FERNANDA GINANI ANTUNES

EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CÉLULAS-TRONCO DA

POLPA DE DENTES DECÍDUOS HUMANOS

NATAL, RN

2017

1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE DENTES

DECÍDUOS HUMANOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutora em Patologia Oral.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza

NATAL, RN

2017

2

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia

Antunes, Fernanda Ginani.

Efeito do laser de baixa intensidade na atividade biológica

de células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos / Fernanda Ginani Antunes. - 2017.

97 f.: il.

Tese (Doutorado em Patologia Oral) - Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de

Pós-graduação em Patologia Oral, Natal, 2017.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.

1. Terapia com luz de baixa intensidade - Tese. 2. Células-

tronco - Tese. 3. Polpa dentária - Tese. 4. Proliferação celular - Tese. 5. Biomateriais - Tese. I. Barboza, Prof. Dr. Carlos

Augusto Galvão. II. Título.

RN/UF/BSO BLACK D21

3

4

“Sabemos como é a vida: num dia dá tudo certo e no outro as coisas já não

são tão perfeitas assim. Altos e baixos fazem parte da construção do nosso

caráter. Afinal, cada momento, cada situação que enfrentamos em nossas

trajetórias é um desafio, uma oportunidade única de aprender, de se tornar

uma pessoa melhor. Só depende de nós, das nossas escolhas...

Não sei se estou perto ou longe demais, se peguei o rumo certo ou errado. Sei

apenas que sigo em frente, vivendo dias iguais de forma diferente. Já não

caminho mais sozinho, levo comigo cada recordação, cada vivência, cada

lição. E, mesmo que tudo não ande da forma que eu gostaria, saber que já

não sou a mesma pessoa de ontem me faz perceber que valeu a pena. Procure

ser uma pessoa de valor, em vez de procurar ser uma pessoa de sucesso. O

sucesso é só consequência”.

Albert Einstein

5

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

À DEUS, por sempre me mostrar um caminho nos momentos

difíceis, não deixando o desânimo tomar conta, por me mostrar toda

a força, a fé e o potencial existentes em mim e por ter colocado

pessoas tão especiais ao meu lado, sem as quais certamente não

teria chegado tão longe.

À minha mãe Viviani Ginani e minha irmã Amanda

Ginani,por sempre acreditarem na minha capacidade e me

acharem a melhor de todas, mesmo não sendo. Agradeço o apoio,

o amor incondicional eaamizade eterna! #nós3sempre... Serei

eternamente grata por tudo. Amo vocês!!

Ao meu amigo e marido, André Cavalcanti, por estar sempre

ao meu lado, me incentivando e me fazendo acreditar que posso

mais do que imagino. Obrigada pela paciência, por todos os

momentos de alegria, dúvida e conquista compartilhados. Te amo!

Ao meu orientador, amigo para vida, chefe querido,Prof. Dr.

Carlos Augusto Galvão Barboza, palavras não conseguem

traduzir minha gratidão por esses 10 anos de orientação e amizade.

Agradeço por ter acreditado e confiado no meu trabalho desde o

início. Hoje, posso dizer, sem sombra de dúvida, que você foi

fundamental na minha vida, um dos maiores exemplos de

profissional... o grande responsável pelo meu encanto com a

pesquisa científica; obrigada por ter pego na minha mão e me

conduzido de forma segura neste caminho e ter se tornado um

amigo com quem eu posso contar.

6

AGRADECIMENTOS

Às minhas amigas, presentes da pós-graduação para a vida, Luciana

Rabêlo, Ruth Medeiros, agradeço pela disposição em ajudar sempre que

precisei (mesmo que reclamassem algumas vezes), por terem aguentado meus

abusos e minhas chatices. Contem sempre com minha amizade... sou a chata

necessária na vida de vocês!

Ao amigo Diego Moura Soares, meu irmão de coração. Obrigada por

estar sempre disposto a me ajudar. Ainda que a distância nos separe, você

estará sempre no meu coração. Nossa amizade e sintonia é eterna.

Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, que abriu as portas

do seu laboratório (Biopol) como se eu fosse um dos seus alunos durante todos

esses anos. Agradeço a oportunidade de tê-lo ao meu lado, ajudando no meu

crescimento profissional e por ter se tornado um amigo.

A todos os colegas do BIOPOL - UFRN, que sempre me receberam de

forma tão gentil no laboratório. Agradeço especialmente a Jailma, Day, Karol,

Rony e Moacir que deixaram mais divertidos meus dias de experimento, e por

sempre estarem dispostos a me ajudar, seja emprestando reagente, a chave

do laboratório ou dividindo a sobremesa para aliviar o estresse.

Aos colegas do laboratório de Cultura de Células - UFRN,

especialmente a bruxa querida do meu coração, Ana Katarina Menezes, pela

disponibilidade em ajudar, pela troca de experiências e por todos os momentos

de descontração vivenciados no laboratório, mesmo quando tudo dava errado.

Chegou a hora da veterana dizer até logo...esse dia tinha que chegar né?!

Sentirei saudades...

Aos colegas da Patologia Oral por todo apoio e paciência com a

biomédica que nunca tinha visto uma lâmina de cistos e tumores

odontogênicos ou de patologias de glândulas salivares na vida. Nos momentos

que pensei em desistir, lembrava do esforço de vocês para que eu não me

sentisse excluída e tive forças para continuar.

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Às Profas. Dra. Lélia Batista de Souza e Dra. Márcia Costa Miguel,

pela participação na banca da qualificação, contribuindo para o aprimoramento

deste trabalho.

Aos Professores do Programa de Doutorado em Patologia Oral, por

todos os ensinamentos e incentivos, que contribuíram para o meu crescimento

acadêmico.

Aos meus amigos da graduação Juliana Alves, Hudson Bezerra,

Jannyce Guedes, Bruno Tardelli, Gabriela Diniz, Hermany Munguba,

Hylarina Diniz, que compartilharam comigo momentos especiais desde o início

da minha jornada pela vida científica.

Aos amigos do grupo de pesquisa em Biologia Crânio-Facial, em

especial Mardem Portela e Haroldo Gurgel, pelas boas energias transmitidas

em todos os momentos e por acreditarem no meu potencial. Aos novatos,

aproveitem todas as oportunidades que surgirem nessa vida meio louca de

cientista. Desejo um lattes com muitos artigos publicados!

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em especial ao

Departamento de Morfologia e ao Departamento de Bioquímica por ter

proporcionado as condições necessárias para a realização deste trabalho e por

serem a extensão da minha casa.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo suporte financeiro na forma de bolsa de doutorado.

Ao CNPq que financiou a pesquisa através do edital universal.

À toda minha família e amigos, que torceram para o sucesso deste

trabalho e pela compreensão em todos os momentos de ausência.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho, meu sincero agradecimento!

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ALP do inglês alkaline phophatase – fosfatase alcalina

APC Aloficocianina

ASC do inglês adult stem cell– célula-tronco adulta

AsGa Arsênio e Gálio

ATP do inglês adenosine triphosphate – adenosina trifosfato

Ca2+ Cálcio

CD marcador de superfície celular

CFU-C do inglês Colony-forming unit in culture – Unidade de

formação de colônia em cultura

Cm Centímetro

cm2 centímetro ao quadrado

CNPase enzima 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase

CO2 gás carbônico

COL 1 colágeno tipo 1

CTM célula-tronco mesenquimal

DAPI corante fluorescente 4'-6-Diamidino-2-phenylindole

DMF Dimetilformamida

DNA do inglês, Deoxyribonucleic Acid – ácido

desoxirribonucléico

DP desvio-padrão

DPSC do inglês postnatal dental pulp stem cells - células-tronco da

polpa dental

DSSP do inglês dentin sialophosphoprotein – sialofosfoproteína

dentinária

ESC do inglês embrionic stem cell - célula-tronco embrionária

FDA do inglês Food and Drug Administration

FITC Fluorescina isoticianato

g/mol grama por mol

GFAP do inglês glial fibrillary acidic protein – proteína ácida fibrial

gliar

h Hora

9

HA/TCP hidroxiapatita associada a fosfatotricálcio

HLA-DR do inglês human leukocyte antigen–DR – antígeno de

leucócitos humanos

IMA Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano

InGaAlP Índio, gálio, alumínio e fósforo

ISCT do inglês International Society for Cellular Therapy –

Sociedade Internacional de Terapia Celular

J/cm2 joule por centímetro ao quadrado

kV quilovolt, medida de tensão elétrica

LADISPO Laboratório de Dispositivos Poliméricos

LBI laser de baixa intensidade

MEC matriz extracelular

MEM do inglês minimum essential media– meio essencial mínimo

mg/mL miligrama por mililitro

mL Mililitro

mM Milimolar

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio

mW Miliwatt

NeuN do inglês neuronal nuclear antigen – antígeno nuclear

neuronal

NF-ĸB do inglês nuclear transcription factor kappa B - Factor

Nuclear Kappa β

NFM Neurofilamento M

NIR do inglês near infrared – próximo ao infravermelho

nm Nanômetro

NO do inglês nitric oxide – óxido nítrico

P1 primeiro subcultivo

P2 segundo subcultivo

P3 terceiro subcultivo

P4 quarto subcultivo

PBS do inglês Phosphate-Buffered saline – solução salina

tamponada com sais de fosfato

PDLSC do inglês periodontal ligament stem cells – células-tronco do

ligamento periodontal

10

PE Ficoeritrina

PEO do inglês polyethylene oxide - óxido de polietileno

pH potencial de hidrogênio iônico

PI iodeto de propídeo

PLA do inglês Poly(lactic acid) – ácido polilático

PVA do inglês Poly(vinyl alcohol)- Poli(Álcool Vinílico)

RNA do inglês ribonucleic acid – ácido ribonucléico

ROS do inglês reactive oxigen species – espécies reativas de

oxigênio

s Segundos

SFB soro fetal bovino

SHED do inglês stem cells from human exfoliated teeth - células-

tronco da polpa de dentes decíduos humanos esfoliados

T0 momento imediato após a primeira irradiação

T24 intervalo de tempo de 24 horas após a primeira irradiação

T48 intervalo de tempo de 48 horas após a primeira irradiação

T72 intervalo de tempo de 72 horas após a primeira irradiação

UI/mL unidades internacionais por mililitro

µg/mL micrograma por mililitro

µL Microlitro

µm Micrometro

ºC grau Celsius

11

RESUMO

O laser de baixa intensidade (LBI) tem apresentado resultados positivos na

proliferação de diversos tipos celulares in vitro. A primeira parte do trabalho

avaliou o efeito do LBI na proliferação e viabilidade de células-tronco da polpa

de dentes decíduos humanos esfoliados (SHED). As células foram irradiadas

ou não (controle) com um laser diodo InGaAlP (660 nm, 30 mW, modo de ação

contínuo) usando duas diferentes doses (0,5 J/cm2 por 16 segundos e 1,0

J/cm2 por 33 segundos) e os três grupos foram estudados nos intervalos de 0,

24, 48 e 72 h. Foi observado que a dose de 1,0 J/cm2 promoveu um aumento

na proliferação celular nos intervalos de 48 e 72 h quando comparada ao grupo

controle e à dose de 0,5 J/cm2 e a viabilidade celular não foi afetada pela

irradiação ao longo do experimento. Em conjunto, os dados mostraram que os

parâmetros do LBI utilizados (660 nm, 30 mW, 1,0 J/cm2) promoveram

proliferação das SHEDs e mantiveram a sua viabilidade. A partir destes

resultados favoráveis, a segunda parte do trabalho avaliou o efeito do LBI com

os mesmos parâmetros na proliferação de SHEDs cultivadas sobre arcabouços

nanofibrosos de PLA confeccionados pela técnica de eletrofiação. Este

procedimento permite a obtenção de arcabouços tridimensionais que simulam

a matriz extracelular a partir de um biomaterial com propriedades físicas

favoráveis e baixo custo. Três grupos experimentais (G1 – não irradiado; G2 –

irradiado com 0,5 J/cm2; G3 – irradiado com 1,0 J/cm2) foram analisados nos

intervalos de 24, 48 e 72 h. Os resultados indicaram que o PLA não é citotóxico

para as SHEDs e que os grupos submetidos à laserterapia tiveram maior

proliferação celular quando comparados com o grupo controle não irradiado.

Com base nos achados, evidenciou-se que as nanofibras de PLA são

arcabouços favoráveis para o cultivo de SHEDs e que a laserterapia estimulou

a proliferação quando aplicada nas células cultivadas sobre este arcabouço.

Com base nos dados gerais obtidos, conclui-se que a laserterapia nos

parâmetros avaliados apresenta efeitos bioestimulatórios nas SHEDs

cultivadas tanto na superfície padrão (plástico da placa de cultivo) quanto sobre

arcabouços nanoestruturados de PLA.

Palavras-chave: laserterapia; células-tronco; polpa dentária; proliferação

celular; biomateriais; polímeros; eletrofiação.

12

ABSTRACT

The low-level laser therapy (LLLT) has been shown positive results in the in

vitro proliferation of several cell types. The first part of the study evaluated the

effect of LLLT on the proliferation and viability of stem cells from human

exfoliated deciduous teeth (SHED).Cells were irradiated or not (control) with an

InGaAlP diode laser (660 nm, 30 mW, continuous action mode) using two

different doses (0.5 J/cm2 for 16 seconds and 1.0 J/cm2 for 33 seconds) and the

three groups were analyzed at the intervals of 0, 24, 48 and 72 h.It was

observed that the dose of 1.0 J/cm2 promoted an increase in cell proliferation at

the 48 and 72 h intervals when compared to the control group and the dose of

0.5 J/cm2, and that cell viability was not affected by irradiation throughout the

experiment. Taken together, the data showed that the LLLT parameters (660

nm, 30 mW, 1.0 J/cm2) promoted proliferation of SHEDs and maintained their

viability. Based on these favorable results, the second part of the study

evaluated the effect of LLLT with the same parameters on the proliferation of

SHEDs cultured on PLA nanofibrous scaffolds obtained by electrospinning. This

procedure allows obtaining three-dimensional scaffolds that mimic the

extracellular matrix from a biomaterial with favorable physical properties and

low cost.Three experimental groups (G1 - non-irradiated; G2 - irradiated with

0.5 J/cm2; G3 - irradiated with 1.0 J/cm2) were analyzed at 24, 48 and 72 h. The

results indicated that PLA is not cytotoxic to SHEDs and that the groups

submitted to laser therapy had higher cell growth when compared to the non-

irradiated control group. Based on these findings, it was shown that PLA

nanofibers are favorable scaffolds for the cultivation of SHEDs and that laser

therapy stimulated the proliferation when applied to the cells cultured on this

scaffold. Based on the general data obtained, it is concluded that the laser

therapy in the evaluated parameters has biostimulatory effects on the

proliferation of SHEDs on both the standard surface (plastic of the culture plate)

and on nanostructured PLA scaffolds.

