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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Ivaldo de Jesus Almeida Belém Filho
EFEITOS NEUROCOMPORTAMENTAIS E NO ESTRESSE OXIDATIVO DA EXPOSIÇÃO CONCOMITANTE AO
METILMERCÚRIO E ETANOL EM RATAS DA ADOLESCÊNCIA À FASE ADULTA
Belém – PA
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
EFEITOS NEUROCOMPORTAMENTAIS E NO ESTRESSE OXIDATIVO DA EXPOSIÇÃO CONCOMITANTE AO
METILMERCÚRIO E ETANOL EM RATAS DA ADOLESCÊNCIA À FASE ADULTA
Autor: Ivaldo de Jesus Almeida Belém
Filho
Orientadora: Profa. Dra. Cristiane do
Socorro Ferraz Maia
Co-Orientador: Prof. Dr. Marcelo de
Oliveira Lima
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Belém – PA
2015
Belém Filho, Ivaldo de Jesus Almeida, 1990- Efeitos neurocomportamentais e no estresse oxidativoda exposição concomitante ao metilmercúrio e etanol emratas da adolescência à fase adulta. / Ivaldo de JesusAlmeida Belém Filho. - 2015.
Orientadora: Cristiane do Socorro FerrazMaia; Coorientador: Marcelo de Oliveira Lima. Dissertação (Mestrado) - UniversidadeFederal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde,Programa de Pós-Graduação em CiênciasFarmacêuticas, Belém, 2015.
1. Metilmercúrio. 2. Etanol. 3.Adolescência. 4. Mulheres. 5. Estresseoxidativo. I. Título.
CDD 22. ed. 615.925663
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)Sistema de Bibliotecas da UFPA
FOLHA DE APROVAÇÃO
Ivaldo de Jesus Almeida Belém Filho
Efeitos neurocomportamentais e no estresse oxidativo da exposição concomitante ao metilmercúrio e etanol em ratas da adolescência à fase adulta
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, do Instituto de Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof(a). Dr(a).: Cristiane do Socorro Ferraz Maia
Instituição: UFPA Assinatura: _______________________________________
Prof(a). Dr(a).: Marta Chagas Monteiro
Instituição: UFPA Assinatura: _______________________________________
Prof(a). Dr(a).: Luana Melo Diogo de Queiroz
Instituição: UFPA Assinatura: _______________________________________
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Ivaldo e Córa, pois a todo o momento estão presentes em minha vida e tudo o que faço é devido ao amor, carinho e admiração que tenho por eles.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Ivaldo e Córa Belém, pessoas que me ensinaram a sempre persistir nos meus sonhos e a sempre tentar melhorar como pessoa. Obrigado pela confiança, carinho, amor, dedicação e apoio em todos os meus sonhos.
Aos meus irmãos Cristiane, Izídio, e Izabela por toda a amizade e parceria, por entenderem os meus momentos de ausência nas reuniões familiares e por todo apoio.
A Nala, minha fiel companheira, a qual passou noites comigo enquanto trabalhava.
À profa. Dra. Cristiane Maia, por ter aceito me orientar nesta empreitada e ter confiado este projeto a mim. Obrigado pelo auxílio e desta experiência levo o melhor.
Ao prof. Dr. Marcelo Lima pelo auxílio nesta etapa final do mestrado e que esta parceria ainda gere bons frutos.
Ao prof. Dr. Enéas Fontes e a equipe do LAFICO pelo auxílio nos diversos momentos desta pesquisa.
À profa. Dra. Marta Chagas pelo auxílio inestimável em parte deste projeto, obrigado por ter aberto o seu laboratório a mim e confiado que tudo daria certo.
Aos meus amigos James, Rosana e Mirian, os quais carrego comigo para toda a vida. Nossa amizade de anos só me mostra que escolhi as melhores pessoas para estarem comigo desde a graduação. Nossa amizade é abençoada desde sempre. Olhar pra trás e ver o que passamos e onde já chegamos é motivador. Torço pelo sucesso de vocês. Obrigado!
Aos meus amigos feitos no convívio do laboratório: Diandra, Klaylton e Alana. Muito obrigado por todas as risadas, ajudas, votos de confiança e todo o apoio. Sem vocês não teria chegado até aqui, Minha caminhada que iniciou solitária se tornou muito mais fácil com vocês ao meu lado. Espero que todos os seus planos se concretizem e precisando de ajuda vocês tem um amigo a quem recorrer, assim como eu tenho em vocês.
Ao meu amigo e parceiro de bancada Rafael Quadros, pois metade deste trabalho se deve a você. Que dê tudo certo na sua vida, pois és um cara muito bom e encontrar pessoas dispostas a ajudar é raridade. Obrigado irmão.
Aos meus amigos da turma PPGCF 2014/01, sempre muito solícitos e mesmo que em laboratórios e linhas de pesquisa diferentes nosso convívio sempre foi o melhor. Espero que nossa amizade continue ultrapassando os muros da UFPA.
As estagiárias e ICs: Paula, Mayara e Taiana por toda a ajuda no meu projeto, pelas brincadeiras e pelo respeito em que sempre tiveram comigo. Que o futuro de vocês seja brilhante.
Ao Brunno, Bruno e Ademar, o pouco tempo de convívio foi suficiente para saber que são boas pessoas e que desejo o melhor a vocês.
A doutoranda Andressa Santa Brígida pelo socorro nos momentos de urgência. Sucesso em tudo.
Aos professores do PPGCF/UFPA: Wagner, José Luiz, Fâni, Roseane e aos integrantes de seus laboratórios. O auxilio de vocês também foi fundamental.
Aos professores do ICB/UFPA: Elena Crespo-Lópes e Rafael Rodrigues e os integrantes dos seus laboratórios, obrigado pela ajuda.
Às secretárias do PPGCF Cliciane e Brasília por ajudar em todas as burocracias, sempre tornando tudo mais fácil e ágil.
Aos novos integrantes do LAFICO, que vocês aproveitem a experiência.
A FAPESPA e CAPES pelo auxílio financeiro ao projeto e pessoal.
EPÍGRAFE
A verdadeira coragem é ir atrás de seus sonhos mesmo quando todos dizem que eles são impossíveis.
Cora Coralina
RESUMO
BELÉM FILHO, I. de J. A. Efeitos neurocomportamentais e no estresse oxidativo da exposição concomitante ao metilmercúrio e etanol em ratas da adolescência à fase adulta. 2015, 111 f, Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Pará, Pará, 2015.
O metilmercúrio (MeHg) é um contaminante ambiental que pode produzir danos em muitos sistemas, incluindo o sistema nervoso central em desenvolvimento ou maduro. Outra situação preocupante é o consumo de etanol (EtOH), que tem aumentado na sociedade sendo relacionada com a incidência de distúrbios psicossomáticos. Muitos mecanismos de toxicidade foram descritos para o EtOH e MeHg, no entanto o estresse oxidativo parece ser um mecanismo comum. Adolescentes e o gênero feminino são duas populações em que há a preocupação dos possíveis danos dessas duas substâncias tóxicas, no qual há poucas evidências sobre a sua fragilidade na intoxicação isolada ou em combinação. O objetivo deste trabalho foi investigar os distúrbios comportamentais causadas pela exposição ao EtOH e/ou MeHg na puberdade de ratas que mimetizam a exposição humana e as alterações de parâmetros de estresse oxidativo. Foram utilizadas ratas Wistar que receberam por via oral MeHg (0,04 mg/kg/dia durante 35 dias) e/ou EtOH (3 g/kg/dia durante três dias consecutivos, uma vez por semana, durante 35 dias de tratamento). Após intoxicação, os animais foram avaliados no teste de campo aberto, labirinto em cruz elevado, teste splash, nado forçado e esquiva inibitória. As amostras de sangue total analisadas para o estresse oxidativo foram a capacidade antioxidante equivalente ao Trolox, malondialdeído, nitrato/nitrito, atividade de catalase, atividade da superóxido dismutase e conteúdo de glutationa. Os resultados mostraram que MeHg em doses consideradas seguras e EtOH no padrão de binge iniciado no período da adolescência pode produzir distúrbios na atividade locomotora, emotividade, comportamento tipo anedônico e comprometimento da memória, em associação ou isolados. O EtOH está relacionado com o comportamento tipo ansiedade e MeHg com comportamento tipo depressivo. Na avaliação do estresse, a capacidade antioxidante total foi aumentada pelos ensaios comportamentais. O EtOH promoveu aumento do malondialdeido, aumento da atividade da catalase e da atividade da superóxido dismutase. O MeHg per se não produziu aumento de malondialdeído, porem apresentou uma atividade da catalase muito aumentada, que não foi seguida pela atividade da superóxido dismutase, que estava em níveis normais. Na associação não houve alteração da atividade da catalase, ocorrendo uma redução da atividade da superóxido dismutase. Todos os tratamentos tiveram a produção de nitrito/nitrato reduzida, assim como um aumento do conteúdo de glutationa.
Palavras-chave: Metilmercúrio. Etanol. Adolescência. Mulheres. Comportamento. Estresse oxidativo.
ABSTRACT
BELÉM FILHO, I. de J. A. Neurobehavioral effects and oxidative stress caused by exposure concomitant to methylmercury and ethanol in adolescent rats until adult life. 2015 111 f, Dissertation (Master) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Pará, Pará, 2015.
Methylmercury (MeHg) is an environmental contaminant that can produced damages in many systems, including central nervous mature or in development. The other worrying situation is a consumption of ethanol (EtOH) that is increased in society and is related with disturbs. Many mechanisms of toxicity were described for those compounds; however oxidative stress seems had been a common mechanism. Female gender and adolescents are two populations that have worry about those toxicants and there is little evidence on its fragility in isolated intoxication or in combination. The aim of this work is to investigate behavioral disorders caused by exposition to EtOH and/or MeHg in puberty female rats mimicking the human exposition and the alterations of parameters from oxidative stress. We used Wistar female rats which received: MeHg (0.04 mg/ kg/ day during 35 days) and/or EtOH (3g/kg/day during three consecutive days, once a week during 35 days of treatment). Assayed on open field test, elevated-plus maze, splash test, forced swimming and inhibitory avoidance. Samples of total blood were analyzed for stress oxidative: Trolox equivalent antioxidant capacity, malondialdehyde, nitrate/nitrite, catalases activity, superoxide dismutase activity and glutathione content. The results showed that MeHg at doses considered safe and EtOH in binge pattern started during adolescence may produce disturbances in locomotor activity, emotionality, anhedonic like-behavior and memory impairment in association or isolated. The EtOH is related to the anxiety like-behavior and MeHg with depressive-like behavior. In the evaluation of stress, total antioxidant capacity was increased by behavioral tests. The EtOH promoted increased malondialdehyde, increased activity of catalase and activity of superoxide dismutase. The MeHg per se did not produce increase of malondialdehyde, however presented a greatly increased activity of catalase, which was not followed by the activity of superoxide dismutase, which was at normal levels. At the association there was no change in the catalase activity, causing a reduction in superoxide dismutase activity. All treatments were the production of nitrite / nitrate reduced, and an increase in glutathione content.
Keywords: Methylmercury. Ethanol. Adolescence. Women. Behavior. Oxidative stress.
LISTA DE ILUSTRAÇOES
Figura 1: Ciclo do mercúrio, vias de liberações antropogênicas e naturais, e via de
exposição humana. ................................................................................................... 18
Figura 2: Ciclo celular do estresse oxidativo, vias enzimáticas e não enzimáticas. .. 36
Figura 3: Tratamento experimental com MeHg e EtOH. ........................................... 44
Figura 4: Aparato do campo aberto. .......................................................................... 46
Figura 5:Aparato do labirinto em cruz elevado. ......................................................... 48
Figura 6: Teste splash ............................................................................................... 49
Figura 7: Teste do nado forçado. .............................................................................. 51
Figura 8: Aparato da esquiva inibitória. ..................................................................... 52
Figura 9: Desenho experimental dos testes comportamentais e coleta realizada. .... 63
Figura 10: Dosagem de mercúrio total em pelos de ratas expostas ao metilmercúrio
(MeHg) e MeHg+ etanol (EtOH) da adolescência à fase adulta, durante 5 semanas.
.................................................................................................................................. 66
Figura 11: Avaliação de peso corporal dos grupos CONTROLE, etanol (EtOH),
metilmercúrio (MeHg) e MeHg+EtOH, da adolescência à fase adulta, durante 5
semanas .................................................................................................................... 68
Figura 12: Efeitos da exposição ao etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em
ratas da adolescência à fase adulta sobre a locomoção espontânea no teste do
campo aberto ............................................................................................................ 69
Figura 13: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em
ratas da adolescência à fase adulta sobre a emocionalidade no teste do campo
aberto ........................................................................................................................ 72
Figura 14:Efeitos da exposição ao etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas
da adolescência à fase adulta no teste do labirinto em cruz elevado ........................ 73
Figura 15:Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas
da adolescência à fase adulta no teste splash .......................................................... 76
Figura 16:Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas
da adolescência à fase adulta no teste do nado forçado .......................................... 77
Figura 17:Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) no teste
da esquiva inibitória ................................................................................................... 80
Figura 18: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em
ratas da adolescência à fase adulta na produção de nitrito/nitrato ............................ 83
Figura 19: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em
ratas da adolescência à fase adulta na capacidade antioxidante total equivalente ao
Trolox ........................................................................................................................ 84
Figura 20: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em
ratas da adolescência à fase adulta na atividade da enzima superóxido dismutase..
.................................................................................................................................. 86
Figura 21: Efeitos da exposição ao etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) na
atividade da enzima catalase. Resultados expressos como a média ± e.p.m. de 5
animais por grupo. *Diferença significativa em relação com BASAL (p<0,05) e ***
(p<0,001). #diferença significativa em relação ao CONTROLE (p<0,05) e
###(p<0,001); +++diferença significativa em relação ao EtOH (p<0,001)e XXX
diferença significativa em relação ao MeHg+EtOH (p<0,001). Teste ANOVA de uma
via seguida do teste Tukey. ....................................................................................... 87
Figura 22: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em
ratas da adolescência à fase adulta no conteúdo de glutationa tripeptídeo .............. 89
Figura 23: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) na
peroxidação lipídica ................................................................................................... 90
Figura 20 - Mecanismo de estresse oxidativo celular da exposição ao metilmercúrio
(MeHg) e/ou etanol (EtOH)........................................................................................ 92
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 1 – Concentrações permitidas de compostos mercuriais em alimentos........19
Quadro 1 – Grupos experimentais, descrição do tratamento e número de animais por grupo..........................................................................................................................44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
•OH Radical hidroxil
ADH Álcool desidrogenase
ALDH Aldeído desidrogenase
AMPA Ácido α-amino-3-hydroxil-5-metil-4-isoxazol-propiônico
BAC Blood Alcohol Concentration
CELDs Exposição crônica a baixas doses, do inglês Chronic exposure to
low dose
CYP1A2 Citocromo P4501A2
CYP2E1 Citocromo P4502E1
CYP3A4 Citocromo P4503A4
CYP450 Citocromo P450
DNA Ácido desoxirribonucleico
EBA Entradas nos braços abertos
EBF Entradas nos braços fechados
ERNs Espécies reativas de nitrogênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
EtOH Etanol
GABA Ácido γ-amino-butirico
Glu Glutamato
Gpx Glutationa peroxidase
GSH Glutationa
H2O2 Peróxido de hidrogênio
Hg Mercúrio inogânico
LB1 Linha de base 1
LB2 Linha de base 2
LCE Labirinto em Cruz Elevado
MCD Memória de curta duração
MDA Malondialdeído
MeHg Metilmercúrio
MLD Memória de longa duração
NADP Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NMDA N-metil-D-aspartato
NO Óxido nítrico, do inglês Nitric Oxide
NOS Óxido nítrico sintentase
O2•- Ânion superóxido
ONOO- Peroxinitrito
ROH Radical peroxil
SNC Sistema nervoso central
SOD Superóxido dismutase
TBA Tempo de permanência dos animais nos braços abertos
TCA Teste do campo aberto
TEAC Capacidade antioxidante total equivalente ao Trolox
TGI Trato gastrointestinal
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 17
1.1 Metilmercúrio: considerações gerais ..................................................... 17
1.2 Toxicocinética do MeHg .......................................................................... 19
1.3 Mecanismos de toxicidade do MeHg...................................................... 21
1.4 Efeitos tóxicos sobre o SNC ................................................................... 22
1.5 Etanol: considerações gerais ................................................................. 25
1.6 Farmacocinética do EtOH ....................................................................... 27
1.7 Mecanismos tóxicos do EtOH ................................................................. 29
1.8 Efeitos tóxicos do EtOH nas funções cerebrais ................................... 32
1.9 Estresse oxidativo ................................................................................... 34
1.10 Interação metilmercúrio X etanol ..................................................... 37
2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 40
2.1 Objetivo geral ........................................................................................... 40
2.2 Objetivos específicos .............................................................................. 40
3 METODOLOGIA .................................................................................................. 42
3.1 Animais de experimentação .................................................................... 42
3.2 Tratamento ............................................................................................... 43
3.2.1 TRATAMENTO COM MeHg ......................................................................................... 43
3.2.2 TRATAMENTO COM EtOH EM PADRÃO BINGE ................................................... 43
3.3 Grupos experimentais ............................................................................. 44
3.4 Ensaios comportamentais ...................................................................... 45
3.4.1 TESTE DO CAMPO ABERTO ..................................................................................... 45
3.4.2 TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO ......................................................... 46
3.4.3 TESTE SPLASH ............................................................................................................. 48
3.4.4 TESTE DO NADO FORÇADO ..................................................................................... 50
3.4.5 TESTE DA ESQUIVA INIBITÓRIA .............................................................................. 51
3.5 Coleta de pelos e sangue intraventricular ............................................. 53
3.6 Dosagem de mercúrio total ..................................................................... 53
3.7 Avaliação do estresse oxidativo ............................................................. 55
3.7.1 NITRITOS E NITRATOS ............................................................................................... 55
3.7.2 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL EQUIVALENTE AO TROLOX ............... 55
3.7.3 DOSAGEM DE ATIVIDADE DA ENZIMA SOD ......................................................... 57
3.7.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA CATALASE ................................................. 59
3.7.5 DOSAGEM DE PROTEÍNAS TOTAIS NO HEMOLISADO ..................................... 60
3.7.6 DOSAGEM DE GLUTATIONA TOTAL NO HEMOLISADO .................................... 60
3.7.7 DOSAGEM DE MALONDIALDEIDO ........................................................................... 61
3.8 Análise estatística .................................................................................... 63
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 66
4.1 Concentração de mercúrio total ............................................................. 66
4.2 Avaliação de peso .................................................................................... 67
4.3 Atividade locomotora espontânea ......................................................... 69
4.4 Emocionalidade ....................................................................................... 72
4.5 Comportamento tipo anedonia e tipo depressivo ................................. 75
4.6 Avaliação da memória de curta duração e de longa duração .............. 79
4.7 Avaliação de nitrito/nitrato ...................................................................... 82
4.8 Avaliação da capacidade antioxidante total equivalente ao Trolox .... 84
4.9 Avaliação da atividade da enzima SOD .................................................. 85
4.10 Avaliação de atividade da enzima catalase .................................... 87
4.11 Avaliação do conteúdo de glutationa .............................................. 88
4.12 Avaliação de peroxidação lipídica ................................................... 90
5 CONCLUSÕES.................................................................................................... 94
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 96
ANEXO A – Parecer do CEPAE .............................................................................. 115
16
I INTRODUÇÃO
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 Metilmercúrio: considerações gerais
Metilmercúrio (MeHg) é um poluente ambiental amplamente distribuído
no meio-ambiente, apresentando efeitos tóxicos e degenerativos tanto no
sistema nervoso em desenvolvimento quanto no adulto (XU et al. 2012). É um
composto produzido a partir do mercúrio inorgânico (Hg), que pode causar
intoxicações agudas e crônicas ao homem, com danos ao sistema nervoso
(OMS, 2008).
