Efeito do extracto de folhas de Ginkgo biloba em células HepG2 … · 2013. 11. 29. · aumento do dano oxidativo no DNA, nas concentrações 1 e 1,5 µM, após 4 horas de incubação

UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO

Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica

Efeito do extracto de folhas de Ginkgo biloba em

células HepG2 tratadas com Paraquato.

Sandra Cristina Machado da Silva

Vila Real, 2012

UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO

Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica

Efeito do extracto de folhas de Ginkgo biloba em

células HepG2 tratadas com Paraquato.

Sandra Cristina Machado da Silva

Vila Real, 2012

II

Júri de Apreciação

Presidente: ______________________________________________

1º Vogal: _______________________________________________

2º Vogal: _______________________________________________

Classificação: ____________________________________________

Data: __/__/____

III

A Orientadora

Prof. Doutora Isabel O’Neill M. Gaivão

Departamento de Genética e Biotecnologia

UTAD

A Co-orientadora

Prof. Doutora Fernanda Leal

Departamento de Genética e Biotecnologia

UTAD

IV

“Para ser grande, sê inteiro: nada

Teu exagera ou exclui.

Sê todo em cada coisa. Põe quanto és

No mínimo que fazes.

Assim em cada lago a lua toda

Brilha, porque alta vive.”

Fernando Pessoa

V

Agradecimentos

Ao finalizar esta etapa da minha vida resta-me apenas agradecer a todos os que me

ajudaram a conseguir alcançá-la.

À Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro em nome do Professor Doutor

Carlos Alberto Sequeira, Reitor da UTAD, pelas facilidades concedidas na realização

deste trabalho.

Ao Coordenador do 2º Ciclo de Genética Molecular, Comparativa e Tecnológica, em

nome do Professor Doutor Valdemar Pedrosa Carnide, pelas facilidades na

realização deste trabalho e pela disponibilidade para esclarecimentos.

À Professora Doutora Isabel Gaivão, minha orientadora, por todo o apoio e incentivo

que me deu ao longo deste ano.

À Professora Doutora Fernanda Leal, minha co-orientadora, por todos os conselhos

sábios dados na altura certa. Agradeço toda a compreensão, simpatia, companhia e

disponibilidade.

Ao laboratório de Biologia Celular e Bioenergética do Departamento de Biologia e

Ambiente da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, na pessoa da

Professora Doutora Amélia Maria Silva, por todo o apoio e disponibilidade que me

foram concedidos e pelo conhecimento científico que me foi transmitido. Muito

obrigada!

Ao Instituto Dr. Ricardo Jorge (Porto), na pessoa do Dr. João Paulo Teixeira, por

sempre tão simpática e prontamente se ter disponibilizado a receber-me.

Ao Jorge Soares não há palavras para agradecer porque muitíssimo obrigada é muito

pouco!

Aos meus Avós Luís Machado e Otília Martins por serem os responsáveis pela

realização do meu sonho. Agradeço-vos toda a ajuda que me deram e todos os

conselhos e experiência de vida que partilharam comigo. Estou-vos muito grata por

tudo! Avó, serás sempre para mim o maior exemplo de dignidade que alguma vez

VI

poderei ter! Eras a pessoa com que mais desejava partilhar este momento, mas sei que,

onde quer que estejas, estás feliz por mim.

À minha Mãe por me ter ajudado a ultrapassar esta etapa da minha vida que em muitos

momentos não foi nada fácil. Obrigado por seres a melhor mãe do Mundo e por seres

minha!

Ao meu Pai pelos conselhos sábios que me dá, por me amar e por ser o melhor Pai do

Mundo! Obrigada por tudo!

À minha Irmã Ana por estar sempre presente. És a pessoa que eu mais amo no Mundo!

A todos os Amigos nomeadamente: Tânia Lopes, Jorge Ferreira, Mónica Batista,

Leandro Costa, por terem sido verdadeiros amigos. Muito obrigado por tudo o que me

deram: pelas folias, pela compreensão, por tentarem manter-me sempre animada e

confiante em alturas de desespero. Obrigada pelas vivências que partilhamos e por todos

os momentos que passamos juntos.

Ao Cazé Pinto por ser o melhor namorado do Mundo. Obrigado por acreditares em

mim, muitas vezes mais que eu própria!

Aos Colegas de Mestrado, pelo companheirismo, sempre com uma palavra amiga e um

sorriso.

A todos que não referi aqui, mas que tiveram do meu lado ao longo deste trabalho, o

meu muito obrigado a todos.

VII

Resumo

O extracto de folhas de Ginkgo biloba L. é um dos fármacos de origem vegetal mais

vendido no Mundo. Relativamente a este extracto o presente trabalho estudou a sua

genotoxicidade/antigenotoxicidade e esclarecer se este detém um efeito quimioprotector

contra os danos induzidos pelo agente indutor de espécies reactivas de oxigénio (ROS),

o Paraquato (PQ), usando a versão alcalina do Ensaio do Cometa para medir as quebras

de cadeia de DNA basais e medir as 8-oxoguaninas e outras purinas alteradas (sítios

FPG) pela incubação com formamidopirimidina DNA glicosilase (FPG). O PQ é um

herbicida que origina a produção de ROS dentro das células e tem sido apontado como

um factor relevante no desenvolvimento da doença de Parkinson. Neste estudo analisou-

se a sua genotoxicidade e pretendeu-se contribuir para o estabelecimento de um

protocolo alternativo aos métodos usados para a indução de danos oxidativos.

O efeito de diferentes concentrações de Paraquato (1; 1,5; 2 e 5 µM) foi testado em

células HepG2. Diferentes concentrações de extracto vegetal (0,5; 5 e 10 g/L) foram

testadas sozinhas ou combinadas com Paraquato (1 e 1,5 µM), ao longo do tempo (de

uma a 24 horas de incubação), de modo a avaliar o efeito mutagénico/antimutagénico

deste extracto vegetal.

A incubação das células HepG2 com o extracto vegetal (10 g/L) durante uma hora

aumentou os danos no DNA (quebras de cadeia e dano oxidativo), provavelmente

devido aos ácidos ginkgólicos presentes no extracto bruto. A incubação com 0,5 g/L ao

longo do tempo (uma, 4 e 24 horas) indicou que, 4 horas após a incubação das células

HepG2, o dano é sobretudo oxidativo. Os tratamentos com Paraquato conduziram a um

aumento do dano oxidativo no DNA, nas concentrações 1 e 1,5 µM, após 4 horas de

incubação. O pré-tratamento de 24 horas das células HepG2 com Ginkgo biloba L. (0.5

e 5 g/L), antes do tratamento com PQ (1 e 1,5 µM, durante 1 hora), aumentou o dano

oxidativo no DNA, revelando, ao contrario do que seria de esperar, efeitos genotóxicos

quando usado nesta concentração e tempo.

Palavras-chave: Ginkgo biloba L., Paraquato; HepG2; Ensaio do Cometa.

VIII

Abstract

Ginkgo biloba L. leaf extract is one of the most widely used nutritional supplements in

the world. The aim of this work was to study the genotoxic/antigenotoxic effect of the

Ginkgo biloba L in HepG2 cells, and testify the protective effect of this extract against

damage induced by the potent reactive oxygen species (ROS) inducer Paraquat (PQ),

using the alkaline comet assay to measure basal DNA strand breaks (SBs) and to

measure 8-oxoguanines and other altered purines (FPG sites) by incubation with

formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG). PQ is an herbicide that produces ROS

inside the cells and it has been appointed as a relevant factor in the development of

Parkinson’s disease. In this study we analyzed its genotoxicity and it was intended to

contribute to the establishment of an alternative protocol to the methods used for the

induction of oxidative damage.

The effect of different concentrations of PQ (1; 1.5; 2 and 5 µM) was tested on HepG2

cells. Different concentrations of plant extract (0.5; 5 and 10 g/L) have been tested alone

and combined with PQ (1 and 1.5 M), over time (from 1 h to 24 h of incubation), to

evaluate the mutagenic/antimutagenic effect of plant extract.

Incubating HepG2 cells with plant extract (10 g/L) for 1 h increased the DNA damage

(strand breaks and oxidative damage), probably due to ginkgolic acids present in crude

extract. Incubation with 0.5 g/L over time (1, 4 and 24 h) indicated that, at 4 h after

HepG2 cells incubation, the damage is mainly oxidative. PQ treatment leads to an

increasing of the oxidative DNA damage, at concentration of 1 and 1.5 µM, after 4 h of

incubation. A 24 h pre-treatment of HepG2 cells with Ginkgo biloba L. (0.5 and 5 g/L),

before PQ treatment (1 and 1.5 µM, for 1 h), increased the oxidative DNA damage,

revealing, in contrast to the expectations, its genotoxic effects when used at this

concentration and time.

Keywords: Ginkgo biloba L.; Paraquat; HepG2; Comet assay.

IX

Índice Geral

Agradecimentos ................................................................................................................ V

Resumo .......................................................................................................................... VII

Abstract ......................................................................................................................... VIII

Índice Geral .................................................................................................................... IX

Índice de Figuras ............................................................................................................ XI

Índice de Quadros ........................................................................................................ XIV

Índice de Tabelas ......................................................................................................... XIV

Lista de abreviaturas e símbolos .................................................................................. XVI

1. Introdução.................................................................................................................. 1

1.1 Espécies Reactivas de Oxigénio e Stresse Oxidativo ........................................ 1

1.1.1. Espécies reactivas de oxigénio: o seu local de produção e sua reactividade

2

1.1.2. Defesas Celulares Contra Espécies Reactivas de Oxigénio ....................... 4

1.1.3. Consequências in vivo da geração de radicais livres de oxigénio .............. 7

1.2. Ginkgo biloba .................................................................................................. 12

1.3. Linha Célular HepG2 ....................................................................................... 18

1.4. Ensaio do Cometa ............................................................................................ 19

1.5. Paraquato (PQ) ................................................................................................. 21

2. Objectivos................................................................................................................ 24

3. Material e Métodos.................................................................................................. 25

3.1. Material Biológico ........................................................................................... 25

3.2. Meios de Cultura e Soluções ........................................................................... 25

3.2.1. Meio de cultura completo ......................................................................... 25

3.2.2. Meio de cultura sem soro.......................................................................... 26

3.2.3. Soluções .................................................................................................... 26

X

3.3. Extracto de folhas de Ginkgo biloba ................................................................ 27

3.4. Preparação da solução stock de Paraquato ...................................................... 28

3.5. Desagregação das células HepG2 com tripsina ............................................... 28

3.6. Contagem das células ....................................................................................... 28

3.7. Avaliação da genotoxicidade e citoprotecção em células HepG2: Ensaio do

Cometa ........................................................................................................................ 29

3.7.1. Procedimento ............................................................................................ 29

4. Resultados ............................................................................................................... 34

4.1. Avaliação do efeito do extrato de Ginkgo biloba no DNA .............................. 35

4.2. Avaliação do efeito genotóxico do Paraquato ................................................. 37

4.3. Avaliação do efeito do extracto de Ginkgo biloba em células HepG2 tratadas

com Paraquato ............................................................................................................. 42

5. Discussão ................................................................................................................. 47

6. Conclusões .............................................................................................................. 56

7. Bibliografia.............................................................................................................. 61

XI

Índice de Figuras

Figura 1: Produção e reparação enzimática de resíduos 8-oxoguanina no DNA (Fonte:

Adaptado de Nash et al, 1996). ............................................................................... 11

Figura 2: Visão global do mecanismo das espécies reactivas de oxigénio e o mecanismo

de lesão oxidativa de tecidos que conduz a condições patológicas (Fonte: Adaptado

de Bandyopadhyay et al, 1999). .............................................................................. 12

Figura 3: Estrutura de cinco ginkgolides e do bilobalide (Fonte: Stromgaard e

Nakanishi, 2004). .................................................................................................... 14

Figura 4: Fórmula de estrutura do Paraquato. ................................................................ 21

Figura 5: Formação de radicais livres na célula aumentada via exposição ao Paraquato

com consequente peroxidação lipídica (Fonte: Adaptado de Bus et al, 1975 citado

por Schmitt et al, 2006). .......................................................................................... 23

Figura 6: Imagens de ensaios do cometa realizados em células HepG2 após a coloração

do seu DNA com Brometo de Etídeo. A) Experiência controlo em que as células

não foram sujeitas a nenhum tratamento – a inexistência de cauda demonstra os

baixos níveis de danos no DNA das células HepG2 utilizadas; B, C e D) Danos no

DNA resultantes da incubação das células com diferentes tratamentos; B)

Paraquato 1 µM (4 horas); C) Extracto de Ginkgo biloba 0,5 g/L (4 horas) e D)

Extracto de Ginkgo biloba 0,5 g/L (24 horas) + Paraquato 1,5 µM (1 hora). Ensaios

com tratamento enzimático FPG. Exemplos ilustrados com setas. Todas as imagens

foram obtidas numa ampliação de 400 vezes. ......................................................... 34

Figura 7: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com diferentes concentrações do

extracto de folhas de Ginkgo biloba (g/L) durante uma hora. Para cada tratamento

foram feitos ensaios com e sem tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos

de DNA é expressa em percentagem (%) de DNA na cauda. Os valores de média e

desvio padrão foram obtidos a partir da análise dos cometas obtidos em quatro géis

(letras iguais indicam diferenças significativas). .................................................... 35

Figura 8: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Ginkgo biloba 0,5 g/L ao longo

do tempo (0, 1, 4 e 24 horas). Para cada tratamento foram feitos ensaios com e sem

tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em

XII

percentagem (%) de DNA na cauda. Os valores de média e desvio padrão foram

obtidos a partir da análise dos cometas obtidos em quatro géis (letras iguais

indicam diferenças significativas). .......................................................................... 37

Figura 9: Dano no DNA em células HepG2 tratadas com diferentes concentrações de

Paraquato (µM) durante 30 minutos. Para cada tratamento foram feitos ensaios com

e sem tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em





Paraquato (µM) durante uma hora. Para cada tratamento foram feitos ensaios com e

sem tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em




Figura 11: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1 µM ao longo do

tempo (0, 5 e 30 minutos, 1, 4 e 24 horas). Para cada tratamento foram feitos

ensaios com e sem tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é

expressa em percentagem (%) de DNA na cauda. Os valores de média e desvio

padrão foram obtidos a partir da análise dos cometas obtidos em quatro géis (letras

iguais indicam diferenças significativas). ............................................................... 40

Figura 12: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1,5 µM ao longo do

tempo (0, 5 e 30 minutos, 1, 4 e 24 horas). Para cada tratamento foram feitos

ensaios com e sem tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é




Figura 13: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1 µM durante uma

hora após uma pré-incubação das células com Gb 0,5 g/L (24 horas). Apresentam-

se valores de dano com e sem a enzima FPG. A avaliação dos danos de DNA é


XIII



Figura 14: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1,5 µM durante

uma hora após uma pré-incubação das células com Gb 0,5 e 5 g/L (24 horas).

Apresentam-se valores de dano com e sem a enzima FPG. A avaliação dos danos

de DNA é expressa em percentagem (%) de DNA na cauda. Os valores de média e

desvio padrão foram obtidos a partir da análise dos cometas obtidos em quatro géis

(letras iguais indicam diferenças significativas). .................................................... 44

Figura 15: Comparação entre o dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato

(1 e 1,5 µM) durante uma hora com uma pré-incubação das células com Gb 0,5 g/L

(24 horas) e a adição conjunta de Paraquato e Gb 0,5 g/L às células durante uma

hora. Apresentam-se valores de dano com e sem a enzima FPG. A avaliação dos

danos de DNA é expressa em percentagem (%) de DNA na cauda. Os valores de

média e desvio padrão foram obtidos a partir da análise dos cometas obtidos em

quatro géis (letras iguais indicam diferenças significativas). .................................. 46

XIV

Índice de Quadros

Quadro 1: Principais espécies reactivas de oxigénio e o seu metabolismo (Fonte:

Nordberg e Arnér, 2001). .......................................................................................... 8

Quadro 2: Enzimas metabolizadoras de xenobióticos presentes em células humanas

HepG2 (Adaptado de Knasmuller et al, 1998). ....................................................... 19

Quadro 3: Plano de preparação das células para o ensaio do cometa............................. 30

Índice de Tabelas

Tabela 1: Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito da adição de

concentrações crescentes de extracto de Ginkgo biloba (g/L) a células HepG2

durante 1 hora. ......................................................................................................... 36

Tabela 2: Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito do tempo de

exposição das células HepG2 ao extracto de Ginkgo biloba 0,5 g/L (em horas). ... 37


concentrações crescentes de Paraquato (µM) a células HepG2 durante 30 minutos.