Palavras-chave: laser therapy; stem cells; dental pulp; cell proliferation;

biomaterials; polymers; electrospinning.

13

SUMÁRIO

1 REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................... 14

1.1 Células-tronco......................................................................................... 14

1.1.1 Célula-tronco da polpa de dente decíduo humano ........................ 15

1.2 Laser e laserterapia ............................................................................... 18

1.2.1 Mecanismo de ação do laser de baixa intensidade ............................ 20

1.2.2 Ação do LBI nas células em cultivo ............................................... 24

1.3 Engenharia tecidual ............................................................................... 28

1.3.1 Ácido Polilático (PLA) ......................................................................... 30

1.3.2 Eletrofiação .................................................................................... 32

2 OBJETIVOS ............................................................................................. 34 3 ARTIGO I .................................................................................................. 35 4 ARTIGO II ................................................................................................. 56 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................... 75

6 REFERÊNCIAS ........................................................................................ 76

ANEXO ........................................................................................................ 93

14

1. REFERENCIAL TEÓRICO

1.1 Células-tronco

A manutenção do número de células, da matriz extracelular, da

arquitetura e da função dos órgãos ocorre devido à renovação celular que

depende, basicamente, da existência de células com capacidade de auto-

renovação e de diferenciação que são denominadas células pluripotentes,

multipotentes, células de reserva ou células-tronco (PERES, CURI, 2005;

ZAGO, COVAS, 2006).

As células-tronco são definidas como células indiferenciadas que,

quando induzidas corretamente, apresentam grande capacidade de auto-

renovação e de diferenciação em tipos celulares especializados (BARRY, 2003;

HOFFMAN, CARPENTER, 2005; FRESHNEY, STACEY, AUREBACH, 2007).

Elas podem ser primariamente classificadas em dois tipos: células-tronco

embrionárias e células-tronco adultas. Outra forma de caracterização de tais

células baseia-se na capacidade de originar um ou mais tipo celular

especializado: totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes

(KRABBE, ZIMMER, MEYER, 2005; SERAKINCI, KEITH, 2006).

As células-tronco embrionárias (Embryonic Stem Cell – ESC) são

encontradas na massa celular interna do blastocisto (embrioblasto) eoriginam

os mais de 250 tipos celulares diferentes do corpo humano. A capacidade

dessas células de se multiplicarem em cultura sem perder a pluripotência,

assim como a possibilidade de induzir sua diferenciação em diversos tipos

celulares, fez com que as células-tronco embrionárias se tornassem uma

poderosa ferramenta de pesquisa e uma promissora fonte de tecidos para

transplantes (ZAGO, COVAS, 2006). Todavia, o aspecto político, moral e

religioso acerca de sua obtenção, o alto custo de manutenção e manipulação

dos embriões são fatores que têm limitado os avanços nos estudos com

essafonte primária de células totipotentes e pluripotentes. Além do já exposto,

essas células apresentam como desvantagens a dificuldade de controlar o

potencial proliferativo e de diferenciação, o que pode resultar na formação de

teratomas justamente por descontrole dessas propriedades (THOMSON et al.,

15

1998; SHAMBLOTT et al., 1998; GRONTHOS et al., 2000; GOLDBERG,

SMITH, 2004; MURRAY et al., 2007).

As células-tronco adultas ou somáticas (Adult Stem Cell – ASC) são

células indiferenciadas, encontradas em tecidos especializados como a medula

óssea, tecido adiposo e tecido hematopoiético e vêm sendo pesquisadas nos

tecidos dentais de animais e de humanos, com evidência que as mesmas se

reprogramem geneticamente (HARADA et al., 1999; GRONTHOS et al., 2000;

BIANCO et al.,2001). Em geral, essas células são consideradas multipotentes,

tendo a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, porém

restritos ao tipo do folheto germinativo de origem (ectoderma, mesoderma ou

endoderma), e apresentam um melhor controle dos processos de diferenciação

e proliferação in vitro. As ASCs podem ser autogênicas, não incorrendo em

limitações morais, e responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao

hospedeiro. Apesar disso, o fato de não serem pluripotentes e da sua presença

em menor quantidade nos tecidos representam suas desvantagens quando

comparadas às ESCs (SONG et al., 2004).

Caracterizar uma célula como célula-tronco não é tão simples; as

células-tronco praticamente não expressam ou expressam poucos marcadores

de superfície específicos. Em 2006, a Sociedade Internacional de Terapia

Celular (ISCT) estabeleceu um painel de marcadores de superfície celular para

identificação de células-tronco mesenquimais (CTM). Pelo menos 95% da

população de CTMs devem ser positivas para CD73, CD90 e CD105; e

negativas para CD34, CD45, CD11b ou CD14, CD19 ou CD79α, e HLA-DR.

Outro aspecto importante que caracteriza as células-tronco é a capacidade de

diferenciação em osteoblastos, condroblastos e adipócitos em condições de

cultivo celular (DOMINICI et al., 2006).

1.1.1 Célula-tronco da polpa de dente decíduo humano

Células progenitoras odontogênicas foram isoladas e expandidas in vitro

pela primeira vez em 2000 a partir da polpa de dente permamente humano

(GRONTHOS et al., 2000). Os autores observaram que essas células eram

capazes de auto-renovação e diferenciação, in vitro e in vivo, denominando-as

de células-tronco da polpa dental (em inglês Dental Pulp Stem Cell – DPSC).

16

Em 2003, um outro grupo identificou uma população de células

clonogênicas com alta capacidade proliferativa na polpa de dentes decíduos,

capazes de formar uma variedade de tipos celulares, que foram denominadas

células-tronco da polpa do dente decíduo esfoliado (em inglês Stem cells from

Human Exfoliated Deciduous teeth - SHED) (MIURA et al., 2003).

Experimentos com esse tipo celular mostraram que há diferenças significativas

entre a biologia de dentes decíduos e de permanentes e que as SHEDs

apresentam uma taxa de proliferação maior (NAKAMURA et al., 2009), maior

número de divisões celulares – o que pode facilitar sua expansão in vitro –

formação de colônias, capacidade de osteoindução in vivo e a formação de

tecido diferente do complexo dentina-polpa (MIURA et al., 2003). Esses autores

acreditam que as SHEDs representam uma população de células multipotentes

que se encontra em um estágio de maturidade inferior do que o verificado nas

DPSCs.

A obtenção das SHEDs é um processo simples, conveniente e com

pouco ou nenhum trauma, tendo em vista que toda criança perde os dentes

decíduos, sendo essa uma oportunidade perfeita para recuperar e armazenar

células-tronco para futuras aplicações clínicas. Além disso, o uso autógeno

dessas células reduz o risco de reações imunológicas ou rejeição de

transplantes e também elimina a possibilidade de contrair doenças de outro

doador (ARORA, ARORA, MUNSHI, 2009).

O aparecimento dessas células se dá por volta da sexta semana do

desenvolvimento pré-natal humano. Os pesquisadores acreditam que essas

células-tronco se comportam diferentemente das células-tronco adultas (pós-

natal) por se multiplicarem rapidamente e se diferenciarem muito mais rápido

do que as células estaminais adultas, sugerindo que elas são menos maduras

(diferenciadas), e consequentemente, com potencial para se diferenciar em

uma ampla variedade de tipos teciduais (MIURA et al., 2003; SEO et al., 2008;

ARORA, ARORA, MUNSHI, 2009).

As células-tronco da polpa dental compartilham diversos marcadores

com células derivadas da medula óssea, como CD146, colágeno tipo I,

colágeno tipo III, α-actina de músculo liso, fosfatase alcalina, osteonectina,

osteopontina, osteocalcina e fator de crescimento de fibroblasto II. Marcadores

hematopoiéticos como CD14, CD45 e CD34 não foram identificados nessas

17

células (GRONTHOS et al., 2000). Há também a expressão de marcadores

neurais (Nestina, βIII-tubulina, NeuN, GFAP, NFM e CNPase) por ambas as

linhagens, DPSC e SHED, o que sugere a origem mesenquimal dessas células,

fortalecendo a hipótese de serem originadas das cristas neurais. Além da

expressão dos marcadores neurais, outro aspecto que aponta para uma origem

dessas células a partir das cristas neurais é a sua morfologia fibroblastóide

(GRONTHOS et al., 2002; MIURA et a., 2003).

Investigando a crista neural como possível origem das células-tronco da

polpa de dentes decíduos esfoliados (SHED), Volponi, Pang e Sharpe (2010)

verificaram que as SHEDs são uma população heterogênea e que apresentam

características moleculares in vitro semelhantes às demais células-tronco

adultas e às células da crista neural. As células da crista neural são células

multipotentes que apresentam potencial de auto-renovação e de diferenciação

em várias linhagens celulares além de desempenharem um importante papel

no desenvolvimento dentário, pois originam os componentes mesenquimais

dos dentes, incluindo odontoblastos, tecido pulpar, ligamento periodontal e

vascularização apical (VOLPONI, PANG, SHARPE, 2010).

Para induzir a formação de osso, cemento e dentina in vivo, os estudos

experimentais demonstram que as células-tronco da polpa requerem um meio

indutor apropriado e um arcabouço composto por hidroxiapatita e fosfato

tricálcico (HA/TCP) (GRONTHOS et al., 2000; BATOULI et al., 2003). As

células-tronco dos dentes decíduos demonstraram uma forte capacidade de

induzir formação óssea in vivo, apesar de não se diferenciarem diretamente em

osteoblastos nos transplantes, essas células foram capazes de induzir nova

formação óssea atraindo células osteogênicas hospedeiras (MIURA et al.,

2003).

Um estudo utilizando células-tronco da polpa de dentes permanentes,

polpa de dentes decíduos humanos esfoliados e do ligamento periodontal

demonstrou que as três linhagens celulares formaram uma variedade de

tecidos associados ao complexo dentina/polpa, osso, músculo liso, tecido

neural, e endotélio. Transplantes xenógenos com carreador HA/TCP com

DPSC ou SHED geraram, no leito receptor, tecidos com diferentes camadas

odontoblásticas e uma estrutura de matriz dentinária mineralizada. Os autores

concluíram que a presença de populações distintas de células-tronco dentárias

18

associada a carreadores têm o potencial para regenerar estruturas dentárias

(SHI et al., 2005).

Cordeiro et al. (2008) avaliaram as características morfológicas dos

tecidos que se formaram quando fragmentos de dente humano (arcabouços

biodegradáveis) semeados com SHEDs foram transplantados em ratos

imunossuprimidos. Os autores observaram que os tecidos resultantes

apresentaram arquitetura e celularidade bem semelhantesao de um tecido

pulpar. Assim, as SHEDs poderiam ser implantadas diretamente na câmara

pulpar de um dente severamente danificado para regenerar a polpa em seu

interior, evitando a necessidade de tratamento endodôntico (ARORA, ARORA,

MUNSHI, 2009).

Sakai et al. (2010), objetivando estabelecer se os vasos sanguíneos da

papila dental são recrutados a partir do mesênquima vizinho, ou se as

populações locais de células-tronco são capazes de formarem estruturas

vasculares (angiogênese), utilizaram SHEDs semeadas em fragmentos de

elementos dentários (arcabouço celular) e implantaram subcutaneamente em

camundongos imunocomprometidos. Os autores concluíram que as SHEDs se

diferenciam em células endoteliais, promovendo o processo de angiogênese, e

em odontoblastos capazes de gerarem dentina tubular.

1.2 Laser e laserterapia

Nos últimos anos, o aprimoramento da tecnologia nas áreas biomédicas

tem propiciado o advento de novos equipamentos. O laser de baixa intensidade

(LBI) pode ser um bom exemplo dessa tecnologia, tendo diversas

aplicabilidades clínicas. O laser é uma fonte de radiação eletromagnética,

possuindo características especiais que o difere de outras fontes convencionais

incandescentes, tornando seu uso viável em múltiplas aplicações médicas

(SULEWESKI, 2000).

A palavra LASER é um acrônimo do termo em inglês Light Amplification

by Stimulated Emission of Radiation, que significa amplificação da luz por

emissão estimulada de radiação, caracterizando bem a forma pela qual essa

luz é produzida (SULEWSKI, 2000; CATÃO, 2004). A luz do laser pode ser

definida como sendo um conjunto de fótons que seguem uma trajetória

19

ondulatória apresentando características especiais de unidirecionalidade,

coerência e monocromaticidade (CATÃO, 2004; PINHEIRO et al., 2010).

Apesar do interesse nos últimos anos pela laserterapia ter crescido

bastante, os primeiros relatos da utilização dessa técnica datam do início do

século XX. Em 1917, o físico alemão Albert Einstein propôs os princípios físicos

da emissão estimulada, postulando as bases teóricas sobre a manipulação

controlada de ondas de luz (CATÃO, 2004). Os primeiros relatos da utilização

do laser de baixa potência são de 1965, por Sinclair e Knoll, que adaptaram

essa radiação a pratica terapêutica. Nesse mesmo ano, o laser foi utilizado

pela primeira vez na Odontologia por Stern e Sognnaes e após a publicação de

alguns trabalhos a partir de 1968, a laserterapia despertou o interesse sobre os

seus efeitos em tecidos vivos (SULEWESKI, 2000).