Existem duas principais fontes de liberação de Hg no ambiente: i)
oriunda de fontes naturais, como erupções de vulcões e incêndios florestais; ii)
e a antropogênica, por ação do homem, como a queima de carvão para
produção de energia, processo de eletrólise cloro-alcalina para fabricação de
soluções cáusticas e através da mineração (KRAEPIEL et al. 2003).
Na mineração os garimpeiros utilizam o Hg para se ligar com o ouro e
formar a amálgama, facilitando assim a identificação do metal valioso. Em
seguida, a amálgama sofre queima para a eliminação do Hg, este emitido na
forma de vapor que alcança a atmosfera, e o restante da queima é o ouro
purificado (PFEIFFER, 1993).
A atividade mineradora tem grande impacto na poluição mercurial, em
especial na Amazônia, onde Bezerra, Verissimo e Uhl (1998) estimaram que na
década de 90, na bacia do rio Tapajós, a mineração lançou aproximadamente
12 toneladas de Hg para a atmosfera, solo e rios.
Ainda na região amazônica, estudos na bacia do Rio Negro encontraram
concentrações de mercúrio total em águas de superfície, semelhantes às
observadas em áreas industrializadas. As condições singulares observadas
para águas escuras, tais como um pH baixo e alto teor de oxigênio, bem como,
o elevado teor de matéria orgânica são fatores que favorecem a metilação, e
por este motivo níveis de MeHg também foram detectados (BISINOTI et al.
2007).
O excesso de Hg líquido e os vapores da queima são depositados nos
leitos e no fundo dos rios, que na presença de bactérias sulfato redutoras no
18
sedimento dos rios e lagos, são metilados e convertidos à MeHg, a forma
orgânica mais tóxica que se acumula nos peixes e penetra no ciclo biológico
(GUIMARÃES et al. 2000; WASSERMAN et al. 2003) e na cadeia alimentar
aquática, no qual sofre bioacumulação e biomagnificação com altas
concentrações sendo encontradas em peixes predadores (Figura 1; KRAEPIEL
et al. 2003).
Figura 1: Ciclo do mercúrio, vias de liberações antropogênicas e naturais, e via de exposição humana.
Fonte: Modificado de Departament of Healthy. Disponível em:<http://health.state.tn.us/environmental/mercury.htm>
A partir do ciclo do mercúrio é possível identificar que a principal via de
exposição humana ao MeHg é o consumo de peixes, crustáceos e mamíferos
aquáticos contaminados (CECCATELLI et al. 2010; VIŠNJEVEC et al. 2014).
Uma vez identificada o padrão de exposição humana, Pinheiro et al. (2000)
verificaram a existência de exposição ao MeHg em populações ribeirinhas do
rio Tapajós, relacionando à ingestão de peixes contaminados como via de
exposição. Considerando estas informações, várias agências regulatórias pelo
19
mundo determinaram seus níveis aceitáveis de contaminação mercurial para
produtos comercializáveis (Tabela 1).
Tabela 1 – Concentrações permitidas de compostos mercuriais em alimentos.
Agência regulatória Limite permitido
O Codex Alimentarius/ Food
and Agriculture Organization
0,5 mg de MeHg/Kg em peixes não
predadores e 1 mg de MeHg/Kg em peixes
predadores.
Food and Drug Administration 1mg de MeHg/Kg em mariscos e peixes
Comunidade Europeia 0,5 mg de mercúrio/Kg produtos pescados*
Japão 0,4 mg de mercúrio total/kg, ou 0,3mg de
MeHg/Kg de peixe
*Com algumas exceções
FONTE: OMS, 2008.
É notável que várias agências regulatórias permitem níveis de
contaminação mercurial em produto para o consumo humano, esta presença
de baixas doses de MeHg em alimentos e consequente ingestão pela
população vem sendo relacionado com efeitos acarretados da exposição
crônica em baixas doses (CELDs, do inglês chronic exposure to low doses) de
MeHg (KONG et al. 2013).
Ao ser ingerido, o MeHg possui uma cinética favorável, no qual sua
absorção ocorre quase na totalidade, cerca de 95%, sendo amplamente
distribuído pelo organismo, estendendo-se aos outros tecidos em apenas
quatro dias (COUNTER; BUCHANAN, 2004; GRANDJEAN, 2007).
1.2 Toxicocinética do MeHg
O MeHg, após a sua ingestão, atinge o trato gastrointestinal (TGI)
humano no qual é absorvido pelo epitélio intestinal principalmente por
transporte passivo atravessando a dupla camada lipídica. Neste processo de
absorção, o MeHg é transportado para o interior das células por um processo
20
de absorção que envolve transportadores de aminoácidos neutros, em especial
pelo sistema B0,+, uma via dependente de Na+ (VÁZQUEZ; VÉLEZ; DEVESA,
2014).
O MeHg também utiliza mecanismo de ligação com cisteínas para
promover sua absorção, em que o metal orgânico livre se liga a porções de
cisteínas, ou quando se apresenta ligado a alguma proteína do peixe realiza
uma troca pela cisteína humana, adquirindo uma semelhança estrutural com
metionina (BRIDGES; ZALUPS, 2006; FARINA; ASCHNER; ROCHA, 2011).
Após absorvidas, todas as formas mercuriais são transportadas pelas
células vermelhas sanguíneas, aproximadamente 90%, sendo que estes
compostos mercuriais têm afinidade pelo encéfalo e a maior parte do mercúrio
circulante se concentra no cérebro (RAMÍREZ, 2008). Uma vez no sistema
nervoso central (SNC), o MeHg tem mais afinidade pela porção cinza que a
branca, e apresenta tropismo por certos grupos neuronais como do cerebelo,
medula espinhal, pedúnculos e mesencéfalo (RAMÍREZ, 2008).
Por conseguinte, é realizada a metabolização do MeHg e há sua
conversão em Hg, por um processo de biodesmetilação que ocorre em vários
tecidos, porém a maior ocorrência acontece no fígado (RAMÍREZ, 2008).
A etapa final é o processo de eliminação, realizado de maneira
compartimental. A eliminação mercurial é dividida em compartimento central,
que envolve todos os órgãos menos rins e fígado; compartimento periférico que
compreende estes dois últimos órgãos; e o último compartimento é o de
depósito, que é o ponto anterior à sua excreção, que é constituído pela urina,
fezes, pelos e unhas (RAMÍREZ, 2008). Os rins acumulam o mercúrio por um
tempo mais prolongado e o elimina muito lentamente, no qual são usados os
processos de filtração glomerular. O fígado o elimina rapidamente, e neste
processo de eliminação são observadas as atividades de secreção biliar e
secreção pela mucosa intestinal (RAMÍREZ, 2008). Assim, o MeHg pode ser
encontrado nos diversos órgãos, com maior afinidade para o SNC, assim
podendo apresentar capacidade causar danos.
21
1.3 Mecanismos de toxicidade do MeHg
Estudos têm investigado a compreensão dos mecanismos tóxicos
envolvidos nos prejuízos ocasionados pelo MeHg, no qual: há a descrição da
interferência no balanço de agentes pró-oxidantes/antioxidantes (ASCHNER et
al., 2007; CUELLO et al., 2010; XU et al., 2012); no aumento na ação do
glutamato (Glu; ASCHNER et al., 2007; XU et al., 2012); afinidade por
grupamentos tiol e selenol (FARINA; ASCHNER; ROCHA, 2011); danos na
mitocôndria (FARINA; ASCHNER; ROCHA, 2011; DALLA CORTE et al., 2013);
distúrbios no transporte de Ca+2 e promover a morte por apoptose
(CECCATELLI; DARÉ; MOORS, 2010; PATEL; REYNOLDS, 2013).
Um dos mecanismos relacionados com a neurotoxicidade é o seu
envolvimento com o equilíbrio oxidativo (FARINA; ASCHNER; ROCHA, 2011;
DENG et al., 2014). Esta perturbação é relacionada com a capacidade
mercurial de se ligar aos grupamentos tióis e selenóis por afinidade química, no
qual moléculas que possuem esse tipo de compostos químicos podem ser
alvos para a ação do toxicante (FARINA; ASCHNER; ROCHA, 2011).
Moléculas como Glutationa peroxidase (Gpx) e Glutationa (GSH)
apresentam grupamentos tióis e selenóis, tornando-se susceptíveis à ação do
MeHg, assim acarretando em uma diminuição da atividade destas enzimas e
consequente aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs). Estas
espécies são altamente instáveis e provocam danos a proteínas redox-
sensíveis, membrana plasmática, enzimas e em ácidos nucleicos (FARINA;
ASCHNER; ROCHA, 2011; XU et al., 2012).
Yang et al. (2015) realizaram intoxicação em ratos com 12 µmol/kg de
MeHg durante 4 semanas, que causou aumento de conteúdo de carbonila,
redução de sulfidrila, que são indicativos de danos oxidativos à proteínas, além
de presença de dano ao ácido desoxirribonucleico (DNA). Ainda, foram
observadas alterações morfológicas correspondentes à necrose, degeneração
e diminuição da densidade celular tecidual, vacuolização citoplasmática e
núcleos picnóticos em cortes de córtex cerebral.
Além do estresse oxidativo, outro alvo de investigação da ação do MeHg
é sobre a homeostase do Glu. Estudo realizado por Feng et al. (2014)
22
evidenciou aumento dos níveis de Glu e redução da glutamina, um precursor
que é convertido em Glu, em ratos tratados mercurialmente. O Glu é o principal
neurotransmissor excitatório do SNC e quando em excesso na fenda sináptica
pode hiperestimular seus receptores, como receptor N-metil-D-aspartato
(NMDA) que leva à excitotoxicidade e morte celular (CHOI, 1992;
FEATHERSTONE, 2010).
Esta hiperestimulação dos receptores do Glu acarreta em um aumento
das concentrações intracelulares de Ca2+ e Na+, provocando um desequilíbrio
associado ao aumento de Ca2+ intracelular, desempenhando um papel
importante no processo neurodegenerativo, assim como pode ocasionar danos
por estresse oxidativo (BISEN-HERSH et al., 2014).
Pesquisas mostraram que o MeHg além de atuar aumentando a
produção de Glu (FENG et al., 2014) também possui habilidade em se
acumular em astrócitos (ASCHNER et al., 2000), induzindo danos na
população astrocitária, diminuindo a reatividade desta célula, e consequente
interferindo na recaptação de Glu (MALFA et al., 2014). Malfa et al. (2014)
verificaram que o MeHg diminui a viabilidade celular, diminuindo a
funcionalidade mitocondrial, porém sem causar necrose celular em astrócitos
humanos.
Os astrócitos são células do SNC que entre suas funções estão o
controle da plasticidade neuronal, regulação do SNC maduro (COLANGELO et
al., 2012), assim como atuam em resposta a danos causados ao cérebro, no
qual o mau funcionamento destas células pode ser um dos fatores que levam a
distúrbios e doenças neurodegenerativas (ARAQUE, 2006).
1.4 Efeitos tóxicos sobre o SNC
De acordo com dados da OMS (2008), há duas subpopulações mais
suscetíveis quando intoxicadas por mercúrio: i) a primeira são os infantes, que
compreende o feto, o recém-nascido e a criança, devido à sensibilidade do
sistema nervoso em desenvolvimento, tanto por exposição ainda no útero
quanto pelo consumo de leite materno contaminado; ii) e a segunda
subpopulação são as mulheres, compreendida pelas novas mães, grávidas e
23
mulheres que possam vir a engravidar que devem estar cientes quanto ao risco
da intoxicação por MeHg.
Sabe-se que o MeHg possui capacidade de atravessar as barreiras
placentária e hematoencefálica, assim depositando-se no SNC, e que uma vez
nele, o composto mercurial sofre um processo lento de desmetilação,
acumulando-se na forma de Hg (CECCATELLI et al., 2013; RAFATI-
RAHIMZADEH et al., 2014).
Modelos animais em estudos com MeHg são muito utilizados na
pesquisa e diferentes formas de intoxicação com diferentes doses levam a
eventos relacionados com a neurotoxicidade mercurial. É bem conhecido que a
exposição perinatal ao MeHg causa distúrbios neurocomportamentais, em
funções sensoriais, motoras e de aprendizagem, que podem ter implicações
com a taxa de aprendizagem e aquisição de novas informações (BISEN-
HERSH et al., 2014).
Alterações comportamentais também foram vistas por Christinal e
Sumathi (2013) em roedores, como do tipo depressivo assim como redução na
atividade locomotora e déficits na memória de trabalho.
Biamonte et al. (2014) utilizando modelo animal com camundongo com
mutação no gene reelina, gene que codifica várias proteínas secretadas na
matriz extracelular para controle do posicionamento de célula e a migração
neuronal durante o desenvolvimento do cérebro, podendo estar envolvido na
esquizofrenia, autismo, transtorno bipolar, depressão grave e epilepsia do lobo
temporal (para revisão ver SAMSOM; WONG, 2015), verificaram alterações
neuropatológicas semelhantes ao autismo, com perda neuronal de células de
Purkinje e distúrbios comportamentais na interação social, relacionadas à
exposição gestacional na dose de 6 ppm, associado à redução da expressão
de reelina, assim avaliando o MeHg como fator epigenético para
desenvolvimento de patologias em modelos pré-susceptíveis.
Estudos a cerca dos efeitos tóxicos do MeHg começaram a ser alvo de
estudos desde casos graves de intoxicação de Minamata (HARADA, 1995) e
Iraque (BAKIR et al., 1973).
A doença de Minamata foi oficialmente descoberta em maio de 1956,
onde o MeHg foi caracterizado como causador de danos teratogênicos quando
24
na exposição intrauterina. Esta síndrome foi caracterizada por produzir graves
manifestações neurológicas e motoras, incluindo ataxia, parestesia, constrição
do campo visual, disartria, além de dificuldades auditivas (HARADA, 1995).
Outro caso de grande impacto foi o envenenamento ocorrido na década
de 70 no Iraque, no qual foi utilizado MeHg como fungicida no tratamento de
grãos. Esta intoxicação levou ao envenenamento 6530 pessoas e 459 óbitos
ocorridos em hospitais (BAKIR et al., 1973).
Estes casos tornaram a ingestão de MeHg em alimentos contaminados
preocupante ao redor do mundo. Estudos coortes feitos nas Ilhas Faroe,
Seychelles e Nova Zelândia, que são locais com alto consumo de peixe,
determinaram altas taxas de mercúrio em crianças que foram expostas ainda
na vida intrauterina, ainda notaram que baixas concentrações de mercúrio
causaram distúrbios na concentração, memória e fala (HONG; KIM; LEE,
2012).
Nas Ilhas Faroe, ainda concluíram que a memória é um dos domínios
conhecido por ter sensibilidade ao agente toxicante (CHOI et al., 2014; MEJIA-
TOIBER et al., 2014). Além disso, Boucher et al. (2012) demonstraram que
uma exposição humana pré-natal estava relacionada com comportamentos de
hiperatividade/impulsividade e falta de atenção, classificados como
externalizados (SAGIV et al., 2012).
Neste sentido, Ng et al. (2014) verificaram a influência positiva de
polimorfismos no gene da apoliproteina E no subtipo ε4 com o aumento nas
concentrações de MeHg durante o período pré-natal e consequente acréscimo
dos distúrbios comportamentais e maior relação com comportamentos
internalizados em humanos, como ansiedade/depressão.
No período da adolescência, poucos trabalhos abordam a questão da
exposição desta faixa etária aos compostos mercuriais, porém Vieira et al.
(2015) analisou amostras de cabelos de adolescentes de duas cidades, com
idades de 14 a 18 anos, ambos os sexos, e detectou concentrações de
mercúrio nos escalpes, no qual o gênero feminino apresentou concentrações
maiores que o masculino, relacionado com um consumo maior de peixe. As
concentrações encontradas em algumas amostras eram superiores às
25
determinadas pela agência de proteção ambiental norte-americana, que é de 1
µg/g de cabelo (USEPA, 1997).
Alterações em estruturas como SNC também podem ser oriundas de
outros compostos tóxicos, como o etanol (EtOH). Sabe-se que o consumo de
bebidas alcoólicas em áreas de alto risco para intoxicação mercurial, como
garimpos, é alto (CORBETT et al., 2007). Sendo assim esta interação entre
MeHg com o EtOH é potencialmente presente e perigosa.
1.5 Etanol: considerações gerais
O EtOH é uma substância com ação no SNC que possui capacidade de
causar dependência, sendo amplamente utilizada por diversas culturas há
séculos, e o seu uso nocivo pode ser responsável por uma variedade de
doenças, com prejuízo social e econômico. Alguns fatores são atribuídos para
explicar tendências e diferenças no consumo desta droga e seus efeitos
nocivos, tais como o desenvolvimento econômico, a cultura, a disponibilidade e
ao nível de eficácia das políticas para o álcool (OMS, 2014).
Em 2012, o consumo de EtOH foi responsável por cerca de 3,3 milhões
de mortes, aproximadamente 5,9% dos casos de óbitos anuais, consistindo em
um fator causal que está relacionado com mais de 200 condições de doenças e
traumatismos. O álcool etílico está associado com risco de desenvolver
problemas de saúde, transtornos mentais, comportamentais e doenças como:
câncer, cirrose hepática, doenças cardiovasculares, bem como ferimentos e
lesões referentes à violência e acidentes de trânsito (OMS, 2014).
As lesões podem ser não intencionais como os acidentes fatais e
intencionais como suicídios, e ocorrem principalmente em faixas etárias
relativamente mais jovens (OMS, 2014).