................................................................................................................................. 38


concentrações crescentes de Paraquato (µM) a células HepG2 durante 1 hora. ..... 39

Tabela 5 Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito do tempo de

exposição das células HepG2 ao Paraquato 1 µM. ................................................. 40

Tabela 6 Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito do tempo de

exposição das células HepG2 ao Paraquato 1,5 µM. .............................................. 42


Ginkgo biloba 0,5 g/L às células HepG2 24 horas antes da adição de Paraquato 1

µM durante uma hora. ............................................................................................. 43

XV


Ginkgo biloba 0,5 e 5 g/L às células HepG2 24 horas antes da adição de Paraquato

1,5 µM durante uma hora. ....................................................................................... 45


Ginkgo biloba 0,5 g/L 24 horas antes da adição de Paraquato (1 e 1,5 µM) e da sua

adição conjunta (durante uma hora) às células HepG2. .......................................... 46

XVI

Lista de abreviaturas e símbolos

·OH Radical hidroxilo

8-oxoGua 8-oxo-7, 8 desidro-2’-desoxiguanosina

ATP Adenosina-trifosfato

BB Bilobalide

BE Brometo de etídio

BER Reparação por excisão de base (Base Excison Repair)

CO2 Dióxido de carbono

Cu Cobre

Cu/Zn-SOD Superóxido dismutase Cobre-zinco

CYP Citocromo P

dGTP Desoxiguanina trifosfato

DMEM Dulbeco’s Modified Eagles Medium (Meio de cultura)

DNA Ácido desoxirribonucleico

e-

Electrão

EGb761 Extracto de Ginkgo biloba padrão

Fe Ferro

FPG Formamidopirimidina-DNA-glicosilase

GA Ginkgolide A

Gb Ginkgo biloba

GB Ginkgolide B

GlyRs Receptores da glicina

GPx Glutationa Peroxidase

GSH Glutationa reduzida

GSSG Glutationa oxidada

H+

Ião hidrogénio

XVII

H2O Água

H2O2 Peróxido de hidrogénio

HepG2 Linha celular derivada de carcinoma hepatocelular

HOCl Ácido hipocloroso

LMP Agarose de baixo ponto de fusão (Low Melting Point)

Mn-SOD Superóxido dismutase de manganês

NADH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (reduzida)

NMP Agarose de normal ponto de fusão (Normal Melting Point)

O2 Oxigénio molecular

O2-

Radical superóxido

ºC Graus Celsius

PAF Factor de agregação plaquetária

PBR Receptores benzodiazepínicos periféricos

PBS Tampão fosfato salino

PQ Paraquato

Prx Peroxirredoxinas

RNA Ácido ribonucleico

RO· Radicais alcoxi

ROO· Radicais peróxidos

ROOH Hidroperóxido

ROS Espécies reactivas de oxigénio (Reactive Oxygen Species)

Sítio AP Lesão apurínica/apirimidínica

SOD Superóxido dismutase

SS Quebras de DNA de cadeia simples

UV Radiação ultravioleta

1

1. Introdução

Desde que o stresse oxidativo foi considerado como o principal factor que conduz ao

envelhecimento e às doenças neurodegenerativas relacionadas com a idade (Ames et al,

1993), as terapias antioxidantes adequadas para controlar estes processos têm sido alvo

de uma atenção especial a nível mundial. O isolamento de um factor antioxidante não

tóxico proveniente de fontes naturais seria uma das melhores abordagens para o controle

da patogenese mediada por espécies reactivas de oxigénio (Bandyopadhyay et al, 1999).

1.1 Espécies Reactivas de Oxigénio e Stresse Oxidativo

O oxigénio é vital para os processos de vida aeróbia. Os organismos aeróbios utilizam o

oxigénio molecular (O2) para a respiração ou para a oxidação de nutrientes de modo a

obter energia. No entanto, cerca de 5% desse O2 é convertido em espécies reactivas de

oxigénio (ROS), designadamente o radical superóxido (O2-), o peróxido de hidrogénio

(H2O2) e o radical hidroxilo (·OH) (Cabiscol et al, 2000; Bandyopadhyay et al, 1999).

As espécies reactivas de oxigénio formam-se principalmente devido à “fuga” de

electrões da cadeia transportadora na mitocôndria. A exposição a radiação ionizante,

radiação ultravioleta (UV), drogas quimioterapeuticas e toxinas ambientais induz uma

sobreprodução de espécies reactivas de oxigénio (Salmon et al, 2004).

O stresse oxidativo surge quando a concentração de oxigénio activo aumenta para um

nível que excede a capacidade de defesa da célula. O stresse oxidativo, através de uma

série de eventos, desregula as funções celulares podendo conduzir a várias condições

patológicas, incluindo disfunções cardiovasculares, doenças neurodegenerativas,

patogenese gastroduodenal, disfunções metabólica, cancro e envelhecimento prematuro.

O stresse oxidativo atinge, como alvos biológicos, os ácidos nucleicos (DNA e RNA),

as proteínas e os lípidos (Cabiscol et al, 2000; Bandyopadhyay et al, 1999).

Até determinado nível, a presença de espécies reactivas de oxigénio é fundamental para

a célula e para o organismo visto que desempenham duas funções principais: defesa

contra infecções e regulação redox da actividade dos factores de transcrição.

2

Quando os fagócitos são activados produzem ROS em quantidade suficiente para

eliminar o agente infeccioso. Nesta situação o complexo NADPH oxidase converte o O2

em O2-. O superóxido é posteriormente reduzido pela enzima superóxido dismutase

(SOD) a H2O2 que é depois convertido em ácido hipocloroso (HOCl) e

espontaneamente origina-se o radical hidroxilo. Estas espécies reactivas de oxigénio são

tóxicas para as bactérias captadas pelos fagócitos. O ácido hipocloroso destrói a ligação

do DNA à membrana, pondo fim à replicação bacteriana (Nordberg e Arnér, 2001).

As espécies reactivas de oxigénio podem também afectar directamente a conformação

e/ou a acção de todas as moléculas que contenham sulfidril através da oxidação deste

grupo (-SH). Este tipo de regulação redox afecta muitas proteínas importantes na

transdução de sinal, enzimas e receptores de membrana. Para muitos factores de

transcrição as ROS funcionam como mediadores fisiológicos do controlo da transcrição

(Nordberg e Arnér, 2001).

1.1.1. Espécies reactivas de oxigénio: o seu local de produção e sua reactividade

O O2 sofre redução num processo sequencial univalente formando-se vários

intermediários, tais como o superóxido, o peróxido de hidrogénio e o radical hidroxilo

que colectivamente são denominados como espécies reactivas de oxigénio (ROS)

(Bandyopadhyay et al, 1999).

O2 (e-) O2- (e-) H2O2 (e-) ·OH (e-) H2O

A redução do O2 é limitada pela enzima citocromo oxidase da cadeia mitocôndrial de

transporte de electrões, que reduz o O2 a H2O sem libertar qualquer O2- ou H2O2.

O2 + 4H+

+ 4e- 2H2O

No entanto, o O2- é sistematicamente produzido na respiração celular (Fridovich, 1983)

devido à "fuga" de um electrão num local específico da cadeia de transporte de electrões

da mitocôndria, resultando numa inadequada redução de electrão único do oxigénio a

O2- (Chance et al, 1979 citado por Bandyopadhyay et al, 1999; Loschen et al, 1974)

3

As células fagocíticas, quando activadas durante a fagocitose, dão origem a O2- e H2O2

através da activação da NADPH oxidase. A dismutação espontânea de O2- em pH neutro

ou a dismutação pela enzima superóxido dismutase resulta na produção de H2O2


Exceptuando episódios de exposição anormal a radiação ionizante, a geração de ·OH in

vivo exige a presença de quantidades vestigiais de metais de transição como o ferro ou o

cobre. A simples mistura de H2O2 e sais de Fe2+

dá origem a ·OH (reacção de Fenton).

Fe2+

+ H2O2 Fe3+

+ ·OH + OH-

Vestígios de Fe3+

podem também reagir com o H2O2.

Fe3+

+ H2O2 Fe2+

+ O2– + H

+

A geração de ·OH pode também ter origem na reacção de duas espécies reactivas de

oxigénio.

O2–

+ H2O2 OH– + ·OH + O2.

A constante de velocidade desta reacção é muito baixa, mas pode ser aumentada se for

catalisada por vestígios de iões de metais de transição - reacção de Haber-Weiss

(Halliwell e Gutteridge, 1984).

Fe3+

+ O2– Fe

2+ + O2

Fe2+

+ H2O2 Fe3+

+ ·OH + OH-

____________________________________________

O2– + H2O2 (sal de ferro) O2 + ·OH + OH

-

Tanto o ferro como o cobre existem nos sistemas biológicos ligados a proteínas,

membranas, ácidos nucleicos ou agentes quelantes (Halliwell e Gutteridge, 1984). No

entanto, durante uma situação extraordinária de isquemia e acidose celular, por

exemplo, os iões destes metais são libertados de algumas metaloproteínas

(Bandyopadhyay et al, 1999; Chevion et al, 1993; Biemond et al, 1984).

4

O O2- mostra uma elevada reactividade em ambientes hidrofóbicos, mas uma baixa

reactividade em soluções aquosas. Devido ao seu estado de carga, o O2- não pode

atravessar as membranas biológicas, com excepção da membrana dos eritrócitos, que

possui um canal de aniões, que auxilia a sua passagem. Uma acção deletéria indirecta do

O2- é a sua dismutação a H2O2, que é sensível à catalase. Num sistema livre de metais de

transição, o H2O2 mostra uma toxicidade limitada. No entanto, o seu elevado tempo

médio de vida e o facto de ser semipermeável às membranas conferem-lhe a capacidade

de se difundir até uma distância considerável do seu local de geração. Pelo contrário, o

·OH é extremamente reactivo tendo um tempo de meia vida muito curto e uma

capacidade de difusão muito limitada. Este radical ataca e danifica quase todas as

moléculas que se encontrem na sua proximidade. Assim, a extensão dos danos às

células pelo O2- e pelo H2O2 aumenta na presença de iões de metais de transição, devido

à geração do radical mais poderoso o ·OH (Bandyopadhyay et al, 1999).

1.1.2. Defesas Celulares Contra Espécies Reactivas de Oxigénio

O aparecimento do oxigénio na atmosfera acarretou o desenvolvimento de mecanismos

de defesa celular que mantêm a concentração de radicais derivados do O2 em níveis

toleráveis e que reparam os danos oxidativos. Tanto as células procariotas como as

eucariotas possuem estes mecanismos. Os mecanismos de defesa incluem: enzimas

como a superóxido dismutase, a catalase, várias peroxidases e moléculas

constitutivamente presentes na célula que mantêm um ambiente intracelular de redução

e que captam o oxigénio reactivo (Cabiscol et al, 2000).

1.1.2.1. A defesa primária contra ROS: Remoção catalítica por enzimas

antioxidantes

A superóxido dismutase (SOD), a catalase e as peroxidases constituem um grupo de

apoio mútuo na defesa das células contra as ROS. Enquanto a SOD diminui o nível de

O2-, a catalase e as peroxidases fazem o mesmo para o H2O2.

5

1. Superóxido Dismutase (SOD; E.C. 1.15.1.1)

O O2- é tóxico para o crescimento da célula e é a superóxido dismutase (SOD), que

recolhe estes radicais.

A SOD foi a primeira enzima metabolizadora de ROS a ser descoberta. Existem duas

isoenzimas SOD: a Mn-SOD presente na mitocôndria e a Cu/Zn-SOD presente no

citoplasma. Na reacção catalisada pela SOD, duas moléculas de superóxido formam

peróxido de hidrogénio e oxigénio molecular (Nordberg e Arnér, 2001).

2O2- + 2H

+ H2O2 + O2

A biossíntese de SOD é controlada principalmente pelo seu substrato, o O2- (Nordberg e

Arnér, 2001; Bandyopadhyay et al, 1999).

2. Glutationa Peroxidase (GPx; E.C. 1.11.1.9)

A glutationa peroxidase catalisa a reacção dos hidroperóxidos com a glutationa reduzida

(GSH) para formar glutationa dissulfeto (GSSG) e o produto de redução do

hidroperóxido.

ROOH + 2GSH ROH + GSSG + H2O

O substrato desta enzima varia entre o H2O2 e hidroperóxidos orgânicos. É uma enzima

selénio. Localiza-se no citoplasma e na mitocôndria (Bandyopadhyay et al, 1999).

3. Peroxirredoxinas (Prx; E.C. 1.11.1.15)

As peroxirredoxinas (Prx) reduzem directamente os peróxidos como o peróxido de

hidrogénio (Roos e Messens, 2011; Nordberg e Arnér, 2001).

2 e- + 2 H

+ + H2O2 2 H2O

ROOH ROH

6

4. Catalase (E.C. 1.11.1.6)

A catalase está presente em quase todas as células de mamíferos e localiza-se nos

peroxissomas ou nos microperoxissomas. É uma hemoproteína e catalisa a

decomposição do H2O2 em água e oxigénio molecular.

2H2O2 O2 + 2H2O

A catalase reduz o risco de formação de radicais hidroxilo a parir do peróxido de

hidrogénio via reacção de Fenton. Esta enzima liga-se ao NADPH que protege a enzima

da inactivação e aumenta a sua eficiência (Nordberg e Arnér, 2001; Bandyopadhyay et

al, 1999).

O Quadro 1 resume a origem das espécies reactivas de oxigénio, o sistema enzimático

de defesa e os produtos resultantes.

1.1.2.2. Defesa secundária contra ROS: “captadores” de radicais livres

A defesa secundária contra as espécies reactivas de oxigénio é constituída por moléculas

(os "captadores") que reagem com os radicais para produzir outros compostos de

radical. Quando os captadores produzem uma espécie radical menos prejudicial,

denominam-se antioxidantes.

Estes antioxidantes não enzimáticos, são nomeadamente o NADH e o NADPH, o ácido

ascórbico, o tocoferol, o ácido úrico, o β-caroteno e a glutationa (GSH) (Cabiscol et al,

2000).

O α-tocoferol, o ascorbato e a glutationa reduzida (GSH) actuam em conjunto como

antioxidantes celulares: o α-tocoferol está presente nas membranas celulares e

lipoproteínas plasmáticas. Quando o radical tocoferol é formado migra para a superfície

da membrana e é reconvertido em α-tocoferol através da sua reacção com a ascorbato

ou com a glutationa. O radical ascorbato resultante pode depois regenerar o ascorbato

por redução com a GSH. A GSH também capta directamente as espécies reactivas de

7

oxigénio, e a GSSG resultante regenera a GSH através do sistema NADPH-glutationa

redutase (Bandyopadhyay et al, 1999).

1.1.3. Consequências in vivo da geração de radicais livres de oxigénio

As espécies reactivas de oxigénio, devido à sua elevada reactividade causam danos em

componentes celulares vitais como os ácidos gordos polinsaturados, as proteínas e os

ácidos nucléicos, sendo potencialmente tóxicas, mutagénicas e carcinogénicas. Em

menor medida, os hidratos de carbono também são alvos das ROS (Cabiscol et al, 2000;

Bandyopadhyay et al, 1999).

Estas reacções podem alterar as propriedades intrínsecas de membrana como a fluidez e

o transporte de iões, conduzir à perda da actividade enzimática, formação de proteínas

com ligação cruzada e/ou inibição da sua síntese e danos no DNA nomeadamente cisão

de cadeia, a modificação de bases (Pacifici et al, 1993; Stadtman, 1990; Moody e

Hassan, 1982).

Os ácidos gordos polinsaturados, devido às suas múltiplas ligações duplas, figuram-se

como excelentes alvos para o ataque dos radicais livres. Esta oxidação está na origem da

formação de placas ateroscleróticas (Cabiscol et al, 2000).

