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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL EMERSON FLORES DE OLIVEIRA ETIOLOGIA, PATOGENICIDADE, CARACTERIZAÇÃO MORFOLOGICA E MOLECULAR DE FUNGOS ASSOCIADOS A SEMENTES DE PLANTAS DANINHAS DO CERRADO GURUPI TO 2015

emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

EMERSON FLORES DE OLIVEIRA

ETIOLOGIA, PATOGENICIDADE, CARACTERIZAÇÃO MORFOLOGICA E MOLECULAR DE FUNGOS ASSOCIADOS A

SEMENTES DE PLANTAS DANINHAS DO CERRADO

GURUPI – TO 2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

EMERSON FLORES DE OLIVEIRA

ETIOLOGIA, PATOGENICIDADE, CARACTERIZAÇÃO MORFOLOGICA E MOLECULAR DE FUNGOS ASSOCIADOS A

SEMENTES DE PLANTAS DANINHAS DO CERRADO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal – área de concentração Fitossanidade.

Orientador: Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos

GURUPI – TO 2015

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da Universidade Federal do Tocantins

Campus Universitário de Gurupi

O48e Oliveira, Emerson Flores Etiologia, patogenicidade e caracterização molecular de fungos associados a

Sementes de plantas daninhas do cerrado / Emerson Flores Oliveira. - Gurupi, 2015. 83f.

Dissertação de Mestrado – Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, 2015. Linha de pesquisa: Área de concentração em Fitossanidade.

Orientador: Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos .

1. Patógenos. 2. plantas invasoras. 3. doenças. I. Santos, Gil Rodrigues dos.II. Universidade Federal do Tocantins. III. Título.

CDD 632.5

Bibliotecária: Glória Maria Soares Lopes – CRB-2 / 592 TODOS OS DIREITOS RESERVADOS – A reprodução total ou parcial, de qualquer forma ou por qualquer meio deste documento é autorizado desde que citada a fonte. A violação dos direitos do autor (Lei nº 9.610/98) é crime estabelecido pelo artigo 184 do Código Penal.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

Defesa nº 05/2015

ATA DA DEFESA PÚBLICA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE EMERSON FLORES DE OLIVEIRA, DISCENTE DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

PRODUÇÃO VEGETAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

Aos 27 dias do mês de Fevereiro do ano de 2015, às 14:00 horas, no(a) Sala de XV do Bloco Bala II, reuniu-se a Comissão Examinadora da Defesa Pública, composta pelos seguintes membros: Prof. Orientador Dr. Gil Rodrigues dos Santos do Campus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Dr. Maruzanete Pereira de Melo / Universidade Federal do Piauí, Dra. Solange Aparecida Ságio do Campus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Prof. Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar do Campus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins sob a presidência do primeiro, a fim de proceder a arguição pública da DISSERTAÇÃO DE MESTRADO de EMERSON FLORES DE OLIVEIRA, intitulada "ETIOLOGIA, PATOGENICIDADE E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS ASSOCIADOS SEMENTES DE PLANTAS DANINHAS DO CERRADO.". Após a exposição, a discente foi arguida oralmente pelos membros da Comissão Examinadora, tendo parecer favorável à aprovação, habilitando-o(a) ao título de Mestre em Produção Vegetal. Nada mais havendo, foi lavrada a presente ata, que, após lida e aprovada, foi assinada pelos membros da Comissão Examinadora.

Dr. MARUZANETE PEREIRA DE MELOPrimeiro examinador

Dra. SOLANGE APARECIDA SÁGIOSegundo examinador

Dr. RAIMUNDO WAGNER DE SOUZA AGUIARTerceiro examinador

Dr. GIL RODRIQUES DOS SANTOS Universidade Federal do Tocantins

Orientador e presidente da banca examinadora

Gurupi, 27 de Fevereiro de 2014.

Dr. Rodrigo Ribeiro Fidelis Coordenador do Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal

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DEDICO

A minha amada esposa Aline e meus queridos filhos, Artur Henrique e Maria Helena, vocês são o bem mais precioso que tenho em minha vida, e a minha razão de cada dia seguir mais em frente.