De acordo com a sua potência e a capacidade de interação com os

tecidos biológicos, os lasers podem ser classificados em duas categorias: laser

de alta intensidade ou laser cirúrgico (Hight Intensity Laser Treatment) e laser

de baixa intensidade ou laser terapêutico (Low Intensity Level Treatment)

(CATÃO, 2004). O primeiro apresenta efeitos térmicos, propriedades de corte,

vaporização e hemostasia, atuando por meio do aumento da temperatura e

produção de calor; o segundo promove efeitos analgésicos, antiinflamatórios e

cicatrizantes, são absorvidos pelos tecidos e estimulam um efeito biomodulador

(PINHEIRO et al., 2010).

O laser de baixa intensidade (LBI) ou laserterapia refere-se ao uso do

laser em dois diferentes espectros que são estabelecidos a partir do

comprimento de onda utilizado. O espectro de ação vermelho ou visível

apresenta comprimento de onda que varia de 630 a 680 nm, enquanto o

infravermelho ou invisível compreende comprimentos de onda próximo a 700 -

904 nm (BENSADOUIN, NAIR, 2015). O comprimento de onda utilizado

durante a instituição da laserterapia parece influenciar o seu efeito nas células

em cultura. Estudos demonstraram que comprimentos de onda no espectro de

luz vermelha variando entre 600 a 700nm, contribuem com o aumento da

proliferação e diferenciação celular (WILDEN, KARTHEIN, 1998; STEIN et al.,

2005; TUBY, MALTZ, ORON, 2007). Em contrapartida, o espectro de luz

infravermelho com variação do comprimento de onda entre 810 a 830 nm tem

20

sido associado à inibição da taxa proliferativa de alguns tipos celulares

(MOORE et al., 2005; HAWKINS-EVANS, ABRAHAMSE, 2008).

Diversos parâmetros da laserterapia devem ser avaliados a fim de que o

efeito sobre o tecido irradiado seja efetivo. Além do comprimento de onda, são

parâmetros fundamentais para os resultados obtidos: a densidade de energia

ou dose (quantidade de energia por unidade de área transferida ao tecido), a

potência (valor informado pelo fabricante em watts), a densidade de potência

(potência de saída da luz por unidade de área medida em watts dividido por

centímetros quadrados) e o intervalo de aplicação (MOORE et al., 2005).

Outra característica relevante que os lasers apresentam é em relação ao

seu modo de funcionamento. Existem lasers de ondas contínuas, que quando

acionados permanecem ligados continuamente até serem desligados e os

lasers de ondas pulsadas, que mesmo após serem acionados, permanecem

parte do tempo ligados e outra parte desligados, fracionando a liberação da luz

durante o intervalo de aplicação (ALMEIDA-LOPES, 2003).

1.2.1 Mecanismo de ação do laser de baixa intensidade

O mecanismo de ação do laser de baixa intensidade no sistema

biológico envolve inicialmente a fotoativação de uma molécula fotorreceptora

da célula, seguida de absorção da luz e o desencadeamento de dois tipos de

reações (primárias e secundárias) (KARU, 1999). As reações primárias

ocorrem na presença da luz e resultam em alterações na configuração

molecular e função do fotoreceptor. Acredita-se que essas reações estejam

relacionadas à formação de oxigênio singlete, modificações das propriedades

do estado redox, presença de óxido nítrico, aumento da temperatura local por

tempo determinado ou superprodução de ânions superóxidos. Já as reações

secundárias ocorrem sem a presença da luz, podendo ser horas ou dias após a

irradiação, compreendendo alterações na sinalização e funções celulares (XU

et al., 2008) como a fotorresposta dos receptores localizados nas mitocôndrias

e a síntese de DNA e RNA no núcleo celular (KARU, 2008).

As pesquisas relacionadas ao mecanismo de ação do LBI envolvem

sempre o estudo das mitocôndrias. Essas organelas desempenham um papel

importante na geração de energia e no metabolismo celular (GAO, XING, 2009;

21

HUANG et al., 2009; SILVEIRA et al., 2009). A absorção de radiação

monocromática visível e próxima ao infravermelho (do inglês near infrared -

NIR) por componentes da cadeia respiratória celular tem sido considerada

como o principal mecanismo de LBI em nível celular (KARU, 1989). Estudos

evidenciam que o LBI age nas células através de um fotorreceptor principal:

citocromo c oxidase – enzima terminal da cadeia mitocondrial de transporte de

elétrons que desempenha papel bioenergético vital na célula (HUANG et al.,

2009; SRINIVASAN, AVADHANI, 2012).

A citocromo c oxidase é uma proteína de membrana mitocondrial de 200

KDa que apresenta duas metades heme (heme a e heme a3), dois sítios redox

ativos de cobre (CuA e CuB), um zinco e um magnésio. A absorção de fótons

pela citocromo c oxidase leva a estados eletronicamente excitados,

estimulando a cadeia respiratória por acelerar as reações de transferências de

elétrons na molécula (YU et al., 1997). Desse modo, ocorre aumento do

potencial elétrico da membrana, maior metabolismo oxidativo e

consequentemente resultando em maior síntese de ATP e espécies reativas de

oxigênio (do inglês reactive oxigen species - ROS) (HUANG et al., 2009;

SILVEIRA et al., 2009).

A atividade da citocromo c oxidase pode ser regulada pelo óxido nítrico

(do inglês nitric oxide - NO) (BELTRAN et al., 2000; BROWN, 2001; KARU,

PYATIBRAT, AFANASYEVA, 2005). O NO produzido na mitocôndria pode inibir

a respiração celular através de uma competição direta com o oxigênio para se

ligar a citocromo c oxidase (ANTUNES, BOVERIS, CADENAS, 2004; HUANG

et al., 2009). A laserterapia pode inverter essa inibição através da dissociação

do NO da citocromo c oxidase, permitindo o influxo de oxigênio e a geração de

espécies reativas de oxigênio que podem ativar fatores de transcrição

nucleares (KARU, PYATIBRAT, KALENDO, 2005; LANE, 2006; HUANG et al.,

2009, POYTON et al., 2011).

As espécies reativas de oxigênio (ROS) resultantes da ativação da

cadeia respiratória podem ter efeitos benéficos ou prejudiciais. De acordo com

Huang et al. (2009), baixos níveis de ROS estão associados a efeitos

bioestimulantes, enquanto altos níveis têm sido relacionados a efeitos

inibitórios e indutores de morte celular. Os estudos indicam que a laserterapia

em altas doses leva ao aumento das concentrações de ROS, que por sua vez

22

leva a uma diminuição do potencial da membrana mitocondrial, ocasionando

uma diminuição da permeabilidade membranar. A dimimuição da

permeabilidade celular leva a destruição da mitocôndria, ativando fatores pró-

apoptóticos que levam a ativação do citocromoc, que ativa caspases

ocasionando a apoptose (OSIPOV et al., 2006; WU et al., 2007).

O LBI produz uma mudança no potencial redox da célula, aumentando a

oxidação (KARU, 1999), a geração de ROS e a atividade redox da célula

(GROSSMAN et al., 1998; ALEXANDRATOU et al., 2002; LAVI et al., 2003;

ZHANG et al., 2008; CHEN et al., 2011). Alterações no estado redox induz a

ativação de numerosas vias de sinalização intracelular tais como a síntese de

acido nucléico, síntese de proteína e progressão no ciclo celular.

Alterações nos elementos da sinalização mitocondrial (potencial de

membrana, ATP, ROS, Ca2+ e óxido nítrico) medeiam a ativação ou a

supressão de moléculas no citoplasma e subseqüentemente promovem a

ativação de cascatas de sinalização. Essas vias de sinalização resultam na

síntese de DNA, RNA e proteínas ou em alterações no citoplasma e na

membrama plasmática que podem relacionar-se a atividade proliferativa

(HAWKINS, ABRAHAMSE, 2006; HU et al., 2007; KARU, 2008; GAO, XING,

2009)

Tentando explicar o efeito bioestimulatorio do LBI em nível molecular,

Karu (1999) propôs uma cadeia de eventos moleculares a partir da absorção

de luz por um fotorreceptor levando à fotoativação de enzimas na mitocôndria,

incluindo a transdução de sinal e eventos de amplificação, terminando com a

foto-resposta. Segundo o mesmo autor, a luz é absorvida pelos componentes

da cadeia respiratória, levando a mudanças nas mitocôndrias e no citoplasma.

Em baixas doses de laser, Ca²+ adicional é transportado para o citoplasma por

um processo que estimula síntese de DNA e RNA, mitose e proliferação

celular. Em altas doses, muito Ca2+ é liberado, resultando em hiperatividade da

ATPase, bombas de cálcio e consequentemente degradação do ATP presente

na célula e inibição do metabolismo celular (SCHINDL et al., 2000). Segundo

Friedmann et al. (1991), a liberação de Ca2+ ocorre a partir da força motriz

protónica e que além da liberação de Ca2+ verifica-se também um aumento de

curto prazo no pH intracelular.

23

Estudos moleculares mostram que após a absorção dos fótons pelas

células numerosas vias de sinalização são ativadas, levando à ativação de

fatores de transcrição. Estes fatores de transcrição podem promover o aumento

da expressão de genes relacionados com a síntese de proteínas, a migração e

proliferação celular, a sinalização anti-inflamatória, as vias anti-apoptóticas e

enzimas antioxidantes (DE FREITAS, HAMBLIN, 2016).

A laserterapia estimula o crescimento celular diretamente através da

regulação da expressão de genes relacionados com a proliferação celular e,

indiretamente, através da regulação de genes relacionados com a migração

celular e remodelação, síntese de DNA e reparo, canal iônico e potencial de

membrana, e metabolismo celular. O LBI também aumenta a proliferação

celular por suprimir a apoptose das células (ZHANG et al., 2003). Tem sido

demonstrado que a laserterapia pode estar relacionada à expressão alterada

de genes e proteínas relacionadas ao ciclo celular (GRECO et al., 2001;

PEPLOW et al., 2011) e parece aumentar a liberação de fatores de

crescimento e citocinas (GAVISH et al., 2004; BYRNES et al., 2005; SHIMIZU

et al., 2007; PEPLOW et al., 2011).

Os mecanismos moleculares e celulares do LBI sugerem que os fótons

são absorvidos pelas mitocôndrias, estimulando a produção de ATP. Baixos

níveis de ROS ativam os fatores de transcrição, tais como NF-ĸB (do inglês

nuclear transcription factor kappa B), para induzir alguns produtos de

transcrição gênica responsáveis pelos efeitos bioestimulatórios do LBI. Em

altas concentrações, as ROS inibem a proliferação celular, levando as células à

apoptose (FARIVAR, MALEKSHAHABI, SHIARI, 2014).

Em se tratando da ação do laser nos diferentes espectros de luz, seu

efeito molecular parece ocorrer de forma distinta quando se compara a luz

vermelha com a infravermelha. A luz visível (vermelha) induz uma reação foto-

química, ocasionando em uma direta ativação da síntese de enzimas, tendo

como principal alvo os lisossomos e as mitocôndrias. As organelas não

absorvem luz infravermelha (espectro invisível), apenas as membranas

celulares apresentam respostas a esse estímulo, logo a luz infravermelha

causa alterações no potencial de membrana induzindo efeitos foto físicos e

fotoelétricos, levando à excitação dos elétrons e a um aumento na síntese de

ATP (ALMEIDA-LOPES et al., 2001).

24

1.2.2 Ação do LBI nas células em cultivo

A ação do LBI na proliferação celular vem sendo estudada em diversos

tipos celulares como fibroblastos (MOORE et al., 2005; HAWKINS-EVANS,

ABRAHAMSE, 2008), células endoteliais (SCHINDL et al., 2003), células

neoplásicas (CASTRO et al., 2005; WERNECK et al., 2005) e osteoblastos

(FUJIHARA et al., 2006), contudo pouco se sabe a respeito da ação do LBI na

proliferação de células-tronco (KHALID et al., 2012).

Dentre as diversas fontes de células-tronco, poucas foram avaliadas na

literatura em relação a laserterapia (GINANI et al., 2015; MARQUES et al.,

2016; BORZABADI-FARAHANI, 2016), o que demonstra a necessidade de

realização de novos estudos com células-tronco obtidas de outras fontes, a fim

de compreender melhor a ação que a laserterapia exerce na proliferação

dessas células.

Com relação aos estudos sobre o efeito do laser em células-tronco, tem

sido observado que a laserterapia pode promover tanto um aumento da

proliferação celular (EDUARDO et al., 2008; GAO, XING, 2009; MVULA et al.,

2010), quanto contribuir com a diferenciação dessas células (HOU et al., 2008;

SOLEIMANI et al., 2012). Os estudos têm utilizado comprimentos de onda que

variam de 600 a 700 nm quando o objetivo é estimular a proliferação e

diferenciação celular (WILDEN, KATHEIN, 1998).

A laserterapia geralmente utiliza baixas densidades de energias e

comprimentos de onda, porém suficientes para desencadear na célula alvo o

processo de biomodulação. A energia é capaz de penetrar nos tecidos,

resultando em aumento da atividade, proliferação e regeneração celular,

síntese de fatores de crescimento, produção de colágeno, angiogênese, além

de analgesia e efeito antiinflamatório (LI, CHEN, WANG, 2006). Tem sido

relatado que a magnitude do efeito de bioestimulação do laser depende do

comprimento de onda utilizado, bem como do estado fisiológico das células no

momento da irradiação, sendo esse efeito mais evidenciado em células com

déficit nutricional, desordem funcional ou injúria (KARU, 1989; PINHEIRO et al.,

2002; TUNER, 2007;).

Em relação ao comprimento de onda, a literatura relata que o espectro

de luz visível (vermelho), variando de 600 a 700 nm, apresenta resultados mais

25

eficazes na bioestimulação celular (WILDEN, KARTHEIN, 1998). Porém,

mesmo em alguns experimentos que utilizaram o espetro de luz infravermelho

(TUBY et al., 2007; BOUVET-GERBETTAZ et al., 2009; SOLEIMANI et al.,

2012), observou-se uma influência positiva na taxa de proliferação celular, com

exceção do estudo de Bouvet-Gerbettaz et al. (2009). Nesse estudo foi

avaliada a influência do LBI (808 nm, 800 mW e 4 J/cm²) a partir do número de

CFU-F de células em suspensão. O grupo não irradiado apresentou um valor

médio de colônias maior que o irradiado.