A peroxidação lipídica é iniciada pelo radical ·OH, radicais alcoxi (RO·) e radicais

peróxidos (ROO·) (Turrens e Boveris, 1980). Isto conduz a um processo de auto

perpetuação uma vez que os radicais peróxidos são iniciadores bem como os produtos

de peroxidação lipídica. Os radicais peróxido de lípidos reagem com outros lípidos,

proteínas e ácidos nucleicos propagando assim a transferência de electrões e

provocando a oxidação de substratos.

Comparando com os radicais livres reactivos, os aldeídos têm um tempo de vida

superior e podem difundir-se do local da sua origem alcançando e atacando alvos

distantes. Actuam como "segundos mensageiros tóxicos" das reacções em cadeia

iniciadas (Cabiscol et al, 2000; Bandyopadhyay et al, 1999).

8

Quadro 1: Principais espécies reactivas de oxigénio e o seu metabolismo (Fonte: Nordberg e

Arnér, 2001).

Molécula ROS Principais Origens Sistema enzimático

de defesa Produto (s)

Superóxido (O2-)

“Fuga” de electrões

da cadeia

transportadora de

electrões

Fagócitos activados

Xantina oxidase

Flavoenzimas

Superóxido

dismutase (SOD)

H2O2 + O2

Peróxido de

Hidrogénio (H2O2)

Do O2- via SOD

NADPH-oxidase

(neutrófilos)

Glucose oxidase

Xantina oxidase

Glutationa

Peroxidase

H2O + GSSG

Catalases

H2O + O2;

Peroxirredoxinas

(Prx)

H2O

Radical Hidroxilo

(·OH)

Do O2- e H2O2 via

metais de transição

(Fe2+

ou Cu2+)

9

Quando as proteínas são expostas a espécies reactivas de oxigénio ocorrem alterações

nas cadeias laterais de aminoácidos e a estrutura da proteína é alterada. Estas

modificações oxidativas conduzem a alterações funcionais que perturbam o

metabolismo celular. Os estudos sobre o processo de envelhecimento demonstram a

acumulação de enzimas cataliticamente inactivas ou menos activas e mais termolábeis

além de um aumento no nível de conteúdo carbonil (indicador da oxidação catalisada

por metais). Contudo, na célula o dano oxidativo de proteínas é um processo normal,

provocado de modo a degradar as proteínas danificadas e assim promover a síntese de

novas proteínas (Cabiscol et al, 2000; Bandyopadhyay et al, 1999).

As modificações oxidativas no DNA foram descobertas por Kasai e Nishimura, 1984

durante um estudo sobre os efeitos de alimentos cozinhados e as modificações que estes

podem provocar no DNA. Mas estas alterações foram também descobertas num estudo

independente deste por Dizdarogiu em 1985 (Poulsen et al, 1999).

As espécies reactivas de oxigénio causam danos oxidativos no DNA, tanto nuclear

como mitocôndrial. Os seus alvos são bases azotadas e açúcares originando-se quebras

de cadeia simples e duplas. Ocorre conjuntamente a formação de lesões

apurínicas/apirimidínicas (sítios AP) e ligações cruzadas do tipo DNA-proteínas. Estas

lesões bloqueiam a replicação do DNA (Cabiscol et al, 2000). Devido a estas

modificações químicas, a acção das ROS é considerada mutagénica caso os sistemas de

reparação do DNA não sejam capazes de regenerar de imediato esta biomolécula.

O radical ·OH dá origem a diversos produtos a partir das bases do DNA que incluem

particularmente a hidroxilação da guanina em C-8 para formar 8-oxo-7, 8 desidro-2’-

desoxiguanosina (8-oxoGua), a 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamimodipirimidina

(Fapy), a 8-OH-adenina, a 2-OH-adenina, a timina glicol e a citosina glicol (Wiseman e

Halliwell, 1996).

Está demonstrado o envolvimento das ROS na indução de mutações no proto-oncogene

humano C-Ha-ras-1 e no gene supressor de tumor p53. Estas mutações desempenham

um papel vital na transdução de sinal conduzindo à proliferação e transformação celular.

As ROS regulam os factores de transcrição pela modulação oxidativa das cascatas de

proteínas cinases. As ROS induzem ainda genes de resposta ao stresse como o c-fos, c-

jun, jun-B, jun-D, c-myc, erg-1 e heme oxigenase-1 (Bandyopadhyay et al, 1999).

10

As espécies reactivas de oxigénio estão envolvidas na regulação dos factores de

transcrição AP-1 e NFkB (Sen e Packer, 1996; Amstad et al, 1992). Estes ligam-se a

regiões promotoras de genes regulando a expressão de várias proteínas, tais como o

factor de necrose tumoral-alfa (TNFα), interleucinas (IL) 1 e 2, colagenase e

metaloproteinases de matriz, proteínas estas envolvidas em respostas inflamatórias e

lesão de tecidos.

As bases azotadas são particularmente afectadas sofrendo uma oxidação possivelmente

genotóxica (Nash et al, 1996). A base modificada 8-oxoguanina (Figura 1) pode ser

incorporada no genoma através do ataque das ROS aos resíduos de guanina adicionados

ao DNA ou através da oxidação dos dGTP a 8-oxo-dGTP que são depois usados como

substrato pelas DNA polimerase. Mas independentemente da forma de incorporação, o

emparelhamento preferencial dos resíduos 8-oxoGua com a adenina (A) durante a

replicação dá origem a mutações por transversão de guanina:citosina (G:C) para

timina:adenina (T:A). Esta tendência de emparelhamento juntamente com o elevado

número de resíduos de 8-oxoGua produzidos no genoma a cada geração celular permite

que estes resíduos sejam os mutagénios endógenos mais significativos (Cabiscol et al,

2000; Nash et al, 1996).

O dano oxidativo do DNA mitocôndrial também envolve a modificação de bases e

quebras de cadeia, que leva à formação de componentes da cadeia transportadora de

electrões imperfeitos. Isto reflecte-se na geração de mais ROS através do aumento da

perda dos electrões e em danos celulares adicionais, sendo isto um ciclo vicioso (Reiter,

1997; Richter, 1988;).

Ainda que existam mecanismos de defesa endógenos contra as espécies reactivas de

oxigénio, quando o sistema antioxidante celular fica indisponível ou quando as ROS

atingem níveis anormalmente elevados, ocorre dano oxidativo nas células que, em

última instância, conduz a várias condições patológicas. Em doenças como artrite

reumatóide, cancro, aterosclerose, fibrose cística, ulcerogenese gastrointestinal, doença

de Alzheimer e de Parkinson foi já relatado o envolvimento de ROS (Das et al, 1997;

Wiseman e Halliwell, 1996).

11

Figura 1: Produção e reparação enzimática de resíduos 8-oxoguanina no DNA (Fonte: Adaptado

de Nash et al, 1996).

O stresse oxidativo mediado por ROS pode conduzir à morte celular por apoptose.

Como consequência desenvolvem-se as doenças neurodegenerativas e ocorre uma perda

progressiva de linfócitos T em casos de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana

(Khalid e Ashraf, 1993). Foi já demonstrado que o produto do gene p35 actua como um

antioxidante captando os radicais livres e prevenindo o processo de apoptose


Eversince Harman foi o primeiro investigador a propor o envolvimento dos radicais

livres no processo de envelhecimento, em 1956. A base molecular do envelhecimento e

o papel das ROS neste processo tem atraído uma atenção considerável nos últimos anos

sendo consensual que o envelhecimento e as doenças relacionadas com a idade resultam

do dano oxidativo nas biomoleculas (Bandyopadhyay et al, 1999; Harman, 1981).

A Figura 2 representa as fontes de espécies reactivas de oxigénio, os seus “captadores”

e as consequências da sua acção.

12

Figura 2: Visão global do mecanismo das espécies reactivas de oxigénio e o mecanismo de

lesão oxidativa de tecidos que conduz a condições patológicas (Fonte: Adaptado de

Bandyopadhyay et al, 1999).

Foi em 1974 que Gebhart detectou os primeiros antimutagénicos. Desde então têm sido

feitos numerosos estudos em compostos que possam proteger as células contra danos

causados no seu DNA por xenobióticos prevenindo as consequências que daí podem

advir (Mersch-Sundermann et al, 2004).

1.2.Ginkgo biloba

A árvore Ginkgo (Ginkgo biloba L.) é o único membro sobrevivente da família

Ginkgoaceae, família esta com origem no período Jurássico. Por esta razão, esta árvore

é considerada um fóssil vivo. Por ser distinta de todas as outras plantas vivas esta árvore

insere-se na sua própria divisão, a Ginkgophyta. A Ginkgo biloba é dióica, pode crescer

mais de 35 metros de altura e chegar a uma circunferência de até 10 metros. Além disto,

13

é capaz de atingir idades superiores a mil anos. Esta árvore é um sobrevivente resiliente

em ambientes poluídos, crescendo onde outras árvores sentem dificuldades. É

excepcionalmente resistente a ataques por fungos e insectos. A descoberta de

anterozóides móveis por parte de um botânico japonês fornece uma conexão crítica

entre os ciclos de vida de plantas inferiores e superiores (Stromgaard e Nakanishi,

2004).

A Ginkgo biloba, sendo a árvore mais velha do Mundo, possui uma vasta história do seu

uso na medicina tradicional chinesa. Os extractos das suas folhas têm sido usados desde

o ano 3000 a.C. para o tratamento da asma e bronquites (Ritch, 2000). O seu uso foi

descrito no livro de Liu Wen-Tai em 1505 e no Chinese Materia Medica por Pen Tsao

Ching (1578) para o tratamento de sintomas de senilidade dos membros mais velhos da

corte real chinesa (Stromgaard e Nakanishi, 2004; Thiagarajan et al, 2002).

O extracto de folha de Ginkgo biloba é actualmente o fármaco de origem vegetal mais

vendido na Europa e um dos dez mais vendidos nos Estados Unidos da América

(Stromgaard e Nakanishi, 2004; Sierpina et al, 2003). As preparações feitas com base

nas suas folhas foram introduzidas no mundo ocidental por volta de 1965 pela

companhia alemã Dr. Willmar Schwabe. Mais tarde, esta companhia em colaboração

com a companhia francesa Beaufour-Ipsen desenvolveu o extracto de Ginkgo biloba

padrão – o EGb761, utilizado em investigação científica e vendido em farmácias e

parafarmácias (Stromgaard e Nakanishi, 2004).

O extracto de folhas de Ginkgo biloba possui mais de 60 compostos bioactivos sendo os

principais os flavonóides, os glicosídeos, os terpenóides (ginkgolides e biobalide) e o

ácido anacárdico (Thiagarajan et al, 2002; Ritch, 2000).

Os ginkgolides (A, B, C, J e M) e o biobalide são compostos exclusivamente

encontrados na árvore Ginkgo biloba (Figura 3).

14

Figura 3: Estrutura de cinco ginkgolides e do bilobalide (Fonte: Stromgaard e Nakanishi, 2004).

O estudo dos efeitos dos componentes individuais do extracto de Ginkgo biloba é

essencial para fornecer uma documentação científica completa dos seus potenciais

efeitos terapêuticos. Mas além do contributo individual de cada composto os efeitos

sinergéticos são um ponto importante a considerar. A biodisponibilidade destes

compostos é também um parâmetro que deve ser tida em conta. Os flavonóides no

extracto de Ginkgo biloba não são capazes de transpor a barreira hemato-encefálica ou,

pelo menos, não em quantidade suficiente para exercer efeitos fisiológicos no sistema

nervoso central. Já a biodisponibilidade dos ginkgolides e do biobalide é de 70 a 80%,

com um tempo médio de vida de 3 a 5 horas. O carácter lipofílico destes torna-os

permeáveis à barreira hemato-encefálica e por isto, a presença destas estruturas únicas é

decisiva na concretização das melhorias associadas ao extracto de Ginkgo biloba

(Stromgaard e Nakanishi, 2004).

Os ensaios com extracto de Ginkgo biloba são vários e permitiram descrever várias

acções biológicas, nomeadamente: acção vasorreguladora com o aumento do fluxo

sanguíneo, melhorias em casos de zumbidos de origem vascular, melhoria cognitiva, da

resposta imunitária, protecção contra a apoptose celular, melhoria dos sintomas da

doença de Alzheimer em fase inicial e atraso na progressão desta doença, alívio do

stresse, efeitos antioxidantes, capacidade de antagonizar o receptor do factor de

agregação plaquetária, inibição de episódios agudos de asma, inibição da formação de

β-amilóide, melhorias em casos de depressão emocional, glaucoma, tonturas e dores de

cabeça, acção reguladora genética, aumento da longevidade, efeito protector na

progressão de retinopatias diabéticas (Ritch, 2000), neuroprotecção, efeitos positivos

15

em casos de disfunção sexual secundária, doença das alturas e diminuição da

vasoactividade em resposta ao frio, melhoria do metabolismo da glicose no cérebro,

vertigens e melhoria dos sintomas congestivos da síndrome pré-mestrual (Stromgaard e

Nakanishi, 2004; Thiagarajan et al, 2002; Sierpina et al, 2003; Ritch, 2000). O extracto

de Ginkgo biloba tem também uma actividade antineoplásica tendo demonstrado um

efeito anticlastogénico em estudos com vítimas do acidente nuclear de Chernobyl

(Ritch, 2000).

Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) demonstram que, em 2010, 50 a 60%

da população mundial com mais de 65 anos sofreu de alguma doença degenerativa.

Informação de 2012 aponta já para a existência de 35,6 milhões de pessoas a sofrer de

demência estimando-se que este valor duplique até 2030 e triplique até 2050. Para já os

tratamentos existentes são pouco eficazes e vitalícios. Para já a OMS recomenda o uso

de Ginkgo biloba na doença de Raynaud e síndrome pós flebítica (Sierpina et al, 2003).

A primeira actividade biológica significativa dos ginkgolides foi descoberta em 1985

quando demonstraram ser potentes antagonistas do receptor do factor de agregação

plaquetária (PAF) (Stromgaard et al, 2004). Os ginkgolides, nomeadamente o

ginkgolide B, são responsáveis pela capacidade neuroprotectora, antioxidante,

capacidade de captação de radicais livres e de relaxamento do endotélio. Os ginkgolides

inibem também a formação de β-amilóide (Sierpina et al, 2003).

O factor de agregação plaquetária está envolvido na modulação de vários processos do

sistema nervoso central e periférico. O PAF é produzido por basófilos, neutrófilos,

monócitos, plaquetas e células endoteliais, e induz a agregação de neutrófilos, aderência

e quimiotaxia. A sua presença aumenta a permeabilidade vascular, a libertação de

lisossomas e a síntese de superóxido (Ritch, 2000).

Os níveis de PAF aumentam no Sistema Nervoso Central durante um trauma e nestes

casos a acção dos antagonistas do PAF é reduzir o dano neuronal pela limitação do

aumento da concentração de iões cálcio induzido pelo PAF. Os inibidores do PAF

diminuem o tamanho do enfarte cerebral e aumentam a recuperação da actividade

metabólica cerebral após isquemia. (Stromgaard e Nakanishi, 2004; Ritch, 2000). O

potencial problema clínico mais importante que envolve a ingestão de Ginkgo biloba

está precisamente relacionado com a sua capacidade de inibição do factor de activação

16

plaquetária. Posto isto, o uso desta planta medicinal não deve ser concomitante com a

ingestão de outros agentes antiplaquetários (Sierpina et al, 2003).

