Efeito do exercício físico nas adaptações

musculares esqueléticas induzidas pela

obesidade

Dissertação apresentada com vista à

obtenção do 2º ciclo em Atividade Física

e Saúde, da Faculdade de Desporto da

Universidade do Porto ao abrigo do

Decreto de Lei nº.74/2006 de 24 de

Março

Orientadores: Prof. Doutor José Magalhães e Prof. Doutora Inês Gonçalves

Autora: Inês Ferreira Moreira Marinho

Porto, outubro de 2015

Ficha de Catalogação

Marinho, I. (2015). Efeito do exercício físico nas adaptações

musculares esqueléticas induzidas pela obesidade. Porto: I.

Marinho. Dissertação de Mestrado em Atividade Física e Saúde

apresentada à Faculdade de Deporto da Universidade do Porto.

Palavras-Chave: MÚSCULO-ESQUELÉTICO, EXERCÍCIO

FÍSICO, OBESIDADE, BIOGÉNESE, STRESS OXIDATIVO

I

Agradecimentos

Este trabalho não seria possível sem a preciosa ajuda e compreensão dos

meus orientadores, Professor Doutor José Magalhães e Professora Doutora

Inês Gonçalves, por todas as horas dedicadas ao meu estudo.

Quero também agradecer a toda a equipa do laboratório, Sílvia Rodrigues,

Telma Bernardo, Estela Alves, pela disponibilidade demonstrada em ensinar-

me e ajudar-me sempre que necessário.

Às amigas de sempre pelo apoio incondicional, Márcia, Catarina, Andreia,

Sofia, Joana, Sara, Maria, Nita. Às minhas amigas e amigos que a faculdade

me deu e que guardo para sempre, Marta, Rai, Jé, Rita, Caças, João, Manel.

Às minhas atletas pela paciência e compreensão.

Por ultimo, mas mais importante, à minha família pelos valores que me

transmitiram e pelo apoio incondicional, seja perto ou longe. Em especial ao

meu pai, à minha mãe pelas noitadas, por todas as horas de pesquisa e leitura,

pela paciência e amor permanentes, à minha irmã que apesar de longe está

sempre perto. E por fim, à minha avó Tété, pela lutadora que é, por ser um

exemplo para mim.

II

III

Índice Geral

Índice Geral III

Índice de Figuras V

Índice de Tabelas VI

Resumo VII

Abstract VIII

Abreviaturas IX

1. Introdução 1

2. Revisão de literatura

2.1. Obesidade: Conceito, prevalência e características 5

2.2. Modelos de dieta animal para indução de obesidade 7

2.3. Obesidade e tecido adiposo 8

2.4. Obesidade em outros tecidos: coração, fígado, cérebro 10

2.5. Obesidade e Musculo: stress oxidativo, biogénese mitocondrial 13

2.6. Papel do exercício físico na obesidade: stress oxidativo,

biogénese mitocondrial 16

3. Objetivos 19

3.1. Objetivo Geral 19

3.1.1. Objetivos específicos 19

IV

4. Metodologia 21

4.1. Caracterização da amostra 21

4.2. Programa de exercício 22

4.3. Western Blotting 22

4.5. Procedimentos Estatísticos 23

5. Resultados 25

6. Discussão 29

7. Conclusões 33

8. Referências bibliográficas 35

V

Índice de Figuras

Figura 1. Distância percorrida no tapete por semana 25

Figura 2. Efeito do exercício físico e da dieta nos marcadores de stress

oxidativo (SH, MDA, Sirt3 e P66Shc) 26

Figura 3. Efeito do exercício físico e da dieta nos marcadores de

biogénese mitocondrial (Tfam e PGC1a) e no conteúdo dos complexos

mitocondriais (OXPHOS) 27

VI

Índice de Tabelas

Tabela 1. Características anatómicas e consumo calórico após 17

semanas de tratamento 25

VII

Resumo

A obesidade é uma doença global, associada a um conjunto de co-

morbilidades metabólicas, como a diabetes, a esteatose hepática entre outras.

Apesar da obesidade ter uma etiologia multifactorial, o sedentarismo é uma das

causas primárias, sendo por conseguinte o aumento da atividade física uma

das mais importantes estratégias preventivas e terapêuticas para esta

patologia. Atendendo ao envolvimento do músculo-esquelético no exercício

físico e ao seu papel no dispêndio energético, o objetivo do presente estudo foi

analisar os mecanismos celulares (biogénese e stress oxidativo) subjacentes

ao potencial efeito protetor do exercício contra as alterações metabólicas

induzidas pela obesidade. Para tal, vinte e quatro ratos Sprague-Dawley foram

divididos em dois grupos: um grupo dieta-controlo (CS, n=11) e um grupo dieta-

gorda sedentários (GS, n=13). Após 9 semanas de dieta, metade dos animais

do grupo CS e do grupo GS, iniciaram um programa de exercício em tapete

rolante durante 8 semanas, 5 dias/semana e 1h/dia (CT, n=5 e GT, n=7).

Foram avaliados marcadores associados à lesão (SH e MDA) ou indução de

stress oxidativo (Sirt 3 e P66shc), assim como marcadores de biogénese

mitocondrial (PGC-1α e Tfam). Para além disto, foi ainda analisado o conteúdo

proteico das subunidades dos complexos mitocondriais. Nos animais do grupo

GS, observou-se um aumento dos grupos tióis e do conteúdo de Sirt3, PGC-1α

e complexo III. O exercício crónico induziu uma redução dos grupos tióis e do

conteúdo proteico do complexo III, enquanto a expressão do complexo IV

aumentou significativamente.

Em conclusão, a dieta rica em gordura induziu um aumento da biogénese,

provavelmente na tentativa de reduzir a produção de espécies reativas de

oxigénio, através do aumento da oxidação de ácidos gordos. O aumento da

expressão do complexo IV nos animais do grupo GT, poderá contribuir para

uma melhoria da capacidade oxidativa mitocondrial e assim atenuar o ambiente

pro-oxidante associado a esta patologia.

Palavras-Chave: MÚSCULO-ESQUELÉTICO, EXERCÍCIO FÍSICO,

OBESIDADE, BIOGÉNESE, STRESS OXIDATIVO

VIII

Abstract

Obesity as been described as a global epidemic, with several associated

metabolic comorbidities, such as diabetes, hepatic steatosis and others.

Although obesity etiology is multifactorial, sedentary behaviors are accepted as

a primary cause for this disorder and increased physical activity one of the first

line therapies for the prevention and treatment of this pathology. Considering

the involvement of skeletal muscle in exercise and its role in energy

expenditure, the aim of this study was to analyze the cellular mechanism

(biogenesis and oxidative stress) behind the potential protective effect of

exercise against metabolic alterations-induced by obesity. For that, twenty-four

Sprague-Dawley rats were divided in two groups: a standard diet (SS, n=11)

and high-fat diet sedentary group (HS, n=13). After 9 weeks of diet treatment,

half of SS and HS group were engaged in an exercise program on treadmill for

8 weeks, 5days/week and 1h/day (ST, n=5 and HT, n=7). Oxidative damage

(SH, MDA) and pro-oxidant signaling (Sirt3 and P66shc), biogenesis markers

(Tfam, PGC-1α), as well as mitochondrial complex content were assessed. HS

showed an increase of thiol groups and Sirt 3, PGC-1α and complex III content.

Chronic exercise induced a decrease of thiol groups and complex III content,

whereas complex IV was significantly increased.