Moore et al. (2005), objetivando avaliar o efeito do laser em diferentes

comprimentos de onda (625, 635, 645, 655, 665, 675 e 810 nm) em dois tipos

celulares (fibroblastos e células endoteliais), avaliaram a taxa de proliferação

celular após um período de 72 h de cultivo. Eles verificaram um aumento no

crescimento tanto das células endoteliais, quanto para os fibroblastos em todos

os comprimentos de onda estudados, exceto para o de 810 nm.

Hawkins-Evans e Abrahamse (2008) obtiveram resultados semelhantes

aos verificados por Moore et al (2005) no que se refere a proliferação de

fibroblastos. Eles avaliaram comprimentos de onda de 632,8 e 830 nm e

verificaram um efeito estimulatório na proliferação desse tipo celular mais

efetivo quando tratados com laser de 632,8 nm, sugerindo que o comprimento

de onda interfere potencialmente na resposta celular.

Além do comprimento de onda, a bioestimulação in vitro é dependente

de outros fatores, tais como a potência (ALMEIDA-LOPES et al., 2001), a

densidade de energia (PEREIRA et al., 2002; KREISLER et al., 2003) e o tipo

de célula que está sendo irradiada (MOORE et al., 2005). Esses parâmetros

são úteis para aumentar a taxa de proliferação, porém eventualmente

promovem efeitos adversos sobre a síntese de proteínas (PEREIRA et al.,

2002). Portanto, é crucial identificar a combinação correta desses fatores para

atingir a taxa máxima de proliferação celular.

Dentre as doses mais utilizadas na laserterapia em células-tronco, há

uma preferência pela utilização de doses baixas, sendo 0,05 J/cm2 a menor

dose até o momento aplicada (PEREIRA et al., 2012), a dose de 0,5 J/cm2 a

mais utilizada (HOU et al., 2008; WU et al., 2012; SOARES et al., 2015) e 42

J/cm2 a maior dose utilizada (PEREIRA et al., 2012). Dentro do espectro de luz

visível a menor potência empregada nos experimentos foi de 0,02 mW

26

(PEREIRA et al., 2012) e a maior, 119 mW (MVULA et al., 2010), enquanto no

espectro de luz invisível a menor potência foi de 50 mW (SOLEIMANI et al.,

2012) e a maior, 800 mW (BOUVET-GERBETTAZ et al., 2009).

Tuby et al. (2007) demonstraram que a laserterapia promove a

proliferação de células-tronco mesenquimais e cardíacas in vitro quando essas

são irradiadas com um laser diodo (AsGa), no comprimento de onda de 804 nm

e com doses de 1,0 e 3,0 J/cm2. A proliferação de ambos os tipos celulares

aumentou significativamente após a aplicação do laser quando comparado ao

grupo controle não irradiado sem causar nenhum dano sobre essas células em

todos os intervalos de tempo analisados (1, 2, 3 e 4 semanas após a

irradiação).

Para aumentar a taxa de proliferação de células-tronco mesenquimais

da medula óssea, Hou et al. (2008) usaram o LBI a partir da utilização do laser

com comprimento de onda de 635 nm e doses de 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 J/cm2. Não

foram encontradas diferenças significativas entre os grupos não irradiados e

irradiados no que se refere à citotoxicidade. No entanto, a taxa de proliferação

das células estudadas foi significativamente maior no grupo irradiado quando

comparado com o grupo controle, sendo a dose de 0,5 J/cm2 a mais efetiva.

Villiers et al. (2011) avaliaram a ação do laser diodo, com 636 nm e 5,0

J/cm2 na proliferação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo

humano, sendo uma linhagem extraída a partir de procedimento cirúrgico e

outra comercial, as quais mostraram resultados completamente distintos. Na

linhagem comercial não houve diferença significativa em nenhum dos tempos

avaliados (24, 48 e 72 h), por sua vez, as células oriundas de procedimento

cirúrgico mostraram diferenças estatisticamente significativas na proliferação

celular nos tempos de 24 e 72 h pós-irradiação quando comparadas com o

controle não irradiado. Esses resultados demonstram que a linhagem também

pode influenciar na ação do LBI.

Soleimani et al. (2012) analisaram a ação do LBI na taxa proliferativa de

células-tronco da medula óssea humana cultivadas em meio indutor de

diferenciação osteogênica e neurogênica. Sabe-se que a taxa proliferativa das

células-tronco é bastante reduzida quando as mesmas encontram-se em

processo de diferenciação. Mesmo em meios indutores, os referidos autores

27

observaram um aumento significativo na proliferação das células irradiadas

quando comparadas com o grupo não irradiado.

Quando se trata de laserterapia em células de origem dental, a literatura

ainda é bastante incipiente. A maioria dos artigos baseia-se em estudos in vitro

utilizando DPSC, enquanto que SHEDs e PDLSCs foram menos estudadas

(BORZABADI-FARAHANI, 2016). Os efeitos da laserterapia em células-tronco

de origem dental parecem seguir a lei Arndt-Schulz: pequenas doses

estimulam, doses moderadas inibem e grandes doses matam (MARQUES et

al., 2016).

Resultados positivos foram relatados na literatura quando as células-

tronco foram cultivadas sob condições de estresse (EDUARDO et al., 2008;

DINIZ et al., 2015), mostrando que as células irradiadas apresentaram um

potencial de proliferação e uma viabilidade superior quando comparadas ao

grupo controle que não foi submetido ao laser.

Diniz et al. (2015) submeteu DPSCs à estresse através do contato com

substânicas nocivas liberadas por adesivos dentais, e mostrou

que a viabilidade dessas células foi maior quando submetidos à laserterapia.

Já um estudo realizado com SHEDs demonstrou que a irradiação dessas

células com deficiência nutricional (10 e 5% de SFB), com um laser de

comprimento de onda de 660 nm e dose de 3,0 J/cm2, promoveu aumento na

proliferação celular. Porém quando se avaliou esse mesmo tipo celular em

condições nutricionais normais (15% de SFB), não houve diferença estatística

entre os grupos (EDUARDO et al., 2008).

No entanto, alguns estudos mostram que, em condições de cultivo ideal

(meio de cultura suplementado com 15% de SFB), células PDLSCs (SOARES

et al., 2015) e DPSCs (ZACCARA et al., 2015) submetidas à laserterapia

tiveram um aumento na proliferação celular quando comparadas com os

grupos controles não irradiados.

Em relação a influência da laserterapia na diferenciação de células-

tronco de origem dental, Turrioni et al. (2014) observaram um aumento da

atividade de fosfatase alcalina (ALP) e da síntese de colágeno, bem como a

expressão de sialofosfoproteína dentinária (DSSP) e colágeno tipo 1 (COL I)

avaliada 72 horas após a última irradiação. Já Pereira et al. (2012), analisando

28

a formação de nódulos mineralizados após 3 semanas, não foram capazes de

encontrar diferenças entre os grupos irradiados e não irradiados.

Os estudos encontrados na literatura, até o presente momento, relatam

ou efeitos benéficos ou nenhuma alteração nas células-tronco submetidas à

laserterapia. Sabendo-se que no cultivo das células-tronco comumente é

observado um baixo rendimento e uma taxa proliferativa reduzida, o uso de

uma ferramenta que venha aumentar essa taxa proliferativa e

consequentemente acelerar o processo de diferenciação celular, é de grande

interesse para a medicina regenerativa.

1.3 Engenharia tecidual

A engenharia tecidual é um campo multidisciplinar que envolve os

princípios de biologia, medicina, engenharia e ciência dos materiais para criar

substitutos biológicos para tecidos perdidos ou danificados, além de contribuir

em paralelo com os avanços nas áreas de biomateriais e biotecnologia (LIAO

et al., 2011). Esta ciência envolve três componentes básicos: um arcabouço

que proporciona estrutura e substrato para o crescimento e desenvolvimento

tecidual (scaffolds); uma fonte de células para facilitar a formação do tecido

desejado; e fatores de crescimento ou estímulos biofísicos que direcionem o

crescimento e diferenciação das células no arcabouço (MURPHY et al., 2013).

Os tecidos animais são compostos por células embebidas em uma

matriz extracelular (MEC), e do ponto de vista estrutural a MEC natural é uma

rede tridimensional de fibras composta por várias proteínas e polissacarídeos,

com diâmetro variando de dezenas a centenas de nanômetros (WANG et al.,

2013). Além disso, a MEC fornece às células uma ampla gama de sinais

químicos que regulam a função celular (LANNUTTI et al., 2007). Assim, na

engenharia tecidual o arcabouço desempenha um papel crítico, devendo

mimetizar as funções biológicas da estrutura e da matriz extracelular (MEC)

naturais do tecido, como a microarquitetura com um tamanho de poro suficiente

para promover a adesão, proliferação e migração celular, além da deposição

de matriz (QUARTO, GIANNONI, 2016).

Os biomateriais possuem um papel primordial no campo da engenharia

tecidual. Esforços consideráveis vêm sendo aplicados na criação de materiais

29

biomiméticos capazes de estabelecer funções celulares específicas e

direcionar interações célula-célula, atuarem como arcabouços para populações

celulares e agentes terapêuticos, funcionando como matrizes que vão guiar a

regeneração do tecido (HUBBEL, 1995; LEE, KASPER, MIKOS, 2015).

Com o desenvolvimento das técnicas de produção dos biomateriais, os

tipos de arcabouços e a qualidade do tecido formado se tornam cada vez mais

versáteis (LANGER, VACANTI, 2016). Dependendo das propriedades físicas e

químicas destes biomateriais, os mesmos podem gerar respostas positivas ou

negativas nos processos de adesão, proliferação, migração e diferenciação

celular (HUTMACHER, 2000; ALLEN et al., 2006; MENDONÇA et al., 2009).

Apesar da existência de um número bastante variado de materiais

potenciais, o arcabouço ideal deve ter algumas propriedades gerais que são

normalmente desejadas. Além de favorecer a adesão, proliferação,

diferenciação e migração celular, os arcabouços devem: 1) possuir poros

interconectáveis de tamanho apropriado para a integração e vascularização do

tecido; 2) ser composto de material com uma taxa de degradação que se

aproxima da taxa de regeneração do tecido natural desejado; 3) possuir

propriedades mecânicas compatíveis com o local de enxertia e com o

manuseio; 4) não provocar resposta inflamatória de toxicidade in vivo; 5) ser

facilmente fabricável em diferentes tamanhos e formas; 6) ser passível de

esterilização, evitando contaminações, mantendo as propriedades estruturais e

mecânicas (HUTMACHER, 2001; LANNUTTI et al., 2007; LANGER, 2008).

Com base no exposto, os biomateriais poliméricos são os preferidos,

podendo ser divididos em dois grupos: naturais, como o colágeno, a gelatina, o

fibrinogênio, o ácido hialurônico e a quitosana; e sintéticos, como os

polianidridos, o poliuretano e os poliésteres (CAO et al., 2004). As vantagens

dos polímeros naturais estão relacionadas à melhor biocompatibilidade e

menor imunogenicidade. No entanto, apresentam variações nas propriedades

mecânicas, na degradação e na reprodutibilidade como suas desvantagens. Já

os polímeros sintéticos podem ser modificados para melhorar suas

propriedades, representam uma fonte mais confiável de matéria-prima, além de

apresentarem baixo custo (VASITA, KATTI, 2006; BARNES et al., 2007;

LIANG, HSIAO, CHU, 2007).

30

1.3.1 Ácido Polilático (PLA)

O ácido polilático (PLA) é um dos polímeros sintéticos mais

amplamente utilizado em uma variedade de aplicações biomédicas devido à

sua elevada resistência, biocompatibilidade, biodegradabilidade, boa

solubilidade em alguns solventes orgânicos como o clorofórmio e a acetona, e

baixo custo (LANZA, LANGER, VACANTI, 2007; LU, MIKOS, 2009;

CASASOLA et al., 2014; SAINI, ARORA, KUMAR, 2016). Quando utilizado

como arcabouço celular, o PLA, sozinho ou combinado com outro material

biodegradável, proporciona um ambiente excelente para o crescimento celular

devido às suas propriedades físicas (ARMENTANO et al., 2013; SANTORO et

al., 2016).

Primeiro sintetizado por Carothers em 1932, o PLA é produzido a partir

de policondensação de ácido lático ou pela polimerização de abertura do anel

do dímero cíclico lactido (JAMSHIDIAN et al., 2010; LOPES, JARDINI, FILHO,

2012). Como outros poliésteres, o PLA degrada-se por hidrólise não enzimática

e os seus subprodutos são eliminados através do metabolismo celular normal

(LASPRILLA et al., 2012). A biocompatibilidade e a biodegradabilidade desse

biomaterial tornam-no um candidato ideal para dispositivos implantáveis

(LOVALD et al., 2009; LASPRILLA et al., 2012)

A regulação de dispositivos baseados em PLA pelo FDA aumentou o

interesse no uso de PLA no campo da engenharia de tecidos. O PLA tem sido

largamente empregado como arcabouço, não só pela sua biocompatibilidade

intrínseca e biodegradabilidade, mas também porque a quiralidade do ácido

láctico (ácido L- e D-láctico) pode ser utilizada para sintetizar PLA com

diferentes estereoregularidades. A esteroregularidade influencia as

propriedades físico-químicas do material, tais como propriedades mecânicas e

térmicas e características de degradação (BIGG, 2005). Consequentemente, o

PLA tem sido amplamente utilizado em aplicações de engenharia tecidual,

tanto como arcabouços, quanto como sistemas de administração de fármacos

(BIGG, 2005; LOPES, JARDINI, FILHO, 2012; RATNER, 2013).

Apesar de suas muitas propriedades desejáveis, a principal

preocupação com o uso de PLA está relacionada com seus produtos de

degradação. PLA degrada em ácido láctico, um ácido relativamente forte que

31

pode provocar uma resposta inflamatória (LANZA, LANGER, VACANTI, 2007).