O conceito de abuso alcoólico tem sido utilizado para definir dois
fenômenos. O primeiro, relacionado com a definição clínica de adição
propriamente dita ou doença, que é utilizado para descrever a ingesta padrão
que ocorre por período prolongado; o segundo conceito é usado para
descrever o consumo de EtOH em episódio único que leva à intoxicação aguda
e em geral é definida como a ingestão de 5 ou mais doses para homens e 4 ou
26
mais doses para mulheres em uma única ocasião por um período em torno de
2 horas (BERRIDGE; HERRING; THOM, 2009).
Esta última definição é conhecida por binge drinking, no qual estudos
demonstram que esta forma de exposição está relacionada com o aumento do
risco individual com problemas relacionados ao EtOH (SILVEIRA et al., 2008).
De acordo com o II Levantamento Nacional de Álcool e Drogas (LENAD), o
consumo em binge teve aumento de 36% dentre o gênero feminino,
especialmente as mais jovens, em níveis superiores aos índices totais de
gêneros, que corresponde a 31,1%emrelação ao ano de 2006 (INPAD, 2013).
Não só do uso de EtOH, mas também o abuso e dependência são
fenômenos comuns entre adolescentes no mundo ocidental. Mais de dois
terços consomem esta droga e mais da metade de todos os adolescentes
experimentaram intoxicação alcoólica em algum momento (SKALA; WALTER,
2013).
Modelos de abuso alcoólico na fase da adolescência em roedores
demonstram a presença de degeneração neuronal com perdas severas na
neurogênese hipocampal. Os autores concluem que a adolescência é um
período de alto risco para modificações na estrutura cerebral e
neurodegeneração relacionados ao EtOH, assim como ocorrem alterações na
expressão gênica e na maturação de fenótipos adultos. Logo, esses achados
subsidiam a hipótese que a puberdade é a fase de alto risco para aumentos
persistentes e duradouros na expressão gênica neuroimune no cérebro, que
promovem aumentos persistentes e de longo prazo no consumo alcoólico, que
por sua vez aumenta ainda mais a indução de genes neuroimunes e de
neurodegeneração que são encontrados associados aos transtornos do uso de
EtOH (para revisão ver CREWS; VETRENO, 2014).
Os adolescentes que se enquadraram nos critérios para distúrbios
relacionados ao uso de álcool demonstram muitas vezes pior desempenho
neurocognitivo, alterações na estrutura do cérebro e os padrões de ativação
funcionais cerebrais discrepantes, quando comparados com os controles que
se abstiveram do uso desta droga. Sendo assim, o abuso de EtOH durante a
adolescência constitui também um importante fator de risco no
desenvolvimento de problemas psicossociais (SKALA; WALTER, 2013).
27
1.6 Farmacocinética do EtOH
O EtOH é uma molécula pequena que possui características hidrofílicas
e lipofílicas, sendo rapidamente absorvido no estômago e intestino, 20% e 80%
respectivamente, por difusão simples (SWIFT, 2003). Após a absorção, o EtOH
se distribui para os tecidos e fluidos corporais sem necessitar de ligação com
proteína. Seu volume de distribuição está relacionado ao teor de água, o que é
parcialmente responsável por diferenças relacionadas à idade e sexo
(NORBERG et al., 2003).
Nos adultos, o teor de água total do corpo depende da idade, peso e
sexo, e é de aproximadamente 50% a 60% do peso total do corpo nos homens
e 45% a 55% do peso corporal nas mulheres (KYLE et al., 2001). Além disso,
esta droga apresenta a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica
e placentária, devido à sua natureza anfifílica (HACKER et al. 2009)
Menos de 10% de EtOH é excretado na respiração, suor e urina. A
fração restante ingerida é metabolizada em acetaldeído por um dos três
sistemas: álcool desidrogenase (ADH), sistema de oxidação microssomal do
EtOH, ou a catalase. O acetaldeído é subsequentemente oxidado a acetato
pela enzima aldeído desidrogenase (ALDH; CEDERBAUM, 2012).
O acetato deixa o fígado e é convertido em acetil-coenzima A, que em
última análise produz dióxido de carbono e água. Uma pequena fração de
EtOH é eliminada por vias não oxidativas e envolve a conjugação com
substratos endógenos, tais como ácidos graxos, fosfolípideos, sulfato, ou ácido
glicurônico para formar ésteres etílicos de ácidos graxos, fosfatidiletanol,
etilsulfato, e etilglicuronídeo (MAENHOUT; DE BUYZERE; DELANGHE, 2013).
Estes metabólitos possuem uma meia-vida mais longa do que o próprio
composto original (INGALL, 2012).
A ADH representa a maior parte do metabolismo oxidativo do EtOH e
tem um amplo espectro de atividade, principalmente para álcoois primários e
secundários. Esta enzima está localizada principalmente no fígado, podendo
ser encontrada em menor grau no TGI, rins, testículos, mucosa nasal e útero.
Os seres humanos apresentam 5 classes principais de enzimas ADH (Classe I-
28
V), cada um com diferentes afinidades para o EtOH. A classe I de ADH é
encontrada principalmente no fígado e contribui para a maior parte do
metabolismo do EtOH, podendo saturar rapidamente (CEDERBAUM, 2012).
O segundo sistema de metabolização é o sistema de oxidação
microssomal, que é dependente do citocromo P450 (CYP450), e envolve as
enzimas do citocromo P4502E1 (CYP2E1), P4501A2 (CYP1A2), e P4503A4
(CYP3A4; LIEBER, 1999). O sistema microssomal é responsável por cerca de
10% de oxidação do EtOH no fígado (LANDS, 1998). Dentro do sistema
metabolizador microssomal, a CYP2E1 desempenha o papel importante na
metabolização (MATSUMOTO; FUKUI, 2002) e nos mecanismos de
desintoxicação e defesa contra xenobióticos (LIEBER, 2004).
O consumo crônico de EtOH aumenta os níveis de CYP2E1, que estão
até quatro vezes aumentadas em etilistas crônicos quando comparados com
abstinentes (TSUTSUMI et al., 1989). O metabolismo por esta via da CYP2E1
gera EROs e tem sido associada à hepatotoxicidade alcoólica (MATSUMOTO;
FUKUI, 2002; KESSOVA; CEDERBAUM, 2003).
O último sistema de metabolização oxidativa do EtOH ocorre pela
enzima catalase, que é uma enzima antioxidante que degrada o peróxido de
hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio e que também pode oxidar uma grande
variedade de compostos, incluindo o EtOH, com o uso de H2O2. Embora seja
amplamente distribuída no organismo, a via é limitada pelas baixas
quantidades de H2O2 no corpo. A via da catalase é responsável por cerca de
2% de metabolismo do EtOH (CEDERBAUM, 2012), mas foi proposta sua
importância por desempenhar um papel na produção local de acetaldeído no
cérebro (ZIMATKIN et al., 2006; CORREA et al., 2012).
Após a primeira metabolização do EtOH em acetaldeído, este composto
deve ser eliminado do organismo pois apresenta alta toxicidade. Enzimas
ALDH oxidam irreversivelmente acetaldeído dependente de nicotinamida
adenina dinucleotídeo fosfato (NADP). Existem cerca de 19 isoformas de ALDH
humana, no qual a ALDH1A1 citosólica e a ALDH2 mitocondrial são as mais
importantes para o metabolismo do acetaldeído (MARCHITTI et al., 2008).
Em condições fisiológicas normais, as concentrações de acetaldeído são
baixas, e a ALDH2 é a isoforma principal responsável pela oxidação de
29
acetaldeído para acetato (LANDS, 1998). A ALDH1A1 e ALDH2 estão
distribuídos por todo o corpo, incluindo o fígado, rins e cérebro (MARCHITTI et
al., 2008).
Desta forma, a maioria do EtOH é metabolizado, com menos de 10%
excretado inalterado pela respiração, urina e suor. Além disso, depois de uma
única dose, cerca de 0,7% a 1,5% da droga é excretada inalterada na urina
(JONES, 1990). Fatores do organismo podem interferir na sua farmacocinética,
estando relacionados com o aumento do consumo e da toxicidade da droga.
De acordo com o Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo
(NIAAA, 2013), mulheres apresentam maiores riscos ao consumirem EtOH e
alguns dos motivos são atribuídos ao fato destas apresentarem menor peso
corporal e consequente menor quantidade de água no organismo que os
homens, tornando-se assim mais susceptíveis aos efeitos alcoólicos com
menores doses consumidas.
Quando uma mulher e um homem ingerem a mesma quantidade
alcoólica, o gênero feminino apresenta maiores níveis de alcoolemia. Segundo
Schuckit (2009) o consumo do álcool continuará a subir nas próximas décadas,
e as mulheres e os adultos jovens constituem os grupos de maior incremento
na elevação dos índices de consumo, tornando o alcoolismo um problema de
saúde pública emergencial.
1.7 Mecanismos tóxicos do EtOH
Muitos sistemas podem ser alvos do EtOH, e esta gama de alvos pode
promover diversos efeitos no SNC e vários mecanismos que levam à
neurotoxicidade. Dentre estes sistemas estão o GABAérgico, glutamatérgico,
dopaminérgico, serotoninérgico e opióide (ERDOZAIN; CALLADO, 2014). É
proposto como o mecanismo principal de ação desta droga a ligação ao
sistema GABAérgico, que apresenta como agonista endógeno e principal o
ácido γ-amino-butirico (GABA), que é um neurotransmissor inibitório do SNC, o
que justifica os efeitos comportamentais e farmacológicos da droga como um
depressor.
30
O receptor GABAA é um complexo proteico composto por 5 subunidades,
formando uma estrutura de canal que atravessa a membrana das células
neuronais, que uma vez ativado se abre permitindo a entrada do íon cloreto,
hiperpolarizando a célula, resultando em diminuição da excitabilidade neuronal.
O EtOH se liga de maneira alostérica no receptor GABAA, sendo assim, outras
substâncias podem interagir com o receptor em diferentes porções, seja no
domínio do canal, na região extracelular ou modulando a atividade do canal de
ânion (BAUR; MINIER; SIGEL, 2006).
O fenômeno de potenciação alostérica da ação do GABAA pode ser
realizado pela ligação de outro estimulador do receptor inibitório como os
barbitúricos e os benzodiazepínicos associados a esta droga, demonstrando
sinergismo entre eles (GROBIN et al., 1998; AGUAYO et al., 2002). A
exposição crónica ao EtOH resulta num aumento na sensibilidade de respostas
mediadas pelo receptor de GABAA, incluindo os efeitos sedativos,
incoordenação motora e déficits cognitivos agudos (SILVERS et al., 2003).
Outro sistema que têm importância no efeito alcoólico é o excitatório
glutamatérgico, no qual o principal neurotransmissor é o Glu, e desempenha
também um papel fundamental nos seus efeitos farmacológicos observados.
Os receptores deste neurotransmissor podem ser divididos em dois grupos de
acordo com o mecanismo pelo qual a sua ativação dá origem a uma corrente
pós-sináptica. Os receptores ionotrópicos, tais como NMDA, o ácido α-amino-3-
hydroxil-5-metil-4-isoxazol-propiônico (AMPA) e cainato que formam um poro
de canal iônico, ativado quando o Glu se liga ao receptor (TRAYNELIS et al.,
2010).
Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos ativam indiretamente
canais de íons na membrana plasmática através de uma cascata de
sinalização que envolve proteínas G (NISWENDER; CONN, 2010).
O efeito do EtOH sobre os sistemas glutamatérgicos ocorre sobre a
modulação dos receptores ionotrópicos. Em particular, os receptores NMDA
são os mais sensíveis aos seus efeitos, mesmo o AMPA e cainato sendo
também modulados por esta droga (DODD et al., 2000). O receptor de NMDA é
composto de quatro subunidades, forma um canal de cátions, e a ativação do
receptor conduz a um aumento de permeabilidade para o Na+, K+, e,
31
principalmente, para o Ca2+, o que resulta em despolarização da membrana
neuronal (TRAYNELIS et al., 2010).
A atividade na intoxicação aguda de EtOH sobre este receptor é o de
reduzir o influxo através do canal (WIRKNER et al., 1999). Esta modificação
pode alterar muitas funções celulares, tais como, a função sináptica por
inibição da liberação de neurotransmissores. Assim, o EtOH inibe o fenômeno
de potenciação de longo prazo, que é importante na aprendizagem e memória,
provavelmente através de receptores NMDA (KERVERN et al., 2015).
O EtOH, assim como outras drogas de abuso, em seu uso agudo, ativa o
sistema dopaminérgico mesocorticolímbico e, após administração crônica,
produz alterações funcionais deste importante do sistema de recompensa do
cérebro. O núcleo anatômico do sistema de recompensa são neurônios
dopaminérgicos da área tegmental ventral que possui projeções neuronais para
o núcleo accumbens, amígdala, córtex pré-frontal e outras estruturas do
cérebro anterior (KOOB; VOLKOW, 2010).
Os dados anteriores sugerem que o sistema mesocorticolímbico
dopaminérgico está envolvido tanto nos efeitos de reforço positivo e negativo
do EtOH (SODERPALM; LOF; ERICSON, 2009). Inicialmente, foi demonstrado
que o EtOH provoca excitação dos neurônios dopaminérgicos na área
tegmental ventral in vivo e in vitro dependente da dose (BRODIE; SHEFNER;
DUNWIDDIE, 1990; GESSA et al., 1985).
Da mesma forma, o EtOH causou um aumento dos níveis de dopamina
no núcleo accumbens, que é outro fator que liga o sistema dopaminérgico
mesolímbico de recompensa (BOILEAU et al., 2003; DI CHIARA; IMPERATO,
1988).
Além disso, estudos comportamentais demonstraram que a
autoadministração de EtOH por roedores estava relacionada diretamente com
a área tegmetal ventral, reforçando ainda mais o envolvimento do sistema de
recompensa nos efeitos do EtOH (RODD et al., 2004).
A serotonina, ou 5-hidroxitriptamina, também tem sido implicada em
vários aspectos da função cerebral, incluindo regulação de estados afetivos,
comportamento de ingestão e vício (HAYES; GREENSHAW, 2011). O EtOH
potencia a função da serotonina e dos receptores 5-HT1A somatodendríticos
32
(LOVINGER, 1999). Além disso, tem sido relatado um aumento nos níveis de
serotonina extracelular no núcleo accumbens após administração de EtOH
(YAN, 1999).
Os estudos realizados em roedores com preferência ao EtOH mostraram
déficits de transmissão de serotonina, incluindo baixo teor cerebral da
serotonina, diminuição de células e fibras serotoninérgicas, além de uma hiper-
regulação compensatória de receptores de 5-HT1A (WONG et al., 1990; ZHOU
et al., 1994).
Além disso, redução da disponibilidade de transportadores de serotonina
tem sido descritas no cérebro de indivíduos alcoólatras (HEINZ et al., 1998), e
também no núcleo caudado de pacientes alcoólatras post-mortem (STORVIK et
al., 2006). Uma vez que estes déficits parecem representar um risco para o
desenvolvimento de comportamento de beber anormal, e as alterações na
transmissão de serotonina parecem ser mais relevantes para o alcoolismo do
tipo-II, caracterizado por traços de personalidade antissocial, maior
hereditariedade e a forma de início precoce da doença, em comparação com o
alcoolismo do tipo-I, com traços de ansiedade e de início tardio e social
(CLONINGER et al., 1988).
Consistente com esta hipótese, estudos em humanos demonstraram
baixo teor no líquido cefalorraquidiano do principal metabólito da serotonina, o
ácido 5-hidroxiindoleacetico predominantemente do tipo II em alcoólatras
(FILS-AIME et al., 1996; VIRKKUNEN; LINNOILA, 1993). Finalmente, há
evidências genéticas para a associação de um polimorfismo particular do
transportador de serotonina com dependência de álcool (FEINN; NELLISSERY;
KRANZLER, 2005).
1.8 Efeitos tóxicos do EtOH nas funções cerebrais
Mudanças no SNC contribuem para a indução de efeitos aversivos,
padrões ansiogênicos e abstinência alcoólica, podendo persistir por longos
períodos. Eventualmente, essas adaptações podem resultar em aumento da
ansiedade e sensibilidade ao estresse, de modo que o alcoolista desencadeie a
33
compulsão pelo EtOH, a fim de amenizar esses estados emocionais negativos
(VALDEZ; KOOB, 2004).
Nesta fase, o consumo etílico não ocorre pelos seus efeitos de reforço
positivos, mas sim de reforço negativo, isto é, para eliminar sensações
desagradáveis, como a ansiedade. Estas alterações adaptativas
neuroquímicas, bem como as alterações morfológicas em algumas regiões do
cérebro, como o córtex pré-frontal, o núcleo central da amígdala e o núcleo da
estria terminal, podem contribuir na recaída, no qual ambas as mudanças
associadas são fundamentais para a dependência do álcool (CLAPP; BHAVE;
HOFFMAN, 2008).
Pascual et al. (2014) mostraram que o uso de EtOH na adolescência
causou sensibilização e potenciação da via dopaminérgica mesocorticolímbica
juntamente com uma neuroinflamação, induzindo a alterações na mielina de
neurônios na região do córtex pré-frontal de ratos.
Cippitelli et al. (2010) mostraram que uma simples exposição alcoólica
na forma binge drinking pode produzir modificações comportamentais em ratos,
na dose de 5g/kg, com alterações funcionais na memória espacial
acompanhadas de déficit na aprendizagem. Da mesma forma, foram relatados
sintomas semelhantes à depressão, com comportamento tipo anedonia e
aumento do tempo de imobilidade em animais com concentração de álcool
sanguínea (BAC, do inglês Blood Alcohol Concentration) ≥ 0.08 g% que
assemelhasse ao BAC definido pelo NIAAA (NIAAA, 2004; BRIONES;
WOODS, 2013).
Concentrações alcoólicas plasmáticas elevadas afetam o hipocampo,
com comprometimento na aprendizagem espacial e memória no tratamento
intragástrico de 3,4g/kg diariamente por 6 dias. Este trabalho demonstrou
também que com o decorrer do tratamento houve piora dos parâmetros
comportamentais de memória, testados do dia 2 ao 6 de intoxicação, com
possível envolvimento do receptor κ opióide/dinorfina, cuja ativação aumenta a
neurotransmissão de Glu, podendo levar a distúrbios cognitivos por causar
aumento na depressão de longa duração e déficit na recuperação da memória
espacial (KUZMIN et al., 2013).
34
Nosso grupo de pesquisa já demonstrou que um binge agudo de EtOH,
dose de 3 g/kg/dia durante três dias, foi o suficiente para alterar funções
motoras e padrões mnemônicos de ratas no início da adolescência, causando
prejuízo em coordenação motora fina, equilíbrio e na memória de curta duração
(FERNANDES, 2014).
O MeHg e o EtOH apresentam capacidade de comprometer funções
SNC por diversos mecanismos supracitados. Sendo que dentre estes
mecanismos, o estresse oxidativo aparenta ser uma via comum que pode estar
envolvida nos danos quanto aos toxicantes isolados, assim como pode basear
a hipótese de sinergismo da associação para prejuízos cognitivos e somáticos.
