Eletroforese capilar e Cromatografia Líquida - ufjf.br · 30/05/2012 2 Principio da separação em eletroforese Diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes quando

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Eletroforese capilar e

Cromatografia Líquida

Prof. Rafael SousaDepartamento de Química - ICE

[email protected]

Notas de aula: www.ufjf.br/baccan

Analítica V: 1S2012

Eletroforese Capilar (EC)

TÉCNICA ELETROANALÍTICA

HISTÓRICOCriada por Arne Tiselius para estudar proteínasem soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)

APLICAÇÕESCompostos orgânicos e inorgânicosMacromoléculas (DNA e RNA)

Introduzida como técnica instrumental (1981): ECJorgenson e Lukacs

EC - Técnica instrumental

Capilar preenchido com uma solução tampãoimerso em recipientes contendo o mesmo tampão (potencial)

Amostra é depositada na extremidade do capilar oposta ao detectorVoltagens de 5 – 60 kV

Correntes de 10 – 100 mA (FEO)

Detector espectrofotométrico de UV-Vis

EC: Na Prática

OBS: Esta animação é uma cortesia do Prof Marcone Leal (DQ-UFJF)

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Principio da separação em eletroforese

Diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes quando aplicadouma ddp entre as extremidades do capilar

ν = µe E µe �� mobilidade eletroforéticaE �� força do campo elétrico (POTENCIAL/DISTÂNCIA)

�Altos potenciais �� velocidade de migração elevada �� separação rápida

EFICIÊNCIA DA SEPARAÇÃO: NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N)

µe VN = D �� coeficiente de difusão (cm2 s-1)

2D

N é geralmente superior àqueles conseguidos em CLAE !

Fluxo eletroosmótico (FEO)

Dependente do pH (geralmente acima de 3): ionização dos grupos silanóis

�Velocidade de fluxo uniforme esem pressão (em contrário à CLAE)

�Atua como uma “bomba”

� Não favorece o alargamento de pico

Instrumentação

Eletrodos de Pt

(4 – 5 µL)

Introdução da amostra

Volumes de 10 a 100 nL são introduzidos no capilar

Favorece a injeção de uma quantidademaior dos íons de maior mobilidade

Não

fun

cio

na

qu

and

o s

e en

che

o c

apila

r co

m g

el capilar

Det

ecto

r

pressão vácuo

eletrocinéticosifonamento

capilar

capilar

capilar

Reservatório de eletrólito

Detector

DetectorDetector

amostraamostra

amostra amostra

Reservatório de eletrólito

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Capilares

Comprimento de 25 – 100 cm

Diâmetro interno de 10 – 100 µm

� Vidro� Teflon (não usado com as voltagens mais elevadas)

� Sílica fundida

A superfície interna pode ser quimicamente modificada

O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido (repetibilidade)

Detector

�� Responde à passagem das espécies “on-column”(Cada espécie apresenta um tempo de passagem diferente)

�� VÁRIOS TIPOS de detectores PODEM SER USADOS

Mais comum: Espectrofotométrico no UV-Vis� caráter “universal”

Outros exemplos:- Fluorescência induzida por laser

- Amperométricos, condutométricos(precisam ser devidamente isolados, eletricamente, do capilar)

Acoplamento com outras técnicas- Espectrometria de massas (informações estruturais das moléculas)

Sinal analíticoEletroferograma: resposta em função do tempo

- Cátions migram mais rápido

- Compostos neutros (em uma única “zona”) seguem o FEO (cetonas)

- Ânions migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO)

� Diferença na mobilidade dos solutos

Fatores que afetam o sinal

� Aquecimento Joule

A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar � CAUSA alargamento dos picos

PARA EVITAR: - Usar voltagem e tampão em conc. adequadas

� Comprimento de “injeção”Comprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois ajanela de detecção é da ordem de 0,1 mm� CAUSA alargamento dos picos

PARA EVITAR:- Usar um solvente com força iônica menor que a do tampão

(para que a corrente atua mais sobre os analitos, que chegarão mais

rápido na outra extremidade da coluna)

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Análise quali e quantitativa

�� Necessidade de calibração

Compara-se a respostade PADRÕES e AMOSTRAS nas mesmas condições

� Respostas (nos tempos de migração correspondentes):

- Áreas dos picos (de espectros UV-Vis, p. ex)

- Construção de curvas de calibração

Análise quali e quantitativa

Exemplo de resultado

Modos de separação por eletroforese

- Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)

- Eletroforese capilar em gel (ECG)

- Isotacoforese capilar (IC)

- Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM)

- Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)


• Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)

� Baseada nas diferenças das velocidades de migração deespécies iônicas em um dado tampão

� Não serve para espécies neutras(a menos que sejam derivatizadas)

• Eletroforese capilar em gel (ECG)

� O capilar é preenchido por um gel com tamanho de poroapropriado

� Macromoléculas como DNA podem ser separadas em funçãodo tamanho

(menores ficam menos retidas, ao contrário da CE)� Também não ocorre separação das espécies neutras

Moléculade DNA

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Eletroforese capilar em gel (ECG)


