XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA Manaus - 2009

EFEITO DE EXTRATOS DE SEMENTES DE PARKIA DISCOLOR BENTHE PARKIA MUL TIJUGA BENTH SOBRE O CRESCIMENTO MICELIALDE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS

Moisés Teixeira ROLIM1; Adriana BARIANI2; Rogério Eiji HANADA3; José Francisco de CarvalhoGONÇALVES4

;

lBolsista PIBICjCNPqj INPA; 2Co-orientadora INPAjCPST; 3pesquisador INPAjCPPF; "OrientadorINPAjCPST

1. IntroduçãoFungos fitopatogênicos são responsáveis por perdas drásticas da eficiência e da qualidade daprodução vegetal. Em contrapartida a estas perdas, têm sido realizadas aplicações excessivas edescontroladas de defensivos químicos sintéticos, o fato é que os níveis de agrotóxicos podem sertóxicos à saúde humana, animal e ao meio ambiente (Santos, 1999). De maneira geral, a imensaquantidade e diversidade de fungos implica sérios problemas para diversas atividades humanas,com ênfase na agricultura, principalmente, em regiões onde haja condições climáticas quefavoreçam o crescimento e desenvolvimento desses microorganismos, a exemplo das áreas declima quente e úmido da Amazônia. Do ponto de vista fitopatológico, as doenças das plantasquase sempre ocorrem na presença de três fatores: patógeno virulento, planta susceptível e umambiente favorável. No contato planta-patógeno ocorre o reconhecimento do possível patógenopela planta e a ativação de mecanismos de defesa por parte da planta, levando a síntese de novoscompostos e ao aumento da atividade de importantes proteínas de defesa, retardando a infecção(Moraes, 1998; Conrath et e!., 2001). A busca de novas moléculas que possam ser utilizadas nocampo, com capacidade de estimular uma ou mais respostas de defesa, já foram isoladas ecaracterizadas, incluind proteínas das classes dos inibidores de proteinases e das lectinas. Estasproteínas possuem estruturas distintas, desempenham função protetora contra o ataque de fungose são produzidas por muitos organismos, incluindo plantas leguminosas e não leguminosas,gimnospermas, fungos, bactérias, insetos e mamíferos (Giudici et a/., 2000; Ng, 2004).No sentido de buscar o aperfeiçoamento e dar continuidade as pesquisas realizadas no Laboratóriode Fisiologia e Bioquímica Vegetal (INPA-CPST) este estudo objetivou estimar os teores deproteínas solúveis totais e determinar o potencial antifúngico dos extratos de sementes de Parkiadisco/ar e Parkia mu/tijuga.

2. Material e métodosAs atividades foram realizadas nos Laboratórios de Fisiologia e Bioquímica Vegetal (INPA-CPST) eno Laboratório de Patologia da Madeira (INPA-CPPF) e as sementes foram fornecidas peloLaboratório de Sementes da Coordenação de Pesquisas em Ciências Agronômicas (INPA-CPCA).Sementes inteiras e maduras foram trituradas até a obtenção de um material pulverizado, o qualfoi utilizado na extração e na quantificação de proteínas totais. Para a extração das globulinas(extrato I para P. disco/ar, extrato I para P. mu/tijuga) o material pulverizado (5g) foi submetido àextração salina (NaCl 0,15 M, 10% pjv) e para a extração das prolaminas e glutelinas básicas(extrato II para P. disco/ar, extrato 11 para P. mu/tijuga) o material pulverizado livre de lipídeos(0,1 g) foi submetido a extração com etanol 80% e NaOH 0,1 M. A estimativa do teor de proteínasfoi determinada de acordo com o método descrito por Bradford (1976). Os extratos I e II foramutilizados em bioensaios com os fungos Sclerotium ro/fsii e Moni/iophtora perniciosa, exceto o de P.disco/ar NaCI que não foi possível realizar os experimentos. O efeito dos extratos sobre ocrescimento micelial foi analisado a cada dois dias, determinando-se o crescimento radial dascolônias em dois eixos ortogonais, com auxílio de régua milimetrada, sendo posteriormentecalculada uma média aritmética. Quando, em um dos tratamentos, o crescimento das colôniasatingiu todo o diâmetro de uma das placas de Petri, o experimento foi interrompido. O efeito dosextratos na diminuição do crescimento micelial foi determinado pelo Índice de Crescimento Micelial(ICM), segundo Oliveira (1991) que é expresso pela fórmula: ICM = (C1jN1) + (C2jN2) + .... +(Cn/Nn) Onde, ICM = índice de crescimento micelial; C1 = diâmetro do crescimento micelial noprimeiro dia; C2 = diâmetro do crescimento micelial no segundo dia; Cn = diâmetro docrescimento micelial no enésimo dia e N1 = número de dias. Dois experimentos foram montados,cada um deles constituído de uma espécie de fungo, quatro extratos protéicos (PD EI, PM EI, PDEII, PM EII) sendo que cada extrato foi testado em cinco diferentes concentrações de proteínastotais (O, 50, 100, 150 e 200 I-Ig mL-1) e uma variável analisada (crescimento micelial). Odelineamento experimental utilizado nos bioensaios, por experimento, foi o inteiramentecasualizado, em esquema fatorial de 4X5, com quatro repetições. Os resultados obtidos do ICM,