Os ginkgolides A, C e J, mas principalmente o ginkgolide B são antagonistas dos

receptores da glicina (GlyRs). Os ligandos dos GlyRs, como moduladores da sua função

podem ser usados como relaxantes musculares, agentes sedativos e analgésicos


Os ginkgolides, particularmente os GA e GB são ainda moduladores da acção dos

receptores benzodiazepínicos periféricos (PBR). A função dos PBRs relaciona-se com a

proliferação celular, stresse e desordens de ansiedade. Em casos de desordens

neurodegenerativas e após danos cerebrais ocorre um aumento no número de PBRs. O

efeito neuroprotector dos GA e GB prende-se com a inibição da expressão de PBRs


Relativamente à sua capacidade antioxidante, os estudos demonstram que o extracto de

Ginkgo biloba protege os neurónios cerebrais expostos a stresse oxidativo induzido por

espécies reactivas de oxigénio: o pré-tratamento destes com Ginkgo biloba prolonga a

sua sobrevivência após exposição a um agente indutor de stresse como o peróxido de

hidrogénio. O seu potencial antioxidante é comparável ao do ácido ascórbico, glutationa

e alfa-tocoferol. Este extracto é um eficaz captador de radicais peroxilo e superóxido

além de conseguir captar o óxido nítrico e inibir a sua produção, impedindo a oxidação

da oxihemoglobina (Ritch, 2000).

O extracto de Ginkgo biloba preserva também o metabolismo mitocondrial e a produção

de ATP em vários tecidos e previne alterações morfológicas e os índices de dano

oxidativo associado ao envelhecimento mitocondrial (Ritch, 2000).

Sabe-se que o extracto de Ginkgo biloba tem um importante efeito protector contra os

danos causados por radicais livres ao nível da peroxidação lipídica em vários tecidos e

sistemas experimentais. A este nível a sua acção prende-se com o aumento dos níveis de

GSH e da actividade da GSSG reductase (Ritch, 2000).

Alguns estudos clínicos realizados com o extracto de Ginkgo biloba demonstraram a

sua eficácia contra o choque séptico induzido por bactérias Gram-negativas e em casos

de falha renal pós-transplante (Stromgaard e Nakanishi, 2004).

17

O extracto de Ginkgo biloba melhora o fluxo sanguíneo cerebral e periférico, um efeito

que tem sido atribuído à fracção não flavonóide. Ocorre ainda a diminuição da

viscosidade do sangue e o aumento da deformabilidade dos eritrócitos. Pacientes com

doença cardíaca coronária, hipertensão, hipercolesterolemia e diabetes têm melhorado

os níveis de fibrinogénio e a viscosidade do plasma após tratamento com este extracto.

Este inibe ainda a formação do trombo arterial (Ritch, 2000).

A Ginkgo biloba e o bilobalide inibem a redução, in vitro, da quantidade de ATP, nas

células endoteliais, induzida por hipoxia e atrasa o início da glicólise. Suprime ainda o

colapso na membrana induzido por hipoxia no cérebro (Ritch, 2000).

O extracto de Ginkgo biloba é útil no tratamento do fenómeno de Raynaud, que ocorre

em resposta à hipotermia ou stresse emocional.A Gingko biloba é capaz de aumentar a

captação de glucose e a síntese de glicogénio nas células do músculo liso arterial (Ritch,

2000). Os ginkgolides têm efeitos cardioprotectores, sendo o GA o composto mais

efectivo (Stromgaard e Nakanishi, 2004).

O bilobalide (BB) modula os principais neurotransmissores do cérebro (glutamato e

ácido γ - aminobutírico (GABA)). Exibe também uma actividade anticonvulsiva


Mas os estudos que utilizam o extracto de Ginkgo biloba estão, neste momento, muito

voltados para a sua potencial utilização no tratamento da doença de Alzheimer. Os

tratamentos com base nesta planta medicinal permitiram o abrandamento do

desenvolvimento dos sintomas cognitivos desta demência e a regressão de certos

aspectos cognitivos nos doentes foi atrasada cerca de 7 a 8 meses. Os estudos

demonstram também que os efeitos do extracto de Ginkgo biloba são mais expressivos

em situações de comprometimento cognitivo leve a moderado em vez de casos de

demência severa sugerindo que a sua função será estabilizar ou atrasar o início dos

sintomas. Os efeitos clínicos observados podem explicar-se pela descoberta de que este

extracto inibe a agregação β-amilóide, que se acredita ser de importância significativa

no desenvolvimento desta patologia (Stromgaard e Nakanishi, 2004).

A Ginkgo biloba é geralmente bem tolerada sendo raros os efeitos colaterais,

normalmente leves, e incluem náuseas, vómitos, diarreia, dores de cabeça, tonturas,

palpitações, inquietação, fraqueza ou erupções cutâneas. Deve ser prestado principal

18

cuidado à ingestão de folhas de Ginkgo biloba não processadas pois estas contêm ácidos

ginkgólicos que são tóxicos (Sierpina et al, 2003).

Para qualquer um dos efeitos pretendidos com a ingestão de Ginkgo biloba, o tempo de

tratamento e a quantidade diária ingerida são factores importantes no surgimento dos

efeitos benéficos. As indicações de dosagem são 120 a 140 mg por dia, em duas a três

doses (Stromgaard e Nakanishi, 2004).

1.3. Linha Célular HepG2

A linha celular HepG2 foi isolada pela primeira vez em 1972 por Aden e colaboradores

a partir de um hepatoblastoma primário de um rapaz argentino de 11 anos (Mersch-

Sundermann et al, 2004). A sua escolha como modelo in vitro em estudos de

genotoxicidade deve-se ao facto de esta linha celular ser capaz de mimetizar as

respostas dadas in vivo. Em primeiro lugar, a escolha de linhas celulares imortais

prende-se com a sua disponibilidade em grandes quantidades, poderem ter origem em

diferentes espécies e serem facilmente mantidas em cultura. As linhas celulares

derivadas de carcinomas são ainda capazes de reter a capacidade de exercer funções

específicas das células e tecido in vivo (Dehn et al, 2004). A linha celular de hepatoma

humano usada neste estudo retém muitas das funções especializadas que caracterizam

os hepatócitos humanos normais, nomeadamente a actividade de enzimas da fase I e II

(Quadro 2), envolvidas na activação metabólica e destoxificação de carcinogénios

genotóxicos e os antioxidantes (Dehn et al, 2004; Majer et al, 2004; Mersch-Sunderman

et al, 2004; Miura et al, 1999; Peppard e Knap, 1999). Por último, a escolha de uma

linha celular de origem humana deve-se ao facto da capacidade de activação das

enzimas metabolizadoras de xenobióticos e as especificidades relativamente ao seu

substrato apresentarem uma variação interespecífica (Mersch-Sundermann et al, 2004).

A toxicidade de algumas substâncias nos hepatócitos pode ser medida recorrendo a

varias estratégias que avaliam diferentes parâmetros e que permitem detectar

perturbações estruturais e funcionais que prejudicam as capacidades normais de uma

célula e produzem danos (Dehn et al, 2004).

19

Quadro 2: Enzimas metabolizadoras de xenobióticos presentes em células humanas HepG2

(Adaptado de Knasmuller et al, 1998).

Enzimas de Fase I Enzimas de fase II

Citocromo P450 (CYP)

CYP 1A

CYP 1A1

CYP 1A2

CYP 2B

CYP 2C

CYP 3A

CYP 2E1

Arilhidrocarbono hidroxilase (AHH)

Nitroredutase

N-demetilase

Catalase

Peroxidase

Oxidases de Função Mista (MFO)

NAD(P)H: citocromo c redutase

Citocromo P450 redutase

NAD(P)H: quinona oxirredutase

Epóxido hidrolase

Sulfotransferase ST

Glutationa S-transferase (GST)

Uridina glucuronosil transferase

N-acetiltransferase

UDP-glucuroniltransferase (UDPGT)

Oxidases de Função Mista (MFO)

1.4. Ensaio do Cometa

A Electroforese em Gel de Célula Isolada ou Ensaio do Cometa é um método simples,

sensível, versátil, rápido e económico que permite a avaliação de quebras nas cadeias do

DNA em células eucarióticas (Collins et al, 2008; Burlinson et al, 2007; Collins, 2004).

Nesta técnica, as células são colocadas num gel de agarose com baixo ponto de fusão

colocado sobre uma lâmina de microscópio previamente revestida com agarose de ponto

de fusão normal. Segue-se a sua desproteinização pela incubação numa solução de lise

sendo depois sujeitas a electroforese. A coloração do DNA com um fluorocromo revela

20

uma imagem semelhante a um cometa onde se pode distinguir uma cabeça e uma cauda

de DNA quando visualizado num microscópio de fluorescência. As células com um

maior número de quebras no DNA apresentam uma cauda maior e/ou uma maior

concentração de DNA nesta estrutura (Collins et al, 2008).

Nas células o DNA está organizado em nucleossomas: DNA enrolado em volta de um

núcleo de histonas criando em superenrolamento (negativo). Após a lise a maioria das

histonas é removida mas o DNA continua superenrolado. Uma quebra de cadeia simples

(SS) vai relaxar o superenrolamento de DNA na “ansa” em que esta ocorreu, permitindo

que este se movimente sob um campo electroforético (Collins et al, 2008; Collins,

2004).

A primeira demonstração do ensaio de electroforese em gel de célula única foi feita em

1984 por Östling e Johanson utilizando pH=10. Actualmente estas condições não são

normalmente adoptadas sendo que a maioria dos ensaios envolve um tratamento em

pH>13, procedimento este que foi sugerido poucos anos depois por dois grupos de

investigação independentes: Singh et al (1988) e Olive et al (1990). Estas condições de

pH permitem detectar quebras de cadeia e sítios alcali-lábeis no DNA (Collins et al,

2008; Collins, 2004).

Os sítios alcali-lábeis são sítios apurínicos e apirimidínicos ou sítios AP. Surgem da

perda de uma base danificada, conduzindo à existência de um açúcar sem base no

esqueleto de DNA. Os sítios AP ocorrem como intermediários no processo de reparação

por excisão de base (BER) ou devido a alterações na estabilidade química do DNA

(Collins et al, 2008; Burlinson et al, 2007; Collins, 2004).

A sensibilidade e a especificidade dos ensaios cometa podem ser melhoradas se ao

procedimento padrão se acrescentarem etapas específicas (Collins et al, 2008; Collins,

2004).

Nas células normais as bases oxidadas ocorrem, pelo menos, em tão grande número

como as quebras de cadeia e os sítios AP. Este dano pode ser detectado em ensaios

cometa através da digestão do DNA por endonucleases especificas de lesão após a etapa

de lise celular (Collins, 2009; Collins et al, 2008).

Algumas destas enzimas mais comummente utilizadas são a endonuclease III que

reconhece pirimidinas oxidadas e a formamidopirimidina-DNA-glicosilase (FPG),

21

utilizada neste estudo, que detecta o principal produto de oxidação de purinas, a 8-

oxoguanina, purinas de anel imidazol aberto ou formamidopirimidinas (fapy Ade e fapy

Gua). O local sensível à enzima é convertido numa quebra de cadeia aumentando a

intensidade da cauda do cometa (Collins, 2009; Collins et al, 2008; Collins, 2004).

Estas enzimas são utilizadas principalmente para avaliar o efeito da suplementação com

antioxidantes e analisar o espectro de danos induzido por um agente genotóxico

(Collins, 2009; Collins et al, 2008; Collins, 2004).

Nos ensaios do cometa, o DNA é visualizado através de microscopia de fluorescência.

Os corantes mais comummente utilizados são o brometo de etídio (BE) e o DAPI (4,6-

diamidino-2-fenilindole) (Collins et al, 2008; Collins, 2004).

A análise dos cometas pode ser feita através de uma avaliação visual em que cada

cometa é classificado numa de cinco categorias sendo 0 (zero) células não danificadas

(cometas sem cauda ou com cauda dificilmente perceptível) e 1 a 4, células com um

aumento relativo na intensidade da cauda, ou através da análise de imagens que utiliza

uma câmara ligada a um computador com um software de análise adequado (Collins et

al, 2008; Collins, 2004).

1.5. Paraquato (PQ)

O 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridina-dicloreto ou Paraquato (Figura 4) foi pela primeira vez

sintetizado por Weidel e Russo em 1882, sendo que as suas propriedades herbicidas

foram apenas descobertas em 1955 e a sua utilização iniciou-se em 1962 (Schmitt et al,

2006; Serra et al, 2003).

Figura 4: Fórmula de estrutura do Paraquato.

22

Devido ao número de casos de intoxicação e mortes por paraquato vários países já

suspenderam ou restringiram o seu uso e adoptaram medidas como diminuir a sua

concentração no produto final e acrescentar substâncias odoríferas, corantes e eméticas

nas preparações comerciais (Schmitt et al, 2006).

Têm sido descritos vários mecanismos subjacentes à citotoxicidade do paraquato. O

modelo geralmente aceite pela comunidade médica e científica refere que os danos nos

tecidos se devem a um aumento na formação de radicais livres e espécies reactivas de

oxigénio (Schmitt et al, 2006; Fukushima et al, 2002).

Nas células, o paraquato é reduzido formando-se o radical livre monocatiónico PQ+ que,

em condições aeróbias, é rapidamente oxidado enquanto se geram radicais superóxido

que iniciam uma cascata de reacções que conduzem à produção de mais espécies

reactivas de oxigénio, principalmente peróxido de hidrogénio e radical hidroxilo, que

causam danos no DNA, destroem os lípidos das membranas celulares (Figura 5) e

podem conduzir à morte celular. Desde que haja NADPH e suprimento de oxigénio, o

radical paraquato continuará a oxidar-se, produzindo danos celulares (Li et al, 2011;

Schmitt et al, 2006).

23

Figura 5: Formação de radicais livres na célula aumentada via exposição ao Paraquato com

consequente peroxidação lipídica (Fonte: Adaptado de Bus et al, 1975 citado por Schmitt et al,

2006).

Estudos epidemiológicos e laboratoriais indicam o paraquato como um factor etiológico

ambiental na doença de Parkinson ao mediar a morte celular dos neurónios

dopaminérgicos através da indução de stresse oxidativo (Yang et al, 2009).

24

2. Objectivos

A realização deste trabalho teve como principais objectivos:

Analisar a genotoxicidade de um composto indutor de espécies reactivas de

oxigénio sob condições específicas – o Paraquato (PQ);

Contribuir para o estabelecimento de um protocolo alternativo aos métodos

usados para a indução de danos oxidativos no DNA;

Estudar o efeito citotóxico e genotóxico do extracto de folhas de Ginkgo

biloba no DNA;

Avaliar um potencial efeito antigenotóxico do extracto de folhas de Ginkgo

biloba contra o stresse oxidativo induzido quimicamente pelo Paraquato.

Para este estudo, utilizaram-se células da linha celular de carcinoma hepatocelular

humano – HepG2 e a técnica do Ensaio do Cometa.

25

3. Material e Métodos

3.1. Material Biológico

Neste estudo a linha celular utilizada foi a linha do carcinoma hepatocelular humano

HepG2 (ATCC). Estas células foram mantidas em meio de cultura completo e numa

incubadora (Binder) à temperatura de 37ºC com 5% de CO2 no laboratório de

Biologia Celular e Bioenergética do Departamento de Biologia e Ambiente da

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.

A manipulação das células foi sempre realizada em condições assépticas, numa

câmara de fluxo laminar, classe II (Faster, BH-EN 2004) de modo a prevenir

quaisquer contaminação de origem bacteriana, fúngica ou viral.

3.2. Meios de Cultura e Soluções

Os meios de cultura são formulados de modo a fornecer às células os nutrientes

essenciais ao seu metabolismo, crescimento e proliferação. Contêm vitaminas,

aminoácidos, glicose e iões inorgânicos. Os meios de cultura, quando não utilizados

de imediato, foram mantidos a 4ºC.

Neste estudo utilizaram-se duas formulações de meio: uma com soro designada por

meio de cultura completo e outra sem soro.

3.2.1. Meio de cultura completo

DMEM (Dulbeco’s Modified Eagles Medium, Gibco), suplementado com 2 mM de

L-glutamina (Gibco, Life Technologies), 10% (v/v) de soro fetal bovino, FBS

(Gibco, Life Technologies) e antibióticos (200 U/mL de Penicilina e 200 µg/mL de

Estreptomicina (Gibco, Life Technologies). Este meio base contém 25 mM de

glicose e 0,1 g/L de piruvato.

26

3.2.2. Meio de cultura sem soro

DMEM (Dulbeco’s Modified Eagles Medium, Gibco), suplementado com 2 mM de

L-glutamina (Gibco, Life Technologies) e antibióticos (200 U/mL de Penicilina e

200 µg/mL de Estreptomicina (Gibco, Life Technologies). Este meio base contém

25 mM de glicose e 0,1 g/L de piruvato.

