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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
THATIANY JARDIM BATISTA
EFEITOS DA EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO
ORGANOFOSFORADO CLORPIRIFÓS SOBRE A FUNÇÃO
CARDIORESPIRATÓRIA
VITÓRIA
2018
THATIANY JARDIM BATISTA
EFEITOS DA EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO
ORGANOFOSFORADO CLORPIRIFÓS SOBRE A FUNÇÃO
CARDIORESPIRATÓRIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof.a Dr.a Karla Nívea Sampaio
VITÓRIA
2018
THATIANY JARDIM BATISTA
EFEITOS DA EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO ORGANOFOSFORADO
CLORPIRIFÓS SOBRE A FUNÇÃO CARDIORESPIRATÓRIA
Trabalho de Dissertação de Mestrado aprovado em 31/08/2018 para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, área de concentração Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal do Espírito Santo
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Prof. Dr. Valdo José Dias da Silva / UFTM
____________________________________
Prof. Dr. Leonardo dos Santos / UFES
____________________________________
Prof.a Dr.a Nazaré Souza Bissoli / UFES
____________________________________
Prof.a Dr.a Karla Nívea Sampaio (orientadora) / UFES
Dedico aos meus queridos pais e
ao meu amado esposo, por todo
apoio e incentivo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, acima de tudo, ao meu grandioso Deus, a quem dedico todo o meu viver.
Se não fosse pela manifestação do Seu poder, certamente eu não estaria
apresentando este trabalho. Obrigada pelo dom da vida. Obrigada pela cura.
Aos meus pais, Adib e Cida, que apesar de não terem tido oportunidade de ter
ensino superior, me ensinaram dedicação, honestidade e responsabilidade em meus
propósitos, além de nunca terem deixado faltar o necessário para que eu me
dedicasse aos estudos. Mesmo depois de casada, a minha mãe ainda cuida de mim.
Me liga perguntando se eu estou na “escola” (risos) ou prepara alguma comida
maravilhosa.
Ao meu esposo, Ernane, por sempre me apoiar no que eu mais gosto de fazer, que
é estudar. Obrigada por cuidar de mim. Obrigada por estar comigo em todos os
momentos. Te amo muito!
À minha querida orientadora, Karla Sampaio. Sou meio suspeita de falar sobre ela
porque a admiro muito. Se estou recebendo o título de Mestre é porque ela não
desistiu de mim. Mesmo quando eu pensei que não dava mais para seguir adiante
(por motivos de saúde), ela ofereceu toda a ajuda e foi até para a bancada com
meus amigos do laboratório para me ajudar a concluir meus experimentos. Com ela
eu aprendi muito mais do que fazer uma apresentação em público, criticar um artigo,
canular um animal, um banner no padrão do laboratório, nunca ficar “à toa” (risos)...
Aprendi a ser humilde; reconhecer quando não sei fazer alguma coisa; aprendi que
eu não preciso fazer tudo sozinha; que não há vergonha em pedir e aceitar ajuda;
aprendi que eu tenho que ler, ler, ler (como ela sempre diz); e a celebrar cada vitória
com champanhe, no meu caso, sem álcool! (risos)
Aos meus amigos do INFARTOX (Laboratório de Investigação Fármaco-Toxicológica
da Função Cardiovascular). Vou arriscar citar cada nome sem esquecer (risos):
Andrew e Vítor, obrigada por me ajudar a cuidar dos animais e em todas as etapas
dos experimentos. Enfim, não tenho palavras para descrever, vocês são demais!!!
Bianca, você que chegou mais recente, mas já faz cirurgia melhor do que todos
(risos), obrigada por nos ajudar neste trabalho! Sara, obrigada pela amizade, por me
ajudar a perder o medo dos animais, a me ensinar a canular e a saborear bolos
(como o da panificadora Graça, risos). Àqueles que já passaram por este laboratório,
deixaram as anotações nos cadernos (muito importante!), lembranças engraçadas; e
seguiram o seu caminho - Akira, Aline, Kamila, Graziany, Luciana. Um tópico
separado para o Igor, porque ele representa nosso Lab no exterior: obrigada pelas
‘aulas’ de estatística, debates de política, pelos seus dois cadernos (só para constar,
mesmo deixando dois cadernos, ainda vamos te perturbar parar tirar dúvidas)... e
por me ajudar com os experimentos quando eu não tinha condições de fazer, muito
obrigada mesmo! Agradeço também àqueles que chegaram um pouco depois e que
também me ajudaram de alguma forma: Claudia e Bruno. E às minhas amigas da
graduação, do mestrado e da vida: Cristina, Fernanda e Josefa.
A professora Claudia Jamal. Ela nem sabe disso, mas às vezes eu chegava bem
cedo para fazer experimento e 8h da manhã já estava estressada, porque alguma
coisa não dava certo, mas aí chegava a professora Cláudia sempre alegre, com um
bom dia animado e com histórias engraçadas para compartilhar. Essas coisas
parecem simples, mas fazem a diferença.
Agradeço também aos amigos do Laboratório de Psicofarmacologia, vulgo Lab da
Vanessa, pela colaboração e amizade. Agradeço a professora Vanessa Beijamini,
por sempre nos ajudar nos dados estatísticos, por nos enviar artigos relacionados ao
nosso trabalho, nos incentivar a estudar, além de nos emprestar o micro-ondas e o
espaço do laboratório para nossas “reuniões”.
Ao professor Leonardo dos Santos, por nos ajudar a explorar ainda mais os nossos
dados, pela disposição em nos atender, paciência (para explicar sobre a
variabilidade, risos) e pelas excelentes contribuições para enriquecer este trabalho.
Não sei como agradecer por ter nos acompanhado nessa jornada, sei que a sua
rotina não é fácil, por isso agradeço de coração por todo tempo a nós dispensados!
Ao professor Tadeu Uggere, pela disponibilidade e contribuições para este trabalho.
Agradeço ao Rodolfo e aos funcionários do biotério, por nos ajudar com o
cuidado com os animais. Vocês são fundamentais, pois sem animais não teríamos
nem pesquisa.
Aos demais alunos do programa que me ajudaram a concluir os créditos. Aos
queridos e dedicados professores e funcionários do departamento de Ciências
Farmacêuticas.
A todos os meus amigos e familiares que sempre se preocuparam com meus
estudos, me incentivaram, oraram, ofereceram ajuda e compreenderam a minha
ausência.
Aos Professores da banca examinadora, professora Nazare Bissoli, professor
Valdo Silva e professor Leonardo dos Santos por aceitarem o nosso convite. Eu
me senti muito honrada em poder contar com as contribuições de vocês, e agora
nessa versão final posso afirmar que tudo que falaram, foi muuuito útil para tornar
este trabalho ainda melhor. Muito obrigada!
Por fim, mas não menos importante, à CAPES e FAPES pelo suporte financeiro.
“mas os que confiam no Senhor recebem sempre novas forças. Voam nas alturas como águias, correm e não perdem as forças, andam e não se cansam.” Isaías 40:31
RESUMO
Estudos prévios do nosso grupo mostraram que exposição aguda a altas doses do
composto organofosforado (OP), clorpirifós (CPF), prejudicaram os reflexos
cardiorespiratórios em ratos. Aliado a isso alguns estudos indicam que a exposição
prolongada a compostos OP prejudica a função cardiovascular, produzindo
hipertrofia cardíaca e alterando as propriedades mecânicas da aorta. Entretanto,
permanecia inexplorado se a exposição prolongada ao CPF também afeta a
regulação cardiorespiratória tônica e reflexa. Ratos Wistar foram intoxicados com
CPF, por via intraperitoneal (i.p.), por 4 semanas (3 vezes/semana) ou 12 semanas
(1 vez/semana), nas seguintes doses: 7 mg/kg (CPF 7; 4 semanas, n=14; 12
semanas, n=14) e 10 mg/kg (CPF 10; 4 semanas, n=9; 12 semanas, n=12). O grupo
controle recebeu solução salina (NaCl, 0,9%) para o mesmo período (SAL; 4
semanas, n=9; 12 semanas, n=13). No final do tratamento, a artéria e veia femoral
foram cateterizadas sob anestesia com tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.), para permitir
registros de pressão arterial e administração de drogas, respectivamente. Após 24
horas de recuperação da cirurgia, foi registrada a pressão arterial pulsátil (PAP), da
qual foram derivadas a pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial sistólica
(PAS), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC). Neste mesmo
período foram feitos registros pletismográficos de frequência respiratória (fR), volume
corrente (VT) e volume minuto (VE). As respostas quimiorreflexas foram avaliadas
por injeções intravenosas de KCN (10, 20, 40 e 80 μg) enquanto o barorreflexo
espontâneo foi avaliado a partir de gravações da PAS e intervalo de pulso (IP)
através do método de sequência. Estas gravações também foram utilizadas para
avaliar a variabilidade de frequência cardíaca (VFC) no domínio do tempo e da
frequência (análise espectral). Por fim, a atividade da acetilcolinesterase (AChE)
cerebral e butirilcolinesterase (BuChE) plasmática foram quantificadas. Os
resultados mostraram que a atividade enzimática dos animais intoxicados com CPF
foi significativamente menor do que o controle. Além disso, os animais tratados por 4
semanas com CPF 10 apresentaram menor ganho de peso. Não foram observadas
diferenças nos valores basais de PAD, PAS, PAM, FC e fR, bem como nos índices
de VFC no domínio do tempo entre os grupos, tanto após 4 ou 12 semanas de
tratamento. Na análise espectral foi observado um aumento apenas para a banda de
muito baixa frequência (VLF). Animais tratados com CPF apresentaram um
comprometimento no ganho do barorreflexo para rampas ascendentes e no índice
de efetividade do barorreflexo (BEI). A resposta bradicárdica quimiorreflexa foi
significativamente reduzida nos ratos tratados com CPF em ambos períodos de
tratamento quando comparados com os grupos controle. Não houve diferença na
resposta pressora quimiorreflexa nem na resposta taquipneica entre os grupos nos
dois períodos de tratamento. Por outro lado, o grupo CPF 10 apresentou aumento de
VT em ambos períodos de tratamento e um aumento no VE, mas somente após 1
mês de tratamento. Semelhante ao que foi previamente demonstrado após
exposição aguda ao CPF, a exposição crônica a baixas doses também prejudica a
função cardiorespiratória em ratos. Esses resultados podem ter implicações clínicas
importantes para os trabalhadores, como os agricultores, frequentemente expostos a
esses compostos.
Palavras-chave: clorpirifós, quimiorreflexo, barorreflexo, VFC, butirilcolinesterase,
acetilcolinesterase.
ABSTRACT
Previous studies of our group showed that acute exposure to high doses of
organophosphorus compound (OP), chlorpyrifos (CPF), impaired cardiorespiratory
reflexes in rats. In addition, some studies indicate that prolonged exposure to OP
compounds impairs cardiovascular function, producing cardiac hypertrophy and
altering the mechanical properties of the aorta. If prolonged CPF exposure also
affects tonic and reflex cardiorespiratory function remained to be explored. Wistar
rats were injected with CPF intraperitoneally (i.p.) for 4 weeks (three times a week) or
12 weeks (once a week) at the following doses: 7 mg/kg (CPF 7; 4 weeks, n=14; 12
weeks, n=14) and 10 mg/kg (CPF 10; 4 weeks, n=9; 12 weeks, n=12). The control
group received saline (NaCl, 0.9%) for the same period (SAL, 4 weeks, n=9, 12
weeks, n=13). At the end of the treatment, the femoral artery and vein were
catheterized under anesthesia with tribromoethanol (250 mg/kg, i.p.), to allow
pressure recordings and drugs administration, respectively. After 24 hours of
recovery from surgery, pulsatile arterial pressure (PAP) was recorded, from which
diastolic blood pressure (DBP), systolic blood pressure (SBP), mean arterial pressure
(MAP) and heart rate (HR) were derived. Respiratory rate (fR), tidal volume (VT) and
minute volume (VE) were obtained by whole-body plethysmography. The
chemorreflex responses were evaluated by intravenous injections of KCN (10, 20, 40
and 80 μg) while the spontaneous baroreflex was evaluated from the PAS and pulse
interval (PI) recordings using the sequence method. These recordings were also
used to evaluate heart rate variability (HRV) in time and frequency domain (spectral
analysis). Finally, the activities of plasma acetylcholinesterase (AChE) and
butyrylcholinesterase (BuChE) were also quantified. The results showed that the
enzymatic activity of the CPF intoxicated animals was significantly lower than the
control. In addition, CPF 10 group treated for 4 weeks presented a lower weight gain.
No differences were observed in the baseline values of DBP, SBP, MAP, HR and fR,
as well as in the HRV time-domain indices, either after 4 or 12 weeks of treatment. In
the spectral analysis an increase was only observed for the very low frequency band
(VLF). Animals treated with CPF presented an impairment of the baroreflex gain, for
ascending ramps, and of the baroreflex effectiveness index (BEI). The chemoreflex
bradycardic response was significantly reduced in the CPF treated rats for both
treatment periods when compared to the control groups. No difference among groups
was observed for the chemoreflex pressor response nor the tachypneic response for
the two treatment periods. On the other hand, CPF 10 group had an increase in VT,
for both treatment periods, and an increase in the VE, only after 1 month treatment.
Similar to what was previously demonstrated after acute exposure to CPF, low doses
chronic exposure also impairs cardiorespiratory function in rats. These results may
have important clinical implications for workers, such as farmers, who are frequently
exposed to these compounds.
Key words: chlorpyrifos, chemoreflex, baroreflex, HRV, butyrylcholinesterase,
acetylcholinesterase.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Histórico de Comercialização de Agrotóxicos no Brasil entre 2000 e 2016.
.................................................................................................................................. 21
Figura 2: Comercialização de agrotóxicos e afins por área plantada (kg/ha) e
incidência de intoxicações por agrotóxicos – Espírito Santo, 2007 a 2013. .............. 22
Figura 3: Estrutura geral dos organofosforados. ...................................................... 25
Figura 4: Relatório de vendas de Ingredientes Ativos no Brasil. .............................. 25
Figura 5: Estrutura do organofosforado clorpirifós. .................................................. 26
Figura 6: Esquema mostrando as vias de conexão após ativação do barorreflexo,
frente a um aumento de pressão arterial. .................................................................. 28
Figura 7: Esquema mostrando as vias de conexão da resposta cardiovascular após
ativação do quimiorreflexo frente a uma situação de hipóxia. ................................... 31
Figura 8: Esquema de administração para o tratamento de 4 semanas (superior) e
12 semanas (inferior). ............................................................................................... 39
Figura 9: Fluxograma das etapas de tratamento e ensaios biológicos adotados. .... 41
Figura 10: Cirurgia de canulação da artéria e veia femoral. ..................................... 43
Figura 11: Interface do algoritmo (CardioSeries versão 2.3) para análise da
variabilidade de frequência cardíaca (VFC) no domínio do tempo. ........................... 44
Figura 12: Interface do algoritmo (CardioSeries versão 2.3) na análise da
variabilidade de frequência cardíaca (VFC) no domínio da frequência. .................... 46
Figura 13: Interface do programa CardioSeries versão 2.3. Método de sequência
para análise do barorreflexo. ..................................................................................... 48
Figura 14: Câmara pletismográfica que permite o registro de frequência cardíaca. 49
Figura 15: Registro típico da resposta do quimiorreflexo após sua ativação com
cianeto de potássio (KCN). ....................................................................................... 50
Figura 16: Esquema ilustrativo mostrando o local do corte na região mais anterior do
tronco encefálico. ...................................................................................................... 53
Figura 17: Atividade da colinesterase plasmática (BuChE) e acetilcolinesterase
cerebral (AChE) no período de 4 e 12 semanas. ...................................................... 59
Figura 18: Ganho de peso corporal dos animais tratados por 4 e 12 semanas. ...... 61
Figura 19: Efeitos da exposição repetida ao clorpirifós sobre a variabilidade da
frequência cardíaca no domínio da frequência em ratos. .......................................... 65
Figura 20: Efeitos da exposição repetida ao clorpirifós sobre o barorreflexo de ratos.
.................................................................................................................................. 67
Figura 21: Variação de pressão arterial média e de frequência cardíaca após
ativação do quimiorreflexo dos animais tratados por 4 e 12 semanas. ..................... 70
Figura 22: Volumes respiratórios corrente e minuto e frequências respiratórias
basais médias dos animais tratados por 4 e 12 semanas ......................................... 72
Figura 23: Frequências respiratórias antes e durante a estimulação do
quimiorreflexo nos animais tratados por 4 semanas. ................................................ 74
LISTA DE TABELAS E FÓRMULAS
Tabela 1. Grupos de tratamento, doses empregadas e número de animais (N) por
grupo e períodos de tratamento. ............................................................................... 40
Tabela 2. Dados hemodinâmicos basais, de variabilidade da pressão arterial
sistólica e de intervalo de pulso no domínio do tempo dos diferentes grupos
estudados. ................................................................................................................. 63
Fórmula 1 ................................................................................................................. 52
Fórmula 2 ................................................................................................................. 54
Fórmula 3 ................................................................................................................. 56
LISTA DE ABREVIATURAS E/ OU SIGLAS
ACh – Acetilcolina;
AChE – Acetilcolinesterase;
Amb – núcleo ambíguo;
ANOVA – Análise de variância;
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária;
AT I – Angiotensina I;
AT II – Angiotensina II;
CEUA-UFES – Comissão de Ética em Experimentação Animal da UFES;
BEI – Índice de efetividade barorreflexa (Baroreflex Effectiveness Index);
BuChE – Butirilcolinesterase plasmática;
CPF – Clorpirifós;
CPF 7 – Clorpirifós na dose de 7 mg/kg;
CPF 10 – Clorpirifós na dose de 10 mg/kg;
CPO – Clorpirifós-oxon;
cpm – ciclos por minuto;
CVLM – Bulbo ventrolateral caudal;
DL10 – Dose Letal capaz de matar 10% de uma população;
DL50 – Dose Letal capaz de matar 50% de uma população;
DP – Desvio padrão;
DTNB – Ácido ditiobisnitrobenzóico;
ECA – Enzima Conversora de Angiotensina;
FC – Frequência cardíaca;
FFT – Transformada rápida de Fourier (Fast Fourier Transform);
fR – Frequência respiratória;
GEE – Equações de estimativa generalizadas (Generalized Estimating Equations);
HF – Alta frequência (High Frequency);
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis;
IML – Coluna intermediolateral;
i.p. – Intraperitoneal;
IP – Intervalo de pulso;
KCN – Cianeto de potássio;
LF – Baixa frequência (Low Frequency);
MTF – Metamidofós;
NaCl – Cloreto de Sódio;
NTS – Núcleo do trato solitário;
OF – Organofosforado;
PA – Pressão arterial;
PAD – Pressão arterial diastólica;
PAM – Pressão arterial média;
PAP – Pressão arterial pulsátil;
PAS – Pressão arterial sistólica;
PE – Polietileno;
pH – Potencial de hidrogênio;
PO2 – Pressão parcial de oxigênio;
PCO2 – Pressão parcial de dióxido de carbono;
RVLM – Bulbo ventrolateral rostral;
RMSSD – Desvio padrão da raiz quadrada da média do quadrado das diferenças de
intervalos sucessivos (root mean square of the successive interval differences);
SAL – Salina;
SINITOX - Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas;
SNA – Sistema Nervo autônomo;
SNC – Sistema Nervoso Central;
SRAA – Sistema Renina-Angiotensina Aldosterona;
VFC – Variabilidade de frequência cardíaca;
VHF – Muito alta frequência (Very High Frequency);
VLF – Muito baixa frequência (Very Low Frequency);
VE – Volume minuto;
VT – Volume corrente;
ΔA – Variação de absorbância.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 20
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 35
2.1 GERAL: ............................................................................................................................. 35
2.2 ESPECÍFICO: ..................................................................................................................... 35
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 37
3.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ............................................................................................... 37
3.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES .............................................................................................. 37
3.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL .......................................................................................... 37
3.4 ENSAIOS FUNCIONAIS ..................................................................................................... 42
3.4.1 Canulação da artéria e veia femoral ........................................................................ 42
3.4.2 Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca ............................................. 43
3.4.3.1 Domínio do tempo .............................................................................. 44
3.4.3.2 Domínio da frequência ........................................................................ 45
3.4.3.3 Barorreflexo espontâneo .................................................................... 46
3.4.5 Análise da frequência respiratória ........................................................................... 50
3.4.7 Dosagem enzimática ................................................................................................ 52
3.4.7.1 Determinação da atividade da colinesterase plasmática (BuChE) ..... 54
3.4.7.2 Determinação da atividade da colinesterase cerebral (AChE) ........... 55
3.5 ANÁLISE DOS DADOS ...................................................................................................... 56
4. RESULTADOS ...................................................................................................... 58
4.1 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE CEREBRAL (AChE) E PLASMÁTICA
(BuChE) .................................................................................................................................. 58
4.2 PESO MÉDIO E SOBREVIDA ............................................................................................. 60
4.3 DADOS HEMODINÂMICOS E VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA (VFC) NO
DOMÍNIO DO TEMPO ............................................................................................................ 62
4.4 ANÁLISE ESPECTRAL ........................................................................................................ 64
4.5 AVALIAÇÃO DO BARORREFLEXO ESPONTÂNEO ............................................................. 66
4.6 AVALIAÇÃO DO QUIMIORREFLEXO ................................................................................. 68
4.7 ANÁLISE DOS PARÂMETROS RESPIRATÓRIOS BASAIS .................................................... 71
4.8 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TAQUIPNEICA DO QUIMIORREFLEXO .................................. 73
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 76
6. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 89
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 91
ANEXO ................................................................................................................... 103
Introdução
20
1. INTRODUÇÃO
A partir da década de 50, novas tecnologias foram inseridas ao processo
tradicional de produção agrícola com o objetivo de controlar doenças e
aumentar a produtividade (BRASIL, 2016a).
