento de uma solução de polissacarídeos da
microalga Porphyridium sp. usando cromatografia de troca iónica e de exclusão molecular foi
13
reportada a existência de dois diferentes polissacarídeos que diferiam entre si na carga e na
composição em açúcares (S. Geresh, Lupescu, & Arad, 1992).
Os estudos efetuados por Gloaguen et al.(2004) demostraram a presença de dois
oligossacarídeos com ligações (1→4), (1→3) e (1→2,4)-Gal e (1→3)-Glc (Figura 6). Contudo,
neste estudo foi identificada a ligação (1→2)-Xyl e não a ligação e (1→3)-Xyl como anteriormente
reportado.
Figura 6 – Estruturas dos dois oligossacarídeos obtidos após tratamento do polissacarídeo da Porphyridium sp. com lítio em etilenodiamina (Gloaguen et al., 2004).
Estudos posteriores em polissacarídeos semelhantes, usando diferentes técnicas e
métodos de análise estrutural em combinação com espectrometria RMN, permitiram a obtenção
de novas informações. Através do isolamento e caracterização da fração ácida do polissacarídeo
(fração maioritária, ~96%) foi demonstrada a possibilidade da cadeia principal deste ser
constituída por uma sequência dos principais quatro monossacarídeos, xilose, glucose,
galactose e ácido glucurónico com ligações (1→4) ou (1→2)-Xyl, (1→3)-Gal, (1→3)-Glc e (1→3)-
GlcA. Ligado ao C-6 dos resíduos de glucose da cadeia principal encontravam-se os grupos
sulfato, terminais xilose e galactose (Figura 7) (Geresh et al., 2009).
14
Figura 7 – Estrutura da cadeia principal (m=2 ou 3) da fração ácida obtida a partir do polissacarídeo da microalga Porphyridium sp. (R=H; sulfato; t-Xyl ou t-Gal) (Geresh et al., 2009).
Segundo estudos realizados por Shrestha et al. (2004) existem várias proteínas ligadas
através de ligações não-covalentes aos polissacarídeos extracelulares da microalga
Porphyrdium. As proteínas mais predominantes são glicoproteínas com 66 kDa, estas consistem
num polipeptídeo com cerca de 58 kDa e uma fração de glicanos com aproximadamente 8 kDa.
Este estudo vem contrariar Heaney-Kieras et al. (1977) que tinha anteriormente reportado a
existência de ligação covalente entre a proteína e o polissacarídeo da parede celular da
microalga Porphyridium cruentum.
15
2.3.2 Extração de exopolissacarídeos
A produção comercial de microalgas tem aumentado ao longo dos anos, mas apenas a
biomassa destas é bastante popular. Sabe-se, no entanto que uma grande variedade de
microalgas excreta grandes quantidades de polissacarídeos para o meio de cultivo, pelo que este
passa a ter um valor comercial atrativo, ainda pouco explorado (Li et al., 2011). O primeiro passo
é efetivamente o estudo das técnicas mais eficientes para a extração e purificação destes EPS.
O método de extração de polissacarídeos usualmente utilizado é o método de precipitação
alcoólica. A adição de um álcool polar à amostra reduz a solubilidade relativa dos polissacarídeos
na água ao alterar a sua polaridade, pelo que estes precipitam na solução aquosa. Patel et al.,
(2013) precipitou EPS’s da microalga Porphyridium cruentum adicionando diferentes
concentrações e razões de álcoois (vol/vol), centrifugou, secou e avaliou a pureza destes
exopolissacarídeos através da quantificação dos açúcares totais. Estes investigadores obtiveram
melhores resultados na extração e purificação de EPS’s nos casos em que adicionaram 3
volumes de EtOH (90%, 80% e 75%), 2 volumes de PrOH (95%) ou 2 volumes de MeOH (99,5%).
Outros métodos de extracção, mais populares ao nível industrial, são os métodos de filtração
com membranas. Estas técnicas de filtração são mais adequadas visto poderem ser facilmente
automatizadas e permitirem o tratamento de grandes volumes. Contudo, este tipo de técnicas
tem de ser investigadas e projetadas com alguma atenção de forma a evitar a precoce
deterioração dos equipamentos devido a, por exemplo, incrustações (Patel et al., 2013). Um
estudo realizado por Li et al. (2011) demonstrou a viabilidade de isolar EPS’s em grande escala
usando um sistema acoplado de microfiltração e ultrafiltração por meio da otimização dos
parâmetros de operação através da eficiência alcançada no isolamento dos mesmos numa
escala piloto. Como o scale-up deste tipo de técnicas é praticamente linear, este estudo concluíu
que sendo rentável a concentração do extracto à escala piloto é viável e realístico o uso deste
sistema à escala industrial para o processamento do meio de culturas comerciais em massa.
Num estudo efetuado recentemente utilizaram membranas de ultrafiltração para numa primeira
fase separarem a biomassa do sobrenadante e numa segunda fase separarem os
polissacarídeos presentes no sobrenadante, utilizando uma membrana de ultrafiltração de 0,05
e 0,01 μm, respetivamente (Teknologi, Perairan, & Perikanan, 2016).
2.3.3 Potencial dos exopolissacarídeos sulfatados
Os polissacarídeos sulfatados podem encontrar-se na natureza numa grande variedade
de organismos como em mamíferos e invertebrados. No entanto, uma das fontes não-animal
mais importante deste material polimérico são as algas marinhas. Diferentes espécies têm
polissacarídeos sulfatados com estruturas únicas e diferentes com novas e potenciais atividades
biológicas. A atividade anticoagulante, antioxidante, anti tumoral, antiviral, anti proliferativa, anti-
inflamatória, anti séptica e anti adesiva são algumas das atividades farmacológicas mais
16
importantes dos polissacarídeos sulfatados provenientes de algas (Costa et al., 2010). Contudo,
nos dias de hoje os polissacarídeos provenientes de fontes marinhas continuam a ser um
território pouco explorado para o desenvolvimento de novos biomateriais (Silva et al., 2012).
Investigações que têm decorrido ao longo dos anos demonstram que uma parte dos EPS’s
produzidos pelas microalgas vermelhas são sulfatados. As propriedades de adsorção e as
características reológicas destes revelaram a possibilidade de poderem ser utilizados como
lubrificantes solúveis em água ou como bio lubrificantes (Arad et al., 2006; Arad & Levy-Ontman,
2010). Os polissacarídeos sulfatados da Porphyridium demonstraram ser bons biolubrificantes
alternativos visto ter sido comprovada a sua absorção e produção de camadas ultrafinas (à
escala nanométrica) de revestimento que podem sustentar a lubrificação e pelo facto de estes
possuírem uma resistência à degradação e estabilidade muito superior ao ácido hialurónico (Arad
et al., 2006).
Alguns estudos revelaram também as atividades antivirais contra várias viroses animais
(Huheihel, Ishanu, Tal, & Arad, 2002; Talyshinsky, Souprun, & Huleihel, 2002), propriedades anti-
inflamatórias, anti-irritantes (Matsui, Muizzuddin , Arad , 2003) e antioxidantes (Tannin-Spitz et
al., 2005) que fazem dos EPS sulfatados componentes adequados para uso em aplicações
dérmicas (Lapidot et al., 2010). Devido a estas propriedades biológicas, os açúcares sulfatados
têm sido introduzidos recentemente numa grande variedade de produtos cosméticos (S. Arad &
Levy-Ontman, 2010).
Sabe-se, ainda, que o conteúdo e a posição dos grupos sulfato nos EPS podem determinar
as características dos polissacarídeos, como por exemplo a propriedade antiviral. Como
reportado por Raposo et al. (2014) verificou-se uma maior atividade antiviral nas amostras com
maior grau de sulfatação. No entanto, continua por explicar o mecanismo de ação dos
polissacarídeos extracelulares da Porphyridium contra os diferentes tipos de vírus.
A atividade antioxidante dos polissacarídeos sulfatados depende das suas características
estruturais, nomeadamente do nível de sulfatação, da distribuição dos grupos sulfato ao longo
da cadeia principal do polímero, do peso molecular deste, da composição em açúcares e da sua
estereoquímica (Ngo & Kim, 2013). Sabe-se que são necessárias determinadas características
estruturais do polímero para a existência de atividades biológicas, pois por exemplo aglomerados
de sulfatos garantem interações entre o polissacarídeo e proteínas catiónicas da mesma forma
que também é importante o tamanho molecular da molécula (Costa et al., 2010).
Os polissacarídeos sulfatados possuem aplicações que os diferenciam de outros
polissacarídeos, estes possuem a capacidade de se ligar às proteínas com diferentes níveis de
especificação, e encontram-se normalmente envolvidos em interações de desenvolvimento, de
adesão, diferenciação e sinalização celular. Estes EPS’s são reconhecidos como moléculas
bioativas com grande potencial em aplicações farmacêuticas, médicas e biotecnológicas, tais
como biomateriais, regeneração de tecidos, estruturas 3D e até medicamentos (Senni et al.,
2011).
17
2.3.4 Viabilidade Económica
A produção de culturas de Porphyridium é uma fonte importante de substâncias químicas,
nomeadamente de polissacarídeos extracelulares, pelo que se torna importante o estudo do
potencial económico da extração destes. Num estudo pormenorizado devem ser tidos em conta
aspetos como o custo da produção da biomassa, custos de energia e custos de extração.
Segundo Vonshak, Cohen, & Richmond (1985), na produção à escala industrial obtém-se
entre 40 a 50 ton∙ha-1∙ano-1 de peso seco de Porphyridium, em que é possível a extração de 20
a 25 toneladas de polissacarídeos. Industrialmente sabe-se que é possível a extração de 15 a
55% do peso das microalgas sob a forma de polissacarídeos. Desta forma, admitindo um cenário
menos otimista em que apenas 15% dos polissacarídeos são extraídos, com um rendimento em
biomassa de 5 toneladas em peso seco por 0,1 hectares e admitindo elevados custos anuais de
produção (27.510€ por 0,1 hectares), o preço mínimo (break-even price) à qual os
polissacarídeos devem ser vendidos deve ser igual a 37€/Kg. Num cenário mais otimista, em que
se extraí cerca de 30% dos EPS’s e os custos anuais de produção são mais baixos (18.340€ por
0,1 hectares) o preço mínimo de venda é inferior a 14€/Kg. Sendo este último um preço modesto
para o custo real de polissacarídeos admite-se que os polissacarídeos provenientes de
microalgas têm um bom potencial económico (Hochman & Zilberman, 2014).
2.4. Produtos no mercado derivados de EPS de Porphyridium spp.
As soluções de EPS obtidas tendem a ser altamente viscosas a pequenas concentrações
do polímero. Estas soluções são estáveis numa grande variedade de temperaturas (30 a 120℃),
de pH (2-9) e a diferentes salinidades (Arad et al., 2006). Estes factos sugerem que a matriz de
polissacarídeos que se encontra à volta da célula protege-a das condições adversas do meio
exterior, funcionando também como uma barreira física contra ataques de bactérias, viroses e
fungos (Raposo et al., 2014). Por estas razões e pelas referidas na seção 2.3.3 os
polissacarídeos sulfatados produzidos pela microalga em estudo têm sido objeto de pesquisa
intensiva e são atualmente utilizados em diferentes aplicações, como por exemplo em
formulações cosméticas.
Nos dias de hoje, diversas algas marinhas têm sido introduzidas na cosmética devido ás
suas conhecidas capacidades terapêuticas, pelo que o interesse na introdução dos bioactivos
presentes na Porphyridium também tem vindo a crescer. A aplicação de algas encontra-se
atualmente bastante focada em tratamentos corporais através da aplicação cutânea (Carvalho,
2013).
A empresa FRUTAROM desenvolveu uma solução cosmética com a designação comercial
de AlguardTM, trata-se de um hidrogel composto por EPS’s da microalga Porphyridium com
propriedades biolubrificantes e de sensação sedosa que pode ser inserido em diferentes
formulações cosméticas. Este produto protege a pele contra irritações, contra a oxidação das
células e confere proteção solar. Previne, também a adesão microbiana à superfície da pele. A
18
formulação desenvolvida destina-se a anti-envelhecimento, proteção solar, anti-inflamações,
anti-irritações, produtos de lifting e a cuidados labiais (“Alguard,” 2012).