Aos meus pais, Jose Valmor e Rosani, meus irmãos, Alexandro, Lucion e Jéssica e meu sobrinho afilhado Lucyano Matheus.

Aos meus queridos avós, Romildo Flores (in memoriam) e Eulina

Maria, Getúlio Oliveira e Cleonice Moura de Oliveira (in memoriam).

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AGRADECIMENTOS

A todos que contribuíram para realização de alguma forma para

realização desse trabalho.

Ao meu orientador Doutor Gil Rodrigues dos Santos, pela orientação,

dedicação, e principalmente ter acreditado em meu potencial para condução do

presente trabalho, tendo por isso nunca medido esforços para tal finalidade.

Ao Programa de Pós Graduação em Produção Vegetal da Universidade

Federal do Tocantins pela oportunidade de realização do curso de mestrado.

Ao Dra. Solange Aparecida Ságio, pela enorme contribuição nas análises

moleculares, além das inúmeras vezes que veio a me socorrer sanado dúvidas

sobre as análises moleculares, e pelo imenso apoio prestado durante a realização

deste trabalho

Ao Dr. Maruzanete Pereira de Melo, pela grande contribuição para este

trabalho, desde a classificação morfológica dos fungos até dicas, sugestões e

ideias que foram fundamentais, e por sempre estar disposto a contribuir para as

melhorias do presente trabalho.

Ao professor Dr Rodrigo Ribeiro Fidelis, que sempre ajudou fornecendo

sementes para todos os testes.

A todos os colegas do grupo de manejo integrado de doenças: Dalmarcia,

Mateus, Ronice, Jaiza, Professor Paulo Tschoeke, Micaele, Rosângela, Jonathan,

Camila, Pedro, Fabiana e Cynthia.

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A Agência de Defesa Agropecuária do Estado do Tocantins – ADAPEC,

em especial ao colegas Paulo Farencena, Rodrigo Cavalheiro, Rodrigo Bianchi,

Edson Pimentel e Marcos Motta (Marcão), que sem a ajuda dos mesmos esse

trabalho não seria possível.

A minha esposa Aline Lof, que sempre me incentivou a continuar

estudando, e sua ajuda foi fundamental para isso, essa vitória também e sua.

Ao meu companheiro das madrugadas de estudo “Chimarrão”

Muito Obrigado.

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O aprendizado e como o horizonte; Não a limites

(Provérbio chinês)

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RESUMO GERAL

As plantas daninhas competem com água, luz e nutrientes com as culturas de

importância agrícolas, e possuem vários mecanismos efetivos de propagação,

além de um extenso banco de sementes, que pode permanecer viável por longos

períodos de tempos. Além disso, podem ser hospedeiras de diversos patógenos

causadores de doenças. Apesar da importância existem poucos estudos sobre

o transporte de fungos associados as sementes das plantas daninhas. Este

trabalho teve como objetivo realizar a análise sanitária de sementes de

Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp., Acanthospermum australe, Cencrhus

echinatus L., Eleusine indica, Sida rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia

polyanthes, Bidens pilosa, Tridax procumbens, Echinochloa crus-pavonis,

Digitaria horizontalis. Das amostras da sementes analisadas foram identificados

13 gêneros fúngicos diferentes, sendo que o gênero Fusarium ocorreu em todas

as espécies de plantas daninhas, e o gênero de maior ocorrência nas sementes

foi Cladosporium. Ocorreram também os gêneros Curvulária, Aspergillus,

Bipolaris, Alternaria, Phoma, Nigrospora, Papularia, Penicillium e Rhizoctonia.

Também foram verificados fungos classificados na classe Oomicetes. Existem

poucos trabalhos relacionado a presença de fungos constatados nas sementes

de plantas daninhas com a sua capacidade de causar doenças na plantas

cultivadas. Desta forma este trabalho teve como objetivo avaliar a

patogenicidade de fungos isolados de sementes de 12 espécies de plantas

daninhas coletas em área tropicais as plantas daninhas hospedeiras e as plantas

cultivadas de arroz (Oryza sativa), milho (Zea mays), feijão (Phaseolus vulgaris),