Nesse contexto foram inseridos os agrotóxicos, que segundo a Lei Nº 7.802
de 11/07/1989, no seu artigo 2°, os define da seguinte forma:
Os produtos e os agentes de processos físicos, químicos ou
biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no
armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas
pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de
outros ecossistemas e também de ambientes urbanos, hídricos e
industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da
fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos
considerados nocivos; (BRASIL, 1989).
Nos últimos anos houve grande aumento no consumo de agrotóxicos no
mundo todo (PELAEZ, 2012). Esse aumento está associado não só ao cultivo
agrícola destinado a alimentação, mas principalmente ao cultivo para a
transformação de alimento em combustível (ex. cana, milho e soja) e em
commodities (ex. soja) (BOMBARDI, 2012).
O uso de agrotóxicos, particularmente no Brasil, é de extrema importância,
como pode ser observado na figura 1, onde nota-se um crescimento do
consumo entre os anos de 2000 a 2016. Neste período houve um salto de
pouco mais de 100 toneladas para mais de 500 toneladas de produtos tóxicos
consumidos pelo país (IBAMA, 2017). De fato, desde 2009 o país é
considerado o maior consumidor mundial de agrotóxicos (BOMBARDI, 2012).
21
Figura 1: Histórico de Comercialização de Agrotóxicos no Brasil entre 2000 e 2016.
Fonte: (IBAMA, 2017). Atualizado em 17/10/2017.
Entre os estados que mais comercializaram agrotóxicos no Brasil, o Espírito
Santo, cuja produção agrícola é baseada principalmente nas culturas de cana-
de-açúcar, café, tomate, banana e coco-da-baía, ocupou a posição 17ª em
2016. Na figura 2 podemos observar que, apesar de não haver grandes
variações na extensão da área plantada no período de 2007 à 2013, houve
um importante aumento de uso de agrotóxicos no Espírito Santo, seguido por
significativo aumento de incidência de intoxicação neste mesmo período
(BRASIL, 2016b). Ainda, em 2014, 5 municípios do Espírito Santo ficaram
entre os 50 municípios brasileiros com maior incidência de notificação de
intoxicações por agrotóxicos (BRASIL, 2018). Vale lembrar que o aumento da
incidência pode ser decorrente de processos de melhoria na detecção e
notificação de intoxicações por agrotóxico, mas fica claro que esses produtos
representam uma importante fonte de exposição a agentes tóxicos na
população, principalmente nos trabalhadores (BRASIL, 2016b, 2018).
22
Figura 2: Comercialização de agrotóxicos e afins por área plantada (kg/ha) e incidência de intoxicações por agrotóxicos – Espírito Santo, 2007 a 2013.
Fonte: Brasil (2016b)
Este maior consumo é preocupante, pois segue acompanhado de uma maior
exposição e risco de envenenamento, como observado em alguns estudos
(ARAÚJO et al., 2007; MACENTE, DOS SANTOS, & ZANDONADE, 2009;
MEW et al., 2017; RECENA, PIRES, & CALDAS, 2006). Dados do Sistema
Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX) apontam que, em
2016, os agrotóxicos de uso agrícola ocuparam o segundo lugar dentre os
casos registrados de intoxicação humana por exposição ocupacional e,
também o segundo lugar entre os casos de intoxicação por tentativa de
suicídio, ficando atrás, somente, de animais peçonhentos e medicamentos,
respectivamente (SINITOX, 2016). Em 2013, entre os estados da região
sudeste brasileira, o Espírito Santo teve a maior incidência de intoxicação por
agrotóxicos, apresentando 15,18 notificações por 100 mil habitantes, seguido
por Minas Gerais e São Paulo (BRASIL, 2016b).
Infelizmente o número de registros não coincide com o número real de
intoxicações. Faria e colaboradores (2007), em uma avaliação dos sistemas
23
oficiais de informação do país, observou que estes não desempenham a
vigilância de forma adequada, uma vez que os casos são registrados de
acordo com a facilidade de acesso aos serviços de saúde (FARIA; FASSA;
FACCHINI, 2007). Bochner (2007) chega a citar que essa subnotificação é da
ordem de 1 para 50, ou seja, 1 notificação para 50 casos não notificados
(BOCHNER, 2007).
Os efeitos decorrentes da exposição aos agrotóxicos, ou outro xenobiótico,
podem ser tanto de curto quanto de longo prazo, podendo se manifestar de
forma leve, moderada ou grave, dependendo de fatores como:
Via de exposição (oral, inalatória, dérmica, parenteral);
Duração da exposição;
Frequência da exposição (EATON; KLAASSEN, 2001).
Baseado nisso, de forma geral, classificam-se os tipos de intoxicação em:
Aguda – conjunto de sinais e sintomas que se apresenta de forma
súbita (minutos ou horas) após exposição a alta dose de um ou mais
toxicantes em até 24h, sendo mais fácil a identificação da causa e
efeito;
Subcrônica – sinais apresentados devido a exposição repetida a
quantidade moderada de produtos tóxicos ao longo de várias semanas
ou meses. Os sinais podem aparecer em dias ou semanas;
Crônica – alterações do estado de saúde causadas por repetidas
exposições a baixas doses de um ou mais toxicantes, que ocorrem
normalmente durante longos períodos de tempo (meses ou anos). Os
quadros clínicos são inespecíficos, tornando o diagnóstico e associação
causa/efeito mais difíceis (EATON; KLAASSEN, 2001; ECETOC, 1998).
Com base nesses dois tipos de intoxicação, os dados obtidos pelo SINITOX
correspondem em grande parte somente a casos agudos (BOCHNER, 2007),
uma vez que os sintomas da intoxicação crônica são mais inespecíficos, como
já mencionado (EATON; KLASSEN, 2001).
24
Os agrotóxicos podem ser classificados quanto ao alvo de ação em
inseticidas, fungicidas, herbicidas, entre outros (MOSTAFALOU; ABDOLLAHI,
2013; OPAS; OMS, 1997). Dentre os inseticidas destacamos a classe química
dos compostos organofosforados (OF), cujas propriedades tóxicas e
inseticidas foram descobertas em 1937 por Schrader, na Alemanha (KAZEMI
et al., 2012). Em toda parte do mundo esses compostos estão relacionados
com casos de intoxicação e morte (ALINEJAD et al., 2017; BUCKLEY et al.,
2011; EDDLESTON, 2000; JOHN et al., 2018; MEW et al., 2017;
RAZWIEDANI & RAUTENBACH, 2017).
Os OF são inseticidas tóxicos para os vertebrados, como mamíferos e peixes,
porém, por serem quimicamente instáveis, ou seja, não persistirem no meio
ambiente, foram escolhidos em substituição aos organoclorados, sendo
amplamente utilizados na agricultura (KING & AARON, 2015; MARRS, 1993).
Os OF, contudo, estão relacionados com casos de intoxicações, óbitos e
tentativas de suicídios (ARAÚJO et al., 2007; DELGADO & PAUMGARTTEN,
2004; MEW et al., 2017; RECENA et al., 2006). Aliado a alta incidência do uso
dessa classe em tentativas de suicídios (FREIRE & KOIFMAN, 2013; LYU et
al., 2018; SINITOX, 2016; WHO, 2014), a exposição pode ocorrer também
pelo consumo de alimentos contaminados (KATZ & WINTER, 2009; MELNYK
et al., 2016; WU et al., 2001) ou pela exposição ocupacional (DELGADO;
PAUMGARTTEN, 2004, MACENTE; SANTOS; ZANDONADE, 2009,
SINITOX, 2016, BOMBARDI, 2017).
Quimicamente, os OF são compostos orgânicos derivados do ácido fosfórico,
tiofosfórico ou ditiofosfórico. Exercem sua principal ação através do bloqueio
da hidrólise da acetilcolina (ACh) em ácido acético e colina, ao inibir a
atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) (ECOBICHON, 2001). A figura
abaixo apresenta a estrutura química geral dos OF:
25
Figura 3: Estrutura geral dos organofosforados.
.
Fonte: Marrs (1993).
Dentre os compostos representantes da classe dos OF, destaca-se o
clorpirifós (CPF), devido a sua alta incidência de utilização (IBAMA, 2017),
como pode ser verificado a seguir, onde o CPF figura entre os produtos mais
vendidos no Brasil em 2016:
Figura 4: Relatório de vendas de Ingredientes Ativos no Brasil.
Fonte: (IBAMA, 2017)
Entre as apresentações comerciais mais conhecidas do CPF (0,0-dietil-(3,5,6-
tricloro-2-piridinil)-fosforotioato) podemos citar: Lorsban 480BR®, Fersol 450
EC® e Vexter® (EMBRAPA, 2009). Seu principal metabólito é o clorpirifós-oxon
(CPO), obtido através da dessulfuração oxidativa do grupo P=S em P=O,
26
sendo esta reação catalisada por isoformas do citocromo P450 (RISHER;
NAVARRO, 1997). A figura abaixo apresenta a estrutura do CPF:
Figura 5: Estrutura do organofosforado clorpirifós.
Fonte: disponível em: https://pt.wikipedia.org/wiki/Clorpirif%C3%B3s
O CPF, assim como os demais OF, é um composto de ação
anticolinesterásica que interfere na transmissão do impulso nervoso nas
sinapses colinérgicas do sistema nervoso central (SNC), sistema nervoso
autônomo (SNA) e da junção neuromuscular. Sua ação anticolinesterásica é
exercida por meio de fosforilação da cadeia lateral (grupo hidroxil) do resíduo
de serina do sítio ativo da AChE. Essa ação resulta no acúmulo de ACh na
fenda sináptica causando uma hiperestimulação colinérgica, que, por sua vez,
pode causar paralisia respiratória de origem central ou periférica, levando a
morte (MARRS, 1993). Além da inibição da atividade da AChE, os compostos
OF, incluindo o CPF, inibem a atividade de outras esterases, incluindo a
colinesterase plasmática ou butirilcolinesterase (BuChE) (CUNHA et al., 2018;
DO NASCIMENTO et al., 2017; MARETTO et al., 2012), presente no plasma e
em outros tecidos como hepático, cardíaco e no sistema nervoso central
(BONO et al., 2015; CHOWDHARY; BHATTACHARYYA; BANERJEE, 2014).
De fato, a medida da atividade plasmática da BuChE frente à exposição a
compostos OF tem sido utilizada como um marcador da intoxicação por estes
compostos (CUNHA et al., 2018; DO NASCIMENTO et al., 2017; EATON et
al., 2008; EDDLESTON et al., 2008; MARETTO et al., 2012).
É bem sabido que o sistema colinérgico é o principal sistema de
neurotransmissão mediando a ativação ganglionar tanto do sistema simpático
quanto do sistema parassimpático (VERNINO et al., 2008).
27
Consequentemente, a resultante hiperestimulação colinérgica associada a
exposição a compostos OF promove marcantes alterações no sistema
autonômico, mudando várias funções fisiológicas, entre elas a função
cardiovascular (VERNINO et al., 2008). Dessa maneira, em quadros de
intoxicação por compostos OF pode-se observar hipertensão ou hipotensão,
taquicardia ou bradicardia, assim como alterações eletrocardiográficas
diversas (O’MALLEY, 1997).
A manutenção da pressão arterial (PA) em níveis adequados para garantir a
perfusão tecidual envolve mecanismos de regulação de curto e longo prazo. A
regulação autonômica tônica e reflexa é obtida por meio de vias neurais que
integram impulsos mecânicos e químicos de forma a modificar a atividade
simpática e parassimpática eferente para os órgãos alvo (SALMAN, 2016;
VASQUEZ et al., 1997). Dentre esses reflexos destaca-se o barorreflexo e o
quimiorreflexo.
O barorreflexo ajusta as alterações da PA momento a momento, por meio de
ajustes na atividade eferente simpática e parassimpática, produzindo
alterações reflexas na FC e resistência periférica total. As alterações da PA
são detectadas pelos barorreceptores - receptores mecânicos sensíveis à
elevação da pressão sanguínea, que estão localizados na camada adventícia
do arco aórtico e seio carotídeo. Eles enviam impulsos aferentes sensoriais
para o centro regulatório cardiovascular no tronco cerebral (GUYENET, 2006).
No tronco encefálico, os impulsos decorrentes dos barorreceptores carotídeos
e aórticos convergem no núcleo do trato solitário (NTS). De fato, Biaggioni e
colaboradores (1994) observaram que lesões do NTS extingue
completamente o barorreflexo em humanos, enquanto que Sato e
colaboradores (2001) constataram essa realidade em ratos (BIAGGIONI et al.,
1994; SATO et al., 2001). A estimulação do NTS envia sinal inibitório via
CVLM (bulbo ventrolateral caudal) para outras estruturas do tronco encefálico,
em particular o bulbo ventrolateral rostral (RVLM), resultando em redução na
atividade eferente simpática. O NTS envia, ainda, projeções estimulatórias
para o núcleo ambíguo (AMB). A partir do AMB os sinais são enviados através
de neurônios vagais para o coração (NOSAKA; YAMAMOTO; YASUNAGA,
28
1979). Desta forma, aumentos na PA estimulam a ativação aferente
barorreceptora, desencadeando a inibição da atividade simpática eferente
para o coração e vasculatura e ativação do fluxo parassimpático para o
coração. A pressão arterial, por sua vez, é restaurada para os níveis basais,
devido aos ajustes promovidos (SALMAN, 2016). Segue abaixo uma
ilustração esquemática das vias evocadas pelo barorreflexo.
Figura 6: Esquema mostrando as vias de conexão após ativação do
barorreflexo, frente a um aumento de pressão arterial.
NTS= núcleo do trato solitário, AMB= núcleo ambíguo, CVLM= bulbo ventrolateral caudal, RVLM= bulbo ventrolateral rostral, IML= coluna intermediolateral. Fonte: Dampney e colaboradores (2002), modificado por Salman (2016).
A avaliação da função barorreflexa tem sido feita tradicionalmente por meio da
administração de drogas vasoativas, que promovem mudanças abruptas na
PA e consequentemente evocam respostas reflexas mensuráveis na FC.
Alternativamente, tem sido utilizada avaliação de pequenas variações que
ocorrem naturalmente (LA ROVERE; PINNA; RACZAK, 2008), por meio de
técnicas computacionais que permitem aferir o barorreflexo em flutuações
espontâneas da PA e FC, detectadas em registros contínuos de pressão
arterial pulsátil (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA, 2001). De fato, Di
29
Rienzo e colaboradores (2001) demonstraram a natureza barorreflexa dessas
flutuações espontâneas ao observar que o número de sequências
concordantes de mudanças na PA e FC caiu significativamente após
desnervação sinoaórtica por remoção cirúrgica em gatos (DI RIENZO et al.,
2001).
Sendo assim, podemos inferir que o controle do sistema cardiovascular é
realizado, em grande parte, pelo SNA, através da modulação da resistência
vascular periférica e da FC, que são ajustadas para as necessidades de cada
momento.
Por conseguinte, depreende-se que alterações na FC, ou em outras palavras,
certo grau de variabilidade da FC (VFC), são normais e indicam a habilidade
do coração em responder aos estímulos fisiológicos e ambientais tais como
alterações posturais, exercício físico, respiração e mudanças hemodinâmicas
(ACHARYA et al., 2006). Dessa forma, a avaliação da VFC tem a capacidade
de inferir, entre outros parâmetros, a respeito do controle autonômico sobre a
função cardiovascular.
Existem vários métodos para avaliar a VFC. Um deles é análise da
variabilidade no “domínio do tempo”, onde os intervalos entre os pulsos
pressóricos ou as ondas elétricas do coração normais e sucessivos, são
determinados ao longo de um período de registro, produzindo índices
tradutores de flutuação. Outro método importante é a variabilidade no
“domínio da frequência”. Nesta, faz-se uma análise espectral do sinal de
registro, decomposto com auxílio de algoritmos matemáticos em diferentes
bandas de frequências de oscilação. Essas diferentes bandas representam
diferentes eventos que influenciam nessas variações, dentre elas, as divisões
do sistema nervoso autônomo (OLIVEIRA et al., 2012; TASK FORCE, 1996;
VANDERLEI et al., 2009).
Uma boa vantagem é que a VFC é uma medida não invasiva, e pode ser
utilizada para identificar fenômenos relacionados ao SNA em indivíduos
saudáveis, atletas e portadores de doenças (VANDERLEI et al., 2009). De
fato, Menezes e colaboradores (2004) ratificaram estudos da literatura médica
30
ao demonstrar que a VFC encontra-se diminuída em pacientes com
hipertensão arterial moderada quando comparados a indivíduos normotensos
(MENEZES; MOREIRA; DAHER, 2004). Outros trabalhos da literatura
confirmam que a análise da VFC é muito utilizada para examinar a função
autonômica cardiovascular (GRASSI et al., 1995; LOMBARDI, 2002).
Outro mecanismo importante de regulação da função cardiovascular é
representado pelo quimiorreflexo. Este reflexo é iniciado pela estimulação de
quimiorreceptores, células especializadas que respondem a alterações
químicas do sangue ou outros fluidos corpóreos. Os quimiorreceptores são
divididos em centrais e periféricos, sendo os primeiros localizados no bulbo
ventrolateral rostral, intermediário e caudal; enquanto as células periféricas se
localizam no arco aórtico e na bifurcação das carótidas (KARA, NARKIEWICZ
& SOMERS, 2003).
Esses receptores periféricos estão em contato constante com o sangue, e
detectam momento a momento alterações no pH, na pressão parcial de
dióxido de carbono (PCO2) e na pressão parcial de oxigênio (PO2) sanguíneo.
Quando estes receptores são ativados, encaminham sinais ao bulbo, onde
induzem mudanças nas vias simpática e parassimpática, modulando o
coração e vasos sanguíneos, bem como o nervo frênico, controlando a
atividade pulmonar (THOMAS, 2011).
Quando ocorre redução na PO2 e pH ou aumento da PCO2, os
quimiorreceptores são estimulados e emitem descargas aferentes e, de forma
reflexa, promovem:
Modulação na descarga do nervo frênico;
Aumento da frequência e amplitude respiratória;
Aumento da atividade simpática, induzindo vasoconstrição, aumento da
resistência periférica e aumento da pressão arterial (PA);
Aumento da descarga parassimpática cardíaca, que pode induzir
bradicardia (FRANCHINI; KRIEGER, 1993; THOMAS, 2011).
31
Deste modo, a resposta respiratória do quimiorreflexo ocorre, basicamente,
pela ativação de neurônios respiratórios localizados no bulbo, aumentando a
frequência de disparos do nervo frênico, levando ao aumento da frequência e
da amplitude do padrão respiratório. Portanto, em situações de hipóxia, esses
receptores são ativados para promover ajustes cardiorespiratórios, mantendo
órgãos vitais adequadamente perfundidos (KARA; NARKIEWICZ & SOMERS,
2003). A figura a seguir apresenta um esquema das vias de ativação deste
reflexo:
Figura 7: Esquema mostrando as vias de conexão da resposta cardiovascular após ativação do quimiorreflexo frente a uma situação de hipóxia.
NTS= núcleo do trato solitário, AMB= núcleo ambíguo, RVLM= bulbo ventrolateral rostral, IML= coluna intermediolateral. Fonte: Dampney e colaboradores (2002), modificado por Salman (2016).
