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Eliane Dantas Rocha
Plasticidade neuronal e glial do sistema olivo-cerebelar induzida pela neurotoxina
3-acetil-piridina e o papel neuroprotetor da minociclina num modelo de ataxia
Universidade Federal do Rio de JaneiroIBCCFº
2008
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Plasticidade neuronal e glial do sistema olivo-cerebelar induzida pela neurotoxina
3-acetil-piridina e o papel neuroprotetor da minociclina num modelo de ataxia
Eliane Dantas Rocha
Tese submetida à pós-graduação de Ciências Biológicas (Biofísica) para concorrer ao título de Doutor em Ciências
Orientador: Dra Leny Alves CavalcanteLaboratório de Neurobiologia do Desenvolvimento
Rio de Janeiro Dezembro
2008
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Título: Plasticidade neuronal e glial do sistema olivo-cerebelar induzida pela neurotoxina 3-acetil-piridina e o papel neuroprotetor da minociclina num modelo de ataxia
Autor: Eliane Dantas RochaTese de Doutorado submetida à avaliação pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade do Brasil, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor.
Aprovada por:
Profª. _________________________________________________
Dra. Leny Alves Cavalcante Orientador
Prof. __________________________________________________
Dra. Ana Maria Blanco Martinez
Prof. __________________________________________________
Dra. Cecilia Hedin Pereira
Prof. __________________________________________________
Dra. Flavia Carvalho Alcantara Gomes
Prof. __________________________________________________
Dr. Mario Fiorani
Prof. __________________________________________________
Dra. Luciana Barreto Chiarini
Prof. __________________________________________________
Dra Silvana Allodi
Rio de Janeiro2008
iv
Ficha Catalográfica
Rocha, Eliane Dantas
Plasticidade neuronal e glial do sistema olivo-cerebelar induzida pela neurotoxina 3-acetil-piridina e o papel neuroprotetor da minociclina nummodelo de ataxia / Eliane Dantas Rocha: Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.
Tese de Doutoradoxv e 1681.Ataxia cerebelar 2. Oliva inferior 3. Neurodegeneração 4. 3-acetil-piridina 5. Regeneração 6. Minociclina
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – IBCCFºII. Tese
v
Ao meu sobrinho João Victor
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus por todos os anjos que permitiu caminharem comigo, que me ensinaram e me
acompanharam e cuidaram de mim e acompanham e cuidam ainda. Hoje eu percebo que
foram muitos.
Aos primeiros anjos que me acolheram aqui quando eu cheguei, os meus pais. Deus não
poderia ter atribuído a tarefa de cuidar de mim a anjos mais zelosos. Obrigado pelos bons
exemplos que me deram, por me ensinarem a acreditar no amor, na solidariedade, na amizade
e na verdade. E a minha mãe novamente, que continua aqui cuidando de mim quando eu
deveria estar cuidando mais dela.
Ao meu pai, a quem eu morrerei amando mesmo na sua ausência.
À minha querida irmã e ao meu querido sobrinho João Victor. O contato com ele sempre
acalma o meu coração.
À Dra. Leny Cavalcante pela orientação cuidadosa deste trabalho, pela amizade, pela forma
carinhosa com que cuida de todos nós do laboratório e por me proporcionar uma oportunidade
única de aprendizado.
Aos queridos Viviane e Felipe, companheiros de bancada. Acompanharam de perto e
dividiram comigo erros e acertos, lágrimas e sorrisos. Muito obrigado.
Aos meus amigos do laboratório, Fernanda, Lítia, Igor, Tainá e Paulinho porque contrubuíram
para tornar minhas tarefas no laboratório mais amenas.
Ao Wagner, de todos, o amigo mais recente, companheiro de trabalho, que contribuiu nos
momentos de indecisão experimental, compartilhou dos meus erros e também dos meus
acertos.
Aos amigos de antes, de antes do doutorado, Serginho e Glauce, Paulo e Lourdes. Obrigado
pela amizade e pelo incentivo.
vii
Aos novos amigos da Marinha que contribuiram para tornar meus finais de domingo mais
leves, depois de horas de trabalho no laboratório. Bem lembrado, sem os sábados e domingos
eu não teria dado conta de terminar esta tese.
À Paula, do biotério do Instituto de Bioquímica Médica, pelo fornecimento de muitos dos
animais utilizados em meus experimentos e pela sua atenção em atender aos meus pedidos.
Às queridas Rita Luppi, Vera e Paula Calmon por todo carinho e amizade que me dedicam.
Aos meus amigos e companheiros de trabalho de Petrópolis, os prezados professores Andrea
Tannus, Izabel Romero, Carlos Lacerda, Vanderson e Victor que fizeram de muitas terças-
feiras dias de flores e sorrisos.
Ao meu querido amigo Antonio Jose, pela amizade, pela sua generosidade e seu sorriso largo
que alegra nossos dias de trabalho.
À profª. Derly Streit pelo apoio e amizade durante o período de realização desta tese.
À Bernadete, pela amizade e pela colaboração durante a organização das imagens desta tese.
Ao prof. Onesio pela amizade de muitos anos.
À todas as pessoas que mesmo sem compreender exatamente o que eu fazia me apoiaram
simplesmente porque gostam verdadeiramente de mim.
Aos meus alunos que não permitem que eu me torne arrogante. Cada pergunta sem resposta é
um exercício de humildade que me leva a melhorar o que faço como professora.
Ao Jefferson, um herói da resistência. Acompanhar uma rotina como a minha só por amor.
Muito obrigado pelo seu amor, pelo tempo que dedica a mim, pelo cuidado que tem comigo.
viii
RESUMO
O cerebelo recebe informações de origem periférica e central que são essenciais para a coordenação do movimento voluntário. Parte destas informações chegam por meio das fibras trepadeiras, procedentes do núcleo olivar inferior (NOI). Muitos neurônios do NOI degeneram após o tratamento com 3-acetilpiridina (3AP), o que resulta em descoordenação motora. No entanto, a recuperação espontânea do padrão normal da atividade motora é observada alguns dias após o tratamento. Os objetivos deste trabalho foram analisar as alterações do comportamento motor e histológicas no NOI e no cerebelo em resposta a 3AP e testar a ação neuroprotetora da minociclina (MINO). Ratos Wistar de 30-35 dias foram submetidos a injeção intraperitoneal de 3AP e BrDU e eutanasiados 24h, 4, 10 e 21 dias após o início do experimento. Os animais tratados com 3AP e controle foram submetidos ao teste de caminhada para quantificação das alterações motoras observadas e em seguida perfundidos-fixados com PF 4%. Foram feitas imuno-histoquímica e histoquímica em cortes coronais do NOI e do cerebelo e as imagens, analisadas por microscopia convencional e confocal. As imagens digitais coletadas foram utilizadas para contagem de células. Para testar a ação da MINO, os animais receberam injeções simultâneas de 3AP e MINO, seguida de uma dose 12h após e doses subsequentes diárias apenas de MINO. Os resultados mostraram a redução quase total da densidade numérica de neurônios do NOI 24h, 4 e 10 dias após o tratamento com a neurotoxina. Novas células foram adicionadas ao NOI a 24h, 4 e 10 dias, mas, neurônios (β-III tubulina positivos) só foram comprovados aos 21 dias. Observamos aumento de astrócitos e de células NG2 positivas, estas especialmente 4 e 10 dias após o tratamento com a 3AP. Microglia marcadamente reativa (identificada pela marcação com lectina IB4 G. simplicifolia) e em maior número foi observada no NOI aos 4 dias. No cerebelo, ocorreu acentuada redução dos neurônios de Purkinje aos 4 e 10 dias e aumento das células NG2 positivas na camada molecular. Os resultados revelaram também aparentes mudanças na expressão de marcadores fenotípicos gliais (GFAP, NG2, lectina IB4) e neuronais (calbindina) no NOI e no cerebelo em resposta a 3AP. Além de neurogênese no NOI foi observada sinaptogênese reativa na camada molecular cerebelar 21dias após o início do experimento, o que pode explicar a recuperação motora espontânea. A MINO teve efeito protetor sobre os neurônios do NOI, o que levou a uma redução do efeito da 3AP sobre a atividade motora e também na ativação microglial observada aos 4 dias. Os resultados nos permitem concluir que o efeito da 3AP sobre o NOI parece resultar, além da ação neurotóxica, da intensa ativação da microglia, que acentua o dano neuronal inicial induzido pela 3AP. A MINO foi capaz de prevenir as alterações motoras provocadas pela 3AP. Esta ação parece resultar primeiro do aparecimento 24h após o tratamento de microglia reativa amebóide, que deve atuar como neuroprotetora e segundo, pela inibição da microglia reativa grosseiramente ramificada observada no NOI aos 4 dias.
ix
ABSTRACT
The cerebellum receives information of peripheral and central origin that is essential to the coordination of the voluntary movement. Part of this information is relayed by the climbing fibers that proceed from the inferior olivary nucleus (ION). Many ION neurons degenerate after treatment with 3-acetylpyridine (3AP), resulting in loss of motor coordination. Nevertheless, there is spontaneous recovery of the normal pattern of motor activity a few days after 3-AP treatment. The objectives of this work were to analyze changes in motor behavior and in the histology of OIN and cerebellum in response to 3AP and to test the neuroprotective action of minocyclin (MINO). Thirty to thirty five day old Wistar rats were submitted to a single intraperitoneal (IP) injection of 3AP plus IP BrDU injections at 24 h, 4, 10, and 21 days after starting experiments. Both untreated controls and 3AP-treated animals were submitted to the walking test for quantification of motor disturbances and, after that, perfusion-fixed with 4% paraformaldehyde. Serial coronal sections of ION and cerebellum were stained by the Nissl method and digital images used for neuronal counting. Other series were used for histochemistry and immunonistyochemistry and analyzed by conventional and confocalmicroscopy. To test MINO action, the animals received simultaneous IP injections of 3AP and MINO, followed by another dosis 12h later and, in other cases, additional daily doses of MINO only until sacrifice. The results showed a near total reduction of the numerical density of ION neurons at 24h, 4d, and 10d after 3AP. BrDU+ cells appeared in increasing numbers at 24h, 4d, and 10d after 3AP but III tubulin-reactive neurons were found at 24d only. We observed apparent increases of GFAP+ or NG2+ cells, with the last type increasing particularly at 4d and 10d. Numerous reactive (strongly stained with G. simplicifolia lectin –IB4) microglia was observed in ION at 4 days. In the cerebellum, there was marked reduction of numbers of Purkinge cells at 4 and 10 days and increased numbers (and/or size) of NG2+in the molecular layer. The results also revealed apparent changes in the expression of glialphenotypic markers (GFAP, NG2, IB4) and calbindin+ neurons in ION in response to 3AP. In addition to neurogenesis in ION, reactive synaptophysin+ puncta (synaptogenesis) were observed 21 days after beginning of the experiments, providing an explanation for spontaneous motor recovery. MINO had a neuroprotector action on ION, leading to the reduction of effects of 3AP on motor activity and also on activation of microglia at 4d. The results suggest that, in addition to the neurotoxic action, the effect of 3AP on ION neurons may result from intense activation of microglia that augments the initial, direct neuronal damage. MINO was able to prevent the motor disturbances provoked by 3AP. This protective action seems to result first from the appearance of reactive ameboid microglia that may provide neuroprotection and second by inhibition of the reactive, roughly branched microglia observed in ION at 4 days.
x
LISTA DE ABREVIATURAS
ARNm – Ácido ribonucleico mensageiroBrdU – 5-Bromo 2’- deoxiuridinaBDNF – Fator de crescimento derivado do cérebroCB – calbindinaEGF – Fator de crescimento epidérmicoFGF2 – bFGF – Fator básico de crescimento de fibroblastoGC – GalactocerebrosídeoGFAP – Proteína ácida do filamento glialIL1 – Interleucina 1IFNγ – Interferon gamaLPS – LipopolissacarídeoMBP – Proteína básica de mielinaMINO – MinociclinaNADP – Nicotinamida adenina fosfatoNOI – Núcleo olivar inferiorPDGFRα – Receptor α do fator de crescimento derivado de plaquetasPLP – proteína proteolipídeoSNC – Sistema nervoso centralSNP – Sistema nervoso periféricoTGFβ- Fator de crescimento transformante betaTNFα – Fator de necrose tumoral alfaZSV – Zona subventricular3AP – 3-acetilpiridina3APADP – 3-acetilpiridina adenina dinucleotídeo fostafo3APAD – 3- acetilpiridina adenina dinucleotídeo
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Neurônios e circuitos do cerebelo .................................................................................. 3
Figura 2 Estrutura das tetraciclinas ............................................................................................... 25
Figura 3 Efeito da neurotoxina 3AP no comportamento motor .................................................... 43
Figura 4 Teste de caminhada ......................................................................................................... 45
Figura 5 Efeito da 3AP nos neurônios do NOI 24h e 4 dias .......................................................... 48
Figura 6 Efeito da 3AP nos neurônios do NOI 10 e 21 dias .......................................................... 50
Figura 7 Imuno-histoquímica para calbindina D-28K no NOI 24h e 4 dias ................................... 53
Figura 8 Imuno-histoquímica para calbindina D-28K no NOI 10 e 21 dias .................................. 55
Figura 9 Imunofluorescência para GFAP no NOI 24h e 4 dias .................................................... 58
Figura 10 Imunofluorescência para GFAP no NOI 10 e 21 dias .................................................... 60
Figura 11 Alterações nas células NG2+ no NOI em resposta à 3AP 24h ...................................... 63
Figura 12 Alterações nas células NG2+ no NOI em resposta à 3AP 4 dias ................................... 65
Figura 13 Alterações nas células NG2+ no NOI em resposta à 3AP 10 dias ................................. 67
Figura 14 Alterações nas células NG2+ no NOI em resposta à 3AP 21 dias ................................. 69
Figura 15 Resposta da microglia no NOI em ratos submetidos à 3AP 5h ...................................... 73
Figura 16 Resposta da microglia no NOI em ratos submetidos à 3AP 24h e 4 dias ...................... 75
Figura 17 Resposta da microglia no NOI em ratos submetidos à 3AP 10 e 21 dias ...................... 77
Figura 18 Resposta da microglia em regiões próximas ao 4º ventriculo ....................................... 79
Figura 19 Efeito da minocilcina na recuperação motora de animais submetidos à ação da 3AP ... 83
Figura 20 Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI 24h ..................................... 85
Figura 21 Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI 4 dias ................................. 87
Figura 22 Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI 10 dias................................ 89
Figura 23 Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI 21 dias ............................... 91
Figura 24 Efeito da 3AP nos neurônios de Purkinje do cerebelo 24h e 4 dias .............................. 94
Figura 25 Efeito da 3AP nos neurônios de Purkinje do cerebelo 10 e 21 dias .............................. 96
Figura 26 Alterações na expressão de calbindina D-28K e na morfologia dos neurônios de Purkinje
24h e 4 dias .................................................................................................................................... 99
Figura 27 Alterações na expressão de calbindina D-28K e na morfologia dos neurônios de Purkinje 10
e 21 dias ......................................................................................................................................... 101
Figura 28 Efeito da 3AP nas células NG2+ do cerebelo 24h ........................................................ 104
Figura 29 Efeito da 3AP nas células NG2+ do cerebelo 4 dias .................................................... 106
Figura 30 Efeito da 3AP nas células NG2+ do cerebelo 10 dias .................................................. 108
Figura 31 Efeito da 3AP nas células NG2+ do cerebelo 21 dias .................................................. 110
Figura 32 Imuno-histoquímica de dupla marcação para BrdU e β-III Tubulina 24h 2e 4 dias .... 113
Figura 33 Imuno-histoquímica de dupla marcação para BrdU e β-III Tubulina 10 e 21 dias ...... 115
xii
Figura 34 Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina e sinaptofisina 24h ............... 118
Figura 35 Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina e sinaptofisina 4 dias ........... 120
Figura 36 Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina e sinaptofisina 10 dias ......... 122
Figura 37 Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina e sinaptofisina 21 dias ......... 124
xiii
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................................... viii
ABSTRACT ...................................................................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................ x
ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................... xi
SUMÁRIO ........................................................................................................................ xiii
1. INTRODUÇÃO
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ATAXIAS ....................................... 1
1.2. O SISTEMA OLIVOCEREBELAR ................................................................ 2
1.3. MODELO DE LESÃO NEURAL: 3-ACETILPIRIDINA .............................. 5
1.4. PROGENITORES E CÉLULAS TRONCO ................................................... 6
1.5. CÉLULAS GLIAIS ......................................................................................... 10
1.5.1. Astrócitos .......................................................................................... 10
1.5.2. Oligodendrócitos ............................................................................... 12
1.5.2.1 Mielina ................................................................................. 14
1.5.3. Polidendrócitos .................................................................................. 15
1.5.4. Microglia ............................................................................................ 17
1.6. MARCADORES FENOTÍPICOS GLIAIS E NEURONAIS ......................... 19
1.6.1. GFAP ................................................................................................. 19
1.6.2. CNPase .............................................................................................. 21
1.6.3. Lectina de Griffonia simplicifolia ...................................................... 22
1.6.4. β-III Tubulina ..................................................................................... 23
1.6.5. Calbindina .......................................................................................... 24
1.7. MINOCICLINA E SUA AÇÃO NEUROPROTETORA ................................ 24
2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 30
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 32
3.1. ANIMAIS ......................................................................................................... 32
3.2. ANTICORPOS E OUTROS LIGANTES ........................................................ 32
3.3. INJEÇÃO INTRAPERITONEAL DE 3-ACETIL-PIRIDINA ........................ 33
3.4. INJEÇÃO INTRAPERITONEAL DE 5-BROMO 2’- DEOXIURIDINA....... 33
3.5. ANÁLISE DO COMPORTAMENTO MOTOR .............................................. 34
3.6. PREPARAÇÃO DO TECIDO .......................................................................... 34
3.7. COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE NISSL (CRESIL VIOLETA) ............... 35
xiv
3.8. PROCEDIMENTOS DE IMUNO-HISTOQUÍMICA ...................................... 35
3.8.1. Imuno-histoquímica de dupla marcação ............................................. 35
3.8.2. Imuno-histoquímica de marcação simples .......................................... 38
3.9. HISTOQUÍMICA DE LECTINA ..................................................................... 39
3.10. TRATAMENTO COM MINOCICLINA ........................................................ 39
3.11. QUANTIFICAÇÃO DAS REAÇÕES IMUNO-HISTOQUÍMICA E
HISTOQUÍMICA ..................................................................................................... 40
4. RESULTADOS
4.1. EFEITO DA NEUROTOXINA 3AP NO COMPOTAMENTO MOTOR ........ 41
4.2. EFEITO DA 3AP NOS NEURÔNIOS DO NOI ............................................... 46
4.3. ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE CALBINDINA D-28K NOS
NEURÕNIOS DO NOI EM RESPOSTA À 3AP ..................................................... 51
4.4. ALTERAÇÃO NA MORFOLOGIA DOS ASTRÓCITOS DO NOI EM
RESPOSTA À 3AP ................................................................................................... 56
4.5. ALTERAÇÕES NAS CÉLULAS NG2 POSITIVAS DO NOI EM
RESPOSTA À 3AP ................................................................................................... 61
4.6. RESPOSTA DA MICROGLIA DO NOI EM RATOS SUBMETIDOS À
AÇÃO DA 3AP ......................................................................................................... 70
4.7. EFEITO DA MINOCICLINA NA RECUPERAÇÃO MOTORA DE RATOS
SUBMETIDOS À AÇÃO DA 3AP ........................................................................... 80
4.8. EFEITO DA MINOCICLINA NA MORFOLOGIA DA MICROGLIA DO
NOI ............................................................................................................................ 80
4.9. EFEITO DA 3AP NOS NEURÔNIOS DE PURKINJE DO
CEREBELO ............................................................................................................... 92
4.10. ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE CALBINDINA D-28K E
NA MORFOLOGIA DOS NEURÔNIOS DE PURKINJE ....................................... 97
4.11. EFEITO DA 3AP NAS CÉLULAS NG2 POSITIVAS DO
CEREBELO ............................................................................................................... 102
4.12. RESPOSTA DE PROLIFERAÇÃO CELULAR OBSERVADA ATRAVÉS
DE DUPLA MARCAÇÃO COM BrdU E β-III TUBULINA NO NOI DE
RATOS SUBMETIDOS À AÇÃO DA 3AP .............................................................. 111
4. 13. EFEITO DA 3AP NOS CONTATOS SINÁPTICOS NA CAMADA
MOLECULAR DO CÓRTEX CEREBELAR ............................................................ 116
5. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 125
xv
6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 136
7. PERSPECTIVAS ................................................................................................. 138
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 139
1
INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ATAXIAS
O cerebelo recebe uma grande quantidade de informações sensoriais cujos efeitos
sobre o cerebelo são vitais para a realização do movimento normal. Entretanto, uma lesão
grave no cerebelo não interfere na percepção sensorial ou na força muscular, mas, é capaz de
gerar descoordenação motora importante, caracterizada principalmente por movimentos
voluntários irregulares e imprecisos. Apesar da descoordenação motora, a locomoção ainda é
possível mas o modo de andar é instável (Nicholls e cols., 2001). Tal descoordenação,
conhecida como ataxia, pode afetar a postura do tronco, quando a lesão cerebelar ocorre na
linha média; a marcha, quando ocorrem lesões paravérmicas; e, seletivamente, os membros,
quando ocorrem lesões laterais do cerebelo. A ataxia, no homem, pode ainda se manifestar
como disartria, isto é, fala enrolada com má articulação das palavras, quando ocorrem lesões
vérmicas (Lundy-Ekman, 1998).