feijão caupi (Vigna unguiculata) e soja (Glycine max). A maioria dos fungos

testados não apresentou patogenicidade as plantas cultivadas, porém sementes

de Pennisetum setosum e Tridax procumbens apresentaram fungos e oomicetos

com patogenicidade às plantas cultivadas. Apenas o gênero Fusarium isolado

de T. procumbes foi patogênico a sua hospedeira, provocando sintomas de

murcha. Os demais gêneros encontrados nas semente e que foram patogênicos

as plantas cultivadas porem não patogênicos as plantas, podem ser

considerados como endofíticos na sua relação com essas planta. A correta

identificação das espécies patogênicas e de suma importância para

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conhecimento e manejo da doença, sendo essas identificações baseiam-se

principalmente em características morfológicas como formas e tamanho dos

esporos assexuais, morfologia das hifas, formação de clamidósporos e

características das celulas conidiogênicas. Diversas técnicas moleculares como

sequenciamento de nucleotídeos de DNA amplificados pela PCR (Reação de

polimerase em cadeia), partindo de genes específicos como calmodulina e β-

tubulina, além de analises de restrição através de enzimas especificas. As

tecnias morfológicas e moleculares possibilitaram a caracterização das espécies

Fusarium.verticilioides, F. proliferatum e F. semitectum, associadas à sementes

de Pennisetum setosum e F. semitectum e F. solani associadas a sementes de

Tridax procumbens

Palavras – chave: Patógenos, plantas invasoras, doenças

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GENERAL ABSTRACT

Weeds compete for water, light and nutrients with crops of agricultural

importance, and have several effective mechanisms of propagation, and an

extensive seed bank, which can remain viable for long periods of time. In addition,

the host can be various disease-causing pathogens. There are few studies on the

transport of fungi associated the seeds of weeds. This work was aimed at making

the health analysis Spermacoce seeds latifolia Aubl, Ipomoea spp.,

Acanthospermum australe, Cencrhus echinatus L., Eleusine indica, Sida

rhombifolia Pennisetum setosum, Vernonia polyanthes, Bidens pilosa, Tridax

procumbens, raw-pavonis Echinochloa , Digitaria horizontalis. The samples of

the seeds analyzed, identified 13 different genera of fungi, and the Fusarium

occurred in all weed species, and the genre most frequent in the seeds was

Cladosporium. There were also the Curvularia, Aspergillus, Bipolaris, Alternaria,

Phoma, Nigrospora, Papularia, Penicillium and Rhizoctonia. We also checked

fungi classified in class Oomycetes. There are few studies related to the presence

of fungi observed in the weed seeds with their ability to cause disease in crops.

Thus this work was to evaluate the pathogenicity of 12 seed species of fungi

isolated weed collections in tropical area host weeds and cultivated plants of rice

(Oryza sativa), corn (Zea mays), beans (Phaseolus vulgaris ), cowpea (Vigna

unguiculata) and soybean (Glycine max). Most fungi tested showed no

pathogenicity cultivated plants, but seeds of Pennisetum setosum and Tridax

procumbens showed fungi and oomycetes with pathogenicity cultivated plants.

Only the genus Fusarium isolated from T. procumbes was pathogenic to its host,

causing symptoms of wilt. The other genera found in the seed and were

pathogenic plants grown however nonpathogenic the source material, can be

considered as endophytic in their relationship with these plant. The correct

identification of pathogenic species and of paramount importance to knowledge

and management of the disease, and these identifications are based mainly on

morphological features like shapes and size of asexual spores, hyphal

morphology, chlamydospores formation and characteristics of Conidiogenous

cell. And in molecular characteristics, in which different molecular techniques

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such as DNA sequencing nucleotides amplified by PCR (polymerase chain

reaction) and restriction analysis by specific enzymes was used. The

morphological and molecular techniques enabled the characterization of

Fusarium verticilioides species, F. proliferatum and F. semitectum associated

with the seeds of Pennisetum setosum and F. solani and F. semitectum

associated with Tridax seeds procumbens

Keywords: Pathogens, weeds, diseases

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SUMÁRIO

RESUMO GERAL ........................................................................................... 9

GENERAL ABSTRACT................................................................................. 11

LISTA DE TABELAS ..................................................................................... 15

Capitulo I ....................................................................................................... 15