In conclusion, high-fat diet feeding increased biogenesis probably as an attempt

to reduce reactive oxygen production and increased fatty acid oxidation, which

will ultimately contribute to ameliorate metabolic conditions. The increased

expression of complex IV-induced by chronic exercise in obese animals, might

had contributed to increase mitochondrial oxidation capacity and therefore

attenuate the pro-oxidant environment.

Keywords: SKELETAL MUSCULE, PHYSICAL EXERCISE, OBESITY,

BIOGENESIS AND OXIDATIVE STRESS

IX

Abreviaturas

ADN Ácido desoxirribonucleico

ADNmt Ácido desoxirribonucleico mitocondrial

ATP Adenosina trifosfato

AVC Acidente vascular cerebral

BSA Albumina do soro de boi

CS Dieta controlo sedentário

CT Dieta controlo treinado

CTE Cadeia transportadora de eletrões

DC Dieta de cafetaria

EROs Espécies reativas de oxigénio

GS Dieta gorda sedentário

GT Dieta gorda treinado

MDA Malondialdeído

Mg Miligramas

Min Minuto

Ml Mililitro

mM Milimolar

NAFLD Doença hepática não alcoólica

NASH Esteatohepatite não alcoólica

OMS Organização Mundial de Saúde

X

OXPHOS do inglês, oxidative phosphorylation

PGC-1α do inglês, peroxisome proliferator-activated receptor gamma

coactivator 1alpha

SDS/PAGE do inglês, polyacrylamide gel electrophoresis

SH Grupo sulfidrilo

Sirt3 Sirtuina 3

TBST Tris buffered saline with tween

Tfam do inglês, mitochondrial transcription factor A

VO2 Volume de oxigénio

WHO World Health Organization

α Alfa

1

1. Introdução

A atividade física é fundamental na melhoria da aptidão cardiorrespiratória bem

como na saúde mental dos indivíduos. Os seus benefícios estão também

relacionados com uma maior interação e envolvimento social das populações

(Cavill, Kahlmeier, Racioppi, 2008). O exercício desencadeia ainda alterações

metabólicas, fisiológicas e hormonais em diferentes órgãos, nomeadamente

adaptações musculares esqueléticas. Por outro lado, a predominância do estilo

de vida sedentário e, por consequência, a falta de exercício físico, tem levado

ao aumento significativo de indivíduos com obesidade desde idades precoces

(WHO, 2015). Há uma necessidade urgente em combater esta doença crónica

que eleva o risco de desenvolvimento de outras doenças como a diabetes,

doenças cardiovasculares, cancro, entre outras, sendo um importante fator de

morbilidade e mortalidade (Beja, Ferrinho & Craveiro, 2014; Hariri, & Thibault,

2010; Peters, 2014; Sarzani, Bordicchia, Spannella, Dessi-Fulgheri,

Fedecostante, 2014; Schmidt, 2012).

O músculo-esquelético adapta a sua capacidade oxidativa às necessidades

bioenergéticas que, por sua vez, são largamente determinadas pelos hábitos

de atividade física ou comportamento sedentário. Na obesidade, a capacidade

oxidativa do músculo é reduzida, característica relacionada com a resistência à

insulina (Menshikova et al., 2007). Parte da energia gerada pela degradação de

substratos (catabolismo) é utilizada para a produção de adenosina trifosfato

(ATP), esta molécula de elevada capacidade energética é importante para a

contração muscular. A fosforilação oxidativa é o processo de síntese de ATP a

partir de diferentes nutrientes. Este processo ocorre na mitocôndria sendo o

mais rentável e eficiente na produção de energia. Em situações de exercício,

há uma necessidade acrescida do consumo de mais substratos energéticos

para poder levar o oxigénio às células, dar resposta às necessidades

fisiológicas e manter o equilíbrio metabólico.

.

2

A atividade física provoca adaptações musculares esqueléticas específicas

relativas ao tipo, intensidade e duração do treino. Com o exercício físico, há um

aumento do consumo de oxigénio com consequente situação favorável à

produção de espécies reativas de oxigénio (EROs) e aparente aumento do

stress oxidativo a nível celular, tecidual e orgânico, avaliado por marcadores

tais como Sirtuina3 (Sirt3), grupo sulfidrilo (SH), proteína oxidante P66Shc. As

EROs são assim indicativas de stress oxidativo durante o exercício

encontrando-se também associadas a danos celulares (Ascensão et al., 2003;

Castrogiovanni & Imbesi 2012). Na realidade, durante o exercício observa-se

um aumento de radicais livres que retiram os eletrões da membrana lipídica

produzindo uma cadeia de reações que conduz à peroxidação lipídica (MDA)

assim como danos no ADN mitocondrial e nas proteínas (Ascensão et al.,

2003; Castrogiovanni & Imbesi, 2012).

Por seu lado, a adaptação do músculo ao treino está associada a mudanças na

expressão génica, regulação dos mecanismos de proteção celular e

remodelação da própria estrutura muscular bem como a biogénese

mitocondrial. Este processo de biogênese mitocondrial exprime-se não apenas

na formação de novas mitocôndrias, mas também na melhoria da expressão da

sua enzimática (Silva, 2014). Esta resulta da ativação do coativador 1α do

receptor gama ativado pelo proliferador de peroxisoma - PGC-1α, proteína

reguladora de uma variedade de processos metabólicos, incluindo a formação

de novas mitocôndrias nos músculos esqueléticos e no coração, bem como o

controle da β-oxidação mitocondrial (Lin et al., 2005; Silveira et al., 2006) e a

resposta celular ao stress oxidativo (St-pierre et al., 2006). Assim sendo, de

uma forma geral, a PGC-1α estimula a biogénese mitocondrial e promove a

remodelação do tecido muscular para uma composição que é mais oxidativa e

menos glicolítica. A sua relevância na modulação do metabolismo lipídico

torna-se um fator chave na intervenção na obesidade e diabetes através do

exercício (Kang & Ji, 2012; Liang & Ward, 2006).

3

À semelhança de outros estudos, neste trabalho foi utilizado o método de

Western Blotting de semi-quantificação de proteínas para perceber de que

forma, comparativamente à condição de sedentário, as proteínas PGC1α, T-

Fam, envolvidas na biogénese mitocondrial, se alteram com o exercício em

animais obesos e não obesos sujeitos a exercício. Adicionalmente, foram ainda

determinados marcadores de stress oxidativo, Sirt3, MDA, SH, p66Shc, bem

como o conteúdo proteico das subunidades dos complexos mitocondriais I, II,

III e IV.

4

5

2. Revisão de literatura

2.1. Obesidade: Conceito, prevalência e características

O excesso de peso e a obesidade constituem um problema de saúde cada vez

mais grave e atual. A obesidade é definida pela World Health Organization

(WHO, 2015) como uma acumulação anormal de gordura que se poderá tornar

um fator de risco para a saúde do individuo.

Em 2014, mais de 1,9 milhões de adultos (> 18 anos) tinham excesso de peso

e, destes, 600 milhões eram obesos (WHO, 2014). Tendo em conta estes

dados e comparando-os com os dados relativos a 1980, a prevalência de

obesidade a nível mundial mais do que duplicou. Os fatores genéticos poderão

ter alguma influência na propensão para obesidade, no entanto, esta condição

parece dever-se sobretudo a um desequilíbrio energético resultante de um

aporte calórico muito superior às necessidades orgânicas e a uma diminuição

significativa da atividade física, muito relacionada com o sedentarismo (Beja,

Ferrinho & Craveiro, 2014; Hariri, & Thibault, 2010; Peters, 2014; Sarzani,

Bordicchia, Spannella, Dessi-Fulgheri, Fedecostante, 2014; Schmidt, 2012).