As ataxias cerebelares constituem um grupo de doenças neurodegenerativas de causas
variadas que incluem mutações genéticas, fatores ambientais, câncer e outros fatores
indeterminados. Cerca da metade das ataxias estão relacionadas a mutações genéticas e têm
sido classificadas, de acordo com o processo patológico envolvido, como mitocondrial,
metabólica, por defeitos no sistema de reparo do ADN, por defeitos na formação da estrutura
tridimensional de proteínas e alterações em canais iônicos (Harding, 1993).
A ataxia não resulta apenas de lesões cerebelares. A interferência na transmissão
somato-sensorial para o cerebelo, seja por lesão espino-cerebelar ou por distúrbios periféricos,
também pode produzir ataxia.
Até o momento, não há tratamento efetivo para nenhum dos tipos de ataxia e como a
etiologia da ataxia é variada, uma única abordagem terapêutica não tem sido possível. Em
2
muitos tipos de ataxia cerebelar tem sido experimentada, com certa dificuldade, como
estratégia terapêutica, a ação de substâncias neuroprotetoras. Embora as células de Purkinje,
do córtex cerebelar, sejam os neurônios mais comumente afetados, outras populações
neuronais podem também ser comprometidas, o que parece dificultar a resposta terapêutica.
Alguns autores consideram que a utilização de substâncias com ação neuroprotetora
combinada a estratégias terapêuticas mais atuais, como por exemplo, as terapias gênica e com
células tronco, possa contribuir de forma mais significativa para o reparo das áreas afetadas e
consequente melhora na descoordenação motora nos pacientes com ataxia (Fernandez e cols.,
2005).
1.2 O SISTEMA OLIVO-CEREBELAR
O cerebelo recebe informações de origem periférica e central através de diferentes
sistemas pré-cerebelares que terminam em diferentes camadas do córtex cerebelar. Essas
informações chegam ao cerebelo através das fibras trepadeiras, que se originam no complexo
olivar inferior, no bulbo, e fazem sinapses com as células de Purkinje, e das fibras musgosas,
originadas na medula espinhal, na formação reticular, no sistema vestibular e nos núcleos
pontinos (figura 1). As informações recebidas pelo cerebelo são, então, integradas para
produzir os ajustes apropriados na atividade dos “neurônios motores superiores”,
especialmente os do córtex motor, e daí na atividade das vias descendentes. Assim, pode-se
dizer que a função primária do cerebelo é detectar diferenças ou “erros motores” entre o
movimento em curso e o movimento. pretendido e, a partir dessas projeções para os
“neurônios motores superiores”, corrigir o erro. Essa correção também pode ocorrer como
uma forma de aprendizado motor quando a informação da correção é armazenada (Purves e
cols., 2001).
3
Adaptado de Purves e cols., Neuroscience, 2001.
Figura 1: Neurônios e circuitos do cerebelo. (A) – Tipos de neurônios no córtex cerebelar e (B) –Esquema mostrando a convergência de sinais para os neurônios de Purkinje a partir das fibras paralelas, neurônios de circuitos locais, além das conexões estabelecidas com as fibras trepadeiras.
A função de coordenação motora executada pelo cerebelo é crítica e depende muito da
atividade das células de Purkinje, que são neurônios calbindina positivos. Barski e
colaboradores demonstraram que a deleção seletiva do gene relacionado à proteína ligante de
cálcio calbindina D-28K, em células de Purkinje cerebelares, provoca déficit severo na
transmissão sináptica e no controle motor cerebelar (Barski e cols., 2003).
O complexo olivar inferior, que representa uma das principais fontes de aferências
para o cerebelo, em mamíferos, é constituído pela oliva principal e pelas olivas acessórias
dorsal e medial e vários subnúcleos menores. Estudos realizados por Ramón y Cajal,
publicados em 1909 e 1911 (ver Ramon y Cajal, 1911), possibilitaram a primeira descrição
4
detalhada dessa área do tronco cerebral. A população de neurônios olivares é relativamente
homogênea e, com exceção de poucos interneurônios, é constituída por dois tipos de
neurônios. Um tipo principal, com corpo celular esférico (com diâmetro entre 15-30 µm) e
uma complexa arborização dendrítica. Este tipo de neurônio é predominante na oliva principal
e na parte rostral das olivas acessórias medial e dorsal. O outro tipo de neurônio tem
arborização radial, longa e difusa e é predominante na parte caudal da oliva acessória medial.
Estudos ultraestruturais desses neurônios têm mostrado que as espinhas dendríticas estão
frequentemente acopladas por meio de junções gap (De Zeeuw e cols., 1989; De Zeeuw e
cols., 1990). Em rato, o núcleo olivar inferior é constituído por cerca de 48.800 células
(Schild, 1970) que se projetam diretamente para 350.000 células de Purkinje. O axônio de
cada neurônio olivar inferior atravessa a linha média a nível bulbar e, após ingressar no
pedúnculo cerebelar contralateral, ramifica-se na substância branca cerebelar para inervar, em
média, sete células de Purkinje.
Três variedades de astrócitos foram identificadas na oliva inferior nos diferentes
animais estudados: astrócitos fibrosos, que apresentam prolongamentos longos, são
imunorreativos para GFAP e estão localizados entre os feixes de fibras mielinizadas,
astrócitos protoplasmáticos, que apresentam menos filamentos intermediários que o primeiro
tipo e astrócitos com véu, que apresentam uma estrutura lamelar organizada ao redor da
arborização dentrítica neuronal. Além disso, estudos ultraestruturais permitiram a
identificação de áreas de contato entre as células gliais. Oligodendrócitos e seu
prolongamentos formam junções comunicantes com astrócitos e junções aderentes com
outros oligodendrócitos (Bozhilova-Pastirova e Ovtscharoff, 2000).
1.3 MODELO DE LESÃO NEURAL: 3 –ACETIL-PIRIDINA
5
Uma variedade de procedimentos podem ser utilizados para observação e estudo das
respostas do sistema nervoso a lesão, que incluem modelos de isquemia, produzidos por
diferentes procedimentos de oclusão de vasos sanguíneos, lesões induzidas por trauma
mecânico, por injeção intracerebral de neurotoxinas e injeção intraperitonial da neurotoxina
3-acetil-piridina (3AP) (Gibb e cols., 1988; Harukuni e Bhardnaj, 2006; Marsala e cols.,
2007).
A 3AP é um antagonista competitivo da nicotinamida capaz de induzir degeneração em
várias regiões do sistema nervoso após administração sistêmica. Embora a perda neuronal
induzida pela 3AP já tenha sido demonstrada no hipocampo, na substância nigra pars
compacta e em vários outros núcleos do tronco cerebral, em roedores o núcleo olivar inferior
é o mais severamente afetado, o que sugere uma ação seletiva da 3AP em certos sub-sistemas
neurais (Desclin, 1974; Balaban, 1985).
No cérebro, a 3AP é rapidamente convertida em 3AP-adenina dinucleotídeo (3APAD)
e em 3AP-adenina dinucleotídeo fosfato (3APADP) pela NADP-glico-hidrolase, levando a
perda funcional da niacinamida e NADP e subsequente impedimento da transferência de íons
H+ em muitas reações enzimáticas dependentes de niacinamida/ NADP (revisto em Wullner e
cols., 1997).
A neurotoxicidade seletiva central da 3AP observada poderia ser explicada, segundo
Hicks e outros autores, por deficiências de niacinamida no plasma, pela permeabilidade das
células a 3AP, pela eliminação da neurotoxina e outros fatores metabólicos neuronais (Hicks,
1955). Trabalhos mais recentes sugerem que o estresse oxidativo pode estar relacionado com
a toxicidade da 3AP, que pode ser atenuado pela ação de substâncias anti oxidantes (Schulz e
cols., 1995).
Estudos de microscopia eletrônica e óptica mostraram que os neurônios olivares
inferiores sofrem rápida degeneração eletro-densa e que há um completo comprometimento
6
bilaterial do núcleo olivar inferior 12 h após a injeção com a 3AP. Além disso, uma intensa
proliferação astrocitária foi também observada em 12 h enquanto a atividade microglial
apareceu mais tardiamente, 60 h após a injeção. Adicionalmente, evidenciou-se alterações
degenerativas no córtex cerebelar com as varicosidades (protuberâncias nas terminações
axonais) das fibras trepadeiras exibindo aspecto degenerativo 24h após a injeção com essa
neurotoxina (Anderson e Flumerfelt, 1980).
Dados da literatura sugerem o uso da 3AP para obtenção de um modelo experimental
de ataxia, em virtude do efeito produzido sobre o núcleo olivar inferior (Fernandez e cols.,
1998). Lopez-Garcia e colaboradores demonstraram que a injeção intraperitoneal de 3AP foi
capaz de causar uma lesão seletiva no cortex cerebral medial de lagartos adultos, com rápida
degeneração da camada granular (Revisão: Lopez-Garcia e cols., 2002). A degeneração
descrita foi seguida por um aumento no número de neuroblastos proliferantes e consequente
processo de regeneração e o desaparecimento transitório da microglia, que reapareceu cerca
de duas semanas após a indução da lesão (Lopez-Garcia e cols., 1994).
1.4 PROGENITORES E CÉLULAS TRONCO
A neurogênese reativa demonstrada por Lopez-Garcia (1994) no córtex cerebral
medial de lagartos adultos em resposta a 3AP, comentada anteriormente, não foi a única
descrição de neurogênese em encéfalo de aninais adultos.
Altman já havia sugerido a persistência da neurogênese no encéfalo de roedores
adultos, em um trabalho intitulado “Are new neurons formed in the brains of adult animals?”,
publicado na Science (Altman, 1962), mas isso só foi confirmado em 1977, quando Kaplan e
Hinds, usando microscopia eletrônica e autorradiografia com timidina tritiada, demostraram a
presença de novos neurônios no bulbo olfatório e no giro dentado hipocampal (Kaplan e
7
Hinds, 1977). Também a partir de 1977, vários estudos em vertebrados não mamíferos
(anfíbios, peixes, répteis e aves) mostraram a formação de novos neurônios na vida adulta,
principalmente em estruturas relacionadas com a visão (John e Easter, 1977; Raymond e
Easter, 1983) ou com o canto dos pássaros (Nottebohm, 1985) e no hipotálamo (Chetverukhin
e Polenov, 1993).
A gênese de novos neurônios, em encéfalo de mamíferos adultos, tem sido
documentada na camada subgranular do giro dentado (Revisão: Gage, 2000) e na zona
subventricular (ZSV) dos ventrículos laterais (Luskin, 1993; Lois e Alvarez-Buylla, 1994;
Gage, 2000) e tem sido demonstrada a produção de novos neurônios em hipocampo de
humanos (Eriksson e cols., 1998). A ocorrência de axogênese e sinaptogênese em indivíduos
adultos foi demonstrada, mesmo em ausência de processos patológicos, em resposta a fatores
hormonais, estresse, entre outros (Theodosis e Poulain, 1993; Frankfurt, 1994). A noção do
encéfalo adulto como uma estrutura imutável foi então substituída pela idéia da plasticidade,
que vem sendo confirmada em diferentes trabalhos e que sugerem que esta neurogênese
sustentada na vida adulta é consequência da persistência de células tronco neurais dentro de
áreas restritas do SNC.
O termo “ célula tronco neural” é usado para designar células que apresentam duas
propriedades principais: capacidade de divisão simétrica para gerar grande número de células
idênticas (multiplicação) e também, de divisão assimétrica para produzir células progenitoras
que poderão dar origem a diferentes tipos celulares, como neurônios e células gliais
(multipotencialidade) (Gage, 2000; Momma e cols., 2000).
A área germinativa da ZSV telencefálica, no adulto, é principalmente constituída por
quatro tipos celulares distintos: células ependimárias que estão voltadas para o lúmen do
ventrículo, neuroblastos migrantes (células tipo A), circundados por astrócitos (células tipo B)
e, por último, células agrupadas e relacionadas aos neuroblastos (células tipo C). Vários
8
estudos têm tentado determinar que células da zona subventricular são células tronco, embora
ainda com resultados controversos. Em 1999, Johansson e cols. apresentaram evidências de
que as células ependimárias seriam as células tronco neurais, enquanto outros resultados,
apresentados por Doetsch e cols., no mesmo ano, sugeriram serem as células tipo B.
Estudos realizados in vitro também têm contribuído para aumentar o conhecimento
sobre as células tronco neurais. A utilização de diferentes marcadores de proliferação celular
(como 5-bromo 2’-deoxiuridina - BrdU) e de diferentes tipos celulares (calbindina: neurônios,
nestina: progenitores, proteína ácida de filamentos gliais – GFAP: astrócitos, entre outros)
permitiu mostrar que as células tipo B proliferam em cultura, formando neuroesferas que
possuem a capacidade de gerar tanto neurônios como células gliais (Reynolds e cols., 1992;
Reynolds e Weiss, 1992; Lois e Alvarez-Buylla, 1993). Além disso, tem sido observado que
as capacidades proliferativa e multipotencial dessas células parece ser regulada por fatores
internos, como hormônios, neurotransmissores e fatores de crescimento e também por
estímulos ambientais, como as variações sazonais e estímulos sensoriais (Cayre e cols., 2002).
Em relação aos fatores de crescimento, por exemplo, observou-se que a adição de FGF-2
(bFGF: fator básico de crescimento de fibroblastos) ou EGF em meio de cultura induziu a
proliferação de células progenitoras, permitindo a formação de clones de células a partir do
hipocampo ou da ZSV de roedores adultos (Reynolds e Weiss, 1992; Gage e cols., 1995). Foi
demonstrado também que BDNF parece atuar como um fator de sobrevivência para os
neurônios recém formados (Kirschenbaum e Goldman, 1995).
Células tronco neurais, isoladas a partir do quarto ventrículo e do canal central da
medula espinhal de camundongos adultos, formam neuroesferas in vitro em resposta a
algumas combinações de fatores de crescimento, como EGF e FGF-2 (Weiss e cols., 1996).
Em rato, a injeção intratecal de EGF e FGF-2 aumentou significativamente a proliferação de
células ao redor do canal central (Kojima e Tator, 2000), embora a injeção apenas de FGF-2
9
no interior do ventrículo lateral de rato tenha sido suficiente para produzir aumento das
células proliferativas no cérebro (Kuhn e cols., 1997). Muito pouco é conhecido sobre quais
os fatores de crescimento são necessários e suficientes para induzir a proliferação de células
tronco no interior do quarto ventrículo e do canal central da medula espinhal. Martens e
colaboradores demonstraram que células tronco e progenitores endógenos, localizados ao
redor do quarto ventrículo e no canal central da medula espinhal, proliferam em resposta a
injeção intraventricular de fatores de crescimento (Martens e cols., 2002). Além disso,
demonstrou-se que células progenitoras neurais foram geradas em cultura, a partir da medula
óssea, na presença dos fatores de crescimento bFGF e EGF , bem como se diferenciaram em
neurônio e glia (Kabos e cols., 2002).
Mezey e colaboradores demostraram a geração de microglia e macroglia, a partir de
células de medula óssea, em diferentes regiões do encéfalo de camundongo. O mesmo grupo
estudando cérebro de mulheres, após a morte, que receberam transplante de medula óssea de
doadores homens, demonstrou a geração de novos neurônios especialmente no hipocampo e
no córtex cerebral (Eglitis e Mezey, 1997; Mezey e cols., 2003). Curiosamente, um outro
estudo demonstrou que a microglia, em cultura, seria uma fonte potencial de neurônios,
astrócitos e oligodendrócitos (Yokoyama e cols., 2004). Estes dados sugerem a análise do
papel de citocinas, que são largamente produzidas pela microglia (Hanisch, 2002) ou agem
sobre elas, no desenvolvimento e na plasticidade do sistema nervoso.
Outra importante observação feita foi a da existência de células tronco neurais
multipotentes no cerebelo. Lee e colaboradores isolaram estas células e demonstraram, in
vitro, que são capazes de se diferenciar em astrócitos, oligodendrócitos e neurônios (Lee e
cols., 2005). Mais recentemente, Bonfanti e cols. (2008) observaram a gênese de
progenitores glial e neuronal no córtex cerebelar de coelhos adultos.
É aceito que certos neurônios no SNC de animais adultos mantém o seu potencial para
10
formação de novos contatos sinápticos em resposta a lesão ou outros estímulos. Este
mecanismo é conhecido como sinaptogênese reativa e já foi demonstrado em diferentes
regiões do cérebro (revisto em Hamori, 1990 e Nadler, 2003). Mais recentemente, Letellier e
cols. (2007) observaram que parte dos eventos iniciais da sinaptogênese podem ser
reproduzidos quando ocorre reinervação em sistemas relativamente maduros em resposta a
lesão. Essas observações destacam a sinaptogêsene reativa como um mecanismo que pode
contribuir pra recuperação de lesões no SN.
1.5 CÉLULAS GLIAIS
1.5.1 Astrócitos
No SNC os astrócitos correspondem a aproximadamente 50% de todas as células
gliais (Reinchenbach, 1989) e são derivadas durante o desenvolvimento principalmente da
glia radial, após ter sido completada a geração e migração neuronal (Schmechel e Rakic,
1979a; Barradas e cols., 1989; Voigt, 1989).
A análise morfológica permitiu classificar os astrócitos em fibrosos e
protoplasmáticos. Os astrócitos fibrosos apresentam corpo celular pequeno, prolongamentos
finos e longos e são encontrados tipicamente na substância branca. Já os astrócitos
protoplasmáticos apresentam corpo celular maior que os fibrosos, possuem prolongamentos
curtos e ramificados e são tipicamente encontrados na substância cinzenta (Privat e cols.,
1995).
Os astrócitos exibem uma forte interligação estrutural com os neurônios em todas as
regiões do SNC. As membranas somática e dendrítica são envolvidas por prolongamentos dos
astrócitos. Na substância branca, os prolongamentos dos astrócitos organizam a estrutura
11
conhecida como aparelho nodal, nos nós de Ranvier (Sims e cols., 1985). Estes
prolongamentos também formam especializações em contato com outros elementos teciduais
do SNC, como vasos sanguíneos (pés terminais perivasculares), que recentemente tem sido
relacionados à indução de propriedades de barreira na vasculatura neural (Garcia e cols.,
2004) e também com as meninges.
Além da interligação estrutural com os neurônios, os astrócitos apresentam-se
interligados entre si pela presença de junções comunicantes (Giaume e Mc Carthy, 1996).