1.9 Estresse oxidativo
O estresse oxidativo é resultante do desequilíbrio entre os sistemas pró
e antioxidante, com danos consequentes (VASCONCELOS et al., 2007). Estes
danos podem ser em proteínas, lipídeos, DNA, além de mudanças em
estruturais em proteínas e carboidratos alterando estrutura e função destas
moléculas. Os danos teciduais podem ser decorrentes de reações bioquímicas
enzimáticas e não enzimáticas mediadas por compostos intermediários
altamente reativos, que podem ser tanto endógenos ou exógenos (PRAKASH;
SINGAPALLI; GOKULNATH, 2012; SMALL et al., 2012).
O sistema antioxidante classifica-se em enzimático e não enzimático. O
enzimático é representado, principalmente, pelas enzimas antioxidantes: a
superóxido dismutase (SOD) que catalisa a dismutação do ânion superóxido
(O2•-) a H2O2 e oxigênio (O2); catalase que atua na decomposição de H2O2 a O2
e água, e a GPx, que atua sobre peróxidos em geral, com utilização de GSH
como co-fator (VASCONCELOS et al., 2007).
O sistema não enzimático é formado por muitas substâncias, entre elas
a GSH, principal composto antioxidante endógeno e intracelular, além das
vitaminas tocoferóis, β-caroteno e ascorbato. O ácido úrico e proteínas de
transporte de metais de transição, como a transferrina (responsável pelo
transporte do ferro) e ceruloplasmina (transporte do cobre e oxidação do ferro
35
para ser captado pela transferrina) também atuam no sistema não enzimático
(VASCONCELOS et al., 2007).
Dentre as formas pró-oxidantes estão os radicais livres, que são
compostos produzidos pelo metabolismo normal celular, úteis para uma série
de processos, como resposta imunológica, tônus vasomotor e de sinalização
celular, em seguida sendo neutralizados pela maquinaria antioxidante celular.
Os radicais livres apresentam alta reatividade, pois envolve a tentativa de ligar
o elétron desemparelhado que estas espécies apresentam (COBB; COLE,
2015).
Em síntese, espécies reativas são formadas por moléculas radicalares
como O2•-, óxido nítrico (NO•), radical hidroxil (•OH) e radical peroxil (ROH),
assim como moléculas não-radicalares como peroxinítrito (ONOO-) e H2O2. São
divididos em dois grupos: EROs, que incluem O2•-, •OH, ROH e H2O2; e
Espécies Reativas de Nitrogênio (ERNs), incluindo NO• e ONOO- (SULTANA;
CENINI; BUTTERFIELD, 2013).
O NO•, é um radical livre gasoso que pertence à família de ERNs.
Sintetizado através da conversão de L-arginina em L-citrulina pela ação da
enzima óxido nítrico sintetase (NOS), na presença de oxigénio, NADPH, e
outros cofatores (Figura 2; ANDREW; MAYER, 1999).
36
Figura 2: Ciclo celular do estresse oxidativo, vias enzimáticas e não enzimáticas. SOD= Superóxido dismutase; RE: Reticulo endoplasmático; XO=Xantina oxidase; NO= Óxido nítrico; NOS= Óxido nítrico sintetase; GSH= Glutationa; GPX=Glutationa peroxidase; GR=Glutationa redutase; GSSG: Glutationa dissulfeto. Fonte: Modificado de Sigma Aldrich®.
O excesso de espécies reativas podem provocar danos as moléculas
como peroxidação de lipídios, sendo assim produzindo malondialdeído (MDA).
O MDA é um produto final da peroxidação lipídica de ácidos graxos poli-
insaturados. Lipídios poli-insaturados são susceptíveis a um ataque oxidativo,
tipicamente por EROs, resultando numa reação com produtos como MDA.
Sendo assim o MDA é um biomarcador para este tipo de dano, e indicativo de
geração excessiva de EROS (LIU et al., 2011; YANG et al., 2015).
O estresse oxidativo vem sendo relacionado com uma série de
patologias, incluindo no SNC, como doença de Huntington, doença de
Parkinson, Alzheimer, esclerose múltipla, convulsões e epilepsia (COBB;
COLE, 2015). Assim grande número de pesquisas vem tentando verificar
neuropatologias ocasionadas pela via do estresse oxidativo.
Como descrito anteriormente, compostos tóxico exógenos como EtOH e
o MeHg podem induzir o estresse oxidativo. Sabe-se que a presença de 2
neurotóxicos acentuam déficits cognitivos e comportamentais e que o
surgimento dos sintomas é dependente do período e intensidade da exposição.
37
A interação entre o EtOH e o MeHg, dependendo do período da exposição e da
concentração deste dois neurotoxicantes ocasionou sinergismo e prejuízos ao
SNC (MAIA et al., 2009; 2010).
1.10 Interação metilmercúrio X etanol
Estruturas do SNC parecem ser afetadas pelos compostos de forma
isolada. Algumas destas pertencem ao sistema límbico, que está envolvido
com o comportamento emocional humano, no qual qualquer desequilíbrio neste
sistema poderia alterar tanto o seu estímulo quanto a sua resposta elétrica,
levando ao desenvolvimento de doenças psicossomáticas (RONAI et al., 2002).
A interação mercurial e alcoólica tem sido alvo de poucos estudos. Os
resultados encontrados em pesquisas anteriores demonstraram os efeitos do
EtOH quanto à morbimortalidade e distribuição do mercúrio nos tecidos de
ratos tratados oralmente com dose diária de 5 mg/kg de MeHg, por 10 dias
consecutivos. O EtOH potencializou a toxicidade do MeHg em relação às
manifestações neurológicas e mortalidade (TAMASHIRO et al., 1986).
Além disso, esta associação apresentou inicialmente um ganho, seguida
de perda, dos pesos corporais de ratos, os quais apresentaram intensa ataxia
(TURNER; BHATNAGAR; YAMASHIRO, 1981), dados estes observados em
outros estudos com potencialização dos efeitos deletérios no SNC (FAZAKAS;
LENGYEL; NAGYMAJTÉNYI, 2005; PAPP; PECZE; VEZÉR, 2005).
Estudo realizado por Maia et al. (2009) no período perinatal demonstrou
prejuízos nas funções cognitivas relacionadas às memórias de curta e longa
duração, e de procedimento; à avaliação de riscos; e ao aprendizado, quando
os animais foram submetidos à intoxicação ao EtOH+MeHg. No mesmo estudo,
os autores demonstraram que a intoxicação concomitante dos dois
neurotoxicantes durante o neurodesenvolvimento em ratos causou distúrbios
relacionados à ansiedade na vida adulta.
Nesta interação, algumas vias têm sido propostas. Estes dois
neurotóxicos parecem promover neurodegeneração por mecanismos também
relacionados, como indução na peroxidação lipídica devido ao estresse
oxidativo e aumento da atividade de fosfolipase A2 (FARINA; ASCHNER;
38
ROCHA, 2011; MOON et al., 2014; TAJUDDIN et al., 2014); ativação da NOS
e/ou aumento de nitritos e nitratos (HUANG et al., 2011); excitotoxicidade
mediada por Glu (CIPPITELLI et al., 2010; DENG et al., 2014); danos à
mitocôndria (GLASER et al., 2014; JUNG, 2014; SOKOLOWSKI et al., 2011); e
sobre microtúbulos (SMITH; BUTLER; PRENDERGAST, 2013).
Deve-se enfatizar que ainda são escassas as pesquisas que relacionam
a toxicidade de ambos os neurotóxicos em associação. Considerando que
ambas as substâncias possuem capacidade de causar danos ao SNC, há um
risco “silencioso” no qual pode estar ocorrendo sinergismo tóxico e que tem
sido pouco investigado. Sabe-se que a população na Amazônia apresenta alta
ingesta de peixes e mariscos, no qual em regiões de garimpo há uma possível
contaminação destes alimentos, uma vez que níveis de MeHg são permitidos
por legislação. Além disso, o consumo de EtOH nas cidades do interior é uma
realidade, e cada vez mais precoce.
Aliado a este cenário, ambos neurotóxicos tem como população de risco
as mulheres e adolescentes, devido ao tropismo por estruturas em
desenvolvimento. Baseado na literatura, este trabalho busca investigar duas
hipóteses: i) Se a ingestão de níveis permitidos de MeHg pela população é
realmente segura ? ii) Se a presença de um segundo neurotoxicante (EtOH)
pode aumentar os danos e prejuízos a estruturas e funções? Desta forma, este
trabalho investiga os possíveis danos ocasionados pelo MeHg per se, assim
como em associação com EtOH na adolescência e em fêmeas, também busca
identificar se uma das vias do prejuízo está relacionada ao estresse oxidativo.
39
II OBJETIVOS
40
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar as alterações neurocomportamentais e alguns parâmetros da
bioquímica oxidativa da exposição crônica e intermitente à baixas doses de
MeHg e na associação ao EtOH em ratas da adolescência à fase adulta.
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar possíveis alterações no peso corporal das ratas expostas
a MeHg e/ou EtOH;
• Verificar os efeitos na atividade locomotora espontânea de ratas
expostas ao MeHg e/ou EtOH, no modelo do teste de campo aberto;
• Avaliar atividade ansiogênica de ratas expostas ao MeHg e/ou
EtOH no modelo do labirinto em cruz elevado;
• Analisar a presença de comportamento do tipo anedonia em ratas
expostas ao MeHg e/ou EtOH no modelo comportamental do teste splash;
• Verificar a presença de comportamento do tipo depressivo em
ratas expostas ao MeHg e/ou EtOH utilizando o modelo do nado forçado;
• Avaliar a atividade mnemônica, através das memórias de curta
duração e de longa duração em ratas expostas ao MeHg e/ou EtOH no modelo
de teste da esquiva inibitória;
• Quantificar o mercúrio total depositado nos pelos das ratas
expostas ao MeHg e/ou EtOH como parâmetro biomarcador de exposição
mercurial;
• Verificar as possíveis alterações no balanço oxidativo através dos
testes da atividade antioxidante total equivalente ao Trolox (TEAC); nos níveis
de MDA; na formação de nitritos e nitratos; da atividade da enzima catalase; da
atividade da enzima SOD; e na quantidade de glutationa tripeptídeo no sangue
das ratas adolescentes expostas ao MeHg e/ou EtOH.
41
III METODOLOGIA
42
3 METODOLOGIA
3.1 Animais de experimentação
Antes da execução, o projeto foi submetido ao Comitê de Ética em
Pesquisa com Animais de Experimentação (CEPAE), obedecendo-se aos
critérios, de acordo com as normas estabelecidas por Guias de Cuidado e Uso
de Animais Laboratoriais (COMMITTEE FOR THE UPDATE OF THE GUIDE
FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS, 2011), com
aprovação sob o número 209-14 (ANEXO A).
Foram utilizadas ratas Wistar, fêmeas, idade 40 dias (n=60),
provenientes do Biotério da Universidade Federal do Pará, que foram mantidas
no biotério de Faculdade de Farmácia, em condições padronizadas de
temperatura (22°+ 2°C), exaustão, ciclo de luz claro/escuro de 12 horas
(06:00h – 18:00h), água e comida ad libitum, separadas em caixas, medindo
41x34x17 cm, em grupos de 5 animais para evitar estresse por isolamento. A
idade dos animais foi escolhida a partir de estudos que apontam o
desenvolvimento rápido pela infância, atingindo a maturidade sexual com 6
semanas de vida, correspondente ao período da adolescência no homem. Por
volta do dia 63 de vida, o animal já é considerado adulto jovem (ANDREOLLO
et al., 2012; SENGUPTA, 2013).
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Farmacologia da
Inflamação e do Comportamento, da Faculdade de Farmácia, do Instituto de
Ciências da Saúde da Universidade federal do Pará e nas salas onde
ocorreram os testes comportamentais foram utilizadas lâmpadas fluorescentes
para iluminação (12 lux). Os animais foram levados para as salas de testes
para aclimatação e ambientação pelo menos uma hora antes dos testes, sendo
que a avaliação comportamental não excedeu o horário de 18:00h para não
haver alteração dos resultados por causa do ciclo circadiano dos animais.
Após a realização dos testes comportamentais, os animais foram
sacrificados com deslocamento tronco-cervical. As amostras biológicas foram
coletadas e as carcaças foram descartadas conforme normas institucionais.
43
3.2 Tratamento
3.2.1 TRATAMENTO COM MeHg
Os animais receberam solução de MeHg (SIGMA ALDRICH®) por via
oral, gavagem com cânula orogástrica (INSIGHT, BRASIL), na dose de
0,04mg/Kg/dia durante 35 dias. A dose de MeHg foi padronizada por Kong et
al. (2013) que determinou que esta concentração não produz sintomas comuns
de intoxicação em doses elevadas de MeHg, como cruzamento dos membros
posteriores, distúrbios da marcha, e diminuição da atividade em roda giratória
(DAY; REED; NEWLAND, 2005).
Da mesma forma, esta dose não causa efeitos neurológicos visíveis e
por este motivo foi escolhida para maximizar os efeitos conhecido por CELDs
de MeHg. Trata-se de uma dose de baixa concentração que não leva a
intoxicação aguda, portanto, a dose utilizada no tratamento mimetiza uma dose
a qual o homem pode ser exposto pela alimentação. Os animais controle
receberam água destilada por gavagem.
3.2.2 TRATAMENTO COM EtOH EM PADRÃO BINGE
As ratas receberam solução de EtOH (NUCLEAR, BRASIL) à 20% (P/V)
por via oral (gavagem) com cânula orogástrica (INSIGHT, BRASIL) na dose de
3g/kg/dia durante três dias consecutivos, uma vez por semana, até
completarem 5 semanas (35 dias) de tratamento. As doses utilizadas foram
padronizadas a partir de levantamentos epidemiológicos realizados pelo
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia para Políticas Públicas do Álcool e
Outras Drogas (INPAD) e NIAAA no qual se optou por utilizar fêmeas, consumo
em “binge” (5 doses/ocasião), frequência de três dias consecutivos por
semana.
Nos dias em que houve tratamento alcoólico, a administração foi
realizada 120 minutos após o tratamento com MeHg, pois é o tempo médio de
esvaziamento gástrico de ratos da espécie Wistar (DALL’AGNOL et al., 2014),
com a finalidade de reduzir possíveis interações químicas no tubo digestivo,
44
evitando também a introdução de grandes volumes de líquidos e distensão
estomacal (Figura 3).
Figura 3: Tratamento experimental com MeHg e EtOH.
3.3 Grupos experimentais
Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais: BASAL;
CONTROLE; MeHg; EtOH; e MeHg+EtOH (Quadro 1).
Quadro 1 – Grupos experimentais, descrição do tratamento e número de animais por grupo.
GRUPO DESCRIÇÃO NÚMERO
BASAL Animais sem tratamento e sem realização de ensaio comportamental. 05
CONTROLE
Recebeu oralmente água destilada todos os dias por 35 dias (controle do MeHg) e mais uma dose adicional de água destilada por dia durante três dias consecutivos uma vez por semana (controle do EtOH).
10
EtOH Recebeu oralmente água destilada todos os dias por 35 dias e mais EtOH três dias consecutivos, uma vez por semana até completar 35 dias.
15
MeHg Recebeu oralmente MeHg durante 35 dias e mais uma dose de água destilada por dia durante três dias consecutivos uma vez por semana.
15
45
MeHg+EtOH Recebeu oralmente MeHg durante 35 dias, mais EtOH três dias consecutivos, uma vez por semana até completar 35 dias. 15
TOTAL 60
O grupo BASAL foi inserido para a coleta de amostras biológicas,
plasma e sangue total, para avaliação dos parâmetros basais dos testes para
estresse oxidativo de ratas fêmeas do gênero Wistar. Este grupo não realizou
gavagem e não realizou ensaios comportamentais.
3.4 Ensaios comportamentais
3.4.1 TESTE DO CAMPO ABERTO
O teste do campo aberto (TCA) é uma importante ferramenta para
análise da locomoção em roedores, no qual o comportamento de ratos e
camundongos pode ser afetado por dois padrões comportamentais, a atividade
locomotora e a emocionalidade, correspondente ao comportamento tipo
ansiedade (DEFRIES; HEGMANN; WEIR, 1966; VON HÖRSTEN et al., 1998).
A atividade de locomoção espontânea que é mensurada no TCA, assim
como a emocionalidade/ansiedade, podem ser avaliadas em arenas quadradas
ou circulares (BADISHTOV et al., 1995), e envolve o paradigma conflituoso
para o animal, pois ratos possuem a tendência natural de exploração de novos
ambientes, porem evitam áreas abertas e bem iluminadas (DEFRIES;
HEGMANN; WEIR, 1966). Este modelo permite avaliar tanto medidas de
exploração (locomoção, levantamento, farejamento), quanto medidas aversivas
(defecação, micção, congelamento; NAHAS, 1999).
Para este teste, foi utilizada uma arena em madeira (100x100x40cm),
pintada com material impermeável, divididos em 25 quadrantes iguais
(20x20cm) separados em duas zonas: central (36%) e periférica (64%).
Inicialmente os animais foram colocados individualmente no quadrante central
do campo aberto e foi permitido o livre deslocamento dentro do aparato por 5
minutos, que foram filmados através de câmera posicionada acima da arena
(Figura 4).
46
Figura 4: Aparato do campo aberto.
A arena de testes foi limpa com solução de álcool a 10% entre um
animal e outro para remoção de qualquer odor que pudesse influenciar os
padrões comportamentais. Foram contabilizados os seguintes indicadores, de
acordo com o protocolo de Walsh e Cummins (1976) e Pandolfo et al. (2007):
a) número de quadrantes cruzados totais (locomoção total); b) distância total
percorrida; c) quadrantes centrais cruzados; d) tempo na área central.
A avaliação dos padrões comportamentais foi mensurada
automaticamente usando o sistema de monitoramento de vídeo ANY-maze®
versão 4.99 (STOELTING CO., USA).
3.4.2 TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO
O Labirinto em Cruz Elevado (LCE) é um modelo de teste em animais de
ansiedade de respostas incondicionadas (HANDLEY; MITHANI, 1984). O LCE
é um aparato elevado do chão, constituído de duas passarelas em forma de
uma cruz simétrica, tendo dois braços opostos fechados por paredes laterais, e
dois braços opostos abertos elevados do chão a uma altura de 50 cm. Perfis de
ansiedade observados no LCE parecem incluir elementos como neofobia,
exploração e conflito de aproximação/esquiva. Assim, o aparato é
47
frequentemente referido como um modelo comportamental de resposta
incondicionada de conflito espontâneo (HOGG, 1996; RODGERS; DALVI,
1997; WALL; MESSIER, 2001).