Este estilo de vida tem efeitos negativos não só na saúde física mas

igualmente na saúde mental (Peters, 2014), constituindo-se como um fator de

risco para dificuldades de aprendizagem, baixa autoestima, distúrbios mentais

(depressão, perturbações de ansiedade) e, na idade adulta, doenças

cardiovasculares, diabetes, distúrbios músculo-esqueléticos (ex: osteoartrite),

cancro (ex: endométrio, mama e cólon). Atendendo ao aumento global da

obesidade e consequentemente das comorbilidades associadas, vários estudos

têm sido realizados nesta área (Beja et al, 2014; Buettner, Scholmerich,

Bollheimer, 2007; Freeman, Haley-Zitlin, Rosenberger, Granholm, 2014; Galic,

Oakhill, Steinberg, 2010; Lindinger et al, 2015; Romacho et al, 2014;

WHO/Europe, 2007).

Na Europa, em 2008, mais de 50% dos indivíduos com idade superior a 20

anos apresentavam excesso de peso e mais de 20% apresentavam obesidade.

No grupo de obesidade a prevalência por género era, aproximadamente, 20%

6

homens e 23% mulheres. Nos adolescentes, dados do inquérito Health

Behaviour in School-aged Children (2009-2010) revelam uma elevada

prevalência de sobrepeso em vários países da Europa com Portugal a registar

32% neste grupo (WHO/Europe, 2013). Entre 1990 e 2008 verificou-se que

cerca de 60% das crianças que apresentavam sobrepeso antes da puberdade

tinham elevada probabilidade de o manter na idade adulta (Beja et al., 2014;

Hariri, & Thibault, 2010; Lehnert et al., 2013; WHO/Europe, 2007).

Dados do Instituto Nacional Ricardo Jorge no âmbito do Childhood Obesity

Surveillance Iniciative - COSI Portugal 2010 (Rito, 2012) mostram que 14,3%

das crianças com idades compreendidas entre os 6-8 anos são obesas e

30,2% encontram-se em excesso de peso sendo a prevalência mais elevada

na região da grande Lisboa e no Arquipélago da Madeira.

Com o aumento do número de obesos numa população de determinado país,

os valores monetários investidos nas despesas de saúde relacionadas com a

obesidade e as doenças associadas, são maiores (Kershaw & Flier, 2004;

Lehnert et al., 2013). Na Europa estima-se que os custos diretos e indiretos

sejam de 0,09% a 0,61% da receita bruta total anual nos países Ocidentais.

Estes custos indiretos estão associados com a redução de produtividade,

problemas a nível dos sistemas de saúde, empregadores e com a economia do

país em geral (Lehnert et al., 2013; Von Lengerke & Krauth, 2011). Assim,

parece evidente que é imperativo um forte investimento nas estratégias de

prevenção, a fim de limitar o crescimento das despesas de saúde imputáveis à

obesidade em toda a Europa (Von Lengerken & Krauth, 2011).

No sentido de prevenir os aspetos negativos acima referidos, a investigação

tem procurado perceber de que forma se poderá combater esta epidemia e

controlar os custos económicos a ela associados. Desta forma têm sido

registadas uma panóplia de intervenções preventivas e terapêuticas,

atendendo à relação custo-eficácia sendo privilegiadas intervenções mais

económicas e, simultaneamente, com elevado grau de eficácia. A intervenção

centrada na prevenção consiste na sensibilização junto das populações mais

7

jovens para uma alimentação saudável, variada e livre de gorduras, bem como

o incentivo à prática de exercício físico (Faeh, 2012; Lehnert et al., 2013).

De facto, as intervenções não farmacológicas propostas pela União Europeia

com vista a combater a obesidade, nomeadamente a atividade física regular e

uma alimentação nutricionalmente equilibrada, são prioridades a serem

atendidas nos vários estados membros nomeadamente nas instituições

educativas (Faeh, 2012). No mesmo sentido a OMS realça estes dois pontos

no seu plano de ação elaborado para 2013-2020 (WHO, 2013).

2.2. Modelos de dieta animal para indução de obesidade

O modelo animal tem sido utilizado frequentemente para mimetizar a

obesidade, todavia algumas variáveis potencialmente confundidoras deverão

ser controladas nomeadamente a espécie, a idade, o nível de gordura da dieta

e ainda o tipo de dieta de controlo (Crescenzo et al., 2013; Farias et al., 2013;

Gajda, 2015; Hariri & Thibault, 2010; Rosini, Silva, Moraes, 2012).

Na literatura, têm sido referidos vários modelos nutricionais de indução da

obesidade nomeadamente: Modelo de cafeteria, Modelo hipercalórico, Modelo

de LiberDeCarli. O modelo nutricional para indução da obesidade, designado

por dieta de cafeteria baseia-se na ingestão ad libitum biscoitos, doces, queijos

e carnes processadas (Gajda, 2015; Hariri & Thibault, 2010). A vantagem

principal desta dieta está na semelhança com a dieta humana ocidental que é

rica em sal, açúcar e gorduras, sem grande definição dos componentes

nutritivos e não nutritivos. Por outro lado, uma das desvantagens desta dieta é

a escolha aleatória de alimentos, pois o animal pode fazer uma seleção de

alimentos diferente em cada dia. Este tipo de dieta, foi utilizado no estudo de

Casanova et al. (2014), para induzir obesidade, tendo o peso corporal

aumentado significativamente nos animais sujeitos a DC comparativamente

com os alimentados por uma dieta controlo (CS).

8

O modelo hipercalórico utilizado continha níveis elevados de gordura animal de

banha de porco (> 30% de gordura) (Farias et al., 2013; Rosini, Silva, Moraes,

2012). Os resultados mostram que a obesidade provoca grandes alterações

relacionadas com diversos parâmetros bioquímicos e moleculares no tecido

adiposo, bem como valores mais elevados do peso corporal (Hariri & Thibault,

2010). Os níveis de glicemia, plasma sanguíneo, triglicerídeos, bem como os

níveis de glicose no sangue, também demonstraram aumentos significativos

(Tinkov, Popova, Polyakova, Skalny, Nikonorov, 2014; Yokota et al., 2009).

Umas das desvantagens das dietas hipercalóricas é o seu tempo de indução –

2 a 3 meses.

Outro modelo de dieta utilizado é a dieta líquida (isocalórica) - modelo de

LiberDeCarli. Este tipo de dieta tem a vantagem de mostrar resultados em

apenas 3 semanas, sendo mais significativos após 5/6 semanas. Estes

resultados traduzem-se no aumento de peso, alterações ao nível da cadeia

respiratória e desenvolvimento de várias características-chave para doenças

associadas à obesidade (Abdelmegeed et al., 2011). Outra das vantagens

deste tipo de dieta é o facto de evitar uma deficiência nutricional. Esta dieta foi

apresentada pela primeira vez no estudo realizado por Lieber et al. (2004) com

ratos Sprague-Dawley machos que utilizou uma dieta líquida rica em gordura

(71% de energia proveniente de gordura, 11% de hidratos de carbono, 18% de

proteínas) e uma dieta controlo (35% de energia proveniente de gordura, 47%

de hidratos de carbono, 18% de proteína). Os autores puderam constatar que a

dieta com elevado teor de gordura causou anomalias mitocondriais,

inflamações mononucleares e aumento do stress oxidativo (Abdelmegeed et

al., 2011; Wang et al., 2009). A desvantagem desta dieta prende-se com a

exigência do procedimento de alimentação pois deverá ser diário e feito

individualmente.