A formulação Densiskin D+ tem na sua composição quatro ingredientes inovadores sendo
um deles polissacarídeos e oligo-metais de alto peso molecular provenientes da microalga P.
cruentum. Estes atuam na junção dermo-epidérmica. Segundo a empresa a formulação pode ser
aplicada em composições cosméticas (géis, cremes e loções) numa dose entre 1 e 10% para
prevenção do envelhecimento da pele, e tratamentos na área dos olhos (“Technical Data Sheet
Densiskin D+,” 2015). Segundo a ficha técnica do produto, testes clínicos efetuados em 54
mulheres demonstraram que o uso de um creme-gel com Densiskin D+ 6%, duas vezes ao dia,
reduzia em 80% as rugas e aumentava em 85% a firmeza da pele (“Densiskin D+",2015).
O Silidine® é também um produto inovador no mercado e segundo a empresa é
caracterizado por ser um produto ativo marinho incomum, desenvolvido por indução metabólica
da microalga Porphyridium cruentum. A sua formulação contem apenas água e uma mistura de
pequenos oligossacarídeos e oligoelementos essenciais provenientes da P. cruentum. O produto
foi desenvolvido com vista a corrigir a síndrome de pernas pesadas e disfunções cutâneas como
a rosácea. Testes in vivo comprovaram que a aplicação duas vezes por dia de uma solução
líquida de Silidine® 3% diminui 26% da rosácea em 28 dias (teste efetuado em 14 voluntários)
(“Silidine-Phytobiactives”,2013).
No mercado existem também formulações que atuam como agentes hidratantes,
mantendo a pele hidratada por formação de uma película protetora sobre a superfície da pele.
Produtos como o Hydrintense aumentam o teor de água no estrato córneo (camada mais externa
da pele) em cerca de 61% e melhoram o micro-relevo da pele em 13% (“Hydrintense,” 2014).
Outras formulações como a LIFTONIN®-XPRESS atuam como fortalecedores da pele e por essa
razão são recomendados para produtos de lifting na forma de emulsões, géis ou loções.
19
2.5. Objetivos
O interesse comercial na produção de polissacarídeos sulfatados, com propriedades
biológicas bastante interessantes, tem aumentado devido à sua valorização por parte das
indústrias alimentar, cosmética e farmacêutica. O facto de a microalga Porphyridium cruentum
excretar estes polissacarídeos para o meio de cultivo permite uma fácil extração destes
compostos. Desta forma, torna-se bastante importante optimizar as condições que permitem uma
maior produção dos EPS por parte da microalga.
Assim, este trabalho tem como principal objectivo a produção à escala laboratorial da
microalga Porphyridium cruentum em diferentes meios de cultura, com a finalidade de estudar
se diferentes condições de crescimento interferem no crescimento celular e na produção de
polissacarídeos extracelulares. Como o teor e a composição dos polissacarídeos pode mudar de
acordo com as condições ambientais de cultivo, nomeadamente temperatura, pH, salinidade e
nutrientes, neste estudo aplicou-se uma dessas condições de stress, a salinidade.
Foram realizados dois ensaios de crescimento e foram escolhidas três diferentes
salinidades para o meio de cultivo, tendo sido cada uma delas estudada em triplicado. Segundo
Ucko et al. (1989) não existem diferenças significativas na densidade celular das células de
Porphyridium em meios com concentrações entre 0 e 0,92 M de NaCl. Desta forma, para o estudo
foi escolhida como salinidade controlo a salinidade da água da Ria Formosa, ou seja, 32 g/L
(0,46 M NaCl) e com o objetivo de perceber se existem diferenças significativas na produção de
exopolissacarídeos aplicou-se duas salinidades extremas, uma mais baixa (18 g/L - 0,31M NaCl)
e outra mais alta (50 g/L - 0,92M NaCl).
21
3. Material e Métodos
3.1. Produção da Microalga Porphyridium cruentum
A microalga Porphyridium cruentum foi obtida através da coleção de culturas de
microalgas da empresa Necton, S.A.
O meio de cultura utilizado foi formulado pela empresa Necton e tem a designação
comercial de Nutribloom (Figura 8). Este foi autoclavado e pasteurizado (121℃, 1 bar durante 40
minutos) e a sua concentração de nitratos foi mantida a uma concentração igual a 4 𝑚𝑀. A
composição do meio de cultura foi: 1,0 𝑚𝑀 𝑍𝑛𝐶𝑙2, 1,0 𝑚𝑀 𝑍𝑛𝑆𝐻4 ∙ 𝐻2𝑂, 1,0 𝑚𝑀 𝑀𝑛𝐶𝑙2 ∙ 4𝐻2𝑂,
0,1 𝑚𝑀 𝑁𝑎2𝑀𝑜𝑂4 ∙ 2𝐻2𝑂, 0,1 𝑚𝑀 𝐶𝑜𝐶𝑙2 ∙ 6𝐻2𝑂, 0,1 𝑚𝑀 𝐶𝑢𝑆𝑂4 ∙ 5𝐻2𝑂, 6,4 𝑚𝑀 𝐸𝐷𝑇𝐴 − 𝑁𝑎,
2,0 𝑚𝑀 𝑀𝑔𝑆𝑂4 ∙ 7𝐻2𝑂, 20,0 𝑚𝑀 𝐹𝑒𝐶𝑙3, 20,0 𝑚𝑀 𝐸𝐷𝑇𝐴 − 𝑁𝑎, 2,0 𝑚𝑀 𝑁𝑎𝑁𝑂3 e
100,0 𝑚𝑀 𝐾𝐻2𝑃𝑂4.
Figura 8 – Meio de cultura utilizado e comercializado pela empresa Necton, S.A. – Nutribloom.
A água salgada utilizada em cada meio de cultura com concentração média de 32 g
NaCl/L, proveio da Ria Formosa tendo sido sujeita a três processos de esterilização. A água foi
ultrafiltrada recorrendo a um equipamento de ultrafiltração JHuesa/Inge com poro igual a 0,2 μm,
foi de seguida sujeita a um tratamento com hipoclorito de sódio e foi posteriormente neutralizada
através do uso de tiossulfato de sódio. Finalmente, procedeu-se à esterilização da água por
autoclavagem, à temperatura de 121 ℃ e 1 𝑏𝑎𝑟 de pressão durante 40 min.
Os fotobioreactores escolhidos foram garrafões de 5 L por serem recipientes de fácil
manuseamento. Estes foram inoculados com uma taxa de inoculação de 25%, usando 0,5 L de
uma cultura-mãe, perfazendo assim um volume útil de 2,5 L.
As culturas foram mantidas em garrafões de 5 L, sujeitas a borbulhento de ar e luz solar
natural de forma a manter um fotoperíodo de 12:12 horas de luz:escuro. O crescimento das
culturas efetuou-se numa sala climatizada a 20-21 ℃.
22
O pH da cultura foi medido diariamente, sempre à mesma hora sendo o pH médio de todos
os inóculos igual a 9,2. O pH e a temperatura foram medidos usando um medidor de pH/℃, pH10
Pen.
Durante os ensaios, a evaporação causada pelo borbulhamento foi compensada com água
doce sempre esterilizada em autoclave (Uniclave 27), durante 40 minutos, a 121 ℃ de
temperatura e 1 𝑏𝑎𝑟 de pressão. O arejamento de cada garrafão foi ajustado a partir de válvulas
individuais.
Os garrafões foram colocados alinhados, junto a uma janela da sala climatizada.
Intercalou-se os garrafões de diferentes salinidades e diariamente era trocada a posição de cada
garrafão de forma a garantir que a posição, a incidência dos raios solares e outros fatores deste
tipo não influenciassem o estudo do crescimento das microalgas em diferentes salinidades
(Figura 9 e 10). O crescimento da microalga foi realizado em dois ensaios com três diferentes
salinidades, 18, 32 e 50 g NaCl/L. Para cada salinidade foi efetuada a produção da microalga em
três garrafões diferentes com crescimentos independentes, sendo estes considerados réplicas.
Figura 9 - Esquema da posição intercalada dos garrafões com diferentes salinidades.
Figura 10 – Garrafões inoculados com Porphyridium cruentum em meios de diferentes salinidades.
De forma a identificar as amostras no seguimento do trabalho apresentado será utilizada
a seguinte nomenclatura, EN ½ - X, em que EN 1/2 representa o ensaio 1 ou 2, respetivamente
e X o número do garrafão.
Posteriormente, fez-se um scale-up gradual da produção laboratorial para a produção à
escala industrial. Este ensaio (ENext) foi, numa primeira fase, realizado no exterior numa parede
18 g/L 32 g/L 50 g/L 18 g/L 32 g/L 50 g/L 18 g/L 32 g/L 50 g/L
1 2 3 4 5 6 7 8 9
23
de polietileno com capacidade de 800 litros durante 16 dias. Posteriormente, fez-se um novo
scale-up dos 0,8 m3 para os 15 m3. O meio de cultura utilizado no ensaio exterior foi o de
salinidade intermédia (32 g/L) (Figura 11).
Figura 11 – (a) Parede de polietileno (“green-wall”) com capacidade de 800 L e (b) fotobioreator tubular com capacidade de 15m3, Necton, Portugal.
3.2. Medição de parâmetros de crescimento
A evolução do crescimento das microalgas foi controlada através da medição da
densidade ótica, número de células e peso seco durante o período de ensaio, através de
amostragens diárias.
3.2.1. Densidade ótica
A densidade ótica (DO) corresponde à quantidade de luz absorvida por uma suspensão
de células e é usualmente utilizada como uma medida indireta, rápida e não destrutiva da
biomassa em culturas de bactérias ou outros microrganismos unicelulares. Esta pode ser
relacionada diretamente com o número de células e com o peso seco através da realização de
curvas de calibração (Griffiths et al., 2011).
A densidade ótica das amostras de cultura foi medida usando um espectrofotómetro
(SHIMADZU UV min 1240). As amostras foram agitadas de forma a distribuir as células
uniformemente. No caso em que o valor de densidade ótica era superior a 1 efetuou-se a diluição
adequada de forma a minimizar erros de medição. A leitura foi executada a um comprimento de
onda igual a 540 𝑛𝑚. A DO de cada cultura foi medida diariamente durante o período de
crescimento, tendo sido medido o valor de cada amostra três vezes e calculado o respetivo valor
médio.
(a) (b)
24
3.2.1. Determinação do Peso Seco
A determinação do peso seco permitiu avaliar a evolução da produção de biomassa
durante o tempo de cultivo. A sua determinação em amostras de culturas de microalgas foi
realizada filtrando 10 mL de cultura, devidamente homogeneizada num agitador vortex, num
sistema de filtração (Figura 12). Os filtros utilizados tinham um poro de 0,45 𝜇𝑚 (Whatmman) e
foram previamente lavados com água destilada e formato de amónio 0,5 𝑀, secos a 60 ℃ durante
4 h e pesados para determinar a sua massa. Após filtração, os filtros foram colocados na estufa
a 60 ℃. Foram realizadas pesagens após 48 e 72 h até que dois pesos consecutivos fossem
iguais.
O cálculo do peso seco (g/L) foi efetuado a partir da equação (1), em que 𝑚𝑖 corresponde
à massa do filtro lavado e 𝑚𝑓 à massa dos filtros com cultura:
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑆𝑒𝑐𝑜 = 𝑚𝑓−𝑚𝑖
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 (1)
Medida a DO das amostras e determinado o peso seco correspondente foi possível a
determinação da curva de calibração peso seco vs DO (Figura 13).
Figura 12 – (a) Sistema de filtração sob vácuo e (b) filtro Whatmman com cultura de P. cruentum .
(a) (b)
y = 1,8934x + 0,1383R² = 0,9935
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
DO
(5
40 nm
)
Peso Seco (g/L)
Figura 13 - Curva de Calibração Peso Secos vs Densidade ótica.
25
3.2.2. Contagem de células
A contagem de células foi efetuada através de um microscópio óptico utilizando uma
câmara de Neubauer espelhada com duas grelhas de contagem, profundidade igual a 0,100 mm
e volume de 0,1 mL.
Após fixada a lamela na câmara, colocou-se a amostra a ser analisada, com uma
micropipeta, entre a câmara e a lamela de forma a que fosse preenchido todo o volume da
câmara. Para tal, colocou-se a amostra suficientemente perto da lamela e esta foi arrastada por
capilaridade. De seguida, colocou-se a câmara no microscópio ótico e com a objetiva de 40X foi
possível a contagem do número de células. Devido ao tamanho das células e à sua densidade
foi escolhido o quadrante central para a contagem das células. De forma a uniformizar as
quantificações, as células que se encontravamm em cima dos limites direito e inferior não foram
contabilizadas e as que se encontravam em cima dos limites esquerdo e superior foram. O
sentido da contagem encontra-se representado na Figura 14.
