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EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM CANA-DE-AÇÚCAR ( Saccharum spp. L.)

Cassiana de Oliveira1, Roberson Dibax2, Aurea Ferriani Portes3, João Carlos Bespalhok Filho4. 1 Acadêmica do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2 Doutor em Agronomia pela Universidade Federal do Paraná, Pesquisador da Universidade Federal do Paraná (Curitiba, PR); 3 Doutora em Agronomia pela Universidade Federal do Paraná, Profª co-orientadora da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 4 Doutor em Agricultura pela Nagoya University, Prof. orientador da Universidade Federal do Paraná (Curitiba, PR). Endereço para correspondência: João Carlos Bespalhok Filho: bespa@ufpr.br ___________________________________________________________________________

RESUMO: A cana-de-açúcar tem grande importância econômica já que pode ser usada como

matéria prima para a fabricação de rapadura, melado, aguardente, açúcar e etanol. Devido este

fator, cada vez mais o melhoramento genético vem sendo estudado, para tanto é preciso de

protocolos eficientes para sua multiplicação in vitro. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito

da auxina 2,4-D sobre a indução de calos embriogênicos para a variedade RB855453. Além disso,

avaliar diferentes concentrações de 2,4-D na manutenção dos calos embriogênicos e verificar se

houve formação de brotações com a citocinina BAP para a variedade RB855156. As culturas

foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2 °C. Os resultados foram

satisfatórios e revelaram que todos os tratamentos com 2,4-D têm a capacidade de formar calos

embriogênicos. Observou-se que em 40 dias de cultivo estes calos embriogênicos ainda

apresentam capacidade de formar brotações e todos os tratamentos utilizados formaram brotações.

Quanto ao aumento da quantidade de massa embriogênica, percebeu-se que não há necessidade de

grande quantidade de auxina na manutenção dos calos embriogênicos, já que todos os tratamentos

tiveram, em média, o mesmo crescimento.

PALAVRAS-CHAVE: fitorreguladores, 2,4-D, BAP, embriogênese indireta.

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ABSTRACT : The sugarcane has great economic importance since it can be used as raw material

for the manufacture of brown sugar, molasses, brandy, sugar and ethanol. Because of this factor,

more breeding is being studied, for both protocols is necessary for its efficient in vitro

multiplication. The aim of this study was to evaluate the effect of 2,4-D on embryogenic callus

induction for variety RB855453. Moreover, to evaluate different concentrations of 2,4-D in the

maintenance of embryogenic callus and see if there shoot formation with BAP for variety

RB855156. Cultures were maintained in a growth chamber with a temperature of 25 ± 2 ° C. The

results were satisfactory and showed that all treatments with 2,4-D have the capacity to form

embryogenic callus. It was observed that in 40 days of these embryogenic calli still have the

ability to form shoots and all treatments formed shoots. As for the increased amount of

embryogenic mass, it was noted that there is need for large amounts of auxin in the maintenance

of embryogenic callus, since all treatments had, on average, the same growth

KEYWORDS: phytoregulators, 2,4-D, BAP, indirect embryogenesis.

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INTRODUÇÃO A cana-de-açúcar (Saccharum spp. L.) é uma gramínea perene de clima tropical que

tem um aspecto importante, tanto social quanto econômico no Brasil, já que é utilizada para a

produção de açúcar, álcool, alimentos, entre outros produtos (SILVA, et al., 2009). Em

decorrência disso, sua multiplicação deve ser rápida e livre de doenças, o que ocorre na

micropropagação.

Um dos caminhos do cultivo in vitro é a embriogênese somática indireta, que envolve

a formação de embriões a partir de tecidos somáticos (RAEMARKERS et al., 1995). As

células somáticas não são naturalmente embriogênicas, o que torna necessário uma fase de

indução para que essas células adquiram competência embriogênica (NAMASIVAYAM,

2007). Esta via, portanto, requer a desdiferenciação das células, ou seja, o desenvolvimento de

calos que vão originar células embriogênicas determinadas com a capacidade de totipotência.

Diversos fatores estão envolvidos neste processo como a utilização de reguladores de

crescimento, o efeito do genótipo, o tipo de explante, os meios de cultura e as condições de

cultivo (SILVA et al., 2009).