Já é bem conhecida a forte relação entre os ajustes mediados pelos
quimiorreceptores periféricos e a hipertensão (SOMERS, MARK, & ABBOUD,
1988; TRZEBSKI et al., 1982). Fletcher e colaboradores (1992) demonstraram
que ratos expostos cronicamente a curtos períodos de hipóxia apresentaram
aumento da PA, não sendo o mesmo efeito observado em ratos submetidos à
32
desnervação do nervo do seio carotídeo (FLETCHER et al., 1992). Também
foi demonstrado que pacientes com apneia do sono apresentaram aumento
na resposta do quimiorreflexo periférico induzida por hipóxia (NARKIEWICZ et
al., 1998).
Apesar de evidências do nosso laboratório mostrarem prejuízo significativo na
resposta tanto do barorreflexo quanto do quimiorreflexo após exposição aguda
a doses subletais com os agentes OF CPF (CUNHA et al., 2018) e
metamidofós (MTF) (MARETTO et al., 2012), não há estudos que apliquem a
análise da VFC após exposição a longo prazo pelo CPF.
Recente revisão sobre cardiotoxicidade e pesticidas, mostrou que inibidores
da colinesterase, como o CPF, são os principais envolvidos com
cardiotoxicidade em testes em animais e em relatos de intoxicação humana.
Em sua maioria, esse efeito foi observado após exposição subcrônica e
crônica (GEORGIADIS et al., 2018), o que ressalta a importância de estudos
de função cardíaca frente a exposição prolongada e esses compostos.
De fato, estudos de Calore e colaboradores (2007) mostraram que animais
expostos por 3 meses ao composto OF MTF apresentaram hipertrofia
cardíaca (CALORE; PEREZ; HERMAN, 2007). Outros autores mostraram que
exposição ao CPF por 3 meses causou prejuízo das propriedades mecânicas
de vasos em ratos (GUVENC TUNA et al., 2011). Ainda, Zafiropoulos e
colaboradores (2014) fizeram um estudo onde observaram toxicidade cardíaca
e aumento do estresse oxidativo em coelhos após exposição a baixas doses
de CPF e outros dois OF por períodos de 1 e 3 meses (ZAFIROPOULOS et
al., 2014). Aliado a isso, há evidências de que a exposição subcrônica e
crônica a OF induz estresse oxidativo, além de alterações histológicas de
fibras musculares cardíacas em ratas (ABDOU; EL MAZOUDY, 2010). Outros
estudos também mostraram alterações no metabolismo lipídico (ZAKI, 2012) e
danos na parede vascular em ratos intoxicados de forma repetida (YAVUZ et
al., 2005). Todavia, grande parte dos estudos experimentais que avaliam
exposições subcrônica e crônica (ABDOU; EL MAZOUDY, 2010; BAŞ;
KALENDER, 2011; GUVENC TUNA et al., 2011; KALENDER et al., 2012;
YAVUZ et al., 2005; ZAFIROPOULOS et al., 2014), usam modelos de
33
exposição contínua, o que difere do padrão de exposição humana. A
frequência de exposição de trabalhadores pode variar em função do tipo de
cultura, onde o pesticida é aplicado, e em função do intervalo de reentrada
nas lavouras que é preconizado pelas indústrias fornecedoras (ADAPAR,
2017; BAYER S.A., 2018). Portanto torna-se importante avaliar se diferentes
padrões de exposição intermitente, ou seja, exposição intervalada, podem
produzir alterações diferenciadas sobre a função cardiovascular.
Deste modo, visto que foi demonstrado por estudos anteriores do nosso
laboratório que os reflexos cardiorrespiratórios são prejudicados após
exposição a CPF, e que a literatura mostra evidências que apontam para um
dano cardiovascular frente a exposição subcrônica e crônica a compostos OF,
a hipótese do presente estudo é que uma exposição intermitente crônica ao
OF CPF também pode promover danos a estes reflexos.
34
Objetivo
35
2. OBJETIVOS
2.1 GERAL:
Avaliar o efeito da exposição intermitente crônica ao inseticida clorpirifós
(CPF) sobre a modulação dos reflexos autonômicos em ratos.
2.2 ESPECÍFICO:
Avaliar o efeito do tratamento intermitente crônico com doses subletais
de CPF sobre:
o Os níveis basais de pressão arterial e frequência cardíaca de ratos
expostos;
o As respostas cardiorespiratórias do quimiorreflexo nos animais
experimentais;
o A sensibilidade barorreflexa espontânea;
o A variabilidade de frequência cardíaca no domínio do tempo;
o A variabilidade de frequência cardíaca no domínio da frequência;
o A atividade da enzima colinesterase plasmática (BuChE);
o A atividade da acetilcolinesterase (AChE) no tronco encefálico de
ratos frente a diferentes esquemas de exposição.
36
Métodos
37
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos, com peso entre 200-300 gramas,
fornecidos pelo Biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Espírito Santo (UFES). Esses animais foram acondicionados em
número máximo de 5 por gaiola de polipropileno, em um ambiente com
temperatura controlada de 25ºC, com acesso livre à água e comida e ciclo
claro/escuro de 12 horas.
Foram utilizados 71 animais divididos em dois períodos de tratamentos
conforme descrito no protocolo experimental (vide item 3.3). Todos os ensaios
biológicos obedeceram às normas de proteção aos animais e os protocolos
experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito
Santo, estando registrados sob o número 36/2016.
3.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES
As soluções foram obtidas por meio de diluição em solução fisiológica 0,9%,
da forma comercial do Clorpirifós (CPF) – Lorsban 480 BR®, 48% m/v, Dow
Agrosciences Industrial Ltda. As soluções utilizadas no tratamento foram
preparadas e utilizadas no mesmo dia e os animais do grupo controle foram
tratados apenas com solução fisiológica 0,9%.
3.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Considerando que a exposição aos pesticidas em trabalhadores pode ocorrer
em diferentes ciclos dependendo da estação, número de aplicações e tipo de
lavoura (Dow-AgroSciences, 2016; Jørs et al., 2006; Muniz et al., 2008;
Roldán-Tapia et al., 2005; Surajudeen et al., 2014), nós propusemos um
38
desenho de exposição intermitente em dois intervalos de tempo, mas com o
mesmo número de doses no total. Os animais foram submetidos a injeções
intraperitoneais (i.p.) de salina (SAL; NaCl 0,9%) ou clorpirifós (CPF) nas
doses de 7 mg/kg (CPF 7) e dose de 10 mg/kg (CPF 10), por dois períodos
distintos de tratamento: 4 e 12 semanas. No grupo tratado por 4 semanas
(N=32), os animais receberam injeções três vezes por semana, em dias
alternados, sendo distribuídos aleatoriamente, em grupo controle (SAL; N=9) e
grupos intoxicados conforme as doses de CPF empregadas (CPF 7, N=14 e
CPF 10, N=9). No segundo período de tratamento (N=39), os animais
receberam injeções intraperitoneais de salina (SAL, N=13) ou CPF (CPF 7,
N=14 e CPF 10, N=12), uma vez por semana por um período de 12 semanas.
Pela adoção do mesmo número de injeções (12 no total), dentro de dois
intervalos diferentes, nós pudemos testar se intervalos mais curtos ou mais
longos entre as exposições diferencialmente impactam a função
cardiorrespiratória. A figura abaixo resume o esquema de administrações
adotado em cada tratamento.
39
Figura 8: Esquema de administração para o tratamento de 4 semanas (superior) e 12 semanas (inferior).
A dose de 10 m/kg de CPF adotada, corresponde a 1/3 da dose de 30 mg/kg
que induziu prejuízo cardiovascular em ratos tratados agudamente (CUNHA et
al., 2018). A dose de 7 mg/kg corresponde a 2/3 da dose de 10 mg/kg. Os
pesos dos animais foram verificados e anotados antes de cada tratamento,
para o correto cálculo da dose a ser administrada em cada animal e
acompanhamento do ganho de peso dos mesmos. Além disso, também foi
acompanhado a sobrevida frente ao tratamento tóxico aplicado. O N final de
cada grupo é apresentado na Tabela 1.
SAL
CPF 7 mg/kg
CPF 10 mg/kg
SAL
CPF 7 mg/kg
CPF 10 mg/kg
Semanas
Semanas
1 2 3 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
40
Tabela 1. Grupos de tratamento, doses empregadas e número de animais (N) por grupo e períodos de tratamento.
Tratamento Dose N=32
4 semanas
N=39
12 semanas
CPF 7 7 mg/kg 14 14
CPF 10 10 mg/kg 9 12
SAL 0 mg/kg 9 13
Clorpirifós (CPF), salina (SAL)
Três dias após o último dia de tratamento de 4 ou 12 semanas, os animais
foram submetidos aos ensaios biológicos propostos neste estudo. A escolha
deste intervalo de avaliação pós tratamento teve o intuito de diferenciar
potenciais efeitos observados frente a este modelo de intoxicação
intermitente, de uma intoxicação aguda induzida pela última dose
administrada. Em estudos anteriores quantificamos, no sangue de animais
intoxicados, os valores de CPF num intervalo de 15 minutos até 24 horas após
a administração (MARQUES et al., 2018). Foi demonstrado que 24 horas após
o procedimento de intoxicação, a concentração de CPF no sangue estava
próxima de zero. Desta forma, com a escolha de um intervalo de três dias
para o início das avaliações, procuramos certificar que concentrações
sanguíneas do ingrediente ativo eram praticamente inexistentes, diferindo
assim de um modelo de intoxicação aguda. A figura 9 apresenta um
fluxograma das etapas de tratamento e dos ensaios biológicos seguidos.
41
Figura 9: Fluxograma das etapas de tratamento e ensaios biológicos adotados.
SAL (salina), CPF 7 (clorpirifós de 7 mg/kg), CPF 10 (clorpirifós de 10 mg/kg), PA (pressão arterial), FC (frequência cardíaca), fR (frequência respiratória), VT (volume corrente) e VE
(volume minuto).
Grupo Experimental
N total = 71 animais
4 semanas
N = 32
3x/semana
SAL
N = 9
CPF 7
N = 14
CPF 10
N = 9
12 semanas
N = 39
1x/semana
SAL
N = 13
CPF 7
N = 14
CPF 10
N = 12
Canulação
Registros Basais de
PA, FC, fR
Análise de
fR, VT e VE
Análise da variabilidade de
frequência cardíaca
Análise do barorreflexo espontâneo
Ativação Quimiorreflexa
Análise do quimiorreflexo
Coleta de amostras de
sangue e bulbo
Determinação da BChE
(plasmática)
Determinação da AChE (cerebral)
Após 72h
Após 24h
42
3.4 ENSAIOS FUNCIONAIS
Para realização dos ensaios fisiológicos cardiovasculares, os ratos foram
cateterizados para permitir os registros de pressão arterial pulsátil (PAP). Este
procedimento cirúrgico foi realizado nos animais previamente anestesiados
com tribromoetanol (250 mg/kg).
3.4.1 Canulação da artéria e veia femoral
A cirurgia para a inserção da cânula foi realizada 3 dias após o final do
tratamento de 4 semanas e 12 semanas. Foram canuladas a artéria e a veia
femoral: a cânula arterial permitiu o registro dos parâmetros cardiovasculares
citados, enquanto que a cânula introduzida na veia femoral permitiu a
administração intravenosa de drogas para a ativação do quimiorreflexo.
As cânulas utilizadas nesta etapa do estudo foram confeccionadas a partir de
frações de tubo de polietileno PE-10 (aproximadamente 5 cm) inseridas e
soldadas a frações de tubo de polietileno PE-50 (aproximadamente 18 cm). As
cânulas foram previamente preenchidas com solução fisiológica e obstruídas
em uma extremidade com pinos de metal. Os animais foram previamente
anestesiados com tribromoetanol (250 mg/kg) e transferidos para a mesa
cirúrgica. Após uma pequena incisão inguinal esquerda (cerca de 1 cm de
diâmetro), nos animais já anestesiados, foi visualizado o feixe vásculo nervoso
femoral e em seguida, foi feito o isolamento do nervo e vasos e as cânulas
inseridas na veia e na artéria femoral.
Por fim, as cânulas já inseridas e fixadas na região inguinal foram dirigidas
subcutaneamente com o auxílio de um trocáter para a região mediocervical
posterior, onde foram exteriorizadas e fixadas com uma linha de sutura. A
parte exteriorizada das cânulas teve o seu tamanho regulado, para que o
animal não conseguisse alcançar e danificar. Após a canulação, os animais
foram mantidos em gaiolas individuais, para recuperação, com acesso livre à
água e ração até o final dos experimentos.
43
Figura 10: Cirurgia de canulação da artéria e veia femoral.
3.4.2 Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca
Após 24 horas do procedimento cirúrgico, foram realizados os registros dos
parâmetros cardiovasculares no animal acordado. Para os registros dos
parâmetros cardiovasculares, o cateter arterial foi conectado a um transdutor
de pressão acoplado a um amplificador e a um sistema de registro
computadorizado, capaz de registrar a pressão arterial pulsátil do animal
(PAP) (Powerlab®, AD Instruments, Nova Zelândia). A partir desta, os valores
de pressão diastólica (PAD), pressão sistólica (PAS) e pressão arterial média
(PAM) e frequência cardíaca (FC) foram derivados pelo software do sistema
(LabChart®, ADInstruments, Nova Zelândia).
3.4.3 Variabilidade da frequência cardíaca
Os métodos a seguir foram realizados conforme descrito anteriormente por
Oliveira e colaboradores (2012) e reproduzidos por Simões e colaboradores
(2017) (OLIVEIRA et al., 2012; SIMÕES et al., 2017).
44
3.4.3.1 Domínio do tempo
Gravações de 10 minutos foram realizadas para a análise da variabilidade da
pressão arterial sistólica (PAS) e intervalo de pulso (IP), usando o parâmetro
do domínio do tempo. O programa computacional CardioSeries (versão 2.3-
http: http://www.danielpenteado.com) foi utilizado para realizar os cálculos. As
sequências dos registros obtidos eram inspecionadas visualmente, por um
indivíduo cego ao tratamento, para detecção de artefatos que pudessem
interferir na análise dos resultados. Caso o registro obtido contivesse um
grande número de artefatos, o animal era excluído da análise dos parâmetros
de variabilidade. Como índices do domínio do tempo, foram calculados para
PAS e IP: a variância, desvio padrão e a raiz quadrada da média do quadrado
das diferenças de intervalos sucessivos (RMSSD). O RMSSD é uma
importante medida, uma vez que pode estimar a atividade regulatória vagal na
FC (OLIVEIRA et al., 2012). Abaixo segue uma figura ilustrando a interface
desse programa.
Figura 11: Interface do algoritmo (CardioSeries versão 2.3) para análise da variabilidade de frequência cardíaca (VFC) no domínio do tempo.
Fonte: Disponível em: http://www.danielpenteado.com/cardioseries. Figura com modificações.
45
3.4.3.2 Domínio da frequência
Para a análise do domínio da frequência, utilizou-se das mesmas gravações
citadas no item anterior e séries de batimentos momento a momento foram
convertidas em pontos de dados usando uma taxa de interpolação de 10 Hz e
meia sobreposição para conjuntos de dados sequenciais contendo 512 pontos
por sequência. Segmentos não estacionários ou aberrantes foram
identificados visualmente e foram excluídos do cálculo da análise espectral. O
espectro foi calculado usando um algoritmo de Transformada rápida de
Fourier (FFT) direto e foi integrado nos componentes de frequência muito
baixa 0–0,2 Hz (VLF, Very Low Frequency: representando a influência dos
sistemas vasomotor e renina-angiotensina periféricos); de baixa frequência
0,2–0,75 Hz (LF, Low Frequency: correspondente a simpático e
parassimpático); e de alta frequência 0,75 a 0,3 Hz (HF, High Frequency:
corresponde à entrada vagal) (SIMÕES et al., 2017; VANDERLEI et al., 2009).
Os resultados são apresentados em potências absolutas e normalizadas para
bandas de estudo. Quando a análise incluiu unidades normalizadas, o VLF foi
excluído e a razão LF/HF também foi calculada, caracterizando o equilíbrio
simpatovagal. A figura a seguir ilustra a interface do programa CardioSeries
para a análise do domínio da frequência.
46
Figura 12: Interface do algoritmo (CardioSeries versão 2.3) na análise da
variabilidade de frequência cardíaca (VFC) no domínio da frequência.
Fonte: Disponível em: http://www.danielpenteado.com/cardioseries. Figura com modificações.
3.4.3.3 Barorreflexo espontâneo
O barorreflexo espontâneo foi avaliado usando o método de sequência no
domínio do tempo. Essa técnica busca identificar sequências de batimentos
consecutivos nos quais aumentos progressivos da pressão sistólica são
seguidos, com até três batimentos de atraso, por aumentos progressivos do
intervalo de pulso (IP) ou vice-versa: ou diminuições progressivas de pressão
sistólica são seguidas por diminuições progressivas de IP (CAMPAGNOLE-
SANTOS; HAIBARA, 2001). A partir disso, é calculada a inclinação dessas
regressões lineares formadas pelas rampas, o que reflete o ganho
barorreflexo espontaneo.
O método de sequência fornece ainda o índice de efetividade barorreflexa
(BEI, de Baroreflex effectiveness index), que confirma se realmente foi
produzida uma resposta reflexa pelo barorreflexo. O cálculo é feito através da
razão entre o número de sequências baroreflexas divididas pelo número total
de rampas de PA (BERTINIERI et al., 1985; DI RIENZO et al., 2001). O BEI e
47
o ganho são índices complementares de função barorreflexa espontânea (DI
RIENZO et al., 2001).
Neste trabalho foi seguido o método descrito por Fazan e colaboradores
(2011) e reproduzida por Simões e colaboradores (2017). Desse modo foram
utilizados gravações hemodinâmicas e o software CardioSeries (versão 2.3-
http: //sites.google.com/site/cardioseries) para realizar os cálculos. As
sequências barorreflexas foram definidas como as rampas detectadas de pelo
menos quatro pulsos arteriais, quando as modificações da PAS foram
diretamente correlacionadas com mudanças de IP e apresentaram coeficiente
de correlação linear <0,8. Para a sensibilidade ou ganho de barorreflexo
espontâneo foi considerado a inclinação da regressão linear calculada para
rampas de subida e descida. Finalmente, para cada período selecionado para
análise foi calculado BEI – razão entre o número total de sequências
barorreflexas detectadas e o número total de rampas de PAS encontradas.
Quanto menor o BEI, menor o número de rampas de PAS que são seguidas
de alterações do IP, ou seja, menor eficácia do barorreflexo (FAZAN et al.,
2011; SIMÕES et al., 2017).
A figura a seguir apresenta a interface do programa computacional
CardioSeries versão 2.3 (http://www.danielpenteado.com) para a análise do
barorreflexo espontâneo.
48
Figura 13: Interface do programa CardioSeries versão 2.3. Método de sequência para análise do barorreflexo.
Fonte: Disponível em: http://www.danielpenteado.com/cardioseries. Figura com modificações.
3.4.4 Avaliação do quimiorreflexo
A avaliação do quimiorreflexo foi realizada a partir da administração
intravenosa de solução aquosa de cianeto de potássio (KCN), segundo o
método descrito por FRANCHINI & KRIEGER (1993). Nesse estudo foram
registradas as respostas hipertensoras, bradicárdicas e taquipnêica
promovidas por meio da ativação dos quimiorreceptores periféricos. Para
avaliação do componente respiratório foi utilizada uma câmara pletismográfica
através do método barométrico de medição (BARROS et al. 2002, MORTOLA;
FRAPPELL, 1998, 2013). Foram avaliados os dados de frequência
respiratória, volume corrente (VT) e volume minuto (VE). A câmara
pletismográfica foi acoplada a um espirômetro (ML141 Spirometer, PowerLab,
AD Instruments, Bella Vista, NSW, Australia), sendo o registro feito através do
software do sistema (LabChart®, AD Instruments, Bella Vista, NSW, Australia).
49
Figura 14: Câmara pletismográfica que permite o registro de frequência
cardíaca.
Foram administradas as doses de 10, 20, 40 e 80 µg em cada rato, de forma
aleatória, aguardando-se a estabilização dos parâmetros medidos em
intervalo mínimo de 10 minutos entre as doses. A ativação deste reflexo foi
avaliada a partir das respostas registradas após a administração do KCN:
diminuição da frequência cardíaca, aumento da pressão média arterial e
aumento da frequência respiratória.
50
Figura 15: Registro típico da resposta do quimiorreflexo após sua ativação com cianeto de potássio (KCN).
PAP – pressão arterial pulsátil; PAM – pressãoarterial média; FC – frequência cardíaca.