Com o objetivo de construir a curva de calibração Número de Células vs Densidade ótica
(Figura 15), ao longo do crescimento foram recolhidas amostras com diferentes densidades
óticas. Para cada DO foram realizadas 8 contagens e determinada a média, de forma a aumentar
o nível de confiança e minimizar a margem de erro na contagem.
Figura 14 – Esquema de contagem celular.
O cálculo do número de células por mililitro foi determinado segundo a equação 2, em que o fator
de diluição apenas é considerado quando esta é efetuada:
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 = 𝑁º 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 × 1 × 104 × 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 (2)
y = 3E-07x + 0,0677R² = 0,9806
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
0,00E+00 2,00E+06 4,00E+06 6,00E+06
DO
(5
40 nm
)
Densidade celular (cel/ml)
Figura 15 - Curva de Calibração Densidade celular vs Densidade ótica.
26
3.3. Extração de exopolissacarídeos
A biomassa e o meio de cultura foram separados através de uma centrifugadora THERMO
(IEC CL40) a 4500 rpm durante 10 minutos. O meio de cultura é rico em EPS e para a sua
obtenção realizou-se uma segunda centrifugação nas mesmas condições que anteriormente.
Com o objetivo de estabilizar o meio de cultura ferveu-se a solução durante 30 minutos e efetuou-
se uma nova centrifugação de forma a remover possíveis resíduos de células e obter apenas o
material solúvel.
A extração de exopolissacarídeos foi realizada através da adaptação de protocolos
propostos por Patel et al. (2013). O sobrenadante obtido foi sujeito a um processo sequencial de
ultrafiltração, à temperatura ambiente, com uma unidade de ultrafiltração MILLIPORE Labscale
TFF System (Figura 17). As membranas de ultrafiltração utilizadas são de celulose regenerada
com fracionamento do peso molecular (MWCO) de 10 kDa e uma área de filtração igual a 50
cm2.
O sobrenadante foi numa primeira fase introduzido no tanque de alimentação e posteriormente
bombeado até à membrana. A fração de permeado foi recolhida e a fração de concentrado foi
reciclada para o tanque de alimentação. Quando o volume do concentrado, no tanque de
alimentação, atingiu cerca de 50 mL foi adicionada água destilada de forma a perfazer um volume
igual a 400 mL. Este procedimento foi realizado diversas vezes até a condutividade elétrica do
permeado ter um valor igual ou inferior a 4,0 𝜇𝑆. 𝑐𝑚−1. Os concentrados obtidos de cada amostra
foram posteriormente congelados e liofilizados num liofilizador VirTis Benchtop “K” series.
A biomassa obtida após a centrifugação das culturas foi dialisada contra água destilada,
utilizando-se mangas de diálise (Medicell, 12-14 kDa) para eliminar o material de baixo peso
molecular. As diálises foram realizadas em recipientes com capacidade de 10L, tendo sido
trocada a água duas vezes por dia. O processo de diálise terminou quando a condutividade do
dialisado e da água destilada se igualaram. O equilíbrio das amostras de biomassa foi atingido
após 7 dias. O dialisado foi depois concentrado através de um evaporador rotativo, sujeito a um
processo de centrifugação, sendo de seguida individualmente congelada e liofilizada a biomassa
e o sobrenadante (Figura 16).
(a) (b)
(c)
27
Figura 16 – (a) Manga de diálise com biomassa, (b) sobrenadante obtido após diálise liofilizado e (c) biomassa liofilizada.
Figura 17 – (a) Sistema de Ultrafiltração e (b) sobrenadante ultrafiltrado liofilizado.
3.4. Análise estrutural dos polissacarídeos
3.4.1. Análise de açúcares neutros
A determinação dos açúcares neutros foi realizada segundo o protocolo proposto por
Coimbra et al. (1994). Primeiramente foi realizada uma pré-hidrolise em que se adicionou 200 μL
de 𝐻2𝑆𝑂4 72% a tubos de cultura (10 mL), contendo cerca de 1-2 mg de amostra. Os tubos foram
colocados à temperatura ambiente durante 3 h e agitados entre 2 a 3 vezes, no vortex. De forma
a efetuar-se a hidrólise das amostras foram adicionados 2,2 mL de água destilada para se obter
uma concentração final de 𝐻2𝑆𝑂4 1 M. Os tubos foram, posteriormente, colocados num bloco de
aquecimento a 100 ℃ durante 2,5 h. Após uma hora, os tubos foram colocados num banho de
água e foram retirados 0,5 mL de hidrolisado para a análise de ácidos urónicos. A hidrólise
continuou durante mais 1,5 h e arrefeceu-se, de seguida, os tubos num banho de água.
A cada tubo foram adicionados 200 μL de padrão interno (2-desoxiglucose 2 mg/mL) e foi
transferido 1 mL de amostra hidrolisada para novos tubos de cultura. De seguida, foram
adicionados 200 μL de 𝑁𝐻3 a 25% com o objetivo de neutralizar as amostras. Posteriormente,
as amostras foram reduzidas com 𝑁𝑎𝐵𝐻4 (15% (m/v) em 𝑁𝐻3 3 M) e colocadas num bloco de
aquecimento a 30℃ durante 1 h. De forma a eliminar o excesso de 𝐵𝐻4− arrefeceu-se os tubos
num banho de gelo e adicionou-se duas vezes 50 μL de ácido acético glacial.
Em seguida efetuou-se a acetilação das amostras, transferiu-se 300 μL para tubos
”sovirel”, colocou-se os tubos num banho de gelo e adicionou-se 450 μL de 1-metilimidazol e 3
mL de anidrido acético. Agitou-se bem e colocou-se os tubos, a incubar, num bloco de
aquecimento a 30℃ durante 1 h. Posteriormente, num banho de gelo foram adicionados 3 mL de
água destilada, de forma a decompor o excesso de anidrido acético, e 2,5 mL de diclorometano.
Agitou-se muito bem para extrair os acetatos de alditol e colocou-se a centrifugar cerca de 30
segundos a 3000 rpm numa centrifuga (KUBOTA 2010). Separadas as duas fases, aspirou-se a
(a) (b)
28
fase aquosa por sucção e voltou a repetir-se o mesmo procedimento. De seguida, foram
adicionados 3 mL de água destilada de forma a lavar a fase orgânica, agitou-se, colocou-se a
centrifugar e removeu-se, novamente, a fase aquosa. Repetiu-se a lavagem com água destilada
e ao aspirar a fase aquosa certificou-se que não existia mais fase aquosa na parede dos tubos.
A fase orgânica foi transferida para tubos próprios e foram colocados no evaporador
rotativo sob vácuo até à secura. De seguida, adicionou-se 1 mL de acetona anidra que foi
seguidamente evaporada.
Os acetatos de alditol foram dissolvidos em 50 μL de acetona anidra para serem injetados
no cromatógrafo em fase gasosa com detetor de ionização de chama (GC-FID) (Perkin Elmer –
Clarus 400) equipado com uma coluna capilar DB-225 (30 m de comprimento, 0,25 mm de
diâmetro e 0,15 μm de espessura). A temperatura do injetor era igual a 220 ℃ e a do detetor
igual a 230 ℃. O programa de temperaturas teve a duração total de 9 min, sendo a temperatura
inicial igual a 200 ℃, aumentando até 220 ℃ a 40 ℃/𝑚𝑖𝑛, mantendo-se esta temperatura durante
7 min. Segue-se um aumento da temperatura até 230 ℃ a 20 ℃/𝑚𝑖𝑛, durante 1 min. O gás de
araste utilizado foi o hidrogénio (𝐻2) com um fluxo de 1,7 mL/min e a uma pressão igual a 17 psi.
A análise de açúcares neutros foi realizada em duplicado. Os açúcares foram
identificados no cromatograma, pelo tempo de retenção por comparação com padrões.
3.4.2. Análise de açúcares neutros – hidrólise redutiva
O método de análise de açúcares neutros recorrendo a uma hidrólise redutiva tem a
vantagem de se efetuar a hidrólise e redução dos polissacarídeos ao mesmo tempo, desta forma
minimiza-se a degradação da amostra e torna-se assim possível identificar resíduos de
monossacarídeos lábeis na hidrólise ácida. A presente análise foi realizada em seis amostras
dos extractos de EPS obtidos segundo descrito na secção 3.3, de três salinidades diferentes e
dos dois ensaios realizados.
Os resultados obtidos na determinação da quantidade de açúcares em cada amostra,
segundo o método descrito na secção 3.4.1, revelaram estar subvalorizados. Por essa razão
efetuou-se a análise de açúcares neutros por hidrólise redutiva, tendo sido verificado que a
quantidade de açúcares neutros era superior à obtida pela análise efetuada anteriormente
(secção 3.4.1). Desta forma, como a análise por hidrólise redutiva apenas foi aplicada a seis
amostras determinou-se a diferença entre os resultados obtidos pelas duas análises e calculou-
se um fator de resposta médio, sendo este igual a 2. Todos os resultados apresentados de
seguida terão em conta o fator determinado (Anexo III).
O método de hidrólise redutiva foi efetuado segundo o protocolo proposto por Stevenson
& Furneaux (1991). A amostra foi pesada, cerca de 1 mg, para tubos e adicionou-se 50 μL de
uma solução de complexo borano-4-metilmorfolina(80 mg/mL) e 200 μL de TFA 3 M. Os tubos
foram colocados num bloco de aquecimento durante 5 min a 80℃. De seguida, foram arrefecidos
até à temperatura ambiente e adicionou-se 50 μL da solução de MMB (80 mg/mL).
Posteriormente, colocou-se novamente os tubos num bloco de aquecimento a 120℃ durante 1h,
arrefeceu-se até à temperatura ambiente, adicionou-se 100 μL de MMB e 100 μL de padrão
29
interno (2-desoxiglucose 1 mg/mL) e colocou-se todas as amostras no evaporador rotativo sob
vácuo até que todo o TFA presente fosse removido, ou seja, até à secura. O resíduo resultante
foi depois dissolvido em 100 μL de ácido acético glacial. As amostras foram acetiladas e
analisadas por GC-FID, como descrito na secção 3.4.1.
3.4.3. Análise de ácidos urónicos
A análise de ácidos urónicos foi realizada segundo um método colorimétrico descrito por
Coimbra et al. (1994). A 0,5 mL de amostra hidrolisada, obtida anteriormente pela hidrólise
efetuada na análise de açúcares neutros (secção 3.4.1.), adicionou-se 3 mL de água destilada e
foram preparados 4 tubos para cada amostra (1 branco e 3 réplicas) com 0,5 mL de amostra.
Para a determinação de ácidos urónicos foi necessária a preparação de padrões com
diferentes concentrações de forma a construir uma curva de calibração. Foi preparada uma
solução padrão de ácido galacturónico (200 μg/mL) e preparados padrões com concentrações
de 0, 20, 40, 60 e 80 μg/mL deste. Para cada um dos padrões foram preparados 3 tubos (1
branco e 2 réplicas) com 0,5 mL da respetiva solução.
Posteriormente, todos os tubos contendo os padrões e as amostras foram colocados num
banho de gelo e foram adicionados 3 mL de borato de sódio 50 mM preparado com ácido sulfúrico
concentrado. Todos os tubos foram agitados muito bem, tapados com folha de alumínio e
colocados num banho a 100℃ durante 10 minutos. Após arrefecimento dos tubos num banho de
gelo foram adicionados, no escuro, 100 μL de m-fenilfenol (MFF) 0,15% (m/v) em NaOH 0,5%
(m/v) a 3 dos 4 tubos de cada amostra. Agitou-se muito bem todos os tubos até ao aparecimento
de cor e foram colocados no escuro a reagir durante 30 minutos. Por último, agitou-se,
novamente, todos os tubos de forma a homogeneizar a solução e a absorvância foi lida a 520
𝑛𝑚 num leitor de microplacas (BioTek EON).
Todas as análises aos ácidos urónicos foram realizadas em duplicado.
3.4.4. Determinação de ésteres de sulfato
A determinação da concentração de ésteres de sulfato em cada amostra foi realizada
segundo um método turbidimétrico proposto por Dodgson e Price (1962). Numa primeira fase foi
necessária a preparação do reagente gelatina – cloreto de bário, este foi preparado através da
dissolução de 1 g de gelatina em 200 mL de água quente (60-70 ℃), seguindo-se um período de
repouso mínimo de 6 horas a 4 ℃. Posteriormente, a solução de gelatina foi dividida em 2 partes
iguais (100 mL) e a uma das partes foi adicionado 0,5 g de cloreto de bário. Estas soluções
permaneceram em repouso 2 a 3 horas.