As auxinas são as principais reguladoras de crescimento utilizadas para a indução de

calos embriogênicos. A auxina natural ácido indolacético (AIA) é rapidamente oxidada in

vitro, por isso não é adequada para meios de cultura (REIS et al., 2007). Para substituir a AIA

é comumente utilizada a auxina sintética 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D). Depois que os

calos já adquiriram a capacidade da totipotência, é necessário a utilização de outros

reguladores no meio de cultura para que estas células se diferenciem em brotações. Para

promover essas brotações são necessárias as citocininas, que são hormônios que estimulam a

divisão celular, regulando o crescimento do vegetal. Dentre as citocininas, o 6-

bencilaminopurina (BAP) tem sido muito eficaz para promover a multiplicação em diversas

espécies (ROGALSKI et al., 2003).

No entanto, após muito tempo de subcultivos no meio de cultura com 2,4-D os calos

embriogênicos perdem a capacidade de formarem brotações. Neste sentido, este estudo

procura estabelecer o tempo em média que os calos embriogênicos continuam com essa

capacidade e a concentração adequada de 2,4-D para a formação de calos embriogênicos das

variedades RB855453 e RB855156.

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MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de Plantas do Setor de

Ciências Agrárias do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo da Universidade Federal

do Paraná, Curitiba, Brasil.

Todas as culturas in vitro respectivas a cada experimento foram mantidas em sala de

crescimento, sob luz fluorescente branca fria com densidade de fluxo fotossintético de 40

µmol.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 h e temperatura de 25 ± 2°C. As culturas foram realizadas

em placas de Petri de 10 cm de diâmetro e 2 cm de altura, contendo 30 mL de meio de cultura

e vedadas com filme PVC, ou em frascos de vidro de 6 cm de diâmetro e 9 cm de altura,

contendo 40 mL de meio de cultura cada um e vedados com tampa de polipropileno rígido.

Todos os meios de cultura tiveram o pH ajustado em 5,7 e foram autoclavados durante 20 min

a 120°C.

O meio de cultura utilizado nestes experimentos foi o MS (MURASHIGE e SKOOG,

1962) modificado para cana-de-açúcar (MSC), suplementado com arginina, cisteína, ácido

cítrico e caseína hidrolisada (anexo 01), sendo diferentes apenas as concentrações dos

fitorreguladores usados.

INDUÇÃO DA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA

Foram utilizadas folhas imaturas (cilindros de aproximadamente 2 x 10 cm) de cana-de-

açúcar da variedade RB855453. Os palmitos, contendo os meristemas apicais, foram levados

à câmara de fluxo laminar onde foi realizado a desinfecção por 1min em etanol 70% (v/v), em

seguida foram enxaguados com água estéril três vezes. Logo depois, ficaram por 20 min em

hipoclorito de sódio 2% (v/v) e lavados, novamente, em água estéril por três vezes.

Em uma placa de Petri, foram retiradas as folhas mais externas dos palmitos, com o

auxilio de um bisturi. Após este procedimento, foram feitos cortes transversais de

aproximadamente 3-5 mm nos palmitos para obtenção dos explantes. Em seguida, os

explantes foram embebidos em cisteína 50 mg.L-1 autoclavada a fim de minimizar a oxidação.

Os explantes foram colocados em meio de cultura com as seguintes concentrações de

2,4-D: 1; 3; 9 e 16 mg.L-1. Sendo, portanto, quatro tratamentos com dez repetições e com

cinco explantes por repetição. Os explantes foram incubados em sala de crescimento com

temperatura controlada descrita acima, porém, no escuro para diminuir a oxidação, durante 60

dias.

Nesta etapa, avaliou-se a formação e as características dos calos, com vista ao processo

embriogênico.

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MULTIPLICAÇÃO DOS CALOS

Para a multiplicação dos calos embriogênicos, foram comparadas as concentrações 0,

1, 2 e 3 mg.L-1 do mesmo fitorregulador (2,4-D), no entanto, a variedade usada foi a

RB855156. Foram feitas cinco repetições por tratamento, com dez explantes por placa. Os

calos utilizados nesta etapa já foram subcultivados por duas vezes em meio MSC com as

suplementações descritas e com 3 mg.L-1 de 2,4-D. Cada explante consistiu em um

aglomerado de calos de aproximadamente 4mm² e com peso aproximado de 13mg, e foram

repicados para o meio MSC já descrito com as concentrações de 2,4-D descritas.

Após vinte dias avaliou-se a expansão em milímetros, peso e aspectos morfológicos

dos calos.