3.2.3. Soluções

É descrito em seguida o nome e a composição das soluções utilizadas neste estudo.

3.2.3.1. Solução de PBS 1x

A solução tampão PBS (tampão fosfato) contém 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1,75

mM KH2PO4 e 10 mM Na2HPO4.2H2O. O pH foi ajustado a 7,4 com HCl 1M.

3.2.3.2. Solução de lise

Esta solução contém 2,5 M NaCl; 0,1 M EDTA; 0,01 M Tris e 5 mL de NaOH 10

M. O pH foi ajustado a 10 com NaOH. Para a sua utilização nos ensaios cometa

adiciona-se Triton X-100 à concentração de 1% (v/v).

3.2.3.3. Solução de electroforese

Esta solução é feita com 300 mM de NaOH e 1 mM de EDTA dissolvidos em água

destilada.

27

3.2.3.4. Tampão F

Preparou-se uma solução de tampão F 10x concentrada, contendo 0,04 M HEPES;

0,1 M KCl; 0,0005 M EDTA e 2% (p/v) BSA. Em cada utilização diluiu-se 50 mL

de tampão F em 450 mL de água destilada.

3.3. Extracto de folhas de Ginkgo biloba

As folhas de Ginkgo biloba L. utilizadas neste estudo foram recolhidas em

Novembro de 2010 de um espécime localizado na Universidade de Trás-os-Montes

e Alto Douro. A preparação do extracto foi realizada como descrito por Ding e

colaboradores (2004).

As folhas foram lavadas com água destilada, os pecíolos dispensados e seguiu-se

uma secagem ao ar, à temperatura ambiente durante aproximadamente três semanas.

De seguida, as folhas foram moídas utilizando um moinho doméstico de modo a

obter-se um pó fino. Este pó foi armazenado em frascos de vidro fechados até ser

utilizado para extracção.

Preparou-se uma solução stock de Ginkgo biloba de concentração 120 g/L pesando

3,6 g de pó de folhas que foram transferidas para um tubo de polipropileno de 50

mL. A este tubo adicionaram-se 30 mL de água destilada. Esta mistura foi aquecida

em banho-maria a 100 ºC durante 5 minutos. Seguiu-se uma centrifugação a 2000 g

durante 15 minutos. Aproveitou-se o sobrenadante e repetiram-se as etapas de

banho-maria e centrifugação. O novo sobrenadante obtido foi filtrado utilizando

filtros de 0,5 µm o seu pH ajustado a 6,5 com NaOH e armazenado a -20ºC.

Para a adição do extracto de Ginkgo biloba às células HepG2 nas concentrações de

0,5; 5 e 10 g/L procedeu-se às diluições da solução stock a 5; 50 e 100 g/L tendo em

conta que, para a adição às células, a cada 900 µL de meio de cultura sem soro se

adiciona 100 µL de extracto (dilui-se 10x).

28

3.4. Preparação da solução stock de Paraquato

A acção do Paraquato (PQ) ou metil viologénio nas células HepG2 foi avaliada

tendo por base a sua capacidade de geração de radicais de oxigénio já descrita.

O Paraquato (Sigma Chemical Co) foi dissolvido em PBS 1x de modo a obter-se

uma solução stock de concentração 1 mM. Esta solução foi armazenada à

temperatura de -20º C (de modo a evitar a sua degradação) em alíquotas de 1,5 mL.

No dia da adição deste composto às células em cultura descongelaram-se as

alíquotas necessárias e procedeu-se às devidas diluições.

3.5. Desagregação das células HepG2 com tripsina

As HepG2 são uma linha celular aderente crescendo in vitro até à confluência total

ou parcial. Quando se atinge uma confluência de 80-90% é necessário sujeitá-las a

subcultura evitando-se, deste modo, a morte celular.

A etapa de tripsinização pretende romper as ligações que as células estabelecem

entre si e com a superfície das caixas de cultura. O tempo de submissão das células a

esta protease depende das ligações estabelecidas.

O meio de cultura presente em cada um dos 12 poços das caixas de cultura foi

cuidadosamente removido. Às células de cada poço foi adicionado 1 mL de tripsina

(Tripsina 0,05% - EDTA, GIBCO) tapando em seguida a caixa de cultura com a sua

tampa. A caixa foi colocada, durante 5 a 7 minutos, na incubadora de CO2 a 37ºC.

Após esta incubação, caso se verificasse que as células ainda se mantinham

aderentes, recorreu-se a uma ligeira “batida ou toque” nas caixas para ajudar ao seu

desprendimento. A etapa de tripsinização termina ao adicionar-se 1 mL de meio de

cultura com soro dado que este inactiva a tripsina.

3.6. Contagem das células

Após a tripsinização, com as células individualizadas, procedeu-se à sua contagem.

O número de células foi determinado através de contagem ao microscópio óptico,

utilizando uma câmara de Neubauer.

29

3.7. Avaliação da genotoxicidade e citoprotecção em células HepG2: Ensaio

do Cometa

3.7.1. Procedimento

3.7.1.1. Revestimento das lâminas com agarose

A primeira etapa do ensaio do cometa consiste em realizar um primeiro

revestimento das lâminas com uma solução de agarose de normal ponto de fusão

(NMP) a 1% em água destilada, de modo a que o gel contendo as células adira. A

solução foi aquecida no microondas até ficar translúcida. De seguida as lâminas

foram mergulhadas nesta solução de agarose ainda quente e limpas com papel no

lado inferior. Estas lâminas ficaram a secar ao ar, marcadas no lado fosco com um

traço a lápis no canto superior direito indicando deste modo o lado revestido com

agarose.

3.7.1.2. Tratamento das células para o ensaio do cometa

As células HepG2 foram plantadas em cinco placas de cultura de 12 poços à

densidade de 1x105

células/mL (1 mL de meio por poço). Aos poços foram

adicionados novos meios sem soro com extracto de Ginkgo biloba, Paraquato ou

ambos, durante períodos de tempo variável (de 5 minutos a 24 horas) de acordo com

o plano apresentado no Quadro 2.

Decorrido o tempo de exposição das células HepG2 aos diferentes meios, estes

foram removidos e procedeu-se à tripsinização. A suspensão obtida foi colocada em

tubos de 1,5 mL para centrifugar 3 minutos a 200 x g (Centrifuga de eppendorfs,

Centrifuge & Vórtex). O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido e

lavado com 1 mL de PBS. O procedimento é repetido. As amostras foram colocadas

em gelo até à adição de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) (Gibco, Life

Technologies).

30

Quadro 3: Plano de preparação das células para o ensaio do cometa.

Placas de cultura de 12 poços

Caixa 1 Caixa 2

1 2 3 4 1 2 3 4

A

Ensaio

Controlo

(PQ=0 µM e

Gb=0 g/L)

Ensaio

Controlo

(PQ=0 µM e

Gb=0 g/L)

PQ1 µM (5

min)

PQ1 µM

(5min)

PQ1,5 µM

(5 min) PQ1,5 µM

(5 min) PQ1,5 µM

(30 min) PQ1,5 µM

(30 min)

B PQ1 µM (30

min)

PQ1 µM (30

min)

PQ1 µM

(1h)

PQ1 µM

(1h)

PQ1,5 µM

(1h) PQ1,5 µM

(1h)

PQ1,5 µM

(4h)

PQ1,5 µM

(4h)

C

PQ1 µM

(4h)

PQ1 µM

(4h)

PQ1 µM

(24h) PQ1 µM

(24h) PQ1,5 µM

(24h) PQ1,5 µM

(24h)

PQ 2 µM

(30 min)

PQ2 µM

(30 min)

Caixa 3 Caixa 4

1 2 3 4 1 2 3 4

A PQ 2 µM

(1h)

PQ2 µM

(1h)

PQ 5 µM

(30 min)

PQ5 µM

(30 min)

Gb 0,5 g/L

(4h)

Gb 0,5 g/L

(4h)

Gb 0,5 g/L

(24h)

Gb 0,5 g/L

(24h)

B PQ 5 µM

(1h)

PQ5 µM

(1h)

Gb 0,5 g/L

(1h)

Gb 0,5 g/L

(1h)

Gb 0,5 g/L

(24h) + PQ

1 µM (1h)

Gb 0,5 g/L

(24h) + PQ

1 µM (1h)

Gb 5 g/L

(24h) + PQ

1 µM (1h)

Gb 5 g/L

(24h) + PQ

1 µM (1h)

C

Gb 5 g/L

(1h)

Gb 5 g/L

(1h)

Gb 10 g/L

(1h)

Gb 10 g/L

(1h)

Gb 0,5 g/L

+ PQ 1 µM

(1h)

Gb 0,5 g/L

+ PQ 1 µM

(1h)

Gb 0,5 g/L

(24h) + PQ

1,5 µM (1h)

Gb 0,5 g/L

(24h) + PQ

1,5 µM (1h)

31

Caixa 5

1 2 3 4

A

Gb 5 g/L

(24h) + PQ

1,5 µM (1h)

Gb 5 g/L

(24h) + PQ

1,5 µM (1h)

Gb 0,5 g/L

+ PQ 1,5

µM (1h)

Gb 0,5 g/L

+ PQ 1,5

µM (1h)

Adicionou-se a cada sedimento 290 µL de agarose LMP e homogeneizou-se. Em

cada lâmina previamente revestida colocaram-se duas gotas de 70 µL cada,

cobrindo-se estas com uma lamela 18x18 mm. As lâminas foram colocadas a 4ºC

durante 5 minutos para solidificar a agarose e depois disso as lamelas foram

removidas.

O número recomendado de cometas num gel é cerca de 2 x 104 (Collins, 2004).

3.7.1.3. Lise alcalina

As lâminas foram colocadas em tinas com solução de lise, durante de uma hora até 4

horas, a 4º C. As lâminas em que as células foram tratadas com Paraquato foram

colocadas numa tina à parte.

A lise alcalina tem por objectivo permitir a lise das membranas celular e nuclear e a

desproteinização do DNA.

3.7.1.4. Tratamento com a enzima FPG

As lâminas foram sujeitas a 3 lavagens de 5 minutos com Tampão F a 4ºC. Durante

a última lavagem procedeu-se à diluição da enzima com o mesmo tampão

adicionando-se 300 µL a cada tubo com FPG pronta a usar. Nas lâminas marcadas

com FPG colocaram-se 50 µL de solução de enzima em cada gel e cobriu-se com

uma lamela 22x22 mm. Para as lâminas não sujeitas à enzima colocaram-se 50 µL

32

de tampão F em cada gel e uma lamela. Todas as lâminas foram colocadas numa

câmara húmida e levadas à incubadora durante 30 minutos a 37ºC. Findo o tempo as

lamelas foram retiradas.

3.7.1.5. Tratamento alcalino

As lâminas foram colocadas na tina de electroforese. Encheu-se a tina com solução

de electroforese recém-preparada de modo a ultrapassar-se o nível das lâminas em

apenas cerca de 0,2 cm. O tempo de exposição das lâminas a esta solução foi de 40

minutos, a 4ºC e em condições de obscuridade.

O tratamento alcalino (pH>13) permite a desnaturação do DNA e a conversão dos

locais AP em quebras de cadeia.

3.7.1.6. Electroforese

Decorridos os 40 minutos de tratamento alcalino iniciou-se a electroforese. Esta

etapa realizou-se a uma voltagem de 0,8 V/cm o que atendendo à dimensão da tina

usada resulta numa voltagem de 25 V e uma corrente de 300 mA, durante 30

minutos. Caso o valor da voltagem não seja atingido deve retirar-se solução de

electroforese da tina. Caso seja o valor da amperagem a não ser atingido então

adiciona-se solução.

3.7.1.7. Neutralização

As lâminas retiradas da tina de electroforese foram sujeitas a duas lavagens de 10

minutos com PBS e água destilada. Após as lavagens as lâminas foram deixadas a

secar à temperatura ambiente, em papel absorvente, no escuro.

Esta etapa realiza-se de modo a eliminar restos de álcalis que podem interferir com a

coloração.

33

3.7.1.8. Visualização dos cometas

A cada gel foram adicionados 20 µL de Brometo de Etídio (2 µg/mL) (Sigma

Chemical Co) imediatamente antes da visualização das lâminas num microscópio de

fluorescência, com uma câmara acoplada e ligada a um computador com um

software adequado. O filtro de excitação adequado é de 542 nm emitindo a 568 nm.

Observou-se cada gel no seu todo, de modo a obter uma perspectiva geral do dano

dos cometas. Neste estudo recorreu-se ao método de avaliação dos cometas por

análise de imagem e utilizou-se o programa Comet Assay IV.

Na selecção dos cometas teve-se em conta, que os bordos do gel e as áreas próximas

de bolhas de ar devem ser evitadas, uma vez que aqui existem cometas com um

nível anormalmente elevado de dano. Tal como recomendado analisaram-se 50

cometas por lâmina.

O parâmetro de avaliação escolhido foi a intensidade da cauda ou percentagem de

DNA na cauda do cometa uma vez que existe uma relação linear com a frequência

de quebra do DNA, é relativamente pouco afectado pelas configurações de limite e

permite a discriminação do dano de 0 a 100% de DNA na cauda. Além disto dá uma

indicação muito clara da aparência dos cometas (Collins, 2004; Collins et al, 2008;

Burlinson et al, 2007).

3.7.1.9. Análise estatística de dados

Os resultados obtidos foram analisados no programa “Statistical Program for Social

Sciences – SPSS”, versão 17.0. Procedeu-se à análise de variância univariada

(ANOVA) para a comparação de mais de duas médias e ao teste de Tukey para as

comparações múltiplas.

Os ensaios foram realizados em duplicado e os resultados apresentados pela média

± desvio padrão. O nível de significância foi estabelecido para p < 0,05.

34

4. Resultados

A extensão dos danos no DNA produzidos pela incubação das células HepG2 a

concentrações crescentes de extracto de Ginkgo biloba e de Paraquato foi determinada

através do ensaio do cometa. A análise dos cometas obtidos foi realizada através da

medição da intensidade luminosa relativa da cauda (% de DNA na cauda). Avaliaram-se

50 cometas por lâmina. Os valores obtidos sem a incubação com enzima FPG

correspondem a quebras na cadeia de DNA simples e duplas, locais de reparação

incompleta, sítios alcali-lábeis enquanto os valores com enzima correspondem a estes

danos mais o principal produto de oxidação de purinas, a 8-oxoguanina (Collins et al,

2008; Burlinson et al, 2007; Collins, 2004).

A Figura 6 evidencia alguns dos resultados obtidos nos ensaios do cometa realizados.

As imagens demonstram diferentes níveis de danos no DNA como consequência dos

diferentes tratamentos a que as células HepG2 foram submetidas.

Figura 6: Imagens de ensaios do cometa realizados em células HepG2 após a coloração do seu

DNA com Brometo de Etídeo. A) Experiência controlo em que as células não foram sujeitas a

nenhum tratamento – a inexistência de cauda demonstra os baixos níveis de danos no DNA das

células HepG2 utilizadas; B, C e D) Danos no DNA resultantes da incubação das células com

diferentes tratamentos; B) Paraquato 1 µM (4 horas); C) Extracto de Ginkgo biloba 0,5 g/L (4

horas) e D) Extracto de Ginkgo biloba 0,5 g/L (24 horas) + Paraquato 1,5 µM (1 hora). Ensaios

35

com tratamento enzimático FPG. Exemplos ilustrados com setas. Todas as imagens foram

obtidas numa ampliação de 400 vezes.

4.1. Avaliação do efeito do extrato de Ginkgo biloba no DNA

A bibliografia disponível não descreve nem orienta relativamente a uma faixa de

concentrações de Ginkgo biloba que se poderiam utilizar em testes de

genotoxicidade in vitro. Posto isto, a acção do extracto de folhas de Ginkgo biloba

no DNA de células HepG2 foi determinada através da adição às células de extractos

diluídos em meios de cultura com concentrações finais de extracto de 0,5, 5 e 10

g/L, durante 1 hora. Os resultados da avaliação dos danos no DNA para os

tratamentos com e sem enzima FPG encontram-se no gráfico da Figura 7.