Assim, os astrócitos parecem constituir um sincício que controla a homeostasia extracelular e
cria condições ideais para a atividade neuronal (Montgomery, 1994).
A morfologia astrocitária pode ser influenciada por vários fatores incluindo interações
com neurônios (Hatten, 1985), neurotransmissores (Cornell-Bell e cols., 1992) e durante
estados fisiológicos, como lactação (Salm e cols., 1985) ou fisiopatológicos, como a
desidratação (Perlmutter e cols., 1985).
Os astrócitos, além das relações estruturais com os neurônios, desempenham
atividades consideradas essenciais para a função neuronal e, conseqüentemente, para a
atividade cerebral normal. Os astrócitos contribuem para a migração neuronal, influenciam o
crescimento de neuritos, dão suporte à sinaptogênese e estão relacionados à plasticidade
sináptica; participam na manutenção do equilíbrio hidro-eletrolítico, da barreira hemato-
encefálica e modulam as respostas imune/inflamatórias e funções fagocíticas (Walz, 2000).
Mais recentemente, tem sido atribuída aos astrócitos a participação na regulação da
transmissão sináptica (Newman, 2003). Além disso, os astrócitos garantem suprimento
energético para os neurônios (Tsacopoulos e Magistretti, 1996).
Os astrócitos também são capazes de proteger os neurônios contra a toxidade de
determinadas substâncias. Apresentam sistemas enzimáticos específicos que permitem o
metabolismo da amônia, radicais livres e glutamato, entre outros (Meister, 1988; Yudkoff e
12
cols., 1990). Estudos mostraram que a capatação do glutamato, do espaço extracelular, pelos
astrócitos pode minimizar a excitotoxicidade neuronal (Brown, 2000).
1.5.2 Oligodendrócitos
Os oligodendrócitos constituem um outro integrante da glia no SNC. Este tipo glial é
responsável pela formação de uma estrutura altamente especializada, a bainha de mielina, que
se constitui de camadas multilamelares de mielina ao redor dos axônios no SNC. Diferente
disto, no sistema nervoso periférico, cada célula de Schwann (do tipo mielinizante) forma
bainha de mielina em apenas um axônio. A bainha de mielina produz um isolamento elétrico
ao redor das fibras nervosas que torna possível a rápida transmissão de sinais neurais no
sistema nervoso.
O termo oligodendroglia foi introduzido por del Rio Hortega em 1928 para a descrição
de células que apresentavam poucos prolongamentos, quando impregnadas pelo carbonato de
prata, e eram mais abundantes na substância branca.
Os oligodendrócitos se originam de precursores localizados na zona ventricular
ventral, em estágios precoces da vida embrionária. O desenvolvimento dos oligodendrócitos é
melhor entendido na medula espinal do que no cérebro. Na medula espinhal, os
oligodendrócitos parecem originar-se a partir de uma área muito restrita na zona ventricular,
num processo dependente dos fatores de transcrição (Olig 1 e Olig 2) e de sinalização por
Sonic Hedgehog (Orentas e cols., 1999). A partir dessa área, as células precursoras de
oligodendrócitos migram para alcançar todas as partes da medula e atingir os axônios alvo,
onde, então, começam a expressar altos níveis dos produtos do gene da mielina e embainhar
os axônios.
13
Os precursores de oligodendrócitos podem ser distinguidos de outras células neuro-
epiteliais pela expressão do ARNm do receptor α do PDGF (PDGFRα) e do ARNm da dm20,
resultante do processamento alterantivo do gene plp (Pringle e cols., 1993; Timsit e cols.,
1995). Estas células, embora sejam encontradas em localidades próximas, não coexpressam
ARN de plp/ dm20 e PDGFRα, sugerindo serem essas duas populações de células
neuroectodérmicas linhagens oligodendrogliais distintas (Spassky e cols., 1998).
Os oligodendrócitos atravessam muitos estágios ao longo do desenvolvimento até
atingirem a maturidade. Sendo assim, a observação da expressão de marcadores antigênicos e
dos estados mitótico e migratório destas células se constituem recursos importantes para a
identificação de estágios ontogenéticos distintos. Alguns desses marcadores antigênicos são
característicos de cada fase do desenvolvimento dos oligodendrócitos. Os precursores
neuroepiteliais expressem o marcador Olig1, enquanto os precursores de oligodendrócitos
expressam PDGFRα e A2B5. As células conhecidas como pró-oligodendrócitos são positivas
para O4. E os oligodendrócitos pré-mielinizante e mielinizante expressam, respectivamente,
galactocerebrosideo (GC) e proteína proteolipídeo (PLP) e proteína básica de mielina (MBP)
(Jessen, 2004).
Os oligodendrócitos são células altamente sensíveis a vários tipos de agressões como
anóxia, radicais livres, entre outros. Nos últimos anos, observou-se que células do SNC adulto
expressam o proteoglicano condroitin sulfato NG2, o receptor α de PDGF e são O4+ (Levine
e cols., 1993; Pringle e cols., 1992; Reynolds e Hardy, 1997). Estas células constituem os
precursores adultos de oligodendrócitos, atualmente denominadas polidendrócitos e
consideradas o quarto tipo glial do SNC (Nishiyama e cols., 2002).
1.5.2.1 Mielina
14
A mielina central é formada como uma extensão das membranas plasmáticas dos
oligodendrócitos, que se espiralizam, produzindo camadas concêntricas, multilamelares, ao
redor dos axônios. Esta estrutura apresenta compartimentos individualizados, como a região
paranodal que pode estar envolvida com o fluxo iônico nos nodos de Ranvier e a mielina
internodal composta por mielina compacta, as incisuras de Schmidt-Lanterman e o
componente radial (Kirschner e Blaurock, 1992). No entanto, a composição da mielina é
distinta da do oligodendroplasmalema (Newman e cols., 1995).
A mielina confere importantes vantagens ao SN dos vertebrados, como o aumento da
velocidade de condução do impulso nervoso, fidelidade na transmissão do sinal a longas
distâncias e economia metabólica e de espaço, em contraste com o SN dos invertebrados,
onde a eficiência da condução é, geralmente, atribuída ao aumento do calibre axonal
(Baumann e Pham-Dinh, 2001). Além disso, a mielina é um alvo importante de atenção uma
vez que está envolvida numa variedade de condições patológicas como leucodistrofias e
esclerose múltipla, no SNC e neuropatias periféricas, no SNP. Por outro lado, pelo seu
elevado teor de proteínas inibitórias do crescimento de neuritos, a mielina central exerce uma
influência negativa sobre a plasticidade no SNC, impedindo a regeneração após lesões
(Schwab, 1996).
1.5.3 Polindendrócitos
Além dos clássicos constituintes celulares do SNC que incluem neurônios, astrócitos,
oligodendrócitos e microglia, a identificação de um quarto tipo glial, os polidendrócitos, vem
acrescentando novos conhecimentos sobre estrutura e função do SN.
Ao longo de, pelo menos, duas décadas, diferentes autores referiram-se a estas células
usando diferentes nomes. Em 2002, o termo polidendrócitos foi introduzido por Nishiyama e
15
colaboradores, como sinônimo de células que expressam o proteoglicano condroitin sulfato –
NG2, que foi identificado por Stallcup e colaboradores há mais de 25 anos (revisto em
Nishiyama, 2007).
Os primeiros estudos de identificação das células NG2 positivas in vivo, feitos em
córtex cerebelar adulto, mostraram células com morfologia estrelada (revistos em Stallcup,
2002) e nenhuma imunorreatividade para GFAP ou filamentos intermediários identificados
por ultraestrutura (Levine e Card, 1987). Estudos posteriores revelaram que a distribuição
espacial e temporal destas células estava mais estreitamente relacionada ao desenvolvimento
de oligodendrócitos do que de astrócitos (Levine e cols., 1993; Nishiyama e cols., 1996a). No
entanto, foi a demonstração de que células NG2 positivas expressam também o receptor α
para PDGF (PDGFR α) que sustentou a idéia de que os polidendrócitos seriam células
precursoras de oligodendrócitos in vivo (Nishiyama e cols., 1996a, 1997).
Após o desenvolvimento, os polidendrócitos persistem no SNC. Em virtude desta
observação, podemos supor que a permanência destas células, após a formação e
amadurecimento da mielina, poderia contribuir para manutenção e reparo desta estrutura.
No SNC adulto normal, os polidendrócitos proliferam lentamente (Levine e cols.,
1993). Por outro lado, a proliferação aumenta nos tratos da substância branca de
camundongos com defeitos genéticos na mielinização (Wu e cols., 2000) e também em
resposta à vários tipos de lesão desmielinizante induzidas química ou imunologicamente (Di
Belo e cols., 1999; Mason e cols., 2000; Watanabe e cols., 2002). Além disso, Reynolds e
colaboradores (2002) mostraram que estas células, após a indução da lesão, apresentaram
imurreatividade para NG2 e CNPase, sugerindo que os polidendrócitos proliferam e se
diferenciam em oligodendrócitos em resposta a lesão desmielinizante.
Os polidendrócitos formam “sinapses” com os neurônios. Vários trabalhos
demonstraram a presença de canais iônicos dependentes de voltagem e receptores
16
ionotrópicos para neurotransmissores nestas células. Comunicações entre polidendrócitos e
neurônios foram demonstradas em hipocampo e em outras regiões anatômicas do SN, como a
camada molecular do córtex cerebelar onde os dendritos das células de Purkinje e os
polidendrócitos são inervados pelas fibras trepadeiras (revisto em Nishiyama, 2007).
Além da mudança na proliferação comentada anteriormente, alterações na expressão
de NG2 e nos prologamentos celulares foram demonstradas em diferentes condições de lesão
do SNC (Levine, 1994; Bu e cols., 2001) e embora esta reação seja diferente daquela exibida
pelos astrócitos, ocorre também na zona da cicatriz glial (Silver e Miller, 2004), o que poderia
sugerir que de alguma maneira a presença destas células pudesse interferir no processo de
progressão do dano ou na recuperação.
Vários estudos mostraram que o NG2 purificado inibe o crescimento axonal (revisto
em Chen e cols., 2002a) e causou colapso do cone de crescimento axonal, além de inibir o
crescimento de neuritos em neurônios cerebelares e de gânglio de raíz dorsal (Chen e cols.,
2002b; Ughrin e cols., 2003). Por outro lado, Yang e colaboradores (2006) mostraram que os
polidendrócitos, que possuem NG2 na sua superfície, promoveram o crescimento de neuritos
em co-culturas com axônios. E ao contrário do que foi mostrado com o NG2 purificado, não
houve colapso dos cones de crescimento axonal quando ocorreu contacto com os
polidendrócitos. É possível que o contato direto com os polidendrócitos de alguma maneira
contribua para o crescimento axonal e a recuperação da lesão.
1.5.4 Microglia
A primeira investigação sistemática da microglia foi realizada por del Rio Hortega,
em 1918, utilizando o método de impregnação por carbonato de prata. A análise de seções de
tecido nervoso permitiu a observação de células com corpo celular reduzido com arborização
17
grande e extremamente ramificada. Apesar de muitos estudos envolvendo a microglia, até
hoje não há clareza sobre as funções desempenhadas por estas células no SN. Diferentemente
dos outros tipos gliais, a microglia tem origem mesodérmica (Cuadros e Navascues, 1998).
A identificação da microglia pode ser feita através da utilização de diferentes métodos,
além da impregnação pela prata. Métodos histoenzimáticos, como nucleosídeo difosfatase e
tamina pirofosfatase, desenvolvido por Novikoff e Goldfisher (Novikoff e Goldfisher, 1961),
por ligação de determinadas lectinas, como as derivadas de Griffonia simplicifolia e de
Lycopersicon esculentum, a glicoconjugados da membrana microglial (Streit e cols., 1985) e
por imuno-histoquímica, utilizando anticorpos monoclonais que reconhecem antígenos
específicos de células da linhagem de monócitos e macrófagos (Perry e cols., 1985; Cuadros e
cols., 1992).
As células microgliais estão presentes em grande número na maioria das áreas
encefálicas, mas sua distribuição não é uniforme. É mais abundante na substância cinzenta do
que na branca especialmente nas regiões do hipocampo, bulbo olfatório, núcleos da base e
substância nigra. Outro aspecto também interessante, descrito por Lawson e colaboradores
em 1990, é o fato da morfologia microglial variar de acordo com sua localização. Na
substância cinzenta observaram células com arborização radial enquanto na substância branca,
arborização longitudinal (alinhadas ao eixo das fibras nervosas), em áreas de barreira hemato-
encefálica frouxa observaram microglia mais arredondada e com prolongamentos mais curtos
e menos ramificados (Lawson e cols., 1990).
Durante o desenvolvimento, a microglia apresenta uma morfologia mais arredondada e
poucos prolongamentos. Esta forma é conhecida como microglia amebóide. Após o
nascimento e com o decorrer das primeiras semanas pós-natais, a morfologia microglial é
modificada, as células passam a apresentar um corpo celular mais reduzido e são evidenciados
muitos prolongamentos, finos e ramificados. Esta microglia, agora conhecida como
18
ramificada, encontrada no cérebro adulto normal, é capaz de responder a condições de lesão e
em consequência, assumir um estado ativado. A microglia ativada exibe mudanças na sua
morfologia e é capaz de expressar propriedades funcionais e antigênicas, semelhantes às dos
macrófagos periféricos (Kreutzberg, 1996; Moore e Thanos., 1996).
A reação microglial à lesão e condições patológicas no cérebro e na medula espinhal
vem sendo descrita há vários anos. Esta reação inicialmente surge como um mecanismo de
defesa do sistema nervoso central e posteriormente, parece atuar de modo a acentuar os
prejuízos desencadeados pela condição patológica. Vários trabalhos demonstraram a relação
entre ativação microglial e neurodegeneração, como a característica da doença de Alzheimer e
desmielinização de axônios na esclerose múltipla (Benveniste, 1997; Akiyama e cols., 2000;
Pocock e Liddle, 2001).
A ativação microglial, já comentada anteriomente, é caracterizada por alterações
morfológicas e também funcionais, em reposta à lesão, que incluem aumento de proliferação,
aumento do volume celular e morfologia amebóide, capacidade fagocítica, aumento da
expressão de moléculas do complexo de histocompatibilidade II (MHC II), além da produção
de citocinas (Gehrmann e Kreutzberg, 1995). Ainda em relação as mudanças funcionais, a
microglia ativada pode liberar substâncias potencialmente citotóxicas (radicais livres, óxido
nítrico, proteases, aminoácidos excitatórios) e citocinas (IL-1, IFN-γ ou TNF-α) (Banati e
cols., 1993a e b; Rothwell e Luheshi, 2000), sugerindo a participação da microglia na
progressão do processo patológico. Em contrapartida, as células da microglia também podem
desempenhar papel protetor. O TGF-ß1, sintetizado e liberado pela microglia ativada, reduz a
formação da cicatriz glial (Lindholm e cols., 1992) e é também capaz de bloquear a
proliferação e induzir apoptose da microglia (Böttner e cols., 2000).
19
1.6 MARCADORES FENOTÍPICOS DE CÉLULAS GLIAIS E NEURONAIS
A identificação de marcadores fenotípicos celulares, em especial marcadores para
células neuronais e gliais, e a utilização dos mesmos têm permitido a análise não apenas
morfológica mas também a compreensão das interações entre essas células e as respostas
celulares às alterações do seu micro-ambiente. Neste trabalho como utilizamos alguns desses
marcadores torna-se necessário uma breve descrição sobre aqueles do nosso interesse.
1.6.1 GFAP
Os astrócitos fibrosos e citoplasmáticos se caracterizam pela presença de filamentos
finos no seu citoplasma, sendo porém esses filamentos mais abundantes na forma fibrosa da
célula. (Mori e Leblond, 1969). Poucos anos depois foi verificado que o principal componente
dos filamentos intermediários dos astrócitos era uma única proteína ácida, que foi então
denominada proteína glial fibrilar ácida (GFAP) (Eng e cols., 1971).
No SNC, a GFAP é encontrada exclusivamente em corpos celulares e prolongamentos
de astrócitos (Bignami e Dahl, 1973, 1974a). Outras observações mostraram que a
distribuição de GFAP não parece estar limitada às estruturas filamentosas intracelulares pois
foi encontrada uma marcação difusa no citoplasma, sem qualquer associação com organelas
subcelulares (Schachner e cols., 1977). Outros trabalhos também mostraram que GFAP está
presente em pituícitos de rato e nos tanicitos de camundongos, o que foi usado para indicar a
existência de uma relação entre estes tipos celulares e os astrócitos convencionais (Bascó e
cols., 1981; Suess e Pliska, 1981). Embora alguns estudos tenham demonstrado a presença
de GFAP, no citoplasma e prolongamentos, de células envolvidas com a formação da mielina,
20
no início de desenvolvimento (Choi e Kim, 1984; Raff e cols., 1983) não há evidências de que
GFAP seja de fato expressa em oligodendrócitos, em neurônios, ou em microglia.
De forma análoga ao SNC, no SNP , a imunorreatividade de GFAP parece estar
restrita às células gliais que não formam mielina, sugerindo uma divisão de tarefas semelhante
àquela que ocorre no SNC entre astrócitos e oligodendrócitos (Dahl e cols., 1982; Jessen e
Mirsky, 1980; Yen e Fields, 1985).
A abundância de GFAP nos astrócitos, e a marcada conservação entre os vertebrados
sugerem uma função crítica para esta proteína. No entanto, essa função ainda permanece
pouco entendida. A expressão de GFAP está relacionada à diferenciação dos astrócitos (Dahl,
1981; Bovolenta e cols., 1984). Além disso, sua expressão é dramaticamente regulada de
forma positiva no processo de gliose em astrócitos hipertrofiados (Amaducci e cols., 1981;
Mathewson e Berry, 1985; Eddleston e Mucke, 1993), o que sugere a participação da GFAP
na determinação da complexa morfologia astrocitária, neste caso, que inclui processos
múltiplos que fazem contato com a parede de vasos sanguíneos, embainham sinapses
neuronais e se interdigitam com a superfície pial. Sendo assim, a utilização de GFAP como
um marcador glial é de extrema importância em diversas patologias, em que os astrócitos
exibem hiperplasia e hipertrofia.
1.6.2 CNPase
A 2’,3’-nucleotídeo cíclico 3’ fosfodiesterase é uma proteína citoplasmática,
localizada na interface entre a bainha de mielina e o axônio e/ ou nas alças mielínicas para-
nodais que contém citoplasma (Braun e cols., 1988) e que não está presente na mielina
compacta. Esta proteína é capaz de hidrolizar, in vitro, nucleotídeos cíclicos 2’,3’
exclusivamente (Whitfeld e cols., 1955). Entretanto, esta atividade enzimática foi considerada
21
irrelevante pela aparente ausência de nucleotídeos 2’,3’ em tecidos animais (Braun e cols.,
1990).
Foi em 1962, que Drumond e colaboradores demonstraram a presença da CNPase, em
níveis maiores aos já conhecidos em outros tecidos, em material proveniente do sistema
nervoso, porém a relação com a mielina só foi demonstrada mais tarde (Drummond e cols.,
1962).
A CNPase possui duas isoformas, uma com 46 KDa, a CNPase I e uma outra com 48
KDa, a CNPase II. Essa isoformas, resultantes do processamento alternativo do ARNm,
parecem ser reguladas de maneira distinta com a CNPase II sendo expressa antes da CNPase I
(Scherer e cols., 1994).
A análise da distribuição celular e ontogênica da CNPase pelo SNC revelou que seu
ARNm aparece no período pré-natal, com a expressão da proteína nos oligodendrócitos,
precedendo o processo de mielinização (Tsukada e Kurihara, 1992). Vários outros trabalhos
realizados durante o desenvolvimento tanto in vitro quanto in vivo indicam que a CNPase é
um marcador precoce de oligodendrócitos (Scherer e cols., 1995; Barradas e cols., 1998).