Com o objetivo de hidrolisar os ésteres de sulfato, pesou-se cerca de 4 mg de cada
amostra e estas foram dissolvidas em 1 mL de HCl 1 M. Posteriormente, as amostras foram
colocadas num bloco de aquecimento a 105 - 110 ℃ durante 5 horas. Após arrefecerem
transferiu-se 0,2 mL da amostra hidrolisada, em triplicado, para tubos de cultura contendo 3,8
mL de ácido tricloroacético (TCA) 3% (m/v). A dois dos tubos preparados para cada amostra
30
adicionou-se 1 mL do reagente gelatina – cloreto de bário e ao tubo restante adicionou-se 1 mL
da solução de gelatina sem adição de cloreto de bário. Foram também preparados os respetivos
brancos nos quais se substituiu a adição de 0,2 mL de amostra por água destilada. De seguida,
agitou-se os tubos e leu-se a absorvância a 360 𝑛𝑚 num leitor de microplacas (BioTek EON) .
Uma curva de calibração de 𝑲𝟐𝑺𝑶𝟒, foi construída contendo entre 20 μg e 200 μg do ião 𝑺𝑶𝟒−𝟐.
A absorvância obtida com as soluções que continham gelatina sem a adição de cloreto de bário
foi subtraída à absorvância das soluções com o reagente gelatina – cloreto de bário.
3.4.5. Análise de ligações por metilação
A análise do tipo de ligação entre os monossacarídeos presentes na amostra foi realizada
por metilação. No procedimento descrito de seguida os resíduos após serem metilados são
hidrolisados e os monossacarídeos parcialmente metilados são posteriormente reduzidos e
acetilados (Harris, Henry, Blakeney & Stone, 1984).
A amostra foi seca sob vácuo na presença de 𝑃2𝑂5. Pesou-se entre 1 a 2 mg , adicionou-
se 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e deixou-se em agitação durante a noite de forma a garantir
a dissolução completa da amostra. Foram adicionados cerca de 40 mg de NaOH, anteriormente
triturado num almofariz sob atmosfera de árgon, e deixou-se a agitar durante 30 min à
temperatura ambiente. De seguida adicionou-se 80 μL de iodeto de metilo (𝐶𝐻3𝐼) e deixou-se a
reagir durante 20 min com agitação vigorosa. Este passo foi repetido duas vezes pelo que
existiram dois períodos de reação de 20 min. A amostra foi dissolvida em 3 mL de uma solução
de 𝐶𝐻𝐶𝐻3: 𝑀𝑒𝑂𝐻 (1:1, v/v) e foi de seguida dialisada contra uma solução de 50% de 𝐸𝑡𝑂𝐻. Após
trocada a solução 3 vezes concentrou-se as amostras dialisadas até à secura num evaporador
rotativo sob vácuo. Dissolveu-se a amostra em 1 mL de DMSO e repetiu-se o processo de
metilação como descrito anteriormente.
Após o processo de metilação seguiu-se o processo de hidrólise em que se adicionou a
cada amostra 500 μL de TFA 2 M e deixou-se incubar durante 1 h a 121 ℃. Posteriormente, o
TFA foi evaporado num evaporador rotativo sob vácuo.
Os monossacarídeos foram reduzidos e acetilados como descrito na secção 3.4.1. A
redução foi realizada por adição de 300 μL de 𝑁𝐻3 2 M e 20 mg de 𝑁𝑎𝐵𝐷4 e deixou-se reagir
durante 1 h a 30℃. Os tubos foram arrefecidos num banho de gelo e por duas vezes foram
adicionados 50 μL de ácido acético glacial.
Após efetuado todo o procedimento cada amostra foi dissolvida em 50 μL de acetona
anidra e foram injetados 2 μL num cromatógrafo em fase gasosa com um detetor de
espectrometria de massa (GC-MS) (Agilent Technoloies 6890N Network) equipado com uma
coluna capilar DB-1 (30 m de comprimento, 0,15 mm diâmetro e 0,15 μm de espessura). A
temperatura inicial do forno do GC foi de 50 ℃, aumentando até 140 ℃ a um ritmo de 8 ℃/min.
Esta temperatura foi mantida durante 5 min, sendo de seguida aumentada até 200 ℃ a 0,5℃/min,
seguindo-se novo aumento até 250 ℃ a 40 ℃/min, mantendo esta última temperatura durante 5
min.
31
A espectrometria de massa consiste numa técnica analítica que permite detetar e identificar
moléculas de interesse recorrendo à massa e à caracterização da estrutura química dessas
mesmas moléculas. A identificação dos iões fragmentados no espectro de massa permite obter
informação sobre a composição em monossacarídeos e informação relativamente quanto ao
padrão de ramificação. Esta identificação foi realizada comparando os espectros obtidos com os
espectros da base de dados CCRC (York, 2016).
3.4.6. Dessulfatação
De forma a determinar os locais de ligação dos ésteres de sulfato no polissacarídeo em
estudo foi realizada uma dessulfatação da amostra. O procedimento utilizado foi o descrito por
Miller et al. (1998). A 10 mg da amostra foi adicionado 1,8 mL de DMSO, 0,1 mL de piridina, 13
mg de ácido piromelítico, 12 mg de fluoreto de sódio e novamente 0,2 mL de piridina.
Posteriormente, colocou-se a amostra no bloco de aquecimento a 120 ℃ durante 3 h e deixou-
se arrefecer até à temperatura ambiente. De seguida, adicionou-se 1 mL de hidrogenocarbonato
de sódio 3%. Dialisou-se a solução contra água destilada com manga de diálise de 12-14 kDa,
sendo de seguida liofilizada com o objetivo de obter os polissacarídeos dessulfatados.
As amostras dessulfatadas foram de seguida metiladas segundo o procedimento descrito
na secção 3.4.5.
3.4.7. Redução de grupos carboxílicos
A determinação das ligações dos ácidos urónicos presentes no polissacarídeo foi efetuada
por redução dos grupos carboxílicos a álcoois. Procedeu-se numa primeira fase à metilação das
amostras, segundo o procedimento descrito na secção 3.4.5. De seguida, colocaram-se as
amostras a secar sob vácuo na presença de 𝑃2𝑂5 por um período superior a 2 h. Adicionou-se a
cada tubo, em atmosfera de árgon, cerca de 20 mg de 𝐿𝑖𝐴𝑙𝐷4 e 1 mL de tetra-hidrofurano (THF)
seco. As amostras foram depois colocadas a reagir durante 4 h a 65℃. De forma a destruir o
excesso de 𝐿𝑖𝐴𝑙𝐷4 foram adicionadas 2 a 3 gotas de etanol e posteriormente 2 a 3 gotas de água
destilada. Com o objetivo de neutralizar a solução foi adicionada uma solução de 𝐻3𝑃𝑂3 2 M.
De seguida foi adicionado a cada amostra 2 mL de uma mistura de solventes 𝐶𝐻𝐶𝑙3: 𝑀𝑒𝑂𝐻
(2:1, v/v), removeu-se o precipitado formado através de centrifugação e lavou-se por mais duas
vezes com 2 mL da mesma solução. Os sobrenadantes obtidos de cada centrifugação foram
colocados em novos tubos e levou-se a concentrar no evaporador rotativo sob vácuo.
Posteriormente procedeu-se à hidrólise, redução e acetilação como descrito no procedimento na
secção 3.4.1.
32
3.5. Determinação de proteína
A quantidade de proteína foi determinada pelo método colorimétrico do ácido bicinconínico
(BCA) através do kit da Sigma-Aldrich (BCA1-1KT). A 50 μL de cada amostra foi adicionado 1
mL de BCA. A mistura foi posteriormente homogeneizada e incubada a 60 ℃ durante 15 min.
Após 30 min à temperatura ambiente foi lida a absorvância a 562 𝑛𝑚 num leitor de placas (BioTek
EON). A proteína solúvel presente foi estimada com base numa curva de calibração (Anexo II)
construída usando albumina de soro bovino (BSA) como padrão com concentrações entre 200 e
1000 μg/mL. Todas as determinações foram realizadas em duplicado.
3.6. Determinação da quantidade de matéria inorgânica
A quantidade de matéria inorgânica presente no material polimérico foi determinada por
uma análise de termogravimetria, onde se determinou a quantidade de cinzas. A análise foi
realizada numa balança termogravimétrica (Setsys Evolution 1750 Setaram) com sensor tipo S.
Foram pesadas cerca de 6 mg de amostra e estas foram aquecidas até aos 900 ℃ a uma taxa
constante de 15 ℃/min. O gás de purga utilizado foi oxigénio com um fluxo de 200 mL/min. A
massa que permaneceu no final da análise, após a combustão, corresponde à quantidade de
matéria inorgânica presente na amostra.
3.7. Análise Estatística
A análise estatística foi efetuada com recurso ao software GraphPad Prism 7.01, tendo
sido utilizados os testes One-way anova e t-test Os testes estatísticos foram realizados às
amostras de diferentes salinidades dos dois ensaios quanto ao crescimento celular,
nomeadamente valores de peso seco e produtividade, e em relação ao conteúdo em material
polimérico e açúcares totais.
33
4. Resultados e Discussão
4.1. Crescimento celular
O crescimento das culturas foi efetuado em dois ensaios com uma duração de 24 dias
cada um. Os ensaios foram realizados consecutivamente, razão pela qual as condições
climatéricas como a temperatura, humidade e horas de luz varia entre ensaios. Em cada ensaio
foi inoculada a microalga Porphyridium cruentum em meios de cultivo com três diferentes
salinidades, 18, 32 e 50 g NaCl/L. O crescimento da microalga em cada ensaio para cada
salinidade foi efetuado em três garrafões diferentes com crescimentos independentes, sendo
considerados réplicas. Desta forma, com o objetivo de obter o crescimento da microalga em cada
salinidade testada admitiu-se que os 3 crescimentos independentes para cada salinidade em
cada ensaio eram réplicas, sendo os valores apresentados uma média dos três crescimentos.
A evolução do crescimento das microalgas foi controlada através da medição da
densidade ótica, número de células e peso seco durante o período de ensaio. Através das curvas
de crescimento é possível uma fácil identificação da fase exponencial e da fase estacionária,
típicas do crescimento celular. No primeiro e segundo ensaio (Figura 18 e 19, respectivamente)
verifica-se que em ambas as curvas para salinidades diferentes a fase estacionária de
crescimento tem lugar a partir do 19º dia.
No geral, o primeiro ensaio (Figura 18) apresentou valores superiores de peso seco em
relação aos valores apresentados no segundo ensaio (Figura 19). No primeiro ensaio,
relativamente ao crescimento em meios de cultura de 18, 32 e 50 g/L atingiu-se a concentração
máxima de biomassa seca de 0,55 ± 0,16 𝑔/𝐿 , 0,91 ± 0,12 𝑔/𝐿 e 0,71 ± 0,03 𝑔/𝐿 ,
respetivamente. No segundo ensaio, a concentração máxima atingida foi, respetivamente, de
0,89 ± 0,05 𝑔/𝐿 , 0,67 ± 0,04 𝑔/𝐿 e 0,83 ± 0,03 𝑔/𝐿 . Segundo os valores apresentados é possível
verificar-se que no 1º ensaio o peso seco máximo obtido é superior nas amostras cultivadas em
salinidade intermédia. No 2º ensaio, as amostras cultivadas a baixa e alta salinidade não
apresentam diferenças estatisticamente significativas em relação ao máximo de peso seco
atingido. No entanto as amostras de salinidade intermédia apresentam valores inferiores de
biomassa. Pelo que se verifica que existe uma grande variabilidade no crescimento da microalga.
34
Figura 18 – Crescimento celular representado em termos de peso seco (g/L) das amostras de diferentes salinidades referentes ao ensaio 1. Os dados apresentados correspondem à média de triplicados.
Na Figura 18 observa-se que a curva de crescimento que representa o crescimento em
salinidade igual a 18 g/L é, entre os dias 1 e 8, superior à curva de salinidade igual a 50 g/L.