Figura 7: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com diferentes concentrações do extracto de

folhas de Ginkgo biloba (g/L) durante uma hora. Para cada tratamento foram feitos ensaios com

e sem tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em percentagem

(%) de DNA na cauda. Os valores de média e desvio padrão foram obtidos a partir da análise

dos cometas obtidos em quatro géis (letras iguais indicam diferenças significativas).

A Tabela 1 faz referência aos valores de dano oxidativo obtidos para os ensaios do

cometa realizados após uma hora de incubação das células HepG2 com concentrações

crescentes de extracto de Ginkgo biloba. Os valores de dano oxidativo são obtidos

subtraindo os valores de intensidade da cauda dos cometas nos ensaios com tratamento

enzimático FPG aos valores obtidos sem este tratamento.

0 0,5 5 10

Sem FPG 3,8 3,9 7,5 8,6

Com FPG 6,6 6,1 8 14,8

0

5

10

15

20

25

% d

e D

NA

na

ca

ud

a

Efeito da adição de concentrações crescentes de

Ginkgo biloba (g/L) - 1 hora

a

d

b e c

f a,b,c

d,e,f

36

[Gb]; 1hora Dano

Oxidativo

0 2,8

0,5 2,2

5 0,5

10 6,2


concentrações crescentes de extracto de Ginkgo biloba (g/L) a células HepG2 durante 1 hora.

Ao comparar-se os resultados obtidos para a incubação das células HepG2 com extracto

de Ginkgo biloba verificou-se que, tanto com como sem tratamento enzimático FPG,

existe um aumento do dano induzido no DNA do ensaio controlo e concentrações 0,5 e

5 g/L para a concentração máxima de 10 g/L. Esta concentração máxima demonstra o

nível de dano oxidativo mais elevado.

O gráfico da Figura 8 e a Tabela 2 demonstram a evolução dos danos induzidos ao

DNA de células HepG2 incubadas com extracto de Ginkgo biloba na concentração

mínima – 0,5 g/L – ao longo do tempo. Os resultados foram obtidos ao fim de uma, 4 e

24 horas de incubação.

A análise dos dados obtidos demonstra que não existem diferenças significativas ao

nível das quebras de cadeia (ensaios sem tratamento FPG).

Nos ensaios com tratamento enzimático também não se verificaram diferenças entre o

controlo e uma hora de incubação. Os valores de dano total no DNA tornaram-se

significativos ao fim de 4 e 24 horas. Às 4 horas de incubação obtém-se o valor de dano

oxidativo no DNA mais elevado. Das 4 horas de incubação para as 24 horas verifica-se,

apesar de não ser estatisticamente significativa, uma tendência decrescente do nível de

danos sendo, no entanto, os valores obtidos muito superiores aos do controlo e de uma

hora de incubação.

37

Figura 8: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Ginkgo biloba 0,5 g/L ao longo do

tempo (0, 1, 4 e 24 horas). Para cada tratamento foram feitos ensaios com e sem tratamento

enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em percentagem (%) de DNA na

cauda. Os valores de média e desvio padrão foram obtidos a partir da análise dos cometas

obtidos em quatro géis (letras iguais indicam diferenças significativas).

[Gb] = 0,5

g/L; tempo

Dano

Oxidativo

Controlo 2,8

1 2,2

4 21,1

24 16,5

Tabela 2: Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito do tempo de exposição

das células HepG2 ao extracto de Ginkgo biloba 0,5 g/L (em horas).

4.2. Avaliação do efeito genotóxico do Paraquato

O efeito do herbicida Paraquato no DNA foi avaliado ao adicionarem-se diferentes

concentrações deste agente gerador de radicais livres à linha celular HepG2. As

concentrações de Paraquato escolhidas neste estudo tiveram por base o estudo realizado

por Dusinská e colaboradores (1998). Os resultados obtidos encontram-se ilustrados nos

gráficos das Figuras 9 a 12.

Para um tempo de incubação de 30 minutos (Figura 9, Tabela 3), nos ensaios sem

tratamento FPG verificou-se uma diminuição significativa no nível de danos no DNA

Controlo 1 4 24

Sem FPG 3,8 3,9 3,5 2,6

Com FPG 6,6 6,1 24,6 19,1

0 5

10 15 20 25 30 35 40 45

% d

e D

NA

na

ca

ud

a

Efeito do tempo de exposição à Ginkgo biloba

0,5 g/L em horas

a,b c,d

a,c

b,d

38

da concentração PQ = 1,5 µM comparando com a concentração de 5 µM e nos ensaios

com tratamento enzimático verifica-se uma diminuição significativa da concentração de

1,5 µM para a concentração de 2 µM.

Figura 9: Dano no DNA em células HepG2 tratadas com diferentes concentrações de Paraquato

(µM) durante 30 minutos. Para cada tratamento foram feitos ensaios com e sem tratamento

enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em percentagem (%) de DNA na

cauda. Os valores de média e desvio padrão foram obtidos a partir da análise dos cometas

obtidos em quatro géis (letras iguais indicam diferenças significativas).

[PQ]; 30

minutos

Dano

Oxidativo

0 2,8

1 2,6

1,5 1,6

2 0,6

5 2,4


concentrações crescentes de Paraquato (µM) a células HepG2 durante 30 minutos.

O dano oxidativo para cada uma das concentrações estudadas situa-se ao nível do

controlo.

0 1 1,5 2 5

Sem FPG 3,8 3,4 5,8 3,2 2,7

Com FPG 6,6 6 7,4 3,8 5,1

0

2

4

6

8

10

12

% d

e D

NA

na

ca

ud

a


Paraquato (µM) - 30 minutos

a

a

b

b

39

Para um tempo de incubação de 1 hora (Figura 10; Tabela 4) o aumento gradual das

concentrações de Paraquato não se repercutiu em diferenças significativas entre as

diferentes concentrações testadas.


Paraquato (µM) durante uma hora. Para cada tratamento foram feitos ensaios com e sem

tratamento enzimático FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em percentagem (%) de

DNA na cauda. Os valores de média e desvio padrão foram obtidos a partir da análise dos

cometas obtidos em quatro géis (letras iguais indicam diferenças significativas).

[PQ]; 1

hora

Dano

Oxidativo

0 2,8

1 1,1

1,5 2,6

2 3,2

5 4,2


concentrações crescentes de Paraquato (µM) a células HepG2 durante 1 hora.

Escolhendo-se as concentrações intermédias de Paraquato (PQ = 1 e 1,5 µM) pretendeu-

se avaliar as consequências genotóxicas da incubação das células HepG2 com este

herbicida ao longo do tempo (tmáx = 24 horas). Os gráficos das Figuras 11 e 12 e as

Tabelas 5 e 6 mostram os resultados obtidos.

0 1 1,5 2 5

Sem FPG 3,8 4,2 3,2 2,4 3,7

Com FPG 6,6 5,3 5,8 5,6 7,9

0

2

4

6

8

10

12

% d

e D

NA

na

ca

ud

a


Paraquato (µM) - 1 hora

40

Figura 11: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1 µM ao longo do tempo

(0, 5 e 30 minutos, 1, 4 e 24 horas). Para cada tratamento foram feitos ensaios com e sem




[PQ]=1µM;

tempo

Dano

Oxidativo

Controlo 2,8

5 minutos 3,9

30 minutos 2,6

1 hora 1,1

4 horas 16,3

24 horas 12,8

Tabela 5 Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito do tempo de exposição

das células HepG2 ao Paraquato 1 µM.

Os resultados obtidos mostram que não existem diferenças significativas de danos no

DNA entre o ensaio controlo, os 5 minutos, os 30 minutos e a hora de incubação. As

diferenças significativas surgem a partir das 4 horas para os ensaios com tratamento

FPG. As 4 horas foram o tempo em que se verificou maior dano oxidativo do DNA. Das

4 para as 24 horas de incubação verificou-se uma tendência de diminuição do nível de

dano oxidativo apesar de esta diferença não ser significativa.

Control

o

5

minutos

30

minutos 1 hora 4 horas

24

horas

Sem FPG 3,8 2 3,4 4,2 3,5 4

Com FPG 6,6 5,9 6 5,3 19,8 16,8

0

5

10

15

20

25

30

% d

e D

NA

na

ca

ud

a

Efeito do tempo de exposição ao Paraquato 1 µM

a,b

a,c,e,g

b,d,f,h

c,d e,f g,h

41

Contr

olo

5

minut

os

30

minut

os

1 hora 4

horas

24

horas

Sem FPG 3,8 2,7 5,8 3,2 2,8 2,6

Com FPG 6,6 9,3 7,4 5,8 20,3 27,7

0

10

20

30

40

% d

e D

NA

na

ca

ud

a

Efeito do tempo de exposição ao Paraquato 1,5

µM

a

a,b,c b

d,f,h,j,l

e.g,i,k,l

c

d,e f,g h,i j,k

Os ensaios sem tratamento enzimático FPG não demonstraram diferenças significativas

ao longo do tempo.

Comparativamente aos resultados obtidos para a concentração de PQ = 1 µM, a adição

de PQ na concentração de 1,5 µM originou uma resposta genotóxica diferente.

Nos ensaios sem tratamento enzimático verificou-se um aumento significativo das

quebras de cadeia dos cinco minutos para os 30 minutos de incubação. O nível deste

tipo de danos decresceu posteriormente às 4 e 24 horas de incubação.

Figura 12: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1,5 µM ao longo do tempo

(0, 5 e 30 minutos, 1, 4 e 24 horas). Para cada tratamento foram feitos ensaios com e sem




Nos ensaios com tratamento FPG não se verificaram alterações significativas entre o

ensaio controlo e uma hora de incubação. Existiu um acréscimo significativo dos danos

ao fim de 4 horas e 24 horas. Ao contrário dos resultados obtidos para a concentração de

1 µM o dano oxidativo aumentou das 4 para as 24 horas correspondendo este último

tempo de incubação ao máximo de danos obtidos.

42

[PQ]=1,5µM;

tempo

Dano

Oxidativo

Controlo 2,8

5 minutos 6,6

30 minutos 1,6

1 hora 2,6

4 horas 17,5

24 horas 25,1

Tabela 6 Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito do tempo de exposição

das células HepG2 ao Paraquato 1,5 µM.

4.3. Avaliação do efeito do extracto de Ginkgo biloba em células HepG2

tratadas com Paraquato

A avaliação de um potencial efeito antigenotóxico por parte do extracto de folhas de

Ginkgo biloba foi realizada ao pré-incubar as células HepG2 com Gb = 0,5 g/L e 5 g/L

durante 24 horas antes da adição de Paraquato nas concentrações de 1 µM e 1,5 µM. Os

gráficos das Figuras 13 e 14 e as Tabelas 7 e 8 apresentam os resultados obtidos nestes

ensaios.

Verificou-se que, mais do que a adição do agente promotor de radicais livres – o

Paraquato – é o efeito do extracto de Ginkgo biloba nas células que induz um

significativo aumento do dano oxidativo no DNA. O dano induzido pela incubação

durante 24 horas com Gb = 0,5 g/L é da mesma ordem do dano induzido após o mesmo

período de incubação com Gb = 0,5 g/L e 1 hora de incubação com PQ 1 µM (Figura

13).

Em termos de quebras de cadeia (ensaios sem tratamento FPG) não se verificaram

diferenças significativas entre a Gb = 0,5 g/L (24 horas de incubação) e Gb = 0,5 g/L

(24 horas) + PQ = 1 µM (1 hora).

43

Figura 13: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1 µM durante uma hora

após uma pré-incubação das células com Gb 0,5 g/L (24 horas). Apresentam-se valores de dano

com e sem a enzima FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em percentagem (%) de



Controlo Gb 0,5 (24h) PQ 1 (1h) Gb 0,5 (24h)

+ PQ 1 (1h)

Sem FPG 3,8 2,6 4,2 4,5

Com FPG 6,6 19,1 5,3 18,6

0

5

10

15

20

25

30

% d

e D

NA

na

ca

ud

a

Efeito da adição de Ginkgo biloba 0,5 g/L 24h

antes da adição de Paraquato 1 µM

a,b

a b

Pré-incubação

com [Gb]=0,5

g/L; [PQ]=1

µM

Dano

oxidativo

Controlo 2,8

Gb 0,5 (24h) 16,5

PQ 1 (1h) 1,1

Gb 0,5 (24h) +

PQ 1 (1h) 14,1

Tabela 7: Valores de dano oxidativo obtidos para a avaliação do efeito da adição de Ginkgo

biloba 0,5 g/L às células HepG2 24 horas antes da adição de Paraquato 1 µM durante uma hora.

44

Figura 14: Dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato 1,5 µM durante uma hora

após uma pré-incubação das células com Gb 0,5 e 5 g/L (24 horas). Apresentam-se valores de

dano com e sem a enzima FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em percentagem (%)

de DNA na cauda. Os valores de média e desvio padrão foram obtidos a partir da análise dos


Nos ensaios sem tratamento enzimático FPG não existem diferenças significativas entre

a incubação das células com extracto de Ginkgo biloba 0,5 g/L (24 horas de incubação)

e a incubação com Gb = 0,5 e 5 g/L (24 horas) seguida de 1 hora de incubação com

Paraquato na concentração de 1,5 µM (Figura 14).

O dano oxidativo induzido pela incubação durante 24 horas com Gb = 0,5 g/L é da

mesma amplitude do dano induzido após o mesmo período de incubação com Gb = 0,5

g/L ou Gb = 5 g/L mais 1 hora de incubação com PQ = 1,5 µM. Verifica-se uma

tendência de dano oxidativo crescente quando se aumenta a concentração de extracto na

pré-incubação apesar de a diferença não ser, pelo menos para estas concentrações,

significativa.

Controlo Gb 0,5 (24h) PQ 1,5 (1h) Gb 0,5 (24h)

+ PQ 1,5 (1h)

Gb 5 (24h) +

PQ 1,5 (1h)

Sem FPG 3,8 2,6 3,2 4,2 5,1

Com FPG 6,6 19,1 5,8 20,1 21,8

0

5

10

15

20

25

30

% d

e D

NA

na

ca

ud

a

Efeito da adição de Ginkgo biloba 24h antes da

adição de Paraquato 1,5 µM

a,b,c

a b c

45

A inexistência de dados relativos à pré-incubação das células HepG2 com extracto de

Ginkgo biloba na concentração de 5 g/L para PQ = 1 µM prende-se com as sucessivas

perdas de géis na fase de incorporação das células em agarose LMP.

O gráfico da Figura 15 e a Tabela 9 permitem a comparação dos resultados obtidos nos

ensaios com pré-incubação das células HepG2 com extracto de Ginkgo biloba na

concentração de 0,5 g/L e a sua adição conjunta com as concentrações de Paraquato 1 e

1,5 µM.

Relativamente aos danos no DNA obtidos sem tratamento FPG verifica-se que estes

permanecem praticamente inalterados para qualquer um dos ensaios realizados.

Os ensaios com tratamento FPG permitiram descobrir um aumento significativo do

dano oxidativo do DNA de células pré-tratadas com Gb = 0,5 g/L durante 24 horas

comparativamente aos ensaios controlo como já foi descrito. No entanto, o dano

oxidativo mensurado para os ensaios de adição conjunta de Gb = 0,5 g/L e PQ = 1 e 1,5

µM encontram-se ao nível dos registados para os ensaios controlo.

Pré-incubação

com [Gb];

[PQ]=1,5 µM

Dano

Oxidativo

Controlo

2,8

Gb 0,5 (24h)

16,5

PQ 1,5 (1h) 2,6

Gb 0,5 (24h)

+ PQ 1,5 (1h)

15,9

Gb 5 (24h) +

PQ 1,5 (1h)

16,7


biloba 0,5 e 5 g/L às células HepG2 24 horas antes da adição de Paraquato 1,5 µM durante uma

hora.

46

Figura 15: Comparação entre o dano no DNA de células HepG2 tratadas com Paraquato (1 e 1,5

µM) durante uma hora com uma pré-incubação das células com Gb 0,5 g/L (24 horas) e a

adição conjunta de Paraquato e Gb 0,5 g/L às células durante uma hora. Apresentam-se valores

de dano com e sem a enzima FPG. A avaliação dos danos de DNA é expressa em percentagem

(%) de DNA na cauda. Os valores de média e desvio padrão foram obtidos a partir da análise

dos cometas obtidos em quatro géis (letras iguais indicam diferenças significativas).