2.3. Obesidade e tecido adiposo

O tecido adiposo é um órgão endócrino complexo e com uma elevada atividade

metabólica, fonte de energia e de secreção de proteínas com uma importante

9

função endócrina e anti-inflamatória. Este tecido é composto por adipócitos e

subdivide-se em: tecido adiposo branco – armazenamento de lípidos – e tecido

adiposo castanho que tem como principal e crucial função a termorregulação

(Lagowska & Jeszka, 2011). Na sua constituição encontra-se ainda tecido

nervoso, células imunes, não sendo considerado apenas um local de

armazenamento de lípidos e triglicerídeos (fontes de energia) e de proteção

(contra a perda de calor) (Galic, Oakhill, Steinberg, 2010; Kershaw & Flier,

2004; Lindinger et al, 2015; Paglialunga, Ludzki, Root-McCaig, Holloway,

2015).

Gollish et al. (2009) mostraram que uma alimentação rica em gorduras

aumentava drasticamente a quantidade total de tecido adiposo. Este estudo

tinha como objetivo estudar os efeitos do treino no tecido adiposo subcutâneo e

visceral em ratos que foram alimentados com uma dieta de ração controlo

(13% gordura) ou tornados resistentes à insulina por uma dieta rica em

gorduras (60%). Já outro estudo realizado por Crescenzo et al, (2013) com

ratos machos Sprague–Dawley, revelou que a dieta rica em frutose utilizada

induz o desenvolvimento de obesidade tendo por base o aumento dos níveis de

gordura em todo o corpo mais especificamente gordura intra-abdominal.

Estudos mostram uma associação entre a síndrome metabólica e a obesidade

abdominal que parece estar altamente dependente da distribuição da gordura

corporal, principalmente no que se refere à gordura periférica (Romancho et al.,

2014).

No que se refere à função endócrina e secretora, o tecido adiposo produz

citocinas (ou adipocinas), proteínas de sinalização intercelulares durante a

resposta imunológica ou inflamatória. Estas podem atuar localmente no tecido

adiposo mas também chegam a outros órgãos através da circulação sistémica

onde intervêm ao nível da regulação da ingestão alimentar e peso corporal,

sensibilidade à insulina, inflamação, coagulação ou função vascular. Esta

função endócrina é potenciada pelas consequências metabólicas adversas

resultantes tanto do excesso de tecido adiposo como da sua redução (Kershaw

& Flier, 2004; Romancho et al., 2014). Os locais de deposição do tecido

10

adiposo afetam a função endócrina uma vez que as hormonas endócrinas

originárias do tecido adiposo visceral são segregadas no sistema portal tendo

assim acesso direto ao fígado (Kershaw & Flier, 2004).

Relativamente à função anti-inflamatória do tecido adiposo, na obesidade os

fatores que fazem desencadear a produção de macrófagos, principal fonte de

citocinas inflamatórias, são elevados e surgem com maior frequência levando a

uma resposta inflamatória crónica, que tem sido associada ao desenvolvimento

da resistência à insulina e aos diabetes (Lagowska & Jeszka, 2011; Romancho

et al., 2014). Alguns estudos referem especificamente os efeitos do tecido

adiposo na resistência à insulina (Lagowska & Jeszka, 2011; Romancho et al.,

2014). Amano et al. (2014) verificaram que o tecido adiposo acumula células

imunes que irão libertar citocinas que poderão desencadear a resistência à

insulina. Os macrófagos existentes no tecido adiposo sofreram uma divisão

celular inesperada o que mostrou um aumento da proliferação na obesidade.

As desordens metabólicas do tecido adiposo estão assim intimamente ligadas

à inflamação que acompanha o recrutamento e infiltração de células imunes o

que inclui macrófagos do tecido adiposo (Cai, Wang, Ji, Meyer, van der

Westhuyzen, 2012). Em síntese, uma dieta rica em gorduras num curto período

de tempo induz um aumento da resistência à insulina e hipóxia em sujeitos

obesos (Furukawa & et al, 2004; Lagowska & Jeszka, 2011), o que poderá ter

consequências noutros tecidos.

2.4. Obesidade em outros tecidos: fígado, coração, cérebro

A obesidade pode manifestar-se por alterações ao nível dos principais órgãos

do ser humano, alterações essas que por sua vez serão fatores de morbilidade

(Wang et al., 2015). De facto, a obesidade é a causa primária de várias

doenças metabólicas, como a diabetes e a doença hepática não alcoólica

(NAFLD). A NAFLD é considerada um síndrome com um amplo espetro de

lesões hepáticas, desde a esteatose simples, à esteatohepatite não alcoólica

(vulgarmente designada por NASH) e, finalmente, fibrose ou cirrose não

11

alcoólica. A NASH, para além da acumulação de gotículas lipídicas nos

hepatócitos caracteriza-se pela apresentação de células inflamatórias (Wang et

al., 2008). Apesar da esteatose ser designada como benigna, a possibilidade

desenvolvimento e progressão da doença é evidente (Abdelmegeed et al,

2011; Lieber et al, 2004; Woo et al., 2014). Machado et al. (2012) concluíram

que a obesidade constitui um dos principais riscos para o desenvolvimento da

esteatose hepática não-alcoólica devido à capacidade de armazenamento do

tecido adiposo estar saturada, levando a uma acumulação de gordura na parte

exterior dos órgãos. Esta acumulação pode desencadear a ativação dos

macrófagos e, consequente, libertação de citocinas pró-inflamatórias. A

inflamação, por sua vez, conduz ao desenvolvimento de fibrose, cirrose e

doença hepática crónica (Negrin et al., 2014). Mais tarde Larter et al. (2013)

demonstrou que ratos (Alms1 mutant) alimentados com dieta gorda

desenvolvem obesidade hiperfágica, diabetes, síndrome metabólica e

esteatose hepática não-alcoólica (Negrin et al., 2014).

Para além destes problemas, a obesidade está associada ao agravamento da

doença inflamatória intestinal sendo o excesso de ingestão de gorduras

saturadas um fator de risco para esta doença (Gruber et al., 2013). Kredel e

Siegmund (2014) demonstraram que a deposição de tecido adiposo está

associada a um aumento da resposta inflamatória no intestino com

consequências sistémicas. O estado de inflamação crónica daí resultante pode

contribuir para o aparecimento da doença de Crohn, cancro do colon, entre

outras. De facto, estudos recentes têm sugerido uma associação entre

alterações na flora microbiana intestinal e várias doenças metabólicas,

nomeadamente a obesidade e a diabetes tipo 2 (Gruber et al., 2013; Ojeda et

al., 2015). Por outro lado, estudos evidenciam que dietas ricas em gordura

induzem hiperinsulinemia e acumulação lipídica que, por sua vez, está

associada a um aumento do stress oxidativo e alterações morfológicas levando

a lesões em tecidos como o fígado, rins e coração (Muthulakshmi & Saravanan,

2013).

Para além de patologias hepáticas e gastrointestinais, outros estudos têm

evidenciado o risco de doença cardíaca associada à obesidade, principalmente

12

se a obesidade estiver presente desde as idades mais jovens podendo refletir-

se no batimento cardíaco e problemas associados à vasodilatação dos

capilares do músculo cardíaco (Lacerda-Miranda et al., 2012; Sarzani,

Bordicchia, Spannella, Dessi-Fulgheri, Fedecostante, 2014). Os mesmos

resultados têm sido evidenciados em humanos (Mogoi, Ilie, Paul, Velea, 2014).