Capitulo II ...................................................................................................... 15

Capitulo III ..................................................................................................... 15

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................... 16

Capitulo I ....................................................................................................... 16

Capitulo II ...................................................................................................... 16

Capitulo III ..................................................................................................... 17

CAPÍTULO I ..................................................................................................... 18

Micoflora associada a Sementes de plantas daninhas coletadas em áreas

tropicais .......................................................................................................... 18

RESUMO ...................................................................................................... 19

ABSTRACT ................................................................................................... 20

INTRODUÇÃO .............................................................................................. 21

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 23

RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 26

CONCLUSÕES ............................................................................................. 29

REFERENCIAS ............................................................................................ 32

CAPÍTULO II ................................................................................................... 35

Fungos associados à Sementes de plantas daninhas como patógenos de

plantas cultivadas .......................................................................................... 35

RESUMO ...................................................................................................... 36

ABSTRACT ................................................................................................... 37

INTRODUÇÃO .............................................................................................. 38

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MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 39

RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 41

CONCLUSÕES ............................................................................................. 50

REFERENCIAS ............................................................................................ 51

CAPÍTULO III .................................................................................................. 56

Análise morfológica e molecular de Fusarium spp. isolados de sementes

de Tridax procumbes L. e Pennisetum setosum (SW. Rich.) ..................... 56

RESUMO ...................................................................................................... 57

ABSTRACT ................................................................................................... 58

INTRODUÇÃO .............................................................................................. 59

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 63

Caracterização Morfológica ....................................................................... 63

Caracterização Molecular .......................................................................... 63

Sequenciamento ....................................................................................... 63

Extração de DNA para Perfil de Restrição ................................................ 64

Condição PCR .......................................................................................... 65

Análise de Restrição ................................................................................. 65

RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 66

Caracterização Morfológica ....................................................................... 66

Caracterização Molecular .......................................................................... 69

CONCLUSÃO ............................................................................................... 75

REFERENCIAS ............................................................................................ 76

CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................. 81

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LISTA DE TABELAS

Capitulo I

Tabela 1: Plantas daninhas coletadas para análise sanitária das sementes................................................................................................... 24

Tabela 02: Incidência de Fungos em sementes de Plantas daninhas coletadas em áreas tropicais no sul do estado do Tocantins.....................

30

Capitulo II

Tabela 01:Testes de patogenicidade de fungos isolados de sementes de plantas daninhas em Arroz (Ar), Feijão (Fe), Feijão caupi (Fc), Soja (So) e Milho (Mi).......................................................................................

42

Tabela 02:Patogenicidade de fungos encontrados associados à sementes de plantas daninhas presentes no cerrado do Tocantins..........

48

Capitulo III

Tabela 01: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Pennisetum setosum...........................................................

69

Tabela 02: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Tridax procumbes. ..............................................................

66

Tabela 03: Agrupamento das espécies de Fusarium de acordo com o padrão dos fragmentos de restrição da região ITS....................................

74

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LISTA DE FIGURAS

Capitulo I

Figura 1: A - Sementes de Ipomea spp., em placas de petri, método "blotter test". B – Sementes de Bidens pilosa, em placas de petri, método "blotter test". C - Preparo e desinfecção das sementes. D – Placas de petri, contendo sementes de plantas daninhas em sala de incubaçã...................................................................................................

25

Figura 2: A - Hifas de Fusarium spp, B - Conídios de Fusarium spp em Tridax procumbens...................................................................................

31

Figura 3: A – Curvularia spp em sementes de Tridax procumbes. B - conídios de Curvulária spp isolados de sementes de Pennisetum sestosum...................................................................................................

31

Figura 4: A - Nigrospora spp, B - Papularia spp, ambos em Tridax

procumbens............................................................................................... 31

Capitulo II

Figura 1: A e B - Mancha - de - curvularia em folhas de milho; C - Curvularia spp em sementes de Pennisetum setosum., D - Conidios de Curvulária spp..........................................................................................

45

Figura 2: Podridão causada por Fusarium spp em colmo de plântulas de milho, inoculadas a partir de sementes de Penissetum setosum..........