INDUÇÃO DE BROTAÇÕES

Para induzir as brotações foi usado o meio MS adicionado o fitorregulador BAP na

concentração de 0,5 mg.L-1. Cada explante constituiu em um aglomerado de calos de

aproximadamente 4mm² e com peso aproximado de 13mg da variedade RB855156. As

repetições foram feitas de acordo com o tratamento usado na multiplicação dos calos, ou seja,

cada tratamento com 2,4-D teve cinco repetições com dez aglomerados de calos por repetição.

Este tratamento ficou dez dias no escuro e dez dias sob iluminação na sala de crescimento.

Após vinte dias avaliou-se a formação de brotações.

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O delineamento estatístico utilizado foi inteiramente casualizado. Para comparação de

médias, os dados foram submetidos ao Testes de Tukey a 5% de probabilidade, pelo programa

estatístico Sisvar®.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A formação de estruturas globulares semelhantes a embriões somáticos (figura 01) foi

visualizada em todos os tratamentos. Percebeu-se que todas as concentrações do 2,4-D não

obtiveram diferença significativa ao avaliar a formação de calos embriogênicos pelo teste de

Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Este resultado indica que as quantidades comparadas

deste fitorregulador para a formação de calos embriogênicos são suficientes e todas tiveram

resposta positiva na formação de calos embriogênicos da variedade RB855453.

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Figura 01. Calos embriogênicos de cana-de-açúcar. (A) A seta aponta para a parte indiferenciada da

massa. (B) A seta aponta para estruturas globulares semelhantes a embriões somáticos. Barra = 0,5

mm

Quanto à oxidação dos explantes, o tratamento contendo 9 mg.L-1 proporcionou a

maior taxa de oxidação (44%), no entanto quando aplicado o teste de Tukey percebeu-se que

os tratamentos não tiveram diferença significativa, como pode ser observado na figura 02.

Figura 02. Porcentagem da formação de calos embriogênicos e de oxidação dos explantes de cana-de-

açúcar da variedade RB855453 de acordo com a concentração da auxina 2,4-D. As médias seguidas de

letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Na primeira avaliação da multiplicação dos calos, após vinte dias, não foi observado

nenhuma regeneração e não houve aumento da massa embriogênica. Depois desta avaliação,

repicou-se de novo para novos meios de cultura com as mesmas quantidades de reguladores e

após vinte dias foi feita nova avaliação.

Já na segunda avaliação, ao pesar cada explante de todos os tratamentos, observou-se

que não houve diferença significativa entre os tratamentos 1, 2 e 3 mg.L-1 de 2,4-D, sendo as

porcentagens encontradas de, respectivamente, 99 %, 107 % e 97 %. No entanto, notou-se que

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também no tratamento com 0 mg.L-1 as massas embriogênicas tiveram um pequeno aumento

de tamanho comparado aos outros tratamentos, de 78%. Percebeu-se que todos os tratamentos

tiveram formação de embriões, até mesmo no tratamento controle. Esta formação de embriões

no tratamento controle pode ser explicado pela ação residual da auxina presente no meio de

cultura anterior. Contudo, Mesquita em 1999, também constatou que houve a formação de

calos em folhas de lechieira (Litchi chinensis) quando não houve suplementação de

reguladores de crescimento ao meio de cultura. Todos os explantes do tratamento sem o 2,4-D

apresentaram oxidação, por liberarem compostos fenólicos nas células danificadas com o

corte.

Ho e Vasil (1983), ao estudarem a formação de calos embriogênicos no clone 68-1067

de cana-de-açúcar, obtiveram resultados semelhantes aos encontrados neste estudo, onde

todos os tratamentos com a auxina tiveram formação de calos. Em 1995, Raemakers et al.

relataram que em monocotiledôneas, como a cana-de-açúcar, a embriogênese primária é

exclusivamente induzida em meio contendo auxinas, o que se comprovou neste estudo.

De acordo com Grattapaglia e Machado (1990), as auxinas como o 2,4-D são

essenciais para estimular a formação de calos, mesmo em baixas concentrações. Isto também

pode ser observado neste experimento, pois os três tratamentos com presença da auxina

tiveram formação de embriões.

Ao verificar a presença de brotações nestes tratamentos, percebeu-se que somente no

tratamento com 0 mg.L-1 de 2,4-D houve presença de pequenas brotações, o que comprova

que esta auxina não desempenha o papel de formar brotações e sim de formar calos

embriogênicos. O resultado destes tratamentos pode ser visto na figura 03, onde percebe-se

que no tratamento com 0 mg.L-1 de 2,4-D não houve formação de massa embriogênica e sim,

de pequenas brotações, enquanto que o tratamento com 3 mg.L-1 foi o que apresentou maior

formação de embriões e maior quantidade de massa.