Como citado anteriormente, a CNPase apresenta uma distribuição assimétrica. Este
tipo de distribuição não é exclusivo da CNPase. Outras proteínas da mielina também
apresentam distribuição assimétrica, com por exemplo MBP (proteína básica de mielina), PLP
(proteína proteolipídica), e MOBP (proteínas básicas associadas à mielina) na mielina
compacta e MAG (glicoproteína associada à mielina), MOG (glicoproteína de
mielina/oligodendrócitos) e Cx32 (conexina 32) na mielina não compacta. É possível que este
tipo de distribuição tenha algum significado funcional. Estudos mostraram a associação da
CNPase e da MOG com microdomínios de oligodendrócitos enriquecidos em
glicoesfingolipídeos e colesterol. Esses microdomínios parecem estar envolvidos no controle
do transporte de proteínas pela célula e na modulação de cascatas de sinalização celular.
22
Desse modo, esses resultados sugerem que a CNPase e também MOG estejam envolvidas em
vias de sinalização celular (Kim e Pfeiffer, 1999).
1.6.3 Lectina de Griffonia simplicifolia
Há uma variedade de marcadores microgliais que permitem estudar tanto sua
localização como migração e morfogênese. Dentre os marcadores mais utilizados podemos
destacar o receptor ao complemento tipo 3 (CR3) e o antígeno F4/80, uma glicoproteína de
membrana, expressa em macrófagos e microglia de camundongo (Perry e cols., 1993). Além
destes, encontramos as lectinas, que são uma classe de proteínas que se ligam especificamente
a resíduos de carboidratos, com configurações e sequências específicas, dos glicolipídeos e
glicoproteínas (Spicer e Schulte, 1992). Estas proteínas podem ser de origem animal ou
vegetal (Spicer e Schulte, 1992).
A isolectina B4, derivada de Grinffonia simplicifolia, que é um ligante da D-
galactose, reconhece uma glicoproteína da membrana de células da microglia de mamíferos
tanto placentários quanto marsupiais (Streit e cols., 1988; Cavalcante e cols., 1995).
Microglia com diferentes morfologias, amebóide, ramificada, perivascular, podem ser
identificadas através de reação histoquímica com a isolectina B4.
A função da ligação de lectinas com glicoproteínas nas células microgliais não está
completamente esclarecida. Estudos mostraram que moléculas da matriz extracelular ou
moléculas de adesão podem direcionar a migração neuronal, crescimento de axônios e
estabilizar a estrutura do cérebro adulto através de suas interações. Além disso, lectinas
endógenas, secretadas pela própria célula, durante a embriogênese podem também estar
envolvidas em interações célula-célula. Foi sugerido que essas lectinas possam funcionar
como pontes entre glicoconjugados de superfície das células nervosas e gliais, sustentando
23
dessa maneira a adesão para as células gliais guiarem a migração neuronal (Koval e cols.,
1994).
1.6.4 Tubulina -III
Os microtúbulos, heterodímeros de - e -tubulina, são componentes ubíquos das
células eucariotas e participam de inúmeros processos. A versatilidade funcional dos
microtúbulos parece ser aumentada pela existência de várias isoformas das subunidades e ,
codificadas por diferentes genes. Após a tradução, essas isoformas sofrem modificações e
exibem distribuição ontogênica, tecidual, e até mesmo, celular distintas (Ludueña, 1998).
Vários trabalhos mostram que a complexidade das tubulinas parece ser máxima no
SNC. Durante o desenvolvimento, várias isoformas são expressas (Denoulet e cols., 1982;
Gozes e Littaer, 1978). Entre essas, a tubulina -III é encontrada quase que exclusivamente
em neurônios (Burgoyne e cols., 1988; Caccamo e cols., 1989).
A isorfoma -III desta proteína parece desempenhar um papel especial no
desenvolvimento neuronal. Ela não é incorporada nos microtúbulos de neurônios em cultura
antes da diferenciação e essa incorporação acompanha a expressão das proteínas associadas à
microtúbulos 2 (MAP2). A fosforilação de um resíduo serina na tubulina -III parece estar
relacionada com a organização e desorganização dos microtúbulos durante o crescimento de
neuritos (Diaz-Nido et al., 1990; Gard e Kirschner, 1985).
A expressão da tubulina -III também é alterada em condições patológicas.
Moskowitz e Oblinger (1995) sugeriram que o aumento nos níveis desta proteína, observado
em neurônios sensoriais axotomizados, facilitem o crescimento axonal no processo de
regeneração.
24
1.6.5 Calbindina
A manutenção da concentração intracelular dos íons Ca++ é crítica para inúmeras
funções celulares. A homeostase do cálcio intracelular é garantida por uma grande família de
proteínas conhecidas como proteínas ligantes de cálcio.
No sistema nervoso central várias destas proteínas já estão bem descritas e incluem
parvalbumina, calretinina, calmodulina, calcineurina, a família S100 e calbindina (Baimbridge
e cols., 1992).
A calbindina (CB) é expressa em muitos neurônios. Vários trabalhos têm mostrado
que a presença da CB parece oferecer vantagem aos neurônios em vários aspectos. Neurônios
do hipocampo, em cultura, que apresentam CB são mais efetivos na redução da concentração
do cálcio intracelular quando comparados com neurônios que não apresentam esta proteína
(Mattson e cols., 1991). Neurônios motores e do hipocampo, transfectados com cADN para
CB, apresentaram aumento na capacidade de tamponamento do cálcio e houve aumento na
sobrevivência após lesão esclerótica e excitotoxicidade (Ho e cols., 1996).
A expressão da CB parece seguir a maturação dos neurônios e por isso tem sido
utilizada como um marcador de neurônios maduros (McDonald e Wojtowicz, 2005).
1.7 MINOCICLINA E SUA AÇÃO NEUROPROTETORA
As tetraciclinas e seus análogos apresentam uma estrutura química conservada que
consiste em um sistema de anéis carboxiamida naftaceno tetracíclico (figura 2). A atividade
antibiótica destas substâncias é conferida pela presença de um grupamento dimetilamino, no
último anel, em sua estrutura. A remoção de tal grupamento reduz as propriedades
antibióticas, mas aumenta as ações não antibióticas. A utilização desta estratégia permitiu o
25
desenvolvimento de várias tetraciclinas quimicamente modificadas e os compostos semi-
sintéticos da tetraciclina, onde estão incluídas a doxiciclina e a minociclina (MINO) (Nelson,
1998).
Diferentes trabalhos mostraram que a MINO além da ação antibiótica é capaz de
exercer ações não antibióticas que resultam em neuroproteção. Essas ações incluem
modulação da microglia e indiretamente de células imune e subseqüente liberação de
citocinas, quimiocinas, mediadores lipídicos da inflamação entre outras.
As citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1β e IL-6 são produzidas por células
microgliais, astrócitos, neutrófilos e macrófagos e aumentam a inflamação e a resposta imune.
Chen e colaboradores, em 2000, demonstraram que a MINO é capaz de reduzir a liberação de
IL-1β. Além disso, demonstrou-se que os níveis de ARN mensageiro para TNF-α
diminuíram, bem como foi possível prevenir a produção de TNF-α induzida por LPS, em
Figura 2: Estrutura das tetraciclinas. Os derivados semisintéticos, incluídos na tabela, resultam de modificações em um ou mais dos sítios identificados como R1, R2, R3 e R4 na estrutura conservada.
26
culturas primárias de células gliais, em resposta ao tratamento com a MINO (Lee e cols.,
2003; Lee e cols., 2004). Adicionalmente mostrou-se que esta substância é capaz de aumentar
a citocina IL-10, que possui ação anti-inflamatória (Lee e cols., 2003).
Outro efeito que poderia contribuir para explicar a ação neuroprotetora, relacionada à
menor ativação microglial, é a modificação nos níveis de quimiocinas. Estas substâncias
atuam como quimioatrativos que guiam a microglia, os astrócitos e as células infiltrantes do
sistema imune para sítios de lesão no sistema nervoso. Em relação a esta questão,
demonstrou-se que a MINO suprimiu a produção de quimiocinas, induzidas por LPS, em
células BV2 semelhantes a microglia, e diminuiu a expressão do receptor CXCR3 (Kremlev e
cols., 2004). A diminuição da expressão deste receptor pode contribuir para diminuir o dano
causado pela ativação e recrutamento de células envolvidas na progressão da lesão.
A MINO também modifica a produção de mediadores lipídicos da inflamação. O
tratamento com MINO inibe a atividade da fosfolipase A2, nas formas secretada e não
secretada desta enzima, in vitro (Pruzanski e cols., 1992), podendo desta maneira inibir a
formação do ácido araquidônico e a conseqüente formação de prostaglandinas e leucotrienos.
A síntese destas substâncias envolve a ativação de duas vias específicas, uma dependente das
ciclooxigenases (COXs) e a outra dependente de lipooxigenases. O pré-tratamento com
minociclina, em modelo de isquemia focal, reduziu quase completamente os níveis de COX 2
e em 55% os níveis de prostaglandinas 2 (Yrjanheikki e cols., 1999). Em 2004, Song e
colaboradores demonstraram que o tratamento com a MINO teve ação protetora para células
PC12 em condições de isquemia e inibiu a ativação da lipoxigenase-5.
Outro aspecto importante envolvido em situações de dano neuronal, observado em
muitas doenças neurodegenerativas, é o da liberação de óxido nítrico pela microglia (Dawson
e Dawson, 1998) e a MINO, segundos vários trabalhos, parece interferir neste mecanismo. A
produção de óxido nítrico induzido por hipóxia, em culturas de microglia, diminuiu após o
27
tratamento com a MINO (Suk, 2004). A expressão da sintase induzida do óxido nítrico foi
reduzida em 30% pelo tratamento com a MINO em modelo de isquemia global (Yrjanheikki e
cols., 1998). Em modelo de Huntington, injeções diárias de MINO inibiu a atividade desta
mesma enzima em 72% (Chen e cols., 2000).
As reações celulares ao dano no sistema nervoso não se reduzem às descritas para a
microglia. Os astrócitos também tornam-se reativos e podem contribuir para a piora da lesão.
Embora em alguns modelos a MINO pareça não afetar a resposta dos astrócitos (Yrjanheikki
e cols., 1999; Du e cols., 2001), há trabalhos que demonstram que a mesma é capaz de
diminuir a resposta astrocitária em condições de agressão ao sistema nervoso (McPhail e
cols., 2004; Ryu e cols., 2004). Nestas condições, a redução da resposta astrocitária pode
diminuir a liberação de mediadores inflamatórios pelos astrócitos e assim diminuir a formação
da cicatriz glial.
Os efeitos descritos acima para a MINO permitem que seja atribuída a ela, além da
ação classicamente conhecida, uma outra, a anti-inflamatória. Esta última poderia explicar a
ação neuroprotetora da MINO que vem sendo descrita há alguns anos em diferentes modelos
de lesão no sistema nervoso. Alguns exemplos desta outra ação são descritos a seguir.
Os primeiros estudos realizados em modelo de isquemia global, em gerbils, mostraram
que a MINO aumenta a sobrevivência dos neurônios piramidais da área CA1 hipocampal em
71% e 77% quando administrada 30 minutos e 12h após o início da lesão, respectivamente
(Yrjanheikki e cols., 1998). Estes mesmos pesquisadores, em 1999, mostraram que o
tratamento com MINO diminuiu o volume do infarto em 63% quando utilizada 4h após
experimentos de isquemia focal (Yrjanheikki e cols., 1999). Tal efeito neuroprotetor da
MINO foi relacionado à redução da ativação da microglia, sugerindo indiretamente uma ação
danosa dessas células em condição de lesão do sistema nervoso central. Além disso, foi
28
demonstrado que a minociclina é capaz de reduzir os níveis de ARN mensageiro para
caspase-1, uma enzima envolvida na inflamação e morte celular (Yrjanheikki e cols., 1998).
Estudos com a MINO em outros modelos de lesão no sistema nervoso também
mostraram seus efeitos benéficos. O tratamento de camundongos R6/2, modelo de doença de
Huntington com este fármaco aumentou a sobrevivência dos animais em 14% e resultou em
melhor resposta motora (Chen e cols., 2000). A MINO foi capaz de inibir a ativação da
microglia e proteger neurônios da substância nigra após a injeção de 6-hidroxidopamina no
núcleo estriado de camundongos (He e cols., 2001). Em modelo de doença de Parkinson,
usando 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina, a MINO diminuiu a neurodegeneração
nigroestriatal (Du e cols., 2001; Wu e cols., 2002). Brundulla e colaboradores, em 2002,
sugeriam o uso da MINO como possibilidade terapêutica para esclerose múltipla.
O efeito da MINO na sobrevivência e função de precursores de oligodendrócitos
transplantados, em ratos mutantes com defeitos na formação de mielina, também foi
observado. Zhang e colaboradores, demonstraram que o pré-tratamento com a MINO resultou
em sobrevivência e mielinização pelas células transplantadas (Zhang e cols., 2003).
Vários outros artigos, publicados por diferentes grupos, mostraram que a MINO tem
ação neuroprotetora também em modelo de lesão da medula espinal. Administrada 1h após a
lesão medular reduziu o extensão do dano e facilitou significativamente a recuperação de
camundongos (Wells e cols., 2003). Adicionalmente, o mesmo grupo observou que a
recuperação funcional, após o tratamento com a MINO, foi mais efetiva do que a obtida com
metilprednisolona, atualmente a única opção de tratamento farmacológico para pacientes com
lesão de medula espinal. O tratamento de ratos com a MINO após a lesão medular reduziu a
expressão de citocinas pró-inflamatórias e aumentou a expressão das citocinas anti-
inflamatórias (Lee e cols., 2003). Por outro lado, o pré-tratamento de ratos, 30 minutos antes
29
da indução da lesão, diminuiu a inflamação, a morte de neurônios, a retração axonal com
consequente aumento da recuperação funcional (Stirling e cols., 2004).
Recentemente demonstrou-se que a MINO foi capar de prevenir a cavitação e impediu
o aparecimento da glia limitante em ratos com lesão cortical induzida por rompimento de
vasos sanguíneos pias (Hua e cols., 2006). Em outro trabalho o uso da MINO reduziu a
ativação da microglia, melhorando o deficit no comportamento motor em modelo transgênico
de amilóide microvascular cerebral (Fan e cols., 2007).
Todos os efeitos da MINO descritos anteriormente e sua ação neuroprotetora têm sido
atribuídos à redução da ativação microglial, normalmente observada em resposta à situações
de agressão ao SNC.
30
OBJETIVOS
GERAIS:
Analisar a plasticidade do sistema olivo-cerebelar em resposta ao dano neuronal
induzido pela neurotoxina 3AP.
Investigar a ação neuroprotetora da minociclina no modelo de ataxia cerebelar
induzido por 3AP.
ESPECÍFICOS:
Analisar as alterações motoras decorrentes do dano no NOI induzido por 3AP e
correlacionar a progressão do dano, bem como a recuperação espontânea da atividade
motora, observada neste modelo, com as alterações teciduais observadas durante o
período experimental.
Analisar, através do método de Nissl, modificações na densidade neuronal no NOI e
na camada de células de Purkinje do cerebelo.
Analisar, através de imuno-histoquímica para calbindina, GFAP, CNPase ou NG2 e
de histoquímica para lectina de G. simplicifolia, as alterações citológicas e /ou
histológicas que ocorrem no NOI em resposta a 3AP.
Analisar, através dos métodos mencionados as alterações que ocorrem no cerebelo em
decorrência do dano neuronal no NOI causado pela 3AP.
Verificar, através de dupla marcação para BrdU e β-III tubulina, a ocorrência de
neurogênese reativa no NOI em resposta a 3AP.
Verificar, através de imuno-histoquímica para sinaptofisina a ocorrência de
sinaptogênese reativa na camada molecular e/ ou nas células de Purkinje cerebelares.
31
Testar o efeito da minociclina na recuperação da atividade motora dos animais
atáxicos.
Analisar o efeito da minociclina na resposta microglial no NOI induzida pela ação da
3AP.
32
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas de segurança
estabelecidas pelo comitê de ética para uso de animais (CEUA) da UFRJ, licença sob o
número IBCCF 020. Neste trabalho foram utilizados ratos Wistar fêmeas e machos, com
idade de 30 a 35 dias (N = 6 em cada experimento). Os animais foram fornecidos pelo centro
de criação de animais de laboratório (CECAL) biotério Central da FIOCRUZ e pelo biotério
Instituto de Bioquímica da UFRJ.
3.2 Anticorpos e outros ligantes
Anticorpos primários - anti-BrdU (monoclonal Sigma, 1:500), anti-βIII tubulina (policlonal
Convance, 1:1000), anti-Calbindina D-28K (monoclonal Swant, 1:1000), anti-GFAP
(policlonal Sigma,1:100), anti-NG2 (policlonal Chemicon, 1:100), anti-Sinaptofisina
(policlonal Santa Cruz, 1:100), anti-CNPase (monoclonal Sigma, 1:100).
Anticorpos secundários - anti-IgG de camundongo conjugado com Cy3 (Sigma, diluição
1:200) ou com alexa 488 (Molecular probes, diluição 1:500), anti-IgG de coelho conjugado
com Cy3 (Sigma, diluição 1:300) ou alexa 488 (Molecular probes, diluição 1:200) e anti-IgG
de cabra conjugado com Cy3(Sigma, diluição1: 100).
Lectina – isolectina IB1-B4 de Griffonia simplicifolia-BS1 conjugada com biotina (Sigma,
diluição 1: 8).
33
3.3 Injeção de 3- acetil-piridina (3AP)
Os ratos foram submetidos a uma única injeção intraperitoneal de 3AP (Sigma) diluída
em solução salina (0,9% NaCl), na concentração de 70 mg/Kg de massa corporal e
eutanasiados 24h, 4, 10 e 21 dias após a referida injeção. Animais, injetados apenas com
salina 0,9%, foram eutanasiados nos mesmos tempos e utilizados como controle.
3.4 Injeção de 5-bromo 2’-deoxiuridina (BrdU)
Os ratos injetados com 3AP e apenas com salina foram submetidos a injeção
intraperitoneal de BrdU (Sigma) diluído em NaOH 0,007 N, na concentração de 50mg/ Kg de
massa corporal. As injeções de BrdU (indicadas pelas setas em preto) e as perfusões
intracardíacas (indicadas pelas setas em vermelho) foram feitas conforme a descrição abaixo:
ANIMAIS CONTROLE
Salina 0,9%
BrdU BrdU BrdU BrdU BrdU
0 dia _ 3° dia 6° dia 9° dia ________ _ 20dia_____
1° dia 4° dia 7° dia 10° dia 21°dia
Período do experimento
34
ANIMAIS TRATADOS COM 3AP
3-AP
BrdU BrdU BrdU BrdU BrdU
0 dia _3° dia 6° dia 9° dia ________ 20° dia____
1° dia 4° dia 7°dia 10° dia 21°dia
Período do experimento
3.5 Análise do comportamento motor
A análise do comportamento motor foi feita através do avaliação da caminhada. Após
o pincelamento das patas de cada animal com tinta azul (anteriores) e vermelha (posteriores),
os mesmos foram colocados para caminhar, por uma distância de 60 cm, sobre uma trilha de
papel. Este teste foi realizado 24h, 4, 10 e 21 dias após a injeção com a 3AP. A distância entre
a pegada direita e esquerda foi medida tanto para as patas anteriores quanto para as
posteriores. Para a comparação dos dados motores obtidos dos animais controle e tratados, no
teste de caminhada, foi usado o ANOVA Two-Way e o pos-test Bonferroni.
3.6 Preparação de tecido
Os animais foram fixados por perfusão intracardíaca iniciada com solução salina 0,9%
por 5 min, seguida de solução fixadora de paraformaldeído 4% em tampão fostato 0,1 M pH
7,4 por 20 min e paraformaldeído 4% com 10% de sacarose por mais 15 min. Após a fixação,
35
a cabeça do animal foi rapidamente removida e em seguida, o encéfalo dissecado e pós-
fixado em paraformaldeído 4% com 10% de sacarose por 2h, sendo a seguir transferido e
mantido em tampão fosfato 0,1M pH 7,4 com 30% de sacarose (para crioproteção), a 4º C.