3.4.5 Análise da frequência respiratória
A frequência respiratória (fR – número de ciclos respiratórios em um minuto)
(CARVALHO, JUNIOR, & FRANCA, 2007; MORTOLA & FRAPPELL, 2013) foi
calculada manualmente. Após a administração de KCN ocorreu a resposta
comportamental de exploração devido a hipóxia-citotóxica, onde foi observado
a movimentação do animal. As oscilações de pressão produzidas pela
respiração do animal dentro da câmara foram registradas nos intervalos de 20
segundos antes e 20 segundos após a injeção intravenosa de KCN. A
quantificação da fR foi realizada a cada intervalo de 2 segundos, na qual o
número de ciclos obtidos foi multiplicado por 30 para expressar o número de
51
ciclos por minuto (cpm). Esses valores foram colocados em um gráfico da fR
(cpm) em função do tempo (segundos) (CRESTANI et al., 2009; RAISMAN,
COWAN, & POWELL, 1966).
3.4.6 Análise do volume corrente e do volume minuto nos animais
Os valores basais de volume corrente (VT – volume de ar inspirado em cada
movimento respiratório), e volume minuto (VE – volume de ar trocado por
minuto) (CARVALHO; JUNIOR; FRANCA, 2007; MORTOLA; FRAPPELL,
2013), foram calculados antes das microinjeções de drogas levando-se em
consideração os registros correspondentes ao intervalo de 20 segundos antes
da administração de KCN no período controle. Estes cálculos foram efetuados
a partir da fórmula (1). Somente a fR foi avaliada após a ativação do
quimiorreflexo, pois a resposta comportamental de exploração induzida pelo
KCN leva ao aumento da linha de base do sinal respiratório, prejudicando a
análise do VT e VE.
Para a obtenção de uma análise confiável dos parâmetros respiratórios, o
animal deve permanecer em estado de repouso. A movimentação do animal
interfere na captação e análise dos ciclos respiratórios, sendo esse um fator
limitante da técnica. Portanto, os animais foram previamente ambientados ao
sistema durante pelo menos 30 minutos antes do início dos experimentos e
somente aqueles que se apresentaram em repouso foram submetidos à
experimentação.
52
Fórmula 1:
VT = PT x Vk x Tc (PB - PA)
Pk
Tc (PB - PA) - TA (PB - PC)
VE = VT x fR
VT: Volume corrente VK Volume de ar injetado para calibração PT: Deflexão de pressão associada com cada volume de ar corrente PK: Deflexão de pressão associada com o volume injetado para
calibração TC: Temperatura corporal TA: Temperatura do ar dentro da câmara do animal PB: Pressão barométrica PC: Pressão de vapor de água à temperatura corporal PA: Pressão de vapor de água à temperatura da câmara do animal VE Volume minuto
3.4.7 Dosagem enzimática
Foram avaliadas neste estudo a atividade das enzimas butirilcolinesterase
(BuChE), no plasma e acetilcolinesterase (AChE), na região do tronco
encefálico. As amostras de sangue e tronco encefálico foram coletadas após
decapitação do animal. O procedimento de decapitação foi realizado sem o
uso de anestésicos, uma vez que evidências sugerem interferência destas
substâncias sobre a atividade da AChE (GOMEZ, GOMEZ, & PRADO, 2000;
PASTUSZKO, 1980; SILVA et al., 2005; VALADÃO et al., 2013; VAN RIJN et
al., 2011). A coleta de sangue foi feita em eppendorf heparinizado após o
tratamento. O plasma foi obtido por centrifugação das amostras de sangue a
7.200 G por 10 minutos a 4°C utilizando uma centrífuga (Universal 320R –
Hettich; Tuttlingen, Alemanha) e armazenado até o momento da dosagem, em
temperatura -80°C. O método utilizado seguiu as etapas indicadas no kit de
determinação da enzima (vide descrição no item 3.4.7.1).
Como dito anteriormente, o tronco encefálico foi obtido através da decapitação
dos animais utilizando guilhotina (EB-271® Insight - Insight Ltda., Ribeirão
Preto, SP). Num prazo entre 2-5 minutos o tronco encefálico foi isolado,
acondicionado em eppendorf (previamente pesado) e pesado em balança
53
analítica (Celtac modelo FA2104N - TDS Instrumental Tecnologia Ltda.
Tijucas Do Sul, PR). Após o isolamento, o tronco encefálico foi armazenado
em temperatura de -80°C até o momento da dosagem. Todo procedimento de
retirada e isolamento do tronco encefálico foi realizado em gelo e com
lavagens esporádicas de solução salina gelada.
Após a decapitação do animal o SNC foi removido da caixa craniana e
colocado sobre uma placa de petri com papel de filtro. O tronco encefálico foi
obtido através de um corte transversal na região da primeira cervical e outro
no final da ponte segundo o atlas de Paxinos e Watson (2009). O cerebelo foi
delicadamente removido com a pinça através da desconexão dos pedúnculos
cerebelares e deslocamento horizontal. Após esse procedimento foi permitido
à visualização do início do aqueduto de Sylvius e da matéria cinzenta
periaquedutal. Com a identificação dessas regiões anatômicas uma leve
elevação no sentindo frontal com a pinça foi feita no mesencéfalo permitindo
que um corte transversal pegasse estruturas de projeções mais anteriores da
ponte (figura 13), objetivando a inclusão dos núcleos parabraquial, Kölliker-
Fuse e locus coeruleus que apresentam funções sobre o sistema respiratório
(SPYER; GOURINE, 2009).
Figura 16: Esquema ilustrativo mostrando o local do corte na região mais anterior do tronco encefálico.
As setas indicam a direção em que ocorrerá a elevação no mesencéfalo para que seja feito o corte; Linha em preto indica o caminho feito pelo corte transversal. Fonte: Google (imagens: rat brain atlas).
54
3.4.7.1 Determinação da atividade da colinesterase plasmática (BuChE)
A atividade colinesterásica foi mensurada de acordo com o método
colorimétrico descrito por Dietz, Rubinstein & Lubrano (1973) com
modificações, utilizando o kit para determinação de colinesterase da marca
Bioclin (Colinesterase – K094® Quibasa química básica LTDA., Minas Gerais,
Brasil) no analisador bioquímico semi-automático (Bio Plus®, BIO-2000 IL,
Brasil). A inibição na atividade dessa enzima, juntamente com a quantificação
da atividade da AChE cerebral, permitiu a avaliação da eficácia do tratamento
com os inseticidas organofosforados.
O princípio de ação desta técnica consiste na ação catalítica da colinesterase
sobre a butiriltiocolina, a qual é hidrolisada em tiocolina e butirato. Em
seguida, a tiocolina reduz o hexacianoferrato (III), de cor amarela, em
hexacianoferrato (II), que é incolor. O decréscimo da absorbância foi medido a
405 nm. No teste, foram adicionados a um tubo de ensaio: 10 µL da amostra,
500 µL do reagente 1 (tampão reagente: pirofosfato pH 7,60 e
hexacianoferrato (III) de potássio), 250 µL do reagente 2 (substrato:
butiriltiocolina) e, imediatamente, foi realizada a leitura colorimétrica no
analisador bioquímico semi-automático termostatizado (37° C) em 405 nm.
Em outro tubo – reagente branco – foram adicionados 10 µL de água
destilada, 500 µL de reagente 1, 250 µL do reagente 2 e também realizado a
leitura. As dosagens foram feitas em duplicata e a atividade foi expressa em
U/L (um U de colinesterase corresponde à quantidade de enzima que hidrolisa
1 µmol de substrato/minuto/mL de soro, a 37°C) e calculada a partir da
fórmula (2), disponível nas descrições do kit utilizado:
Fórmula 2:
ΔA / min = [ ΔA / min da amostra ] – [ ΔA / min do branco ]
Atividade (U/L) = ΔA / min x 68500
55
3.4.7.2 Determinação da atividade da colinesterase cerebral (AChE)
A atividade da AChE foi mensurada de acordo com o método colorimétrico
descrito por Ellman e colaboradores (1961) e modificado por Lassiter e
colaboradores (2003). A amostra do tronco cerebral do animal, previamente
pesada, foi homogeneizada em tampão fosfato (pH= 8,0; 0,1M) e 1% de Triton
(Triton X-100) (v/v) na proporção de 20 mg de tecido para cada 1 mL de
tampão. A homogeinização foi feita em um macerador de tecido Potter-
Elvehjem e pistilo de teflon durante um tempo total de 6 minutos, sendo feita
em períodos de 30 segundos com intervalos de 10 segundos para o descanso
da amostra. Após a homogeinização a amostra foi transferida para um tubo
falcon 15 mL e centrifugado (Centrifuge 5804R – Eppendorf AG. Hamburgo,
Alemanha) com refrigeração 4°C durante 5 minutos a 7.800G e, por fim, o
sobrenadante transferido para um eppendorf. Todo o procedimento foi
executado e armazenado em gelo.
Uma alíquota de 135 µL desse homogenato foi adicionada em uma cubeta
contendo 820 µL de tampão (pH= 8,0) e 35 µL de DTNB. O reagente ácido
Ditiobisnitrobenzóico (DTNB) 0,01M foi preparado no dia do experimento; 1,9
mg do ácido foi dissolvido em 100 µL de NaOH 0,1 M qsp de água para 1 mL,
seguido de agitação em vórtex. A amostra com os reagentes na cubeta foram
incubados durante 10 minutos em temperatura ambiente na bancada e em
seguida adicionado o 10 µL do substrato. O iodato de acetiltiocolina 0,075 M
(21,67 mg/mL) foi o substrato. O princípio de ação desta técnica consistiu na
ação catalítica da AChE sobre a acetiltiocolina, a qual é hidrolisada em
tiocolina e acetato. A tiocolina reage com o DTNB em uma reação de
substituição nucleofílica liberando o ânion de cor amarelo ácido 5-tio-2-nitro-
benzóico. A análise foi feita pelo método cinético e lida no comprimento de
onda de 412 nm em espectrofotômetro (Epoch 2 Microplate
Spectrophotometer – BioTek, Winooski, VT, EUA). A atividade da enzima foi
calculada de acordo com a fórmula (3).
56
Fórmula 3:
U = [ ΔA / 13600 ] . [ 135 / 1000 ] . X
U = É igual ao número de mols da acetiltiocolina hidrolisado por hora por
miligrama de proteína.
ΔA = Mudança na absorbância por minuto.
13600 = É o coeficiente de extinção do ânion amarelo
135 = É o volume da amostra
1000 = É o volume total da reação
X = É a quantidade de tecido (mg)
3.5 ANÁLISE DOS DADOS
Os resultados foram analisados com o software GraphPad Prism versão 5.00
para Windows (GraphPad Software®, San Diego California USA). Os gráficos
foram construídos utilizando o software GraphPad Prism versão 5.00 para
Windows (GraphPad Software®, San Diego California USA). O nível de
significância foi fixado em p<0,05 e os dados apresentados como média ± erro
padrão da média (EPM). Os métodos de análise empregados são descritos
nos itens a seguir:
O teste estatístico ANOVA de duas vias para medidas repetidas com
ajustes de Bonferroni foi empregado nas análises de PAM, FC e
resposta taquipneica frente a ativação quimiorreflexa. Esse teste
também foi utilizado para a análise do peso médio;
A ANOVA de uma via foi utilizada para análise da atividade das
enzimas AChE e BuChE e para os Parâmetros Basais de PAD, PAS,
PAM, FC, fR média basal, VT, VE, VFC no domínio do tempo, VFC no
domínio da frequência e barorreflexo espontâneo, todos seguidos pelo
teste Post-Hoc de Bonferroni ou Tukey, quando apropriado.
57
Resultados
58
4. RESULTADOS
4.1 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE CEREBRAL (AChE) E PLASMÁTICA (BuChE)
A figura 17 ilustra a atividade da enzima butirilcolinesterase (BuChE) e
acetilcolinesterase (AChE) nos grupos avaliados.
A atividade da BuChE foi alterada pelo tratamento de 4 semanas (F(2,20) =
5,849; P = 0,01) e 12 semanas (F(2,24) = 7,583; P = 0,003).
Os animais intoxicados com CPF por 4 semanas (painel A), apresentaram
uma menor atividade da enzima tanto para a dose de CPF de 7 mg/kg (CPF 7,
P < 0,05), quanto de 10 mg/kg (CPF 10, P < 0,05) em relação ao grupo
controle (SAL). O mesmo foi observado com os animais intoxicados por 12
semanas (painel C), onde as doses de 7 mg/kg (CPF 7, P < 0,01) e 10 mg/kg
(CPF 10, P < 0,05) apresentaram uma menor atividade em relação ao grupo
controle.
Resultados semelhantes foram encontrados para a atividade da
acetilcolinesterase (AChE) no tronco encefálico, sendo observadas diferenças
entre os grupos, tanto para animais tratados por 4 semanas (F(2,15) = 8,935; P
= 0,003) quanto por 12 semanas (F(2,36) = 22,260; P < 0,01).
No painel B, podemos observar que os animais intoxicados por 4 semanas
com CPF nas doses de 7 mg/kg (CPF 7; P = 0,050) e 10 mg/kg (CPF 10; P <
0,01) apresentaram menores atividades da AChE em relação ao grupo
controle (SAL). Os animais intoxicados por 12 semanas (painel D) com as
mesmas doses de CPF, 7 mg/kg e 10 mg/kg (CPF 7, P < 0,01; CPF 10, P <
0,01), também apresentaram uma menor atividade em relação ao grupo
controle.
59
Figura 17: Atividade da colinesterase plasmática (BuChE) e acetilcolinesterase cerebral (AChE) no período de 4 e 12 semanas.
4 Semanas
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
100
200
300
**
Ativ
idade B
uC
hE
(U
/L)
4 Semanas
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
2
4
6
***
Ativ
idade A
ChE
(um
ol/h
/mg d
e p
rote
ina)
12 Semanas
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
100
200
300
***
Ativ
idade B
uC
hE
(U
/L)
12 Semanas
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
2
4
6
****
Ativ
idade A
ChE
(um
ol/h
/mg d
e p
rote
ina)
(A)
(C)
(B)
(D)
Colinesterase Plasmática Colinesterase Cerebral
28%32%
39% 34%
37%
57%
50%56%
Salina 0,9% (SAL, barra preta), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7, barra azul), clorpirifós de 10 mg/kg (CPF 10, barra vermelha). Painel A e C: Atividade da colinesterase plasmática após tratamento de 4 semanas (SAL, N=7; CPF 7, N=9; CPF 10, N=7) e 12 semanas (SAL, N=9; CPF 7, N=9; CPF 10, N=9), respectivamente. Painel B e D: Atividade da acetilcolinesterase cerebral após tratamento por 4 semanas (SAL, N=6; CPF 7, N=6; CPF 10, N=6) e 12 semanas (SAL, N=13; CPF 7, N=14; CPF 10, N=12), respectivamente. Atividade da colinesterase plasmática expressa como U/L e atividade da acetilcolinesterase cerebral expressa como umol/h/mg de proteína. ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Bonferroni.*p<0,05, **p<0,01 indicam diferenças entre os grupos CPF e SAL.
60
4.2 PESO MÉDIO E SOBREVIDA
Os dados de ganho de peso corporal dos animais tratados por 4 e 12
semanas estão representados na figura 18.
Nos animais tratados por 4 semanas (painel A), um ganho significativo de
peso foi observado ao longo do tempo (F(3,29) = 44,976; P < 0,01). O
tratamento, porém, não afetou de forma significativa o ganho de peso (F(2,29) =
1,316; P = 0,284), mas houve interação entre o tempo e o tratamento (F(8,29) =
2,937; P = 0,048).
Os animais tratados por 12 semanas (painel B), também apresentaram um
ganho significativo de peso ao longo do tempo (F(11,36) = 438,624; P < 0,01).
Em contrapartida, o tratamento não afetou o ganho de peso (F(2,36) = 1,010; P
= 0,374), assim como não houve interação entre o tratamento e o tempo
(F(22,36) = 0,429; P = 0,767) para os grupos avaliados.
A despeito da ausência de alteração no peso induzido pelo tratamento, a
exposição ao CPF na dose de 10 mg/kg por 4 semanas, promoveu uma
mortalidade de 14,6% nos animais tratados.
61
Figura 18: Ganho de peso corporal dos animais tratados por 4 e 12 semanas.
1 2 3 4100
200
300
400
500
Semanas
SAL
CPF 7
CPF 10
Peso C
orp
ora
l (g
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12100
200
300
400
500
Semanas
Peso C
orp
ora
l (g
)
(A) 4 Semanas
12 Semanas(B)
Salina 0,9% (SAL – linha preta), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7 – linha azul) e 10 mg/kg (CPF 10 – linha vermelha). Painel A: Animais tratados pelo período de 4 semanas (SAL, N=9; CPF 7, N=14; CPF 10, N=9). Painel B: Animais tratados pelo período de 12 semanas (SAL, N=13; CPF 7, N=14; CPF 10, N=12). ANOVA de duas vias para medidas repetidas seguida de Post-Hoc de Bonferroni.
62
4.3 DADOS HEMODINÂMICOS E VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA (VFC) NO DOMÍNIO DO TEMPO
Os resultados obtidos na análise dos valores basais de PAD, PAS, PAM e FC
de ratos tratados por 4 semanas com salina 0,9% (SAL) e CPF nas doses de
7 mg/kg (CPF 7) e 10 mg/kg (CPF 10), são mostrados na tabela 2. Não foram
observadas diferenças estatisticamente significantes entre os diferentes
grupos tratados para os valores basais de PAD (F(2,29) = 0,233; P = 0,793),
PAS (F(2,29) = 1,123; P = 0,339), PAM (F(2,29) = 1,913; P = 0,166) e FC (F(2,29) =
1,266; P = 0,297).
Para os animais tratados por 12 semanas (SAL; CPF 7 e CPF 10), também
não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os
diferentes grupos tratados para os valores basais de PAD (F(2,36) = 1,358; P =
0,270), (PAS) (F(2,36) = 0,112; P = 0,894), PAM (F(2,36) = 0,310; P = 0,736) e FC
(F(2,36) = 2,961; P = 0,065).
Os valores médios da variabilidade de frequência cardíaca (VFC) no domínio
do tempo dos animais tratados por 4 semanas com salina 0,9% (SAL) e CPF
nas doses de 7 mg/kg (CPF 7) e 10 mg/kg (CPF 10) estão representados na
tabela 2. Não foi observado diferença estatística nos índices desvio padrão
(DP) (F(2,27) = 1,325; P = 0,282) e variância (F(2,27) = 1,446; P = 0,253) de
pressão arterial sistólica. O mesmo resultado foi observado na análise de
variabilidade de intervalo de pulso (IP) para os índices: DP (F(2,27) = 2,087; P =
0,144), variância (F(2,27) = 2,281; P = 0,122) e RMSSD (raiz quadrada da média
do quadrado das diferenças de intervalos sucessivos) (F(2,27) = 1,013; P =
0,377).
De forma semelhante, entre os animais tratados por 12 semanas com salina
0,9% (SAL) e CPF nas doses de 7 mg/kg (CPF 7) e 10 mg/kg (CPF 10), não
foi observado diferença estatística na análise de variabilidade da pressão
sistólica, para os índices desvio padrão (DP) (F(2,32) = 0,080; P = 0,923) e
variância (F(2,32) = 0,159; P = 0,854); e para a análise de variabilidade de IP
para os índices: DP (F(2,32) = 2,293; P = 0,117), variância (F(2,32) = 2,803; P =
0,076) e RMSSD (F(2,32) = 1,23; P = 0,30).
63
Tabela 2. Dados hemodinâmicos basais, de variabilidade da pressão arterial sistólica e de intervalo de pulso no domínio do tempo dos diferentes grupos estudados.