Desta forma, o LCE é um teste de conflito baseado na etologia do
animal, entre aproximação e esquiva, que é sensível ao tratamento com
medicamentos ansiolíticos (CRUZ; FREI; GRAEFF, 1994; PELLOW; FILE,
1986). Ratos preferem locais escuros, fechados e pequeno a um local amplo,
aberto e bem iluminado, no entanto ainda mantem o comportamento altamente
exploratório (KARL; PABST; VON HÖRSTEN, 2003).
Uma das primeiras tarefas de LCE de ratos foi desenvolvido por
Montgomery et al. (1955) que gerou a hipótese que a geração de estímulo à
novidade gera tanto um comportamento exploratório de aproximação, quanto
um comportamento de esquiva levando a um medo dirigido, que foi utilizada
para desenvolver o LCE, sendo que este medo dirigido, ou ansiedade, pode ser
mensurado pela proporção de entrada nos braços abertos e braços fechados
(MONTGOMERY, 1955).
Os braços abertos e fechados do labirinto geram comportamento
exploratório e evitar os braços abertos elevados é uma indicação da
intensidade de ansiedade (HOGG, 1996; LISTER, 1987). Este teste foi validado
farmacologicamente, pois drogas ansiolíticas foram responsáveis por aumentar
a entrada nos braços abertos, assim como agentes ansiogênicos diminuem as
entradas neste braço (HANDLEY; MITHANI, 1984).
No início do teste, o animal foi colocado no centro do LCE com a face
voltada para um dos braços fechados, sendo permitida a exploração do
labirinto por 5 min. A ansiedade pode ser medida pelo tempo gasto nos braços
abertos, bem como o percentual de entradas nos braços abertos (HOGG, 1996;
PELLOW; FILE, 1986). Estes parâmetros estão inversamente relacionados
com a ansiedade. O número de entradas no braço fechado reflete a atividade
motora geral (PELLOW; FILE, 1986). Além disso, o movimento de mergulhar a
cabeça sobre as bordas dos braços abertos, a avaliação de risco, o grooming e
os bolos fecais também podem ser registrados (KARL; PABST; VON
HÖRSTEN, 2003). Após cada sessão de teste do animal, o aparato foi limpo
48
com solução de álcool a 10% para evitar influência de odores sobre os
parâmetros comportamentais.
O número de entradas nos braços abertos (EBA) e fechados (EBF) e o
tempo de permanência dos animais nos braços abertos (TBA) do equipamento
foram medidos automaticamente usando o sistema de monitoramento de vídeo
ANY-maze® versão 4.99 (STOELTING CO., USA).
As porcentagens de EBA (%EBA) foram calculadas em relação ao
número total de entradas nos dois braços e, as de TBA (%TBA), ao tempo de
exploração nesses braços em relação ao tempo total do experimento. As
%EBA e %TBA foram respectivamente calculadas de acordo com as fórmulas:
(EBA / EBA + EBF) x 100; (TBA / TBA + TBF) x 100 (Figura 5; BAHI, 2013;
PANDOLFO et al., 2007; PELLOW; FILE, 1986).
Figura 5:Aparato do labirinto em cruz elevado.
3.4.3 TESTE SPLASH
O teste foi realizado de acordo com Isingrini et al. (2010), com
modificações (FREITAS et al., 2013).O teste splash é um modelo validado
farmacologicamente, em que o animal apresenta uma forma de comportamento
49
motivacional considerado paralelo com alguns sintomas de depressão, tais
como o comportamento apático (WILLNER, 2005). Além disso, a indução de
comportamento de autolimpeza é associado com a reatividade hedônica no
teste de preferência à sacarose e aumento de tempo de imobilidade no teste de
nado forçado (GRIEBEL; STEMMELIN; SCATTON, 2005; POTHION et al.,
2004).
O teste consiste em esguichar solução de sacarose a 10% na pelagem
que reveste a região dorsal do animal, que foram colocados em caixas de
acrílico (9x7x11cm) individualmente. Devido à sua viscosidade, a solução de
sacarose suja a pele do rato, e este inicia o comportamento de limpeza. Após a
aplicação da solução de sacarose, o tempo de latência para autolimpeza e o
tempo da autolimpeza foram registrados manualmente por um período de 5
minutos, como um índice de autocuidado e comportamento motivacional. Após
a sessão de cada animal, as caixas foram limpas com uma solução de etanol à
10% para eliminar os vestígios de outro animal (Figura 6).
Figura 6: Teste splash
50
3.4.4 TESTE DO NADO FORÇADO
O teste do nado forçado foi executado de acordo com o proposto por
Porsolt, Le Pichon e Jalfre (1977), e neste teste o animal é colocado em um
cilindro com água suficiente para que não possa apoiar-se no fundo. Desta
forma, o nado constitui um estressor intenso que não pode ser controlado e
inescapável, no qual inicialmente o animal apresenta intenso nado e escaladas,
com perspectiva de fuga eminente, porém com a impossibilidade de escape, os
animais apresentam um típico comportamento de imobilidade, que são simples
movimentos suficientes para manter o animal flutuando na água.
Este teste é conhecido como um modelo do “desespero
comportamental”. Em animais com comportamento do tipo depressivo, o tempo
de imobilidade tende a ser maior. Esse período de imobilidade é acompanhado
de hipotermia e se prolonga por 30 minutos após o teste, podendo apresentar
um comportamento de apatia, com animais que tenham desistido de fugir do
ambiente, caracterizando o estado tipo depressivo (CRYAN; MARKOU; LUCKI,
2002; PORSOLT; LE PICHON; JALFRE, 1977).
Gomez et al. (2003) relata que o nado forçado acompanha alterações de
neurotransmissores que podem ajudar na elucidação da etiologia da
depressão, assim como é um modelo que serve para desenvolvimento de
novas alternativas terapêuticas ou fármacos.
Os animais foram submetidos ao teste de maneira individual, assim
sendo colocados no cilindro de vidro (50 cm de altura com 30 cm de diâmetro),
com uma coluna de água de 40 cm a uma temperatura de 23 + 1ºC e ficaram
no aparato por 5 minutos, no qual os 2 primeiros minutos foram para
reconhecimento do ambiente como aversivo, sendo contabilizados o tempo de
imobilidade, tempo de nado, números de escaladas nos 3 minutos finais do
teste. Os animais foram retirados do equipamento e secos com auxílios de
flanelas e colocados na gaiola com palha seca (Figura 7).
51
Figura 7: Teste do nado forçado.
FONTE: Modificado de Cryan. Markou e Lucki (2002).
3.4.5 TESTE DA ESQUIVA INIBITÓRIA
Este teste é utilizado em estudo sobre a aprendizagem e memória, que
consiste na obtenção da resposta comportamental a partir de um estímulo
aversivo (IZQUIERDO et al., 1998; MAIA et al., 2009), no qual a esquiva
inibitória de uma sessão é um modelo de condicionamento ao medo, que
envolve estímulo condicionado e não condicionado, onde a plataforma segura
representa o estimulo condicionado e o choque que é aplicado no animal ao
descer da plataforma com as 4 patas é o estimulo não condicionado,
determinado pelo tempo de latência de descida da área segura (CAMMAROTA
et al., 2004).
O teste consiste em um equipamento do tipo Step Down (INSIGHT ®,
EP 104R) em alumínio de 2 mm, com pintura epóxi de alto impacto, na cor
bege claro, que possui no chão de barras paralelas de aço inoxidável com
espaçamento de 12,5 mm, com área interna de fuga com dimensões
52
200mmx75mm, porta superior e frente em acrílico transparente e bandeja
coletora de dejetos e urina (Figura 8).
Figura 8: Aparato da esquiva inibitória.
O protocolo experimental foi aplicado em um período de 3 dias. No
primeiro dia foi realizada a habituação dos animais ao aparato por um período
de 180 segundos. O segundo dia consistiu em colocar os animais
individualmente na plataforma segura com a face virada de forma oposta ao
observador, no momento que o animal desceu com as 4 patas na grade foi
aplicado um choque de 0,4 µA durante 1 segundo e foi retirado do
equipamento imediatamente. Esta etapa correspondeu à etapa da linha de
base 1 (LB1).
Para a avaliação da memória de curta duração (MCD), foi considerada a
linha de base 2 (LB2) que foi avaliada 1,5h após o procedimento da LB1, e o
tempo de permanência do animal na plataforma é indicativo de retenção de
memória, sendo o tempo máximo para descida do animal padronizado em 180
segundos. 24 horas após a LB2, os animais foram reexpostos ao aparato,
como já descrito, para a avaliação de memória de longa duração (MLD). O
tempo de permanência do animal na plataforma foi indicativo de retenção de
53
memória, no qual o tempo máximo para descida do animal também foi
padronizado em 180 segundos.
3.5 Coleta de pelos e sangue intraventricular
Após os ensaios comportamentais, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical, em seguida foi realizada a coleta de pelos da região
dorsal dos animais com auxílio de uma tesoura e armazenados em envelopes
identificados, para realização de dosagem de mercúrio total.
Par a coleta de sangue foi escolhida a retirada da região intravetricular
de todos os grupos experimentais, assim como o grupo BASAL. O
procedimento consistiu na realização de toracotomia para ter acesso à
cavidade torácica. Em seguida, com auxílio de seringa de 5 ml e agulha 25x8,
foi realizada a perfuração do coração pela região do ventrículo esquerdo e
retirado de 2 a 3 ml de sangue de 5 animais por grupo experimental em um
total de 25 animais, para realização das dosagens dos parâmetros do estresse
oxidativo.
Após a coleta de sangue, as amostras foram colocadas em tubos de
ensaios de 5 mL que haviam sido adicionado previamente uma gota de EDTA
para evitar a coagulação das amostras. Em seguida, os tubos contendo as
amostras foram colocados em centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos para
separação dos elementos figurados e plasma. Procedeu-se a coleta do plasma
com auxílio de pipeta automática e as amostras de plasmas foram estocadas
em eppendorf de 2,5 mL e acondicionadas sob refrigeração (±0ºC).
As amostras de sangue total foram coletadas da maneira supracitada,
porém armazenadas em tubo vácuo K3/EDTA de 4 mL (LABOR IMPORTS),
em seguida armazenados sob refrigeração (-20ºC).
3.6 Dosagem de mercúrio total
A técnica de dosagem de mercúrio total (Hg Total) nas amostras de
pelos foi realizada de acordo com a metodologia de Voegborlo e Akagi (2007),
54
utilizando os mesmos procedimentos feitos para amostras de cabelos
humanos. A dosagem de Hg Total foi realizada no Laboratório de Toxicologia,
da Seção de Meio Ambiente, do Instituto Evandro Chagas.
Inicialmente, as amostras foram preparadas e cortadas. Pesou-se
aproximadamente 10 mg de amostra e colocou em um balão volumétrico
PyrexR, (Koei Co. Ltd., Kumamoto, Japão), por se tratar de um frasco mais
resistente. Adicionou-se 1mL de água deionizada, 2 mL de HNO3-HClO4 (1+1),
e 5 mL de H2SO4 em sequência. Aquecendo-se em uma chapa elétrica à 200-
230°C durante 30 minutos. Deixou-se esfriar, em seguida, adicionou água
deionizada para fazer um volume fixo (50 mL), sendo resultante como a
solução amostra.
Para a leitura da solução amostra foi empregado o método que envolve
redução e espectrometria de absorção atômica por vapor frio, com sistema
aberto de circulação do fluxo de ar, conhecido por Analisador de Mercúrio
Semi-automatizado Modelo Hg-201 (Sanso Seisakusho Co. Ltd., Tóquio,
Japão). Ocorre a redução de íons Hg2+ na solução da amostra com cloreto
estanhoso para gerar vapor de Hg; e a introdução de vapor de mercúrio na
célula de foto-absorção para a medida de absorbância a 253,7 nm.
O aparato constitui um sistema fechado e inclui uma bomba de
diafragma, recipiente de reação, armadilha de gás ácido, armadilha de umidade
(banho de gelo), e uma válvula de 4-estágios. Durante sua operação, o vapor
elementar gerado pela adição de cloreto estanhoso é circulado via válvula de 4-
estágios a uma taxa de fluxo de 1-1,5 L/min por 30 segundos para
homogeneizar a concentração na fase gasosa. A válvula de 4-estágios é então
girada 90° para introduzir a fase gasosa toda de uma vez na célula de foto-
absorção. A leitura foi realizada em um registrador com um pico preciso para
cada amostra, que foram lidas em duplicata.
Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão e
expressos em parte por milhão (ppm) de mercúrio total.
55
3.7 Avaliação do estresse oxidativo
Os ensaios de estresse oxidativo foram realizados no Laboratório de
Ensaios in vitro, Imunologia e Microbiologia, da Faculdade de Farmácia,
Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará.
3.7.1 NITRITOS E NITRATOS
O ensaio de Griess é um dos métodos mais populares e mais simples
utilizados para detectar a concentração de NO. O mecanismo de Griess é
resumido como o acoplamento azo entre as espécies de diazônio, que são
produzidos a partir de sulfanilamida por NO2, e N-naftil-etilenodiamina.
Portanto, o total de metabólitos de NO são detectáveis.
A análise quanto à produção de nitritos e nitratos pela reação de Griess
ocorreu de acordo com Green et al. (1982). As amostras foram
desproteinizadas com auxílio de sulfato de zinco (ZnSO4) 15 g/L, em seguida
centrifugadas a 3000 rpm durante 15 minutos, sendo pipetado o sobrenadante.
Foram adicionadas 100µL destas alíquotas em cubeta para leitor de ELISA
incubadas com 100µL dos reagentes (50µL da solução de sulfanilamida 1% e
50µL de solução de N-naftil-etilenodiamina 0,1% em 2,5% de H3PO4) à
temperatura ambiente por 10 minutos. A leitura foi realizada em leitor de ELISA
com absorbância de 570 nm.
3.7.2 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL EQUIVALENTE AO TROLOX
O princípio do ensaio de antioxidante equivalente ao Trolox (TEAC) é a
formação de radical cátion do sal diamônio do ácido 2,2’-azinobis(3-
etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS∙+), um cromógeno solúvel de coloração
verde que pode ser determinado por espectrofotometria. A supressão da
produção do cátion pelos antioxidantes funciona de modo dependente da
concentração e da intensidade que a coloração diminui. O Trolox (ácido 6-
hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico; ALDRICH CHEMICAL), um
análogo da vitamina E solúvel em água serve como padrão antioxidante.
56
A TEAC foi determinada segundo o protocolo modificado (RE et al.,
1999). Em um momento antecedente à dosagem das amostras biológicas, foi
necessário o preparo dos reagentes e soluções, como a solução salina
isotônica (PBS) em pH 7,2, a solução de estoque do (ABTS∙+), solução de
estoque de Trolox e solução de trabalho de ABTS∙+. O PBS foi preparado com
finalidade de solvente no preparo dos reagentes e diluição das amostras
através de 1 litro de água destilada, 1,48 g de fosfato de sódio dibásico
(Na2HPO4), 0,43 g de fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4) e 7 g de cloreto
de sódio (NaCl). O pHmêtro foi ajustado para pH 7,2.
A solução de estoque de ABTS∙+ (2,45 mM) foi preparada pela reação
entre o sal diamônio do ácido 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico)
(ABTS) (SIGMA-ALDRICH®) com o persulfato de potássio (K2S2O8)(SIGMA-
ALDRICH®). Foram pesados em balança analítica 0,0768 g de ABTS 7mM e
0,7560 g de K2S2O8 140 mM em 2 béqueres separados. Após a pesagem,
eram acrescentados 20 ml de PBS em cada becker, e retirados 352 μl da
solução contendo o ABTS e acrescentados a esta 352 μl da solução de
K2S2O8. O béquer permaneceu por 12 a 16 horas em temperatura ambiente na
bancada e embrulhado em papel alumínio para evitar a entrada da luz,
condições necessárias para a reação adequada de formação do radical cátion
ABTS∙+. A solução de estoque de Trolox foi preparada pela mistura de 0,647 g
Trolox, o ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico (ALDRICH
CHEMICAL CO) em 1 litro de PBS em placa agitadora magnética.
Finalmente, a solução de trabalho de ABTS∙+ foi preparada 12-16 horas
após o preparo da solução de estoque de ABTS∙+. Foi misturada solução de
estoque ao PBS compassadamente até que a absorbância em
espectrofotômetro atingisse 0,7 ± 0,02. Primeiramente, o espectrofotômetro foi
calibrado na leitura de 734 nm, zerando com PBS. Com todas as soluções e
reagentes preparados, deu-se início às dosagens das concentrações de Trolox
e das amostras de plasma. Foram separados 6 tubos de ensaio, identificados
de “A” a “F”, para colocar solução de estoque de Trolox e PBS em cada tubo
para construir uma curva padrão da atividade antioxidante de Trolox em função
da concentração.
57
As leituras foram realizadas em espectrofotômetro calibrado em 734 nm.
Inicialmente, sendo acrescentados a cubeta 2970 μl de solução de trabalho,
seguido da leitura da absorbância em espectrofotômetro. Este valor
corresponde ao T0. Posteriormente, foram acrescentados 30 μL da solução de
Trolox, homogeneizado e acionando o cronômetro para marcar 5 minutos.
Passados 5 minutos, foi anotada a absorbância, que corresponde a T5. O
processo foi repetido para cada tubo.
A leitura das amostras foi realizada igualmente, sendo que, foi
acrescentado 30 μl da amostra de plasma à solução de trabalho ao invés da
solução de Trolox. O cálculo dos resultados foi obtido a partir do emprego de
fórmulas baseadas nos resultados das absorbâncias dos tubos A-F, curva
padrão (R2= 0,9964; y=0,01732x-0,1367) para, então, obter-se o cálculo da
capacidade antioxidante da amostra equivalente ao Trolox, na seguinte ordem:
TAAc = (T0+T5/T0) – TAA do controle branco e TEAC = (TAAc-
0,1367)/0,01732.
Os resultados finais foram expressos em micromoles por litro (µM/L),
valor correspondente a concentração do Trolox com capacidade antioxidante
equivalente à da amostra analisada (MILLER et al., 1993; RE et al., 1999).
3.7.3 DOSAGEM DE ATIVIDADE DA ENZIMA SOD
A metodologia de dosagem a atividade de SOD foi feita de acordo com
McCord e Fridovich (1969), que consiste na determinação enzimática da SOD
por competição com a enzima xantina oxidase (XOD) pelo radical superóxido.
Inicialmente, preparou-se a solução de tampão fosfato de potássio,
49,3mg/mL de água ultrapura, com pH final da solução de 7,8. Em seguida foi
realizada a solução de EDTA, à 4 mg/mL.