Posteriormente, o material, incluído em OCT, foi seccionado, em plano coronal, em criostato
a – 20 C, em cortes de 14m. Os cortes obtidos foram recolhidos em lâminas cobertas
com poli-L-lisina na concentração de 400µg/ml e organizadas de forma seriada. O mesmo
procedimento descrito acima, com paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M pH 6,8, foi
feito para obtenção das condições necessárias à imunomarcação com anticorpo anti- NG2.
3.7 Coloração pelo Método de Nissl (Cresil violeta)
Cortes adjacentes aos imunorreagidos eram submetidos à deslipidação com soluções
de etanol em concentrações crescentes (70% a 100%), reidratados e corados em solução
aquosa de violeta de cresila a 0,25%. Após lavagem com água destilada, fazia-se a
diferenciação da coloração e desidratação com soluçoes crescentes de etanol, seguidas de
clarificação em xilol e montagem em Entellan.
3.8 Procedimentos de imuno-histoquímica
3.8.1 Imuno-histoquímica (dupla marcação)
Os cortes obtidos contendo o núcleo olivar inferior e o cerebelo foram submetidos a
reações imuno-histoquímicas de dupla marcação com anticorpos primários anti-βIII tubulina,
contra um marcador neuronal precoce e anti-BrdU, contra marcador de proliferação celular
(5-bromo 2’ deoxiuridina), com anti-NG2 (marcador de precursores de oligodendrócitos) e
36
anti-CNPase e com anti-calbindina D-28K, marcador neuronal e anti-sinaptofisina, marcador
de terminal pré-sináptico.
Para identificação do fenótipo neuronal das células proliferativas foram realizadas
reações de dupla marcação com os anticorpos primários anti-BrdU (1:500) e anti-βIII
tubulina (1:1000). Esta dupla marcação foi feita seguindo as etapas descritas abaixo:
Os cortes foram lavados com PBS 10mM pH 7,4 (5x 5 min). A seguir foi feito feito
bloqueio das reações inespecíficas com 10% de soro normal de cabra (NGS) em PBS por uma
hora, à temperatura ambiente. Após esse período, o material foi novamente lavado e incubado
com o primeiro anticorpo primário anti-βIII tubulina diluído em PBS-triton 0,3% / albumina
de soro bovino (BSA) 1%, por um período de 18h, à 4º C.
No dia seguinte o material foi lavado em PBS (3x 5 min) e fixado com solução de
paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 por 15 min. Após a fixação, o material
foi novamente lavado, primeiro PBS (3x 5min) e em seguida com HCl 2N, a 37º C, em
banho-maria, durante 30mim. O material lavado em PBS (8x 5 min) foi submetido ao
tratamento com tripsina 0,1% , a 37º C, em B.O.D., por 20 min. Após lavagens em PBS (3x 5
min), foi feito um segundo bloqueio com NGS 10% em PBS-triton X-100 0,3% durante 30
min, a 37º C, em B.O.D.. Terminado o tempo de bloqueio, o material foi incubado com o
segundo anticorpo primário anti-BrdU diluído em PBS- triton X-100 0,3% / BSA 1% a 37º C,
em B.O.D., por 2h. Após lavagem em PBS (1x 5 min) e lavagens em PBS triton X-100 0,3%
( 5x 5 min), foi feita a incubação com os anticorpos secundários fluorescentes: anti-IgG de
camundongo conjugado com Cy3 (Sigma, diluíção 1:200) ou com fluoresceína (Santa Cruz,
diluição 1:25), ou anti-IgG de coelho conjugado com Cy3 (Sigma, diluição 1:300) ou alexa
488 (Molecular probes, diluição 1:500) diluídos em PBS triton X-100 0,3%/ BSA 1% por 2
h, à temperatura ambiente. Após esta incubação, os cortes foram lavados em PBS e montados
em solução de p-fenilenodiamino em glicerol (5 mg de fenilenodiamino-1,4 em 500µl de PBS
37
0,15 M, 3,5 ml de glicerol e 1 ml de tampão carbonato-bicarbonato pH 9,0). O material foi
analisado e fotografado em microscópio confocal Zeiss.
Para verificar se as células NG2 positivas eram também CNPase positivas, a dupla
marcação foi feita utilizando-se os anticorpos primários anti-NG2 (1:100) e anti-CNPase
(1:100) diluídos em PBS triton X-100 0,3%/ BSA 1%, seguindo as etapas descritas abaixo:
Após lavagens dos cortes com PBS triton X-100 0,3% (5x 5 min), foi feito bloqueio com
NGS a 10% em PBS por 1h, em câmara úmida. Terminado o tempo de bloqueio, os cortes
foram incubados com os anticorpos primários por 18h, à 4° C. Após o período de incubação,
os cortes foram lavados em PBS triton X- 100 0,3% (5x 5 min) e incubados com os anticorpos
secundários fluorescentes, anti-IgG de camundongo conjugado com Cy3 (diluição 1:100) e
anti-IgG de coelho conjugado com alexa 488 (diluição 1: 200) diluídos em PBS triton 0,3% /
BSA 1%, por 2 h, à temperatura ambiente. Ao final desta incubação, foram feitas lavagens
lavados com PBS (5x 5min), os núcleos das células foram corados com DAPI, e os cortes
montados com o meio de montagem contendo de p-fenilenodiamino descrito acima.
Para identificação dos contatos sinápticos das fibras trepadeiras com as células de
Purkinje cerebelares foi feita dupla marcação com anticorpos primários anti-Calbindina D-
28K (1: 1000) e anti-Sinaptofisina (1: 100) em diluídos em PBS triton 0,3% / BSA 1%,
seguindo as etapas abaixo:
Após lavagens em PBS triton X-100 1% ( 5x 5min), foi feito bloqueio com solução de
NGS 5%, BSA 5% em PBS triton 1%, por um período de 3 h. Terminado o bloqueio, os
cortes foram incubados com os anticorpos primários por 18h, à 4° C e então lavados com
PBS (3x 5min). Após lavagens, foi feita a incubação com os anticorpos secundários
fluorescentes, anti-IgG de cabra conjugado com Cy3 (1: 100) e anti-IgG de camundongo
conjugado com alexa 488 (1: 400) diluídos em PBS triton X-100 0,3% / BSA 1%, por 2h. Os
cortes foram lavados em PBS (3x 5 min) e montados com o meio de montagem descrito
38
acima. O material obtido foi analisado e fotografado em microscópio Axioscope Zeiss.
3.8.2 Imuno-histoquímica (marcação simples)
Reações imuno-histoquímicas simples foram feitas com anticorpos primários contra
marcador neuronal (calbindina D-28K), de astrócitos (GFAP), de precursores de
oligodendócitos (NG2), seguindo o protocolo abaixo:
Os cortes foram lavados com PBS triton X-100 0,3% (5x 5 min). A seguir foi feito
bloqueio das reações inespecíficas com NGS 10% em PBS por uma hora, à temperatura
ambiente. Após esse período, o material foi novamente lavado e incubado com o anticorpo
primário anti-calbindina D-28K (1:500; policlonal, Chemicon) ou anti-GFAP (1:100;
policlonal, Sigma) ou anti-NG2 (1:100, policlonal, Chemicon) diluído em PBS-triton 0,3% /
BSA 1%, por um período de 18h, à 4º C.
No dia seguinte, após lavagens em PBS triton X-100 0,3% (5x 5 min), foi feita a
incubação, por 40 min, com anticorpo biotinilado contra imunoglobulinas de coelho (anti-
NG2, e anti-calbindina D-28K, policlonais), diluído 1:15 ou com anticorpo secundário
fluorecente anti-IgG de camundongo conjugado com alexa 488, diluído 1: 500 em PBS triton
X-100 0,3% / BSA 1% durante 2h, à temperatura ambiente. Após lavagens em PBS (6x 5
min), foi feita a incubação dos cortes com extra-avidina marcada com peroxidase (Sigma),
diluída 1:20 em PBS, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após esta incubação, os
cortes foram novamente lavados, em PBS (5x 5 min) e em tampão acetato 0,05M (pH 5,0),
durante 5 minutos. A revelação da peroxidase foi feita utilizando-se H2O2, como substrato, e o
cromógeno o 3-amino-9-etil-carbazol (AEC), como acoplador durante 5 a 10 min. Nas
reações reveladas pela peroxidase, uma etapa de inativação das peroxidases endógenas foi
realizada logo após a lavagem incial dos cortes com PBS triton X-100 0,3%. Ao final do
39
tempo de revelação, cortes foram lavados com água deionizada (5x 5 min) e as lâminas
montadas com gelatina de glicerina.
Nas reações finalizadas com o anticorpo secundário fluorescente, o procedimento de
lavagens e montagens seguiu como o descrito acima, na dupla marcação. A análise do
material e o registro das imagens foi feita em microscópio Axioscope Zeiss.
3.9 Histoquímica de lectina
Para identificação da microglia utilizamos a lectina de Griffonia simplicifolia-BS1,
isolectina IB1-B4 conjugada com biotina. Os cortes de tronco cerebral, contendo o núcleo
olivar inferior, foram lavados em PBS (1x 5 min) e em seguida, submetidos a etapa de
inativação das peroxidases endógenas com H2O2 0,5%, por 10 minutos. Após esse período, os
cortes foram lavados com PBS triton X-100 0,3% (5x 5 min) e submetidos a incubação com
a lectina diluída no mesmo tampão de lavagem, na concentração de 25µg/ml, por 18h à 4ºC.
Os cortes foram lavados em PBS triton X-100 0,3% (5x 5 min) e incubados com extra-
avidina conjugada com peroxidase em PBS triton 0,3%, diluíção1:20, por 20 min, à
temperatura ambiente. Após esta incubação, os cortes foram novamente lavados, em PBS (2x
5 min) e em tampão acetato 0,05M (pH 5,0).
A revelação foi feita utilizando-se H2O2, como substrato, e o cromógeno o 3-amino-9-
etil-carbazol (AEC), como acoplador durante 5 a 10 min. Após revelação os cortes foram
lavados com água deionizada (5x 5 min) e as lâminas montadas com gelatina de glicerina.
O material foi analisado e fotografado em microscópio Axioscope Zeiss.
3.10 Tratamento com Minociclina
40
Os animais controle e injetados com 3AP foram submetidos ao tratamento com
minociclina. A minociclina, diluída em solução salina 0,9%, foi administrada por via
intraperitoneal no início do experimento, isto é, juntamente com a injeção de salina 0,9% nos
animais controle e com a injeção de 3AP nos animais experimentais, na concentração de
50mg/Kg de massa corporal. Doze horas após o início do experimento, os animais receberam
uma segunda injeção de minocilcina e doses subsequentes foram feitas diariamente, no
mesmo horário, na concentração de 25 mg/ Kg. Animais controle, injetados apenas com
salina 0,9%, e animais injetados apenas com 3AP também foram utilizados.
3.11 Quantificação da reações imuno-histoquímica e histoquímica
Para cada experimento de marcação imuno-histoquímica e histoquímica, foram
selecionadas três seções de tecido por animal. Em cada seção, uma imagem digital incluindo a
área de interesse foi capturada e utilizada para contagem de células marcadas com apenas um
dos anticorpos ou duplamente marcadas. A área determinada (m2), onde as células foram
contadas, foi medida em cada imagem usando o programa para análise de imagens Image J
versão 1.38x. Os dados obtidos das contagens, nas áreas de interesse, foram apresentados
como média ± S.E.M. Para comparação dos resultados obtidos entre dois grupos foi feito o
test t , e para aqueles entre mais de dois grupos, o ANOVA seguido de pós-teste de múltipla
comparação. Os níveis de significância estão indicados nos gráficos apresentados nos
resultados.
41
RESULTADOS
4.1 EFEITO DA NEUROTOXINA 3AP NO COMPORTAMENTO MOTOR
Os animais submetidos à injeção intraperitoneal de 3AP foram observados a partir do
início do experimento até o momento da perfusão intracardíaca. Todos os animais injetados
apresentaram alterações motoras observadas cerca de 3h após a injeção da neurotoxina, tendo,
como características marcantes, a extensão das patas posteriores e a consequente perda da
capacidade de sustentar a parte posterior do corpo (figura 3). O teste de caminhada (figura
4A), feito para avaliar as alterações motoras, mostrou diferenças importantes em vários
aspectos. Em animais controle, a marcação observada das patas anteriores foi caracterizada
pela sobreposição das patas posteriores ipsolaterais (figura 4B). Além disso, pouca ou
nenhuma diferença foi observada em relação às distâncias entre as patas anteriores e entre as
patas posteriores, bem como entre a pata anterior e sua ipsolateral posterior. Nos animais
tratados com 3AP , a sobreposição das patas, comentada acima, foi muito menos frequente
(figura 4C). Outra observação importante foi o aumento da distância entre as patas anteriores
e entre as patas posteriores, mais marcante nas últimas (figura 4E). Esse resultado confirma
um dado já conhecido, inclusive em humanos com ataxia, onde o aumento da distância das
passadas e o alargamento do apoio consequente, contribui para a manutenção da postura
corporal afetada pela ataxia (Victor e Ropper, 2005).
As alterações motoras persistiram por vários dias e, somente após 10 a 21 dias a partir do
início do experimento, foi possível observar recuperação dos padrões normais de atividade
motora.
42
Figura 3. Efeito da 3AP no comportamento motor. A figura mostra ratos após injeção
intraperitoneal de 3AP. Em A é possível observar a modificação no posicionamento das patas
posteriores, característica observada em todos os animais tratados com a neurotoxina. Em B e
C, observar a incapacidade do animal de sustentação da parte posterior do corpo e o
alargamento do apoio característico (observar o aumento da distância entre as patas
posteriores), em repouso e durante a tentativa de locomoção, respectivamente.
43
A
C
A
B
C
44
Figura 4. Teste de caminhada. A imagem apresentada em A mostra um animal durante o
teste de caminhada, após o pincelamento das patas anteriores e posteriores, respectivamente,
com tinta azul e vermelha. Os resultados característicos deste teste, obtidos de animais
controle e de animais submetidos à ação da 3AP são mostrados, respectivamente, em B e C.
Notar a sobreposição das marcações das patas posteriores (vermelho) sobre as patas anteriores
(azul) nos animais controle (B). Notar também o acentuado aumento da distância entre as
patas posteriores (linha perpendicular verde) e o eixo central da caminhada (indicado pela
linha vertical em verde) nos animais atáxicos (C). A quantificação das alterações observadas
são apresentadas nos gráficos D (EPD – medida da distância do centro da pata anterior ao
eixo central da caminhada) e E (EPT – a mesma medida, porém obtida a partir da pata
posterior). As diferenças de EPT observadas entre os animais controle e tratados com 3AP
forma estatisticamente significativas. p< 0,01 (para os tempos de 24h e 10 dias), p< 0,001 (4
dias).
45
24h 4 dias 10 dias 21 dias0
1
2
3
4
5controle3AP
EP
T (
cm)
ED
24h 4 dias 10 dias 21 dias1.0
1.5
2.0
2.5
3.0 controle3AP
EP
D (
cm)
46
4.2 EFEITO DA 3AP NOS NEURÔNIOS DO NOI
A ação neurotóxica da 3AP, já descrita por outros autores (Torres-Aleman e cols.,
1998), produz lesão seletiva dos neurônios do NOI. A reprodução deste modelo em nosso
laboratório permitiu a confirmação deste efeito. A coloração pelo método de Nissl, que cora a
substância de Nissl (retículo endoplasmático rugoso) dos neurônios e o núcleo das células
gliais, mostrou uma redução dos neurônios da oliva inferior 24 horas após o tratamento com a
3AP quando comparado ao observado em animais controle (figuras 5B e 5D). Esse efeito foi
também observado nos animais atáxicos perfundidos aos 4 e 10 dias após o início do
experimento (figuras 5E e 6D). Aos 21 dias, já era possível observar alguns neurônios corados
(figura 6E).
47
Figura 5. Efeito da 3AP nos neurônios do NOI 24h e 4 dias. Coloração de Nissl em seções
coronais do tronco cerebral contendo o NOI. Em A, montagem mostrando a organização
característica dos neurônios no NOI. Barra de calibração: 50μm. A área delimitada pela linha
desenhada em preto, em A, indica o local de onde foram obtidas as imagens, em maior
aumento, mostradas em B, C, D e E. Imagens de animais controle e tratados com 3AP
(colunas) eutanasiados 24h (B e D) e 4 dias (C e E) pós injeção. Barra de calibração: 25μm
48
49
Figura 6. Efeito da 3AP nos neurônios do NOI 10 e 21 dias. Coloração de Nissl em seções
coronais do tronco cerebral contendo o NOI. Em A, montagem mostrando a organização
característica dos neurônios no NOI. Barra de calibração: 50μm. A área delimitada pela linha
desenhada em preto, em A, indica o local de onde foram obtidas as imagens, em maior
aumento, mostradas em B, C, D e E. Imagens obtidas de animais controle e tratados com 3AP
(colunas) eutanasiados 10 dias (B e D) e 21 dias (C e E) pós injeção. Notar que nos animais
tratados há pouquíssimos neurônios grandes aos 10 dias (D) e que estes neurônios são mais
numerosos aos 21 dias (cabeças de setas) (E). O gráfico, em F, apresenta a quantificação dos
neurônios grandes do NOI corados com cresil violeta , feita em cortes coronais de tronco
cerebral, de animais controle e tratados com a neurotoxina (p< 0,0001 para todos os tempos).
Barra de calibração: 25μm
50
24h 4 dias 10 dias 21 dias0
25
50
75
100controle3AP
F
neu
rôn
ios
51
4.3 ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE CALBINDINA D-28K NOS NEURÔNIOS
DO NOI EM RESPOSTA À 3AP
A análise dos resultados da imuno-histoquímica para calbindina D-28K não indicou
alterações na marcação para esta proteína em animais controle eutanasiados em diferentes
idades. Marcação citoplasmática e um número relativamente abundante de neurônios foram
observados no NOI dos animais controle. Em contraste, não foram observados neurônios
calbindina positivos 24h após o tratamento com 3AP (figura 7C). Por outro lado, aos 4 dias
observamos um aumento no número de células imunomarcadas com valores próximos aos de
animais controle (comparar as figuras 7D e 7B). Aos 10 e 21 dias, embora tenham sido
observadas marcação para calbindina no NOI dos animais atáxicos, a marcação foi menor do
que o observado nos animais controle nos mesmos tempos (figura 8).
52
Figura 7. Imuno-histoquímica para calbindina D-28K no NOI. As imagens mostradas em
A e C foram obtidas de cortes coronais de tronco cerebral de animais controle e tratados com
3AP após 24h, respectivamente e, em B e D, após 4 dias. Notar a ausência de
imunorreatividade após 24h (C) e o aumento após 4 dias (D). Barra de calibração: 25μm.
53
24h 4d
Controle
3AP
54
Figura 8. Imuno-histoquímica para calbindina D-28K no NOI. As imagens mostradas em
A e C foram obtidas de cortes coronais de tronco cerebral de animais controle e tratados com
3AP após 10 dias, respectivamente e, em B e D, após 21 dias. Observar a marcante redução
da imunorreatividade para calbindina nos neurônios no NOI após o tratamento com a
neurotoxina (C e D). O gráfico, em E , mostra os resultados da quantificação das células
calbindina positivas no NOI de animais controle e tratados. Diferenças estatisticamente
significativas foram observadas entre o grupos controle e tratado após 24h (p< 0,0009) , aos
10 dias (p< 0,0008) e 21 dias (p< 0,04). Barra de calibração: 25 μm.
