UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS

DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Ludmilla Soares Sena sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia

Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

http://www.elisa-development.com/

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

http://www.elisa-development.com/

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou

anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes

de cultura.

• Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de

uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de

quantidades mínimas de uma substância em particular e com

grande confiabilidade.

• Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um

substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno

incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da

concentração de Ag/Ac pesquisados.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços

dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual

Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.

• É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.

CARACTERÍSTICAS BÁSICASo Elementos necessários para a realização:

• Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)

• Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)

• Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos

• Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios

quantitativos

• Amostras a serem testadas

• Placa de poliestireno

• Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac

ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes

• Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima

• Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor

• Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor

resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO)

CARACTERÍSTICAS BÁSICASo Elementos necessários para a realização:

Placas de ELISA

Leitoras de ELISAhttp://www.laborlifescience.com.br/equipamentos_elisa.html

http://www.dellta.com.br/detalhes.php?prod_id=89

http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html

http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p4ae04e96cbc7f/placa_elisa.jpg

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o Vantagens• Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades

mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem

de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.

• Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em

questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de

falsos-positivos.

• Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.

• Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em

comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

oDesvantagens• Necessidade de mão de obra especializada.

• Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à

luz do sol ou a elevadas temperaturas.

• Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível

a erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e

alterações nos reagentes.

PRINCIPAIS TIPOS

http://www.elisa-development.com/

PRINCIPAIS TIPOS

• INDIRETO: detecta principalmente Ac

• SANDUÍCHE: detecta principalmente Ag

• COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular

(monovalentes)

• CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM,

evitando a ação do fator reumatóide)

Y

YYY

Y

Y

YY

1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços 3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs

Y

Y Y

Y Y

Y

YY

6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor

ELISA INDIRETOY

YAntígeno

Anticorpo Cromógeno

Conjugado

o Interpretação dos resultados:• A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da

amostra pesquisada.

ELISA INDIRETO

• Para determinar quais indivíduos são

positivos ou negativos para a doença

pesquisada, deve-se calcular um ponto

de corte (“cut-off”) para aquele ensaio.

Acima dos limites do cut-off, encontram-

se os indivíduos positivos e abaixo os

negativos.

• O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele

momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato

com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.

Contr. Positivo →

Contr. Negativo →Cut-off →

http://www.labimuno.org.br/ensino.cfm?load=aulas

o Aplicações na medicina humana e veterinária:• Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de Ac

IgG, IgA ou IgE seja significativa.

• Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas

e da SIDA/AIDS.

• Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite Caseosa e da

Leishmaniose.

• OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator

reumatóide. O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM,

específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações,

particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG

específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim

um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA

indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.

ELISA INDIRETO

1) O Ag específico é adicionado á placa, e em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do excesso não ligado

3) Adiciona-se o conjugado anti-IgM

Y

4) Adiciona-se o cromógeno e o substrato, desenvolvendo-se cor. Devido ao Fator Reumatóide unido à IgG específica, tem-se um resultado superestimado da quantidade de IgM pesquisada, podendo levar até a resultados falsos-positivos

AÇÃO DO FATOR REUMATÓIDE NO ELISA INDIRETO PARA IgM

Antígeno

Ac IgM especí-fico pesquisado

Cromógeno

Conjugado anti-IgM

YYY YY. Fator Reumatóide

Y

2) Adiciona-se a amostra do paciente, que contém o Ac IgM pesquisado e o Fator Reumatóide. O Fator Reumatóide pode estar ligado a Acs IgG específicos para o Ag presente na placa, formando imunocomplexos que se ligam a este Ag

YYY YY.Y Ac IgG

YYYY YY.YYY YY.

Y YYYYY.YYYYYY.

YYYY YY.

YYY YY. YYYYYY.

YY

Y

Y

ELISA SANDUÍCHE

Y

YYY

Y Y

Y YY

1) Um Ac conhecido é adicionado à placa e se liga à sua superfície

2) Lavagens são feitas para retirar os Ac livres3) Adiciona-se a solução com o Ag a ser pesquisado e este, caso presente, se liga aos Ac nos poços4) Realiza-se lavagens para retirar o Ag não capturado5) Adiciona-se conjugado específico para o Ag procurado

YY

YY

Y YY

6) Novas lavagens retiram o conjugado livre7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor

Y

YAntígeno

Anticorpo Cromógeno

Conjugado

o Interpretação dos resultados:• A intensidade da cor é diretamente

proporcional à concentração de Ag da

amostra pesquisada.