A solução de citocromo C à 1,1 mM foi feita pesando-se 14,6mg/mL da
solução de citocromo C e diluindo em água ultrapura. A solução de xantina foi
preparada com a dissolução e 1,64 mg em 90 Ml de água ultrapura, com
adição de pequena quantidade de 1N de KOH. Em seguida, a solução foi
transferida para a balão volumétrico de 100 mL e aferido com água. A última
58
solução produzida foi a enzima xantina oxidase a 0,05 unidades/mL. Após a
fabricação de todas as soluções, os reagentes foram misturados nas seguintes
proporções:
Água ultrapura – 23 mL
Reagente tampão fosfato de potássio – 25 mL
Reagente EDTA – 1,0 mL
Reagente citocromo C – 1,0 mL
Solução de xatina – 50 mL
Todas as soluções acima foram misturadas e ajustadas o pH para 7,8,
formando a solução de coquetel. Em seguida, foi realizada da checagem da
XOD, de acordo com a metodologia.
As amostras foram preparadas para a leitura, em que foram retirados
100 µL e adicionados 400 µL de água gelada para promover hemólise. As
cubetas foram preparadas para a leitura da seguinte forma:
Branco Não inibido Teste
Solução coquetel (mL) 2,8 2,8 2,8
Água purificada (mL) 0,2 0,1 -
Amostra (mL) - - 0,1
Reagente XOD (mL) - 0,1 0,1
Foi totalizada 3 mL nas cubetas, que foram lidas em espectrofotômetro
Spectra MAX 250 (Molecular Devices, Union City, CA, USA) com comprimento
de onda 550nm, no tempo de 5 minutos, sendo que os valores de absorbância
foram anotados do tempo 0 (T0) e tempo 5 (T5). O T0 foi anotado antes da
adição do reagente XOD, em seguida foi adicionado o XOD e contados 5
minutos para verificar como final de reação (T5).
Os resultados foram calculados a partir das seguintes fórmulas:
%inibição = (∆A550nm/min Não inibido - ∆A550nm/min Teste)x(100)
(∆A550nm/min Não inibido - ∆A550nm/min Branco)
Em seguida:
Enzima (Unidades/mL) = (%inibição)x(Fator de diluição)
(50%)x(0,10)
59
Onde: 50% é a taxa de redução do Citocromo C por definição de
unidade; e 0,10 o volume em mililitros da amostra usada em cada teste. Os
resultados finais foram expressos em Unidades/mL.
3.7.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA CATALASE
A determinação da atividade da catalase foi realizada de acordo com a
metodologia de Aebi (1984), modificado por Bukowska e Kowalska (2004).
Inicialmente a amostra de sangue total foi preparada para a análise. Uma
alíquota da amostra foi retirada e foram hemolisadas com adição de água
gelada (1:3) em seguida, foram diluídas com solução tampão TRIS base
(Tampão Tris 1 M / EDTA 5mM pH8,0).
A verificação da atividade da catalase é realizada pela medida da taxa
de decaimento de H2O2. Para isso preparou-se a solução de reação, que
consiste em 50 µL de H2O2 (30%) com 50 mL de água ultrapura, retirando-se 5
mL desta solução e adicionando 2,5 mL da solução TRIS base e 2 mL de água
ultrapura, deixando em banho-maria (37ºC) durante 15 minutos.
Para a leitura, foi colocada 8 µL da amostra com 3,992 µL da solução de
reação. A diminuição da concentração de H2O2 foi verificada a λ=240 nm a
25°C durante 60 segundos. A atividade de catalase foi definida como a
atividade necessária para degradar um 1 mol H2O2 em 60 seg, em pH 8 a
25°C.
Para calcular a atividade de catalase foi utilizada a equação:
(2,3/∆t)x(a/b)x(Log a1/a2), onde ∆t é a variação do tempo da reação (60s), a é
o volume do hemolisado na cubeta, b é a concentração de proteínas totais da
amostra em g/dL, a1 é o valor da absorbância no tempo 0 (t=0s) e a2 é o valor
da absorbância no tempo final (t=60s). Os resultados finais foram expressos
em k/gProt/min.
60
3.7.5 DOSAGEM DE PROTEÍNAS TOTAIS NO HEMOLISADO
Determinar a quantidade de proteínas contidas nas amostras é
fundamental para obterem-se os valores finais de catalase. Estes valores foram
obtidos a partir do método do biureto modificado (WEICHSELBAUM, 1946) e
usado o kit comercial para proteínas totais da Doles®.
O método do reagente de biureto modificado baseia-se em uma reação
com formação de cor com as proteínas. Isoladamente, o biureto não reage com
as proteínas, somente após sua alcalinização dá-se o desenvolvimento de
reação corada.
O procedimento inicial é a preparação da solução de uso de biureto. A
solução biureto de uso apresenta a seguinte composição: Citrato Trissódico
0,114M, Carbonato de Sódio 0,21M e Sulfato de Cobre 0, 01M.
Em seguida, houve o preparo dos tubos de ensaio, no qual foram
preparadas as amostras, o branco e o padrão. Adicionou-se 2,5 mL do
reagente de biureto (solução de uso) em todos os tubos, em seguida 50 µL da
amostra, com exceção dos tubos branco e padrão. Em seguida, adicionou-se
50 µL da solução padrão (4g/dL) nos tubos padrões. Nos tubos brancos não
foram adicionados amostra nem solução padrão.
Por fim, foi adicionado 2 gotas de Hidróxido de Sódio 6M em todos os
tubos de ensaio. Homogeneizou-se e deixou-se em repouso durante cinco
minutos, à temperatura ambiente (20-30ºC). Por seguinte, foram adicionadas
aos poços da placa de leitura de ELISA e realizadas as leituras, comprimento
de onda em 550nm ou filtro verde, acertando o zero com o branco.
O cálculo de proteínas totais foi realizado de acordo com a fórmula:
Proteínas totais = (Absorbância teste/Absorbância padrão) x4. Os valores finais
foram expressos em g/dL.
3.7.6 DOSAGEM DE GLUTATIONA TOTAL NO HEMOLISADO
A GSH é um tripeptídeo, formado por L-γ-glutamil-L-cisteinilglicina, que
exerce várias funções na célula. Entre elas, destaca-se o papel como cofator
61
da família de enzimas GPx, em que desempenha papel protetor contra o
estresse oxidativo, com sua oxidação a glutationa dissulfeto. A GSH é o único
tiol não proteico presente em espécies aeróbias e atua como importante
antioxidante, que inclui ação como desintoxicante de xenobióticos e de EROs
(VASCONCELOS et al., 2007).
A determinação dos níveis intracelulares de GSH foi realizada de acordo
com a metodologia de Ellman (1959), com modificações (SCHALCHER et al.,
2014). Este método é baseado na capacidade que a GSH presente na amostra
possui de reduzir o composto ácido-5,5-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) para
ácido nitrobenzóico (TNB), sendo esta reação acompanhada por leitura no
espectrofotômetro à 412 nm.
Foi retirada 20 µL do sangue total e adicionado à 180 µL de água
destilada, formando assim o hemolisado. A partir do hemolisado, foram
retirados 20 µL e adicionados mais 20 µL de água destilada e 4 mL de
PBS/EDTA e agitados em vórtex.
Para o procedimento de leitura foram retirados 3 mL da amostra e
colocadas na cubeta de leitura do espectrofotômetro, sendo lido a absorbância
referente ao tempo 0 (T0). Seguidamente, foram adicionados 100 µL do DTNB
e foi iniciada a contagem do tempo de 3 minutos.
As amostras foram lidas no tempo de 1 minuto a partir da adição da
reagente (T1) e no tempo de 3 minutos (T3).
Para calcular a concentração de GSH na amostra foi utilizada a equação
de uma curva padrão realizada previamente (y=154,38x-3,2983; R²=0,9421).
As concentrações de GSH nas amostras foram expostas em µg/mL.
3.7.7 DOSAGEM DE MALONDIALDEIDO
A dosagem de MDA foi realizada de acordo com a metodologia de
Percário (2004), baseado na formação do complexo com ácido tiobarbitúrico
com MDA, TBA-MDA
62
A etapa inicial consistiu em preparar aproximadamente 1000 ml de água
destilada acidificada até pH 2,5, utilizando para isso um pHmetro. Em seguida,
foi pesado 10 g de fosfato monobásico de potássio e misturado em água
destilada acidificada dentro de um béquer de 500 ml até completa dissolução.
O conteúdo foi então transferido para um balão volumétrico de fundo chato de
1000 ml, acrescentando água acidificada até completar 1000 ml da solução.
Dessa forma foram preparados 1000 ml de fosfato monobásico de
potássio – tampão fosfato 75 mM (pH 2,5). O ácido tiobarbitúrico (TBA)
(SIGMA®) 10 Nm utilizado para formação do complexo TBA-MDA. Foi utilizado
0,144 g de TBA para 100 ml da solução de fosfato monobásico de potássio,
terminando a dissolução completa (PERCÁRIO; VITAL; JABLONKA, 1994).
A solução padrão de MDA (1,1,3,3-tetrahidroxipropano, SIGMA®) 20 μM
foi preparada, inicialmente, a partir de uma solução de 400 μM/L, através de
pipetação de 99 μL do produto original em 1L de água destilada usando um
balão volumétrico de 1L. O procedimento seguiu diluindo esta solução na
proporção de 5 ml de solução padrão de MDA 400 μM em 100 ml de água
destilada, chegando a concentração de 20 μM.
Com as soluções prontas, uma estante era montada com tubos de
ensaio identificados, com paredes reforçadas e resistentes a alta temperatura.
Iniciou-se com a pipetagem de 1 ml do reagente TBA 10 nM em cada tubo de
ensaio. Para o tubo de controle branco e padrão foram adicionados 500 μl de
água destilada 500 μl de solução padrão de MDA 20 μM. Por fim, os tubos em
diante receberam 500 μl das amostras de plasma. Em seguida, os tubos
fechados foram colocados em banho-maria à 94 ºC durante 1 hora, a vedação
foi para evitar perda ou contaminação das amostras com água condensada.
Após uma hora de banho-maria, as amostras foram resfriadas em
temperatura ambiente durante 15 minutos. Observou-se nesta fase a coloração
de tonalidade rósea proporcional à quantidade de MDA nas amostras. A cada
tubo de ensaio foi acrescentado 4 mL do reagente álcool n-butílico, tampados
com rolhas apropriadas e submetidos à homogeneização no vórtex para
alcançar máxima extração do MDA para a fase orgânica. Por fim, os tubos
63
foram centrifugados a 2500 rpm por 10 minutos, sendo 3 ml do sobrenadante,
pipetados para a cubeta e lido em espectrofotômetro calibrado em 535 nm e
zerado com o tubo controle branco.
As amostras foram novamente submetidas a alguns minutos em banho-
maria a 37 ºC antes da leitura, caso fosse observado condensação das
amostras nos tubos de ensaio. O cálculo para o valor de MDA da amostra foi
obtido pelo emprego da seguinte fórmula com os resultados expressos em
ng/ml: MDA = Absorbância das amostras x (10 x 440,61/Absorbância padrão
MDA). Todas as etapas experimentais estão descritas na figura 9 abaixo.
Figura 9: Desenho experimental dos testes comportamentais e coleta realizada.
3.8 Análise estatística
Foi realizado o teste de distribuição gaussiana, normalidade, para cada
grupo experimental pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Após a observação da
64
homogeneidade dos dados, foi utilizada ANOVA uma via, seguido de teste de
Tukey para comparações post hoc.
Os dados de cada grupo foram expressos como a média + erro padrão
médio (e.p.m.), em que a probabilidade utilizada como existência de diferença
significativa foi p<0,05. Para construção dos gráficos e a análise estatística foi
utilizado o software GraphPad Prism 5.0.
65
IV RESULTADOS E DISCUSSÃO
66
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Concentração de mercúrio total
A dosagem de mercúrio total do pelos dos animais submetidos ao
tratamento com MeHg, isolado ou em associação com EtOH, mostrou
concentrações de aproximadamente 0,06 ppm no grupo MeHg. O tratamento
concomitante com EtOH evidenciou uma diminuição das concentrações totais
de MeHg em relação ao grupo MeHg (p<0,05), demonstrando que o EtOH
reduz a concentração de MeHg (Figura 10).
Basal MeHg MeHg+EtOH0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
#
[Hg
] to
tal (
pp
m)
Figura 10: Dosagem de mercúrio total em pelos de ratas expostas ao metilmercúrio (MeHg) e MeHg+ etanol (EtOH) da adolescência à fase adulta, durante 5 semanas. Resultados foram expressos como a média + e.p.m. de 5 animais por grupo. Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
Maia et al. (2009) realizando intoxicação concomitante de MeHg+EtOH
em ratas grávidas encontrou resultados semelhantes, com uma redução da
concentração de mercúrio nos pelos analisados. Porém, não pôde concluir se
houve algum tipo de interferência farmacocinética ou farmacodinâmica
responsável por tal resultado.
Por outro lado, trabalho realizado por Tamashiro et al. (1986) com ratos
adultos, verificou que a presença de EtOH em doses crescentes causou
aumento da concentração tanto de MeHg e Hg total em amostras de cérebro,
rins e fígado. Resultados diferentes dos nossos, porem as doses de MeHg e o
67
padrão de consumo de EtOH foram diferentes e pode provocar alterações na
concentração mercurial.
A detecção de Hg em vários tecidos, ainda o cabelo tem sido utilizado
como parâmetro biomarcador de exposição mercurial em várias estudos como
um excelente bioindicador para estimação de exposição ao MeHg em
populações humanas (YASUTAKE et al., 2003, 2004). Para o cabelo, no
momento da formação, o MeHg dos capilares sanguíneos penetra os folículos
pilosos, sendo assim a concentração de encontrada nos cabelos reflete a
concentração de MeHg no sangue (OMS, 1990). No caso do nosso trabalho a
dosagem em cabelo foi extrapolada para o pelo das ratas.
O aumento na concentração de mercúrio ocasionada pela presença de
EtOH, não ocorre sobre todas os padrões de intoxicação (TURNER;
BHATNAGAR; SPEISKY, 1990), assim como o ocorrido em nosso modelo de
intoxicação, que não apresentou este tipo de aumento e sim uma redução do
Hg total.
4.2 Avaliação de peso
A partir dos dados coletados não se observou diferença significativa na
avaliação de peso corporal das ratas expostas (Figura 11) entre os grupos que
receberam água, EtOH, MeHg e MeHg+EtOH, ao longo das cinco semanas de
intoxicação.
68
1 2 3 4 50
50
100
150
200CONTROLEEtOHMeHgMeHg+EtOH
Pes
o (
g)
Figura 11: Avaliação de peso corporal dos grupos CONTROLE, etanol (EtOH), metilmercúrio (MeHg) e MeHg+EtOH, da adolescência à fase adulta, durante 5 semanas. Resultados expressos como a média + e.p.m. de 10-15 animais por grupo. Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
A avaliação de ganho de peso é um parâmetro indicativo da saúde do
animal. Fatores como: tipo de dieta utilizada, o padrão ad libitum e restrição
alimentar podem afetar no peso e consequentemente os resultados dos testes
envolvendo animais (MORAAL et al., 2012).
Modelos de intoxicação com doses maiores de MeHg (5mg/kg, durante
10 dias) e EtOH ad libitum em animais com 49 dias de vida, mostrou redução
do ganho de peso nos grupos isolados e em associação (TAMASHIRO et al.,
1986). A presença dos neurotóxicos, isolados e em associação, em um período
do desenvolvimento mais precoce, na vida intrauterina, mostrou alteração no
ganho de peso em todos os grupos até a vida adulta (MAIA et al., 2009).
A fase do desenvolvimento da adolescência aparenta ser mais resistente
a exposição de MeHg e EtOH, no que se refere ao parâmetro de ganho de
peso. Assim como as doses utilizadas parecem influenciar este parâmetro. A
alteração do ganho de peso por MeHg e EtOH, de acordo trabalhos anteriores
(MAIA et al., 2009; TAMASHIRO et al., 1986), parece ser dependente da dose
utilizada e/ou do período de desenvolvimento de vida do animal.
69
Assim os animais utilizados encontravam-se em uniformidade de peso.
Após a última pesagem dos animais, procederam-se os testes
comportamentais, iniciando com a atividade locomotora.
4.3 Atividade locomotora espontânea
No teste do TCA foi avaliada a locomoção espontânea e a distância total
percorrida. A figura 12 (painel A e B) demonstra que estes dois parâmetros
estavam diminuídos em todos os grupos tratados [Locomoção espontânea:
todos os grupos tratados comparado ao controle (p<0,001); Distância total
percorrida: MeHg (p<0,05), EtOH e MeHg+EtOH (p<0,001)].
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
50
100
150
*** *** ***
Qua
dran
tes
tota
is c
ruza
dos
(nº)
A
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
10
20
30
*** ****
Dis
tânc
ia p
erco
rrid
a (m
)
B
Figura 12: Efeitos da exposição ao etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta sobre a locomoção espontânea no teste do campo aberto. Painel A representa o número de quadrantes totais cruzados. Painel B representa a distância total percorrida. Resultados expressos como a média ± e.p.m. de 10-15 animais por grupo. *Diferença significativa em relação com Controle (p<0,05) e ***(p<0,001). Teste ANOVA uma via seguida do teste Tukey.
Teixeira et al. (2014) também relataram prejuízos motores avaliados no
TCA, com redução da locomoção espontânea em ratos intoxicados
cronicamente desde a adolescência com doses de EtOH (6,5 g/kg/dia) durante
55 dias. Resultado semelhante ao encontrado nesta pesquisa, mesmo que
utilizado outro modelo de intoxicação, assim demonstra que o EtOH tem
capacidade de dano a funções motoras, mesmo em paradigmas de intoxicação
diferentes.
70
A locomoção é um comportamento complexo que envolve diversos
sistemas no cérebro como o cerebelo, o sistema dopaminérgico telencefálico,
córtex motor, corpo estriado, globo pálido e tálamo. O envolvimento de várias
estruturas e sistemas faz com que este comportamento seja influenciado por
danos em qualquer parte do controle motor (HANDLEY et al., 2009; KARL;
PABST; VON HÖRSTEN, 2003).
Alguns danos a vias motoras, no trato cerebelar e ao sistema nervoso
periférico foram descritos como sendo produzidos pelo consumo de EtOH,
provocando prejuízos motores, tanto sobre influência do EtOH, quanto na
abstinência (VASSAR; ROSE, 2014).
O EtOH aparenta possuir tropismo por estruturas como o cerebelo, área
responsável por parte do controle motor integrado, onde a possível
interferência na função mitocondrial parece ser o mecanismo envolvido.
Dietrich et al. (1992) utilizando injeção de NMDA no interior do ventrículo lateral
cerebelar de ratos adultos, induziu ruptura de mitocôndrias, assim indicando
danos por moléculas excitatórias. Sabe-se que a abstinência de EtOH ocorre
um aumento da atividade do receptor NMDA, que pode causar estes danos
supracitados.
Esta ativação do NMDA é mediada por Glu, na abstinência, que também
é uma molécula excitatória, que leva ao aumento de cálcio intracelular mediado
por Glu. A liberação dos receptores glutamatérgicos, antes inibidos pela
presença do álcool, leva a uma ativação destes pelo neurotransmissor Glu,
causando a abertura de canais de cálcio que em excesso pode promover
danos às mitocôndrias (JUNG, 2014).