46

Figura 3: A - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão, B - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão caupi, C e D - Inoculação de Oomiceto spp. em Arroz, E - Inoculação de Oomiceto spp em milho e F - Podridão de Oomiceto spp em colmo de milho ......................................................

47

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Capitulo III

Figura 1: Padrão de alinhamento gerado pelo algoritmo Blastx............... 69

Figura 2: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região ITS. M: Marcador Molecular 1Kb; C+: controle positivo da reação, C-: controle negativo; 1 a 20: isolados de Fusarium ....................

69

Figura 3: Morfologia da colônia em meio BDA - (A) Fusarium proliferatum; (B) Fusarium solani; (C) Fusarium verticilioides; (D) Fusarium semitectum...............................................................................

71

Figura 4: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região ITS com o padrão de digestão para: (A) HpaII; (B) HaeIII; (C) EcoRI; com (M) marcador molecular de 1Kb............................................

72

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CAPÍTULO I

Micoflora associada a Sementes de plantas daninhas

coletadas em áreas tropicais

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19

Micoflora associada a sementes de plantas daninhas coletadas em áreas

tropicais

RESUMO

As plantas daninhas competem por água, luz e nutrientes com as culturas de

importância agrícolas, e possuem vários mecanismos efetivos de propagação,

além de um extenso banco de sementes, que pode permanecer viável por longos

períodos de tempos. Além disso, podem ser hospedeiras de diversos patógenos

causadores de doenças. Apesar da importância existem poucos estudos sobre

o transporte de fungos associados as sementes das plantas daninhas. Este

trabalho teve como objetivo realizar a análise sanitária de sementes de

Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp., Acanthospermum australe, Cencrhus

echinatus L., Eleusine indica, Sida rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia

polyanthes, Bidens pilosa, Tridax procumbens, Echinochloa crus-pavonis,

Digitaria horizontalis. As sementes foram coletadas em áreas tropicais do

ecossistema cerrado, e em seguida foram submetidas ao método do papel filtro

(“blotter test”) no delineamento inteiramente casualizado, com 12 tratamentos e

3 repetições, utilizando-se 90 sementes por tratamento, em 3 repetições de 30

sementes cada. Das amostras da sementes analisadas foram identificados 13

gêneros fúngicos diferentes, sendo que o gênero Fusarium ocorreu em todas as

espécies de plantas daninhas, e o gênero de maior ocorrência nas sementes foi

Cladosporium. Ocorreram também os gêneros Curvularia, Aspergillus, Bipolaris,

Alternaria, Phoma, Nigrospora, Papularia, Penicillium e Rhizoctonia. Também

foram verificados fungos classificados na classe Oomicetes. A diversidade de

fungos encontrados nas análises sanitárias das sementes de plantas daninhas

demonstra que a mesmas contém importantes gêneros de fungos, que podem

representam riscos de disseminação, e em alguns casos causadores de doenças

em plantas cultivadas, como os gêneros Fusarium, Rhizoctonia, Bipolaris, e

Alternaria, demonstrando o potencial do inóculo que estas mesmas podem

representar a produção agrícola das principais culturas.

Palavras – chave: Micoflora, plantas invasoras, transporte

Page 20: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

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Mycoflora associated with weed seed collected in tropical áreas

ABSTRACT

Weeds reduce the production of agricultural crops, and are widely known as

alternative host pathogens, and one of the most effective mechanisms for

propagation and seed bank, which can remain viable for long periods of time, and

not has knowledge of fungi associated the seeds of weeds. This work was aimed

at making the health analysis seed Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp.,

Acanthospermum australe, Cencrhus echinatus L., Eleusine indica, Sida

rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia polyanthes, Bidens pilosa, Tridax

procumbens, Echinochloa crus-pavonis, Digitaria horizontalis, seeds which were

collected, dried and subjected to the filter paper method "blotter test", using 90

seeds, in 3 replicates of 30 seeds each. The samples of the seeds analyzed,

identified 13 different genres, and the Fusarium occurred in all weed species, and

the gender of the greater incidence in the seeds was Cladosporium. There were

also genres Curuvlaria, Aspergillus, Bipolaris, Alternaria, Phoma, Nigrospora,

Papularia, Penicillium and Rhizoctonia, and the isolates with similar

characteristics Oomicetos. The diversity of fungi found in health analysis of weed

seeds shows that they contain important genera of fungi which may represent

spread risk, and in some cases cause diseases in cultivated plants such as genus

Fusarium, Rhizoctonia, Bipolaris, and Alternaria, demonstrating the potential of

the inoculum that they have as well as the importance of correct management of

the same.