Este efeito é ainda mais exacerbado pelo fato dos dispositivos feitos em PLA

sofrerem geralmente erosão em massa. Como resultado, a acumulação de

produtos ácidos dentro da massa do material acelera sua degradação,

eventualmente levando a uma perda súbita de sua integridade mecânica e uma

resposta inflamatória retardada (LANZA, LANGER, VACANTI, 2007; RATNER,

2013). No entanto, o PLA é ainda um material preferido para a fabricação de

arcabouços por causa da concentração reduzida de produtos de degradação

com porosidade aumentada. Consequentemente, várias abordagens para

amenizar as deficiências deste polímero sintético são propostas, incluindo a

preparação de copolímeros de ácido láctico e compósitos baseados em PLA

(ATHANASIOU, NIEDERAUER, AGRAWAL, 1996; HABRAKEN, WOLKE,

JANSEN, 2007; PUPPI et al., 2010; WEI et al., 2015).

Outra limitação para aplicação do PLA em um ambiente hidrofílico é a

sua superfície hidrofóbica. A hidrofobicidade do PLA também resulta em baixa

afinidade celular e pode desencadear uma resposta inflamatória do hospedeiro

após o contato direto com fluidos biológicos (GUO et al. , 2015; STANKEVICH

et al., 2015; MURARIU, DUBOIS, 2016). Para expandir a utilização de PLA,

foram utilizados polímeros hidrofílicos como óxido de polietileno (PEO) (ZHAO

et al., 2012), poli (álcool vinílico) (PVA) (ABDAL-HAY et al., 2016) nas

modificações de PLA para melhorar a sua hidrofilicidade. O futuro do PLA para

a engenharia de tecidos complexos provavelmente reside na sua combinação

com outros biomateriais, a fim de potencializar suas vantagens e minimizar

suas fraquezas (SANTORO et al., 2016).

O uso do PLA, seja puro ou em blendas/modificações, vem sendo

amplamente investigado com diversos focos (XIAO et al., 2012), seja para

sistema de liberação de fármacos (LI et al., 2013; LUO et al., 2015); analisar a

eficácia em fazer a interface no processo de cicatrização de tecidos (JAMSHIDI

et al., 1988); ou investigar a interação com diversos tipos celulares, como

condrócitos humanos e fibroblastos NIH/3T3 (LEE et al., 2002; FUKUHIRA et

al., 2006; PRIME et al., 2007), células percursoras osteogênicas (HAMAJIMA et

al., 2003; HU et al., 2003; ABDAL-HAY et al., 2013), células do sistema imune

(STANKEVICH et al., 2015), e linhagens de células neuronais (ÁLVAREZ et al.,

2013; XIE et al., 2013; MEI et al., 2014; MOBASSERI et al., 2014).

32

Arcabouços nanofibrosos de PLA produzidos pela técnica de eletrofiação

têm se mostrado uma ferramenta versátil para a engenharia tecidual em virtude

da sua superfície topográfica tridimensional que permite uma maior adesão das

células, além de funcionar como um dispositivo para entrega de drogas ou

moléculas bioativas (SANTORO et al., 2016).

1.3.2 Eletrofiação

A eletrofiação (eletrospinning) é uma das técnicas mais comumente

utilizadas na literatura para a fabricação de suportes fibrosos. É uma técnica

relativamente simples e de baixo custo, que utiliza forças eletrostáticas para

produzir arcabouços fibrosos, usando soluções poliméricas ou polímeros

fundidos, resultando em fibras contínuas de diâmetros variados (LU et al.,

2009).

Essa técnica produz malhas não tecidas contendo fibras de diâmetro

variando de dezenas de micrômetros até dezenas de nanômetros. Materiais

sintéticos ou naturais podem ser utilizados, mas os polímeros sintéticos

geralmente permitem uma maior capacidade de adaptar as propriedades

mecânicas e a taxa de degradação (LANNUTI et al., 2007). As características

desses arcabouços, tais como a porosidade, o tamanho de poro e o tamanho

da fibra, podem ser facilmente regulados (PHAM, SHARMA, MIKOS, 2006).

A técnica de eletrofiação baseia-se na aplicação de elevado potencial

elétrico a uma solução polimérica, inicialmente armazenada em um capilar

metálico que é bombeado a um fluxo controlado. O aparato típico para a

execução da técnica consiste em uma fonte elétrica, um sistema de

bombeamento da solução polimérica e um coletor. Quando o potencial elétrico

aplicado excede as forças de tensão superficial que agem em direção oposta,

um jato polimérico fino é ejetado da seringa e segue em direção ao coletor

onde as fibras são depositadas (PALGRAVE, PAYNE, EGDELL, 2009; LIEN et

al., 2011; LANDAU, ROTHSCHILD, 2012). O solvente da solução é evaporado,

durante o trajeto da seringa até o coletor, formando a fibra que se deposita

aleatoriamente, dando origem a uma malha não tecida caracterizada por uma

elevada área superficial (LANNUTI et al., 2007).

33

Apesar da facilidade de utilização da técnica de eletrofiação, um grande

número de parâmetros do processo pode influenciar a composição, a

morfologia e a estrutura das fibras geradas e podem ser agrupados em três

categorias: propriedades da solução (concentração e peso molecular do

polímero, viscosidade, condutividade elétrica, elasticidade, tensão superficial),

condições do processo (voltagem, fluxo de alimentação, distância entre a

seringa e o coletor, diâmetro da abertura da seringa) e condições ambientais

(temperatura, umidade, tipo de atmosfera e pressão atmosférica) (XIE, LI, XIA,

2008; SANTORO et al., 2016).

34

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral:

• O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de

experimentos in vitro, a influência do laser de baixa intensidade

(LBI) na atividade biológica das células-tronco da polpa de dente

decíduo humano esfoliado (SHED).

2.2. Objetivos específicos:

• Avaliar a influência do LBI, aplicado nas doses de 0,5 e 1,0 J/cm2,

na capacidade de proliferação e na viabilidade in vitro das

SHEDs.

• Avaliar se o LBI promove melhor biointegração in vitro das SHEDs

cultivadas sobre um arcabouço polimérico (PLA) nanofibroso.

35

3. ARTIGO I

Para submissão à Lasers in Medical Science (ISSN 0268-8921) – IF 2.461

(JCR® 2015) – Qualis A2

LASER DE BAIXA INTENSIDADE INDUZ A PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE

CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS HUMANOS

ESFOLIADOS.

Low-level laser irradiation induces in vitro proliferation of stem cells from

human exfoliated deciduous teeth.

Fernanda Ginania, Carlos Augusto Galvão Barbozaa

a Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

Autor para correspondência:

Carlos Augusto Galvão Barboza

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral

Av. Salgado Filho, 1787 – Lagoa Nova

CEP 59056-000 – Natal – RN – Brasil

e-mail: cbarboza@cb.ufrn.br

36

RESUMO

O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do laser de baixa intensidade (LBI) na

proliferação e viabilidade de células-tronco da polpa de dentes decíduos

humanos esfoliados (SHED). As células foram irradiadas ou não (controle) com

um laser diodo InGaAlP (660 nm, 30 mW, modo de ação contínuo) usando

duas diferentes doses (0,5 J/cm2 por 16 segundos e 1,0 J/cm2 por 33

segundos). As irradiações foram realizadas nos intervalos de 0 e 48 h, com a

ponta do laser fixada perpendicularmente a cada placa a uma distância de 0,5

cm das células. A proliferação e a viabilidade celular foram analisadas nos

intervalos de 0, 24, 48 e 72 h, através do método de exclusão do azul de Tripan

e do ensaio de MTT. O ciclo celular e a expressão de Ki67 foram analisados

por citometria de fluxo. Eventos relacionados à apoptose foram avaliados pela

expressão de Anexina V e PI e alterações morfológicas no núcleo foram

analisadas pela coloração com DAPI. Os resultados demonstraram que a dose

de 1,0 J/cm2 promoveu um aumento na proliferação celular nos intervalos de

48 e 72 h quando comparada ao grupo controle e à dose de 0,5 J/cm2. A

distribuição das células nas fases do ciclo cellular revelou que os grupos

irradiados exibiram a maioria das células nas fases S e G2/M, o que foi

confirmado pelo aumento da expressão de Ki67. Todos os grupos exibiram

baixa marcação para Anexina V e PI e nenhuma alteração nuclear foram

detectadas, o que indica que a viabilidade não foi afetada pelas doses

estudadas. Conclui-se que os parâmetros do LBI utilizados (660 nm, 30 mW,

1,0 J/cm2) promovem proliferação das SHEDs e mantêm a sua viabilidade.

Palavras-chave: Polpa dentária; célula-tronco; terapia a laser; proliferação de

células.

37

INTRODUÇÃO

Células-tronco da polpa de dente decíduo humano esfoliado (sigla em

inglês SHED – Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth) foram

isoladas por Miura et al. [1] como uma população de células clonogênicas com

alta capacidade proliferativa, capaz de formar uma variedade de tipos

celulares. Experimentos com este tipo celular mostraram que há diferenças

significativas na biologia de células-tronco obtidas de dentes decíduos e de

dentes permanentes. Quando comparadas às células-tronco provenientes da

polpa de dentes permanentes, notou-se que as SHEDs apresentaram uma

maior taxa de proliferação [2], maior número de divisões celulares – o que pode

facilitar sua expansão in vitro –, além de maior formação de colônias,

capacidade de osteoinduçãoin vivo e formação de tecidos diferentes do

complexo dentina-polpa [1].

A obtenção dessas células é um processo simples, conveniente e com

pouco ou nenhum trauma, tendo em vista que toda criança perde os dentes

decíduos, sendo essa uma oportunidade perfeita para recuperar e armazenar

células-tronco para tratar doenças ou lesões futuras [3]. No entanto, estas

células precisam ser armazenadas para permitir seu uso clínico posterior; e o

rendimento em cultivo normalmente é baixo, tornando-se fundamental a

estimulação da proliferação in vitro, para que se obtenha um número adequado

de células [4].

A irradiação com laser de baixa intensidade (LBI) pode ser uma

estratégia eficaz para promover uma ampliação significativa do número de

células in vitro e sua posterior diferenciação, contribuindo com os processos

regenerativos in vivo e nos protocolos de engenharia tecidual. A capacidade

que o LBI apresenta de estimular a proliferação dos mais diferentes tipos

celulares tem sido relatado como o seu mais importante efeito fisiológico [5]. A

literatura mostra que o estimulo do LBI provoca um aumento na taxa

proliferativa em diversos tipos celulares como fibroblastos [6,7], células

endoteliais [8] e osteoblastos [9].

Dentre as diversas fontes de células-tronco, poucas foram avaliadas

quando submetidas à laserterapia [10-12], o que demonstra a necessidade de

38

realização de novos estudos para melhor compreender a ação que a

laserterapia exerce na proliferação dessas células. Quando se trata de

laserterapia em células-tronco de origem dental, a maioria dos artigos utiliza

células-tronco derivadas da polpa de dentes permanentes (DPSCs), enquanto

que estudos com células de outras fontes dentais ou periodontais são escassos

na literatura [12,13]. Por essa razão, o objetivo desse trabalho foi avaliar,

através de experimentos in vitro, a influência do LBI na atividade biológica de

células-tronco da polpa de dente decíduo humano esfoliado (SHED).

MATERIAIS E MÉTODOS

O presente estudo foi aprovado pelo do comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Parecer CAAE:

34913314.4.0000.5537). Para isolamento das SHEDs foram utilizados três (03)

dentes decíduos humanos com pelo menos 1/3 de rizólise fisiológica.

Cultura de células

Após a exodontia, cada dente foi imediatamente mantido em tubo tipo

Falcon contendo 5 mL de meio alfa-MEM em condição hipotérmica (4ºC).

Posteriormente, em câmara de fluxo laminar, os dentes foram submetidos ao

protocolo descrito por Vasconcelos et al. [14], para evitar possível

contaminação por microorganismos: três lavagens de 10 minutos cada, com

uma solução contendo meio alfa-MEM enriquecido com 10.000 U.I./mL de

Penicilina, 10.000 µg/mL de Estreptomicina, 100 mg/mL de Gentamicina e 250

µg/mL de Anfotericina B (todos reagentes da Gibco, USA).

As SHEDs foram obtidas de acordo com o protocolo descrito por Ginani

et al. [15]. O tecido pulpar foi cuidadosamente retirado por curetagem e, em

seguida, o extrato foi submetido à digestão enzimática com 3 mg/mL de

colagenase I (Gibco,USA) e 4mg/mL de dispase (Gibco, USA), por 1 hora a

37°C. As culturas foram mantidas em meio alfa-MEM suplementado com 15%

de soro fetal bovino (Gibco, USA) a 37ºC em 5% de CO2 até atingirem 70 –

90% de confluência, com troca de meio a cada três dias.

39

Na primeira passagem (P1), as células foram analisadas para confirmar

sua natureza de célula-tronco, de acordo com os critérios estabelecidos por

Dominici et al. [16]. Em resumo, uma alíquota de células foi avaliada em

citometria de fluxo usando Human MSC Analysis Kit (BD Stemflow™, USA) que

permite avaliar os marcadores de superfície celular que, em conjunto,

identificam as células-tronco mesenquimais através de anticorpos para detectar

expressões positivas (CD105 PerCP-Cy5.5, CD73APC, CD90 FITC) e

negativas (CD45, CD34, CD11b, CD19, HLA-DR PE). Adicionalmente, as

células foram cultivadas em meios de diferenciação osteogênico e adipogênico

(StemPro® Differentiation Kits, InvitrogenCorp., Carlsbad, CA, USA) por até 21

dias e a natureza multipotencial das SHEDs foi confirmada através das

colorações de Von Kossa e Oil Red.

Desenho experimental

A Figura 1 mostra as etapas realizadas neste estudo. Após a

caracterização, as SHEDs foram expandidas e divididas em três grupos de

acordo com o tratamento utilizado: (I) Controle: sem irradiação; (II) Laser 0,5:

células irradiadas com uma dose de 0,5 J/cm2; (III) Laser 1,0: células irradiadas

com uma dose de 1,0 J/cm2. Em seguida, as células de todos os grupos foram

submetidas a ensaios para avaliar a viabilidade e a capacidade proliferativa e

identificar eventos relacionados à apoptose e ao ciclo celular.

Figura 1–Desenho experimental do estudo. P: passagem (subcultivo celular).