• Isotacoforese capilar (IC)

� Em um dos tampões: íons com alta mobilidade (dianteiros)- localizado próximo ao detector

� No outro: íons com baixa mobilidade (terminadores)

- componentes da amostra se separam em zonas(de acordo com a sua mobilidade)

- todas essas zonas se movem com a mesma velocidade- Na quantificação se mede os comprimentos das zonas

• Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)

� Substâncias anfóteras (proteínas) ficam focalizadas em umadada região do capilar devido a um gradiente de pH

� Utiliza-se uma mistura de anfólitos* para dissolver a amostra

� O cátodo é mantido em pH alto e o ânodo em pH baixo

* ács. poliméricos sintéticos

Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)

“A”, “B” e “C” ficam“focalizadas” na região de

pH que corresponde aoseu ponto isoelétrico

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• Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM) – técnica híbrida

� Utiliza-se eletrólitos contendo conc. elevadas de surfactantesa ponto de formarem micelas (carga neg.)

� Espécies positivas movem-se mais lentamente� Espécies neutras sofrem partição entre as micelas e a fase

aquosa do tampão (migração intermediária)� Espécies negativas são repelidas pelas micelas e migram mais

rapidamente

�� VANTAGEM SOBRE CLL:Maior eficiência de separação

Vantagens e desvantagens

VANTAGENS:

� Elevada frequencia analítica (rapidez)� Versatilidade� Baixo custo

- Baixo consumo de amostras, reagentes e solventes� Desempenho analítico satisfatório

- Excelentes separações e resoluções� Possibilidade detecção on line

DESVANTAGENS:

� Não se aplica a todos os tipos de compostos, como:- Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar

(adequados para CG)- Polímeros iônicos de massa molar alta

Referências

Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A.Principles of Instrumental Analysis

5th ed., Saunders College Publishing, 1998

Harris, D. C.Análise Química Quantitativa

7a ed., LTC – Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008

Grossman, P. D.; Colburn. J. C. Capillary Electrophoresis. Theory and Practice

Academic Press Inc., 1992

Queiroz, SCN; Jardim, ICSF; “Eletroforese Capilar”, Chemkeys, 2001

Tavares, MFM; “Eletroforese Capilar: Conceitos Básicos”, Quim. Nova, 19 (1996) 173

Questões

1- Defina eletroforese capilar e explique o que é o fluxoeletroosmótico.

- Técnica separação na qual a separação de substâncias iônicas ocorre emfunção da carga e da mobilidade iônica.

- O fluco eletroosmótico (FEO) é o fluxo de espécies carregadas (íons) dotampão que migram do anodo (+) para o catodo (-), carreando os constituintes

da amostra.

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2- Em relação ao sinal analítico, qual é o perfil esperado para umeletroferograma? Justifique.

As espécies com carga positiva saem primeiro (migram mais rápido), as

espécies com carga negativa saem por último (sofrem repulsão pela catodo) eas espécies neutras saem entre as positivas e as negativas, por seremcarreadas pelo FEO.

3- Cite duas fontes de alargamento de banda na eletroforese capilar ecomente como este problema pode ser minimizado.

- Quantidades de amostra elevadas (comprimentos de injeção grandes);

- Aquecimento joule (corrente formada no capilar);

� Quantidades adequadas de amostras, tampões apropriados e usarsistema de refrigeração do capilar.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL)em Inglês

Interação diferenciada dos componentes da amostra com uma

FASE ESTACIONÁRIA e uma FASE MÓVEL

sólido

oulíquido

líquido

ougás

Crom. líquida (CL)

Crom. gasosa (CG)

Uma das diferenças entre a CG e a CL são as configurações experimentais:

Sólido

líquido sobre um sólido

FASEESTACIONÁRIA

CONFIGURAÇÃOEXPERIMENTAL

PLANAR

COLUNA

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Ex de interação analito - FE

Equilíbrio FE – FM (partição na crom. Líquido-líquido)

� Diferente para as substâncias diferentesPolaridade

Tamanho

Cromatografia planar

Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente dividido

FM (capilaridade) � separação

� Fácil realização� Análises quali e quantitativas

� Baixo custo� Baixas

- Resolução e- Repetibilidade- Reprodutibilidade

Cromatografia em coluna

Convencional (Clássica)

Solvente

Fase estacionária

Suporte inerte

Líquida de alta eficiência (CLAE)

- Colunas verticais (FM - gravidade)- Análises quali e quantitativas- Baixo custo- Baixa frequência- Desempenho regular

- Colunas e FM – altas pressões- Análises quali e quantitativas- Desempenho analítico satisfatório- Rapidez analítica, automação- Custo elevado ...