Keywords: Mycoflora, invasive plants, transportation

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21

INTRODUÇÃO

A agricultura brasileira vem ano após ano em constante crescimento,

expandindo-se para novas fronteiras agrícolas, sendo que no ano de 2014

atingiu-se 192,8 milhões de toneladas de grãos, cultivados em uma área de 56,3

milhões de hectares (IBGE, 2014). Porém mesmo com esse volume de

produção, existem vários fatores que podem influenciar negativamente nessa

produção, sendo que uma das grandes preocupações atual da agricultura, está

justamente voltada aos prejuízos causados pelas plantas daninhas nas lavouras

(Vasconcelos et al., 2012).

As plantas daninhas além de reduzir a produção das lavouras, aumentar

os custos de produção devido aos custos com métodos de manejo, também

assumem grande importância devido ao fato das mesmas serem hospedeiras de

pragas e doenças, como alguns exemplos citados por Carmo & Santos (2008),

que relata 57 espécies de plantas infestantes como hospedeiras alternativas de

Meloidogyne javanica, já Junior et al. (2012) em estudos dos sistemas

radiculares de plantas daninhas em áreas produtoras de melão isolou o fungo

Macrophomina phaseolina em 13 espécies diferentes de plantas daninhas e o

fungo Rhizoctonia solani em uma espécie de planta daninha, sendo esses fungos

responsáveis pelo colapso das ramas do meloeiro, doença que atinge as

lavouras, principalmente na região nordeste do brasil, além de vários outros que

relatam as plantas daninhas como hospedeiras de vírus, como begomovirus para

plantas de tomateiro, conforme descrito por Silva et al (2010), Assunção et al.

(2006), dentre outros.

As plantas daninhas podem atuar como hospedeiras secundárias de

fitopatógenos, servindo com fontes de inócuo e desempenhando uma

importante função na epidemiologia das doenças, entretanto pouco se conhece

sobre a importância de plantas daninhas como hospedeira alternativas de

patógenos, além das mesmas atuarem como hospedeiras, produzem

substâncias alopáticas, serem toxicas para animais, além da depreciação da

terra, danos a colheita das plantas cultivadas e efeitos prejudiciais causados

pelos métodos de controle desnecessários (Junior et al., 2012; Vasconcelos et

al., 2012).

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22

Para sua disseminação e sobrevivência os patógenos também dependem

do processo de disseminação, que implica em sua movimentação,

movimentação está proporcionada na maior parte na maior parte dos casos por

agentes externos, como água, ar, homem, insetos (Amorim, et al 2011) e

sementes (Barrocas e Machado, 2010).

Barrocas & Machado (2010) exalta que em geral as sementes podem

abrigar e transportar microrganismos de todos os grupos taxonômicos,

patogênicos ou não, por isso a detecção desses organismos torna-se uma das

mais importantes ferramentas para o manejo sanitário de doenças. Porém, no

caso de plantas daninhas as mesmas dispõem de um eficiente banco de

sementes, onde constituem um sério problema a atividade agrícola, pois

garantem as infestações por um longo período de tempo, mesmo que medidas

de controle sejam adotadas (Leck, 2012), devido as mesmas disporem de

mecanismos como facilidades de dispersão, como vento, solo, preparo do solo,

água, animais, além de mecanismos como dormência e efeito alopáticos

(Carmona, 1992).

Apesar da importância de estudos nesta área buscando-se obter um

maior conhecimento desta associação. Praticamente não foram encontrados

trabalhos em áreas de cerrado em espécies típicas deste ecossistema.