Após este dia observa-se uma diminuição da biomassa seca das culturas de salinidade inferior
sendo o seu crescimento continuamente menor ao apresentado pelas amostras de salinidade
elevada. Desde o 8º dia de cultivo até ao 24º verificou-se um aumento de apenas 0,28 g/L (peso
seco) nas culturas a baixa salinidade em comparação com o aumento de 0,42 g/L (peso seco)
nas culturas a alta salinidade.
No 1º ensaio desde o dia 1 até ao último dia de ensaio (dia 24), o crescimento celular das
culturas cultivadas em salinidade baixa, intermédia e alta, em termos de biomassa seca, foi de
0,55 g/L, 0,85 g/L e 0,68 g/L, respetivamente.
Figura 19 – Crescimento celular representado em termos de peso seco (g/L) das amostras de diferentes salinidades referentes ao ensaio 2. Os dados apresentados correspondem à média de triplicados.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Pes
o S
eco
(g/
L)
Tempo (dias)18 g/L 32 g/L 50 g/L
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Pes
o S
eco
(g/
L)
Tempo (dias)18 g/L 32 g/L 50 g/L
35
No segundo ensaio desde o dia 1 até ao último dia de ensaio (dia 24), o crescimento celular
das culturas cultivadas em salinidade baixa, intermédia e alta teve um crescimento em termos
de biomassa seca de 0,70, 0,50 e 0,77 g/L, respetivamente. Tendo sido o crescimento mais
elevado nos 24 dias de cultivo, verificado nas culturas de salinidade alta.
Num estudo realizado por Razaghi et al. (2014), com a microalga P. cruentum cultivada
em condições de azoto variáveis, os investigadores obtiveram produções entre 0,04 g/L e 1,22
g/L de biomassa seca, pelo que todos os valores apresentados anteriormente se encontram
nesta gama de resultados.
A variação do número de células desde o primeiro dia de crescimento até ao último, nos
dois ensaios efetuados e nas diferentes salinidades, encontra-se representado na Tabela 1. Em
ambos os ensaios e diferentes salinidades verifica-se um aumento de uma grandeza desde o dia
1 até ao dia 24. O número de células por mililitro de cultura obtido nos diferentes ensaios
realizados encontra-se de acordo com os apresentados na literatura. Asgharpour et al. (2015)
obteve uma densidade celular máxima ao 19º dia de cultivo igual a 3,0 x 106 células por mL e
Singh et al. (2000) obteve à escala laboratorial densidades celulares entre 5 e 6 x 106 células/mL.
Tabela 1 – Número de células de P. cruentum presentes por mL de cultura, no início e ao fim de 24 dias de crescimento. Os dados apresentados representam a média de três réplicas.
Dia 1
(Células/mL) Dia 24
(Células/mL)
EN 1
18 g/L 5,7 x 105 3,7 x 106
32 g/L 5,4 x 105 5,6 x 106
50 g/L 3,6 x 105 4,5 x 106
EN 2
18 g/L 3,8 x 105 5,8 x 106
32 g/L 3,8 x 105 4,5 x 106
50 g/L 4,4 x 105 5,5 x 106
A taxa específica de crescimento (μ) é um parâmetro cinético que relaciona o número de
gerações que ocorrem por unidade de tempo numa cultura em crescimento exponencial. Este
corresponde ao declive da reta que resulta da representação gráfica do logaritmo neperiano do
número de células em função do tempo, equação 2.
𝐿𝑛 (𝑁𝑡) = 𝐿𝑛 (𝑁0) + 𝜇 ∙ 𝑡 (2)
A taxa especifica de crescimento (μ) e o tempo de duplicação ou geração (g) de uma
população estão relacionados entre si segundo a equação 3. Este último reflete o tempo
necessário para uma determinada população duplicar o número de células.
𝜇 = 𝐿𝑛 2 × 𝑔−1 (3)
36
Na Tabela 2 encontram-se apresentados os dados referentes aos dois ensaios, para cada
salinidade. As taxas específicas de crescimento obtidas são inferiores às encontradas na
bibliografia. Num estudo realizado por Oh et al. (2009) onde foi cultivada a microalga e foi
investigado o efeito dos ciclos de luz:escuro obteve-se taxas de crescimento iguais a 1,01 dia-1
(18:6) e 0,74 dia-1 (12:12). Por sua vez, noutro estudo foi verificado que as taxas de crescimento
eram influenciadas pela concentração em NaCl do meio de cultivo. Para salinidades entre 26 g/L
(0,45 M NaCl) e 47 g/L (0,8 M NaCl) observaram taxas específicas de crescimento iguais a 0,55
dia-1, enquanto em concentrações iguais a 12 g/L e 58 g/L de NaCl a taxa específica de
crescimento era igual a 0,36 dia-1 (Lee et al., 1989). As taxas de crescimento obtidas não se
encontram de acordo com o anteriormente reportado (Lee et al., 1989) pois não se observaram
diferenças significativas nas taxas de crescimento entre diferentes salinidades (Tabela 2).
Tabela 2 – Taxa específica de crescimento (μ), tempo de duplicação (g) e resumo dos dados obtidos na representação gráfica Ln (Nt) em função do tempo.
Ensaio 1 Ensaio 2
𝜇 (𝑑𝑖𝑎𝑠−1) 𝑔 (𝑑𝑖𝑎𝑠) 𝑅2 equação 𝜇 (𝑑𝑖𝑎𝑠−1) 𝑔 (𝑑𝑖𝑎𝑠) 𝑅2 Equação
18 g/L
0,05 13,86 0,76 𝑦 = 0,052𝑥
+13,889 0,07 9,90 0,70
𝑦 = 0,069𝑥 +13,96
32 g/L
0,11 6,30 0,84 𝑦 = 0,105𝑥
+13,830 0,06 11,55 0,61
𝑦 = 0,059𝑥 +13,90
50 g/L
0,10 6,93 0,88 𝑦 = 0,100𝑥
+13,36 0,09 7,70 0,79
𝑦 = 0,086𝑥 +13,68
Na Tabela 3 encontra-se a produtividade obtida na produção da microalga Porphyridium
cruentum nos dois ensaios realizados e para as três salinidades testadas.
A produtividade da microalga P. cruentum, segundo condições de cultivo à escala
laboratorial, revelou ser inferior às obtidas em estudos anteriormente reportados (Tabela 3). A
produtividade nos dois ensaios e a diferentes salinidades variou entre 0,02 e 0,04 𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1,
não existindo diferenças significativas entre ensaios e salinidades.
Asgharpour, Rodgers, & Hestekin (2015) obtiveram produtividades superiores, entre 0,06 e 0,09
𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1 dependendo da condição de crescimento a que cada amostra foi sujeita. Da
mesma forma, Vonshak, Cohen, & Richmond (1985) obtiveram produtividades entre 0,15 e 0,18
𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1 num estudo realizado à escala piloto, com capacidade de 130 L. No entanto, não
é possível justificar a diferença entre as produtividades obtidas devido à variabilidade das
condições em que foram realizados os ensaios pois, por exemplo, algumas variáveis como a
intensidade da luz solar não foram controladas.
37
Tabela 3 – Produtividade obtida no cultivo da microalga Porphyridium cruentum a diferentes salinidades. Os valores apresentados representam a média de três réplicas.
Salinidade Produtividade (𝒈 ∙ 𝑳−𝟏 ∙ 𝒅𝒊𝒂−𝟏)
Ensaio 1 Ensaio 2
18 g/L 0,02 ± 0,007 0,03 ± 0,007
32 g/L 0,04 ± 0,004 0,02 ± 0,006
50 g/L 0,03 ± 0,002 0,03 ± 0,004
4.2. Composição material polimérico
Numa primeira fase foi analisada a composição do material polimérico existente no
sobrenadante. Desta forma, após a centrifugação das culturas, o sobrenadante foi ultrafiltrado e
liofilizado, permitindo calcular o rendimento que representa a massa de sobrenadante liofilizado
por litro de meio de cultura ultrafiltrado. Posteriormente, analisou-se os açúcares totais presentes
para cada salinidade e em ambos os ensaios, Tabela 4.
Tabela 4 – Rendimento do sobrenadante obtido nas amostras do ensaio 1 e 2. Média dos triplicados de cada ensaio.
Amostras Massa material
polimérico (mg/L) Açúcares Totais (mg
Aç/g amostra) % Açúcares
Totais
EN 1
18 g/L 115,5 ± 21,5 576,7 ± 120,0 58
32 g/L 149,8 ± 22,5 695,7 ± 136,0 70
50 g/L 78,4 ± 0,6 475,7 ± 112,3 48
EN 2
18 g/L 153,8 ± 31,0 638,1 ± 207,9 64
32 g/L 135,6 ± 32,8 710,1 ± 91,7 71
50 g/L 82,4 ± 4,9 526,4 ± 124,2 53
Verifica-se que as amostras produzidas nas salinidades 18 e 32 g/L foram as que
apresentaram maior rendimento em material polimérico para os dois ensaios (116 a 154 mg/L).
As amostras com rendimento inferior, em ambos os ensaios, são as amostras de salinidade
superior (50 g/L) com 78 e 82 mg/L para o ensaio 1 e 2, respetivamente. Estas apresentam
diferenças estatisticamente significativas (p˂0,05) em relação às amostras de salinidade baixa e
intermédia. No entanto, as amostras de salinidade 18 g/L e 32 g/L não apresentam diferenças
estatisticamente significativas (p˃0,05) em relação à quantidade de material polimérico no meio
extracelular com um rendimento entre 12 e 15% (m/m).
38
Os valores relativos à extração do material polimérico são inferiores aos anteriormente
reportados que obtiveram uma produção entre 0,18 e 0,95 g/L (You & Barnett, 2004). No entanto,
neste mesmo estudo os autores reportaram maiores taxas de crescimento (entre 0,38 e 0,28 dia-
1) e atingiram valores superiores de número de células (4,0 x 109 cel/mL), pelo que a produção
de exopolissacarídeos pode ser superior. No entanto, outro estudo tinha reportado um
rendimento de 0,12 a 0,16 g/L de polissacarídeos extracelulares o que está de acordo com os
resultados obtidos neste trabalho (Jones 1962).
A quantidade de açúcares totais (açúcares neutros, ácidos urónicos e grupos sulfato)
determinados, que varia entre 48 e 71% de açúcares no material polimérico, não apresentam
diferenças estatisticamente significativas entre os resultados apresentados. Nos resultados
apresentados na Tabela 4 é possível observar os desvios padrão bastante elevados, estes
refletem a variabilidade do cálculo devido à utilização de dois métodos diferentes para a
determinação dos açúcares neutros.
A percentagem de açúcares totais (açúcares neutros, ácidos urónicos e grupos sulfato)
nas amostras varia entre 48 e 71%, sendo as amostras de salinidade elevada que possuem os
valores mais baixos, no entanto esta variação não é significativa. Estes valores estão de acordo
com o reportado noutros trabalhos que apresentam valores entre 55 e 63% (Geresh et al., 2002;
Percival & Foyle, 1979) de hidratos de carbono no meio de cultura da P. cruentum.
A composição aproximada do material polimérico extraído do meio de cultura foi analisado
em três amostras do segundo ensaio, com salinidades diferentes, e encontra-se representada
na Tabela 5.
Tabela 5 - Composição do material polimérico de três amostras de diferentes salinidades, nomeadamente, EN 2-3, EN2-4 e EN 2-8.
mg/g amostra
Amostras Açúcares Totais Ésteres de Sulfato Proteína Cinzas
EN 2 – 18 g/L 696,3 78,2 11,3 54,5
EN 2 – 32 g/L 725,9 79,8 25,9 72,6
EN 2 – 50 g/L 409,4 80,8 26,1 89,8
As amostras são maioritariamente constituídas por açúcares (açúcares neutros e ácidos
urónicos), nomeadamente entre 41 e 73% (m/m). A amostra de salinidade igual a 32 g/L
apresenta maior composição em açúcares totais (73% m/m) face às duas outras amostras
analisadas.
A análise de ésteres de sulfato foi realizada assumindo que no processo de ultrafiltração
apenas permaneceu no permeado compostos de alto peso molecular, desta forma os valores
determinados correspondem ao sulfato presente nos polissacarídeos. O conteúdo de sulfato
obtido nas amostras analisadas varia entre 7,8 e 8,1% (m/m), verificando-se que a amostra com
maior percentagem em ésteres de sulfato é a amostra de salinidade igual a 50 g/L. Os valores
39
obtidos, em relação ao conteúdo em sulfato, são semelhantes ao anteriormente reportado por
Percival & Foyle (1979).