4 Semanas 12 Semanas
SAL (N=9) CPF 7 (N=14) CPF 10 (N=9) P SAL (N=13) CPF 7 (N=14) CPF 10 (N=12) P
PAD (mmHg) 95,67 ± 2,55 92,55 ± 2,79 93,38 ± 4,53 0,793 93,39 ± 2,32 90,22 ± 2,60 96,20 ± 2,76 0,270
PAS (mmHg) 129,36 ± 3,12 127,18 ± 2,55 122,81 ± 3,19 0,339 128,41 ± 2,85 127,51 ± 3,60 126,02 ± 4,08 0,894
PAM basal (mmHg) 111,00 ± 2,43 108,28 ± 2,59 102,69 ± 3,41 0,166 109,09 ± 2,34 107,03 ± 2,86 109,98 ± 2,99 0,736
FC basal (bpm) 357,81 ± 9,93 371,61 ± 9,45 343,10 ± 19,78 0,297 390,85 ± 16,02 409,14 ± 17,45 352,10 ± 16,45 0,065
SAL (N=9) CPF 7 (N=13) CPF 10 (N=8) P SAL (N=12) CPF 7 (N=13) CPF 10 (N=10) P
Variabilidade da Pressão Sistólica
DP (mmHg) 2,77 ± 0,21 3,40 ± 0,29 3,01 ± 0,31 0,282 2,98 ± 0,29 3,15 ± 0,36 3,02 ± 0,27 0,923
Variância (mmHg2) 8,18 ± 1,14 12,84 ± 2,34 9,85 ± 1,85 0,253 9,83 ± 2,11 11,52 ± 3,13 9,81 ± 1,74 0,854
Variabilidade do Intervalo de Pulso
DP (ms) 3,20 ± 0,24 3,83 ± 0,33 4,18 ± 0,34 0,144 3,75 ± 0,25 3,88 ± 0,25 4,68 ± 0,47 0,117
Variância (ms2) 10,84 ± 1,64 16,72 ± 2,54 18,57 ± 3,04 0,122 14,80 ± 1,98 15,96 ± 1,96 24,06 ± 4,70 0,076
RMSSD (ms) 3,73 ± 0,30 4,21 ± 0,35 4,69 ± 0,67 0,377 3,84 ± 0,46 4,18 ± 0,30 4,71 ± 0,38 0,305
Salina (SAL), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7), clorpirifós de 10 mg/kg (CPF 10), pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC), pressão arterial
sistólica (PAS), desvio padrão (DP), raiz quadrada da média do quadrado das diferenças de intervalos sucessivos (RMSSD). ANOVA de uma via.
64
4.4 ANÁLISE ESPECTRAL
A análise espectral absoluta dos animais tratados por 4 semanas (painel A) mostrou
que houve diferença entre as bandas de muito baixa frequência (VLF, Very Low
Frequency) do espectro de intervalo de pulso (PI) (F(2,24) = 9,871; P = 0,001), onde o
grupo tratado com CPF na dose 10 mg/kg apresentou uma maior potência em
relação ao grupo salina (P < 0,01) e ao grupo CPF 7 (P < 0,01). Em contrapartida,
análise das potências absolutas para as bandas de baixa frequência (LF, Low
Frequency) (F(2,24) = 2,252; P = 0,127) e de alta frequência (HF, High Frequency)
(F(2,24) = 0,654; P = 0,529) não mostrou diferença estatisticamente significante entre
os grupos tratados estudados.
A análise espectral em unidades normalizadas (painel C) não mostrou diferença
estatística significante para as bandas LF (F(2,24) = 1,479; P = 0,248) e HF (F(2,24) =
1,479; P = 0,248) entre os diferentes grupos tratados, ainda que uma tendência de
aumento da banda de LF e de redução da banda de HF possa ser observada nos
grupos intoxicados com CPF. Ainda, para a razão LF/HF (painel E), não foi
observado diferença estatística significante (F(2,24) = 1,385; P = 0,270) entre os
diferentes grupos estudados.
Em relação aos animais tratados por 12 semanas, a análise dos dados de potência
espectral absoluta (painel B) mostrou diferença entre os grupos para a banda de
muito baixa frequência (VLF) do espectro de PI (F(2,31) = 5,664; P = 0,008), onde o
grupo tratado com CPF na dose 10 mg/kg apresentou uma maior potência (CPF 10;
P < 0,01) em relação ao grupo salina (SAL). A análise das bandas de baixa
frequência (LF) (F(2,31) = 1,099; P = 0,346) e de alta frequência (HF) (F(2,31) = 1,572; P
= 0,224) não mostrou diferença estatística significante entre os grupos tratados
estudados.
De forma semelhante, a análise dos espectros em unidades normalizadas (painel D)
não mostrou diferença estatística significante para as bandas LF (F(2,31) = 0,81; P =
0,454) e HF (F(2,31) = 0,810; P = 0,454) entre os diferentes grupos tratados, assim
como não foram observadas diferenças para a razão LF/HF (painel F; F(2,31) = 0,733;
P = 0,488) entre os grupos para este período de tratamento.
65
Figura 19: Efeitos da exposição repetida ao clorpirifós sobre a variabilidade da frequência cardíaca no domínio da frequência em ratos.
0
5
10
15
20
banda LF banda HFbanda VLF
&&
**
Potê
ncia
absolu
ta (
ms
2)
0
5
10
15
20
banda LF banda HFbanda VLF
**SAL
CPF 7
CPF 10
Potê
ncia
absolu
ta (
ms
2)
0
20
40
60
80
100
banda LF banda HF
Unid
ades n
orm
aliz
adas (
%)
0
20
40
60
80
100
banda LF banda HF
Unid
ades n
orm
aliz
adas (
%)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ra
zão L
F /
HF
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ra
zão L
F /
HF
4 Semanas 12 Semanas(A)
(C)
(E)
(B)
(D)
(F)
Salina 0,9% (SAL, barra preta), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7, barra azul) e 10 mg/kg (CPF 10; barra vermelha). Painel A e B: Análise espectral absoluta - tratamento por 4 semanas (SAL, N=9; CPF 7, N=11; CPF 10, N=7) e 12 semanas (SAL, N=11; CPF 7, N=13; CPF 10, N=10). Painel C e D: Análise em unidades. Painel E e F: Razão LF/HF. ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Bonferroni. **p<0,01 indica diferença entre os grupos CPF 10 e SAL. &&
p<0,05 indica diferença entre os grupos CPF 7 e CPF 10.
66
4.5 AVALIAÇÃO DO BARORREFLEXO ESPONTÂNEO
A análise barorreflexa dos animais tratados por 4 semanas (painel A) mostrou uma
diferença estatística significante entre os grupos para o ganho barorreflexo das
rampas de subida (F(2,24) = 6,968; P = 0,004). O ganho dos animais intoxicados com
as doses de 7 mg/kg (CPF 7; P < 0,01) e 10 mg/kg (CPF 10; P < 0,05) foi menor em
relação ao grupo controle (SAL).
Podemos observar ainda, que as rampas de descida não apresentaram diferença
significativa entre os grupos tratados por 4 semanas (F(2,24) = 2,760; P = 0,083),
enquanto que as rampas totais, ou seja, rampas de subida somadas as rampas de
descida, também apresentaram diferença estatística (F(2,24) = 5,422; P = 0,011),
sendo observada uma redução estatisticamente significante apenas entre os animais
intoxicados com clorpirifós na dose de 7 mg/kg (CPF 7; P < 0,05) e o grupo controle
(SAL).
O método de sequência também fornece o índice de efetividade barorreflexa (BEI),
que através da razão do número de sequências divididas pelo número de rampas de
PA, interpretadas como a porcentagem de rampas de PA, confirma se realmente
produzem uma resposta reflexa pelo barorreflexo (BERTINIERI et al., 1985, DI
RIENZO et al., 2001). A análise estatística desta variável (painel C) mostrou uma
diferença estatisticamente significante entre os grupos tratados por 4 semanas
(F(2,24) = 6,758; P = 0,005), sendo observada uma redução significante para os
animais tratados com CPF na dose de 7 mg/kg (CPF 7; P < 0,01) em relação ao
grupo controle (SAL).
Entre os animais tratados durante 12 semanas, a análise não mostrou diferença
estatisticamente significante para o ganho barorreflexo (painel B) das rampas de
subida (F(2,31) = 0,123; P = 0,885), assim como para as rampas de descida (F(2,31) =
0,174; P = 0,841), e as rampas totais (F(2, 31) = 0,087; P = 0,917) entre os diferentes
grupos estudados. Da mesma forma, o BEI (painel D) não apresentou diferença
estatisticamente significante entre os grupos tratados por 12 semanas (F(2,31) =
1,611; P = 0,216).
67
Figura 20: Efeitos da exposição repetida ao clorpirifós sobre o barorreflexo de ratos.
0
1
2
3
SUBID
A
DESC
IDA
TODAS
**
SA
L
CP
F 7
CP
F 1
0**
Ganho (
ms/m
mH
g)
0
1
2
3
SUBID
A
DESC
IDA
TODAS
SA
L
CP
F 7
CP
F 1
0
Ga
nh
o (
ms/m
mH
g)
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
**
BE
I
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
BE
I
4 Semanas 12 Semanas
(A)
(C)
(B)
(D)
Salina 0,9% (SAL, barra preta), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7, barra azul) e 10 mg/kg (CPF 10; barra vermelha). Painel A e B: Valores de ganho barorreflexo calculado com o método de sequência e delay 3 pulsos, em animais tratados por 4 semanas (SAL, N=9; CPF 7, N=11; CPF 10, N=7) e 12 semanas (SAL, N=12; CPF 7, N=12; CPF 10, N=10), respectivamente. Painel C e D: Índice de efetividade barorreflexa (BEI) após tratamento por 4 semanas e 12 semanas, respectivamente. ANOVA de uma via seguida de Post-Hoc de Bonferroni. *p<0,05 e **p<0,01 indicam diferenças em relação ao grupo SAL..
68
4.6 AVALIAÇÃO DO QUIMIORREFLEXO
A figura 21 mostra as alterações observadas na PAM e FC frente a ativação do
quimiorreflexo com doses crescentes de cianeto de potássio (KCN) nos animais dos
diferentes grupos estudados.
Para o tratamento de 4 semanas podemos observar no painel A que as diferentes
doses de KCN induziram respostas de diferentes magnitudes na PAM (F(3,29) =
136,304; P < 0,01), porém não houve diferença estatisticamente significante entre os
grupos (F(2,29) = 0,866; P = 0,431), nem houve interação entre o tratamento e as
doses de KCN (F(6,29) = 0,504; P = 0,732).
As doses de KCN (painel B) também induziram diferentes respostas bradicárdicas
neste período de tratamento (F(3,29) = 126,846; P < 0,01), assim como as respostas
bradicárdicas apresentaram diferentes magnitudes entre os grupos estudados (F(2,29)
= 4,723; P = 0,017), mas não foi observada interação entre o tratamento e as
diferentes doses de KCN (F(6,29) = 1,063; P = 0,387).
A análise post-hoc desses dados permitiu observar uma redução estatisticamente
significante na resposta bradicárdica dos animais tratados com CPF para a dose de
40 µg de KCN (CPF 7, P < 0,01; CPF 10, P < 0,05) quando comparada ao grupo
controle (SAL).
De forma semelhante, nos animais tratados por 12 semanas (painel C), foram
observadas respostas pressoras de diferentes magnitudes frente as doses de KCN
(F(3,36) = 138,441; P < 0,01), sem diferença estatisticamente significante entre os
grupos (F(2,36) = 0,26; P = 0,772), mas com interação entre o tratamento e as doses
empregadas (F(6,36) = 2,63; P = 0,056).
Para este mesmo período de tratamento, observamos diferentes respostas
bradicárdicas após a administração das diferentes doses de KCN (F(3,36) = 185,879;
P < 0,01), assim como as respostas bradicárdicas apresentaram diferentes
magnitudes entre os grupos estudados (F(2,36) = 7,701; P = 0,002), mas sem
interação entre o tratamento e as diferentes doses de KCN (F(6,36) = 1,757; P =
0,145) (painel D).
69
A análise post-hoc desses dados permitiu observar uma redução estatisticamente
significante na resposta bradicárdica para a dose de 40 µg (CPF 7, P < 0,01; CPF
10, P < 0,01) e a dose de 80 µg (CPF 10, P < 0,01) quando comparadas ao grupo
controle (SAL).
70
Figura 21: Variação de pressão arterial média e de frequência cardíaca após ativação do quimiorreflexo dos animais tratados por 4 e 12 semanas.
10 µg 20 µg 40 µg 80 µg0
20
40
60
80
KCN
P
AM
(m
mH
g)
10 µg 20 µg 40 µg 80 µg0
20
40
60
80
SAL
CPF 7
CPF10
KCN
P
AM
(m
mH
g)
10 µg 20 µg 40 µg 80 µg
-250
-200
-150
-100
-50
0
*##
KCN
F
C (
bpm
)
10 µg 20 µg 40 µg 80 µg
-250
-200
-150
-100
-50
0
****## %
KCN
F
C (
bpm
)
(A) (C)
(B) (D)
4 Semanas 12 Semanas
Salina 0,9% (SAL, N=9, linha preta), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7, N=14, linha azul) e 10 mg/kg (CPF
10, N=9; linha vermelha). Painel A e C: Variação de pressão arterial média; e Painel B e D: Variação
de frequência cardíaca de animais tratados por 4 semanas (SAL, N=9; CPF 7, N=14; CPF 10, N=9) e
12 semanas (SAL, N=13; CPF 7, N=14; CPF 10, N=12). Quimiorreflexo ativado por meio da
administração de quantidades crescentes de KCN (10, 20, 40 e 80 µg/kg). ANOVA de duas vias
seguida de Post-Hoc de Bonferroni. ##
p<0,01 indica diferença do grupo CPF 7 em relação ao grupo
salina, e *p<0.05 e **p<0.01 e indica diferença do grupo CPF 10 em relação ao grupo salina. %
p<0.05
indica diferença entre os grupos CPF 7 e CPF 10.
71
4.7 ANÁLISE DOS PARÂMETROS RESPIRATÓRIOS BASAIS
Os dados do volume corrente (VT) e volume minuto são apresentados na figura 22.
Para o tratamento de 4 semanas, podemos observar no painel A que o VT,
apresentou uma diferença estatística significante entre os diferentes grupos de
tratamento (F(2,29) = 7,2; P = 0,003). Pode-se observar que os animais intoxicados
com CPF na dose de 10 mg/kg (CPF 10; P < 0,01), apresentaram um aumento do VT
em relação ao grupo controle (SAL). Também foi observada uma diferença
estatisticamente significante para o VE (painel C) entre os grupos para o mesmo
período de tratamento (F(2,29) = 4,465; P = 0,02). Os animais intoxicados com CPF na
dose de 10 mg/kg (CPF 10; P < 0,05), apresentaram um maior VE quando
comparado ao grupo controle (SAL).
O VT dos animais tratados por 12 semanas (painel B), assim como demonstrado
para o período de 4 semanas de tratamento, apresentou diferença estatística
significante entre os diferentes grupos de tratamento (F(2,36) = 7,038; P = 0,003). O
teste post-hoc mostrou que os animais intoxicados com CPF na dose de 10 mg/kg
(CPF 10; P < 0,01), apresentaram um aumento do VT em relação ao grupo controle
(SAL). Para o VE (painel D), entretanto, não foi observada diferença estatística (F(2,36)
= 3,043; P = 0,060).
A análise da frequência respiratória (fR) basal média (painel E e D) não indicou
diferença entre os diferentes grupos tratados tanto por 4 semanas (F(2,29) = 1,593; P
= 0,221), quanto por 12 semanas (F(2,36) = 0,341; P = 0,714).
72
Figura 22: Volumes respiratórios corrente e minuto e frequências respiratórias basais médias dos animais tratados por 4 e 12 semanas
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
2
4
6
8
10
**
VT (
mL/K
g-1
)
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
2
4
6
8
10
**
VT
(mL/K
g-1
)
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
200
400
600
800
1000*
VE (
mL.K
g-1
.min
-1)
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
200
400
600
800
1000
VE (
mL.K
g-1
.min
-1)
(A) (B)
(C) (D)
12 Semanas4 Semanas
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
50
100
150
200
f R (
cp
m)
SAL
CPF 7
CPF 1
0
0
50
100
150
200
f R (
cp
m)
(E) (F)
Salina 0,9% (SAL, barra preta), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7, barra azul) e 10 mg/kg (CPF 10, barra vermelha). Painel A e B: Volumes respiratórios corrente (VT;); Painel C e D: Volumes respiratórios minuto (VE;); Painel E e F: Frequências respiratórias (fR;). de animais tratados por 4 semanas (SAL, N=9; CPF 7, N=14; CPF 10, N=9) e 12 semanas (SAL, N=13; CPF 7, N=14; CPF 10, N=12), respectivamente. ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01 indica diferença em relação ao grupo SAL.
73
4.8 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TAQUIPNEICA DO QUIMIORREFLEXO
Para os animais tratados por 4 semanas (painel A), as respostas taquipneicas do
quimiorreflexo apresentaram uma relação dose dependente para as diferentes doses
de KCN (F(3,29) = 32,433; P < 0,01). O tratamento, porém, não mostrou alterações
significativas entre os diferentes grupos (F(2,29) = 0,672; P = 0,518), nem interação
entre o tratamento e as doses de KCN (F(6,29) = 0,596; P = 0,715).
Ainda, para os animais tratados durante 12 semanas (painel B), as respostas
taquipneicas do quimiorreflexo apresentaram uma relação dose dependente para as
diferentes doses de KCN (F(3,36) = 33,027; P < 0,01). Mas não houve diferença na
resposta taquipneica entre os diferentes grupos (F(2,36) = 0,304; P = 0,739), assim
como não houve interação entre o tratamento e as doses de KCN (F(6,36) = 0,681; P =
0,664).
74
Figura 23: Frequências respiratórias antes e durante a estimulação do quimiorreflexo nos animais tratados por 4 semanas.
10 µ
g
20 µ
g
40 µ
g
80 µ
g
0
200
400
600
800
1000
KCN
f R (
cp
m)
10 µ
g
20 µ
g
40 µ
g
80 µ
g
0
200
400
600
800
1000
SAL
CPF 7
CPF 10
KCN
f R (
cp
m)
(B)
(A) 4 Semanas
12 Semanas
Salina 0,9% (SAL – linha preta), clorpirifós de 7 mg/kg (CPF 7 – linha azul) e 10 mg/kg (CPF 10 – linha vermelha). Frequências taquipneicas (fR, cpm) após ativação do quimiorreflexo com administração de quantidades crescentes de KCN (10, 20, 40 e 80 µg/kg) em animais tratados pelo período de 4 semanas (Painel A: SAL, N=9; CPF 7, N=14; CPF 10, N=9), e por 12 semanas (Painel B: SAL, N=13; CPF 7, N=14; CPF 10, N=12). ANOVA de duas vias seguida de Post-Hoc de
Bonferroni.
75
Discussão
76
5. DISCUSSÃO
Neste estudo demonstramos que a exposição crônica a baixas doses de clorpirifós
(CPF) produziu marcantes alterações no controle autonômico do sistema
cardiorespiratório, caracterizadas por inibição da resposta bradicárdica do
quimiorreflexo, prejuízo na função barorreflexa, alterações significativas na função
respiratória basal, redução da potência das bandas de muito baixa frequência (VLF),
estando esses efeitos aliados a uma inibição significativa da atividade das enzimas
butirilcolinesterase (BuChE) plasmática e da acetilcolinesterase (AChE) no tronco
encefálico, sem, contudo serem observadas alterações dos valores de ganho de
peso e níveis basais de pressão arterial e frequência cardíaca.
Conforme anteriormente mencionado nos métodos, nossa referência para escolha
da dose partiu do estudo de Cunha e colaboradores (2018). Neste estudo foi testada
a letalidade frente à exposição a 6 doses de CPF, sendo adotada para exposição
aguda a dose de 30 mg/kg, considerada como dose máxima tolerada, pois não
induziu letalidade e produziu marcantes prejuízos sobre os reflexos
cardiovasculares. Todavia, como o foco do presente estudo era a avaliação dos
efeitos resultantes de uma exposição cumulativa ao CPF testamos uma dose
correspondente a 1/3 da dose adotada nos estudos agudos, a qual induziu letalidade
em 16,7% dos animais testados no período de 4 semanas de exposição. Desta
forma, testamos também a exposição repetida a uma menor dose (7 mg/kg) que não
causou letalidade no período de 4 e 12 semanas de tratamento. De forma
semelhante ao adotado em nosso estudo, alguns trabalhos envolvendo exposição
crônica a compostos OF também avaliaram e compararam os efeitos de exposição
repetidas a doses que induzem baixa letalidade com aqueles produzidos por doses
não letais (HOWARD et al., 2007; ZAFIROPOULOS et al., 2014; ZHENG et al.,
2000). Já a escolha da via de administração foi apoiada em estudos de nosso grupo
(CUNHA et al., 2018; DO NASCIMENTO et al., 2017; MARETTO et al., 2012) e de
outros autores que também investigaram efeitos da exposição a compostos OF
adotando essa via de administração (GUVENC TUNA et al., 2011; JUDGE et al.,
2016; SAVY et al., 2015), uma vez que apresenta menor variabilidade em relação a
dose recebida em comparação à administração oral.
77
A escolha do período de 12 semanas foi baseada no estudo de Calore e
colaboradores (2007) em que a administração de 12 doses de metamidofós (MTF),
um outro OF, durante 12 semanas, causou alterações na morfometria cardíaca de
ratos expostos (CALORE; PEREZ; HERMAN, 2007). Todavia, a exposição
ocupacional de trabalhadores pode ocorrer com diferentes frequências em função
das atividades exercidas (ALBERS et al., 2004; KAMEL et al., 2005; ROLDÁN-
TAPIA; PARRÓN; SÁNCHEZ-SANTED, 2005; STEPHENS et al., 1995).