Neste trabalho objetivou-se realizar a análise sanitária de sementes de

Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp., Acanthospermum australe, Cencrhus

echinatus L., Eleusine indica, Sida rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia

polyanthes, Bidens pilosa, Tridax procumbens, Echinochloa crus-pavonis,

Digitaria horizontalis, visando identificar os gêneros de fungos presentes nas

sementes das mesmas.

Page 23: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

23

MATERIAL E MÉTODOS

Os trabalhos foram conduzidos no laboratório de manejo integrado de

doenças de plantas da Universidade Federal do Tocantins – Campus

Universitário de Gurupi, no período de Setembro de 2013 a Agosto de 2014, de

onde as sementes das 12 espécies de plantas daninhas (Tabela 01) foram

coletadas nas áreas de cerrado localizadas na latitude 11°44’47,18” e longitude

49°02’56,97” do campo experimental da UFT, onde as mesmas foram coletadas,

diretamente das plantas daninhas, catalogadas, corretamente identificadas.

Posteriormente foi separada uma amostra de 90 sementes de cada espécie. Em

seguida, cada amostra foi dívida em 3 sub amostras contendo 30 sementes

cada, onde foram secadas em estufa a 40ºc por 45 minutos, a fim de perder o

excesso de umidade, para evitar contaminações e não afetar a sobrevivência

dos fungos o que poderia interferir nos posteriores resultados após o

armazenamentos das sementes.

Para as análises sanitárias, foi adotado o método do papel filtro ou “blotter

test”, conforme metodologia adaptada de Neergaard (1977) para 90 sementes.

Inicialmente, foi feita assepsia das sementes em álcool (50%/30seg) e depois

em hipoclorito de sódio (1%/40seg), em seguida, foi retirado o excesso de

hipoclorito em água esterilizada contida em 3 placas de petri. Depois, as

sementes de cada espécie, foram colocadas sobre 3 camadas de papel filtro,

esterilizado no interior de cada placa de petri, sendo colocadas 90 sementes por

tratamento, distribuídas com 30 sementes por cada placa (repetição). As

sementes foram colocadas em sala de incubação (Figura 1) por 7 dias, sob a

temperatura de 25°C ± 1°C e fotoperiodo de 12 horas, onde permaneceram até

a avaliação.

Após o período de incubação, as sementes foram analisadas

individualmente com auxílio de microscópio estereoscópio binocular Physis

modelo Sqf - F, para visualização das características morfológicas das estruturas

dos fungos, sendo que, quando necessário, foram preparadas lâminas, que

foram visualizadas ao microscópio óptico trinocular Physis modelo exp 100, para

identificação. Após a identificação e com auxílio de um estilete estéril, estruturas

fungicas, foram transferidos para placas de petri, contendo meio de cultura BDA,

Page 24: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

24

e incubados por 7 dias, à uma temperatura constante de 25ºC ± 1ºC, para nova

identificação e armazenamento para posteriores estudos com os diferentes

gêneros. Na sequência, cada fungo foi repicado e transferido para tubos de

ensaio, contendo meio de cultura BDA, de onde foram levados para conservação

em freezer a baixas temperaturas.

Tabela 1: Plantas daninhas coletadas para análise sanitária das sementes

Espécie Família

Spermacoce latifólia Aubl Rubiaceae

Ipomea sp. Convolvulaceae

Acanthospermum australe Asteraceae

Cencrhus echinatus L. Poaceae

Eleusine indica Poaceae

Sida rhombifolia Malvaceae

Pennisetum setosum Poaceae

Vernonia polyanthes Asteraceae

Bidens pilosa Asteraceae

Tridax procumbens Asteraceae

Echinochloa crus-pavonis Poaceae

Digitaria horizontalis Poaceae

Para identificação correta dos gêneros de fungos encontrados, foi

utilizada a literatura especifica para consultas, como Barnett; Hunter (1998) e

Watanabe (2010). Foram observadas estruturas dos fungos presentes na

superfície das sementes, morfologia das colônias em meio BDA, morfologia das

hifas e características de esporos assexuais (conídios) ou sexuais, onde todas

as características dos gêneros foram comparadas e fotografadas com auxílio de

câmera digital acopladas a microscópio óptico, para elaboração de pranchas,

contendo imagens das estruturas avaliadas e utilizadas na correta identificação

do gênero.