Um estudo realizado por Sarzani et al, (2014), na Alemanha e na Suíça com

260,000 crianças obesas ou com excesso de peso, revelou que 35% tinham

hipertensão com aumento do ventrículo ou rigidez arterial. Com efeito, os

autores concluíram que crianças que mantêm um padrão de obesidade até à

idade adulta estão propensas a desenvolver hipertensão, diabetes,

aterosclerose (Mogoi, Ilie, Paul, Velea, 2014).

As alterações metabólicas induzidas pela obesidade estão também associadas

a alterações no cérebro, tanto ao nível estrutural como funcional (Bilbo &

Tsang, 2010). De facto, tem sido sugerido que a hiperglicémia provoca danos

graves no tecido cerebral levando ao desenvolvimento de doenças neuro

degenerativas como a doença de Alzheimer e Parkinson (Ashrafian, Harling,

Darzi, Athanasiou, 2013; Davidson et al., 2013; Jayaraman, Lent-Schochet,

Pike, 2014; Sheikhpour, & Khoradmehr, 2014; Wang et al., 2015). Para além

destas patologias, a demência surge também associada a uma deficiente

alimentação, principalmente à base de carnes vermelhas, açucares e grãos

refinados e alimentos com elevado teor de gordura, como também, alimentação

rica em ácidos gordos saturados está associada a uma pior performance

cognitiva (Davidson et al., 2013; Ashrafian, Harling, Darzi, Athanasiou, 2013;

Freeman, Haley-Zitlin, Rosenberger, Granholm, 2014). A demência define-se

por uma deterioração de uma ou mais partes do cérebro levando a uma

diminuição da performance cognitiva. Estudos comprovam que a obesidade e o

consumo de uma dieta com elevado teor de gordura aumenta o risco de

desenvolvimento de demência, estando associada a uma diminuição da

integridade dendrítica e ativação das células microglias no hipocampo

(Davidson et al., 2013; Freeman, Haley-Zitlin, Rosenberger, Granholm, 2014).

Assim a relação entre a obesidade e a diminuição da capacidade cognitiva é

13

cada vez mais evidente. (Jayaraman, Lent-Schochet, Pike, 2014; Sheikhpour, &

Khoradmehr, 2014).

Para além dos efeitos da obesidade ao nível dos órgãos referidos

anteriormente, existem igualmente consequências nefastas ao nível muscular.

2.5. Obesidade e Músculo: stress oxidativo, biogénese mitocondrial

Num estado de obesidade, a condição física do individuo torna-se limitada, o

que por sua vez limita a sua capacidade de trabalho, nomeadamente através

da restrição de determinados movimentos e da diminuição da agilidade e força

gerada pelo músculo.

Com o incremento da obesidade, a prevalência dos efeitos negativos no

músculo-esquelético aumentaram. Neste sentido, os estudos nesta área têm-se

tornado relevantes a nível clinico. Lafortuna, Tresoldi, Rizzo, (2014)

demonstraram que a mudança de peso de normal para obeso estava

associado a um aumento progressivo do volume muscular do membro inferior e

da área de secção transversal do músculo-esquelético. Isto poderá ser visto

como uma resposta adaptativa muscular do aumento do peso corporal. Para

além disto, vários estudos têm reportado a alteração do metabolismo

mitocondrial no músculo-esquelético, não estando contudo esclarecido quais as

vias celulares envolvidas nestas alterações e quais as suas consequências

(Baker II et al., 2015).

O músculo-esquelético é um tecido altamente especializado com excelente

plasticidade em resposta a estímulos externos, como o exercício físico. As

contrações musculares realizadas durante o treino desencadeiam uma

variedade de características fenotípicas e respostas fisiológicas incluindo a

ativação da biogénese mitocondrial, transformação do tipo de fibra, fibra mais

oxidativa e menos glicolítica, e angiogénese. Em conjunto, estas respostas

aumentam a capacidade do metabolismo aeróbico do músculo e a sua

resistência à fadiga (Liang & Ward, 2006; Steinbacher & Eckl, 2015).

14

A obesidade, por seu lado, provoca vários efeitos nefastos no músculo-

esquelético. Por exemplo, ao nível da sua vasculatura podemos observar um

comprometimento da função endotelial, aumento da vulnerabilidade dos sinais

vasoconstritores e resistência vascular à insulina. Apesar disto, várias

evidências propõem que estas consequências não são exatamente iguais para

todos os indivíduos pois nem todos os sistemas vasculares são igualmente

afetados. Jenkins et al. (2014) relataram recentemente que as artérias dos

músculos gastrocnemius e solear apresentam diversas vulnerabilidades na

disfunção endotelial e diferenciam-se nas ações dos vasodilatadores endotélio-

dependente. Outros estudos mostram que a ingestão de uma dieta altamente

calórica resulta num estado de hiperglicemia e de níveis elevados de ácidos

gordos na circulação sanguínea, levando a um estado de stress oxidativo. Com

efeito, o aumento do stress oxidativo no músculo-esquelético pode prejudicar a

função mitocondrial e limitar a capacidade de exercício físico. O dano oxidativo

pode atingir primariamente as mitocôndrias o que poderá fazer com que o ADN

mitocondrial afete a biogénese mitocondrial e, por consequência, induzir

disfunção mitocondrial (Farias et al., 2012).

A este respeito, Boudina et al. (2012) salientam que as adaptações

mitocondriais no músculo-esquelético de animais submetidos a uma dieta rica

em gorduras são complexas e específicas. No entanto, não parece provável

que o stress oxidativo tenha um impacto direto na diminuição da absorção da

glicose mediada pela insulina que caracteriza os estádios inicias da resistência

à insulina. Da mesma forma, os antioxidantes parecem ter um papel limitado na

prevenção primária da resistência à insulina. Por sua vez, a redução da beta-

oxidação mitocondrial é responsável pelo desenvolvimento da resistência à

insulina no músculo-esquelético. Esta resistência à insulina está ainda

associada a uma diminuição da expressão genética dos componentes que

medeiam a fosforilação oxidativa (Boudina et al., 2012; Buchner et al., 2011).

Neste sentido, sendo o músculo-esquelético um tecido heterogéneo constituído

por diferentes tipos de fibras contráteis, é particularmente importante estudar a

fosforilação mitocondrial oxidativa e a glicólise na produção de energia. Os

15

músculos com características mais glicolíticos geram energia por processos

metabólicos essencialmente anaeróbicos, enquanto os músculos mais

oxidativos estão implicados na resistência à fadiga e obtenção de energia a

partir do processo metabólico oxidativo, cuja capacidade é principalmente

determinada pela função mitocondrial e pela biogénese (Gómez-Pérez et al.,

2012). Skovbro, Boushel, Hansen, Helge, (2011) concluíram que o grupo de

ratos alimentado com dieta isocalórica sofreu uma inibição do estado 3 da

resposta respiratória mitocondrial ao nível muscular na presença dos

substratos glicolíticos visto que estes não estavam presentes após estimulação

com ácidos gordos.

Os resultados do estudo de Crescenzo et al. (2015) mostraram que uma

alimentação com alto teor de gordura induz alterações no equilíbrio energético,

fazendo com que haja uma diminuição do gasto de energia despendida e um

aumento de lípidos. Este tipo de alimentação poderá levar a um aumento do

fluxo de lípidos e da eficiência energética no músculo-esquelético, tendo como

consequência principal a redução da oxidação de ácidos gordos e consequente

acumulação de lípidos que poderão desencadear resistência à insulina no

músculo e mais tarde progredir para diabetes tipo 2 (Crescenzo et al., 2015;

Standford & Goodyear, 2014). Desta forma, quando o músculo se encontra em

repouso, as mudanças no número de organelos e/ou na atividade do músculo

podem não ter efeitos negativos na bioenergética celular, enquanto

modificações na eficiência energética mitocondrial farão variar a energia

oxidada pela célula mesmo que o ATP (turnover) não varie (Crescenzo et al.,

2015).