163

XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/fNPA Manaus - 2009

em cada tratamento, foram submetidos à análise de regressão, tendo concentração de proteínastotais por extrato como variável independente e ICM como variável dependente.

3. Resultados e discussãoTeor de proteínas- Os extratos 11 de P. discolor e P. mu/tijuga apresentaram teores de proteínasmaiores que os extratos I, com valores de 2,33 (±0,74) e 2,4 (±0,9) mg mL-1 nos extratos 11 e de0,55 (±0,04) e de 0,54 (±0,02) mg mL-1 nos extratos I, respectivamente (Figura 1).Considerando-se que os teores protéicos das duas espécies apresentaram valores semelhantespode-se inferir que espécies do mesmo gênero botânico podem apresentar semelhança no teor deproteínas.

• Extrato I

M~C00É. 2

-;:;:9~ 1

'"ÕC>.

Extrato 11

oP. discoior P.mu/tijugo

Figura 1 - Teor de proteínas totais dos diferentes extratos, provenientes de sementes de leguminosas arbóreasda flora Amazônica.

Efeito dos extratos sobre o crescimento mice/ia/ dos fungos- A aplicação do extrato I de P.mu/tijuga e dos extratos 11 de P. discolor e P. mu/tijuga, quando comparado ao crescimentoapresentado pelo controle, resultou no decréscimo do crescimento micelial das colônias do fungoSclerotium ro/fsii (figura 2) e Moniliophtora perniciosa (figura 3), em todas as concentraçõesprotéicas testadas. Estes resultados evidenciam que, apesar da diminuição do crescimentoocasionada por esses extratos não ter sido acima de 50%, pode-se inferir que há algum princípioativo nos extratos que interfere no desenvolvimento vegetativo do fungo.A diminuição do crescimento micelial de colônias do fungo Sclerotium ro/fsii também foi verificadaem estudo com extratos salinos (globulinas) de sementes de leguminosas arbóreas da Amazônia,no qual foi observado que na concentração de 80 \.Ig de proteínas totais do extrato de Caesa/piniaferrea varo cearensis houve 4% de diminuição do crescimento do fungo e nas concentrações de 10e 20 \.Ig de proteínas totais do extrato de Swartzia po/yphy/la essa diminuição foi de 5 e 6%,respectivamente (Bariani, 2007).

80 *~~70~

~ ê :~. ~..~ .' APDEI!~::--u.!!! 40010;

"O u 30 j._~E"O 20·'.tS 10 --<

oo

• PM EI

.:. PM EU

50 100 150 200

Proteína (~g mL-l)

Figura 2 - Efeito dos extratos I e II de sementes de P. discolor e P. mu/tijuga sobre o crescimento micelial deSc/erotium ro/fsii. Regressão linear: P. mu/tijuga EII (y = -0,0601x + 65,544, R2 = 0,5044); P. mu/tijuga EI (y= -0,1051x + 70,204, R2 = 0,7859) e P. discotor EII (Y = -0,2099x + 72,088, R2 = 0,7559).