40

Irradiação laser

Na terceira e quarta passagens (P3 e P4), os grupos experimentais II e

III foram irradiados com um aparelho de Laser diodo InGaAlP (Kondortech –

Modelo BioWave LLLT Dual, São Carlos, Brasil), com os seguintes parâmetros:

potência de 30 mW; comprimento de onda de 660 nm; doses de 0,5 e 1,0

J/cm2; tempos de irradiação de 16 s (0,5 J/cm²) e 33 s (1,0 J/cm²); diâmetro da

ponta de 0,01 cm2; modo de ação contínuo; e aplicação com sonda de

irradiação perpendicular à placa, a 0,5 cm das células. A potência do laser foi

medida com o dispositivo Laser Check Power Meter (Coherent Inc., Santa

Clara, CA, USA) antes de cada aplicação.

As irradiações foram efetuadas nos intervalos 0 e 48 h e as análises

foram efetuadas nos intervalos de 0, 24, 48 e 72 h após a primeira aplicação do

laser. Para o teste de exclusão do Azul de Tripan e ensaio de MTT, as células

foram cultivadas em placas de 24 e 96 poços, respectivamente, com a

irradiação sendo realizada no ponto central de cada poço. Nos ensaios para

avaliação do ciclo celular, expressão de Ki67 e apoptose, as células foram

cultivadas em placas de 6 poços e a aplicação do laser ocorreu em cinco

pontos fixos e distintos em cada poço. O plaqueamento celular foi realizado de

forma que entre os poços semeados havia um poço vazio, impedindo a

dispersão de luz não intencional entre os poços durante aplicação da

laserterapia.

Análise da proliferação celular

A proliferação celular foi analisada pelo método de exclusão do Azul de

Tripan e pelo ensaio de MTT, nos intervalos de 0, 24, 48 e 72 h após a primeira

irradiação, com todos os experimentos realizados em quadruplicata (n=4). Para

a coloração com Azul de Tripan, as células foram cultivadas em placas de 24

poços, na densidade de 2x104 células/poço. O número de células coradas pelo

Azul de Tripan em cada poço foi obtido através da contagem em câmara de

Neubauer, em cada intervalo de tempo analisado. Para o ensaio de MTT, as

células foram cultivadas em placas de 96 poços na densidade de 5x103

células/poço e a absorbância das amostras foi medida em um leitor de

microplacas (Epoch-Biotech Instruments, USA) no comprimento de onda de

570 nm.

41

Análise do Ciclo Celular

A fim de avaliar os efeitos da laserterapia sobre o ciclo celular, as células

de cada grupo foram cultivadas em triplicata (n=3) em placas de seis poços na

densidade de 2 x 105 células/poço. Após os intervalos estudados (0, 24, 48 e

72h), as células foram processadas e foram adicionados 5 µL de Iodeto de

Propídeo (25 mg/mL, Invitrogen, USA), juntamente com 200 µL de PBS gelado,

seguindo-se a análise das células em citômetro de fluxo FACS Canto II (BD

Biosciences, USA).

Análise da expressão de Ki67

A análise da expressão da proteína nuclear Ki67 foi realizada em

citometria de fluxo. Para isso, as células foram cultivadas em triplicata (n=3),

em placas de seis poços na densidade de 2 x 105 células/poço. No intervalo

T72, as células foram processadas e incubadas com 10 µL do anticorpo

monoclonal anti-Ki67 conjugado com FITC (Clone 7B11, Invitrogen, USA) por

20 minutos com proteção contra a luz e, em seguida, as células foram

analisadas em citômetro de fluxo.

Análise da Apoptose

Para avaliar os efeitos da laserterapia sobre a apoptose, foi utilizado o kit

FITC/Annexin V Dead Cell Apoptosis Kit with FITC Annexin and PI, for Flow

Cytometry (Invitrogen, USA). As células foram cultivadas em triplicata em

placas de seis poços na densidade de 2 x 105 células/poço. No último intervalo

de tempo analisado (T72), as células foram processadas e incubadas com 3 µL

de Annexin V – FITC e 1 µL da solução de PI a 100 µg/mL, por 15 minutos em

temperatura ambiente e mantidas sob proteção de luz. Após o período de

incubação, as células foram analisadas em citômetro de fluxo, medindo a

emissão de fluorescência a 530 nm e 575 nm.

Análise morfológica do núcleo

Para avaliar a existência de danos nucleares nas células submetidas à

laserterapia, as células foram cultivadas em placas de 24 poços, na densidade

de 2x104 células/poço. No intervalo de 72 horas, as células foram incubadas

42

com DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole, Molecular Probes, USA), na diluição

1:1000, por 20 minutos em câmara escura. As células foram avaliadas em

microscópio de fluorescência (NIKON Eclipse Ti-U, USA), a fim de identificar a

eventual presença de núcleos picnóticos e fragmentação nuclear nas células

dos três grupos.

Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise não paramétrica. A diferença entre

os grupos para cada um dos intervalos de tempo estudados (0, 24, 48 e 72h)

foi analisada pelos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney,

considerando-se um nível de significância de 5% (p<0,05).

RESULTADOS

As células pulpares apresentaram positividade para os marcadores de

superfície CD90 (98,8%), CD73 (99,9%) e CD105 (97,4%). Já para os

marcadores CD45, CD34, CD11b, CD19 e HLA-DR, menos de 1% das células

foram positivas. A microscopia de luz mostrou a deposição de matriz

mineralizada corada por Von Kossa e a presença de vesículas lipídicas

coradas por Oil Red O, o que representa, respectivamente, a diferenciação de

células osteoblásticas e adiposas (Figura 2).

43

Figura 2–(A-D) Análise da expressão dos marcadores de superfície para células-tronco

mesenquimais nas SHEDs: (A) CD90; (B) CD73; (C) CD105; (D) Coquetel negativo.(E-F)

Fotomicrografias das SHEDs submetidas a diferenciação osteogênica (E; Coloração por Von

Kossa, amplificação original x40) e adipogênica (F; Coloração por Oil Red, amplificação original

x100).

A análise do número de células obtidas pelo método de exclusão do Azul

de Tripan revelou que a dose de 1,0 J/cm2 promoveu um aumento da

proliferação celular nos intervalos de 48 e 72 horas, quando comparado com os

grupos controle e Laser 0,5 (p<0,05). Observa-se que o grupo controle teve

uma menor proliferação celular quando comparado com os grupos irradiados

(Laser 0,5 e Laser 1,0), com diferença estatisticamente significativa (p<0,05) no

intervalo de 72 h entre os grupos irradiados (Figura 3).

44

Figura 3 - Número de SHEDs nos intervalos de tempos estudados. Letras iguais correspondem

a diferença estatisticamente significativa (p<0,05; Teste de Mann-Whitney).

A atividade mitocondrial, medida pelo ensaio de MTT, apresentou

resultados semelhantes aos achados através das contagens com azul de

Tripan, uma vez que o grupo irradiado com a dose de 1,0 J/cm2 mostrou uma

redução significativamente maior do MTT nos intervalos de 24, 48 e 72 h,

quando comparado com o grupo não irradiado. Apenas no intervalo de 48 h foi

observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos irradiados

(Tabela 1).

Tabela 1. Análise dos valores de absorbância das SHEDs em cada intervalo de tempo após a

lasertarpia nos diferentes grupos estudados.

DP: desvio padrão. *Teste de Mann-Whitney; os números em negrito indicam diferença

estatisticamente significativa (p<0,05)

Controle Laser 0,5 Laser 1,0 p*

Média ± DP Média ± DP Média ± DP C vs. 0,5 C vs. 1,0 0,5 vs. 1,0

T0 0,306 ± 0,080 0,334 ± 0,061 0,358 ± 0,070 0,3624 0,0524 0,2152

T24 0,387 ± 0,077 0,469 ± 0,060 0,454 ± 0,055 0,0038 0,0077 0,6619

T48 0,593 ± 0,095 0,608 ± 0,088 0,695 ± 0,088 0,9430 0,0127 0,0184

T72 0,696 ± 0,095 0,773 ± 0,095 0,813 ± 0,076 0,1067 0,0183 0,4965

45

A distribuição das células nas fases do ciclo celular foi coerente com

células em proliferação ao longo do experimento, sendo o grupo irradiado com

1,0 J/cm2 o que apresenta mais células proliferativas, com sua grande maioria

nas fases S e G2/M nos intervalos T48 e T72 (Figura 4).

Figura 4 - Distribuição das SHEDs nas fases do ciclo celular para os diferentes grupos

estudados, nos intervalos de tempo analisados. Os valores da porcentagem de cada fase do

ciclo representam a média da triplicata.

No intervalo de 72 horas após a primeira irradiação, a expressão da

proteína nuclear Ki67 foi maior nas células dos grupos irradiados do que nas

células que não foram irradiadas (controle), sendo que a dose de 1,0 J/cm2 foi

a que promoveu uma expressão maior de Ki67 (Figura 5). Esse resultado

corrobora com a análise do ciclo celular, uma vez que confirma que as células

do grupo Laser 1,0 concentravam-se nas fases proliferativas.

46

Figura 5 – Imunoexpressão de Ki67 nos grupos estudados. FlowJo (USA)

Em relação à avaliação de apoptose, as células exibiram níveis baixos

de fluorescência tanto para a anexina V quanto para o PI na citometria de fluxo

– o que é compatível com células viáveis – no intervalo de 72 horas,

demonstrando que não houve alterações consideráveis ao longo do

experimento (Figura 6). Este fato representa um indicativo de que as doses

estudadas não estão causando danos celulares às SHEDs.

Figura 6 - Imunomarcação das SHEDs com Anexina V/PI no intervalo de 72 horas. Q1: Anexina

V negativo/PI positivo; Q2: Anexina V/PI positivos; Q3: Anexina V positivo/PI negativo; Q4:

Anexina V/PI negativos. (A) Grupo controle não irradiado; (B) Grupo Laser 0,5; (C) Grupo Laser

1,0.

Não foram observados danos morfológicos ao DNA das SHEDs

submetidas a laserterapia durante o intervalo do estudo. As células não

apresentaram alterações significativas, tais como fragmentações nucleares e

núcleos picnóticos (Figura 7).

47

Figura 7 – Fotomicrografia das SHEDs após 72 horas de cultivo, coradas por DAPI. A -

Controle; B - Laser 0,5; C - Laser 1,0. (Coloração DAPI, 40x)

DISCUSSÃO

As células-tronco de origem dental são isoladas dos tecidos dento-

alveolares [17,18] e apresentam alta capacidade proliferativa e plasticidade,

podendo ser utilizadas para a regeneração das estruturas dento-faciais (como

osso alveolar, complexo dentina-polpa) ou outros tecidos como o tecido neural

[19]. Dentes decíduos humanos têm sido relatados na literatura como uma

fonte promissora para obtenção de células-tronco mesenquimais, que poderão

ser usadas em diversas aplicações clínicas, incluindo a engenharia de tecido

dentário [1], reparo de defeitos ósseos [20] e até mesmo no tratamento de

lesões do tecido neural e doenças degenerativas [21,22].

O isolamento simples e conveniente e a imunogenicidade insignificante –

permitindo, assim, seu uso em transplantes alogênicos sem a utilização de

imunossupressores [21,23,24] – conferem às células-tronco da polpa de dente

decíduo humano esfoliado (SHED) uma importante utilidade clínica, inclusive

na criação de bancos de células. Todavia, a proliferação dessas células é um

processo demorado e a identificação de métodos que aumentem o número de

células disponíveis em um menor intervalo de tempo tornam-se fundamentais.

Nesse contexto, uma das possibilidades sugeridas na literatura é o uso do laser

de baixa intensidade (LBI) [25-27].

O efeito bioestimulatório do LBI tem sido relatado há pelo menos quatro

décadas. Desde que esse efeito foi relatado pela primeira vez, os

pesquisadores neste campo têm buscado o melhor protocolo de laserterapia

48

para promover os efeitos bioestimulatórios positivos atribuídos ao laser de

baixa intensidade [28]. Na literatura, dentre as diversas fontes de células-

tronco, poucas foram avaliadas em relação a laserterapia, especialmente em

relação a células-tronco de origem dental [11,12,13], demonstrando assim a

necessidade de novos estudos com células-tronco obtidas de outras fontes, a

fim de compreender melhor a ação que o LBI exerce na proliferação dessas

células. O presente estudo avaliou o efeito da LBI em SHEDs, uma fonte de

célula-tronco dental pouco estudada, com apenas três estudos publicados

anteriormente [28-30].

Com relação a avaliação da ação do LBI nas células-tronco pulpares, a

literatura apresenta efeitos positivos da associação das células da polpa de

dentes permanentes com a laserterapia [27,31,32]. Quando se trata de SHEDs

associada ao laser de baixa intensidade, estudos prévios mostraram efeitos

positivos na sobrevida de SHEDs submetidas à condição de estresse [30] e na

diferenciação odonto-osteogênica [29], todavia este é o primeiro estudo a

avaliar, além da viabilidade e da proliferação, os efeitos da laserterapia no ciclo

celular, apoptose e morfologia nuclear, exibindo seus resultados favoráveis

nestes eventos biológicos.

Alguns aspectos do laser podem influenciar os resultados de proliferação

desejados, como o comprimento de onda, a potência e a densidade de energia

[26]. A literatura relata que tanto o espectro de luz visível (vermelho), quanto o

de luz infravermelho causam efeitos biológicos nas células irradiadas, sendo o

comprimento de onda variando de 600 a 700 nm o que apresenta melhores

resultados na bioestimulação celular [33-35]. Assim, optou-se por usar o

comprimento de onda de 660 nm nesse estudo, o que promoveu efeitos

bioestimulatórios positivos semelhantes aos relatados por Soares et al. [26],

Zaccara et al. [27], Eduardo et al. [31], confirmando a ação bioestimulátoria do

espectro de luz vermelha.

Além do comprimento de onda, a dose (densidade de energia) é outro

parâmetro que deve ser considerado quando se deseja a bioestimulação

celular. Doses variando de 0,5 a 10 J/cm2 são utilizadas para induzir a

proliferação celular, enquanto doses superiores a 10 J/cm2 podem promover

efeitos antiproliferativos [35]. Densidades de energia variando de 0,5 a 4 J/cm2

têm sido mais efetivas na estimulação do crescimento em células-tronco [25-

49

27,36,37] porém o efeito da variação da densidade de energia com

manutenção da potência ainda é desconhecido em SHEDs.

