Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida

1-Introdução2-Determinação da Malha no Gel3-Eletroforese em condições

desnaturantes SDS-PAGE4-Visualização das proteínas separadas

por SDS-PAGE

Edmar Vaz de Andrade

1-introduçao

Poros (malha) com dimensões moleculares, onde a separação no gel ocorre de acordo com a filtração em gel e com mobilidade eletroforética das moléculas.

Indicada para separação de:DNAProteínas

PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

2-Determinação da Malha no Gel

acrilamida

N, N’-metilenobisacrilamida

Ligação cruzada Acri-Bis

Acri-Bis: acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida

MonômerosPolímero formado pela reação entre Acri-Bis

2-Determinação da Malha no Gel

A polimerização entre Acri-Bis é catalisada por radicais livres

APS: persulfato de amônio. Se decompõe naturalmente formando radicais livres.

TEMED: estabiliza os radicais livres formados a partir do APS.

2-Determinação da Malha no Gel

A formação do polímero entre acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida determina a dimensão dos poros formados (malha) no gel.

Depende da quantidade de ligações cruzadas:

Varia em função da concentração de acrilamida e N, N’-metilenobisacrilamida

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

SDS-PAGE

SDS: dodecil sulfato de sódio. Detergente aniônico forte.

Interage com a proteína de modo independente da seqüência primária (proporcional a massa molecular)

1 molécula de SDS para cada 2 resíduos de aminoácidos

Desnaturação da proteína:

Aquecimento a 100 °C

β-mercaptoetanol: agente redutor

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

Desnaturação da proteína

Ligaçao de SDS com a / proteína

Efeito do SDS sobre as proteínas desnaturadas:

Conformação linearizada

Carga líquida negativa

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

Gel separador

Gel concentrador

Aparato para eletroforese em SDS-PAGE

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE

Coloração por azul brilhante de Coomassie

4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE

Coloração por azul brilhante de Coomassie

75

50

35

30

25

Quitinase de Crhomobacterium violaceum expressa em Escherichia coli

kDa