• Para este teste se tornar quantitativo, é

necessária a construção de uma curva

com os valores de densidade ótica

obtidos a partir da reação de padrões

com concentrações conhecidas do

antígeno a ser dosado. A curva serve

como padrão de comparação para

deduzir as quantidades de antígenos nas

soluções-teste.

ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE

Curva Padrão (exemplo)

Concentração de IgE

Abs

orvâ

ncia

(45

0/62

0)

http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm

o Aplicações na medicina humana e veterinária:• Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras

proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros

patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.

• Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da

gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).

• Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos

(pesquisa de patógenos e contaminantes nos alimentos).

ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE

ELISA POR COMPETIÇÃO

YYY

Y Y

Y

Y

1) Adição do Ac específico aos poços da placa2) Lavagem para retirar os Ac livres3) Adição da solução com o Ag a ser pesquisado e de uma outra solução contendo Ag marcado (conjugado) no mesmo poço. Os Ags competem entre si pelo sítio de ligação do Ac e aquele que estiver em maior concentração, se ligará a mais Ac4) Lavagem para retirar os Ag não capturados5) Adiciona-se o cromógeno e o substrato. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac da placa, ocorrerá reação enzimática e o cromógeno será oxidado, havendo desenvolvimento de cor

YAntígeno

Anticorpo Cromógeno

Conjugado

o Interpretação dos resultados:• A intensidade da cor é INVERSAMENTE proporcional à concentração de ag da

amostra pesquisada, ou seja, quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a

possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor

emitida.

ELISA POR COMPETIÇÃO

o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária:• Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas.

Diagnóstico sorológico de algumas doenças.

• Exemplo na Medicina Humana: dosagem de T3, T4, testosterona,

estradiol, progesterona.

• Exemplo na Medicina Veterinária: detecção sorológica de Herpesvírus

Bovino tipo I.

ELISA POR COMPETIÇÃO

YYY

Y Y

Y YY

1) Adição de Ac IgG monoclonal contra IgM aos poços da placa2) Lavagem para retirar os Ac livres3) Adição da solução com Ac IgM específico a ser pesquisado4) Lavagem para retirar o Ac não capturado5) Adiciona-se Ag específico marcado com uma enzima (conjugado) para o Ac pesquisado6) Lavagem7) Adição de cromógeno e de substrato. Se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor

YYY YY.YYY YY.

YYY YY.YYY YY.

YYY YY.YYY YY.YYY YY.

ELISA DE CAPTURA

YAntígeno

Anticorpo IgG CromógenoConjugado

YYY YY. Anticorpo IgM

o Interpretação dos resultados• Intensidade da cor diretamente proporcional à concentração de Acs.

• Por ser um ELISA muito utilizado para a detecção de IgM, é capaz de

identificar infecções na fase aguda.

ELISA DE CAPTURA

o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária• Principalmente usado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os

mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários) em todas as

doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento.

Apesar de ser mais utilizado para a detecção de IgM, o ELISA de Captura

também pode ser utilizado para a dosagem de outros Acs.

• Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico de rubéola, toxoplasmose,

herpesvírus e citomegalia, em suas fases agudas, da gestante (complexo

TORCH).

• Exemplo na Medicina Veterinária: diagnóstico da Diarréia Bovina Viral

(DVB).

ELISA DE CAPTURA

• http://www.msd-brazil.com/msd43/m_manual/mm_sec22_243.htm

• http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.microvet.arizona.ed

u/courses/mic419/ToolBox/elisa3.jpg&imgrefurl=http://www.microvet.arizon

a.edu/courses/mic419/ToolBox/elisa.html&usg=__S6BHPl-P0h7OPfk0xg8UxK

PQY6o=&h=686&w=682&sz=56&hl=pt-BR&start=1&um=1&tbnid=gr7dJIdxrJF1

eM:&tbnh=139&tbnw=138&prev=/images%3Fq%3DElisa%26hl%3Dpt-BR%26s

a%3DX%26um%3D1

• http://www.verus.net/index.php?option=com_content&task=view&id=79&

Itemid=1&lang=pt_br

• http://www.actavetscand.com/content/49/1/7

• http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm

REFERÊNCIAS