Pela análise termogravimétrica as amostras apresentaram uma composição em material
inorgânico entre 5,5 e 9,0% (m/m). A amostra de salinidade igual a 50 g/L apresenta uma maior
percentagem em cinzas face às duas outras amostras analisadas.
Todas as amostras analisadas apresentam menor conteúdo em proteína. A percentagem
de proteína solúvel determinada nas amostras (1 – 3%) encontra-se entre os valores descritos
na bibliografia com valores entre 2 e 5,5%, excepto a amostra de salinidade igual a 18 g/L que
possuí um conteúdo em proteína inferior (1,1% m/m) (Gloaguen et al., 2004; Hung, Santschi, &
Gillow, 2005; Percival & Foyle, 1979).
4.3. Polissacarídeos extracelulares
A microalga Porphyridium cruentum é caracterizada por se encontrar encapsulada dentro
de um gel formado por polissacarídeos sulfatados. Durante o seu crescimento, uma parte deste
gel dissolve-se no meio e outra continua ligada à célula (Patel et al., 2013). Desta forma, foram
analisadas as composições da fração solúvel no meio e da fração que se encontra na biomassa.
4.3.1. Composição dos polissacarídeos da fração solúvel
A composição dos polissacarídeos foi determinada para todas as amostras dos dois
ensaios efetuados laboratorialmente, Tabela 6, tendo-se confirmado que todas as amostras
contêm principalmente açúcares neutros.
Tabela 6 - Composição dos polissacarídeos das amostras produzidas a diferentes salinidades. Os dados apresentados são a média dos triplicados de cada ensaio.
mg/g amostra
Amostra Açúcares Neutros Ácidos Urónicos Ésteres de Sulfato Total
EN 1 -18 g/L 442,2 ± 104,3 66,5 ± 24,07 68,0 ± 8,8 576,7 ± 120,0
EN 2 - 18 g/L 502,2 ± 171,6 71,0 ± 31,3 64,9 ± 15,2 638,1 ± 136,0
EN 1 - 32 g/L 546,3 ± 150,4 65,7 ± 22,2 83,7 ± 6,4 695,7 ± 112,3
EN 2 - 32 g/L 539,5 ± 73,2 94,3 ± 17,0 76,3 ± 3,9 710,1 ± 207,9
EN 1 - 50 g/L 338,2 ± 87,3 75,1 ± 27,4 62,3 ± 14,9 475,7 ± 91,7
EN 2 - 50 g/L 371,8 ± 84,3 77,5 ± 24,2 77,1 ± 29,4 526,4 ± 124,2
Os polissacarídeos da fração solúvel são maioritariamente constituídos por açúcares
neutros, entre 33,8 e 54,6% (m/m). Em ambos os ensaios verifica-se que os polissacarídeos que
apresentam maior percentagem em açúcares pertencem às amostras de salinidade igual a 32
g/L, entre 54 e 55% (m/m), e os que apresentam menor percentagem são as amostras de 50 g/L.
A composição de ácidos urónicos nas amostras encontra-se entre 6,6 e 9,4% (m/m) e a de
40
ésteres de sulfato entre 6,2 e 8,4% (m/m). Verificou-se também que o conteúdo de ácidos
urónicos e de ésteres de sulfato, de ambas as amostras, é semelhante.
Com o objetivo de confirmar qual o ácido urónico presente na amostra procedeu-se à
realização de uma análise qualitativa através do procedimento para determinação de açúcares
e urónicos por GC-FID (Anexo VI). Desta forma, pela análise dos cromatogramas obtidos das
amostras EN 1-1 e EN 2-6 verificou-se que o ácido urónico presente é o ácido glucurónico, não
tendo sido detetado o ácido galacturónico. O resultado obtido encontra-se de acordo com os
dados reportados na literatura (Geresh et al., 1992; Patel et al., 2013; Percival & Foyle, 1979;
Shi-yan et al., 2000).
A composição dos polissacarídeos da fração solúvel, apresentada na Tabela 6, apresenta
valores inferiores aos anteriormente reportados por Percival & Foyle (1979), 76 e 11% (m/m)
relativamente ao conteúdo em açúcares e sulfatos nas amostras, respetivamente. No entanto,
os valores apresentados por Raposo et al. (2014) são semelhantes aos determinados, entre 40
e 60% (m/m) de açúcares totais e entre 1 e 8% de grupos sulfato.
A composição em monossacarídeos das amostras de dois ensaios sujeitas a três
diferentes salinidades encontra-se na Tabela 7. Todas as amostras analisadas possuem uma
composição semelhante sendo o açúcar neutro mais abundante a xilose (38-49 %molar),
seguindo-se os ácidos urónicos (16-31 %molar), a galactose (15-21 %molar) e a glucose (12-15
%molar). A manose, embora com percentagem inferior a 1 %molar foi identificada nas amostras,
assim como uma quantidade residual de ramnose, fucose e arabinose.
Tabela 7 – Composição em monossacarídeos da fração solúvel das amostras de meio de cultura. Média dos triplicados de cada ensaio.
% Molar
Amostra Xyl Man Gal Glc Residuais Ácidos Urónicos
EN 1 -18 g/L 44,6 ± 2,1 0,6 ± 0,1 19,8 ± 2,5 13,9 ± 0,9 1,0 ± 0,4 20,1 ±2,7
EN 2 - 18 g/L 49,1 ± 3,2 0,3 ± 0,1 16,4 ± 0,7 14,6 ± 0,7 0,4 ± 0,4 19,2 ± 2,7
EN 1 -32 g/L 45,2 ± 1,3 0,5 ± 0,1 20,7 ± 4,1 12,7 ± 3,1 0,7 ± 0,2 20,2 ± 5,3
EN 2 -32 g/L 45,9 ± 6,2 0,6 ± 0,3 20,2 ± 3,8 16,7 ± 1,8 0,6 ± 0,1 16,0 ± 8,9
EN 1 -50 g/L 37,9 ± 3,0 0,9 ± 0,1 19,1 ± 1,1 12,8 ± 0,8 1,3 ± 0,4 28,0 ± 4,1
EN 2- 50 g/L 40,6 ± 3,1 0,2 ± 0,2 14,9 ± 2,2 12,4 ± 0,6 0,6 ± 0,1 31,2 ± 5,9
As amostras de baixa e alta salinidade do ensaio 2 apresentam diferenças significativas
na composição em monossacarídeos, nomeadamente na composição em xilose (49,1 e 40,6
%molar, respetivamente) e ácidos urónicos (19,2 e 31,2%molar, respetivamente).
A composição em açúcares neutros nas amostras analisadas estão de acordo com o
reportado anteriormente em vários estudos de exopolissacarídeos da P. cruentum (Patel et al.,
2013, Gloaguen et al., 2004, Arad et al., 1985, Ramus, 1972 e Percival & Foyle, 1979). As
proporções molares da xilose, glucose, galactose e ácidos urónicos (3:1:2,5:0,8) presentes na
mucilagem extracelular da microalga Porphyridium cruentum descritas por Percival & Foyle
41
(1979) são semelhantes às proporções obtidas neste estudo. As proporções molares médias
determinadas foram 3,2:1:1,4:1,7, verificando-se que a proporção de galactose é inferior e a de
ácidos urónicos superior aos dados descritos anteriormente.
Contudo, recentemente, um estudo verificou que o enriquecimento do meio de cultura com
sulfato aumenta o conteúdo em proteína e ésteres de sulfato, tendo reportado como açúcares
principais a galactose, a glucose e a arabinose e como açúcares residuais a manose, fucose,
xilose e ramnose (Raposo et al., 2014). A composição em monossacarídeos difere da
composição reportada por Patel et al. (2013), em que o açúcar neutro maioritário é a galactose,
seguindo-se a xilose e a glucose.
O facto de nas amostras analisadas, os resíduos de ácidos urónicos representarem entre
16 e 31,2 % molar, pode também contribuir para a elevada solubilidade em soluções aquosas
dos polissacarídeos presentes na amostra. Segundo Raposo et al. (2014) o conteúdo em ácidos
urónicos é um parâmetro importante e o seu aumento influencia positivamente as características
iónicas do polissacarídeo permitindo um espectro maior de aplicações possíveis.
4.3.2. Composição dos polissacarídeos da biomassa
Após a centrifugação das culturas para a obtenção dos exopolissacarídeos, obteve-se
também a biomassa. Esta biomassa, amostra EN 1-1 de salinidade igual a 18 g/L e amostra EN
1-6 de salinidade igual a 50 g/L, foi dialisada contra água destilada e posteriormente liofilizada
para análise de açúcares neutros. Após a diálise obteve-se o material polimérico que é
constituído pelos polissacarídeos que se encontravam agregados à célula. Na Tabela 8 é
apresentada a composição molar e o total de açúcares neutros presentes nesta fração.
Tabela 8 - Composição em monossacarídeos da biomassa.
% Molar Total Açúcares Neutros (mg /g
amostra)
Amostra Xyl Man Gal Glc Residuais
EN 1 – 18 g/L 28,5 ± 4,6 0,2 ± 0,0 16,1 ± 2,3 51,7 ± 3,5 3,5 ± 1,3 308,7 ± 7,9
EN 1 – 50 g/L 27,8 ± 11 0,5 ± 0,2 29,6 ± 10,9 38,4 ± 1,7 3,6 ± 1,5 209,5 ± 6,8
A composição em monossacarídeos da fração que se encontra ligada à célula difere da
composição da fração solúvel, Tabela 7. A percentagem molar de glucose, na presente fração,
é maioritária em ambas as amostras, estando a xilose e a glucose também presentes. O total de
açúcares neutros presentes na fração da biomassa representa 41 e 32% relativamente ao total
de açúcares das frações solúvel e da biomassa das amostras EN 1-1 e EN 1-6, sendo o total de
açúcares neutros na fração solúvel igual a 452,1 e 438,2 mg/g, respetivamente. Estes resultados
diferem dos publicados, em que entre 50 a 70% dos polissacarídeos permanecem ligados à
célula (Singh et al., 2000). No presente estudo a percentagem de polissacarídeos na biomassa
42
é inferior ao reportado, o que significa que mais de 50% dos polissacarídeos totais dissolveram-
se no meio de cultura.
A razão entre o total de açúcares neutros na fração solúvel e na fração da biomassa é
para a amostra EN 1-1 igual a 0,73 e para a amostra EN 1-6 igual a 1,05. Um estudo com a
microalga Porphyridium sp. obteve razões mais baixas, entre 0,11 e 0,26 (Shi-yan et al., 2000),
o que indica que apesar de estes investigadores terem obtido taxas de crescimento maiores
(entre 0,4 e 0,7 dias-1), a fração de polissacarídeos que se solubilizaram no meio é muito inferior
aos que permaneceram na biomassa. Segundo os autores, concentrações mais altas de CO2
aumentam a produção de polissacarídeos na biomassa e a limitação de CO2 aumenta a produção
de polissacarídeos solúveis.
43
4.4. Análise de ligações glicosídicas
As ligações glicosídicas e a posição dos grupos sulfato nos polissacarídeos presentes nas
frações solúveis foram determinados através de análises de metilação, dessulfatação e de
redução dos grupos carboxílicos. As análises referidas foram efetuadas a três amostras de
material polimérico solúvel, nomeadamente EN2-3, EN2-4 e EN2-8, obtidas a diferentes
salinidades, 50 g/L, 18 g/L e 32 g/L, respectivamente.
Os resultados obtidos, Tabela 9, indicam que os resíduos de açúcares neutros presentes
no polissacarídeo nas 3 amostras têm como ligações maioritárias as ligações terminal, (1→3) e
(1→4)-Xilose; terminal, (1→3,4) e (1→2,3,4)-Galactose e terminal, (1→3 ) e (1→3,6)-Glucose.
Entre as três amostras analisadas não se verificam diferenças significativas na proporção das
ligações detetadas. Estes resultados parecem mostrar que os polissacarídeos são muito
ramificados, pois têm uma elevada percentagem de resíduos terminais.
Tabela 9 – Análise de metilação e dessulfatação das amostras EN 2-3, EN 2-4 e EN 2-8.