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

- Amplamente utilizada- Dentre as modalidade mais importantes- Vem se desenvolvendo desde a década de 70

NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA

� Necessidade de calibração

RESULTADO : Amostras x Padrões(cromatograma)

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Subdivisões da CLAE

� Tipo de FE (MECANISMO de separação)

Cromatografia líquido-sólido: CLS�� FE é um sólido (adsorção)

Cromatografia líquida de fase ligada: CLFL�FE é um líquido ligado quimicamente a um suporte sólido

(partição)

Cromatografia líquido-líquido: CLL�� FE é um líquido que recobre um sólido (partição)

Cromatografia por exclusão: CE

� FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controladaAplicação importante: análise de polímeros (GPC)

Cromatografia de troca iônica: CTI

� FE sólida contém grupos NR3+ (para troca

aniônica) ou grupos SO3- (para troca catiônica)

Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc)

Mesmo princípio da Prática 10 !

Cromatografia por afinidade: CA

� FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivacom proteínas e anticorpos

Cromatografia quiral: CQ

� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirseletivamente com compostos quirais

“Para aprofundar o conhecimento”:

Pesquisar substâncias que são determinadas por CA e por CQ

Separação e Sinal analítico

FM

FM

FM

FM

FM

FM + componente separado

Cromatograma

Tempo de retenção

Sin

al

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Entendendo o cromatograma

Diferentes espécies � SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr(tr= tempo de retenção � medida em função do tempo)

saca

rin

a

aspartame

ben

zald

eíd

o

Informaçõesquali equantitativas

Tempo de retenção

Resposta do detector

Muita interaçãoPouca interação

Análise quantitativa

Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picoscromatográficos com áreas diferentes

�� Necessidade de calibração:

�Relaciona-se as áreas dos picos com as concentrações

� Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES

Configuração instrumentalComponentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta

eficiência:

� Cada componente: função no processo analítico

Sistema de bombeamento

Reservatóriode FM

Válvula deamostragem

Colunacromatográfica

Detector

Processador-Registrador


Reservatóriode FM



Detector Registrador

frasco de plástico

ouvidro

FMÁgua

+Solvente(s) orgânico(s)

n-hexanoAcetonitrilaMetanolMetil-t-butil-éterClorofórmioDiclorometanoTetrahidrofurano2-propanol

eliminação departículas maiores

que 5 µm

retirada de gasesDissolvidos

Ultrasomou

Borbulhamento gases inertes

USO(preparação diária)

CUIDADOS

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Reservatóriode FM




� Impulsionar a FM para dentro da coluna com vazão constante e reprodutível

� BOMBAS DE ALTA PRESSÃO

Composição constante(eluição ISOCRÁTICA)

Composição variável(eluição por GRADIENTE)

Bomba de seringa

Bomba pneumática

Amostras complexasCompostos de polaridade

muito diferente

Bomba recíproca

Proporção doSolvente mais polar


Reservatóriode FM




Ex: Bomba recíproca (uma das mais usadas)

Desvantagens:

Vazão pulsada � amortecedorCavitação (bolhas) devido à compressão

Vantagem:

Mudança da fase móvel

Para coluna


Reservatóriode FM




Dispositivo de aço inoxidável com uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna

ALÇA TROCÁVEL �� Volumes de 2 a 1000 µL


Reservatóriode FM




Coluna �� tubo de aço inoxidável �� separação

Capacidade: dimensões

Фi= 1 – 20 mm

L= 3 – 25 cm

FEPartículas com Ф na faixa de µmUso de partículas pequenas�� melhor separação (aumenta N)

+

FM

DUAS COMBINAÇÕES

Fase reversa

Fase normal

FE apolar (baixa polaridade)FM polar

FE polarFM apolar (baixa polaridade)

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EFICIÊNCIA DA COLUNA �� RESOLUÇÃO

� REPRESENTAÇÃO: N“Número de pratos teóricos”

N = 16 tr

W

2

� Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação

� Não implica em rapidez ! (Altura do prato (H): H= L / N)

Determinada pelo no de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FM

Sin

al d

o d

etec

tor

Tempo de retenção

Detecção dos componentes conforme saem da coluna

�UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA

�� Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE)

- Que respondem à concentração�� sinal proporcional à concentraçãoEx: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluorescência

MAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEIS

- Que respondem à massa �� sinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de tempoEx: Detectores eletroquímicos e de condutividade elétrica


Reservatóriode FM




MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADIENTE

Considerações práticas

� Várias configurações instrumentais podem ser empregadas

determinação de vários tipos de substâncias(mesmo em amostras complexas)

sistema à alta pressão: checar vazamentos

As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamno resultado

para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padrõesinternos

(substância com características físico-químicas semelhantes às do

analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida)

Questões

1- Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia líquidade alta eficiência (CLAE) e explique, brevemente, a função de cada um deles.

2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes emanalgésicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases móveisdiferentes e em modo isocrático (X: 70% MeOH/ 30% HAc; Y: 60% MeOH/ 40% HAc;Z: 40% MeOH/ 60% HAc). Considerando essas informações, responda qual é ocomposto mais polar e qual das fases móveis você utilizaria para fazer essamesma separação.

X Y Z

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Referências

Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A.Principles of Instrumental Analysis5th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998

Harris, D. C.Análise Química Quantitativa7a ed., LTC – Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008

Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S.Fundamentos de Cromatografia1a ed., Editora UNICAMP: Campinas, 2006

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