De acordo com Karu [38] o aumento da dose pode provocar danos aos

fotorreceptores e como resultado, o efeito biomodulatório do laser é reduzido. É

provável que doses menores diminuam o risco de dano celular e, no caso das

células-tronco, contribuam para o aumento de sua população, mantendo suas

características inicias íntegras [26]. Utilizando doses menores (0,5 e 1,0 J/cm2),

o presente estudo conseguiu promover a bioestimulação sem causar danos a

morfologia do núcleo celular nem perda de viabilidade. Fato este confirmado

pela marcação dos núcleos das células irradiadas com DAPI, que demonstrou

núcleos íntegros, sem a presença de fragmentação nuclear ou núcleos

picnoticos. Além disso, a análise dos marcadores relacionados à apotose

(anexina V/PI) mostraram que a maioria das células que foram submetidas à

laserterapia permaneceu viável, reforçando que o LBI não afeta a viabilidade

das células estudadas.

Nossos resultados corroboram os de Fernandes et al., [28] quanto ao

êxito na proliferação de células-tronco da polpa de dentes decíduos utilizando

comprimento de onda de 660 nm e com doses baixas (1,2 J/cm2). Todavia, os

autores avaliaram variações de dose e também da potência (1,2 J/cm2 – 0,5

mW; 2,5 J/cm2 – 10 mW; 3,7 J/cm2 – 15 mW; 5,0 J/cm2 – 20 mW; e 6,2 J/cm2 –

25 mW) e ainda utilizaram intervalos muito curtos para avaliação da

proliferação celular (6 e 24 horas). De fato, variações de parâmetros na

laserterapia têm sido um dos principais complicadores na comparação de

estudos em fotobiomodulação [39].

Doses de 0,5 e 1,0 J/cm2 foram testadas anteriormente em células-

tronco do ligamento periodontal humano [26] e em células-tronco da polpa de

dentes permanentes [27], com os demais parâmetros do laser iguais ao

utilizados no presente estudo. As células da polpa de dentes permanentes

apresentaram uma maior proliferação nos últimos tempos estudados (72 e 96h

após a irradiação) quando irradiadas com a dose de 1,0 J/cm2 comparadas

com o grupo controle não irradiado [27]. Comportamento semelhante foi

demonstrado com as células-tronco do ligamento periodontal humana que,

quando irradiadas com uma dose de 1,0 J/cm2, apresentaram uma taxa

proliferativa significativa maior quando comparado com o grupo não irradiado,

50

nos últimos tempos avaliados (48 e 72 horas após a irradiação) [26]. Com base

nestes resultados e nos encontrados no presente estudo, acredita-se que a

dose de 1,0 J/cm2 possa ser efetiva no aumento da proliferação de outras

fontes de células-tronco. Além disso, pode-se observar que esta dose permitiu

uma resposta proliferativa mais acentuada das SHEDs em comparação com a

dose 0,5 J/cm2, o que foi demonstrado pela expressão de Ki67 e a distribuição

das células no ciclo celular.

A análise do ciclo celular demonstrou a distribuição das células em fases

consistentes com a proliferação celular (S e G2/M), corroborando os achados

anteriores em células-tronco da polpa dental [27]. Embora o mecanismo

molecular exato pelo qual o LBI exerce seus efeitos sobre a proliferação celular

não esteja completamente compreendido, os dados experimentais mostraram

que a irradiação é seguida pelo aumento da síntese de fatores de crescimento,

óxido nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ROS), ATP, RNA, e DNA

[40]. No teste de MTT, o grupo irradiado com a dose de 1,0 J/cm2 exibiu os

melhores resultados nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após a primeira

irradiação em comparação com o grupo controle (não irradiado) e este foi

significativamente melhor quando comparado ao grupo irradiado na dose de

0,5 J/cm2, no intervalo de 48 horas. Os resultados estão de acordo com os

estudos de Barboza et al. [25], que irradiaram células-tronco da medula óssea

e derivadas do tecido adiposo e de Stein, et al. [41], que irradiaram

osteoblastos humanos. Ambos os trabalhos apresentaram maior proliferação

celular usando um comprimento de onda de 660 nm e uma dose de 1,0 J/cm2.

Os resultados deste estudo mostraram que o LBI nos parâmetros

utilizados (potência de 30 mW, comprimento de onda de 660 nm e densidade

de energia de 1,0 J/cm2) estimularam a proliferação de SHEDs, sem afetar a

viabilidade ao longo do experimento. Estes dados têm relevância clínica

potencial, uma vez que o uso do LBI representa uma oportunidade terapêutica,

especialmente no campo da terapia celular e da engenharia tecidual.

Considerando o número limitado de experimentos e a heterogeneidade das

metodologias empregadas, mais pesquisas são necessárias para identificar os

parâmetros ideais para estimular proliferação e especialmente a diferenciação

deste tipo celular induzidos pela laserterapia.

51

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56

4. ARTIGO II

Para submissão ao Journal of Biomedical Materials Research – Part

B:Applied Biomaterials (ISSN 1552-4981) – IF 2.881 (JCR® 2015) – Qualis

A2

INFLUÊNCIA DA FOTOBIOMODULAÇÃO NA PROLIFERAÇÃO DE

CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DENTÁRIA CULTIVADAS SOBRE

ARCABOUÇOS POLIMÉRICOS NANOFIBROSOS.

Influence of photobiomodulation on the proliferation of dental pulp stem

cells cultivated on polymeric nanofibrous scaffolds.

Fernanda Ginania, Talita Nascimento da Silvab, Paulo Henrique de Souza

Piccianib, Carlos Augusto Galvão Barbozaa

aPrograma de Pós-Graduação em Patologia Oral, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

bPrograma de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Polímeros,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Autor para correspondência:

Carlos Augusto Galvão Barboza

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral

Av. Salgado Filho, 1787 – Lagoa Nova

CEP 59056-000 – Natal – RN – Brasil

e-mail: cbarboza@cb.ufrn.br

57

RESUMO

A eletrofiação tem sido estudada para produção de nanofibras de polímeros,

sendo o ácido polilático (PLA) um biomaterial promissor pelas suas

propriedades físicas e baixo custo. O laser de baixa intensidade (LBI) tem

apresentado resultados positivos na proliferação de diversos tipos celulares in

vitro. Este estudo avaliou o efeito do LBI (comprimento de onda 660 nm;

potência 30 mW; doses de 0,5 e 1 J/cm2) na proliferação de células-tronco da

polpa de dentes decíduos humanos cultivadas sobre arcabouços nanofibrosos

de PLA confeccionados pela técnica de eletrofiação. Três grupos experimentais

(G1 – não irradiado; G2 – irradiado com 0,5 J/cm2; G3 – irradiado com 1,0

J/cm2) foram analisados nos intervalos de 24, 48 e 72 h. Os resultados

demonstraram que o PLA não é citotóxico para as SHEDs, que apresentaram

tendência proliferativa em todos os grupos no decorrer do experimento. Os

grupos submetidos à laserterapia (G2 e G3) tiveram maior crescimento celular

do que o grupo controle não irradiado (G1), com melhores resultados para o G3

no intervalo inicial (T24) e para G2 nos demais intervalos (T48 e T72). Conclui-

se que as nanofibras de PLA são arcabouços favoráveis para o cultivo de

SHEDs e que a laserterapia nos parâmetros estudados promoveu efeitos

bioestimulatórios quando aplicada nas células cultivadas sobre este arcabouço.

Palavras-chaves: Materiais biocompatíveis; polímeros; eletrofiação; células-

tronco; laserterapia.

58

INTRODUÇÃO

A engenharia de tecidos tem sido bastante utilizada para proporcionar a

reparação funcional, com o desenvolvimento de substitutos biológicos que

possam restaurar, manter ou substituir tecidos e órgãos danificados. Esta

ciência envolve três componentes básicos: um arcabouço que proporciona

estrutura e substrato para o crescimento e desenvolvimento tecidual; uma fonte

de células para facilitar a formação do tecido desejado; e fatores de

crescimento ou estímulos biofísicos que direcionem o crescimento e

diferenciação das células no arcabouço [1].

Os tecidos animais são compostos por células embebidas em uma

matriz extracelular (MEC); estruturalmente a MEC natural é uma rede

tridimensional de fibras composta por várias proteínas e polissacarídeos, com

diâmetro variando de dezenas a centenas de nanômetros [2]. Assim, na

engenharia tecidual o arcabouço desempenha um papel crítico, devendo

mimetizar as características estruturais e as funções biológicas da MEC natural

do tecido, como a microarquitetura com um tamanho de poro suficiente para

promover a adesão, proliferação e migração celular, além da deposição de

matriz [3].

Com o desenvolvimento das técnicas de produção dos biomateriais, os

tipos de arcabouços e a qualidade do tecido formado se tornam cada vez mais

versáteis [4]. A eletrofiação (eletrospinning) é uma das técnicas mais

comumente utilizadas na literatura para a fabricação de suportes fibrosos. É

uma técnica bem estabelecida, usada para fabricar arcabouços fibrosos cujas

propriedades (tais como a porosidade, o tamanho de poro e o tamanho da

fibra) podem ser facilmente regulados [5]. A eletrofiação produz malhas não

tecidas contendo fibras que variam em diâmetro de dezenas de nanômetros até

dezenas de micrômetros. Materiais sintéticos ou naturais podem ser utilizados,

mas os polímeros sintéticos geralmente permitem uma maior capacidade de

adaptar as propriedades mecânicas e a taxa de degradação [6]. Os parâmetros

de fabricação, tais como o solvente de polímero, a concentração de polímero, a

tensão e a distância do coletor, podem ser variados para modificar as

propriedades da fibra e da estrutura [7].

59

O ácido polilático (PLA) é um biopolímero comercial que pertence à

família do ácido α-hidroxil e que pode ser usado puro ou associado a outros

polímeros naturais ou sintéticos, possuindo uma variedade de aplicações

biomédicas devidas a sua elevada resistência, biodegradabilidade,

biocompatibilidade e baixo custo [8-10]. Quando utilizado como arcabouço, o

PLA promove um excelente ambiente para o crescimento celular especialmente

por suas propriedades físicas [11]. Arcabouços nanofibrosos de PLA

produzidos pela técnica de eletrofiação têm se mostrado uma ferramenta

versátil para a engenharia de tecidos, como uma superfície topográfica

tridimensional para a fixação das células, além de funcionar como um

dispositivo para entrega de drogas ou moléculas bioativas e um substrato para

bio-funcionalização [7].

O laser de baixa intensidade (LBI) tem sido considerado um grande

avanço tecnológico em virtude de suas diversas propriedades, tais como

monocromaticidade, direcionalidade, coerência e brilho, sendo utilizado como

adjuvante na área biomédica em virtude dos seus efeitos terapêuticos,

sobretudo para a bioestimulação tecidual e reparo ósseo. Estudos mostram

que a energia da luz também aumenta a quantidade de ATP; acelera a mitose;

melhora a reparação tecidual e óssea; equilibra a produção de fibroblasto,

normalizando as fibras colágenas e elásticas, que são depositadas na

reparação tecidual; e aumenta a circulação sanguínea periférica, promovendo

ação anti-inflamatória e cicatrização tecidual [12].

Estudos moleculares mostram que, após a absorção dos fótons pelas

células, numerosas vias de sinalização são ativadas, levando à ativação de

fatores de transcrição. Estes fatores de transcrição podem promover o aumento

da expressão de genes relacionados com a síntese de proteínas, a migração e

proliferação celular, a sinalização anti-inflamatória, as vias anti-apoptóticas e

enzimas antioxidantes. As células-tronco e células progenitoras parecem ser

particularmente suscetíveis ao LBI [13].

O efeito do LBI tem sido intensamente estudado nos últimos anos com o

objetivo de acelerar a proliferação de vários tipos celulares, representando uma

ferramenta útil para futuros avanços em engenharia tecidual [14]. Um efeito

bioestimulatório positivo in vitro do LBI foi demonstrado em osteoblastos sob

condições convencionais de cultivo [15-17] e em diversos tipos celulares

60

cultivados sob a superfície de biomateriais, incluindo policarbonato uretano

[18], biosilicato [19,20], matriz dérmica acelular [21] e estrutura porosa de

hidroxiapatita [22].

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da fotobioestimulação com

laser diodo no espectro de luz visível (660 nm) na proliferação de células-

tronco da polpa de dentes decíduos humanos (SHEDs) cultivadas sobre

arcabouços nanofibrosos de PLA confeccionados pela técnica de eletrofiação.

MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Parecer CAAE:

34913314.4.0000.5537). As células-tronco foram isoladas de três (03) dentes

decíduos em estágio final de esfoliação ou com exodontia indicada.

Após a exodontia, os dentes foram mantidos em condição hipotérmica

(4ºC) e submetidos ao protocolo de lavagem com antibióticos e antimicóticos

descrito por Vasconcelos et al. [23], com o objetivo de eliminar possível

contaminação das células por micro-organismos orais. Para obtenção das

SHEDs, o tecido pulpar foi cuidadosamente retirado por curetagem e, em

seguida, o extrato foi submetido à digestão enzimática com 3 mg/mL de

colagenase I (Gibco,USA) e 4mg/mL de dispase (Gibco, USA), por 1 hora a

37°C. As culturas foram mantidas em meio alfa-MEM suplementado com 15%

de soro fetal bovino (SFB) a 37ºC em 5% de CO2 até atingirem 70 – 90% de

confluência, com troca de meio a cada três dias.

Na primeira passagem (P1), a natureza das células-tronco

mesenquimais foi determinada de acordo com os critérios estabelecidos por

Dominici et al. [24]: adesão das células ao plástico de cultivo; imunomarcação

positiva de anticorpos de superfície (CD105, CD73 e CD90) em citometria de

fluxo usando o Human MSC Analysis Kit (BD Stemflow™, USA); e capacidade

de diferenciação osteogênica e adipogênica após cultivo com meios de indução

(StemPro® Differentiation Kits, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) por até 21

dias.