Pré-incubação

com [Gb] =

0,5 g/L ou

adição

conjunta com

[PQ] = 1 e 1,5

µM

Dano

Oxidativo

Controlo 2,8

Gb 0,5 (24h)

+ PQ 1 (1h)

14,1

Gb 0,5 + PQ

1 (1h)

0,5

Gb 0,5 (24h)

+ PQ 1,5 (1h)

15,9

Gb 0,5 + PQ

1,5 (1h) 1,3


biloba 0,5 g/L 24 horas antes da adição de Paraquato (1 e 1,5 µM) e da sua adição conjunta

(durante uma hora) às células HepG2.

Controlo Gb 0,5 (24h)

+ PQ 1 (1h)

Gb 0,5 + PQ

1 (1h)

Gb 0,5 (24h)

+ PQ 1,5 (1h)

Gb 0,5 + PQ

1,5 (1h)

Sem FPG 3,8 4,5 4,6 4,2 3,5

Com FPG 6,6 18,6 5,1 20,1 4,8

0

5

10

15

20

25

30

% d

e D

NA

na

ca

ud

a

Efeito da adição de Ginkgo biloba 0,5 g/L 24 h

antes da adição de Paraquato e da adição conjunta

a,b

a,c

c

b,d

d

47

5. Discussão

O uso de plantas medicinais acompanhou o Homem ao longo da sua história. Mais

recentemente o benefício empírico destas plantas tem sido cientificamente comprovado

ou refutado porque, apesar de se tratar de produtos naturais, isso não significa que sejam

inócuos, devendo ser submetidos a vários ensaios clínicos e científicos que

comprovarão se a sua toma está isenta de risco.

O extracto de folhas de Ginkgo biloba tem demonstrado, na maioria dos estudos, efeitos

biológicos benéficos para a saúde humana, tais como, a inibição da produção de radicais

de oxigénio, a captação de radicais livres, efeitos anti-lipoperoxidativos, redução de

danos neuronais, redução da agregação plaquetária, acção anti-inflamatória, anti-

tumoral e anti-envelhecimento (Chan et al, 2007). Mas, apesar de a maioria dos estudos

demonstrar os efeitos quimioprotectores dos polifenóis presentes neste e noutros

extractos de origem vegetal, existem também estudos que demonstram uma natureza

dual destes compostos que podem actuar como pró-oxidantes (Babich et al, 2011).

O estudo realizado pretendeu dar um modesto contributo para a compreensão do modo

de acção do extracto de folhas de Ginkgo biloba ao nível do DNA, isto porque a

informação relativa à genotoxicidade e tumorigenicidade destes produtos é limitada.

Como previamente referido, a escolha das células HepG2 prendeu-se com diversos

factores de entre os quais o facto de o fígado ser o principal órgão responsável pela

biotransformação da maioria dos xenobióticos ingeridos. Muitos autores defendem ser

fundamental que os compostos sejam avaliados relativamente à sua toxicidade hepática

estimando-se in vitro se o fígado seria capaz de metabolizar o composto teste (Liu e

Zeng, 2009).

Os resultados obtidos apontam para um aumento dos danos no DNA das células HepG2

quando expostas durante uma hora com extracto de folhas de Ginkgo biloba, algo que

foi avaliado utilizando a técnica do Ensaio do Cometa. O nível de dano obtido está

dependente da concentração de extracto utilizada: comparativamente ao ensaio controlo

(Gb = 0 g/L) foi para concentração de 10 g/L que se verificou um aumento dos danos no

DNA tanto para os ensaios sem tratamento FPG como para o ensaios em que se utilizou

esta enzima. As concentrações de 0,5 e 5 g/L avaliadas não se repercutiram num

aumento de nenhum dos dois tipos de danos analisados.

48

Tendo por base a menor concentração de extracto de folhas de Ginkgo biloba analisada

(0,5 g/L) pretendeu-se investigar de que modo a sua adição às células HepG2 poderia

influenciar o DNA ao longo do tempo. Para tal realizaram-se ensaios do cometa ao fim

de uma, 4 e 24 horas após a adição do extracto às células em cultura. Apurou-se que, ao

nível das quebras de cadeia de DNA, não se verificaram alterações ao longo do tempo

em estudo encontrando-se este valor ao nível dos ensaios controlo. O dano oxidativo foi

o que aumentou significativamente atingindo-se um máximo após 4 horas de incubação.

Das três possíveis respostas celulares à exposição a polifenóis: (a) stresse oxidativo

moderado e despoletar dos sistemas de defesa antioxidante após uma exposição

moderada, (b) subjugação dos sistemas de defesa antioxidante e indução da morte

celular por apoptose após uma exposição intermédia a elevada e (c) subjugação das

defesas antioxidantes celulares e dano oxidativo que conduz à morte celular por necrose

após uma exposição muito elevada (Babich et al, 2011), pode pressupor-se que a que se

verificou neste estudo sobre o efeito do extracto de Ginkgo biloba ao longo do tempo,

foi a primeira, isto porque se verificou uma tendência de diminuição do dano oxidativo

das 4 para as 24 horas, apesar de esta não ser significativa. O alargamento do tempo de

exposição analisado poderia confirmar esta hipótese.

A natureza pró-oxidante do extracto de folhas de Ginkgo biloba verificada neste estudo

através do ensaio do cometa foi já identificada em outros estudos que utilizam

estratégias diferentes na avaliação do stresse oxidativo induzido às células tais como a

avaliação do nível da glutationa, da peroxidação lipídica ou de enzimas antioxidantes

celulares (Babich et al, 2011).

Alguns estudos demonstram que ocorre a geração de H2O2 no meio de cultura DMEM

quando este é suplementado com extracto de Ginkgo biloba. Os componentes do meio

tais como sais inorgânicos, vitaminas e aminoácidos contribuem para a geração de ROS.

(Babich et al, 2009). Reconhece-se também que o pH é um parâmetro importante uma

vez que a instabilidade dos polifenóis em pH alcalino conduz à sua auto-oxidação

causando a geração de ROS em meios de cultura modificados com os extractos vegetais

(Babich et al, 2011).

Existem também estudos como o elaborado por Yeu e colaboradores (2000) que se

debruçam sobre compostos únicos presentes no extracto de Ginkgo biloba, como a

49

ginkgetina, demonstrando também a ocorrência de elevados níveis de ROS

intracelulares em células de carcinoma cervical OVCAR-3.

A acção da quercetina (um ginkgoflavonóide) foi também estudada utilizando o ensaio

do cometa demonstrando-se que esta danifica de modo significativo o DNA através de

quebras nas cadeias do DNA e do aumento de 8-oxoGUA (Silva et al, 2002; Yamashita

e Kawanishi, 2000).

O nível de danos no DNA obtido pode dever-se a um aspecto importante a ter em conta

e que se refere ao facto de, neste estudo, se ter usado extracto bruto, isto é, sem qualquer

processamento após a sua obtenção a partir das folhas da árvore. Deverá notar-se que os

estudos científicos realizados no âmbito do extracto de folhas de Ginkgo biloba têm por

base o extracto padrão EGb761 que é processado de modo a obter-se 24% de

flavonóides glicosilados, 6% de terpenóides e 5 a 10% de ácidos orgânicos (Vasseur, et

al, 1994). Ou seja, os ácidos ginkgólicos que, pelas suas propriedades tóxicas, são

practicamente removidos dos extractos processados (Jaggy e Koch, 1997) estavam

presentes no extracto utilizado neste estudo.

De acordo com vários estudos, os ácidos ginkgólicos presentes na Ginkgo biloba têm

demonstrado propriedades citotóxicas, mutagénicas, carcinogénicas e genotóxicas (Liu

e Zeng, 2009; Fuzzati et al, 2003; Hecker et al, 2002; Baron-Ruppert e Luepke, 2001;

Koch et al, 2000; Westendorf e Regan, 2000; Siegers, 1999). Posto isto, existem

orientação de várias autoridades reguladoras que requerem a remoção parcial dos ácidos

ginkgólicos de extractos de Ginkgo biloba usados terapeuticamente de modo a obter-se

uma concentração limite de, no máximo, 5ppm.

No estudo de Siegers (1999) o potencial tóxico dos ácidos ginkgólicos foi testado em

várias linhas celulares humanas e de animais (I-407, HepG2, HaCat, LLC-MK2 e LLC-

PK1) representando deste modo diferentes sistemas de órgãos. Tendo por base o teste

IC50 verificou-se que os dois extractos de folhas de Ginkgo biloba padrão (com 2,2 e 3

ppm de ácidos ginkgolicos) foram significativamente menos citotóxicos que as fracções

contendo ácidos ginkgólicos. Estima-se que o extracto bruto de Ginkgo biloba contenha

2,2% deste tipo de ácidos (Siegers, 1999).

Estudos demonstram que os ácidos ginkgólicos originam uma libertação de lactato

desidrogenase (LDH) indicando que a sua actividade tem por base danos na membrana

50

celular. Por sua vez o extracto padrão EGb761 não induz esta libertação mesmo em

concentrações elevadas demonstrando não possuir propriedades citotóxicas. No entanto,

inibe a proliferação celular (Heckeret al, 2002).

O estudo de Hecker e colaboradores (2002) demonstrou que os ácidos ginkgólicos

exercem efeitos tóxicos complexos que, dependendo do tipo celular e da concentração

utilizada, podem causar diferentes padrões de dano e culminar em morte celular por

apoptose ou necrose.

Por sua vez, um estudo de Liu e Zeng (2009) demonstrou que a toxicidade dos ácidos

ginkgólicos em células HepG2 foi superior à estimada em hepatócitos primários de

ratos devido a diferenças no metabolismo de fase II. Estudos realizados em hepatócitos

primários de rato demonstraram existir morte celular quando as células foram incubadas

com ácidos ginkgólicos na concentração de 10 mg/L e quebras de cadeia e indução da

proliferação celular em concentrações inferiores (0,1 a 3 mg/L) (Hecker et al, 2002). As

concentrações utilizadas nos estudos referenciados são muito superiores às adicionadas

às células HepG2 no presente estudo. Assim, ocorrendo um coerente aumento na

citotoxicidade positivamente correlacionado com o aumento da concentração de ácidos

ginkgólicos, a questão – concentrações de extracto de Ginkgo biloba tendo em vista

uma posterior transição dos resultados obtidos in vitro para efeitos in vivo – é algo

difícil de avaliar. As concentrações de Ginkgo biloba usadas no presente estudo não têm

uma relevância fisiológica em termos de um organismo no seu todo, como aliás

acontece na maioria dos estudos. Os testes realizados em células em cultura são, no

entanto, a primeira etapa nos estudos de compostos possivelmente terapêuticos.

O estudo de Liu e Zeng (2009) revelou que a combinação de toma de ácidos ginkgólicos

e fármacos como o Omeprazole (indutores das enzimas CYP1A e 3A) pode conduzir à

biotransformação destes ácidos em compostos ainda mais tóxicos, tendo esta descoberta

relevância ao nível da polimedicação em que os indivíduos combinam vários tipos de

fármacos com suplementos com extracto de Ginkgo biloba vendido em farmácias,

ervanárias e supermercados.

Por outro lado, os ácidos ginkgólicos já demonstram possuir acções benéficas como

actividade moluscicida (controle de moluscos, como lesmas e caracóis) (Chen et al,

2007), antimicrobiana e funções antitumorais (Chen et al, 2008). Relativamente ao

Toxoplasmagondii causador de toxoplasmose verificou-se que os ácidos ginkgólicos

51

inibem o seu crescimento e são menos tóxicos que a Azitromicina (antibiótico) para

células HFF (Hecker et al, 2002).

Desde a introdução do Paraquato como herbicida em 1962 que se especula acerca do

seu mecanismo de citotoxicidade (Peter et al, 1992). Estudos demonstram que esta

toxicidade ocorre via peroxidação lipídica (Tawara et al, 1996), dano oxidativo

mitocondrial (Cochemé e Murphy, 2008) e danos no genoma (Peter et al, 1992). Em

investigação científica o PQ é utilizado para aumentar os níveis do radical superóxido

quando se pretende investigar o stresse oxidativo (Cochemé e Murphy, 2008).

Os danos pelo Paraquato podem ser induzidos directamente na molécula de DNA ou

através da produção de radicais livres devida à forte peroxidação lipídica induzida. A

peroxidação de lípidos polinsaturados dá origem a uma gama de substâncias que

possuem o potencial de danificar o DNA. Estas substâncias incluem peróxidos lipídicos

e espécies que contém electrões desemparelhados como os radicais alcoxil e peroxil

(Martínez-Tabche et al, 2004; Burcham, 1998).

O potencial genotóxico do PQ tem sido estudado em diferentes organismos e linhas

celulares desde 1970 revelando a indução de alterações cromossómicas e

genotoxicidade. A acumulação de H2O2 gera a produção dos radicais hidroxilo

altamente tóxicos através da reacção de Fenton (Nicotera et al, 1985; Tanaka e Amano

1989) e consequentemente quebras na cadeia de DNA e degradação da desoxiribose

(Salam et al, 1993; Martínez-Tabche et al, 2004). Também têm sido relatadas

modificações na actividade de enzimas mitocondriais (Konstantinova e Russanov,

1999). Por outro lado, também existem estudos em que estas alterações não foram

observadas (Ortiz et al, 2000).

No entanto, a genotoxicidade deste herbicida revela-se pouco estudada

comparativamente ao que se sabe sobre os mecanismos pelos quais o Paraquato induz

peroxidação lipídica e danos na mitocôndria. Posto isto, os resultados obtidos neste

estudo tiveram pouco termo de comparação e a sua comprovação deveria ser feita com

estudos posteriores usando outras técnicas de analise de danos no DNA.

52

Os resultados obtidos neste estudo demonstraram o aumento significativo do dano

oxidativo para as concentrações de Paraquato 1 e 1,5 µM às 4 e 24 horas de incubação o

que era expectável visto que a metabolização deste composto na célula, como já foi

referido, acarreta a produção de espécies reactivas de oxigénio. A pouca diferença entre

ensaios com e sem tratamento enzimático FPG após 1 hora de incubação para todas as

concentrações estudadas está de acordo com o estudo realizado por Dusinská e

colaboradores, apesar de, neste estudo de 1998 os valores de percentagem de DNA na

cauda serem superiores visto que as células utilizadas – macrófagos alveolares e células

epiteliais tipo II – não possuirem os mecanismos de destoxificação presentes nas células

HepG2.

O estudo de Martínez-Tabche e colaboradores (2004) demonstrou uma diminuição no

nível de danos no DNA induzidos pelo Paraquato no último período de incubação (8

dias) provavelmente como resultado da reparação estimulada pela mutagénese. No

presente estudo verificou-se uma tendência de diminuição (apesar de não significativa)

no nível de dano oxidativo das 4 para as 24 horas de incubação das células para a

concentração de 1 µM de Paraquato. A avaliação de uma exposição das células ao

Paraquato alargada no tempo poderia esclarecer esta dinâmica celular.

Um dos resultados obtidos neste estudo e que não vai de encontro ao estudo de

Dusinská e colaboradores (1998), em que com o aumento da concentração de Paraquato

ocorre um concomitante aumento nos níveis de dano do DNA das células, é o facto de,

aos 30 minutos de incubação, para a concentração PQ = 5 µM o nível de quebras de

cadeia de DNA diminuir comparativamente à concentração PQ = 1,5 µM. Para o

mesmo tempo, o dano oxidativo diminui de forma significativa de PQ = 1,5 µM para

PQ = 2 µM. Uma explicação possível poderá ser a existência de proteínas de Multi-

Drug Resistance (MDR) nas células HepG2. As proteínas MDR são capazes de

bombear os xenobióticos para fora da citomembrana, usando a energia do ATP. Este

mecanismo é complexo e envolve a sobrexpressão destas proteínas transportadoras de

drogas quando as células são expostas a compostos tóxicos como o Paraquato. Apesar

de as células utilizadas no estudo de Dusinská e colaboradores (1998) também

expressarem este tipo de proteínas, este mecanismo deverá ser mais expressivo na linha

celular HepG2 visto tratarem-se de células tumorais e serem células hepáticas (Gao et

al, 2007).