Ligações EN 2 - 3 EN 2 – 4 EN 2 - 8
M (%) DS (%) M (%) DS (%) M (%) DS (%)
t-Xyl 17,2 30,5 18,1 30,9 14,1 34,5
1,3-Xyl 11,5 12,1 11,5 14,5 13,5 13,3
1,4-Xyl 20,4 16,0 19,6 18,1 16,0 16,6
Total 48,9 58,3 49,5 63,1 42,6 63,6
t-Gal 4,8 6,5 5,5 6,7 6,0 6,9
1,4-Gal 1,1 1,1 1,5 1,7 1,6 1,1
1,3-Gal 1,8 1,7 2,0 1,3 3,4 2,7
1,3,4-Gal 5,1 0,9 3,2 1,1 4,7 1,3
1,2,3-Gal 2,0 0,7 - - 1,2 0,3
1,3,6-Gal - - 1,2 0,3 2,7 0,4
1,2,3,4-Gal 14,4 13,4 14,6 10,4 14,1 9,2
1,2,3,4,6-Gal - - 1,2 0,5 - -
Total 34,5 20,7 31,4 27,9 35,2 26,2
t-Glc 4,1 4,2 5,2 5,3 5,6 5,9
1,3-Glc 4,9 8,1 3,1 5,2 3,9 4,7
1,4-Glc 2,2 3,0 2,3 1,8 2,5 1,7
1,3,6-Glc 8,3 1,1 9,1 1,8 9,0 1,3
1,2,3,4,6-Glc 2,3 0,6 2,2 0,4 1,7 0,3
Total 16,6 20,9 19,3 8,9 20,9 10,3
Os dados apresentados são semelhantes aos apresentados em trabalhos anteriores onde
foram determinadas as ligações (1→3) e (1→4)-Xilose, (1→3)-Glucose, (1→3)-Galactose, (1→4),
(1→3,4) e (1→2,3,4)-Glucose/Galactose (Percival & Foyle, 1979). No entanto estes autores não
reportaram a existência de ramificações no C-2 da galactose. No estudo que realizaram sobre
os polissacarídeos extracelulares da microalga P. cruentum, determinaram cerca do dobro da
44
percentagem de terminais glucose em relação à percentagem de terminais galactose. Contudo,
esta diferença não foi verificada sendo estas duas percentagens semelhantes nas análises
efetuadas. Estudos na microalga Porphyridium sp. (Geresh et al., 2009; Gloaguen et al., 2004)
detetaram a presença da ligação (1→2)-Xyl, todavia esta ligação não foi encontrada nas análises
efetuadas.
Comparando as análises de metilação após a dessulfatação da amostra, que permite
identificar as posições dos grupos sulfato no polissacarídeo, é possível verificar um aumento da
ligação (1→3)-Glc e uma diminuição simultânea da ligação (1→3,6)-Glc. Este facto sugere que
os grupos sulfatos se encontram ligados ao C-6 nos resíduos de glucose, o que se encontra de
acordo com o descrito na literatura ( Arad & Levy-Ontman, 2010; Geresh et al., 2009; Lupescu
et al., 1991).
A diminuição do resíduo totalmente acetilado, (1→2,3,4,6)-Glc, após a dessulfatação das
amostras pode indicar a existência de resíduos duplamente sulfatados. No entanto, o aumento
existente noutras ligações não é suficiente para suportar a diminuição observada.
Em todas as amostras existe também uma diminuição das ligações (1→3,4), (1→2,3) e
(1→2,3,4)-Gal. Contudo, não é observado qualquer aumento nas ligações terminal, (1→3) ou
(1→4)-Gal que possa justificar a presença de grupos sulfatos ligados ao C-3 ou C-6 dos resíduos
de galactose como foi anteriormente reportada (S. Arad & Levy-Ontman, 2010; Lupescu et al.,
1991).
Nas três amostras, após a análise de dessulfatação, é observado um aumento significativo
do terminal xilose (t-Xyl) sendo esse aumento, no caso da amostra EN 2-8 de salinidade igual a
32g/L, de 2,5 vezes. Da mesma forma, a ligação (1→4)-Xyl tem uma pequena diminuição, pelo
que seria possível afirmar a existência de alguns grupos sulfatos no C-4 dos resíduos de xilose.
Contudo, o grande aumento do terminal de xilose não é suficiente para justificar esta diferença e
seriam necessários outros métodos para confirmar a posição dos grupos sulfato. Este aumento
do terminal Xyl pode também ser devido a uma despolimerização do polímero durante o processo
de dessulfatação, apesar de teoricamento o procedimento apenas clivar a ligação com o grupo
sulfato e não as ligações glicosídicas.
Pela Tabela 9, através da análise dos dados de metilação após dessulfatação é possível
determinar o tamanho aproximado da cadeia do polímero. Desta forma, analisando a quantidade
de terminais obtidos pela análise verificou-se que a soma da percentagem molar dos terminais
de xilose, galactose e glucose era superior à soma dos terminais necessários tendo em
consideração a percentagem dos resíduos ramificados. Esta diferença, nas amostras EN 2-3,
EN 2-4 e EN 2-8, é igual a 11%, 18% e 24%, respetivamente, o que parece indicar que os
polissacarídeos têm um tamanho pequeno. Desta forma, admitindo que todos os resíduos
quantificados fazem parte da cadeia principal do polímero e sabendo a percentagem de terminais
em excesso determinou-se que os polissacarídeos são na verdade oligossacarídeos, ou seja, o
polímero contém cerca de 10 resíduos. É importante relembrar que o sobrenadante das culturas
45
de microalga foi sujeito a técnicas de ultrafiltração com membrana de 10kDa, caso estes
oligossacarídeos fossem bastante simples e pequenos não teriam sido obtidos após a
ultrafiltração.
As amostras EN 2-3, EN2-4 e EN 2-8 foram também sujeitas a uma análise de redução
dos grupos carboxílicos com o objetivo de se identificar as ligações dos ácidos urónicos. Pelos
dados obtidos (Tabela II, Anexo V) não é possível identificar um aumento significativo nas
ligações que permita a identificação da ligação correspondente ao ácido urónico. As
percentagens determinadas anteriormente, por método colorimétrico, de ácidos urónicos é
relativamente pequena pelo que não foi possível identificar os resíduos.
Estudos efetuados anteriormente determinaram que o ácido glucurónico se encontrava
ligado preferencialmente pela ligação (1→3) galactose ou glucose (Heaney-Kieras et al., 1977;
Medcalf et al., 1975;Percival & Foyle, 1979).´
4.5. Scale-up
Após a validação dos ensaios efetuados à escala laboratorial foi efetuado um ensaio à
escala industrial. A salinidade escolhida para o ensaio exterior foi a salinidade intermédia (32
g/L) pelo facto de ser a salinidade da água utilizada para produção de outras culturas na empresa
Necton e por ter sido verificado anteriormente que as salinidades não afetam significativamente
a quantidade e composição dos polissacarídeos.
4.5.1. Crescimento celular
O acompanhamento do crescimento celular permitiu identificar claramente a fase lag, a
fase de crescimento exponencial e a fase estacionária, Figura 20. A fase exponencial correu
entre o 2º dia e o 9º dia de produção, a partir deste último teve inicio a fase estacionária em que
se verificou um crescimento de apenas 0,11 gramas de peso seco por litro de cultura.
O peso seco máximo atingido nos 16 dias de cultivo, em termos de biomassa, foi igual a
1,1 g/L. Este valor encontra-se de acordo com os valores obtidos para os ensaios laboratoriais
efetuados à mesma salinidade e também na gama obtida por Razaghi et al. (2014), 0,04 - 1,22
g/L de biomassa seca.
Desde o primeiro dia de ensaio até ao 16º dia observou-se um crescimento em termos de
peso seco de 1,02 g/L. Pelo que se verifica que o ensaio efetuado em condições exteriores teve
um crescimento maior num tempo de produção menor, em comparação com o crescimento
obtido nas diferentes amostras, em 24 dias, nos ensaios 1 e 2 efetuados à escala laboratorial.
46
Figura 20 – Representação gráfica do peso seco (g/L) ao longo do tempo de produção, nas paredes de polietileno com capacidade de
800 L.
A partir da fase exponencial de crescimento obteve-se a equação da reta e
consequentemente a taxa específica de crescimento, 0,13 𝑑𝑖𝑎𝑠−1. O coeficiente de determinação
da equação foi igual a 0,981 pelo que se verificou que a reta ajusta-se de forma adequada à
situação real. Asgharpour et al. (2015) obtiveram taxas específicas de crescimento semelhantes
à obtida, no entanto verificaram que diminuindo a concentração de nitratos obtinham taxas
superiores (0,22 𝑑𝑖𝑎𝑠−1).
Nos 16 dias de cultivo obteve-se uma produtividade igual a 0,07 𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1, valor este
superior às produtividades obtidas à escala laboratorial (entre 0,02 e 0,04 𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1, Tabela
3). Esta é semelhante aos valores apresentados por Asgharpour et al. (2015), entre 0,06 e 0,09
𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1, contudo a produtividade obtida do ensaio ENext é inferior aos dados apresentados
por Vonshak et al. (1985) na produção de P. cruentum em condições exteriores (0,8 e 0,9 𝑔 ∙
𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1), num sistema de cultivo piloto com 130 L de cultura.
4.5.2. Análise de Açúcares Totais
O material polimérico foi separado e analisado, como descrito para os ensaios realizados
à escala laboratorial, nomeadamente as análises de açúcares neutros, ácidos urónicos e ésteres
de sulfato.
Após a amostra ter sido ultrafiltrada e liofilizada obteve-se um rendimento em material
polimérico de 239,9 mg/L, o qual se encontra no limite mínimo da gama de valores descrita em
estudos anteriores (Vonshak et al. 1985), em que a concentração de polissacarídeos no meio de
cultura da P. cruentum varia desde 240 mg/L a 1490 mg/L durante um período de crescimento
de 19 dias, estabilizando após este período. Contudo, neste estudo obtiveram produtividades
maiores o que justifica uma maior concentração de polissacarídeos.
Foi também determinada a composição de açúcares totais na amostra, tendo sido
verificado que esta possui 44,2% (m/m) de açúcares neutros, 6,3% (m/m) de ácidos urónicos e
9,4% (m/m) de ésteres de sulfato. Estes resultados são semelhantes aos apresentados na
Tabela 6 da seção 4.3.1, pelo que se verifica que a composição em massa dos açúcares totais
não é significativamente alterada na produção à escala industrial.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Pes
o S
eco
(g/
L)
tempo (dias)
47
A percentagem de açúcares totais na amostra é igual a 51%, esta percentagem encontra-
se entre a gama obtida nos ensaios laboratoriais para as diferentes salinidades (48-73%) e está
de acordo com o reportado anteriormente na bibliografia (Geresh et al., 2002; Percival & Foyle,
1979). Desta forma, verifica-se que o scale-up efetuado não influenciou a quantidade de
açúcares produzidos.
A composição em monossacarídeos presentes na fração solúvel da amostra ENext é similar
às composições das amostras obtidas à escala laboratorial (Tabela 10). Os açúcares maioritários
são efetivamente a xilose (43 %molar), a galactose (28%), a glucose (16%) e os ácidos urónicos
(11%). Contudo, observa-se maior percentagem molar de galactose e menor de ácidos urónicos
relativamente ao descrito para a P. cruentum produzida à escala laboratorial com a mesma
salinidade (32 g/L), i.e. 20-21% e 16-20% respectivamente.
Tabela 10 – Composição em monossacarídeos da fração solúvel da amostra ENext.
% Molar
Amostra Xyl Man Gal Glc Residuais Ácidos Urónicos
ENext 43,2 ± 0,2 1,3 ± 0,0 27,9 ± 0,2 15,6 ± 0,1 0,6 ± 0,0 11,4 ± 0,2
49
5. Conclusões
No presente trabalho foi estudado o crescimento da microalga Porphyridium cruentum em
meios de cultivo com diferentes salinidades, nomeadamente com concentrações de NaCl iguais
a 18 g/L, 32 g/L e 50 g/L. Pela análise dos crescimentos obtidos nos dois ensaios efetuados
concluiu-se que apesar de existir alguma variabilidade entre os ensaios não foi verificada uma
diferença significativa no crescimento da microalga. O valor máximo de produção de biomassa
obtido no dois ensaios foi de 0,9 g/L. A produção de biomassa no reator de 800 L sob condições
exteriores e com meio a salinidade intermédia, salinidade da água da Ria Formosa, foi
ligeiramente superior 1,1 g/L. No ensaios efectuados à escala laboratorial a produtividade obtida
variou entre 0,02 e 0,04 𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1, contudo no ensaio realizado à escala industrial o valor
obtido foi igual a 0,07 𝑔 ∙ 𝐿−1 ∙ 𝑑𝑖𝑎−1.Pelo que se pode validar o processo de scale-up efetuado
visto que este não alterou significativamente o crescimento das células e num período de
produção menor atingiu valores superiores de biomassa seca e produtividade.