A biogénese mitocondrial pode ser entendida como uma adaptação

vocacionada para neutralizar a quantidade elevada de substrato disponível. De

facto, estudos mostram que uma alimentação rica em gordura induz a

biogénese mitocondrial através do aumento da PGC-1α, principal regulador da

energia metabólica. O aumento dos níveis desta proteína implica um reforço da

capacidade oxidativa do músculo enquanto os níveis de ADN mitocondrial

(ADNmt) apontam para um aumento do conteúdo mitocondrial (Gómez-Pérez et

16

al., 2012; Kang & Ji, 2012; Tadaish et al., 2011). Estas alterações estão

altamente relacionadas com a prática de atividade física, ou a falta desta, pelo

que se torna relevante compreender de que forma o exercício físico pode ser

um fator de prevenção ou de terapia na obesidade.

2.6. Papel do exercício físico na obesidade: stress oxidativo, biogénese

mitocondrial

O exercício físico tem um papel crucial no combate à obesidade, quando

realizado de forma regular, estando associado a uma redução da gordura

abdominal (Ross, Hudson, Stotz, Lam, 2015). Segundo a European Society of

Lifestyle Medicine (2015), a prática semanal de atividade física moderada

contribui para a redução do risco de doença cardíaca isquémica (em 30%),

diabetes (27%), de cancro da mama ou colon (21-25%) reduzindo ainda o risco

de AVC, depressão e hipertensão.

Decorrente da prática regular de exercício, há um aumento do consumo de

oxigénio, tornando-se numa situação favorável à produção de EROs e aparente

aumento do stress oxidativo. Esta produção elevada de EROs é por vezes

associada a efeitos secundários negativos como a redução da capacidade de

gerir força e um aumento da atrofia muscular. De facto, este aumento dos

radicais livres pode causar peroxidação lipídica assim como danos no ADNmt e

em proteínas. No entanto, estudos recentes têm vindo a comprovar que as

EROs também produzem efeitos positivos pois o aumento de EROs vai

influenciar os processos celulares que se relacionam com o aumento da

expressão dos antioxidantes, os quais neutralizam os efeitos dos radicais livres

estando envolvidos na adaptação muscular induzida pelo exercício

(Castrogiovanni & Imbesi, 2012; Steinbacher & Eckl, 2015). Para perceber de

que forma o stress oxidativo aumenta com o exercício, existem marcadores

que sinalizam este aumento e que identificam ocorrência de peroxidação

lipídica e modificação de proteínas. Um dos marcadores utilizados é o MDA

que tem origem na peroxidação dos lípidos e é normalmente medido através da

17

sua reação com o ácido tiobarbitúrico (Stanković & Radovanović, 2012). A Sirt3

é outro dos marcadores utilizados como indicador da ocorrência de stress

oxidativo. Esta proteína tem uma função protetora em diferentes tecidos

nomeadamente no tecido muscular e no tecido cardíaco. Os seus valores

aumentam em situação de exercício de modo a proteger a mitocôndria dos

danos provocados pelas EROs (Bause & Haigis, 2013; Palacios, et al., 2009;

Sundaresan, et al. 2008)

Assim, o aumento do metabolismo aeróbio durante o exercício é

potencialmente uma fonte de stress oxidativo. Uma vez que os benefícios do

exercício na saúde são bem conhecidos, a possibilidade de redução do stress

oxidativo causado pela adaptação à atividade física implica o aumento da

capacidade antioxidante e a redução da formação de radicais durante a

fosforilação oxidativa (Stanković & Radovanović, 2012).

A obesidade aponta para níveis elevados de hiperglicemia o que leva à

produção de EROs na mitocôndria. Quando o gradiente de protões excede o

limiar, a transferência de eletrões no complexo III da cadeia respiratória é

bloqueada, dando-se a formação do ião superóxido. Há uma redução da

capacidade oxidativa e mitocondrial no músculo-esquelético o que está

relacionado com o ganho de peso e a resistência à insulina. Estudos mostram

que o exercício aumenta a atividade oxidativa enzimática bem como um

aumento do número das mitocôndrias, aumento dos antioxidantes e da via

lipolítica (Farias et al., 2012; Menshikova et al., 2007). Hariri e Thibault (2010)

realizaram um estudo com ratos submetidos a dieta gorda e a exercício até à

exaustão. Os resultados mostraram que, em comparação com os ratos com

dieta controlo, atingiram níveis de exaustão mais rapidamente tendo sido ainda

observado um decréscimo do pico de VO2. Os autores mostraram também que

o exercício físico reequilibra estas alterações o que induz um menor ganho de

peso.

A PGC-1α possui um papel fundamental na regulação do metabolismo

energético e está intimamente relacionada com o aumento da biogénese

mitocondrial. Vários estudos comprovam que o treino de endurance está

18

relacionado com o aumento de conteúdo mitocondrial e capacidade respiratória

do músculo-esquelético resultando numa taxa mais lenta de utilização de

glicogénio no músculo e glicose no sangue e, por outro lado, uma maior

dependência da oxidação de gordura e menor acumulação de lactato durante o

exercício (Kang & Ji, 2012; Skovbro et al., 2011). O exercício físico é um fator

fundamental para a regulação da expressão génica da PGC-1α e,

consequente, regulação positiva da biogénese mitocondrial (Kang & Ji, 2012;

Steinbacher & Eckl, 2015). Outros estudos mostram ainda que a PGC-1α

aumenta com o exercício e promove a biogénese mitocondrial e a angiogénese

no músculo, tem o papel de ativar simultaneamente os fatores de transcrição

na resposta às solicitações energéticas resultando na ativação dos genes

nucleares envolvidos na biogénese mitocondrial, nomeadamente na transcrição

mitocondrial da TFAM. No entanto, curiosamente, uma dieta rica em gordura

induz a biogénese mitocondrial músculo-esquelética observando-se um

aumento da PGC-1α e dos níveis da TFAM. (Gómez-Pérez et al., 2012;

Steinbacher & Eckl, 2015; Tadaish et al., 2011).

19

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral

O objetivo fundamental deste estudo foi compreender os mecanismos celulares

(stress oxidativo e biogénese) associados ao potencial efeito protetor do

exercício físico no músculo-esquelético em situação de obesidade.

3.1.1. Objetivos específicos

Pretendeu-se analisar as alterações induzidas pelo exercício crónico realizado

concomitantemente com uma dieta rica em gordura:

- em marcadores de stress oxidativo (SH, MDA, Sirt3, p66Shc);

- em marcadores de biogénese mitocondrial (Tfam e PGC-1α);

- no conteúdo proteico das subunidades dos complexos da CTE.

20

21

4. Metodologia

4.1. Caraterização da Amostra

A amostra foi constituída por 24 ratos Sprague-Dawley macho com 6 semanas

de idade e um peso entre 125-150g. No decorrer do protocolo, os animais

foram mantidos em gaiolas individuais, em biotério e numa atmosfera

controlada (21-22ºC; 50-60% humidade), com comida e água ad libitum, e num

ciclo de 12 horas dia/noite.