Assim como no EtOH, o MeHg também foi responsável por alterações
motoras. Yokoo et al. (2003) verificaram que adultos expostos às baixas doses
de MeHg através da alimentação apresentavam danos em funções motoras,
especialmente com comprometimento em testes de velocidade motora fina e
destreza.
71
Em estudos com animais submetidos a intoxicação por MeHg, Dalla
Corte et al. (2013) verificaram uma redução na locomoção espontânea no TCA,
em um modelo de intoxicação de 5 mg/kg/dia durante 21 dias. Estes resultados
são semelhantes aos encontrados neste estudo, mostrando que a locomoção
pode ser alterada, porém de uma maneira tempo dependente.
Alguns estudos apontam que o MeHg possui certa afinidade por
estruturas motoras, entre estas está o cerebelo, onde pode causar danos a
camada granular, envolvendo inicialmente necrose aguda seguida de
apoptose, ainda promovendo dissolução dos microtúbulos paralelo à apoptose
(CASTOLDI et al., 2000).
Além das alterações em nível central, sistemicamente o MeHg pode
atuar provocando lesões em neurônios periféricos, onde ratos tratados com 4
mg/kg/dia durante 21 apresentaram uma ataxia de marcha média a partir do dia
15, e verificou-se que houve degeneração no gânglio da raiz dorsal, em
neurônios do tipo A e B, mediado por processos de neurotoxicidade e processo
de morte anterógrada, respectivamente para cada fibra, sem envolvimento de
apoptose, como descrito para o cerebelo (CASTOLDI et al., 2000).
Com diversos mecanismos sendo descritos para ação do MeHg, Cao et
al. (2013) propuseram que o mecanismo de neurotoxicidade parece ser
dependente do tipo neuronal, assim como dependente de fatores intrínsecos da
célula, ainda não identificados.
Maia et al. (2009), com seu modelo de exposição pré-natal, mostrou no
TCA que a associação não alterou a locomoção dos animais. Sendo que as
respostas para os neurotóxicos depende do modelo experimental usado para
cada comportamento avaliado. Nosso modelo causou redução da locomoção,
podendo ser tanto por ação do MeHg ou do EtOH, sem ação sinérgica ou
aditiva. Outras funções também foram comprometidas pela intoxicação,
relacionadas com distúrbios somáticos, relacionados a transtornos do sistema
límbico.
72
4.4 Emocionalidade
O segundo parâmetro avaliado no TCA foi relacionado aos parâmetros
de emocionalidade, no qual o número de entradas nos quadrantes centrais e o
tempo gasto nos quadrantes centrais (Figura 13, Painéis A e B) apresentaram
uma diminuição significativa nos grupos tratados em comparação ao controle
[Entrada quadrantes centrais: MeHg (p<0,001), EtOH e MeHg+EtOH (p<0,03);
Tempo quadrantes centrais: todos os grupos comparados ao controle
(p<0,001)].
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
5
10
15
***** **
En
trad
a q
uad
ran
tes
cen
tra
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nº)
A
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
10
20
30
40
****** ***
Tem
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ntra
is (
s)
B
Figura 13: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta sobre a emocionalidade no teste do campo aberto. Painel A representa o número de entradas nos quadrantes centrais. Painel B representa o tempo de exploração nos quadrantes centrais. Resultados expressos como a média + e.p.m. de 10-15 animais por grupo. *Diferença significativa em relação ao grupo CONTROLE (p<0,05), **(p<0,03) e ***(p<0,001). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
Para confirmação de atividades tipo ansiogênica, os animais foram
submetidos ao LCE, teste de maior sensibilidade. No qual foram verificados o
percentual de entrada nos braços abertos e do tempo que o animal
permaneceu nos braços abertos (Figura 14, Painéis A e B), apresentando
diferença somente na %EBA do grupo EtOH e MeHg+EtOH em relação ao
controle não apresentando diferença significativa nos demais grupos [%EBA:
EtOH e MeHg+EtOH (p<0,05)].
Como forma de validação motora do teste, observou-se o número de
entrada nos braços fechados (Figura 14, Painel C), que não apresentaram
diferença significativa. Assim, nota-se que na avaliação no TCA pode verificar
padrão ansiogênico nas ratas em todos os tratamentos, enquanto no LCE
73
somente nos grupos envolvendo tratamento com EtOH apresentaram este
comportamento.
Controle EtOH MeHg EtOH+MeHg0
20
40
60
80
*
A
*
%E
BA
Controle EtOH MeHg EtOH+MeHg0
10
20
30
40
B
%TB
A
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
5
10
15
EB
F (n
º)
C
Figura 14:Efeitos da exposição ao etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta no teste do labirinto em cruz elevado.Painel A % de entradas nos braços abertos. Painel B % de tempo nos braços abertos. Painel C número de entradas nos braços fechados. Painel D tempo nos braços fechados. Resultados expressos como a média + e.p.m. de 10-15 animais por grupo. *Diferença significativa em relação com CONTROLE (p<0,05). Teste ANOVA uma via seguida do teste Tukey.
74
O comportamento tipo ansiedade parece ser uma das características
apresentada pelo consumo de álcool etílico durante a fase da adolescência,
como visto por Zhao et al. (2013) que ao utilizar ratos intoxicados com EtOH
(3g/kg/dia, intraperitoneal, por 28 dias) apresentaram comportamento
ansiogênico no LCE, quando testados 72 horas após a última dose, ou seja, na
abstinência.
A ansiedade é uma consequência de vários fatores, entre estes o
ambiente, estado físico, doença de base do SNC, vulnerabilidade aumentada
devido à idade com declínio cognitivo e problemas psicológicos.
Biologicamente, a ansiedade é conceituada como uma interação complexa
entre vários sistemas dentro do cérebro, que incluem o córtex pré-frontal, a
amígdala, vias de norepinefrina e serotoninérgicas ascendentes, assim como
do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (BELZUNG; TURIAULT; GRIEBEL, 2014;
ETKIN, 2012; GOMOLL; KUMAR, 2015).
Estruturas como hipocampo apresentam papel dual dependendo da
região envolvida, em animais a porção do ventral, que no homem corresponde
a parte anterior, regula a ansiedade endógena, enquanto que a região dorsal
hipocampal, posterior no homem, é envolvido com a memória, incluindo a
memória do medo (ETKIN, 2012).
Um dos mecanismos envolvidos com a ansiedade mediada pelo EtOH é
o envolvimento com receptores GABA e NMDA, que na abstinência da droga
ocorre redução do sistema GABAérgico e uma exacerbação da ação de
glutamatérgica, por aumento da atividade NMDA, com alterações no sistema
serotoninérgico (DOREMUS et al., 2003). Sabe-se que o padrão de consumo
em binge, caracterizado por consumo seguido de abstinência, pode causar
danos neuronais relacionados com mobilização de cálcio, podendo ser via
receptor NMDA (HUNT, 1993).
Além do mecanismo proposto acima, Valenzuela (1997) também
explana que o uso prolongado de EtOH pode levar a uma redução da função
do GABAa, sendo assim na abstinência do EtOH, essa redução da atividade
neurotransmissora inibitória pode contribuir para a ansiedade, uma vez que
este sintoma pode ser reduzido com o uso de benzodiazepínicos, agonista de
GABAa (VALENZUELA, 1997).
75
Assim como o EtOH, a ação de MeHg sobre parâmetros de
emocionalidade no TCA demonstrou um indicativo de comportamento
ansiogênico. Bourdineaud et al. (2011), com uso de MeHg em doses que
mimetizaram a dieta de consumo (7 μg/kg) de peixe por humanos em
camundongos com 3 semanas de vida durante 2 meses, verificaram alteração
no comportamento tipo ansiogênico no TCA, com redução no tempo
despendido no centro do aparato, correspondente com nossos resultados.
Maximino et al. (2011), utilizando um modelo de peixe-zebra, também
relatou um efeito ansiogênico agudo na intoxicação por MeHg em baixas
doses, 1 e 5 µg/g, associado com mudanças no sistema serotoninérgico e
aumento do conteúdo de triptamina-4,5-diona, uma serotonina oxidada (CHEN
et al., 1989).
Ainda, Maximino et al. (2011) propôs que sintomas semelhantes a
ansiedade podem ser usados para detectar efeitos precoces de intoxicação por
MeHg, uma vez que este parece ser um efeito precoce associado ao
envenenamento por baixas doses.
Uma das proposições sobre o mecanismo que leva à ansiedade
provocada pelo MeHg envolve o sistema glutamatérgico, assim como o EtOH
possui. Possivelmente, o MeHg por atuar na transmissão de Glu, seja pelo
aumento da produção de Glu (FENG et al., 2014), ou por interferir na
recaptação deste neurotransmissor (MALFA et al., 2014), podendo levar a
quadro de ansiedade.
4.5 Comportamento tipo anedonia e tipo depressivo
Para avaliação destes parâmetros comportamentais relacionado com
comportamentos depressivos utilizou-se dois testes, o teste splash e o nado
forçado. No teste splash foi avaliado o comportamento tipo anedonia. Na figura
15 foi verificado o tempo de latência para iniciar o comportamento de
autolimpeza, assim como pelo tempo de lambidas/autolimpeza (Painéis A e B),
onde os grupos somente tiveram redução do tempo de lambidas em
comparação ao controle [Tempo de lambidas: EtOH (p<0,03), MeHg e
76
MeHg+EtOH(p<0,001)], sendo relacionado com falta de sensação prazerosa
em atividade que anteriormente produziam prazer, característica da anedonia.
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
20
40
60
Tem
po d
e la
tênc
ia (
s)
A
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
50
100
150
*** *****
Tem
po
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da (
s)
B
Figura 15:Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta no teste splash. Painel A representa o tempo de latência. Painel B representa o tempo de lambida. Resultados expressos como a média + e.p.m. de 10-15 animais por grupo.**Diferença significativa em relação com CONTROLE (p<0,03) e *** (p<0,001). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
Após o teste splash, os animais foram submetidos ao teste do nado
forçado, e verificou o tempo de imobilidade, tempo de nado e frequência de
escaladas (Figura 16). Houve aumento no tempo de imobilidade nas ratas que
receberam MeHg e da associação comparados com o controle [Tempo de
imobilidade: MeHg (p<0,05) e MeHg+EtOH (p<0,03)]. Não houve alterações
significativas no tempo de nado dos animais (Figura 16, Painel B), porém o
grupo MeHg+EtOH apresentou redução da frequência da escaladas
[Frequência de escalas: diferença tanto comparado ao controle (p<0,03),
quanto ao EtOH (p<0,05)], fato que pode ser relacionado com alteração motora
apresentada pelo grupo ou com alteração de comportamento tipo depressivo.
77
CONTROLE EtOH MeHg MeHg+EtOH0
50
100
150
****
Tem
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CONTROLE EtOH MeHg MeHg+EtOH0
50
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150
Tem
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s)
B
CONTROLE EtOH MeHg MeHg+EtOH0
1
2
3
4
**#E
scal
adas
(nº
)
C
Figura 16:Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta no teste do nado forçado. Painel A representa o tempo de imobilidade. Painel B representa o tempo de nado. Painel C representa o número de tentativas de escaladas. Resultados expressos como a média + e.p.m. de 10-15 animais por grupo. *Diferença significativa em relação com CONTROLE (p<0,05), **(p<0,03) e ***(p<0,001); #diferença significativa em relação ao EtOH (p<0,05). Teste ANOVA uma via seguida do teste Tukey.
Acerca dos testes utilizados para avaliar depressão, Kalueff e Tuohimaa
(2004) indicaram que o aumento do tempo para iniciar a autolimpeza e a
78
redução no tempo total de lambidas é indicativo de comportamento tipo
depressivo, considerado um paralelo ao comportamento apático e motivacional
observado na depressão (WILLNER, 2005). Da mesma forma, o nado forçado
demonstra comportamentos tipo depressivo, avaliados pelo tempo de
imobilidade (PORSOLT; LE PICHON; JALFRE, 1977).
Estudos vêm apontando a relação entre beber em binge com
sintomatologia depressiva em humanos, com comorbidade de alcoolismo e
depressão (CHOI; DINITTO, 2011; PALJÄRVI et al., 2009). Estudos mostraram
que ratos expostos ao EtOH durante a adolescência apresentam elevados
níveis de dopamina no núcleo accumbens (BADANICH; MALDONADO;
KIRSTEIN, 2007; PASCUAL et al., 2009), assim como após uma dose aguda
de EtOH (PASCUAL et al., 2009). Na retirada do EtOH ocorre uma redução de
dopamina nessa área do SNC (ROSSETTI et al., 1992), sendo associada com
o anseio grave de pacientes alcoólatras desintoxicados (HEINZ et al., 2005).
A dopamina está intimamente relacionada com o fator de liberação de
corticotrofina, onde projeções de dopamina inervam estruturas cerebrais ricas
em expressão deste fator (MELONI et al., 2006), enquanto que o fator de
liberação de corticotrofina aumenta a libertação de dopamina (LAVICKY;
DUNN, 1993). Assim uma redução de dopamina associada com o retirada do
EtOH pode gerar uma redução o fator de liberação de corticotrofina, que como
consequência leva a anedonia (VALDEZ et al., 2002). O modelo em binge leva
a uma retirada abrupta do EtOH, que pode levar a redução de o fator de
liberação de corticotrofina e consequente da dopamina.
O grupo MeHg e a associação apresentaram, além de comportamento
tipo anedonia, comportamento tipo depressivo, mostrando que esta
sintomatologia está envolvida com a intoxicação mercurial. Síndromes
depressivas foram reportadas em humanos após intoxicação por MeHg
(MAGHAZAJI, 1974).
Em um modelo de intoxicação pré-natal, utilizando dose de 0.5
mg/kg/dia de MeHg via água de beber, do dia 7 gestacional ao dia 7 pós-parto,
foi verificado a ação sobre funções da prole, observou-se que as fêmeas não
79
apresentaram nenhuma alteração nos parâmetros comportamentais, somente
os machos, sendo que o comportamento tipo depressivo no nado forçado, com
aumento do tempo de imobilidade, foi encontrado (ONISHCHENKO et al.,
2007). Nossos resultados mostraram que fêmeas também são susceptíveis às
síndromes depressivas provocadas por MeHg, em um modelo de intoxicação
diferente.
Maia et al. (2009) obtiveram resultados semelhantes ao nossos, em
ratos expostos durante a gestação a ambos toxicantes, nas doses de 6,5
g/kg/dia de EtOH e 8 mg/kg de MeHg de forma aguda. Mesmo nestas doses
utilizadas no nosso estudo mantiveram o comportamento avaliado no nado
forçado, assim também sendo esperado um comportamento anedônico, um vez
que existe uma relação entre o aumento do tempo de imobilidade com a
redução da frequência de lambidas (GRIEBEL; STEMMELIN; SCATTON, 2005;
POTHION et al., 2004).
Outra função com danos relacionados aos toxicantes que vem sendo
estudada é quanto ao processo mnemônico.
4.6 Avaliação da memória de curta duração e de longa duração
A fim de avaliar a retenção de memória após um estimulo aversivo, foi
realizado o teste da esquiva inibitória modificado para verificar prejuízos tanto
na memória de curta duração, quanto na de longa duração. No início do teste
(fase de habituação ao aparato) foi verificado que todos os grupos desceram
da plataforma segura de maneira semelhante (Figura 17, Painel A). Após a
descida da plataforma, os animais receberam o choque. Após 90 minutos, os
animais foram reexpostos ao aparato e mediu-se o tempo de latência de
descida da plataforma segura para avaliação da memória de curta duração.
Nesta avaliação, os grupos EtOH (p<0,05) e MeHg+EtOH (p<0,03) reduziram o
tempo de latência de descida, demonstrando prejuízo da memória de curta
duração (Figura 17, Painel B). Além disso, o grupo MeHg+EtOH apresentou
diferença em relação ao grupo MeHg (p<0,05).
80
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
2
4
6
8
10
LB1
(s)
A
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
50
100
150
**
+
*
B
LB2
(s)
Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
20
40
60
80
100
C
+Latê
ncia
(s)
Figura 17:Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) no teste da esquiva inibitória. Painel A representa a linha de base 1 (LB1) que consiste no tempo de latência para o animal descer da plataforma no período da habituação. Painel B representa a linha de base 2 (LB2) que consiste no tempo de latência 90 min após a LB1. Painel C representa o tempo de latência 24 horas após a LB2. Resultados foram expressos como a média + e.p.m. de 10-15 animais por grupo. *Diferença significativa em relação com CONTROLE (p<0,05) e **(p<0,03); +diferença significativa em relação ao MeHg (p<0,05). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
81
Os animais foram reexpostos 24 horas após a LB2 para avaliação da
memória de longa duração (Figura 17, Painel C), utilizando o mesmo
parâmetro, latência para descida da plataforma segura. Neste parâmetro, o
grupo MeHg+EtOH apresentou diferença significativa quando comparado ao
MeHg (p<0,05).
A memória é uma função que é afetada pelo consumo de EtOH. Um
paradigma de binge por 4 dias, dose de 5g/kg/dia, resultou em dificuldades de
aprendizagem e memória (CIPPITELLI et al., 2010; OBERNIER et al., 2002),
além de danos ao sistema corticolímbico, em estruturas do bulbo olfatório,
córtex piriforme, córtex perirrinal, córtex entorrinal e giro denteado do
hipocampo, evidenciando que a exposição ao EtOH em binge de curto prazo
pode levar a mudanças de longo prazo na cognição (OBERNIER et al., 2002).
Danos às funções de memória têm sido relatadas em exposições ao
MeHg. Falluel-Morel et al. (2007) verificou que na exposição única na dose de
5μg/g no dia 7 pós-natal, pode comprometer funções mnemônicas, sendo
avaliados na adolescência (idade 35 dias). Sokolowski et al. (2013) utilizando
uma dose de 0,6 μg/g no mesmo paradigma de exposição única e avaliação na
adolescência, também verificou danos na memória e aprendizagem,
relacionados com danos ao hipocampo, demonstrando que esta estrutura é
sensível mesmo em baixas doses de MeHg.
O grupo de associação apresentou danos na memória de curta, sendo
que Maia et al. (2009) utilizando a esquiva inibitória também verificou prejuízos
sobre a memória de curta duração no tratamento com EtOH+MeHg, resultado
semelhantes aos deste estudo.
A formação de memórias é o resultado de mecanismos celulares e
moleculares ativados em diferentes estruturas do cérebro. A capacidade de um
animal para adaptar o seu comportamento em resposta aos estímulos
ambientais depende da plasticidade estrutural e funcional de várias regiões do
cérebro (GIOVANNINI; LANA; PEPEU, 2015).