O estudo do material polimérico obtido de cada amostra a diferentes salinidades revelou
que a quantidade de material polimérico extraído do meio de cultura era superior para as
salinidades de 18 e 32 g/L. Contudo, a quantidade extraída de material polimérico é inferior aos
dados presentes na literatura o que pode dever-se ao facto de a microalga P. cruentum não ter
tido as condições ideais de crescimento.
Um dos objetivos do presente trabalho era determinar se na produção em ambientes mais
salinos a microalga excretava polissacarídeos com diferentes características, contudo verificou-
se que não existiam diferenças na quantidade de açúcares neutros, ácidos urónicos e grupos
sulfatos determinados no material obtido na diferentes salinidades.
A composição em monossacarídeos revelou que os açúcares maioritários eram xilose,
galactose, glucose e ácido glucurónico, não tendo sido verificadas diferenças significativas na
composição dos polissacarídeos nas amostras de diferentes salinidades. Na análise de ligações
glicosídicas foram identificadas como ligações maioritárias as ligações (1→3) e (1→4)-Xilose;
(1→3,4) e (1→2,3,4)-Galactose e (1→3 ) e (1→3,6)-Glucose, tendo sido identificada a presença
de grupos sulfato no C-6 nos resíduos de glucose. Os polissacarídeos parecem ter uma cadeia
principal curta e serem muito ramificados.
A extração de polissacarídeos excretados pela microalga Porphyridium cruentum a partir
do meio de cultivo destas tem um elevado potencial. Com o trabalho realizado concluiu-se que a
produção da microalga em questão em meios de salinidade igual a 18 g/L e 32 g/L promoveu
maior produção de exopolissacarídeos e que a salinidade não afeta a composição do material
polimérico.
A produção da microalga Porphyridium cruentum tem vindo a ganhar um grande interesse
comercial devido à produção de grandes quantidades de polissacarídeos sulfatados
extracelulares. Devido às propriedades biológicas destes exopolissacarídeos e à grande
variedade de possíveis aplicações na indústria cosmética, alimentar e nutracêutica o interesse
na optimização da produção e extracção destes tem vindo a ganhar bastante relevo. O facto de
50
ser possível a comercialização da biomassa da P. cruentum, que contem também moléculas de
elevado valor comercial, e dos polissacarídeos excretados por esta para o meio de cultivo permite
a valorização e consequentemente a comercialização dos produtos e sub-produtos associados
à produção da microalga em questão.
No estudo efetuado a microalga não foi cultivada nas suas condições ótimas nem foram
tidos em conta meios de cultivo que promovessem a produção de exopolissacarídeos por essa
razão é de prever resultados mais interessantes ao nível da produtividade dos
exopolissacarídeos aquando da otimização das condições de cultivo. À escala laboratorial e
industrial será necessário investigar o período de tempo médio em que a microalga se deve
encontrar na fase estacionária para a obtenção e posterior extração do máximo material
polimérico que esta produz. Visto que a maior produção de polissacarídeos ocorre nesta fase.
51
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Anexos
Anexo I – Protocolo de determinação de nitratos
A quantificação de nitratos nas culturas foi realizada a cada três dias de acordo com o
protocolo de Narayana & Sunil (2009) adaptado nas instalações da empresa Necton.
Inicialmente, centrifugou-se 10 mL de cultura a uma velocidade igual a 4500 rpm, durante 15
min. Posteriormente, pipetou-se 1 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio, sendo
adicionados de seguida 8,8 mL de uma solução de NaCl a 35g/L e 0,2 mL de HCl 1 M. Para cada
amostra foi preparado um duplicado. O branco continha 9,8 mL de NaCl e 0,2 mL de HCl.
As absorvâncias foram medidas no espectrofotómetro Shimadzu, UV-mini 1240, em
células de quartzo com capacidade para 4 mL, a dois comprimentos de onda λ1= 220 𝑛𝑚 e λ2=
275 𝑛𝑚. A curva de calibração (equação 4) foi obtida através da absorvância de soluções de
diferentes concentraçãoes, em mM, de nitrato de sódio (NaNO3). O coeficiente de determinação
(r2) obtido foi igual a 0,9981. De forma a ajustar a concentração de nitratos da cultura à pretendida
foi necessário calcular a absorvância a utilizar na equação 4, pela equação 3 e fazer a média
das concentrações de nitrato na cultura.
𝐴𝑏𝑠220𝑛𝑚 − 2 ∙ 𝐴𝑏𝑠275𝑛𝑚 = 𝑦 (3)
Em que 𝑦 é a absorvância relativa obtida.
𝑦 = 0,2487 ∙ 𝑥 − 0,0195 (4)
Em que 𝑥 corresponde à concentração de nitratos no meio.
59
Anexo II – Curva de Calibração de Albumina de Soro de Bovino
A determinação da proteína solúvel em cada amostra foi determinada após a realização
de uma curva de calibração. Desta forma, foi utilizada uma solução de albumina de soro de
bovino (BSA) ressuspensa em NaCl 0,15M e com 0,05% de NaN3.
A curva de calibração foi obtida através da absorvância de soluções diferentes com
concentrações entre 0 e 1000 μg/ml de BSA, tendo sido obtido um r2 igual a 0,9915.
𝑦 = 0,0005 ∙ 𝑥 − 0,0575 (4)
Em que 𝑦 corresponde à absorvância lida e 𝑥 à concentração de albumina de soro de
bovino presente na amostra.
Figura I – Curva e calibração da albumina de soro de bovino (BSA).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 200 400 600 800 1000 1200
Ab
sorv
ânci
a
[BSA] (μg/ml)
61
Anexo III – Determinação do fator de resposta para a determinação dos
açúcares neutros
A determinação de um fator de resposta, como descrito na secção 3.4.1 e 3.4.2, tornou-
se necessária pelo facto de se ter verificado que o método convencional realizado para a análise
de açúcares degradava a amostra e a determinação da massa de açúcares presentes por massa
de amostra era subvalorizada. Desta forma, realizou-se a análise por hidrólise redutiva a seis
amostras dos dois ensaios realizados e de diferentes salinidades. Os valores obtidos pelo
método de análise por hidrólise redutiva foram comparados com os dados obtidos pelo método
convencional. De forma a obter-se um fator de resposta calculou-se a diferença entre os
resultados e a média destas diferenças, tendo-se obtido um fator de resposta igual a 2.
Tabela XI - Massa de açúcares totais por grama de amostra segundo a análise de açúcares por método convencional e por hidrólise redutiva, diferença em percentagem destes valores.
Amostras Açúcares Totais (mg / g amostra)
Diferença (%) M. Convencional M. Hidrólise Redutiva
EN 1-1 392,30 609,1 155
EN 1-5 304,9 575,1 189
EN 2-5 305,8 622,9 204
EN 1-6 329,8 602,8 183
EN 2-6 308,1 664,6 216
Enext 280,4 599,1 214
63
Anexo IV – Gráficos Tempo vs Nº de células
Figura II – Crescimento celular representado em termos de Nº de células das amostras de diferentes salinidades referentes ao ensaio 1. Os dados apresentados correspondem à média de triplicados.
Figura III - Crescimento celular representado em termos de Nº de células das amostras de diferentes salinidades referentes ao ensaio 2. Os dados apresentados correspondem à média de triplicados
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Nº
de
Cél
ula
s (x
10
6cé
lula
s/m
L)
Tempo (dias)
18 g/L
32 g/L
50 g/L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Nº
de
Cél
ula
s (x
10
6cé
lula
s/m
L
Tempo (dias)
18 g/L
32 g/L
50 g/L
65
Anexo V – Tabela Metilação vs Redução dos Grupos Carboxílicos
Tabela XII - Análise de metilação e redução de grupos carboxílicos das amostras EN 2-3, EN 2-4 e EN 2-8. Valores apresentados em percentagem relativa.
Ligações EN 2 - 3 EN 2 - 4 EN 2 - 8
M RGC M RGC M RGC
t-Xyl 17,2 14,1 18,1 20,3 14,1 23,7
1,3-Xyl 11,5 13,5 11,5 10,9 13,5 12,4
1,4-Xyl 20,4 16,0 19,6 16,1 16,0 18,3
t-Glc 4,1 5,6 5,2 4,7 5,6 5,4
t-Gal 4,8 6,0 5,5 6,2 6,0 6,9
1,3-Glc 4,9 3,9 3,1 3,4 3,9 3,6
1,4-Glc 2,2 2,5 2,3 2,8 2,5 3,0
1,4-Gal 1,1 - 1,5 1,0 1,6 -
1,3-Gal 1,8 3,4 2,0 2,1 3,4 -
1,3,4-Gal 5,1 4,7 3,2 2,0 4,7 2,2
1,2,3-Gal 2,0 - - - 1,2 -
1,3,6-Glc 8,3 9,0 9,1 5,9 9,0 4,5
1,2,3,4-Gal 14,4 14,1 14,6 12,9 14,1 11,9
1,3,6-Gal - - 1,2 - 2,7 1,9
1,2,3,4,6-Man - - - 1,3 - -
1,2,3,4,6-Glc 2,3 2,7 2,2 9,1 1,7 5,2
1,2,3,4,6-Gal - - 1,2 1,3 - 1,1
67
Anexo VI – Procedimento para determinação de açúcares neutros e
ácidos urónicos por GC-FID
Com o objetivo de identificar o ácido urónico presente nas amostras de polissacarídeos
obtidas após um processo de ultrafiltração procedeu-se à análise apresentada de seguida. Esta,
no entanto não permitiu a correta quantificação dos açúcares neutros por comparação com os
métodos efetuados anteriormente. Por essa razão a metodologia apresentada refere-se a um
método qualitativo e não quantitativo.
Inicialmente pesaram-se cerca de 2 mg de amostra para tubos speed-vac e foram, de
seguida, adicionados 0,5 mL de TFA 2M. Colocaram-se as amostras no bloco de aquecimento a
120 ℃ durante 1 hora. Posteriormente, colocaram-se as amostras no evaporador rotativo sob
vácuo para completa evaporação do TFA. Adicionou-se 200 μL de 2-desoxiglucose com
concentração igual a 1 mg/mL, 100 μL de NaBH4 em NH3 3M (15% m/v) e colocaram-se as
amostras no bloco de aquecimento a 30℃. Após uma hora neutralizaram-se as amostras através
da adição de 50 μL (2 vezes) de ácido acético glacial, a adição foi realizada em banho de gelo.
De seguida eluiu-se cada amostra numa coluna Dowex 50WX8 (3 mL numa seringa com filtro
0,45 μM) para novos tubos speed-vac, para posterior evaporação até à secura num evaporador
rotativo sob vácuo. Foram adicionados 500 μL de MeOH a cada amostra e voltou-se a evaporar
até à secura, este passo foi efetuado mais quatro vezes até à obtenção de uma amostra
transparente. Após o passo anterior colocaram-se os tubos secos num bloco de aquecimento a
85℃, durante 30 min e evaporou-se até à secura.
Depois foram adicionados 200 μL de piridina saturada em KOH e 400 μL de n-propilamina.
Colocaram-se as amostras, novamente no bloco de aquecimento a 55℃, durante 30 minutos e
levou-se as amostras novamente à secura. Posteriormente, adicionou-se 100 μL de piridina
saturada em KOH e 100 μL de anidrido acético e colocaram-se as amostras no bloco de
aquecimento a 120℃ durante cerca de 20 min. Após arrefecimento destas, foram adicionados
0,5 mL de tolueno e coloram-se as amostras no evaporador rotativo sob vácuo de forma a
evaporar a piridina e o anidrido acético, este passo foi efetuado duas vezes. Posteriormente,
foram adicionados 2 mL de água destilada e 2 mL de diclorometano, centrifugou-se a amostra
durante 30 s a 3000 rpm e aspirou-se a fase aquosa, depois adicionou-se 2 mL de água destilada,
centrifugou-se e aspirou-se a fase aquosa novamente.
Finalmente, colocaram-se as amostras no evaporador rotativo sob vácuo para evaporação
total do diclorometano. Estas foram depois diluídas em 50 μL de acetona anidra e injetadas no
GC-FID para posterior análise dos dados.
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Figura IV– Cromatograma obtido após análise da amostra EN 1-1 segundo o procedimento para determinação de açúcares neutros e urónicos por GC-FID. (ST = padrão interno).