53

Interessante será também verificar que as concentrações de Paraquato utilizadas no

estudo aqui apresentado e no estudo de Dusinská e colaboradores (1998) de modo a

obter resultados significativos em termos de genotoxicidade são da ordem dos

micromolar (µM) (10 µM é a concentração mais elevada do estudo de 1998 obtendo-se

para esta concentração uma percentagem de DNA na cauda dos cometas na ordem dos

60%). No entanto, nos estudos sobre o mecanismo de toxicidade do Paraquato através

da peroxidação lipídica e de danos na mitocôndria as concentrações utilizadas são

significativamente superiores. Por exemplo, segundo o estudo de Peter e colaboradores

(1992) em termos de peroxidação lipídica induzida por Paraquato a concentração de 2,5

mM é a concentração mínima para que os resultados comecem a ser significativos.

Posto isto, a indução de genotoxicidade deverá ser alvo de maior interesse por parte da

comunidade científica de modo a compreender-se melhor esta faceta da citotoxicidade

induzida pelo Paraquato.

Vários compostos têm sido utilizados na indução de stresse oxidativo, nomeadamente o

peróxido de hidrogénio (H2O2), o cloreto de cádmio (CdCl2), sulfato e cobre (CuSO4),

luz visível e poluentes ambientais em geral (Shukla et al, 2011). Mas muitos outros

compostos têm sido estudados como potenciais indutores deste tipo de danos no DNA e

o presente estudo propôs-se também a estudar de que forma o Paraquato poderia ser

utilizado na indução do dano oxidativo. E, de facto, os resultados obtidos demonstram

que este herbicida é capaz de induzir stresse oxidativo sem aumentar o nível de danos

de cadeia quando as células são submetidas às concentrações de 1 ou 1,5 µM durante

pelo menos 4 horas. É de salientar, no entanto, que estes resultados foram obtidos tendo

por base um estudo feito em células HepG2 que, sendo células de carcinoma de fígado

possuem enzimas de destoxificação, protectoras da célula em geral e do DNA em

particular, que poderão estar presentes de forma menos significativa noutros tipos de

células, pelo que a concentração utilizada e o tempo de exposição das células ao

herbicida podem variar muito na obtenção dos mesmo resultados. O trabalho de

Dusinská e colaboradores (1998) demonstra as diferenças que existem em termos de

dano no DNA para as mesmas concentrações de Paraquato e os mesmos tempos de

exposição mas utilizando dois tipos de células diferentes – macrófagos alveolares e

pneumócitos.

54

Pretendendo-se estudar um efeito quimioprotector do extracto de Ginkgo biloba,

verificou-se que uma pré-incubação de 24 horas das células HepG2 com concentrações

de 0,5 e 5 g/L de extracto de folhas de Ginkgo biloba acarretou um aumento do dano

oxidativo do DNA quando estas foram submetidas ao tratamento com Paraquato 1 e 1,5

µM durante uma hora. O aumento deste tipo de danos no DNA comparativamente aos

resultados obtidos para as mesmas concentrações e tempo de exposição ao Paraquato

em células não pré-tratadas é substancial, sendo o extracto de Ginkgo biloba o pró-

oxidante de maior destaque. A incubação com PQ, durante uma hora, não aumentou o

nível de danos de DNA além daquele já previamente obtido para os ensaios com

extracto bruto de Ginkgo biloba, 24 horas – não se verificou um efeito sinergético na

indução de dano oxidativo quando o PQ é adicionado de forma consecutiva ao extracto.

Os resultados obtidos na avaliação dos danos no DNA para a adição conjunta às células

de extracto de Ginkgo biloba e Paraquato – diminuição significativa do nível de danos

no DNA comparativamente aos danos obtidos na adição consecutiva destes compostos –

pode indicar a activação de mecanismos de protecção das células. Muitos tipos de

células e nomeadamente as células de carcinoma hepático HepG2 são dotadas de

estratégias que permitem a sua sobrevivência, nomeadamente as proteínas MDR já

mencionadas. Necessitando esta hipótese de ser corroborada, esta poderá ser uma das

explicações que integrada noutras permitem perceber a biologia complexa da célula

quando exposta a compostos citotóxicos.

Assim, apesar de a maioria dos estudos demonstrar uma faceta quimioprotectora dos

compostos fenólicos existentes em produtos de origem vegetal (pelo que um dos

possíveis resultados poderia ser que o extracto de folhas de Ginkgo biloba facilitasse a

destoxificação do Paraquato e prevenisse a oxidação e mutação do DNA), os resultados

obtidos neste estudo vão de encontro ao pequeno número de estudos que demonstram

uma capacidade pró-oxidante deste extracto.

A um nível mais técnico pode fazer-se um apontamento relativamente aos ensaios

cometa controlo em que as células HepG2 não foram sujeitas a nenhum tratamento,

permanecendo todo o tempo em meio de cultura DMEM. Muitos autores defendem que

um baixo nível de danos no DNA obtido nos ensaio cometa controlo são o melhor

indicador de que as células estão vivas e capazes a facultar resultados fidedignos. Os

55

ensaios cometa são mais fiáveis na avaliação da viabilidade celular (feita nas amostras

antes de estas serem sujeitas aos diversos estudos) que o teste mais comummente

utilizado – o teste de exclusão pelo azul de tripano – visto que neste teste as células

podem captar o corante sem estarem mortas: este teste apenas testa a integridade da

membrana celular (Collins et al, 2008).

A principal dificuldade encontrada ao longo da execução dos ensaios do cometa foi a

perda dos géis. Esta situação ocorreu preferencialmente após a incorporação das células

em agarose LMP e ocasionalmente durante as etapas de lise ou electroforese. A

principal explicação apontada pelos investigadores tem sido o facto de, em atmosfera

húmida, os géis não aderirem tão bem às lâminas de vidro. Uma das possíveis soluções

é a substituição das lâminas por filme plástico para agarose (Gelbond®). Esta opção

apesar de ser mais dispendiosa garante a aderência dos géis.

56

6. Conclusões

As plantas medicinais são geralmente consideradas como possuidoras de uma ampla

gama terapêutica e baixos níveis de risco toxológicos. No entanto, os fármacos

derivados de plantas podem conter constituintes que exercem efeitos secundários não

desejados (Ernst e Barnes, 1998). Deste modo, os produtos fitoterapêuticos, assim como

as drogas sintéticas, devem ser avaliados por critérios de eficácia, qualidade e segurança

(Hecker et al, 2002; Couzinier e Mamatas, 1986).

O presente estudo permite inferir, ao nível de ensaios em cultura de células in vitro, que

a incubação com extracto aquoso bruto de folhas de Ginkgo biloba, isto é, feito a partir

de folhas da árvore sem qualquer processamento posterior, poderá representar um

potencial perigo genotóxico devido, principalmente, à presença de ácidos ginkgólicos.

Os estudos de Zuang (2001) e Hecker e colaboradores (2002) já tinham demonstrado a

redução do número de células viáveis quando expostas a este extracto vegetal e o

presente estudo contribuiu, com dados genotóxicos, para uma compreensão alargada dos

mecanismos subjacentes à acção nefasta que o extracto bruto pode representar para as

células.

O potencial antigenotóxico e quimioprotector já descrito noutros estudos sobre o

extracto de folhas de Ginkgo biloba foi também refutado nos ensaios realizados. Este

tipo de conclusões tem sido retirada para vários extractos de origem vegetal, nutrientes e

micronutrientes que são empiricamente considerados benéficos.

Este estudo, no entanto não afasta os notórios benefícios da toma do extracto de Ginkgo

biloba na melhoria das capacidades cognitivas, efeito dilatador dos vasos sanguíneos e

impedimento da oxidação do colesterol LDL, sendo consequentemente importante na

prevenção de doenças vasculares. A toma de fármacos à base de Ginkgo biloba

vendidos em farmácias está, à partida, isenta de riscos uma vez que há um

processamento do extracto de modo a que a concentração de ácidos ginkgólicos não

ultrapasse os 5 ppm, concentração esta considerada segura. Por outro lado, os

ginkgolides e o bilobalide já demonstraram ser capazes de ultrapassar a barreira hemato-

encefálica que é o principal entrave de muitos compostos estudados que, apesar de

potencialmente benéficos, não exercem qualquer função em estudos in vivo (Lang et al,

2010). A questão levantada neste estudo coloca-se quando o extracto de folhas de

57

Ginkgo biloba, é obtido directamente das folhas destas árvores sendo depois os seus

princípios benéficos e nefastos extraídos em água. Existem dois aspectos a ter em conta

neste caso: o primeiro prende-se com o facto de esta infusão natural parecer à partida

inócuo podendo conduzir a uma ingestão acima do recomendável; além disto, deve

notar-se que os benefícios do extracto de Ginkgo biloba são principalmente

direccionados para uma faixa etária acima dos 40 anos o que a nível genético pode

acarretar um efeito nefasto sinergético uma vez que, aos danos no DNA e mutações

adquiridos ao longo da vida, se poderão juntar os danos induzidos por constituintes

prejudiciais da toma do extracto. Em última análise isto poderia potenciar o

desenvolvimento de doenças com uma base genética, como o desenvolvimento de

cancro.

É por esta razão que a produção de extractos de plantas medicinais padrão deve

obedecer ao princípio do seu enriquecimento em compostos terapeuticamente relevantes

e exclusão de substâncias com possíveis propriedades nefastas. Assim, durante a

produção do extracto padrão de folhas de Ginkgo biloba, EGb 761, que é

comercializado, as fracções contendo ácidos ginkgólicos são removidas enquanto as

concentrações mínimas dos constituintes terapeuticamente activos estão garantidas. A

eliminação destes compostos e outros alquilfenóis do extracto padrão é justificável sob

considerações toxicológicas e, por razões de segurança, não é aceitável permitir

concentrações destes compostos que excedam os níveis propostos (Hecker et al, 2002).

A relevância clínica desta afirmação é sublinhada por alguns relatos médicos em que se

verificou o desenvolvimento de dermatites de contacto sistémicas após a ingestão oral

de suplementos de Ginkgo biloba com elevadas quantidades de ácidos ginkgólicos

(Chiu et al, 2002).

Uma questão relevante prende-se com o facto de cerca de 25% das drogas

comercializadas terem origem vegetal. Mas, apesar disso, esta é uma com um enorme

potencial de evolução visto existirem entre 250 000 a 500 000 espécies vegetais sendo

que apenas uma pequena percentagem está a ser estudada.

O estabelecimento de plantas in vitro é provavelmente um dos pontos cruciais na

elaboração de fármacos à base de espécies vegetais isto porque, quando a planta ou

parte de planta têm origem no campo pode ocorrer uma grande variabilidade dos

compostos benéficos e nefastos sendo esta inconstância uma das principais dificuldades

58

de uma produção em massa. Outras questões prendem-se com a bioacumulação de

substâncias tóxicas, por parte da planta, devido à poluição e também com a salvaguarda

dada à biodiversidade que, por vezes, é colocada em causa com a sobre-exploração de

algumas plantas.

Os resultados obtidos neste estudo utilizando a técnica do ensaio do cometa devem ser

complementados com vários outros testes, como os teste de redução do tetrazólio MTT,

método de exclusão do azul de tripano ou de captação do vermelho neutro de modo a

avaliar-se o crescimento celular, a viabilidade, a integridade e a morfologia das células

quando incubadas com o extracto vegetal de Ginkgo biloba (Hecker et al, 2002). A

avaliação dos efeitos deste extracto noutras linhas celulares e modelos in vivo permitiria

deslindar, de uma forma mais aprofundada, quais os riscos reais da toma de uma infusão

de folhas de Ginkgo biloba.

A realização do trabalho aqui apresentado permitiu concluir que a utilização do

Paraquato é um meio eficaz e barato de se produzir dano oxidativo na linha celular

HepG2. De facto este herbicida é capaz de aumentar a geração de radicais livres

concomitantemente com a formação enzimática de radicais monocatiónicos de

Paraquato na presença de NADPH, induzindo posteriormente dano oxidativo no DNA

(Tanaka e Amano, 1989; Nicotera et al, 1985; Bus et al, 1974; Dodge e Harris 1970;

Gage, 1968).

A relevância dos compostos capazes de induzir este tipo de danos, expressa-se na

investigação fundamental de danos no DNA e a sua reparação in vitro, em estudos de

quimioprotecção onde se avalia a capacidade de protecção das células por parte de

fitoquímicos ou a acção de nutrientes e micronutrientes contra danos oxidativos. Além

disto, deverá notar-se que o dano oxidativo base no DNA é um possível factor da

etiologia do cancro, pelo que estudos nesta área são também desejáveis (Collins, 2004).

O presente estudo revelou também que o aumento da concentração de Paraquato

acrescentado a células HepG2 contribui para o acréscimo dos danos no DNA até ao

ponto em que, provavelmente, as células começam a bombear o xenobiótico de novo

para o meio de cultura diminuindo a quantidade de danos no DNA como forma de

59

proteger a sua integridade. Este pequeno indício de um mecanismo de protecção contra

compostos citotóxicos e genotóxicos coloca em hipótese a realização de estudos

posteriores que o confirmem ou refutem mas que, mesmo assim, poderão elucidar a

comunidade científica sobre aspectos como a importância das proteínas MDR na

resistência das células cancerígenas às drogas quimioterapeuticas. Um outro tipo de

estudos possíveis poderá debruçar-se sobre a forma como certos compostos de origem

vegetal poderiam ser úteis, combinados com a quimioterapia, ao inibirem a acção das

proteínas MDR, como demonstra o estudo de Li e colaboradores (2011). Esta é uma

área ainda inexplorada cujo potencial poderá ser significativo.

Como anteriormente referido, deve ter-se em conta que as concentrações de Paraquato e

o tempo de exposição aferidos neste estudo são válidos para a linha celular HepG2 com

todas as características inerentes a uma linha celular de carcinoma hepatocelular,

podendo estas características ser distintas ou até inexistentes noutras linhas celulares ou

em células recentemente obtidas de uma origem in vivo.

Os ensaios do cometa são uma técnica que, sendo possível variar ou introduzir etapas ao

protocolo base, permitem uma avaliação aprofundada e específica da acção de

diferentes compostos ao nível do DNA. Os ensaios do cometa – FISH (hibridação in

situ fluorescente) utiliza sondas de cDNA ou oligonucleotidos que reconhecem

sequências de interesse, sendo úteis na avaliação das taxas de reparação especificas de

um gene após a exposição a baixas doses a um agente que danifica o DNA visto que,

permitem localizar cromossomas, regiões de cromossomas, classes de DNA ou genes

específicos. Outra variante interessante é a exposição das células ao composto teste após

a sua incorporação na agarose LMP e após a etapa de lise. Deste modo, a avaliação do

efeito do composto ao nível do DNA é directa e não está dependente do metabolismo

celular (Collins, 2004).

Concluindo, o presente estudo permitiu apurar:

O aumento da concentração de Paraquato contribui para o acréscimo dos

danos no DNA das células HepG2 até ao ponto em que mecanismos de

protecção celular são activados contra uma toxicidade aguda;

60

O aumento do tempo de exposição das células ao Paraquato nas

concentrações menores (1 e 1,5 µM) resulta no incremento do dano

oxidativo;

A utilização de Paraquato é uma alternativa viável aos métodos usados

para a indução de dano oxidativo no DNA. Para as células HepG2 obtém-se

o nível máximo de dano oxidativo após 4 horas de incubação ao Paraquato

nas concentrações de 1 ou 1,5 µM;

O extracto bruto de folhas de Ginkgo biloba é capaz de aumentar o nível de

danos no DNA devido à presença de ácidos ginkgólicos;

Este extracto vegetal, em bruto, induz o acréscimo do dano oxidativo do

DNA ao longo do tempo e não manifesta o potencial antigenotóxico descrito

em estudos científicos que utilizam extracto processado.

61

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Efeito do extracto de folhas de Ginkgo biloba em células HepG2 … · 2013. 11. 29. · aumento do dano oxidativo no DNA, nas concentrações 1 e 1,5 µM, após 4 horas de incubação