A esquiva inibitória é uma forma de aprendizagem associativa que é
adquirido em um julgamento por vários estímulos sensoriais. A memória na
82
esquiva inibitória depende da atividade integrada dos cornos de Amon 1, córtex
entorrinal e parietal posterior, sendo modulado pela amígdala e pelos neurônios
colinérgicos da parte basal do cérebro anterior do septo medial e indiretamente
por hormônios de estresse (CAMMAROTA et al., 2007; IZQUIERDO; MEDINA,
1997; IZQUIERDO, 1989), assim prejuízos nas funções de memória acessada
pelo teste da esquiva inibitória pode estar relacionado com danos nas áreas
supracitadas ou alterações com hormônios do estresse, como corticosterona.
Muitas doenças vêm sendo relacionadas contendo envolvimento com
estresse oxidativo, em vários sistemas, incluído o SNC, como a doença de
Alzheimer e distúrbios de pânico com agorafobia (BAR-OR et al., 2015; GUL et
al., 2013). Porém, para uma melhor abordagem para o estudo do papel do
estresse oxidativo em doenças é necessário primeiro a medir a capacidade
redox em geral do tecido e do sangue antes de avaliar o efeito de compostos
específicos (BAR-OR et al., 2015).
4.7 Avaliação de nitrito/nitrato
A partir do plasma e sangue total coletado das ratas intoxicadas, foi
possível realizar avaliações de parâmetros relacionados com o estresse
oxidativo.
O conteúdo de nitrito/nitrato apresentou níveis aumentados (p<0,001) no
grupo controle submetido ao estresse comportamental, em relação ao grupo
BASAL. EtOH e MeHg+EtOH apresentaram redução dos níveis de NO em
comparação ao grupo controle (p<0,05) e verificou-se uma diminuição da
concentração nos grupos EtOH, MeHg e EtOH+MeHg (Figura 20), quando
comparados com o BASAL (p<0,001), demonstrando um possível consumo de
NO nos grupos tratados.
83
Basal Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
1
2
3
4
5
* *
***
### ### ###
Con
cent
raçã
o de
nitr
ito/n
itrat
o (µ
mol
/L)
Figura 18: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta na produção de nitrito/nitrato. Resultados expressos como a média ± e.p.m. de 5 animais por grupo. *Diferença significativa em relação com BASAL (p<0,05) e ***(p<0,001). ###Diferença significativa em relação a grupo CONTROLE (p<0,001). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
Dentre muitos eventos, a intoxicação pode a acarretar a uma situação de
estresse crônico, na qual estudos apontam que durante este processo de
estresse ocorre ativação de eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, que acarreta em
aumento no metabolismo celular induzido por liberação de glicocorticoides,
levando a formação espontânea de radicais de nitrogênio e oxigênio (CHEN et
al., 2015). Este aumento não foi observado em nossos resultados, pois houve
uma redução de nitrito/nitrato em todos os tratamentos, podendo ser por
diminuição da produção ou consumo em excesso.
Maia et al. (2010b) mostraram que a exposição de desenvolvimento para
EtOH e MeHg, isolados ou em combinação, altera a atividade em nitrérgica no
cérebro do rato adulto de diferentes maneiras. Dependendo da localização, a
atividade nitrérgica é alterada, e EtOH e EtOH + MeHg parecem induzir a uma
supra regulação de NO sintetase enquanto MeHg parece regular
negativamente. O grupo MeHg em nossos testes corroboram com o estudo de
Maia et al. (2010b), enquanto que o EtOH e o grupo de associação não
apresentaram o mesmo resultado. Porém, o paradigma de intoxicação adotado
no trabalho e a amostra testada foram diferentes.
84
Grotto et al. (2009), verificou que em doses baixas de MeHg ocorre uma
depleção de nitritos/nitratos, analisados em sangue total, correlacionando com
danos ao endotélio vascular e hipertensão. Uchino e Araki (1985) reportaram
aumento da incidência de hipertensão e doença vascular cerebral entre
pacientes idosos com doença de Minamata. Assim, essa redução de
nitritos/nitratos pode ser por esta via de danos endoteliais que levam a
distúrbios pressóricos.
Como já citado, o NO tem papel fisiológico, sendo que é produzido no
interior das células e pode seguir duas vias conhecidas, ser consumido em
uma reação de complexação com o H2O2 ou reagir com ânions superóxido para
formação de peroxinitrito (BAUER, 2014). Radi et al. (2002) afirmam que o
peroxinitrito tem papel como mediador chave da disfunção mitocondrial e danos
a esta estrutura, no nosso modelo esta disfunção pode ser relacionada com o
beber em binge de EtOH.
4.8 Avaliação da capacidade antioxidante total equivalente ao Trolox
O TEAC, que não apresentou diferença significativa entre os grupos
(Figura 18), exceto em relação ao grupo Basal (p<0,001).
Basal Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
1
2
3
4
5*** *** *** ***
µm
ol de
equiv
alen
tes
de
Tro
lox/
L
Figura 19: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta na capacidade antioxidante total equivalente ao Trolox. Resultados expressos como a média + e.p.m. de 5 animais por grupo. ***Diferença significativa em relação com Basal (p<0,001). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
85
A exposição dos animais aos testes comportamentais, que envolvem
esforço físico, provocou um aumento do TEAC. Bogdanis et al. (2013)
demonstraram que o exercício físico pode elevar parâmetros antioxidantes,
entre eles a capacidade antioxidante total, que após 4 sessões de 30 segundos
de treino intenso, com resultados de aumento de 84 ± 9%. Ainda concluiu que
o exercício físico intenso pode atenuar o estresse oxidativo por uma
suprarregulação das defesas antioxidantes. Estando de acordo com nossos
achados.
O TEAC é uma técnica que apresenta vantagens, como a sua
simplicidade e baixo custo por amostra, porém possui desvantagens como
diferentes ensaios detectam uma combinação particular de compostos
(FRAGA; OTEIZA; GALLEANO, 2014). Como teste para avaliação da função
antioxidante total o TEAC é valido, porem pode não possuir especificidade para
determinar alterações em atividade enzimáticas, por exemplo, que também
influenciam o estresse oxidativo.
Resultados sem alterações no TEAC não descartam, por completo, a
participam da via oxidativa nos danos, e para isso procedeu-se a avaliação de
mais parâmetros do estresse oxidativo.
4.9 Avaliação da atividade da enzima SOD
A atividade da enzima SOD mostrou-se aumentada no grupo EtOH
comparação ao Basal (p<0,03); e ao Controle (p<0,05). O grupo de associação
MeHg+EtOH apresentou uma redução da atividade da enzima SOD, em
comparação a todos os grupos [Figura 11: comparação ao Controle e MeHg
(p<0,03); comparação ao EtOH (p<0,001)].
86
Basal Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
200
400
600 **+
##++xxx
*
Sup
eróx
ido
dism
utas
e (
U/m
L)
Figura 20: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta na atividade da enzima superóxido dismutase.Resultados expressos como a média ± e.p.m. de 5 animais por grupo. *Diferença significativa em relação ao grupo BASAL (p<0,05) e ** (p<0,03). ##diferença significativa em relação ao grupo CONTROLE (p<0,03). +diferença significativa em relação ao grupo MeHg (p<0,05) e ++ (p<0,03). XXXdiferença significativa em relação ao grupo EtOH (p<0,001).Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
A família SOD é um complexo enzimático composto por três espécies
conhecidas, SOD1, SOD2 e SOD3 (FUKAI; USHIO-FUKAI, 2011). SOD1,
também conhecida por Cu-/Zn-SOD, é encontrada no citoplasma celular,
SOD2, Mn-SOD, é encontrada na mitocôndria, e por ultimo a SOD3, também
Cu-/Zn-SOD, encontrada nas regiões extracelulares (LE PRELL; BAO, 2012).
A atividade de SOD causada pela intoxicação por MeHg é dependente
da área, onde no cerebelo mostrou um aumento de sua atividade enquanto no
córtex não alterou (ZEMOLIN et al., 2012). Grotto et al. (2009) utilizando ratos
expostos a MeHg por gavagem na dose 100 µg/Kg/dia, durante 100 dias,
avaliou a atividade da SOD e obteve resultados semelhantes aos nossos, em
que nesta dose, o MeHg não alterava a atividade enzimática.
Nossos resultados não demostraram alterações, sendo que uma das
possibilidades é que a SOD atua de diferentes maneiras em diferentes modelos
de intoxicação mercurial, além disso, como apresenta 3 isoformas conhecidas
e distribuídas na célula pode não ser necessário aumento da sua atividade
para remoção de EROs.
87
No modelo de EtOH em binge, Ostojic et al. (2012) verificaram dois
diferentes efeitos na atividade da SOD, enquanto ocorre um aumento na
atividade de Mn-SOD, a Cu-/Zn-SOD diminui, e também identificou que a este
aumento na atividade da Mn-SOD era uma resposta adaptativa dos hepatócitos
ao aumento de EROS induzido por EtOH.
Assim no uso agudo de EtOH, esta superexpressão de Mn-SOD ocorre
para prevenção dos danos, e a deficiência deste subtipo de SOD provoca
disfunção mitocondrial e depleção DNA mitocondrial. Este déficit foi verificado
no grupo de associação, evidenciando possíveis danos à mitocôndria. Além
deste fato, a mitocôndria aparenta ser alvo central no estresse oxidativo por
EtOH em binge.
4.10 Avaliação de atividade da enzima catalase
A atividade da enzima catalase foi avaliada e mostrou um aumento na
sua atividade nos grupos EtOH em comparação ao grupo Basal e ao Controle
(p<0,05). O MeHg apresentou uma ativação muito aumentada em relação à
todos os grupos (p<0,001), evidenciando uma alta atividade enzimática devido
ao tratamento (Figura 21).
Basal Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0.000
0.002
0.004
0.006
*#
***###+++xxx
Cat
alas
e (k
/gP
rot/m
in)
Figura 21: Efeitos da exposição ao etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) na atividade da enzima catalase. Resultados expressos como a média ± e.p.m. de 5 animais por grupo. *Diferença significativa em relação com BASAL (p<0,05) e *** (p<0,001). #diferença significativa em relação ao CONTROLE (p<0,05) e ###(p<0,001);
88
+++diferença significativa em relação ao EtOH (p<0,001)e XXX diferença significativa em relação ao MeHg+EtOH (p<0,001). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
A catalase é uma enzima que apresenta função de degradar o H2O2,
uma das formas de EROs, além de oxidar muitos compostos como o EtOH
utilizando o H2O2. De acordo com Cederbaum (2012), a catalase é responsável
por cerca de 2% do metabolismo total do EtOH, entretanto esta mesma via
apresenta importância na produção de acetaldeído local no SNC (CORREA et
al., 2012; ZIMATKIN et al., 2006), sendo assim um aumento da catalase pode
ser esperado devido o consumo de EtOH.
Em relação à hiperestimulação da atividade da catalase provocada pelo
MeHg, Zemolin et al. (2012) encontrou resultados semelhantes aos observados
neste estudo, trabalho no qual houve aumento da atividade de catalase em
cerebelo e córtex de camundongos intoxicados com MeHg, sendo que esta
exposição poderia estar relacionada com a via Nrf2-ARE.
A Nrf2-ARE é uma via de resposta regulada de transcrição, que codifica,
inicialmente, duas principais enzimas de desintoxicação, que são glutationa-s-
transferase A2 e a NADPH quinona oxidorredutase 1 (FAVREAU; PICKETT,
1991; RUSHMORE; PICKETT, 1990). Estas vias são ativadas em resposta ao
H2O2, mais especificamente por compostos químicos com capacidade de
entrarem no ciclo redox ou serem transformados em intermediários reativos
(RUSHMORE et al., 1990). Compostos que são capazes de reagir com grupos
sulfidrilas também são potentes indutores desta via (NGUYEN; NIOI; PICKETT,
2009) e sabe-se que o MeHg possui afinidade por grupamentos sulfidrilas.
Para converter H2O2 em água e O2, a catalase necessita de um grupo
doador de oxigênio, dentre estes grupos estão os compostos nitrogenados,
como o nitrato (BAUER, 2014), assim este aumento da atividade da catalase
pode ser umas das formas que está consumindo o nitrito/nitrato das amostras,
visto nos nossos resultados.
4.11 Avaliação do conteúdo de glutationa
89
A avaliação do conteúdo de GSH mostrou que todos os tratamentos
apresentaram-se aumentados em relação ao grupo Basal (p<0,03) e ao
Controle (p<0,05), não havendo diferença significativa entre eles (Figura 12).
Basal Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
1
2
3
4
5 **# **
# **#
Glu
tati
on
a (
µg
/mL
)
Figura 22: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) em ratas da adolescência à fase adulta no conteúdo de glutationa tripeptídeo. Resultados expressos como a média ± e.p.m. de 5 animais por grupo. **Diferença significativa em relação ao grupo BASAL (p<0,03). #diferença significativa em relação ao grupo CONTROLE (p<0,05). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
O GSH é um importante antioxidante que pode atuar diretamente na
remoção de radicais livres ou como cofator de enzimas antioxidantes, como a
GPx e a GST (MEISTER, 1982). Atuando no metabolismo do EtOH, a GSH
pode ser necessária tanto para os radicais livres como para o acetaldeído
formado pela via metabólica do EtOH (CEDERBAUM; LU; WU, 2009), assim o
aumento da GSH apresentado pelo grupo EtOH.
A GPx, uma das enzimas envolvidas no ciclo da GSH, atua na oxidação
da GSH e consequente redução do H2O2 em água. Franco et al. (2009)
mostrou que o MeHg pode inibir esta ação e assim promover danos de
peroxidação lipídica. No nosso paradigma de intoxicação, o MeHg não foi
capaz de promover este tipo de dano a membranas, consequentemente, a via
da GSH estava atuando e devido a isso o aumento obtido no conteúdo do
tripeptídeo GSH.
90
4.12 Avaliação de peroxidação lipídica
Determinação de peroxidação lipídica é realizada a partir da formação
de MDA. O tratamento com EtOH teve um aumento da produção de MDA
(Figura 19) em comparação ao controle e ao MeHg (p<0,05). O grupo da
associação entre EtOH+MeHg também apresentou aumento da peroxidação
lipídica quando comparado ao controle e MeHg (p<0,03), porém a provável
causa é devido ao EtOH, uma vez que o MeHg não foi capaz de aumentar a
peroxidação.
Basal Controle EtOH MeHg MeHg+EtOH0
5
10
15 ***#+
***##++
***
Mal
on
dia
ldeí
do
(n
g/m
L)
Figura 23: Efeitos da exposição de etanol (EtOH) e/ou metilmercúrio (MeHg) na peroxidação lipídica. Resultados expressos como a média + e.p.m. de 5 animais por grupo. *Diferença significativa em relação ao grupo BASAL (p<0,05), **(p<0,03) e *** (p<0,001); #diferença significativa em relação ao grupo CONTROLE (p<0,05) e ##(p<0,03); +diferença significativa em relação ao grupo MeHg (p<0,05) e ++(p<0,03). Teste ANOVA de uma via seguida do teste Tukey.
O MDA é um biomarcador de estresse oxidativo que é indicativo de
danos à membrana plasmática (LIU et al., 2011; YANG et al., 2015). A ação
neste teste foi possivelmente mediada pelo EtOH, uma vez que o MeHg não
apresentou diferença estatística ao controle.
Foi relatado que o MeHg possui ação de provocar degeneração lipídica,
com formação de lipoperóxidos no plasma. A dosagem de MDA realizada por
Grotto et al. (2009), apontou que exposição à doses baixas de MeHg, durante o
período de 100 dias promoveu a peroxidação lipídica. Resultados opostos aos
nossos, que utilizamos doses menores e período menor de exposição.
91
Estudos apontam que o consumo de EtOH em padrão binge possui uma
via de estresse oxidativo que envolve uma neuroinflamação e neurotoxicidade,
relacionada com ativação de fosfolipase A2 em cortes de hipocampo-entorrinal-
cortical (TAJUDDIN et al., 2014). Moon et al. (2014) encontrou ação de
fosfolipase A2 secretora e fosfolipase citosólica independente de Ca+2 em ratos
tratados com binge de 4 dias.
Collins et al. (2014) encontrou fosfolipase A2 dependente de Ca+2
durante uma agressão neuroinflamatória, detectado em hipocampo, córtex
entorrinal e bulbo olfatório. A ativação de fosfolipase leva a uma degeneração
de membrana lipídica e consequente liberação de ácido araquidônico. Assim,
este mecanismo de estresse causado por EtOH em binge pode promover a
peroxidação lipídica e consequente aumento de MDA visto nas amostras.
Em resumos nossos resultados do estresse oxidativo e possíveis
mecanismos estão expostos na figura 20.
92
Figura 24 - Mecanismo de estresse oxidativo celular da exposição ao metilmercúrio (MeHg) e/ou etanol (EtOH). Painel A: EtOH em padrão binge. Painel B: MeHg subcrônico em baixas doses. Painel C: MeHg na presença de EtOH.
B
A
C
93
V CONCLUSÕES
94
5 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos observou-se que a intoxicação crônica
em baixas doses de MeHg observou-se uma redução da locomoção
espontânea, aumento de emocionalidade, indução de comportamento tipo
anedônico e comportamento tipo depressivo. Quanto a relação com estresse
oxidativo, mesmo sem promover danos a membranas celulares, o MeHg
isolado reduziu a nitritos/nitratos, promoveu uma hiperatividade de catalase,
que não foi acompanhada pela SOD, e o aumento da glutationa.
Com a presença de EtOH em padrão binge, houve uma redução das
concentrações de Hg total no pelos, sendo que as alterações comportamentais
do grupos exposto a associação acompanharam os mesmos resultados do
grupo EtOH isolado: redução da locomoção espontânea, aumento de
emocionalidade, comportamento tipo ansiogênica, comportamento tipo
anedônico e tipo depressivo, além de danos a memória de curta duração.
Ainda, quanto aos parâmetros do estresse oxidativo mostrou-se uma redução e
nitrito/nitrato, assim como da enzima SOD, sem alteração da catalase, que
permaneceu basal, porém promoveu danos a membranas, relacionado com o
EtOH em binge.
Os resultados do grupo EtOH+MeHg não explicam os mecanismos
tóxicos e as alterações comportamentais encontradas para este grupo. Assim
como não ocorreu sinergismo dos toxicantes para este grupo em nenhuma
avaliação comportamental ou de estresse oxidativo. Logo, outras teorias devem
ser estudadas para elucidar os mecanismos tóxicos dos compostos em
associação.
Podemos concluir que a ingestão de MeHg em doses baixas permitidas
para alimentos (peixes e mariscos) são prejudiciais a processos somáticos e
motores, tanto na ingesta isolada ou em conjunto com EtOH em padrão binge.
95
VI REFERÊNCIAS
96
REFERÊNCIAS
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ANEXO A – Parecer do CEPAE
