Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec

Graduação em Biotecnologia

TÉCNICAS INSTRUMENTAIS

15/06/2012

ELETROFORESES

Marcelo Mendonça

PrincípioPrincípio

• Eletroforese � Consiste na migração e separação de partículas em uma matriz (suporte), submetidas a umadiferença de potencial elétrico

• A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas

Gel de Agarose Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Os matriz podem ser:

DNA / RNA Proteínas / DNA / RNA

EletroforeseEletroforese emem gelgel

• Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho

– Gel de Poliacrilamida

• Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas

– Gel de Agarose

• Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas grandes - Usado mais para DNA e RNA

• O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo positivo

• Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la

PrincípioPrincípio

A amostra é

inserida nos

“pocinhos” Partículas de

menor tamanho ou

Corrente elétrica

é aplicada

carga mais

negativa correm

primeiro

PrincípioPrincípio

• Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas

• Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho

� O ladder (marcador) é formado pordiferentes tamanhos de DNA e serve como marcador de peso molecular

• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte

• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manterestáveis as condições de pH do meio

Gel de Gel de AgaroseAgarose

Video

Eletroforese em Gel de AgaroseEletroforese em Gel de Agarose

Gel de Gel de AgaroseAgarose

• A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha

• Dissolve em tampão quente e então gelifica quando esfria

Preparação do gel

VisualizaçãoFotodocumentador com luz UV Fotodocumentador com luz UV

Tampões utilizados para preparo do gel e na cuba de corrida (migração)

Gel de AgaroseGel de Agarose

� Concentrado e diluídos para o uso

Tampões comumente usado

TBE: Tris-Borato-EDTA Diluído para 0,5x – Fornece poder tamponante suficiente, Diluído para 0,5x – Fornece poder tamponante suficiente,

Maior poder tamponante do que outros

TAE: Tris-Acetato-EDTADiluído para 1x – Resolução melhor para alguns DNAs (maiores)

TPE: Tris-Fosfato-EDTA

IntercalantesIntercalantes

CorantesCorantes• Brometo de Etídio

– Agente intercalante do DNA• Cancerígeno!

– Composto fluorescente - luz UV

• GelRed• GelRed

• GelGreen

Visualização do gel de agarose em luz UV

Transluminador – UV

(Fotodocumentador)

Gel de Gel de poliacrilamidapoliacrilamida

• A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel para a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;

• Utilizada para observação de fragmentos menores (poucos pares de bases ou proteínas);(poucos pares de bases ou proteínas);

• Melhor resolução do que a eletroforese em gel de agarose;

• Desvantagem: Neurotóxica

(Acrilamida em forma liquída)

Gel de Gel de PoliacrilamidaPoliacrilamida

SDSSDS--PAGEPAGE

• É realizada em uma cuba de eletroforese vertical