Os arcabouços foram confeccionados no Laboratório de Dispositivos

Poliméricos (LADISPO) do Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa

61

Mano (IMA) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). O PLA (peso

molecular 200.000 g/mol; Natureworks, Minnetonka, MN, USA) foi dissolvido

em clorofórmio e dimetilformamida (DMF), em uma proporção de 4:1. A

eletrofiação da solução polimérica de PLA a 16% foi realizada por meio de uma

fonte de alimentação de alta tensão (Modelo PS / FC60P02.0-11, Glassman

High Voltage Inc., NJ, EUA) e uma bomba de seringa controlada digitalmente

(Modelo 100, KD Scientific Inc., Holliston, MA) nas seguintes condições: vazão

da solução polimérica na seringa de 0,5 mL/hora, tensão aplicada de 20 kV,

umidade relativa de 71% a 22ºC. A distância entre o coletor e a seringa foi de

13 cm. A morfologia das nanofibras de PLA foi avaliada no IMA/UFRJ em um

microscópio eletrônico de varredura com emissão de campomodelo Hitachi S-

4700 (NewYork, USA).

Após a obtenção das fibras nas dimensões adequadas (6 mm de

diâmetro), estas foram submetidas ao processo de esterilização adaptado do

protocolo descrito por Mansourizadeh et al. [25]: exposição por três horas na

luz ultravioleta em câmara de fluxo laminar; lavagem com etanol 70% durante

30 minutos; e três lavagens com tampão fosfato (PBS) por 15 minutos cada.Em

seguida, as fibras de PLA foram dispostas em placas de 96 poços e imersas

em meio alfa-MEM suplementado com 15% de SFBovernight a 37ºC em 5% de

CO2, com o objetivo de aumentar a hidrofilia do biomaterial.

Após esse período, os arcabouços foram divididos em três grupos

experimentais para o cultivo celular: (G1) PLA: células cultivadas no PLA sem

irradiação; (G2) PLA + Laser 0,5: células cultivadas no PLA e irradiadas com

uma dose de 0,5 J/cm2; (G3) PLA + Laser 1,0: células cultivadas no PLA e

irradiadas com uma dose de 1,0 J/cm2. As células foram cultivadas na

densidade de 5x103 células/poço. Nos grupos G2 e G3 as células foram

irradiadas nos intervalos T0 e T48 (48 h após a primeira irradiação) com um

aparelho de Laser diodo (Kondortech – modelo Bio Wave LLLT Dual, São

Carlos, Brasil), com as características apresentadas na Tabela 1. O

plaqueamento celular foi realizado de forma que entre os poços semeados

havia um poço vazio, impedindo a dispersão de luz não intencional entre os

poços durante aplicação da laserterapia.

62

Tabela 1 - Parâmetros do Laser utilizado

Composição InGaAlP

Potência 30 mW

Comprimento de onda 660 nm

Modo de ação Contínuo

Diâmetro da ponta 0,01 cm2

Doses utilizadas 0,5 e 1,0 J/cm²

Tempo de irradiação 16 s (0,5 J/cm²) e 33 s (1,0 J/cm²)

Modo de aplicação sonda de irradiação perpendicular à placa, a 0,5 cm das células

A proliferação e viabilidade celular foram avaliadas através do ensaio de

MTT e através do Live-Dead Assay Cytotoxicity Kit for mammalian cells

(Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Para o ensaio de MTT, a leitura da

absorbância das amostras foirealizada em um leitor de ELISA em um

comprimento de onda de 570nm, nos intervalos de 24, 48 e 72 h após a

primeira aplicação do laser.

No intervalo de 72 horas foi realizado o ensaio Live/Dead. Para tanto, os

poços dos grupos foram incubados com 2 µM de calceína AM (que cora em

verde o citoplasma de células vivas) e 4 µM de homodímero de etídio (que cora

em vermelho o núcleo de células mortas), por 20 minutos, em ambiente

protegido da luz. As amostras foram avaliadas em microscópio de fluorescência

(Zeiss Imager A2, Oberkochen, Alemanha) e foram obtidas fotomicrografias do

campo central de cada amostra (n=4) para análise do número de células

mortas.

Os dados foram submetidos à análise não paramétrica. A diferença entre

os grupos para cada um dos intervalos de tempo estudados foi analisada pelos

testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando-se um

nível de significância de 5% (p<0,05).

RESULTADOS

63

A microscopia eletrônica de varredura revelou que as fibras de PLA

produzidas pela técnica de eletrofiação, nos parâmetros utilizados,

apresentaram tamanho médio de 616 ± 177 nm (Figura 1).

Figura 1 – Micrografia eletrônica das fibras de PLA produzidas por eletrofiação. (A) Aumento de

1.500x; (B) Aumento de 30.000x.

Através do ensaio de MTT foi possível observar que o PLA não é

citotóxico para as SHEDs, uma vez que as mesmas apresentaram uma

tendência proliferativa no decorrer do experimento (Figura 2). Quando

comparamos a associação do biomaterial com a laserterapia, observa-se que,

no primeiro intervalo analisado (T24), o laser na dose 1,0 J/cm2 (G3) promoveu

um maior crescimento celular, sendo significativamente melhor do que o laser

na dose de 0,5 J/cm2 (G2). Já após a segunda irradiação (T48), essa situação

se inverte, passando o grupo irradiado com o laser na dose de 0,5 J/cm2 a

apresentar melhores resultados em relação a proliferação celular, quando

comparado com o grupo G3 (PLA + Laser 1,0) (p<0,05) (Tabela 1). Todavia, no

intervalo de 72 h, o ensaio do MTT mostra uma queda considerável nas leituras

do G2, enquanto os dados do G3 seguem em ascendência.

64

Figura 2 – Curva de proliferação das SHEDs associadas ao PLA nos intervalos de tempos

estudados, através do MTT.

Tabela 1. Análise dos valores de absorbância das SHEDs associadas ao PLA em cada

intervalo de tempo após a lasertarpia nos diferentes grupos estudados.

*Teste de Mann-Whitney; os números em negrito indicam diferença estatística (p<0,05)

Os dados do MTT foram confirmados pelo ensaio de viabilidade celular

(Live/Dead), que mostrou que o G2 exibiu médias de células mortas (marcadas

em vermelho pelo homodímero de etídeo) significativamente maior do que os

grupos G1 e G3 no intervalo de 72 h (Figura 3).

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

T24 T48 T72

De

nsi

da

de

óp

tica

(5

70

nm

)G1

G2

G3

G1 G2 G3 p*

Média ± DP Média ± DP Média ± DP G1 vs. G2 G1 vs. G3 G2 vs. G3

T24 0,490 ± 0,065 0,509 ± 0,056 0,620 ± 0,061 0,8182 0,0082 0,0140

T48 0,785 ± 0,045 0,949 ± 0,088 0,683 ± 0,083 0,0025 0,0732 0,0012

T72 0,792 ± 0,078 0,872 ± 0,056 0,792 ± 0,071 0,1320 0,9452 0,0245

65

Figura 3 – (A-C) Imunofluorescência das células marcadas com Live/Dead nos grupos G1 (A),

G2 (B) e G3 (C). Marcação em vermelho representa células mortas. Barra de escala = 100 µm.

(D) Média do número de células mortas por campo nos grupos estudados, no intervalo de 72 h.

*p<0,05; Teste de Mann-Whitney.

DISCUSSÃO

O PLA é amplamente utilizado em uma variedade de aplicações

biomédicas pelas suas características de biocompatibilidade,

biodegradabilidadee baixo custo [8,10] e por proporcionar um ambiente

favorável para o crescimento celular [7,11,26]. Sua interação tem sido estudada

com diversos tipos celulares, como condrócitos, fibroblastos [27-29], células

percursoras osteogênicas [30-32], células do sistema imune [33], e linhagens

de células neuronais [34-37].

Uma importante perspectiva para o uso do PLA é sua associação com

células-tronco, especialmente na forma de arcabouços tridimensionais

nanofibrosos produzidos pela técnica de eletrofiação. Este processo promove

um microambiente adequado para a manutenção do fenótipo celular e do

crescimento das células com base na orientação das fibras, favorecendo a

66

adesão e a proliferação celular [38]. Marei et al. [26] cultivaram células

mesenquimais derivadas da medula óssea e do tecido adiposo

sobrearcabouços de PLA eletrofiados e observaram que o biomaterial

favoreceu a adesão e a proliferação celular. Russo et al. [39] também

observaram um aumento da adesão e proliferação celular quando cultivaram

células-tronco epiteliais aminióticas em arcabouços de PLA produzidos pela

mesma técnica. O presente estudo representa o primeiro relato do uso de

SHEDs associadas a nanofibras de PLA e os resultados favoráveis obtidos

podem representar uma perspectiva promissora na reconstrução de tecidos

dentários e ósseos perdidos.

Um requisito na engenharia tecidual é a obtenção de um número

adequado de células-tronco, visto que o seu rendimentoin vitro normalmente é

baixo [40]. Neste sentido, o laser de baixa intensidade (LBI) destaca-se como

uma ferramenta importante para aumentar o número de células-tronco

disponíveis em um menor intervalo de tempo [14]. Todavia, a literatura é

escassa quanto ao número de estudos investigando o efeito do LBI na adesão

e proliferação de células cultivadas em diferentes biomateriais e não há

estudos quanto à sua aplicação associada ao PLA. Quando submetidas à

laserterapia, as SHEDs cultivadas sobre o PLA exibiram uma curva crescente

de proliferação ao longo do experimento, demonstrando que o biomaterial não

é citotóxico para este tipo celular e que o LBI exerceu efeitos bioestimulatórios.

Os efeitos positivos da irradiação em células-tronco mesenquimais em

condições de cultivo regulares foram previamente descritos [41-44] e têm sido

associados ao aumento do potencial da membrana mitocondrial e, portanto, à

produção de ATP [45,46] e à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS)

[47,48]. Estes eventos bioquímicos têm sido apontados como sendo

responsáveis pelo controle da proliferação, viabilidade, diferenciação celular e

apoptose [17,49,50]. Como o efeito da laserterapia é dose dependente [51], as

SHEDs, na presença do PLA, podem necessitar de um estímulo inicial maior

para proliferação, o que explicaria o melhor resultado para a maior dose

avaliada (1 J/cm2) no intervalo inicial do experimento (T24).

Choi et al. [21], estudando o efeito da irradiação com 1 J/cm2 na

viabilidade e proliferação de células mesenquimais cultivadas em uma matriz

dérmica acelular, observaram resultados positivos, semelhantes aos

67

encontrados nesse trabalho, o que sugere o uso da laserterapia como uma

abordagem interessante para a engenharia de tecidos. Efeitos bioestimulatórios

associados a terapia a laser também foram encontrados por Hsu et al. [18], que

irradiaram células endoteliais cultivadas em um suporte de poliuretano poroso

com uma dose de 1,18 J/cm2. Estes últimos autores optaram por irradiar as

células antes do cultivo no arcabouço por se tratar de uma biomaterial poroso,

enquanto no presente trabalho a irradiação ocorreu diretamente sobre as

células previamente cultivadas no arcabouço de PLA, apresentando resultados

semelhantes.

Avaliando doses maiores do LBI, Renno et al. [19] observaram que

células pré-osteoblásticas (MC3T3-E1) cultivadas em biosilicato e irradiadas

comuma dose de 10 J/cm2 apresentaram uma diminuição da proliferação

celularquando comparada ao grupo não irradiado. Resultados semelhantes

foram encontrados no estudo de Pinto et al. [20], que também utilizou um

suporte de biosilicato e uma dose de 120 J/cm2 para o reparo de defeitos

ósseos em ratos, e não identificou um efeito extra da laserterapia no processo

de regeneração. Esses resultados podem ser um efeito da interferência do

biomaterial no momento da aplicação do laser, onde a luz pode sofrer refração

ou absorção [19]. Além disso, as doses muito altas do laser podem causar

efeitos antiproliferativos como já relatado na literatura [52,53]. No caso do

arcabouço de PLA usado no presente trabalho, a possível refração ou

absorção de luz pelo biomaterial não parece ocorrer, já que obtivemos uma

curva proliferativa mais ascendente nos grupos irradiados quando comparados

com o grupo não irradiado durante o experimento.

Um resultado inesperado foi a queda na proliferação celular no G2 no

intervalo de 72 h, demonstrado pelo MTT e visto no ensaio Live/Dead como

uma quantidade significativamente maior de células mortas. Esta observação

requer futuras investigações e uma das hipóteses para este fenômeno é o fato

deste grupo ter exibido uma expressiva proliferação celular no intervalo de 48

h, o que pode ter comprometido o transporte de nutrientes e promovido uma

sobrecarga de metabólitos celulares no microambiente de cultivo.

Conclui-se que as nanofibras de PLA são arcabouços favoráveis para o

cultivo de SHEDs e que a laserterapia nos parâmetros estudados promoveu

efeitos bioestimulatórios quando aplicada nas células cultivadas sobre este

68

arcabouço. Estudos futuros são necessários para a melhor compreensão dos

processos envolvidos na proliferação e especialmente na diferenciação celular

induzidos pela laserterapia na superfície do biomaterial. Isto deve incluir

experimentos aplicando esta metodologia in vivo e o uso do PLA em forma de

blendas e/ou com modificações estruturais, visando proporcionar uma melhor

resposta celular.

69

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75

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Em resumo, o presente estudo mostrou que o LBI nos parâmetros

utilizados (potência de 30 mW, comprimento de onda de 660 nm e densidades

de energia de 0,5 e 1,0 J/cm2) estimularam a proliferação de SHEDs cultivadas

tanto na superfície padrão (plástico da placa de cultivo celular) quanto em

arcabouços tridimensionais de PLA produzidos por eletrofiação.

O uso do LBI apresenta um importante potencial terapêutico,

especialmente com aplicação no campo da engenharia tecidual. Considerando

o número limitado de experimentos e a heterogeneidade das metodologias

empregadas, mais estudos são necessários para a melhor compreensão dos

processos envolvidos na proliferação e especialmente na diferenciação celular

induzidos pela laserterapia. Isto deve incluir experimentos in vivo e o uso do

PLA em forma de blendas e/ou com modificações estruturais, visando

proporcionar uma melhor resposta celular para utilização na medicina

regenerativa e na engenharia tecidual.

76

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