Durante as 17 semanas do protocolo experimental, os animais foram

submetidos a dietas isocalóricas com diferentes quantidades de lípidos: dieta

controlo (35% das Kcal derivadas dos lípidos) ou dieta gorda (71% das Kcal

derivadas dos lípidos).

Para se adaptarem à consistência da dieta, todos os animais foram

alimentados com a dieta de controlo liquida durante a primeira semana.

Posteriormente, os animais foram distribuídos aleatoriamente por quatro

grupos:

1) Dieta controlo sedentário (CS, n=6),

2) Dieta controlo e treino aeróbio (CT, n=5),

3) Dieta gorda sedentário (GS, n=6),

4) Dieta gorda e treino aeróbio (GT, n=7)

Após 9 semanas, os grupos CT e GT iniciaram o programa de exercício,

mantendo-se o protocolo das dietas. Semanalmente, procedeu-se à

quantificação do volume de dieta ingerida pelos animais. O consumo

energético por semana foi calculado da seguinte forma: 1 mL =1 Kcal para

ambas as dietas.

22

4.2. Programa de exercício

Os animais submetidos ao protocolo de treino de endurance (CT e GT) foram

adaptados durante a primeira semana à passadeira rolante, 30 minutos a uma

velocidade de 15 m/min-1 e sem inclinação. Posteriormente, os animais

correram 60 minutos a uma velocidade inicial de 15 m/min-1 aumentando

progressivamente até 25 m/min-1, 5 dias por semana, durante 8 semanas.

Durante o protocolo de treino, os animais sedentários (CS e GS) foram

colocados numa passadeira rolante imóvel de forma a expor os animais às

mesmas condições ambientais e de manuseamento (Gonçalves et al., 2014;

Passos et al., 2015).

4.3. Western Blotting

A expressão de proteínas (PGC1α, T-FAM, Sirt3 e P66shc) foi determinada por

Western-blot, utilizando-se quantidades iguais de proteína (50µg) que foram

posteriormente desnaturadas em tampão de lise e separadas por eletroforese

em gel de dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS/PAGE) como descrito por

Laemmli (1970), seguida de uma transferência para uma membrana de

nitrocelulose (Hybond-ECL, Amersham Biosciences). Após a secagem, as

membranas foram bloqueadas com uma solução de 5% (w/v) de leite em pó ou

de BSA em TBST-T. As membranas foram incubadas com o anticorpo primário

(diluição 1:1000) em 1% de leite em pó ou de BSA durante 2 horas à

temperatura ambiente (22-25ºC). Após o período de incubação, as membranas

foram lavadas três vezes e incubadas durante 2 horas com o anticorpo

secundário. A visualização das bandas foi feita através de reagentes

quimioluminescentes ChemiDoc (BioRad Laboratories) o software Image Lab

(BioRad Laboratories) para análise das mesmas.

23

4.4. Procedimentos Estatísticos

O tratamento estatístico dos dados foi realizado recorrendo ao programa

Statistical Package for the Social Sciences (SPSS Inc. version 21.0 para

Windows).

A média e o erro padrão da média foi calculado para todas as variáveis. Na

comparação de médias foi utilizado o teste paramétrico, a ANOVA a dois

fatores de medidas independentes seguida pelo teste à post hoc de Bonferroni.

Em ambos os testes o nível de significância foi estabelecido em 5 %.

24

25

5. Resultados

Na tabela 1 e na figura 1, são apresentados os valores do peso corporal, índice

de massa corporal, assim como o consumo calórico e a distância percorrida

pelos animais no protocolo de exercício. O exercício induziu uma redução do

peso corporal e do índice de massa corporal, independentemente da dieta

utilizada. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas no

consumo da dieta nem na distância percorrida pelos grupos experimentais.

Tabela 1. Características anatómicas e consumo calórico após 17 semanas de tratamento.

CS CT GS GT Valor de p1

Peso corporal (g) 676.8±11.5 559.3±10.0a

684.3±14.2 592.8±7.3c DxT

Índice de massa corporal 0.8 ± 0,02 0.7 ± 0.01a

0.8 ± 0.02

0.7 ± 0.01c DT

Consumo alimentar (Kcal/dia) 84.5 ± 0.8 84.7 ± 1.1 86.2 ± 1.1 84.3 ± 1.2 NS

Os valores são médias ± EPM (n=10). Diferentes letras indicam diferenças significativas entre os grupos:

CS, dieta controlo sedentário; CT, dieta controlo treinado; GS, dieta gorda sedentário; GT, dieta gorda

treinado. 1Significativo (p<0,05), efeito da dieta (D), do treino (T), interação entre dieta e treino (DxT) ou a

ausência de diferenças (NS); a vs. CS; b vs. CT; c vs. GS; d vs. GT.

Figura 1. Distância percorrida no tapete rolante por semana.

Adaptado de: Gonçalves, Passos, Rocha-Rodrigues, Torrella, et al. (2014, p.3).

26

Após 17 semanas, os animais sedentários alimentados com dieta gorda

apresentaram um aumento do conteúdo de Sirt 3, assim como dos grupos tióis

(figura 2). Todavia, o treino de endurance apenas reverteu as alterações

induzidas na Sirt 3 (GS vs. GT). Não foram observadas diferenças no marcador

de peroxidação lipídica (MDA) nem na expressão da P66Shc.

27

Na figura 3, encontram-se representados alguns marcadores de biogénese

mitocondrial (PGC-1α e Tfam) e a expressão dos complexos mitocondriais.

Como é possível observar, a dieta rica em gordura aumentou o conteúdo da

proteína PGC-1α, assim como a subunidade do complexo III mitocondrial nos

animais sedentários (GS vs. CS). O exercício por um lado, aumentou a

expressão do complexo IV mitocondrial e, por outro lado, diminuiu a expressão

do complexo III nos animais obesos (GT vs. GS).

28

29

6. Discussão

O estilo de vida ocidental, caracterizado por dietas hipercalóricas ricas em

gordura e sedentarismo, tem sido descrito como a causa primária para o

desenvolvimento de várias doenças metabólicas (Willett et al., 2006). Com

efeito, alterações destes fatores de risco são aceites como as principais

estratégias na prevenção de patologias crónicas como a obesidade, diabetes e

cancro (Willett et al., 2006). Em particular, estudos têm demonstrado que o

exercício físico possui um papel fundamental na modelação de mecanismos

intracelulares e sistémicos (Gonçalves et al., 2014; Gonçalves et al., 2015)

nomeadamente a nível da funcionalidade mitocondrial (Gonçalves et al., 2014)

e da resistência à insulina (Ross et al., 2004). Considerando o papel do

músculo-esquelético na regulação da glucose sanguínea e o envolvimento da

mitocôndria na utilização e produção energética, procuramos neste estudo

compreender o efeito do exercício nas alterações celulares (stress oxidativo e

biogénese) do músculo-esquelético induzidas pela obesidade. Os resultados do

presente estudo mostraram que a obesidade estimulou alguns mecanismos

associados a um aumento da proteção contra o stress oxidativo e a um maior

consumo energético (PGC-1α, CIII). Por outro lado, o exercício crónico parece

ter contribuído para uma melhor funcionalidade tecidual observada pelo

aumento da expressão da subunidade do complexo IV mitocondrial.