Figura 03. Formação de calos embriogênicos e brotações da cana-de-açúcar, sob diferentes

concentrações de 2,4-D. Barra = 1 cm

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De acordo com Silveira et al., em 2004, a presença de reguladores de crescimento,

como o 2,4-D, no meio de cultura induz a multiplicação de células, o que pode ser

comprovado neste estudo já que houve aumento da massa embriogênica na presença desta

auxina.

Com a avaliação da regeneração, foi observado que todos os tratamentos apresentaram

mais de 80% de formação de brotações, enquanto que no tratamento com 0 mg.L-1 da auxina

houve apenas 4 % de brotação, como pode ser observado na figura 04.

Figura 04. Porcentagem de regeneração e de oxidação dos explantes de cana-de-açúcar de acordo com

a concentração da auxina 2,4-D. As médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de

Tukey a 5% de probabilidade.

O tratamento que veio do meio com 0 mg.L-1 de 2,4-D apresentou maior taxa de

oxidação. Watt e colabores (2009), depois de doze semanas de cultivo de calos embriogênicos

de cana-de-açúcar do genótipo 88H0019, estes apresentaram aumento do número de

embriões, provavelmente devido a exposição prolongada ao 2,4-D. Este resultado mostra que,

assim como neste experimento, após vários subcultivos os calos ainda apresentaram

capacidade embriogênica, ou seja, podem formar brotações.

Cidade et al. (2006) perceberam que após o terceiro mês de cultivo, na presença de

2,4-D, houve perda significativa da capacidade regenerativa dos calos para a variedade

RB739735. Este resultado mostra a necessidade de continuar este estudo, para verificar por

quanto tempo ainda a variedade RB855156 continua com sua capacidade regenerativa. Cidade

e colaboradores (2006) relatam ainda que estes resultados restringem a utilização de calos da

variedade RB739735 como tecidos-alvo para transformação genética aos três primeiros meses

de subcultivo, de forma que a baixa eficiência de regeneração, não comprometa a obtenção de

plantas a partir de células transformadas.

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CONCLUSÃO

A partir dos resultados de indução de embriogênese somática indireta pode-se concluir

que:

• Todos os tratamentos analisados com a auxina 2,4-D têm a capacidade de formar

calos embriogênicos para a variedade RB855453 de cana-de-açúcar.

• Após quatro subcultivos os calos embriogênicos ainda formavam brotações e todas as

quantidades comparadas tiveram a mesma taxa de formação de brotações.

• Não é necessária uma maior quantidade de auxina do que as testadas neste trabalho na

manutenção de calos embriogênicos da variedade RB855156, já que todos os tratamentos

tiveram, em média, a mesma quantidade de crescimento.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CENTELLAS, A. Q.; FORTES, G. R. L.; MULLER, N. T. G.; ZANOL, G. C.; FLORES, R.;

GOTTINARI, R. A. Efeito de auxinas sintéticas no enraizamento in vitro da macieira.

Pesquisa Agropecuária Brasileira. Brasília, v.34, n.2, p.181-186, 1999.

CIDADE, D. A. P.; GARCIA, R. O.; DUARTE, A. C.; SACHETTO-MARTINS, G.;

MANSUR, E. Morfogênese in vitro de variedades brasileiras de cana-de-açúcar. Pesquisa

Agropecuária Brasileira. Brasília, v.41, n.3, p.385-391, 2006.

GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. IN: TORRES, A.C.:

CALDAS, L.S. Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasilia.

ABCTP/EMBRAPA- CNPH, p. 99-169, 1990.

HEERDT, E. Indução da embriogênese somática em cana-de-açúcar. 2008. 40 f. Dissertação

(Mestrado em Genética e Melhoramento) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2008.

HO, W. J.; VASlL, I. K. Somatic embryogenesis in sugarcane (Saecharurn officinarum L.)

The growth of and plant regeneration from embryogenic cell suspension cultures. Annals of

Botany, v.51, p. 719 – 726, 1983.

LAMEIRA, O. A.; PINTO, J. E. B. P.; CARDOSO, M. G.; GAVILANES, M. L. Efeito de

Thidiazuron na indução e manutenção de calos de erva-baleeira (Cárdia verbenácea L.).

Ciência Rural. Santa Maria, v. 27, n. 1, p. 47-49, 1997.