55
10d 21d
Controle
3AP
24h 4 dias 10 dias 21 dias0
10
20
30
40 controle3AP
E
ne
urô
nio
s c
alb
ind
ina
+
56
4.4 ALTERAÇÃO NA MORFOLOGIA DOS ASTRÓCITOS NO NOI EM
RESPOSTA À 3AP
A imuno-histoquímica para GFAP revelou a presença de poucos astrócitos nos animais
controle às 24h, 4, 10 e 21 dias, os quais foram mais facilmente visualizados no NOI dos
animais perfundidos aos 21 dias após o início do experimento (aproximadamente 56 dias de
idade) (figura 10B). Deve-se notar que resultados idênticos foram obtidos pela
imunofluorescência ou pelo método da biotina-avidina-HRP (não mostrado). Nos animais
tratados com 3AP foi possível observar uma marcação mais intensa, especialmente, nos
tempos de 24h e 4dias (figuras 9C e 9D). Além disso, os astrócitos no NOI apresentaram
morfologia compatível com astrócitos protoplasmáticos. Uma menor imunoreatividade para
GFAP foi encontrada nos animais tratados com 3AP e perfundidos aos 10 e 21 dias (figuras
10C e 10D).
57
Figura 9. Imunofluorescência para GFAP no NOI. Em A e B são mostradas imagens do
NOI de animais controle e em C e D, de animais tratados com a 3AP. A imunomarcação foi
feita utilizando-se anticorpo primário anti-GFAP policlonal Sigma. Uma intensa
imunorreatividade foi observada no NOI 24h e 4 dias após o tratamento com a neurotoxina.
Pouca ou nenhuma imunorreatividade foi observada nos cortes obtidos de animais controle.
Em azul são mostrados os núcleos corados pelo DAPI. Barra de calibração: 25 μm.
58
24h
4d
controle 3AP
59
Figura 10. Imunofluorescência para GFAP no NOI. Em A e B são mostradas imagens do
NOI de animais controle e em C e D, de animais tratados com a 3AP. A imunomarcação foi
feita utilizando-se anticorpo primário anti-GFAP policlonal Sigma. Imunorreatividade para
GFAP foi observada no NOI, 10 e 21 dias após o tratamento com a neurotoxina. Astrócitos
imunomarcados no NOI foram observados em animais controle eutanasiados 21 dias após o
início do experimento. Em azul são mostrados os núcleos corados pelo DAPI. O gráfico, em
E, mostra os resultados da quantificação das células GFAP positivas no NOI dos animais
controle e tratados com 3AP. Os valores de p encontrados foram os seguintes: 24h (p= 0,003)
, 4 dias (p< 0,001), 10 dias (p= 0,0002) e 21 dias (p= 0, 02). Barra de calibração: 25μm.
60
Controle 3AP
10d
21d
24h 4 dias 10 dias 21 dias0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5controle3AP
E
cé
ls G
FA
P+
61
4.5 ALTERAÇÕES NAS CÉLULAS NG2 POSITIVAS NO NOI EM RESPOSTA À
3AP
A imuno-histoquímica para NG2 revelou um aumento no número de células NG2
positivas no NOI e uma imunomarcação virtualmente maior do que o observado nos animais
controle, aos 4 e 10 dias após o tratamento com a 3AP (figuras 12D e 13D). Aos 21 dias não
observamos diferenças entre os animais controle e tratados com 3AP. Nos animais controle,
foram encontradas células NG2 positivas apenas no tempo de 24h (figura 11A).
Como era nosso objetivo saber se essas células também expressavam CNPase foi feita
dupla marcação imuno-histoquímica. Esta reação mostrou que as células NG2 positivas
observadas no NOI aos 4 e 10 dias nos animais tratados com 3AP não apresentaram marcação
para CNPase. Entretanto, células marcadas apenas com CNPase foram identificadas nos
animais tratados com 3AP, aos 4, 10 e 21 dias (figuras 12E, 13E e 14E). As observações dos
cortes duplamente imunorreagidos na região do NOI, nos períodos supracitados, revelaram
uma diminuição gradual de células CNPase positivas.
62
Figura 11. Alterações nas células NG2 positivas no NOI em resposta a 3AP. Imuno-
histoquímica de dupla marcação para NG2 e CNPase no NOI 24 horas após o tratamento com
a 3AP. As imagens mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e as mostradas
em D, E e F, de animais tratados com a 3AP. Foram utilizados anticorpos primários anti-
CNPase monoclonal e anti-NG2 policlonal. Anticorpos secundários marcado com Cy3 e
Alexa 488 foram utilizados. Observar a ausência de marcação para NG2 (verde) ou CNPase
(vermelho) no NOI 24h após o tratamento. Os núcleo corados pelo DAPI são mostrados em
C e F. Barra de calibração: 25μm.
63
NG2
CNPase
DAPI
24h
64
Figura 12. Alterações nas células NG2 positivas no NOI em resposta a 3AP. Imuno-
histoquímica de dupla marcação para NG2 e CNPase no NOI 4 dias após o tratamento com a
3AP. As imagens mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e as mostradas
em D, E e F, de animais tratados com a 3AP. Foram utilizados anticorpos primários anti-
CNPase monoclonal e anti-NG2 policlonal. Anticorpos secundários marcados com Cy3 e
Alexa 488 foram utilizados. Neste tempo foi possível observar imunoreatividade para NG2
(verde) e CNPase (vermelho) após o tratamento. Os núcleos corados pelo DAPI são
mostrados em C e F. Barra de calibração: 25 μm.
65
NG2
CNPase
DAPI
4 d
66
Figura 13. Alterações nas células NG2 positivas no NOI em resposta a 3AP. Imuno-
histoquímica de dupla marcação para NG2 e CNPase no NOI 10 dias após o tratamento com
a 3AP. As imagens mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e as mostradas
em D, E e F, de animais tratados com a 3AP. Foram utilizados anticorpos primários anti-
CNPase monoclonal e anti-NG2 policlonal. Anticorpos secundários marcados com Cy3 e
Alexa 488 foram utilizados. Imunorreatividade para NG2 (verde) e CNPase (vermelho)
continuam a ser observadas após o tratamento com a neurotoxina. Os núcleo corados pelo
DAPI são mostrados em C e F. Barra de calibração: 25μm.
67
10 d
NG2
CNPase
DAPI
68
Figura 14. Alterações nas células NG2 positivas no NOI em resposta a 3AP. Imuno-
histoquímica de dupla marcação para NG2 e CNPase no NOI 21 dias após o tratamento com
a 3AP. As imagens mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e as mostradas
em D, E e F, de animais tratados com a 3AP. Foram utilizados anticorpos primários anti-
CNPase monoclonal e anti-NG2 policlonal. Anticorpos secundários marcado com Cy3 e
Alexa 488 foram utilizados. Notar a redução da imunorreatividade para NG2 (verde) e
CNPase (vermelho). Os núcleo corados pelo DAPI são mostrados em C e F. O gráfico, em G,
mostra os resultados da quantificação das células NG2 positivas no NOI. Diferença
estatisticamente significativa só foi observada aos 10 dias (p< 0,0001). Barra de calibração:
25 μm.
69
21 d
NG2
CNPase
DAPI
24h 4 dias 10 dias 21 dias0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
controle
3AP
G
cé
ls N
G2
+
70
4.6 RESPOSTA DA MICROGLIA DO NOI EM RATOS SUBMETIDOS À AÇÃO DA
3AP E CONTROLE
Além das alterações motoras e do dano neuronal, era do nosso interesse avaliar que
outras alterações teciduais ocorreriam em consequência do tratamento com a 3AP. Desde que
existem controvérsias a respeito de alterações na microglia em resposta à 3AP (Ogawa e cols.,
1992) iniciamos a investigação deste tópico.
Os animais que receberam a injeção intraperitoneal de 3AP foram sacrificados 5h, 1,
4, 10 e 21 dias após o início do experimento. Com exceção de um aumento pronunciado de
um glicoconjugado (IB4+) na parede dos vasos, não detectamos diferenças entre os animais
tratados e controle, após 5h da injeção da 3AP (figura 15), indicando que a reação microglial,
neste modelo, não parece manifestar-se de forma aguda. Nenhuma marcação foi encontrada
no NOI dos animais controle o que esta de acordo com a rara marcação para lectina em
microglia, já foi descrita, em regiões do tronco cerebral de ratos (Lawson e cols., 1990).
Entretanto, a partir do 1º dia foi possível observar microglia com morfologia mais
arredondada no NOI, e com uma intensa resposta nos animais eutanasiados 4 dias após o
início do experimento (figura 16). Nestes animais, a microglia apresentou um aspecto
amebóide, com corpo celular aparentemente maior que a microglia controle. Além disso, os
prolongamentos são grosseiros e a marcação aparentemente mais intensa para a lectina,
típicos de microglia reativa. Uma marcação de menor intensidade e células com
prolongamentos mais delgados que os normalmente visualizadas aos 4 dias, foram observadas
nos animais eutanasiados aos 10 e 21 dias após a injeção da 3AP (figura 17). Nossos
resultados também permitiram observar a presença de microglia reativa em regiões próximas
a zona subventricular do quarto ventrículo, mais numerosa aos 4 dias pós injeção, mas
71
também presente aos 10 e 21 dias (figura 18), diferente do que foi observado no NOI, que
apresentou marcação já no 1º dia pós injeção.
72
Figura 15. Resposta da microglia em ratos submetidos à ação da 3AP após 5h.
Histoquímica de lectina para identificação de microglia em região próxima ao 4º ventrículo
(*) e no NOI 5h após a injeção com a 3AP. As imagens obtidas dos animais controle são
mostradas em A (região próxima ao 4º ventrículo) e B (NOI). As imagens obtidas de animais
submetidos ao tratamento com a neurotoxina são mostradas em C (4º ventrículo) e em D
(NOI). Neste curto período de tempo, apenas vasos sanguíneos foram visualizados. Barra de
calibração: 25 μm.
73
Controle 3AP
74
Figura 16. Resposta da microglia no NOI em ratos submetidos à ação da 3AP.
Histoquímica de lectina para identificação de microglia no NOI. Em A e B são mostradas
imagens de animais controle e em C e D de animais tratatados com a 3AP. Em A e C, após
24h e em B e D, após 4 dias, a partir do início do experimento. Microglia intensamente
marcada pela lectina e morfologia compatível com microglia reativa (cabeças de seta) foi
observada aos 4 dias. Barra de calibração: 25 μm.
75
24h
4 d
76
Figura 17. Resposta da microglia no NOI em ratos submetidos à ação da 3AP.
Histoquímica de lectina para identificação de microglia no NOI. Em A e B são mostradas
imagens obtidas de animais controle e em C e D, de animais tratatados com a 3AP. Em A e
C, após 10 dias e em B e D, após 21 dias a partir do início do experimento. Aos 10 e 21 dias,
pós injeção, microglia marcada pela lectina ainda estava presente (cabeças de seta), porém
com morfologia aparentemente menos reativa. Em E são mostrados os resultados da
quantificação das células marcadas pela lectina no NOI, em cortes coronais, de animais
controle e tratados com a 3AP. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas
entre os animais controle e tratados, eutanasiados 24h pós injeção (p< 0,0015), 4 dias (p<
0,0001) 10 dias (p< 0,05).Barra de calibração: 25 μm.
77
24h 4 dias 10 dias 21 dias0
5
10
15
20
25controle3AP
E
cé
ls le
cti
na
+
10 d
21 d
78
Figura 18. Resposta da microglia em regiões próximas ao 4º ventrículo de ratos
submetidos à ação da 3AP. Histoquímica de lectina para identificação de microglia em
regiões próximas ao 4º ventrículo (*). As imagens mostradas em A, B, C e D foram obtidas a
partir de cortes coronais de tronco cerebral de animais controle e as imagens E, F, G e H, de
animais tratados com 3AP. A e E resultados 24h após a injeção, B e F aos 4 dias, C e G aos
10 dias e D e H aos 21 dias. Notar a presença de microglia reativa principalmente aos 4 dias
(cabeças de seta) após o tratamento com a 3AP. Barra de calibração: 25μm.
79
24h
4d
10d
21d
80
4.7 EFEITO DA MINOCICLINA NA RECUPERAÇÃO MOTORA DE ANIMAIS
SUBMETIDOS À AÇÃO DA 3AP
A ação neuroprotetora da minociclina já foi descrita em outros modelos de lesão no
sistema nervoso (Stirling e cols., 2005). Assim sendo, decidimos analisar se a minociclina
seria capaz de produzir algum efeito sobre a recuperação motora, já observada naturalmente,
neste modelo induzido pela 3AP. A injeção simultânea de minociclina e 3AP e as doses de
minociclina diárias subsequentes provocaram redução acentuada das alterações motoras
comumente observadas após a injeção de 3AP. Os resultados do teste de caminhada
mostraram que o tratamento com a minociclina foi capaz de minimizar as alterações motoras
observadas nos animais atáxicos, especialmente aquela descrita anteriormente como
alargamento do apoio (figura 19 E). A análise quantitativa do teste de caminhada confirmou
estas observações (figura 19F).
4.8 EFEITO DA MINOCICLINA NA MORFOLOGIA DA MICROGLIA DO NOI
Um dos efeitos descritos e que pode explicar a ação neuroprotetora da minociclina é a
redução a ativação da microglia em resposta ao dano neuronal. Considerando esta evidência,
a etapa seguinte foi analisar se a minociclina seria capaz de provocar alguma alteração
microglial. A histoquímica de lectina para identificação de microglia mostrou que a
minociclina afeta a microglia no NOI neste modelo de ataxia induzida pela 3AP. O
tratamento com a minociclina levou ao aparecimento de uma microglia com corpo celular
intensamente marcado pela lectina IB4, com raros e espessos prolongamentos, 24h após a
injeção simultânea com 3AP (Figura 20D). Além disso, foi capaz de induzir o
desaparecimento da microglia reativa que aparece aos 4 dias em resposta a injeção da 3AP
(Figura 21D). A microglia que também é observada 21 dias após a injeção com a 3AP
81
apenas, desaparece após o tratamento com a minociclina (Figura 23D). Nenhuma diferença,
em relação aos animais controle, foi observada após o tratamento apenas com minociclina.
82
Figura 19. Efeito da minociclina na recuperação motora de animais submetidos à ação
da 3AP. A imagem apresentada em A mostra um animal durante o teste de caminhada, após
o pincelamento das patas anteriores e posteriores, respectivamente, com tinta azul e
vermelha. Os resultados mostrados foram obtidos de animais controle (B), controle tratados
apenas com minociclina (MINO) (C), de animais submetidos à ação da 3AP somente (D) e
tratados com 3AP + MINO. Notar, em E, que o tratamento dos animais simultaneamente
com 3AP + MINO reduz a alteração motora observada no teste de caminhada dos animais
após o tratamento com a neurotoxina apenas (D). Em F, é mostrada a quantificação desses
resultados obtidos após 24h (p< 0,01).
83
24h
Controle 3AP 3AP+Mino0
1
2
3
4
**
EP
T (
cm
)
F
84
Figura 20. Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI de animais
submetidos à ação da 3AP e controle. As imagens mostradas em A, B, C e D foram
obtidas de animais eutanasiados 24h após o início do experimento nas seguintes condições:
A – controle, B - controle + MINO, C – 3AP e D - 3AP + MINO. O histograma, em E,
mostra o resultado da quantificação das células marcadas pela lectina no NOI, feita em cortes
coronais (valores de p< 0,05). A injeção simultânea de minocilina com 3AP induz o
aparecimento de microglia intensamente marcada pela lectina no NOI (observar cabeças de
seta em C). Barra de calibração: 25 µm.
85
24h
Controle Controle + 3AP 3AP+0
3
6
9
12
15
MINO MINO
******
Nº d
e cé
ls
E
86
Figura 21. Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI de animais
submetidos à ação da 3AP e controle. As imagens mostradas em A, B, C e D foram
obtidas de animais eutanasiados 4 dias após o início do experimento nas seguintes condições:
A – controle, B - controle + minociclina (MINO), C – 3AP e D - 3AP + MINO. O
histograma, em E, mostra o resultado da quantificação das células marcadas pela lectina no
NOI, feita em cortes coronais (p< 0,05). Microglia marcada pela lectina foi observada no
NOI após o tratamento com a 3AP (cabeças de seta). Notar a ausência de microglia reativa
no NOI de animais submetidos à ação da 3AP e tratados com minociclina (D). Barra de
calibração: 25 µm.
87
4 dias
Controle Controle + 3AP 3AP+0
5
10
15
20
25
MINO MINO
***
Nº d
e cé
ls
E
88
Figura 22. Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI de animais
submetidos à ação da 3AP e controle. As imagens mostradas em A, B, C e D foram
obtidas de animais eutanasiados 10 dias após o início do experimento nas seguintes
condições: A – controle, B - controle + minociclina (MINO), C – 3AP e D - 3AP + MINO.
O histograma, em E, mostra o resultado da quantificação das células marcadas pela lectina
no NOI, feita em cortes coronais. Nenhum efeito foi evidenciado nos animais injetados com
3AP + MINO. Barra de calibração: 25 µm.
89
E
10 dias
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
CONT CONT+mino
3AP 3AP+ mino
**
n° c
éls
90
Figura 23. Efeito da minociclina na morfologia da microglia no NOI de animais
submetidos à ação da 3AP e controle. As imagens mostradas em A, B, C e D foram
obtidas de animais eutanasiados 21 dias após o início do experimento nas seguintes
condições: A – controle, B - controle + minociclina (MINO), C – 3AP e D - 3AP + MINO.
A microglia marcada pela lectina e evidenciada no NOI, em resposta à 3-AP, desapareceu
nos animais injetados com 3AP + MINO. O histograma, em E, mostra o resultado da
quantificação das células marcadas pela lectina no NOI, feita em cortes coronais. Não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas. Barra de calibração: 25 µm.
91
21 dias
Controle Controle + 3AP 3AP+0
5
10
15
20
MINO MINO
Nº d
e cé
ls
E
92
4.9 EFEITO DA 3AP NOS NEURÔNIOS DE PURKINJE DO CEREBELO
Os neurônios olivares inferiores projetam seus axônios para o cerebelo e constituem
uma das principais aferências que fazem sinapse com os neurônios de Purkinje. Em virtude
disto, decidimos acompanhar as alterações cerebelares em decorrência do dano no NOI
causado pela 3AP.
A coloração, pelo método de Nissl, de cortes coronais do cerebelo mostrou uma
aparente redução no número de neurônios de Purkinje no córtex cerebelar. Essa diminuição
já foi observada 24 horas após o tratamento com a 3AP e também aos 4 dias (figura 24). Aos
10 e 21 dias (figura 25), uma redução, menos evidente, foi também observada.
93
Figura 24. Efeito da 3AP nos neurônios de Purkinje do cerebelo 24h e 4 dias. Coloração
de Nissl em seções coronais do cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. Imagens de
animais controle (A e B) e tratados com 3AP (C e D), eutanasiados 24h (A e C) e 4 dias (B e
D) pós injeção. Notar regiões da monocamada de neurônios de Purkinje mostrando a
ausência destas células (cabeças de seta). CM - camada molecular e CG – camada granular.
Barra de calibração: 25 µm.
94
95
Figura 25. Efeito da 3AP nps neurônios de Purkinje do cerebelo 10 e 21 dias. Coloração
de Nissl em seções coronais do cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. Imagens de
animais controle (A e B) e tratados com 3-AP (C e D) eutanasiados 10 (A e C) e 21 dias (B e
D) pós injeção. Notar regiões da monocamada de neurônios de Purkinje mostrando ainda a
ausência destas células (cabeças de seta). O gráfico, em E, mostram a quantificação dos
neurônios de Purkinje em cortes coronais de cerebelo de animais controle e tratados com
3AP. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas nos animais eutanasiados,
24h, 4 e 10 dias (p< 0,0001). Aos 21 dias não foi observada diferença estatisticamente
significativa. CM – camada molecular e CG – camada granular. Barra de calibração: 25 µm.
96
24h 4 dias 10 dias 21 dias0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5controle3AP
E
ne
urô
nio
s d
e P
urk
inje
97
4.10 ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE CALBINDINA D-28K E NA
MORFOLOGIA DOS NEURÔNIOS DE PURKINJE.