Considerando que 1 dia de vida do rato adulto, corresponde em média a 30 dias de
idade no homem (SENGUPTA, 2013), e considerando que o intervalo médio de
reentrada nas lavouras, preconizados nos rótulos dos fabricantes, é de 21 dias
(ADAPAR, 2017; BAYER S.A., 2018) adotamos a administração intermitente
também com um menor intervalo de forma a avaliar se a administração do mesmo
número de doses (12 administrações) num menor intervalo de tempo (4 semanas),
poderia promover efeitos diferenciados sobre os parâmetros cardiorespiratórios
avaliados. A grande maioria dos estudos no campo experimental utiliza um modelo
de exposição crônica continua (ABDOU; EL MAZOUDY, 2010; BAŞ; KALENDER,
2011; GUVENC TUNA et al., 2011; KALENDER et al., 2012; YAVUZ et al., 2005;
ZAFIROPOULOS et al., 2014). Por outro lado, observamos que de modo geral os
trabalhadores aplicam o agrotóxico na lavoura numa frequência de 1 a 3 vezes por
semana ou a partir de 3 vezes por mês (JØRS et al., 2006; MUNIZ et al., 2008;
SURAJUDEEN et al., 2014). Em outras palavras, a realidade ocupacional frente a
exposição a agrotóxicos é mais próxima da forma de exposição intermitente.
Portanto, os resultados da comparação entre os períodos de 4 e 12 semanas de
exposição crônica intermitente pode talvez tornar claro se, por exemplo, os
trabalhadores que respeitam as determinações de segurança, podem, de fato, se
sentir seguros em condições similares de exposição.
Apesar de evidências mostrarem que a medida de inibição da BuChE plasmática
pode não se correlacionar diretamente com sinais clínicos de intoxicação (AURBEK
et al., 2009; EDDLESTON et al., 2008), esta enzima foi utilizada como biomarcador
para verificação da efetividade da intoxicação, uma vez que é bem estabelecida sua
inibição frente a exposição a compostos OF (ANTHON; CAMPAÑA-SALCIDO, 2011;
CUNHA et al., 2018; DO NASCIMENTO et al., 2017; LASSITER et al., 2003;
MARETTO et al., 2012; POHANKA, 2013). Adicionalmente, a facilidade de execução
78
e rapidez do método empregado para quantificação, reforçam a sua utilização na
prática clínica como um teste rápido para screening de exposição a compostos OF
(STEFANIDOU; ATHANASELIS; SPILIOPOULOU, 2009), sendo um biomarcador
aceitável na nossa legislação (BRASIL, 1978). Mirajkar & Pope (2008) incubaram
homogenatos de tecido cardíaco e córtex com inibidores específicos da BuChE e
AChE, onde observaram que a maioria das colinesterases no cérebro foram
definidas como AChE, enquanto que a BuChE foi a principal no coração. Eles
também observaram que a BuChE tem maior sensibilidade a ligação ao CPF-oxon
do que a AChE (MIRAJKAR; POPE, 2008). Além disso, a BuChE tem se mostrado
um importante marcador em estudos da função cardíaca, onde sua baixa atividade
parece estar relacionada com mortalidade em casos de doenças cardíacas
(GOLIASCH et al., 2012; SULZGRUBER et al., 2015; SUN et al., 2016).
A atividade da BuChE foi significativamente inibida após 4 semanas de tratamento
com CPF de 7 mg/kg (28%) e 10 mg/kg (32%), e após 12 semanas, pelas duas
doses de CPF testadas, 7 mg/kg (39%) e 10 mg/kg (34%). Em um estudo de
exposição aguda às doses de 10 mg/kg e 25 mg/kg de CPF por via oral, foram
observadas semelhantes magnitudes de inibição da colinesterase, produzindo a
menor dose 50,7% e a maior dose 41,7% de inibição da atividade da colinesterase
plasmática em relação aos respectivos controles (SMITH & GORDON, 2005).
Estudos de nosso grupo em que ratos foram expostos de forma aguda por via i.p.
com MTF, outro OF, evidenciou 80% de inibição da atividade da BuChE (DO
NASCIMENTO et al., 2017), enquanto a intoxicação repetida por 7 dias em
camundongos pelo mesmo composto, reduziu a atividade em 70% (MARETTO et al.,
2012). Resultado semelhante foi observado após intoxicação aguda de ratos com
CPF, a qual promoveu 77% de inibição da atividade desta enzima (CUNHA et al.,
2018).
Nossos resultados também mostraram inibição da atividade da BuChE frente a
exposição repetida ao CPF, ainda que um menor percentual de inibição tenha sido
observado para as doses testadas (cerca de 30% de inibição). É possível que as
diferenças sejam devidas à menor dose administrada durante o tratamento crônico.
Nostrandt, Padilla & Moser (1997), fizeram um estudo de intoxicação aguda frente a
diferentes doses de CPF, onde a atividade da colinesterase foi determinada em
vários tecidos, incluindo o plasma, em dois tempos diferentes: 3,5h e 24h após a
79
exposição. Neste estudo foi observado que após 24h da exposição ao CPF, a
atividade da colinesterase plasmática se mostrou parcialmente recuperada para as
menores doses testadas, diferente das doses maiores, em que a inibição persistia
após esse período (NOSTRANDT; PADILLA; MOSER, 1997). Em outro estudo,
camundongos foram expostos a 5 mg/kg de CPF via oral por um total de 8 semanas,
e a atividade da colinesterase plasmática foi determinada em três períodos
diferentes de tratamento: após uma semana de exposição ao CPF; no final das 8
semanas de tratamento; e 8 semanas após o final do tratamento. Foi observado que
o grupo exposto por 8 semanas teve atividade menor que o grupo exposto apenas
por uma semana, enquanto que a atividade enzimática do grupo analisado 8
semanas após o final do tratamento, foi recuperada (BASAURE et al., 2017). Dessa
forma, diferentes doses e tempo de exposição ao CPF, bem como diferentes
intervalos entre a exposição e a coleta de amostra para determinação enzimática,
podem influenciar no nível de inibição das enzimas avaliadas.
Além da BuChE, foi realizada a quantificação da acetilcolinesterase (AChE) no
tronco encefálico, uma vez que nessa região do cérebro estão localizados os
principais núcleos que modulam a função cardiorespiratória (SALMAN, 2016).
Assim como os resultados da BuChE, também encontramos inibição da AChE para
as duas doses de CPF utilizadas nos dois períodos distintos de tratamento. No
período de 4 semanas esta enzima apresentou um pouco mais de 30% de inibição
para o tratamento com 7 mg/kg de CPF, enquanto no tratamento por 12 semanas
com essa mesma dose e com a dose de 10 mg/kg em ambos períodos, foi
observado uma inibição entre 50-55% da atividade da AChE. Nostrandt, Padilla &
Moser (1997) analisaram a AChE no tronco encefálico frente a diferentes doses de
CPF e encontraram inibições dose dependente que variaram, aproximadamente,
entre 50% a 90% da atividade enzimática dos animais controle. Do Nascimento e
colaboradores (2017) também quantificaram a AChE em todo tecido cerebral de
camundongos, encontrando 25% de inibição da atividade após a exposição por 7
dias ao OF MTF (DO NASCIMENTO et al., 2017). Em contrapartida, Cunha e
colaboradores quantificaram, especificamente no tronco encefálico, a atividade da
AChE de ratos expostos agudamente ao CPF e encontraram uma inibição de 66%
da atividade desta enzima (CUNHA et al., 2018). De forma, semelhante ao
observado para a atividade da BuChE, uma grande variação de inibição da atividade
80
da AChE pode ser observada em função do tempo de exposição, do OF empregado
e do tecido avaliado, mas nossos dados mostram que a exposição ao CPF pelos
dois períodos de tratamento promoveu significativa inibição da atividade da AChE no
tronco encefálico, onde estão localizados os principais núcleos que modulam a
função cardiorespiratória.
Nossos dados também mostraram que, embora o tratamento isoladamente não
tenha afetado o ganho de peso corporal, uma tendência a menor ganho de peso é
observada em animais expostos por um menor período de tempo (4 semanas).
Howard e colaboradores (2007), mostraram que exposição única a diferentes doses
de CPF, subletal e DL10, em ratos de diferentes idades (recém-nascidos e adultos),
promoveu um menor ganho de peso em relação ao grupo controle (HOWARD et al.,
2007). Similarmente, ratos expostos cronicamente ao CPF desde a fase gestacional
até a fase adulta, também apresentaram menor ganho de peso em relação aos
animais controle (DARWICHE et al., 2018). Zheng e colaboradores (2000), avaliando
animais expostos de forma subcrônica (14 dias) a várias doses de CPF por via oral,
encontraram alterações de peso corporal apenas no grupo recebendo a dose mais
alta e a partir do 10º dia de tratamento (ZHENG et al., 2000). Outro estudo, com
exposição por 8 semanas com o OF diclorvós, também evidenciou redução no
ganho de peso não associada a alterações no padrão alimentar, sendo sugerido que
a redução do peso pode ser um efeito da intoxicação ao OF sobre o metabolismo
celular dos animais (RAHEJA; GILL, 2007). Por outro lado, alguns estudos
mostraram que ratos expostos a administração repetida de baixas doses de CPF
não apresentam alterações no ganho de peso corporal em relação aos controles
(TERRY et al., 2007; YAN et al., 2012). Portanto, em geral, o corpo de evidências
mostra que a mudança na peso corporal na exposição crônica a OPs pode diferir de
acordo com o tratamento períodos e doses utilizadas.
O tratamento crônico com CPF não alterou de maneira significativa os parâmetros
cardiovasculares basais de pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial
sistólica (PAS), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) em relação
ao grupo controle.
Maretto e colaboradores (2012) não encontraram alteração nos níveis basais de
PAM e FC após exposição aguda ao MTF. Da mesma forma, Cunha e colaboradores
81
(2018), ao intoxicar ratos de forma aguda com o CPF também não observaram
alterações nos valores basais de PAM e FC (CUNHA et al., 2018; MARETTO et al.,
2012). Esses estudos corroboram nossos achados, onde também não encontramos
alterações em animais expostos a baixas doses de CPF. Por outro lado, SMITH &
GORDON (2005) encontraram um aumento da PAD, PAS e PAM, aliado a uma
taquicardia em duas linhagens de animais, ratos espontaneamente hipertensos e
ratos controle normotensos, após exposição aguda por via oral com uma dose de 25
mg/kg de CPF. Porém, ao testarem uma dose de CPF de 10 mg/kg, não observaram
alterações nesses parâmetros nas linhagens testadas, apesar da atividade da
enzima colinesterase plasmática ter sido significativamente inibida (SMITH;
GORDON, 2005). E em um estudo de Anthon & Campaña-Salcido (2011), ratos
Wistar foram expostos a três diferentes doses de CPF por via oral, de formas aguda
e subcrônica, por 3 e 14 dias, respectivamente. Neste estudo eles não encontraram
alterações na FC, entretanto, nas duas maiores doses testadas eles observaram
aumento da PAD, PAS e PAM nos diferentes esquemas de tratamentos (ANTHON;
CAMPAÑA-SALCIDO, 2011). Diante disso, é importante salientar que, além dos
estudos referidos adotarem diferentes doses de tratamento, o esquema de
tratamento também se constitui em uma variável importante que pode justificar as
diferenças nos resultados uma vez que nosso trabalho utilizou uma exposição
intermitente crônica, enquanto que os estudos referidos adotaram ou exposição
aguda ou uma exposição contínua subcrônica.
A análise espectral fornece informações sobre a modulação autonômica e tem sido
aplicada para estudos da função cardiovascular em humanos e animais
(AKSELROD et al., 1981; BASELLI et al., 1986; DIAS DA SILVA et al., 2002).
Nossos dados da análise espectral mostraram aumento significativo nos valores
absolutos da banda de muita baixa frequência (VLF) em ambos períodos de
tratamento, sem mudanças significativas nos demais componentes, exceto uma
tendência a aumento nos componentes de baixa frequência (LF) e de alta frequência
(HF) entre os valores absolutos e a razão LF/HF no tratamento de 4 semanas.
Dados clínicos mostraram que pacientes que morreram por falência respiratória
aguda devido ingestão suicida de OF, incluindo o CPF, apresentaram uma menor
potência do componente LF e VLF do espectro de variações da PA e FC (YEN et al.,
2000). Em contrapartida, pacientes que se recuperaram após a intoxicação, exibiram
82
uma proeminente elevação da potência dos componentes LF e VLF, sugerindo que
esses componentes espectrais poderiam ser importantes índices de previsão de
mortalidade no prognóstico pós-intoxicação (YEN et al., 2000). Em um recente
estudo com pacientes intoxicados com inibidores da colinesterase, OF e
carbamatos, apenas o componente de VLF e a relação LF/HF foram
significantemente menores (KIM; JEONG, 2017).
No campo experimental, animais anestesiados, quando intoxicados agudamente por
meio da administração intravenosa com o OF, mevinfos, apresentaram alterações
hemodinâmicas distintas, caracterizadas em duas fases. Na primeira fase, os
animais apresentaram hipertensão e taquicardia leve, com aumento na potência das
bandas de muito alta frequência (VHF), assim como HF, LF e VLF derivadas dos
sinais de PA. Na fase subsequente, os animais apresentaram significativa
hipotensão com redução das potências de VHF e VLF para níveis controle e
diminuição da potência dos componentes de HF e LF para níveis inferiores a linha
de base. A estimulação direta de neurônios simpatoexcitatórios bulbares com
mevinfos produziu o mesmo padrão de resposta nos componentes do espectro, e os
autores concluíram que essas mudanças podem ter ocorrido devido ao acúmulo
progressivo de ACh, sendo que a concentração inicial resultou em estimulação, e a
hiperestimulação por sua vez resultou em ação inibitória (YEN et al., 2001). Em outro
estudo experimental foi avaliado os efeitos da interação entre estresse psicossocial e
inibidores da colinesterase sobre os componentes espectrais em camundongos
(JOAQUIM et al., 2004). Neste estudo, o grupo de camundongos expostos por três
dias somente ao inibidor reversível da colinesterase, a piridostigmina, não
apresentou alterações nos componentes de LF e HF do espectro, assim como não
apresentaram diferenças nos índices avaliados no domínio do tempo (JOAQUIM et
al., 2004).
Dos registros basais também extraímos os dados da variabilidade no domínio do
tempo. Nossos dados mostraram que não foram observadas diferenças
estatisticamente significantes para os índices de variabilidade da PAS e do IP no
domínio do tempo entre os grupos estudados.
Em um estudo realizado em indivíduos normais, foi administrado de forma aguda um
inibidor reversível da colinesterase (piridostigmina), e foi demonstrado um aumento
83
na média de IP, porém sem diferença no índice RMSSD (raiz quadrada da média do
quadrado das diferenças de intervalos sucessivos), índice este sugestivo de
atividade vagal (NOBREGA et al., 2001). De forma semelhante aos nossos achados,
Kim & Jeong (2017) também não observaram mudanças significativas na análise da
VFC no domínio do tempo em pacientes internados decorrente de intoxicação com
OF e carbamatos (KIM; JEONG, 2017).
Apesar de não haver muitos estudos voltados para análise da VFC frente a
intoxicação por compostos OF, as evidências disponíveis no campo experimental e
clínico, incluindo inibidores reversíveis da colinesterase, apontam para uma
multiplicidade de efeitos observados tanto na análise espectral, quanto para análise
da variabilidade no domínio do tempo. Nossos achados não apontaram alterações
estatisticamente significantes no equilíbrio autonômico identificado pela análise
desses componentes para as doses e períodos de tratamento empregado. Todavia,
observa-se uma tendência de aumento, dose dependente, da banda LF e de
redução na banda HF do espectro de animais expostos por 4 semanas. É bem
aceito que o componente HF da análise espectral da VFC reflete a atividade
parassimpática cardíaca, enquanto o componente LF é o resultado da influência dos
tônus vagal e simpático, sendo assim a razão LF/HF um índice de tônus simpático
cardíaco (DEBOER, KAREMAKER, & STRACKEE, 1987; MADWED et al., 1989;
OOSTING, STRUIJKER-BOUDIER, & JANSSEN, 1997; PAGANI et al., 1986; WAKI
et al., 2003). Já evidências mostram que o componente VLF parece estar associado
a termorregulação, ao tônus vasomotor periférico e a modulação por agentes
hormonais, incluindo a participação do sistema renina-angiotensina aldosterona
(SRAA), (CERUTTI et al., 1991; FAZAN; SILVA, 2000; SÁ et al., 2013; VANDERLEI
et al., 2009). A angiotensina II (AT II), um hormônio peptídeo produzido pelo SRAA,
atua no sistema nervoso central para modular as vias neuro-humorais envolvidas na
excitação simpática, liberação de vasopressina, controle da sede e termorregulação
(DAMPNEY et al., 2007; DAVISSON, 2003; LARSEN; THORP; SCHLAICH, 2014).
Estudos experimentais apontam para uma influência de pesticidas sobre o SRAA
(MÜLLER-RIBEIRO et al., 2010). Num modelo de intoxicação aguda por outro OP,
mevinfos, foi demostrando um aumento da expressão de receptores de angiotensina
I (AT I) e AT II no RVLM, o que parece mediar um estresse oxidativo e nitrosativo
associado a intoxicação (LI et al., 2013). Aumento da atividade da enzima
84
conversora de angiotensina (ECA) também foi demonstrado em ratos expostos
subcronicamente a um composto OP (SARKAR; MOHANAKUMAR; CHOWDHURY,
2000). Em contrapartida, o uso de um inibidor da ECA, captopril, em ratos
intoxicados cronicamente com diazinon, reduziu o estresse oxidativo associado a
exposição crônica a esse composto (KARIMANI, 2018). Desta forma, diversas
evidências experimentais apontam para uma participação do SRAA na mediação
dos efeitos induzidos pela intoxicação por OP. É possível assim, que o incremento
na faixa de muito baixa frequência do espectro possa estar associado a um potencial
efeito da exposição intermitente sobre a regulação do SRAA. Apesar de não
podermos assegurar a existência de alteração autonômica, baseada somente em
nossos dados da análise espectral, a tendência de aumento da razão LF/HF e o
aumento observado no componente VLF sinalizam um risco associado a uma
exposição repetida por esses compostos.
Diferentes efeitos sobre a função quimio e barorreflexa foram observados para
animais expostos ao clorpirifós pelo período de 4 e 12 semanas. O tratamento com
CPF não promoveu alterações significativas sobre a resposta pressora do
quimiorreflexo, mas promoveu um prejuízo da resposta bradicárdica nos dois
períodos de tratamento. Já sobre a função barorreflexa, a exposição as diferentes
doses de CPF promoveram um prejuízo do ganho barorreflexo nos animais expostos
por 4 semanas nas duas doses testadas, sem alterar o ganho dos animais expostos
a este agente com um maior intervalo de tempo, sugerindo que neste regime de
exposição há menor dano ou mesmo maior possibilidade de recuperação da função
barorreflexa. Em contrapartida, quando avaliado o índice de efetividade barorreflexa
(BEI), constatou-se que somente os animais intoxicados com CPF na dose de 7
mg/kg por 4 semanas apresentaram um prejuízo em relação aos controles.
Estudos anteriores de nosso grupo mostraram prejuízo nas respostas quimiorreflexa
e/ou barorreflexa frente a exposição aguda aos OF MTF (MARETTO et al., 2012) e
CPF (CUNHA et al., 2018). Em relação a resposta bradicárdica do quimiorreflexo, o
presente resultado corrobora achados prévios do nosso grupo frente a exposição
aguda, onde foi observado um prejuízo bradicárdico após exposição a dois
diferentes OF. Contudo, os resultados encontrados para a resposta pressora diferem
dos relatos de Cunha e colaboradores (2018), que observaram prejuízo neste
componente da resposta reflexa ao intoxicar animais com uma dose subletal aguda
85
de CPF. Já Maretto e colaboradores (2012) não observaram alteração da resposta
pressora quimiorreflexa após a exposição aguda ao MTF. Além dos estudos
mencionados envolvendo exposição aguda a OF e avaliação dos reflexos neurais
envolvidos na regulação cardiovascular, não há estudos voltados a avaliação dos
efeitos exercidos pela exposição repetida a esses compostos sobre a modulação
reflexa cardiovascular, tornando difícil contrastar os resultados obtidos. Todavia, as
diferenças observadas sobre a resposta pressora quimiorreflexa poderiam ser
decorrentes de um efeito diferenciado sobre a vasculatura exercido por uma
exposição crônica. De fato, um estudo demonstrou que animais expostos de forma
subcrônica ao metidation, um outro OF, apresentaram danos na parede de vasos
aórticos (YAVUZ et al. 2005). Além disso, Guvenc Tuna e colaboradores (2011)
observaram que a exposição crônica de ratos a baixas doses de CPF promoveu uma
diminuição da rigidez e do tônus da aorta, o que os autores sugerem estar
relacionado com a capacidade de OF fragmentarem fibras colágenas e elastina na
parede aórtica de ratos (GUVENC TUNA et al., 2011). Nossos dados não indicaram
aumento ou redução na resposta pressora quimiorreflexa para as doses e
frequências de exposição adotadas, mas é possível que as diferenças observadas
sobre esse parâmetro numa exposição aguda e crônica, sejam devidas a efeitos
diferenciados sobre a vasculatura.