9

MAGALHÃES, J. S.; SANTOS, M. D. M.; CUNHA FILHO, F. N.; BLUMER, L.;

GUERRA, M. P.; TORRES, A. C. Indução de embriogênese somática em genótipos de

batata-doce. Horticultura Brasileira . Campinas, v. 24, n. 1, p.79-83, 2006.

MESQUITA, A.C. Estabelecimento in vitro de lechieira (Litchi chinenesis Sonn.) através do

cultivo de segmentos foliares e nodais e análise bioquímica de calos. Dissertação de

Mestrado, Curso de Pós-graduação em Agronomia, UFLA, Lavras, 1999.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physiology Plantarum. Copenhagen, v. 15, p. 473-497, 1962.

NAMASIAVAYAM, P. Acquisition of embryogenic competence during somatic

embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands, v. 90, p. 1-8, 2007.

RAEMARKERS, C. J. J. M.; JACOBSEN, E.; VISSER, R. G. F. Secondary somatic

embryogenesis and applications in plant breeding. Euphytica. Netherlands, v. 81, n. 1, p. 93-

107, 1995.

REIS, I. N. R. S.; LAMEIRA, O. A.; CORDEIRO, I. M. C. C. Efeito do 2,4-D na indução de

calos in vitro de Paricá (Schizolobium parahyba var. amazonicum (Huber ex Ducke)

Barneby). Revista Brasileira de Biociências. Porto Alegre, v. 5, supl. 2, p. 498-500, 2007.

ROGALSKI, M.; GUERRA, M. P.; DA SILVA, A. L. Multiplicação in vitro da ameixeira

‘santa rosa’: efeito da citocinina BAP. Revista Brasileira de Fruticultura. Jaboticabal, v. 25,

n. 2, p. 365-367, 2003.

SAHOO, Y.; PATTNAIK, S.K.; CHAND, P.K. Plant regeneration from callus cultures of

Morus indica L. derived from seedlings and mature plants. Scientia Horticulturae. v.69,

n.1/2, p.85-98, 1997.

SILVA, M. M. A.; HERCULANO, L.; CARNEIRO, F. W. O.; WILLADINO, L.; CAMARA,

T. Efeito da luminosidade na formação de embriões somáticos de cana-de-açúcar in vitro. In:

Jornada de Ensino, Pesquisa e Extensão da UFRPE, 9, 2009, Pernambuco. Anais Jornada de

Ensino, Pesquisa e Extensão da UFRPE. Pernambuco, 2009.

SILVEIRA, V.; BALBUENA, T. S.; SANTA-CATARINA, C.; FLOH, E. I. S.; GUERRA,

M. P.; HANDRO, W. Biochemical changes during zygotic embryogenesis in Pinus taeda L.

Plant Growth Regulation, v.44, n.2, p. 147-156, 2004.

10

WATT, M. P.; BANASIAK, M.; REDDY, D.; ALBERTSE, E. H.; SNYMAN, S. J. In vitro

minimal growth storage of Saccharum spp. Hybrid (genotype 88H0019) at two stages of

direct somatic embryogenic regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture.

Netherlands, v.96, p.263–271, 2009.

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Anexo 01. COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA MSC (MURASHIGE e SKOOG, 1962) MODIFICADO PARA CANA-DE-AÇÚCAR

Componentes MS Subst. Inorgânicas (mg L-1)

NH4 NO3 1650 KNO3 1900 H3 BO3 6,2 KH2PO4 170

KI 0,83 Na2MoO4. 2 H2O 0,25

CoCl2. 6 H2O 0,025 CaCl2. 2 H2O 440

Mg SO4. 7 H2O 370 Mn SO4. H2O 16,90 ZnSO4. 7 H2O 8,6 CuSO4. 5 H2O 0,025 FeSO4. 7 H2O 27,80

Na2EDTA 37,30 K2SO4 KCl

(NH4)2 SO4 Subst. orgânicas Arginina (mg.L-1) 50

Ác. Nicotínico (mg.L-1) 0,5 Ác. Cítrico (mg.L-1) 0,15 Piridoxina (mg.L-1) 0,5

Glicina (mg.L-1) 2 Tiamina (mg.L-1) 1

Mio-inositol (mg.L-1) 100 Cisteína (mg.L-1) 50

Caseína Hidrolizada (mg.L-1) 500 Agar (g.L-1) 6

Sacarose (g.L-1) 30 pH 5,8