A imuno-histoquímica para calbindina revelou desorganização na monocamada formada
pelos neurônios de Purkinje, caracterizada pela presença de grandes lacunas sem células
imunomarcadas, além de células com morfologia irregular, em algumas células observamos
dendritos enquanto em outras estes parecem ausentes, bastante diferente do que foi
observado no cerebelo dos animais controle perfundidos nos mesmos tempos, 24h, 4, 10 e 21
dias (figuras 26 e 27). Além das mudanças evidentes na morfologia desses neurônios, foi
observada, à inspeção visual, uma redução na expressão de calbindina no cerebelo dos
animais tratados com 3AP. Tal redução foi observada nos referidos neurônios e também nos
seus prolongamentos dendríticos na camada molecular do córtex cerebelar. Deve-se notar
que entre os animais controle pode haver variações na intensidade de marcação, mas
intensidades aparentemente maiores são sempre encontradas nos controles tanto aos 10 e 21
dias como também nos animais perfundidos 24h e 4 dias após o início do experimento.
98
Figura 26. Alterações na expressão de calbindina D-28K e na morfologia dos neurônios
de Purkinje 24h e 4 dias. Imuno-histoquímica para calbindina D-28K em cortes coronais de
cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. As imagens mostradas em A e C foram
obtidas de animais controle e C e D, de animais tratados com a neurotoxina. Os resultados
desta imunomarcação, 24h após o início do experimento, são mostradas em A e B e em C e
D, após 4 dias. Notar a redução da imunorreatividade nos neurônios de Purkinje após o
tratamento com a 3AP e a irregularidade na monocamada bem como na morfologia destes
neurônios. Barra de calibração: 25µm.
99
24 h
4 d
100
Figura 27. Alterações na expressão de calbindina D-28K e na morfologia dos neurônios
de Purkinje 10 e 21 dias. Imuno-histoquímica para calbindina D-28K em cortes coronais de
cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. As imagens mostradas em A e C foram
obtidas de animais controle e C e D, de animais tratados com a neurotoxina. Os resultados
desta imunomarcação, 10 após o início do experimento, são mostradas em A e B e em C e D,
após 21 dias. Aos 21 dias após o tratamento com 3AP o resultado foi semelhante ao
observado nos animais controle em termos de intensidade de marcação, permanecendo,
entretanto a diferença em termos de densidade numérica de células de Purkinje entre
controles e tratados. O gráfico, em E, mostra a quantificação dos neurônios de Purkinje em
cortes coronais de cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. Diferenças
estatisticamente significativas foram observadas em todos os tempos. Valores de p foram os
seguintes: 24h e 4 dias (p< 0,0001), 10 dias (p< 0,0006) e 21 dias (p< 0,003). Barra de
calibração: 25 µm.
101
10 d
21 d
24h 4 dias 10 dias 21 dias0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0controle3AP
E
ne
urô
nio
s c
alb
ind
ina
+
102
4.11 EFEITO DA 3AP NAS CÉLULAS NG2 POSITIVAS DO CEREBELO
Células NG2 positivas cerebelares também são alvos das fibras trepadeiras. Assim sendo,
decidimos investigar as possíveis modificações, nestas células, decorrentes do dano
provocado no NOI pela 3AP. Células NG2 positivas estão presentes no córtex cerebelar dos
animais controle e são mais numerosas na superfície. Nos animais atáxicos observamos um
aumento no número de células NG2 positivas após o tratamento com 3AP. Este aumento foi
maior 24h e 4 dias após o tratamento (figuras 28 e 29). Um aumento menos pronunciado foi
observado após 10 dias de tratamento (figura 30). Nos animais eutanasiados 21 dias após o
início do experimento não foi encontrada diferença estatisticamente significativa no número
de células NG2 positivas (figura 31).
103
Figura 28. Efeito da 3AP nas células NG2 positivas do cerebelo 24h. Imuno-
histoquímica para NG2 em cortes coronais de cerebelo de animais controle e tratados com
3AP. As imagens apresentadas em A e B mostram, respectivamente, córtex cerebelar de
animais controle e tratado com 3AP eutanasiados 24h pós injeção. Notar a intensa marcação
(verde) e o aumento na densidade numérica de células NG2 positivas após o tratamento. As
imagens em C e D motram os núcleos corados pelo DAPI, respectivamente, nos mesmos
campos de onde foram obtidas as imagens mostradas em A e B. Barra de calibração: 25 µm.
104
NG2
DAPI
24 h
105
Figura 29. Efeito da 3AP nas células NG2 positivas do cerebelo 4 dias. Imuno-
histoquímica para NG2 em cortes coronais de cerebelo de animais controle e tratados com
3AP. As imagens mostradas em A e B mostram, respectivamente, córtex cerebelar de
animais controle e tratado com 3AP eutanasiados 4 dias pós injeção. Notar a intensa
marcação (verde) e o aumento na densidade numérica de células NG2 positivas após o
tratamento. As imagens em C e D motram os núcleos corados pelo DAPI, respectivamente,
nos mesmos campos de onde foram obtidas as imagens mostradas em A e B. Barra de
calibração:25µm.
106
4 d
NG2
DAPI
107
Figura 30. Efeito da 3AP nas células NG2 positivas do cerebelo 10 dias. Imuno-
histoquímica para NG2 em cortes coronais de cerebelo de animais controle e tratados com
3AP. As imagens mostradas em A e B mostram, respectivamente, córtex cerebelar de
animais controle e tratado com 3AP eutanasiados 10 dias pós injeção. Notar a marcação
(verde) e ainda densidade numérica de células NG2 positivas maior após o tratamento. As
imagens em C e D motram os núcleos corados pelo DAPI, respectivamente, nos mesmos
campos de onde foram obtidas as imagens mostradas em A e B. Barra de calibração: 25 µm.
108
10 d
NG2
DAPI
109
Figura 31. Efeito da 3AP nas células NG2 positivas do cerebelo 21 dias. Imuno-
histoquímica para NG2 em cortes coronais de cerebelo de animais controle e tratados com
3AP. As imagens mostradas em A e B mostram, respectivamente, córtex cerebelar de
animais controle e tratado com 3AP eutanasiados 21 dias pós injeção. As imagens em C e D
motram os núcleos corados pelo DAPI, respectivamente, nos mesmos campos de onde
foram obtidas as imagens mostradas em A e B. O gráfico, em E, mostra os resultados da
quantificação destas células feita em cortes coronais de cerebelo de animais controle e
tratados com 3AP. Diferenças estatisticamente significativa foram observadas 24h
(p=0,0015), 4 dias (p< 0,0001) e 10 dias (p=0,01) pós injeção. Barra de calibração: 25 µm.
110
21 d
NG2
DAPI
24h 4 dias 10 dias 21 dias0
4
8
12
16
20controle3AP
E
céls
NG
2+
111
4. 12 RESPOSTA DE PROLIFERAÇÃO CELULAR OBSERVADA ATRAVÉS DA
DUPLA MARCAÇÃO COM BrdU E βIII-TUBULINA NO NOI DE RATOS
SUBMETIDOS À AÇÃO DA 3AP
Os experimentos para identificação de proliferaçao celular, a partir da incorporação de
BrdU, e identificação do perfil fenotípico das células proliferativas do NOI, foram feitos
utilizando-se técnica imuno-histoquímica de dupla marcação com anticorpos anti-BrdU e
anti-III-tubulina (marcador precoce de neurônios). Nossos resultados mostraram células
marcadas com anticorpo anti-BrdU no NOI dos animais eutanasiados 1, 4 e 10 dias após o
tratamento com a 3AP (figuras 32 e 33). Nestes períodos não foi evidenciada
imunoreatividade para III-tubulina. Entretanto, após os 21 dias, foi marcante a presença de
células duplamente imunomarcadas (figura 33E e 33F).
112
Figura 32 . Imuno-histoquímica de dupla marcação para BrdU e β-III tubulina no NOI
de animais controle e tratados com 3AP. Em A e B são mostradas imagens de microscopia
confocal obtidas de cortes de tronco cerebral de animais controle e em C e D, de animais
tratados com 3AP, eutanasiados 24h e 4 dias após o início do experimento. Foram
utilizados anticorpos primários anti-BrdU monoclonal e anti-β-III tubulina policlonal.
Anticorpos secundários marcado com Cy3 e Alexa 488 foram utilizados. Células marcadas
apenas com BrdU (vermelho) foram observadas no NOI dos animais tratados com a 3AP
(D). Em E, imagem de corte da mesma região onde os anticorpos primários foram omitidos.
Barra de calibração: 20μm.
113
24h
4d
114
Figura 33. Imuno-histoquímica de dupla marcação para BrdU e β-III tubulina no
NOI de animais controle e tratados com 3AP. Em A e B são mostradas imagens de
microscopia confocal obtidas de cortes de tronco cerebral de animais controle e em D e
E, de animais tratados com 3AP, eutanasiados 10 e 21 dias após o início do
experimento. Foram utilizados anticorpos primários anti-BrdU monoclonal e anti-β-III
tubulina policlonal. Anticorpos secundários marcado com Cy3 e Alexa 488 foram
utilizados. Aos 10 dias, células marcadas apenas com BrdU (vermelho) foram
observadas no NOI dos animais tratados com a 3AP (D). Células duplamente marcadas,
positivas para BrdU e para β-III tubulina (verde) foram observadas no NOI aos 21 dias
nos animais tratados (E). Em C, imagem de corte da mesma região onde os anticorpos
primários foram omitidos. Barra de calibração: 20μm. Em F é mostrada uma região, em
maior aumento, com células duplamente marcadas (barra de calibração: 8μm) e em G, o
histograma com os resultados da quantificação das células duplamente marcadas no
NOI dos animais controle e tratados com a neurotoxina aos 21 dias (p = 0,001).
115
21 dias
Controle 3AP0
20
40
60
***C
éls
Brd
U/ß
III T
ubul
ina
+
G
116
4.13 EFEITO DA 3AP NOS CONTATOS SINÁPTICOS NA CAMADA
MOLECULAR DO CÓRTEX CEREBELAR
O modelo de ataxia empregado neste trabalho é conhecido pelo dano no NOI e
também pela recuperação motora espontânea que é observada alguns dias após o início
do experimento e que se acentua no período entre o 10º e o 21º dia. Em virtude desta
observação decidimos analisar as alterações nos contatos sinápticos nos neurônios de
Purkinje e na camada molecular, onde observamos uma resposta mais intensa das
células NG2 positivas, que também são alvos das fibras trepadeiras.
A imuno-histoquímica de dupla marcação com os anticorpos anti-Calbindina
D28-K e anti-sinaptofisina revelou uma redução acentuada na densidade numérica de
contatos sinápticos formados com os neurônios de Purkinje e na camada molecular, 24
horas e 4 dias após o tratamento com a 3AP (figuras 34 e 35) Essas observações foram
confirmadas pela a quantificação dos pontos marcados pela sinaptofisina (figura 34G) .
Aos 10 dias, já foi possível observar um aumento na densidade numérica desses
contatos sinápticos (figura 36), comparado com o observado nos animais tratados com
3AP 24h e 4 dias, e aos 21 dias o resultado foi semelhante ao observado nos animais
controle (figura 37). Neste último caso a diferença observada, a partir da quantificação,
não foi estatisticamente significativa (figura 37G).
117
Figura 34. Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina D28K e
sinaptofisina em cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. As imagens
mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e em D, E e F, de animais
tratados com 3AP e eutanasiados 24h após o tratamento. Foram utilizados anticorpos
primários anti-calbindina D-28K monoclonal e anti-sinaptofisina policlonal e anticorpos
secundários marcados com Cy3 e Alexa 488. Em A e D, imunomarcação para
calbindina (verde) e em B e E, para sinaptofisina (vermelho). Notar a marcante redução
nos contados sinápticos (pontos marcados em vermelho) após tratamento com a
neurotoxina. Em C e F são mostradas as sobreposições das imagens mostradas
anteriormente. Barra de calibração: 25 µm.
118
Calbindina
Sinaptofisina
24 h
119
Figura 35. Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina D28K e
sinaptofisina em cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. As imagens
mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e em D, E e F, de animais
tratados com 3AP e eutanasiados 4 dias após o tratamento. Foram utilizados anticorpos
primários anti-calbindina D-28K monoclonal e anti-sinaptofisina policlonal e anticorpos
secundários marcados com Cy3 e Alexa 488. Em A e D, imunomarcação para
calbindina (verde) e em B e E, para sinaptofisina (vermelho). Notar a redução nos
contados sinápticos (pontos marcados em vermelho) após o tratamento com a
neurotoxina. Em C e F são mostradas as sobreposições das imagens mostradas
anteriormente. Barra de calibração: 25 µm.
120
4 d
Calbindina
Sinaptofisina
121
Figura 36. Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina D-28K e
sinaptofisina em cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. As imagens
mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e em D, E e F, de animais
tratados com 3AP e eutanasiados 10 dias após o tratamento. Foram utilizados anticorpos
primários anti-calbindina D-28K monoclonal e anti-sinaptofisina policlonal e anticorpos
secundários marcados com Cy3 e Alexa 488. Em A e D, imunomarcação para
calbindina (verde) e em B e E, para sinaptofisina (vermelho). Observar a
imunorreatividade para sinaptofisina no cerebelo após o tratamento com a neurotoxina.
Em C e F são mostradas as sobreposições das imagens mostradas anteriormente. Barra
de calibração: 25 µm.
122
10 d
Calbindina
Sinaptofisina
123
Figura 37. Imuno-histoquímica de dupla marcação para calbindina D-28K e
sinaptofisina em cerebelo de animais controle e tratados com 3AP. As imagens
mostradas em A, B e C foram obtidas de animais controle e em D, E e F, de animais
tratados com 3AP e eutanasiados 21 dias após o tratamento. Foram utilizados anticorpos
primários anti-calbindina D-28K monoclonal e anti-sinaptofisina policlonal e anticorpos
secundários marcados com Cy3 e Alexa 488. Em A e D, imunomarcação para
calbindina (verde) e em B e E, para sinaptofisina (vermelho). Observar o notável
aumento de pontos marcados com sinaptofisina nos animais tratados com a neurotoxina
e longa sobrevida. Em C e F são mostradas as sobreposições das imagens mostradas
anteriormente e em G, os resultados da quantificação dos pontos marcados pela
sinaptofisina, feita em cortes coronais de cerebelo de animais controle e tratados.
Diferenças estatisticamente significativas foram observadas 24h (p< 0,0001), 4 dias (p<
0,0009) e 10 dias (p=0,009) após o tratamento com a 3AP. Barra de calibração: 25 µm.
124
21 d
Calbindina
Sinaptofisina
24h 4 dias 10 dias 21 dias0
50
100
150
200
250controle3AP
G
po
nto
ss
ina
pto
fis
ina
s+
125
DISCUSSÃO
Neurotoxicidade da 3AP. Os contatos sinápticos das fibras trepadeiras com os
neurônios de Purkinje interferem de forma direta na atividade destes neurônios no controle
motor, de modo que a perda dessas aferências leva a alterações severas na coordenação
motora.
O uso de diferentes protocolos experimentais de intoxicação pela 3AP mostrou que
esta neurotoxina é capaz de produzir lesões seletivas no sistema nervoso central
(Balaban,1985) e com um efeito pronunciado sobre os neurônios do NOI, o que sugeriu o seu
uso para obtenção de um modelo experimental de ataxia cerebelar (Fernandez e cols., 1998).
Desta maneira, este modelo de lesão neural, que é acompanhado por uma recuperação
espontânea da atividade motora normal, constitui-se em um interessante recurso capaz de
auxiliar no estudo e na compreensão de mecanismos de plasticidade do tecido nervoso em
resposta ao dano neuronal.
Mudanças no padrão normal da caminhada de ratos e descoordenação motora foram
observadas por nós neste modelo de ataxia cerebelar induzido pela 3AP. As alterações no
comportamento motor observadas incluíram o alargamento do apoio e a dificuldade de
sustentação da parte posterior do corpo.
A investigação histológica do efeito da 3AP no sistema olivocerebelar nos permitiu
fazer uma série de observações que podem contribuir para esclarecer a progressão do dano e a
recuperação caracteristicamente observada neste modelo. A coloração de cortes coronais de
tronco cerebral pelo método de Nissl, permitiu observar o efeito neurotóxico da 3AP no NOI
24h após o tratamento, o que está de acordo com o descrito por Ogawa (Ogawa e cols., 1992).
Aos 4 dias, a ausência de neurônios corados é evidente e coincide com o período de maior
severidade das alterações motoras observadas nos ratos tratados com a 3AP. A recuperação
126
motora espontânea observada nos períodos subsequentes foi acompanhada pelo
reaparecimento de neurônios corados no NOI, especialmente aos 21 dias, onde foi possível
observar um número maior destes.
A calbindina e a atividade de neurônios do NOI e do cerebelo. As alterações
observadas em relação aos neurônios no NOI não se restringem a redução numérica dos
mesmos. A expressão de calbindina D-28K (CB), uma proteína ligadora de cálcio, presente
nos neurônios olivares inferiores e de Purkinje e essencial para a atividade destes no controle
motor cerebelar (Barski e cols., 2003), é muito afetada nos animais tratados com a 3AP. Vinte
e quatro horas pós injeção não observamos células marcadas positivamente para CB no NOI.
Em contraste, aos 4 dias pós injeção, observamos um aumento acentuado desta marcação.
Este aumento da expressão de CB pode sugerir um mecanismo compensatório com o objetivo
de manter a atividade dos neurônios remanescentes no NOI, o que permitiria, ainda que de
modo precário, a transmissão de sinais para o cerebelo. Este aumento, porém, não foi
sustentado, pois houve redução da imunomarcação para CB aos 10 e 21 dias, e nem foi
suficiente para permitir a recuperação imediata da coordenação motora.
Ao contrário do que observamos no NOI, a marcação para CB nos neurônios de
Purkinje diminuiu acentuadamente 24h e 4 dias após o tratamento com a neurotoxina. A
perda das aferências olivares pelos neurônios de Purkinje, em consequência da ação da 3AP,
sobre os neurônios do NOI, alterou não apenas a expressão de CB como também induziu
mudanças na morfologia dos neurônios de Purkinje e a perda da regularidade da
monocamada, do córtex cerebelar, constituída por estas células. Esta última alteração,
mostrando a ausência dos referidos neurônios, foi também observada e muito evidente 24h e
4 dias após o tratamento com a 3AP quando a coloração pelo método de Nissl foi realizada.
Barski e cols. (2003) mostraram que a deleção seletiva do gene relacionado a CB, nos
neurônios de Purkinje, provoca déficit severo na transmissão sináptica e no controle motor
127
cerebelar. Além disso, a presença da CB parece ter um efeito favorável aos neurônios. A
transfecção de cDNA para esta proteína, em neurônios motores e hipocampais, aumentou o
tamponamento de cálcio e também a sobrevivência dos mesmos após a lesão da esclerose
lateral amiotrófica e excitotoxicidade (Ho e cols., 1996). Estas observações corroboram a
idéia de que as alterações motoras observadas nos animais após o tratamento com 3AP
podem ser resultantes, pelo menos em parte, da redução da expressão desta proteína ligadora
de cálcio nos neurônios de Purkinje.
Vários fatores como, por exemplo, a interação com neurônios e neurotransmissores,
são capazes de alterar a morfologia dos astrócitos (Hatten, 1985; Cornell-Bell e cols., 1992).
Alterações na morfologia astrocitária e também na expressão de GFAP são observadas em
diferentes condições de lesão no SN. Em nossos resultados também observamos alterações
nos astrócitos. Um aumento evidente da imunomarcação para GFAP no NOI foi observado
24h e 4 dias após o tratamento com a 3AP. Aos 10 e 21 dias após o tratamento esta marcação
foi menos evidente. Como a expressão de GFAP é regulada positivamente no processo de
gliose (Eddleston e Mucke, 1993), já era esperado que o dano induzido pela 3AP nos
neurônios do NOI provocasse reatividade astrocitária. O processo de gliose e todas as
alterações que caracterizam o mesmo estão relacionados com a formação da cicatriz glial, o
que têm sido referido como um impedimento para a regeneração e reparo do tecido nervoso
lesado (revisto em Fitch e Silver, 2008). Entretanto, trabalhos mais recentes têm sugerido um
papel destas células no reparo de áreas lesadas no SN. Populações de astrócitos de nichos
neurogênicos proliferam após lesão perinatal e, no caso de camundongos jovens, podem se
diferenciar em neurônios e oligodendrócitos que migram para o córtex cerebral, substituindo
células que foram perdidas (revisto em Vaccarino e cols., 2007). É importante destacar que
em nossos resultados, as alterações mais marcantes observadas em relação aos astrócitos
128
ocorreram 24h e 4 dias após o tratamento com a 3AP, o que coincide com o período em que
observamos também alterações motoras mais severas nos animais atáxicos.