Como já mencionado, o quimiorreflexo promove mudanças tanto na via simpática
quanto parassimpática do sistema autônomo (THOMAS, 2011; SALMAN, 2016),
portanto um prejuízo bradicárdico após exposição ao CPF poderia estar relacionado
a um efeito destes agentes sobre o componente parassimpático. Isso é reforçado
pelo fato de que, além da inibição da colinesterase, com consequente acúmulo de
ACh nas sinapses colinérgicas, há evidências da ligação direta do CPF (oxon) em
receptor muscarínico do tipo M2 (BOMSER; CASIDA, 2001), o que poderia
representar um mecanismo adicional de toxicidade colinérgica exercida por este
composto, contribuindo assim para o prejuízo bradicárdico encontrado.
Alteração da modulação autonômica simpática também não pode ser descartada
uma vez que o prejuízo observado na função barorreflexa espontânea poderia
sinalizar o envolvimento de ambos componentes. Cunha e colaboradores (2018)
também observaram prejuízo na função barorreflexa frente a exposição aguda ao
CPF, de forma semelhante aos nossos achados. Esse reflexo é ativado a momento
86
a momento, em condições fisiológicas, para controlar a PA (LA ROVERE, PINNA &
RACZAK et al., 2008; SALMAN, 2016), portanto danos ao seu funcionamento podem
alterar de maneira importante o equilíbrio hemodinâmico. É importante ressaltar que
o prejuízo sobre a função barorreflexa só foi observado frente a exposição ao
mesmo número de doses, porém num menor intervalo de tempo (4 semanas). Isso
pode sinalizar um aspecto importante na preservação da função deste reflexo numa
exposição repetida a esses compostos. Mesmo que o devido cuidado deva ser
tomado ao se fazer extrapolação de dados do campo experimental para a clínica,
nossos dados sugerem que um intervalo maior entre as exposições parece produzir
um menor prejuízo sobre as funções avaliadas, o que pode sinalizar um aspecto
importante quando transposto para a exposição humana.
Em casos de intoxicação aguda por OF, a insuficiência respiratória é responsável
por uma parcela considerável de casos de mortes (CAREY; DUNN; GASPARI,
2013). Em nosso estudo, analisamos os efeitos da exposição crônica ao CPF tanto
sobre a resposta taquipneica do quimiorreflexo, quanto sobre os valores basais de
frequência respiratória (fR), volume corrente (VT) e volume minuto (VE).
A resposta taquipneica do quimiorreflexo não foi alterada pela exposição ao CPF
nos dois períodos de tratamento. De forma semelhante, os valores basais de fR dos
animais intoxicados não diferiram dos animais controle. A exposição ao CPF pelos
dois períodos de tratamento, no entanto, promoveu um aumento no VT nos animais
intoxicados, enquanto que sobre o VE, somente a exposição pelo período de 4
semanas produziu uma diferença estatisticamente significante.
Houzé e colaboradores (2010) avaliaram a intoxicação aguda de animais com o OF
dietilparaoxon sobre a função respiratória. Neste estudo, a exposição ao
dietilparaoxon promoveu um aumento no VT, no tempo de expiração, além de uma
redução da fR (HOUZÉ et al., 2010). Gaspari e Paydarfar (2011) mostraram num
modelo in vitro para avaliação da função cardiorespiratória que intoxicação aguda
com diclorvós, um OF, promoveu diminuição na fR , no VT, além de culminar com o
surgimento de apnéia (GASPARI; PAYDARFAR, 2011). Dados de nosso laboratório
envolvendo experimentos in vivo e in vitro em animais intoxicados agudamente com
CPF, mostraram resultado controversos em ambas análises para o parâmetro
respiratório. Enquanto que não foram observadas alterações nos valores basais de
87
VT e VE no modelo in vivo, o modelo in vitro, por outro lado, apresentou alterações
nos parâmetros da amplitude de disparo do nervo frênico, indicando um possível
prejuízo na capacidade inspiratória. Além disso, foi observado uma menor fR basal
para os animais intoxicados com CPF, contudo, a preparação in vitro não mostrou
alterações em relação a frequência de disparo do nervo frênico. Observou-se ainda
um prejuízo na resposta taquipneica após ativação do quimiorreflexo sem, contudo,
observar alterações no modelo in vitro (FELIPPE, 2017). Em outro estudo, Darwiche
e colaboradores (2018) mostraram em ratos jovens e adultos, que a intoxicação
crônica com CPF durante a gestação e durante a fase pós-nascimento, resultou em
aumento do número de episódios de apneias durante o sono, assim como do tempo
expiratório e do VT na fase adulta (DARWICHE et al., 2018).
Circuitos colinérgicos tem um papel chave no controle respiratório central (CAREY,
DUNN & GASPARI, 2013). Tem sido demonstrado que aumentos na concentração
de ACh pela exposição a inibidores reversíveis da AChE, em regiões do tronco
encefálico modulando a função respiratória, promovem um aumento na atividade
respiratória nos animais expostos (SHAO; FELDMAN, 2005). Contudo, numa
intoxicação por OF, é possível que os neurônios responsáveis pela manutenção da
função respiratória possam perder a capacidade de resposta (GASPARI;
PAYDARFAR, 2011). De fato, evidências sugerem que as alterações respiratórias
observadas em ratos intoxicados com paraoxon, um OF, parecem ser resultado de
alterações na sinalização muscarínica no SNC (HOUZE et al., 2008).
É possível que as mudanças respiratórias observadas em nosso estudo sejam
resultado de acúmulo de ACh tanto em nível central, quanto periférico. As evidências
da literatura, juntamente como os nossos dados mostram ainda que, a exposição
tanto aguda quanto crônica a compostos organofosforados promove alterações
importantes no plano respiratório, o que pode contribuir para a mortalidade numa
intoxicação aguda e para o desenvolvimento de doenças crônicas numa exposição
repetida. Todavia, de forma semelhante aos efeitos observados sobre os reflexos
cardiovasculares, maiores intervalos entre a exposição parecem promover um menor
prejuízo sobre a função respiratória.
88
Conclusão
89
6. CONCLUSÃO
A exposição crônica a baixas doses do inseticida clorpirifós (CPF) promoveu um
prejuízo caracterizado por inibição da resposta bradicárdica do quimiorreflexo,
alterações significativas na função respiratória basal e na função barorreflexa, além
de inibição significativa da atividade das enzimas butirilcolinesterase (BuChE) e da
acetilcolinesterase (AChE) no tronco encefálico. Tais prejuízos podem estar
relacionados a um acúmulo de acetilcolina a nível central e periférico. Além disso, a
manipulação do regime de exposição com diferentes doses e tempo de exposição
ao CPF influenciou os resultados obtidos. Constatamos que uma menor dose ou um
maior intervalo entre as exposições parecem contribuir para um menor prejuízo
frente a intoxicação com CPF, o que do ponto de vista clínico torna-se extremamente
importante, uma vez que em decorrência da sua grande utilização mundial, o
respeito aos limites e intervalos de exposição são fundamentais para segurança
frente a exposição a estes compostos.
90
Referências
91
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDOU, H. M.; EL MAZOUDY, R. H. Oxidative damage, hyperlipidemia and histological alterations of cardiac and skeletal muscles induced by different doses of diazinon in female rats. Journal of Hazardous Materials, v. 182, n. 1–3, p. 273–278, 2010.
ACHARYA, U. R. et al. Heart rate variability: A review. Medical and Biological Engineering and Computing, v. 44, p. 1031–1051 DOI, 2006.
ADAPAR. AGÊNCIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA DO PARANÁAGROFIT - Ministério da Agricultura, pecuária e abastecimento, 2017. Disponível em: <http://www.adapar.pr.gov.br/arquivos/File/defis/DFI/Bulas/Inseticidas/lorsban480br260218.pdf>. Acesso em: 24 jul. 2018
AKSELROD, S. et al. Power Spectrum Analysis of Heart Rate Fluctuation: A Quantitative. Science (New York, N.Y.), v. 213, p. 220–222, 1981.
ALBERS, J. W. et al. The effects of occupational exposure to chlorpyrifos on the peripheral nervous system: a prospective cohort study. Occup Environ Med, v. 61, n. 201–211, p. 201–212, 2004.
ALINEJAD, S. et al. A narrative review of acute adult poisoning in Iran. Iranian Journal of Medical Sciences, v. 42, n. 4, p. 327–346, 2017.
ANTHON, A. A.; CAMPAÑA-SALCIDO, A. D. Chlorpyrifos induces hypertension in rats. Journal of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, v. 3, n. 12, p. 304–308, 2 nov. 2011.
ARAÚJO, A. J. DE et al. Exposição múltipla a agrotóxicos e efeitos à saúde: estudo transversal em amostra de 102 trabalhadores rurais, Nova Friburgo, RJ. Ciência & Saúde Coletiva, v. 12, n. 1, p. 115–130, mar. 2007.
AURBEK, N. et al. Suitability of human butyrylcholinesterase as therapeutic marker and pseudo catalytic scavenger in organophosphate poisoning : A kinetic analysis. Toxicology, v. 259, p. 133–139, 2009.
BARROS, R. C. H. et al. Cardiovascular responses to chemoreflex activation with potassium cyanide or hypoxic hypoxia in awake rats. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical, v. 97, n. 2, p. 110–115, 2002.
BAŞ, H.; KALENDER, Y. Chlorpyrifos induced cardiotoxicity in rats and the protective role of quercetin and catechin. Gazi University Journal of Science, v. 24, n. 3, p. 385–395, 2011.
BASAURE, P. et al. Two cholinesterase inhibitors trigger dissimilar effects on behavior and body weight in C57BL/6 mice: The case of chlorpyrifos and rivastigmine. Behavioural Brain Research, v. 318, p. 1–11, 2017.
BASELLI, G. et al. Spectral and cross-spectral analysis of heart rate and arterial blood pressure variability signals. Computers and Biomedical Research, v. 19, p. 520–534, 1986.
BAYER S.A. Hamidop® 600 - Metamidofós. Disponível em: <http://www.adapar.pr.gov.br/arquivos/File/defis/DFI/Bulas/Inseticidas/HAMIDOP_600.pdf>. Acesso em: 24 jul. 2018.
92
BERTINIERI, G. et al. A new approach to analysis of the arterial baroreflex . J Hypertens Suppl., v. 3, n. 3, p. 79–81, 1985.
BIAGGIONI, I. et al. Baroreflex Failure in a Patient with Central Nervous System Lesions Involving the Nucleus Tractus Solitarii. Hypertension, v. 23, n. 4, p. 491–495, 1994.
BOCHNER, R. Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas SINITOX e as intoxicações humanas por agrotóxicos no Brasil. Ciência & Saúde Coletiva, v. 12, n. 1, p. 73–89, mar. 2007.
BOMBARDI, L. M. Agrotóxicos e agronegócio: arcaico e moderno se fundem no campo brasileiro. p. 1–13, 2012.
BOMSER, J. A.; CASIDA, J. E. Diethylphosphorylation of rat cardiac M2 muscarinic receptor by chlorpyrifos oxon in vitro. Toxicology letters, v. 119, n. 1, p. 21–6, 3 fev. 2001.
BONO, G. F. et al. Butyrylcholinesterase: K variant, plasma activity, molecular forms and rivastigmine treatment in Alzheimer’s disease in a Southern Brazilian population. Neurochemistry International, v. 81, p. 57–62, 2015.
BRASIL. NR 7 - Programa de controle médico de saúde ocupacionalPortaria GM n.o 3.214, de 08 de junho de 1978, 1978. Disponível em: <http://trabalho.gov.br/images/Documentos/SST/NR/NR7.pdf>
BRASIL. Lei n° 7.802, de 11 de julho de 1989. Dispõe sobre agrotóxicos, seus componentes e afinsDiário oficial da uniãoBrasília, DF, 12 jul. 1989. Disponível em: <https://www.jusbrasil.com.br/diarios/3595038/pg-3-secao-1-diario-oficial-da-uniao-dou-de-12-07-1989/pdfView>. Acesso em: 7 maio. 2014
BRASIL. Agrotóxicos - Ministério do Meio Ambiente. Disponível em: <http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/leis/L7802.htm>. Acesso em: 20 maio. 2016a.
BRASIL. Relatório Nacional de Vigilância em Saúde de Populações Expostas a Agrotóxicos. 1a ed. Brasília, DF: [s.n.].
BUCKLEY, N. et al. Oximes for acute organophosphate pesticide poisoning ( Review ). THE COCHRANE COLLABORATION. Published by JohnWiley & Sons, Ltd., n. 2, 2011.
CALORE, E. E.; PEREZ, N. M.; HERMAN, M. M. Morphometric studies of cardiac myocytes of rats chronically treated with an organophosphate. Ecotoxicology and environmental safety, v. 66, n. 3, p. 447–50, mar. 2007.
CAMPAGNOLE-SANTOS, M. J.; HAIBARA, A. S. Reflexos cardiovasculares e hipertensão arterial. Revista Brasileira de Hipertensão, v. 8, n. 1, p. 30–40, 2001.
CAREY, J. L.; DUNN, C.; GASPARI, R. J. Central respiratory failure during acute organophosphate poisoning. Respiratory Physiology and Neurobiology, v. 189, n. 2, p. 403–410, 2013.
CARVALHO, C. R. R. DE; JUNIOR, C. T.; FRANCA, S. A. III Consenso Brasileiro de Ventilação Mecânica Ventilação mecânica: princípios, análise gráfica e modalidades ventilatórias. Jornal Brasileiro de Pneumologia, v. 33, n. 2, p. 54–70, 2007.
CERUTTI, C. et al. Autonomic nervous system and cardiovascular variability in rats: a spectral analysis approach. Am J Physiol Heart Circ Physiol, v. 261, n. 4 Pt 2, p. H1292-9, 1991.
93
CHOWDHARY, S.; BHATTACHARYYA, R.; BANERJEE, D. Acute organophosphorus poisoning. Clinica Chimica Acta, v. 431, p. 66–76, 2014.
CRESTANI, C. C. et al. Role of the bed nucleus of the stria terminalis in the cardiovascular responses to acute restraint stress in rats. Stress, v. 12, n. 3, p. 268–78, maio 2009.
CUNHA, A. F. et al. Neuroreflex control of cardiovascular function is impaired after acute poisoning with chlorpyrifos, an organophosphorus insecticide: Possible short and long term clinical implications. Toxicology, v. 398–399, n. November 2017, p. 13–22, 2018.
DAMPNEY, R. A. L. et al. Cardiovascular effects of angiotensin II in the rostral ventrolateral medulla: the push–pull hypothesis. Curr Hypertens Rep, v. 9, n. 3, p. 222–7, 2007.
DARWICHE, W. et al. Impact of chronic exposure to the pesticide chlorpyrifos on respiratory parameters and sleep apnea in juvenile and adult rats. PLoS ONE, v. 13, n. 1, p. 1–12, 2018.
DAVISSON, R. L. Physiological genomic analysis of the brain renin-angiotensin system. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology, v. 285, n. 3, p. R498-511, 2003.
DEBOER, R. W.; KAREMAKER, J. M.; STRACKEE, J. Hemodynamic fluctuations and baroreflex sensitivity in humans: a beat-to-beat model. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, v. 253, n. 3, p. H680–H689, 1987.
DELGADO, I. F.; PAUMGARTTEN, F. J. R. Intoxicações e uso de pesticidas por agricultores do Município de Paty do Alferes, Rio de Janeiro, Brasil. Cadernos de Saúde Pública, v. 20, n. 1, p. 180–186, fev. 2004.
DI RIENZO, M. et al. Baroreflex effectiveness index : an additional measure of baroreflex control of heart rate in daily life. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol, p. 744–751, 2001.
DIAS DA SILVA, V. J. et al. Intravenous amiodarone modifies autonomic balance and increases baroreflex sensitivity in conscious rats. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical, v. 95, n. 1–2, p. 88–96, 2002.
DIETZ, A. A.; RUBINSTEIN, H. M.; LUBRANO, T. Colorimetric determination of serum cholinesterase and its genetic variants by the propionylthiocholine-dithiobis(nitrobenzoic acid)procedure. Clinical chemistry, v. 19, n. 11, p. 1309–13, nov. 1973.
DO NASCIMENTO, C. P. et al. Methamidophos, an Organophosphorus Insecticide, Induces Pro-aggressive Behaviour in Mice. Neurotoxicity Research, v. 32, n. 3, p. 398–408, 2017.
EATON, D.; KLAASSEN, C. PRINCIPLES OF TOXICOLOGY. 6a ed. [s.l: s.n.], 2001.
EATON, D. L. et al. Review of the toxicology of chlorpyrifos with an emphasis on human exposure and neurodevelopment. Critical reviews in toxicology, v. 38 Suppl 2, p. 1–125, jan. 2008.
ECETOC. Organophosphorus Pesticides and Long-term Effects on the Nervous System. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, n. 75, p. 1–111, 1998.
94
EDDLESTON. Patterns and problems of deliberate self-poisoning in the developing world. Qjm, v. 93, n. 11, p. 715–731, 2000.
EDDLESTON, M. et al. Management of acute organophosphorus pesticide poisoning. Lancet, v. 371, p. 597–607, 2008.
ELLMAN, G. L. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activityBiochemical Pharmacology, 1961. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-33644811612&partnerID=40&md5=326c7a2432a68867ad9ff71c28a4cc30>
EMBRAPA. Inseticidas registrados para o controle de insetos praga na cultura do milho – Setembro/2009. Disponível em: <www.cnpms.embrapa.br/publicacoes/milho_6_ed/inseticida.html%0ADichelops>. Acesso em: 2 jun. 2016.
FARIA, N. M. X.; FASSA, A. G.; FACCHINI, L. A. Intoxicação por agrotóxicos no Brasil: os sistemas oficiais de informação e desafios para realização de estudos epidemiológicos. Ciência & Saúde Coletiva, v. 12, n. 1, p. 25–38, mar. 2007.
FAZAN, R. et al. Changes in autonomic control of the cardiovascular system in the Wistar audiogenic rat (WAR) strain. Epilepsy and Behavior, v. 22, p. 666–670, 2011.
FAZAN; SILVA, V. J. D. DA. Principais fatores que interferem nas variações da pressão arterial e do intervalo cardíaco. Rev Bras Hipertens, v. 7, n. 2, p. 180, 2000.
FELIPPE, I. S. A. Avaliação in vitro e in vivo dos efeitos da intoxicação aguda com o inseticida organofosforado, clorpirifós, e da eficácia do tratamento farmacológico empregado na intoxicação sobre a modulação cardiorrespiratória tônica e reflexa. [s.l.] UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO, 2017.
FLETCHER, E. C. et al. Repetitive, episodic hypoxia causes diurnal elevation of blood pressure in rats. Hypertension, v. 19, n. 6 Pt 1, p. 555–61, 1992.
FRANCHINI, K. G.; KRIEGER, E. M. Cardiovascular responses of conscious rats to carotid body chemoreceptor stimulation by intravenous KCN. Journal of the autonomic nervous system, v. 42, n. 1, p. 63–9, jan. 1993.
FREIRE, C.; KOIFMAN, S. Pesticides, depression and suicide: A systematic review of the epidemiological evidence. International Journal of Hygiene and Environmental Health, v. 216, n. 4, p. 445–460, 2013.
GASPARI, R. J.; PAYDARFAR, D. Dichlorvos-induced central apnea: Effects of selective brainstem exposure in the rat. NeuroToxicology, v. 32, n. 2, p. 206–214, 2011.
GEORGIADIS, N. et al. Pesticides and cardiotoxicity. Where do we stand? Nikolaos. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 353, n. February, p. 1–14, 2018.