Por outro lado, na aplicação do extrato I de P. mu/tijuga a concentração 150 \.Ig apresentoudecréscimo maior que o apresentado pela concentração 200 \.Ig de proteínas totais, sendo aindaassim maior que o controle. Resultados similares foram observados em estudo que avaliou o efeitode extratos cítricos sobre o crescimento do fungo Co/letotrichum /agenarium, em que na presençada concentração 10 ppm houve uma menor inibição do fungo do que em 1 ppm (Motoyoma et a/.,2003). Esse comportamento pode ocorrer devido ao fator genético das colônias, visto que cadacolônia apresenta características genotípicas diferenciadas, podendo resultar na produção de hifase esporos em quantidades distintas.

164

XVIJI Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA Manaus - 2009

45 -40 *====35-'~~30-, i!';~

~~ ~ ~15 -10 "5o

+PMEI

PM EII

" PD EII

o 50 100 150 200

Proteína total (Ilf\ rnl.+)

Figura 3 - Efeito dos extratos I e II de sementes de P. discotor e P. mu/tijuga sobre o crescimento micelial deMoni/iophtora perniciosa. Regressão linear: P. multijuga EII (y = -O,142x + 41,2, R2 = 0,531) e P. âiscotorEII(y = -O,048x + 38,8, R2 = 0,7559); P. mu/tijuga EI - regressão polinomial (y = -O,OOlx2 + O,160x + 33,62,R2 = 0,743).

4. ConclusõesOs extratos de P. discolor e P. multijuga, submetidos à extração com etanol 80% e NaOH,apresentaram teores de proteínas maiores do que a extração com NaCI.Apesar da diminuição do crescimento micelial das colônias destes fungos, ocasionada pelosextratos de P. multijuga, provenientes da extração em NaCl, e P, discolor e P. multijuga, em etanol80% e NaOH, não ter sido acima de 50%, pode-se inferir que há algum princípio ativo nessesextratos que interfere no desenvolvimento vegetativo dos fungos Sclerotium rolfsii e Moniliophtoraperniciosa, sendo, portanto, espécies potenciais para futuros estudos bioquímicos e biológicos deproteínas de defesa isoladas de suas sementes, contribuindo para identificar se as mesmasapresentam potencial biotecnológico.

s. ReferênciasBariani, A., 2007. Propriedades bioquímicas e biológicas de proteínas de sementes de leguminosasarbóreas da Amazônia. Dissertação de Mestrado, Instituto Nacional de Pesquisas daAmazônia/Fundação Universidade do Amazonas, Manaus, Amazonas. 122p.

Bradford, M, M, 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principie of protein - dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254.

Conrath, U.; Thulke, O.; Schwindling, 5,; Kohler, A. 2001. Priming as a mechanism in inducedsystemic resistance of plants. European Journal of Plant Pathology, 107(1): 113-119.

Giudici, A.M.; Regente, M.C.; La Canal, L. de. 2000. A potent antifungal protein from Helianthusannus flowers is a trypsin inhivitor. Plant Physiology Biochemistry, 38: 881-888.

Moraes, M.G. 1998. Mecanismos de resistência sistêmica adquirida em plantas. Revisão Anual dePatologia de Plantas, 6: 261-284.

Motoyoma, M.M.; Schuwan-Estrada, K.R.F.; Stangarlin, J.R.; Fiori-Tutida, A.C.G.; Scapim, C.A.2003. Indução de fitoalexinas em soja e em sorgo e efeito fungitóxico de extratos cítricos sobreCol/etotrichum lagenarium e Fusarium semitectum. Acta Scentiarum Agronomy, 25(2): 491-496.

Ng, T.B. 2004. Review: antifungal proteins and peptides of leguminous and non-Ieguminousorigins. Peptides, 25(7): 1215-1222.

Santos, S.R. 1999. Dos espirros à morte: agrotóxicos provocam mortes e danos irreverssíveis àsaúde humana. Revista CREAjPR,1(4): 22-23.

Oliveira, J.A. 1991. Efeito do tratamento fungicida em sementes e no controle de tombamento deplântulas de pepino (Cucumis sativus L.). Dissertação de Mestrado - Universidade Federal deLavras, Lavras, MG, 111p.

·165