Diferentes trabalhos reportaram as células NG2 positivas como capazes de responder
rapidamente a condições de lesão do cérebro e da medula espinhal, com mudanças evidentes
24h após a indução da lesão (Levine, 1994; Nishiyama e cols., 1999; Jones e Tuszynski,
2003). Estas células estão presentes no SN adulto normal porém são menos numerosas do
que o observado durante o desenvolvimento e proliferam lentamente (Levine e cols., 1993).
Por outro lado, já foi demonstrado que a proliferação das células NG2 positivas aumenta nos
tratos do encéfalo de camundongos com defeitos na mielinização (Wu e cols., 2000) e
também em resposta a lesões desmielinizantes induzidas química ou imunologicamente
(Mason e cols., 2000). Em nossos ensaios, numerosas células NG2 positivas foram
observadas no NOI dos ratos tratados com a 3AP 4 e 10 dias após o início do experimento.
Nos animais controle, foram raras as células NG2 positivas encontradas no NOI.
Sinapses estabelecidas entre polidendrócitos e neurônios já foram descritas no
hipocampo (Bergles e cols., 2000; Jabs e cols., 2005), mas também em outras regiões
anatômicas do SN como o cerebelo. Na camada molecular do córtex cerebelar, os dendritos
dos neurônios de Purkinje e os polidendrócitos são inervados pelas fibras trepadeiras (Lin e
cols., 2005). Em virtude destas observações, decidimos investigar se alguma alteração nas
células NG2 positivas poderia ser observada no cerebelo após o tratamento com a 3AP. A
densidade numérica das células NG2 positivas no cerebelo foi maior do que observado no
NOI, o que está de acordo com o mostrado por Dawson e cols. (2003) e revisto em Nishiyama
(2007). Além da densidade numérica de células NG2 positivas aumentada na camada
molecular do córtex cerebelar, um aparente aumento na expressão do NG2 foi observado
especialmente nos animais atáxicos eutanasiados 24h e 4 dias após o início do experimento.
129
O papel dos polidendrócitos no sistema nervoso adulto e do próprio NG2 são ainda
alvos de discussão. Estudos in vitro mostraram considerável potencial inibitório do
proteoglicano NG2 sobre o crescimento axonal (Dou e Levine, 1994; Ughrin e cols., 2003).
Por outro lado, Yang e cols. (2006) mostraram que estas células fornecem um substrato
adesivo para o cone de crescimento axonal e promove o seu crescimento, mesmo em presença
de altos níveis do proteoglicano NG2.
Além das observações relativas a este tipo glial no NOI e no cerebelo em resposta a
3AP, nós visualizamos, em cortes coronais do tronco cerebral, no mesmo nível ântero-
posterior da marcação de NG2 no NOI, células NG2 positivas ao longo da linha média,
formando um rastro, desde a zona próxima a ZSV do quarto ventrículo até a região do NOI
(dados não mostrados). Este rastro de células NG2 positivas só foi observado 10 dias após o
início do experimento, tempo este intermediário entre o período de maior severidade da
alteração motora observada e a recuperação espontânea já comentada anteriormente. Embora
o significado deste resultado não esteja claro, pode sugerir que as células NG2 positivas
observadas no NOI sejam provenientes de outra região do tronco cerebral que não
propriamente o NOI. Além disso, já foi demonstrado que as células NG2 positivas podem
contribuir para gênese de neurônios (Belachew et cols., 2003; Aguirre e Gallo, 2004) e
funcionar como células tronco neural multipotentes (Belachew e cols., 2003).
A reação microglial à lesão e condições patológicas no cérebro e na medula espinhal é
conhecida há vários anos, no entanto, ainda não está claro o limite entre ativação microglial
capaz de contribuir para piorar ou melhorar o dano neuronal produzido em condições de lesão
do SNC. A reatividade da microglia já foi demonstrada por Ogawa e cols. (1992) no mesmo
modelo de lesão neural utilizado em nossos experimentos. Nestes observamos microglia no
NOI dos animais 24h após o tratamento com 3AP. Porém, foi 4 dias após o tratamento que
observamos microglia intensamente marcada pela lectina IB4 e com morfologia
130
marcadamente reativa. Deve-se destacar que foi também neste período que observamos as
alterações motoras mais severas nos animais tratados com a 3AP.
A microglia ativada em reposta à lesão do SNC participa da patogênese de desordens
neurológicas através da secreção de várias moléculas inflamatórias como citocinas e óxido
nítrico (Hanish, 2002). Essas moléculas servem de sinais para outras células, por exemplo,
astrócitos que amplificam sua resposta inflamatória resultando em acúmulo de agentes
neurotóxicos. Além disso, a microglia ativada libera mediadores inflamatórios que recrutam
mais microglia para o sítio de lesão, uma vez que, além de produzir, é também alvo de muitos
destes mediadores (revisto em Garden e Möller, 2006). Estas observações corroboram a idéia
de que a microglia intensamente reativa observada aos 4 dias pós-injeção, em nossos ensaios,
pode contribuir para acentuar o dano induzido pela 3AP.
Um outro aspecto importante que deve ser considerado é o fato de que aos vinte e um
dias, quando não observamos mais alterações na caminhada, a presença de microglia reativa
nos animais tratados com 3AP foi eventual, e em comparação com os animais controle, a
diferença observada não foi estatisticamente significativa.
A ação neuroprotetora da minociclina (MINO) já foi descrita em vários modelos de
lesão no sistema nervoso e a principal evidência que justifica esta ação parece ser a redução
da ativação da microglia em resposta ao dano neuronal (revisto em Stirling e cols., 2005).
Como observamos em nossos resultados, microglia marcadamente reativa no NOI em um
período que é coincidente com aquele em que observamos maior severidade das alterações
motoras nos animais tratados com 3AP, decidimos verificar se a MINO seria capaz de
proteger os neurônios do NOI da ação neurotóxica da 3AP. Em nossos ensaios a MINO foi
capaz de induzir o aparecimento de microglia intensamente marcada pela lectina IB4 e com
morfologia amebóide no NOI 24h após o início do experimento. A observação dos animais no
teste de caminhada feito após a injeção simultânea de 3AP e MINO, seguida de doses diárias
131
subsequentes desta última, mostrou um padrão de caminhada muito semelhante ao observado
nos animais controle. A quantificação destes dados confirmou as observações do
comportamento motor feitas por nós durante o período experimental. A administração da
MINO juntamente com a 3AP parece exercer uma ação protetora sobre os neurônios do NOI,
o principal alvo da 3AP (Fernandez e cols., 1998), prevenindo assim a ocorrência das
alterações motoras, especialmente aquela descrita como alargamento do apoio, por nós
observadas quando os animais eram submetidos à ação apenas da 3AP.
Além do descrito acima, a MINO foi também capaz de provocar desaparecimento da
microglia reativa que observamos no NOI 4 dias após o tratamento com a 3AP. Como
comentado anteriormente, os efeitos neuroprotetores da MINO têm sido atribuídos à redução
da ativação microglial. Ryu e cols (2004) demonstraram que a MINO inibiu a morte neuronal
e a ativação microglial induzidas por peptídeo β-amiloide em hipocampo de rato. Em modelo
de lesão neural induzida por hipóxia isquêmica, a MINO foi capaz de atenuar a lesão, reduzir
a ativação microglial e melhorar o comportamento motor (Fan e cols., 2006). A MINO
também preveniu a cavitação em ratos após lesão induzida por desvascularização cortical
(Hua e Wals, 2006). Em outro trabalho, demonstrou-se que a MINO reduziu ativação
microglial e melhorou o déficit motor observado em modelo transgênico de amilóide
microvascular cerebral (Fan e cols., 2007).
As alterações motoras mais severas foram observadas no mesmo período em que a
microglia reativa aparece no NOI após o tratamento com a 3AP, o que sugere que a atenuação
das alterações motoras nos animais tratados com 3AP e MINO decorra realmente da redução
da ativação microglial, assim como o que foi mostrado em outros modelos de lesão neural já
referidos acima.
Por outro lado, o fato de a MINO induzir o aparecimento de microglia com aspecto
amebóide 24h após o início do experimento somado ao fato de o comportamento motor não
132
ser significativamente alterado pode sugerir que esta microglia reativa, que aparece 24h após
o tratamento com 3AP e MINO, possa de alguma maneira contribuir para proteção dos
neurônios do NOI. O mecanismo que explica esta proteção é desconhecido por nós neste
modelo mas poderia estar relacionada, por exemplo, à síntese de substâncias ou fatores
neuroprotetores liberados pela microglia em resposta à ação da MINO. A microglia é
conhecida como fonte e alvo de diferentes citocinas, tanto pró-inflamatórias quanto anti-
inflamatórias (Hanisch, 2002.). A produção destas últimas pela microglia ativada em resposta
ao tratamento com a MINO poderia explicar o efeito neuroprotetor e a atenuação do dano
motor induzido em resposta a neurotoxicidade da 3AP no NOI. Já foi demonstrado em
diferentes modelos animais, que a MINO diminui a ativação da enzima caspase 3, envolvida
no mecanismo de apoptose (Stirling e cols. 2004). A atividade desta enzima também foi
diminuida pela MINO após lesão da medula espinhal, lesão traumática do cérebro e doença
de Huntington (revisto em Stirling e cols. 2005).
Este resultado é até certo ponto contraditório. Lopez-Garcia e cols. (2002), em um
estudo sobre neurogênese no córtex medial de lagartos, mostrou que durante o período de
neurogênese a microglia desaparece, sugerindo a presença da microglia como um
impedimento ao processo de regeneração. Nos nossos experimentos com a MINO, os
resultados sugerem que a microglia pode, dependendo do estado ou grau de ativação, ter
efeito benéfico aos neurônios, pelo menos no NOI. Nós acreditamos que outros experimentos
serão necessários para que possamos explicar de que maneira a microglia ativada, que aparece
24h, após a injeção da 3AP nos ensaios com a MINO, promove neuroproteção.
Um outro tópico importante entre todos já discutidos até aqui é a questão da
recuperação motora espontânea observada nos animais atáxicos. A observação dos animais
após o tratamento com a 3AP, e a análise do comportamento motor realizada através do teste
de caminhada, confirmaram um dado que já era conhecido. Do 10º ao 21º dia após o início do
133
experimento, observamos nos animais tratados com a 3AP uma redução progressiva dos
sinais de ataxia e recuperação do padrão normal da atividade motora.
Embora a recuperação motora espontânea observada neste modelo não seja inédita, a
descrição dos mecanismos que a justificam não são muito claros. Bergman e cols. (1997)
correlacionaram o recrescimento de axônios, após lesão no córtex entorrinal de ratos, com a
expressão de sinaptofisina, uma proteína característica de vesículas sinápticas. Isso nos levou
a investigar como estariam os contatos sinápticos na camada molecular, onde é observada a
arborização dendrítica dos neurônios de Purkinje e sobre a qual são estabelecidos os contatos
sinápticos das fibras trepadeiras. As reações de dupla marcação para calbindina D28K,
marcador dos neurônios de Purkinje, e anti-sinaptofisina, um marcador pré-sináptico,
mostraram que na fase inicial, entre 24h e 4 dias após o tratamento com a 3AP, período em
que foram observadas também as alterações motoras mais severas, houve redução dos pontos
imunomarcados pelo anticorpo anti-sinaptofisina. Entretanto, a observação desta mesma
dupla marcação nos cortes de cerebelo obtidos dos animais tratados com a 3AP e
eutanasiados 10 e 21 dias após o início do experimento, mostrou aumento dos pontos de
imunorreatividade tipo sinaptofisina em relação aos animais controle, indicando que, pelo
menos em parte, a recuperação motora espontânea observada ocorre em decorrência da
reinervação dos neurônios de Purkinje pelas fibras trepadeiras derivadas de neurônios
sobreviventes do NOI. O mecanismo referido acima é conhecido como sinaptogênese reativa
e já foi demonstrado em diferentes regiões do cérebro (revisto em Hamori, 1990 e Nadler,
2003).
Durante o desenvolvimento, na primeira semana pós-natal, como parte dos eventos da
sinaptogênese, ocorre eliminação de sinapses e há também um refinamento a nível sub-
celular, com a translocação dos terminais das fibras trepadeiras do corpo celular dos
neurônios de Purkinje para sua localização nos dendritos proximais (Mason e cols., 1990).
134
Nos nossos resultados observamos sinais de novos contatos sinápticos no corpo celular dos
neurônios de Purkinje, o que parece recapitular o padrão normal observado durante o
desenvolvimento. Letellier e cols. (2007) observaram que parte dos eventos iniciais da
sinaptogênese podem ser reproduzidos quando ocorre reinervação em sistemas relativamente
maduros em resposta a lesão.
Além da reinervação dos neurônios de Purkinje pelas fibras trepadeiras derivadas dos
neurônios do NOI, a reorganização estrutural deste núcleo, com a formação de novos
neurônios, podería contribuir para justificar a recuperação da atividade motora já comentada.
Em virtude disto, realizamos reações imuno-histoquímicas de dupla marcação com
anticorpos anti-BrdU, um marcador de proliferação celular, e anti-βIII-tubulina, marcador
precoce de neurônios, para analisar a resposta proliferativa no NOI. Os resultados mostraram
resposta proliferativa apenas, sem marcação concomitante com anti-βIII- tubulina, no NOI
24h, 4 e 10 dias após o tratamento com a 3AP, marcação esta que não foi observada no NOI
dos animais controle. Diferente disto, muitas células duplamente marcadas foram observadas
no NOI dos animais submetidos à ação da 3AP e eutanasiados aos 21 dias. Este resultado
sugere a ocorrência de um mecanismo de repovoamento do NOI com novos neurônios
também como justificativa para a recuperação espontânea do padrão normal da atividade
motora observada. Deve-se notar também que aos 21 dias pós injeção não observamos mais
diferenças na caminhada dos animais atáxicos em relação aos controle. A origem destes
novos neurônios, porém, não é conhecida.
Estudos in vitro demostraram a presença de células com características de células
tronco neurais, nas regiões ao redor do terceiro e quarto ventrículos e no canal central da
medula espinhal (Weiss e cols., 1996). Além disso, Martens e colaboradores (2002)
demonstraram que as mesmas células tronco endógenas, referidas anteriormente, e
progenitores da região ao redor do quarto ventrículo e do canal central da medula espinhal
135
proliferam in vivo em resposta a infusão de fatores de crescimento exógenos, como FGF2 e
EGF. Itokazu e cols. (2006) demonstraram que entre as células epiteliais do plexo coroide
existem progenitores neurais que proliferam em resposta a infusão de EGF e FGF2 no interior
do quarto ventrículo. Estas células, em resposta ao dano produzido pela 3AP, poderiam
migrar em direção ao NOI possibilitando assim o repovoamento com novos neurônios e a
reorganização estrutural deste núcleo.
Outra possível fonte de células tronco que explicaria os novos neurônios no NOI, em
nossos experimentos, seria o próprio cerebelo. Lee e cols. (2005) isolaram células tronco do
cerebelo no período pós-natal e demonstraram que estas foram capazes formar neuroesferas e
originar astrócitos, oligodendrócitos e neurônios in vitro e também após transplante no
cerebelo. Estas células poderiam migrar a partir do cerebelo, ao longo dos axônios dos
neurônios olivares inferiores remanescentes, em direção ao NOI e lá originar novos
neurônios.
136
CONCLUSÕES
1. A 3AP provocou morte de neurônios no NOI, acarretando alterações na coordenação
motora. Este efeito foi observado 24h, 4 e 10 dias após o tratamento com a
neurotoxina. Aos 21 dias, embora raros, observamos neurônios corados no NOI dos
animais tratados.
2. Houve diminuição do número de neurônios calbindina positivos no NOI dos animais
submetidos a ação da 3AP 24h, 10 e 21 dias. Por outro lado, aos 4 dias foi significativo
o aumento dos mesmos, bem como o aparente aumento da expressão de calbindina.
3. Aumento no número de astrócitos e na imunomarcação para GFAP nos animais
tratados com 3AP foram observados em todos os tempos experimentais. Poucos
astrócitos foram vizualizados no NOI dos animais controle.
4. Células NG2 positivas aumentou no NOI dos animais tratados com 3AP. Este aumento,
porém, foi estatisticamente significativo naqueles animais eutanasiados 10 dias após o
início do experimento.
5. Não observamos microglia reativa 5 h após o tratamento com a 3AP, indicando que
pelo menos no NOI, não houve uma resposta aguda da microglia nesta condição. Ao
contrário disto, microglia reativa foi observada no NOI em resposta à 3AP,
especialmente aos 4 dias. Estes últimos resultados foram evidenciados no mesmo
período em que observamos as alterações motoras mais severas nos animais atáxicos.
137
6. A minociclina (MINO) protegeu o NOI contra o dano gerado pela 3AP e diminuiu as
alterações motoras observadas nos animais atáxicos. A MINO inibiu a reatividade da
microglia e induziu o aparecimento de microglia amebóide 24h após o início do
experimento, sugerindo a participação destas em mecanismos de neuroproteção.
7. A 3AP induziu redução no número de neurônios de Purkinje no córtex cerebelar e
também a expressão de calbindina por estes e provocou uma desorganização na camada
de células de Purkinje no córtex cerebelar, com marcantes alterações na morfologia
destes neurônios.
8. A 3AP induziu aumento no número de células NG2 positivas na camada molecular do
córtex cerebelar.
9. A 3AP induziu resposta proliferativa no NOI. Células marcadas apenas com anticorpo
anti-BrdU foram observadas no NOI, 24h, 4 e 10 dias após o tratamento com a 3AP.
Células duplamente marcadas (BrdU e beta III tubulina positivas) no NOI 21 dias após
o tratamento, indicando a neurogênese reativa no NOI com uma provável justificativa
para a recuperação motora espontânea observada no modelo estudado.
10. Redução, estatisticamente significativa, no número de pontos sinaptofisina positivos foi
observada na camada molecular do córtex cerebelar 24h, 4 e 10 dias após o tratamento
com a 3AP. Aos 21 dias, os resultados mostraram o aumento dos pontos sinaptofisina
positivos, sugerindo a sinaptogênese reativa como um mecanismo envolvido na
recuperação motora.
138
PERSPECTIVAS
Pretendemos estender estes estudos com a 3AP com o objetivo de investigar o plexo
coroide como uma possível fonte de precursores neurais que contribua para o esclarecimento
sobre a origem dos neurônios responsáveis pelo repovoamento do NOI, observado aos 21 dias
após o tratamento com a neurotoxina. Como já foi demonstrado, há progenitores neurais entre
as células epiteliais do plexo coroide (Itokazu e cols., 2006). Assim sendo, o estudo terá o
objetivo de analisar a resposta proliferativa e migração dessas células, de seu local de origem
em direção ao NOI.
Pretendemos também estender os estudos com a minociclina com o objetivo de
esclarecer a participação da microglia reativa (com morfologia amebóide), identificada 24h
no NOI após o tratamento com a minociclina, no mecanismo neuroprotetor sugerido pelos
nossos resultados.
As células NG2 positivas podem contribuir para gênese de neurônios (Belachew et
cols., 2003; Aguirre e Gallo, 2004) e funcionar como células tronco neural multipotentes
(Belachew e cols., 2003). Em virtude desses achados, pretendemos verificar se a minocilcina
seria capaz de modificar a resposta das células NG2 positivas no cerebelo e no NOI, bem
como a expressão do proteoglicano NG2 induzida pela 3AP, de modo que seja possível
relacionar as alterações observadas nestas células com o processo de recuperação e/ou
neuroproteção observada em nossos experimentos.
139
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