GOLIASCH, G. et al. Butyrylcholinesterase Activity Predicts Long-Term Survival in Patients with Coronary Artery Disease. Clinical Chemistry, v. 58, n. 6, p. 1055–1058, 2012.
GOMEZ, R. S.; GOMEZ, M. V; PRADO, M. A. The effect of isoflurane on the release of [(3)H]-acetylcholine from rat brain cortical slices. Brain research bulletin, v. 52, n.
95
4, p. 263–7, 1 jul. 2000.
GRASSI, G. et al. Sympathetic Activation and Loss of Reflex Sympathetic Control in Mild Congestive Heart Failure. Circulation, v. 92, p. 1–13, 1995.
GUVENC TUNA, B. et al. Effects of organophosphate insecticides on mechanical properties of rat aorta. Physiological research / Academia Scientiarum Bohemoslovaca, v. 60, n. 1, p. 39–46, jan. 2011.
GUYENET, P. The sympathetic control of blood pressure. NATURE REVIEWS | NEUROSCIENCE, v. 7, 2006.
HOUZE, P. et al. Ventilatory effects of low-dose paraoxon result from central muscarinic effects. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 233, n. 2, p. 186–192, 2008.
HOUZÉ, P. et al. Pharmacokinetics and toxicodynamics of pralidoxime effects on paraoxon-induced respiratory toxicity. Toxicological Sciences, v. 116, n. 2, p. 660–672, 2010.
HOWARD, M. D. et al. Comparative effects of oral chlorpyrifos exposure on cholinesterase activity and muscarinic receptor binding in neonatal and adult rat heart. Toxicology, v. 238, n. 2–3, p. 157–65, 5 set. 2007.
IBAMA. HISTORICO DE CONSUMO DE AGROTÓXICOS ENTRE 2000-2016 NO BRASIL.
JOAQUIM, L. F. et al. Enhanced heart rate variability and baroreflex index after stress and cholinesterase inhibition in mice. AJP: Heart and Circulatory Physiology, v. 287, n. 1, p. H251–H257, 2004.
JOHN, H. et al. Fatal sarin poisoning in Syria 2013: forensic verification within an international laboratory network. Forensic Toxicology, v. 36, n. 1, p. 61–71, 2018.
JØRS, E. et al. Occupational pesticide intoxications among farmers in Bolivia: a cross-sectional study. Environmental Health: A Global Access Science Source, v. 5, n. 10, p. 1–9, 2006.
JUDGE, S. J. et al. Mechanism for the acute effects of organophosphate pesticides on the adult 5-HT system. Chemico-Biological Interactions, v. 245, p. 82–89, 2016.
KALENDER, Y. et al. Protective effects of catechin and quercetin on antioxidant status, lipid peroxidation and testis-histoarchitecture induced by chlorpyrifos in male rats. Environmental toxicology and pharmacology, v. 33, n. 2, p. 141–8, mar. 2012.
KAMEL, F. et al. Neurologic symptoms in licensed private pesticide applicators in the agricultural health study. Environmental Health Perspectives, v. 113, n. 7, p. 877–882, 2005.
KARA, T.; NARKIEWICZ, K.; SOMERS, V. K. Chemoreflexes – physiology and clinical implications. Acta Physiol Scand, v. 177, p. 377–384, 2003.
KARIMANI, A. Captopril Attenuates Diazinon-Induced Oxidative Stress : A Subchronic Study in Rats. v. 43, n. 5, 2018.
KATZ, J. M.; WINTER, C. K. Comparison of pesticide exposure from consumption of domestic and imported fruits and vegetables. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research
96
Association, v. 47, n. 2, p. 335–8, fev. 2009.
KAZEMI, M. et al. Organophosphate pesticides: A general review. Agricultural Science Research Journals, v. 2, n. 9, p. 512–522, 2012.
KIM, Y.; JEONG, J. Heart rate variability analysis in acute poisoning by cholinesterase inhibitors. Signa Vitae - A Journal In Intensive Care And Emergency Medicine, v. 13, n. 2, p. 33–40, 2017.
KING, A. M.; AARON, C. K. Organophosphate and carbamate poisoning. Emergency medicine clinics of North America, v. 33, n. 1, p. 133–51, fev. 2015.
LA ROVERE, M. T.; PINNA, G. D.; RACZAK, G. Baroreflex sensitivity: measurement and clinical implications. Annals of noninvasive electrocardiology, v. 13, n. 2, p. 191–207, 2008.
LARSEN, R.; THORP, A.; SCHLAICH, M. Regulation of the sympathetic nervous system by the kidney. Current Opinion in Nephrology and Hypertension, v. 23, n. 1, p. 61–68, 2014.
LASSITER, T. L. et al. Automated measurement of acetylcholinesterase activity in rat peripheral tissues. Toxicology, v. 186, n. 3, p. 241–253, 2003.
LI, F. C. H. et al. Transition from oxidative stress to nitrosative stress in rostral ventrolateral medulla underlies fatal intoxication induced by organophosphate mevinphos. Toxicological Sciences, v. 135, n. 1, p. 202–217, 2013.
LOMBARDI, F. Clinical implications of present physiological understanding of HRV components. Cardiac Electrophysiology Review, v. 6, n. 3, p. 245–249, 2002.
LYU, P. C. et al. Letter to the Editor Case Control Study of Impulsivity , Aggression , Pesticide Exposure and Suicide Attempts Using Pesticides among Farmers *. Biomed Environ Sci, v. 31, n. 5, p. 242–246, 2018.
MACENTE, L. B.; DOS SANTOS, E. G.; ZANDONADE, E. Tentativas de suicídio e suicídio em município de cultura Pomerana no interior do estado do Espírito Santo. Jornal Brasileiro de Psiquiatria, v. 58, n. 4, p. 238–244, 2009.
MADWED, J. B. et al. Low-frequency oscillations in arterial pressure and heart rate: a simple computer model. The American journal of physiology, v. 256, n. 6 Pt 2, p. H1573–H1579, 1989.
MARETTO, G. X. et al. Acute exposure to the insecticide O,S-dimethyl phosphoramidothioate (methamidophos) leads to impairment of cardiovascular reflexes in rats. Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 80, p. 203–207, jun. 2012.
MARQUES, G. L. M. et al. Method validation for simultaneous determination of atropine, pralidoxime and 12 organophosphorus compounds in blood samples by means of high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v. 1097–1098, n. June, p. 44–53, 2018.
MARRS, T. C. Organophosphate poisoning. Pharmacology & therapeutics, v. 58, n. 1, p. 51–66, jan. 1993.
MELNYK, L. J. et al. Prioritization of pesticides based on daily dietary exposure potential as determined from the SHEDS model. Food and Chemical Toxicology, v.
97
96, p. 167–173, 2016.
MENEZES, A. D. S.; MOREIRA, H. G.; DAHER, M. T. Análise da variabilidade da freqüência cardíaca em pacientes hipertensos, antes e depois do tratamento com inibidores da enzima conversora da angiotensina II. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v. 83, n. 2, p. 165–168, 2004.
MEW, E. J. et al. The global burden of fatal self-poisoning with pesticides 2006-15: Systematic review. Journal of Affective Disorders, v. 219, n. May, p. 93–104, 2017.
MIRAJKAR, N.; POPE, C. N. In vitro sensitivity of cholinesterases and [3H]oxotremorine-M binding in heart and brain of adult and aging rats to organophosphorus anticholinesterases. Biochemical pharmacology, v. 76, n. 8, p. 1047–58, 15 out. 2008.
MORTOLA, J.; FRAPPELL, P. Measurements of air ventilation in small vertebrates. Respiratory Physiology and Neurobiology, v. 186, n. 2, p. 197–205, 2013.
MORTOLA, J. P.; FRAPPELL, P. B. On the barometric method for measurements of ventilation, and its use in small animals. Canadian journal of physiology and pharmacology, v. 76, n. 10–11, p. 937–944, 1998.
MOSTAFALOU, S.; ABDOLLAHI, M. Pesticides and human chronic diseases: evidences, mechanisms, and perspectives. Toxicology and applied pharmacology, v. 268, n. 2, p. 157–77, 15 abr. 2013.
MÜLLER-RIBEIRO, F. C. D. F. et al. Evidence that central action of paraquat interferes in the dipsogenic effect of Ang II. NeuroToxicology, v. 31, n. 3, p. 305–309, 2010.
MUNIZ, J. F. et al. Biomarkers of oxidative stress and DNA damage in agricultural workers: A pilot study. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 227, n. 1, p. 97–107, 2008.
NARKIEWICZ, K. et al. Contribution of tonic chemoreflex activation to sympathetic activity and blood pressure in patients with obstructive sleep apnea. Circulation, v. 97, n. 10, p. 943–945, 1998.
NOBREGA, A. C. L. et al. Enhancement of heart rate variability by cholinergic stimulation with pyridostigmine in healthy subjects. Clinical Autonomic Research, v. 11, n. 1, p. 11–17, 2001.
NOSAKA, S.; YAMAMOTO, T.; YASUNAGA, K. Localization of Vagal Cardioinhibitory within Rat Brain Stem Pregang I ionic Neurons. J. COMP. NEUR, p. 79–92, 1979.
NOSTRANDT, A. C.; PADILLA, S.; MOSER, V. C. The relationship of oral chlorpyrifos effects on behavior, cholinesterase inhibition, and muscarinic receptor density in rat. Pharmacology, biochemistry, and behavior, v. 58, n. 1, p. 15–23, set. 1997.
O’MALLEY, M. Clinical evaluation of pesticide exposure and poisoningsThe Lancet, 1997. Disponível em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673696072224>
OLIVEIRA, L. R. et al. Induction of chronic non-inflammatory widespread pain increases cardiac sympathetic modulation in rats. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical, v. 167, n. 1–2, p. 45–49, 2012.
98
OOSTING, J.; STRUIJKER-BOUDIER, H.; JANSSEN, B. Validation of a continuous baroreceptor reflex sensitivity index calculated from spontaneous fluctuations of blood pressure and pulse interval in rats. Journal of Hypertension, v. 15, n. 4, p. 391–399, 1997.
OPAS; OMS. Manual De Vigilância Da Saúde De Populações Expostas a AgrotoxicosOrganização Pan-Americana de Saúde. [s.l: s.n.].
PAGANI, M. et al. Power spectral analysis of heart rate and arterial pressure variances as a marker of sympatho-vagal interaction in man and conscious dog. Circulation Res, v. 59, p. 178–193, 1986.
PASTUSZKO, A. Action of barbiturates on activity of acetylcholinesterase from synaptosomal membranes. Neurochemical research, v. 5, n. 7, p. 769–76, jul. 1980.
PAXINOS, G.; WATSON, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Compact 6t ed. [s.l.] Academic Press, 2009.
PELAEZ, V. 2o Seminário Mercado de Agrotóxicos e Regulação. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/content/anvisa+portal/anvisa/sala+de+imprensa/menu+-+noticias+anos/2012+noticias/seminario+volta+a+discutir+mercado+de+agrotoxicos+em+2012>. Acesso em: 9 jun. 2014.
POHANKA, M. Butyrylcholinesterase as a biochemical marker. Bratisl Lek Listy, v. 114, n. 12, p. 726–734, 2013.
RAHEJA, G.; GILL, K. Altered cholinergic metabolism and muscarinic receptor linked second messenger pathways after chronic exposure to dichlorvos in rat brain. Toxicology and Industrial Health, v. 23, n. 1, p. 25–37, 2007.
RAISMAN, G.; COWAN, W. M.; POWELL, T. P. An experimental analysis of the efferent projection of the hippocampus. Brain : a journal of neurology, v. 89, n. 1, p. 83–108, mar. 1966.
RAZWIEDANI, L.; RAUTENBACH, P. Epidemiology of Organophosphate Poisoning in the Tshwane District of South Africa. Environmental Health Insights, v. 11, n. 0, p. 10–13, 2017.
RECENA, M. et al. Pesticides exposure in Culturama, Brazil--knowledge, attitudes, and practices. Environmental research, v. 102, n. 2, p. 230–6, out. 2006.
RECENA, M. C. P.; PIRES, D. X.; CALDAS, E. D. Acute poisoning with pesticides in the state of Mato Grosso do Sul, Brazil. The Science of the total environment, v. 357, n. 1–3, p. 88–95, 15 mar. 2006.
RISHER, J. F.; NAVARRO, H. A. Toxicological Profile for ChlorpyrifosU.S. Departament of Health and Human Services, 1997.
ROLDÁN-TAPIA, L.; PARRÓN, T.; SÁNCHEZ-SANTED, F. Neuropsychological effects of long-term exposure to organophosphate pesticides. Neurotoxicology and Teratology, v. 27, n. 2, p. 259–266, 2005.
SÁ, J. C. F. et al. Variabilidade da frequência cardíaca como método de avaliação do sistema nervoso autônomo na síndrome dos ovários policísticos. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, v. 35, n. 9, p. 421–426, 2013.
SALMAN, I. M. Major Autonomic Neuroregulatory Pathways Underlying Short-
99
and Long-Term Control of Cardiovascular FunctionCurrent Hypertension Reports, mar. 2016. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26838031>. Acesso em: 16 jun. 2016
SARKAR, R.; MOHANAKUMAR, K. P.; CHOWDHURY, M. Effects of an organophosphate pesticide , quinalphos , on the hypothalamo – pituitary – gonadal axis in adult male rats. Journal of Reproduction and Fertility, p. 29–38, 2000.
SATO, M. A. et al. Lesions of the Commissural Nucleus of the Solitary Tract Reduce Arterial Pressure in Spontaneously Hypertensive Rats. Hypertension, v. 38, n. 2, p. 560–564, 2001.
SAÚDE, M. DA. Relatório Nacional de Vigilância em Saúde de Populações Expostas a Agrotóxicos: Agrotóxicos na ótica do Sistema Único de Saúde (M. da Saúde, Ed.). Brasilia, DF: [s.n.]. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/agrotoxicos_otica_sistema_unico_saude_v1_t.1.pdf>.
SAVY, C. Y. et al. Low-level repeated exposure to diazinon and chlorpyrifos decrease anxiety-like behaviour in adult male rats as assessed by marble burying behaviour. Neurotoxicology, v. 50, p. 149–56, set. 2015.
SENGUPTA, P. The Laboratory Rat : Relating Its Age With Human ’ s. International journal of preventive medicine, v. 4, n. 6, p. 624–630, 2013.
SHAO, X. M.; FELDMAN, J. L. Cholinergic neurotransmission in the preBötzinger Complex modulates excitability of inspiratory neurons and regulates respiratory rhythm. Neuroscience, v. 130, n. 4, p. 1069–81, 2005.
SILVA, J. H. et al. Acetylcholine release induced by the volatile anesthetic sevoflurane in rat brain cortical slices. Cellular and molecular neurobiology, v. 25, n. 5, p. 807–18, ago. 2005.
SIMÕES, M. R. et al. Low-level Chronic Lead Exposure Impairs Neural Control of Blood Pressure and Heart Rate in Rats. Cardiovascular Toxicology, v. 17, n. 2, p. 190–199, 2017.
SINITOX. Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas. Disponível em: <https://sinitox.icict.fiocruz.br/sites/sinitox.icict.fiocruz.br/files//Brasil6_1.pdf>. Acesso em: 9 maio. 2018.
SMITH, E. G.; GORDON, C. J. The effects of chlorpyrifos on blood pressure and temperature regulation in spontaneously hypertensive rats. Basic & clinical pharmacology & toxicology, v. 96, n. 6, p. 503–11, jun. 2005.
SOMERS, V. K.; MARK, A. L.; ABBOUD, F. M. Potentiation of sympathetic nerve responses to hypoxia in borderline hypertensive subjects. Hypertension, v. 11, n. 6 Pt 2, p. 608–612, 1988.
SPYER, K. M.; GOURINE, A. V. Chemosensory pathways in the brainstem controlling cardiorespiratory activity. Philosophical transactions of the Royal Society of London, v. 364, n. 1529, p. 2603–10, 12 set. 2009.
STEFANIDOU, M.; ATHANASELIS, S.; SPILIOPOULOU, H. Butyrylcholinesterase: Biomarker for exposure to organophosphorus insecticides. Internal Medicine Journal, v. 39, n. 1, p. 57–60, 2009.
STEPHENS, R. et al. Neuropsychological effects of long-term exposure to
100
organophosphates in sheep dip. Lancet, v. 345, n. 8958, p. 1135–1139, 1995.
SULZGRUBER, P. et al. Butyrylcholinesterase predicts cardiac mortality in young patients with acute coronary syndrome. PLOS ONE, v. 10, n. 5, p. 1–10, 2015.
SUN, L. et al. Low Serum-Butyrylcholinesterase Activity as a Prognostic Marker of Mortality Associates with Poor Cardiac Function in Acute Myocardial Infarction. Clinical laboratory, v. 62, n. 6, p. 1093–9, 2016.
SURAJUDEEN, Y. A. et al. Oxidative stress indices in Nigerian pesticide applicators and farmers occupationally exposed to organophosphate pesticides. International Journal of Applied and Basic Medical Research, v. 4, p. 37–40, 2014.
TASK FORCE, G. Heart rate variability Standards - Standards of measurement, physiological interpretation, and clinical use. European Heart Journal, v. 17, p. 354–381, 1996.
TERRY, A. V et al. Chronic, intermittent exposure to chlorpyrifos in rats: protracted effects on axonal transport, neurotrophin receptors, cholinergic markers, and information processing. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics, v. 322, n. 3, p. 1117–28, 1 set. 2007.
THOMAS, G. D. Neural control of the circulation. Advances in physiology education, v. 35, n. 1, p. 28–32, mar. 2011.
TRZEBSKI, A. et al. Increased sensitivity of the arterial chemoreceptor drive in young men with mild hypertension. Cardiovascular research, v. 16, p. 163–172, 1982.
VALADÃO, P. A. C. et al. Etomidate evokes synaptic vesicle exocytosis without increasing miniature endplate potentials frequency at the mice neuromuscular junction. Neurochemistry international, v. 63, n. 6, p. 576–582, 15 set. 2013.
VAN RIJN, C. M. et al. Decapitation in rats: Latency to unconsciousness and the “wave of death”. PLoS ONE, v. 6, n. 1, p. e16514, 2011.
VANDERLEI, L. C. M. ; et al. Basic notions of heart rate variability and its clinical applicability. Rev Bras Cir Cardiovasc, v. 24, n. 2, p. 205–217, 2009.
VASQUEZ, E. C. et al. Neural reflex regulation of arterial pressure in pathophysiological conditions : interplay among the baroreflex , the cardiopulmonary reflexes and the chemoreflex. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 30, p. 521–532, 1997.
VERNINO, S. et al. Invited Article: Autonomic ganglia: Target and novel therapeutic tool. Neurology, v. 70, n. 20, p. 1926–1932, 13 maio 2008.
WAKI, H. et al. Dynamic exercise attenuates spontaneous baroreceptor reflex Translation and Integration Experimental Physiology : In humans , it has been reported that dynamic exercise attenuates spontaneous baroreceptor reflex sensitivity. 2003b.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Global status report on noncommunicable diseases 2014. p. 176, 2014.
WU, M. et al. Food Poisoning Due to Methamidophos- Contaminated Vegetables. Clinical Toxicology, v. 39, n. 201, p. 333–336, 2001.
YAN, C. et al. Repeated exposures to chlorpyrifos lead to spatial memory retrieval impairment and motor activity alteration. Neurotoxicology and teratology, v. 34, n.
101
4, p. 442–9, 2012.
YAVUZ, T. et al. Vascular wall damage in rats induced by organophosphorus insecticide methidathion. Toxicology Letters, v. 155, n. 1, p. 59–64, 2005.
YEN, D. H. T. et al. Spectral analysis of systemic arterial pressure and heart rate signals of patients with acute respiratory failure induced by severe organophosphate poisoning. Critical care medicine, v. 28, n. 8, p. 2805–11, ago. 2000.
YEN, D. H. T. et al. Spectral changes in systemic arterial pressure signals during acute mevinphos intoxication in the rat. Shock, v. 15, n. 1, p. 35–41, jan. 2001.
ZAFIROPOULOS, A. et al. Cardiotoxicity in rabbits after a low-level exposure to diazinon, propoxur, and chlorpyrifos. Human & experimental toxicology, v. 33, n. 12, p. 1241–1252, 2014.
ZAKI, N. Evaluation of Profenofos Intoxication In White Rats. Nature and Scienc, v. 10, n. 12, p. 67–77, 2012.
ZHENG, Q. et al. Comparative cholinergic neurotoxicity of oral chlorpyrifos exposures in preweanling and adult rats. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology, v. 55, n. 1, p. 124–132, 2000.
102
Anexo
103
ANEXO