Stress oxidativo e Biogénese na “obesidade muscular”

O stress oxidativo é descrito como um desequilibro entre a produção de

espécies reativas de oxigénio (EROs) e as defesas antioxidantes a favor da

primeira (Halliwell et al., 1994). Esta alteração da homeostasia redox poderá

ocorrer devido ao aumento do fluxo de eletrões ou a um comprometimento da

cadeia transportadora, com consequências deletérias para alguns dos

componentes celulares (proteínas, lípidos e ácido nucleicos) (Begriche et al.,

2006). Na obesidade, estudos em humanos e modelos animais têm

demonstrado um aumento dos marcadores de stress oxidativo (Banse et al.,

30

2015; Bonnard et al., 2008; SamJoo et al., 2013) e uma diminuição das defesas

antioxidantes no músculo-esquelético (Banse et al., 2015 & Pimenta et al.,

2015). Todavia, os resultados do presente estudo parecem contrariar os dados

da literatura, na medida em que observamos um aumento dos grupos tióis e do

conteúdo de Sirtuina 3, ambos compatíveis com a melhoria da antioxidante nos

animais obesos (GS vs. CS). De facto, a expressão da Sirtuina 3 no músculo

tem sido descrita como determinante no controlo da produção de ROS e

consequentemente da energia (Jing et al., 2011; Lin et al., 2014). Num estudo

desenvolvido com ratinhos knockout para Sirt3, Jing et al. (2011) observaram

um aumento do stress oxidativo e uma diminuição do consumo de oxigénio

mitocondrial nestes animais. Adicionalmente, Lin et al. (2014) utilizando um

modelo genético com expressão muscular da isoforma Sirt3 (SIRT3M3),

verificaram que estes animais apresentavam um aumento do dispêndio

energético comparativamente com os controlos. Com efeito, o fenótipo protetor

aparentemente observado nos animais obesos poderá constituir uma estratégia

defensiva/adaptativa, no sentido de procurar aumentar o dispêndio energético,

reduzindo-se o “leakage” de eletrões na CTE e, por conseguinte, a produção de

EROs nesta patologia.

Segundo alguns autores o exercício crónico contribui para a tolerância

cruzada em relação a estímulos indutores de stress oxidativo adicional, como

por exemplo a obesidade e diabetes (Nojima et al., 2008; Oh et al., 2013).

Neste sentido, seria expectável que o exercício induzisse adaptações positivas

nos marcadores de oxidação proteica (SH), peroxidação lipídica (MDA) ou de

algumas proteínas pro-oxidantes (Sirt3 e P66Shc). Os resultados do presente

estudo parecem, contudo, contrariar esta premissa verificando-se uma maior

oxidação dos grupos tiol e uma redução da expressão da proteína Sirt3 no

grupo GT. Todavia, estudos anteriores em tecidos não contrateis têm

igualmente demonstrado o aumento de marcadores de stress oxidativo com o

exercício regular (Ascensão et al., 2012; Gonçalves et al., 2014), tendo sido

sugerido que outros mecanismos anti-pro-oxidantes poderão ser estimulados

pelo exercício, nomeadamente aqueles associados à glutationa (Navarro et al.,

2004; Sun et al., 2010). Neste sentido, outros marcadores deverão ser

31

analisados em trabalhos futuros, para melhor descrever o papel do exercício na

modelação do stress oxidativo muscular. Recentemente, Strobel et al. (2014)

demonstraram ainda que a depleção da glutationa muscular, conjuntamente

com o exercício agudo (indutor de stress) parece ter uma importante função na

regulação da PGC-1α e, consequentemente, na biogénese mitocondrial. No

presente estudo observamos que os animais obesos apresentavam um

aumento da PGC-1α, o que parece sugerir uma estimulação da biogénese

mitocondrial. Este resultado é corroborado por Gomez-Perez et al. (2012),

segundo os quais a PGC-1α muscular poderá aumentar em situações de

obesidade, como uma estratégia compensatória da disfunção mitocondrial.

Para além disto, um aumento do número de mitocôndrias poderá estimular a

produção de energia com recurso aos ácidos gordos, promovendo um aumento

do dispêndio energético. No entanto, importa referir que outros estudos têm

sugerido uma diminuição do conteúdo de mitocôndrias musculares na

obesidade por comprometimento da síntese de novos organelos (Andersen et

al., 2005; Crunkhorn et al., 2007; Sparks et al., 2005). Apesar das alterações

observadas na PGC-1α e considerando a importância da biogénese

mitocondrial muscular no controlo energético, não foram observadas diferenças

no conteúdo de Tfam. Este resultado parece estar de acordo com o estudo de

Goto et al. (2001) que sugere a ocorrência da transcrição mitocondrial sem

uma intervenção significativa da Tfam. Para além de uma função reguladora na

biogénese, a PGC-1α apresenta igualmente um papel central no controlo da

formação de EROS (St-Pierre et al., 2003; St-Pierre et al., 2006; Vale et al.,

2005), uma vez que um aumento do volume mitocondrial permitirá dissipar a

força protomotriz, reduzindo a probabilidade de formação de ROS. De acordo

com St-Pierre et al. (2003), os animais knockout para a PGC-1α apresentam

uma maior suscetibilidade para estímulos indutores de stress. Deste modo, a

diminuição da oxidação de grupos tióis no grupo alimentado com dieta gorda

(GS), poderá ser também o resultado do aumento da expressão da PGC-1α.

Apesar do exercício crónico ser descrito como um indutor de biogénese

muscular (Hood et al., 2009; Hood et al., 2011), observamos uma diminuição

significativa no conteúdo da PGC-1α. Todavia, este resultado não é

32

completamente surpreendente, uma vez que alguns autores (Leick et al., 2008)

sugerem que a PGC-1α poderá não ser essencial para a síntese de

determinados genes/proteínas mitocondriais (citocromo c e citocromo oxidase).

Este facto, poderá justificar o aumento do conteúdo da subunidade do

complexo IV mitocondrial na ausência de um aumento simultâneo da PGC-1α

no grupo GT. O aumento da expressão dos complexos mitocondriais (CIII) foi

igualmente observado nos animais obesos sedentários, o que parece estar de

acordo com o estudo de Jain et al. (2014), no qual é demostrado que a

obesidade de origem genética ou nutricional induz um aumento dos complexos

da cadeia respiratória, com concomitante aumento da biogénese mitocondrial,

provavelmente numa tentativa de aumentar a oxidação de ácidos gordos e, por

outro lado, de reduzir a produção de ROS.

Em suma, o aumento da biogénese mitocondrial observado nos animais

obesos (GS), poderá ser interpretado como estratégia protetora no sentido de

atenuar uma condição pro-oxidante através da utilização dos ácidos gordos

como substrato energético. O exercício parece ter um efeito positivo na

modelação do conteúdo do complexo IV mitocondrial, uma vez que o aumento

da sua expressão está associado a uma melhoria da capacidade oxidativa

mitocondrial (Larsen et al., 2012).

33

7. Conclusões

Após a análise do efeito do exercício crónico realizado concomitantemente com

uma dieta rica em gordura em marcadores de stress oxidativo e biogénese

mitocondrial parece-nos possível retirar as seguintes conclusões:

I) A obesidade induziu um aumento da biogénese mitocondrial (PGC-

1α), o que se traduziu em melhorias no ambiente pro-oxidante

(grupos tiol e Sirt3).

II) A obesidade induziu um aumento do conteúdo do complexo III

mitocondrial o que poderá ter contribuído igualmente para uma

redução da pressão redox (tiol e Sirt3).

III) O exercício crónico induziu um aumento do conteúdo proteico das

subunidades do complexo IV mitocondrial, contribuindo para uma

melhoria da oxidação mitocondrial dos substratos energéticos e

assim para uma redução da pressão redox induzida pelo tempo de

redução dos complexos mitocondriais.

34

35

8. Referências Bibliográficas

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