Page 25: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

25

Figura 1: A - Sementes de Ipomea spp., em placas de petri, método "blotter test". B – Sementes

de Bidens pilosa, em placas de petri, método "blotter test". C - Preparo e desinfecção das

sementes. D – Placas de petri, contendo sementes de plantas daninhas em sala de incubação.

Page 26: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

26

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O número de fungos identificados nas sementes de plantas daninhas

divergiram entre as espécies, sendo encontrados um total de 13 gêneros

diferentes, sendo que, alguns de fungos com importância para cultivos agrícolas,

bem como alguns isolados com características semelhantes a Oomicetos

(Tabela 2).

O gênero mais presente nas sementes analisadas foi o Cladosporium, o

qual foi verificado em todas as amostras analisadas. Este gênero, normalmente

é considerado contaminante, comumente encontrado em sementes

armazenadas, porém, existem espécies patogênicas às plantas de trigo,

maracujá e pessegueiro (Martins, et al, 2006).

O segundo gênero de maior incidência nas sementes foi o Fusarium

(Figura 02), o qual trata-se de um fungo amplamente distribuído, sendo que, a

maioria das espécies é composta por fungos que em sua grande maioria atuam

na decomposição de substratos derivados de celulose, ou possuem hábitos

saprofíticos, porém, algumas espécies podem ser patógenos de plantas, além

de serem produtoras de toxinas (Leslie; Summerell, 2008). Para a correta

identificação, levou-se em consideração a produção dos espóros assexuais

(macroconidios e microconidios), onde os microconidios são unicelulares e

uninucleados, e os macroconidios, que são mais comuns são multicelulares,

porém, uninucleados(Leslie & Summerell, 2008; Puhalla, 1981).

O gênero Curvularia (Figura 03) foi encontrado nas sementes de 7

espécies de plantas daninhas, com destaque T. procumbens, o qual apresentou

a maior taxa de incidência, com valores de 47,7 % (Tabela 02). Segundo a

literatura, o gênero Curvularia, possui mais de 40 espécies, sendo na sua grande

maioria, saprofíticos ou endofiticos, porém, algumas espécies são consideradas

fitopatogênicas, principalmente em gramíneas, nas regiões tropicais e

subtropicais (Sivanesan, 1987; Watanabe, 2010).

Phoma foi encontrado em sementes de 9 espécies de plantas daninhas,

e é considerado um gênero que possui uma vasta gama de hospedeiros, além

de ocorrer em diversas culturas de interesses econômicos (Boerema et al.,

2004). Este fungo pode provocar enormes perdas econômicas, bem como,

Page 27: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

27

restrição do comércio, por apresentar espécies com restrições quarentenárias, o

que impede ou dificulta o comércio internacional de derivados (Aveskamp; De

Gruyter; Crous, 2008).

Alternaria foi encontrado nas sementes de 8 espécies de plantas

daninhas, com destaque também para T. procumbens, que apresentou uma taxa

de incidência de 45,5% das sementes contaminadas com o fungo (Tabela 02).

Töfoli e Domingues (2010) ressaltam que espécies do gênero Alternaria estão

entre as principais causadoras de doenças fúngicas em hortaliças, além de

mencionar os meios de sobrevivência dos fungos como restos culturais, nas

formas de micélio, esporos, clamidósporos e principalmente em sementes. Vale

ressaltar, que são escassos os relatos de contaminação de fungos do gênero

Alternaria em sementes de espécies de plantas daninhas.

Outro importante fungo encontrado em sementes de 2 espécies de

plantas daninhas, foi o Bipolaris, o qual foi verificado em sementes de P. setosum

e E. crus-pavonis, ambas espécies pertencentes a família das Poaceas (Lorenzi,

2006). Espécies do complexo Bipolaris normalmente podem causar lesões

foliares necróticas, provocando a morte dos tecidos em várias gramíneas da

mesma família, como por exemplo, a mancha de Bipolaris, importante doença

foliar da cultura do milho (Trigiano et al., 2010).

A planta daninha T. procumbens também apresentou a ocorrência do

fungo R. solani, que embora tenha ocorrido em menor incidência (10%), se trata

de um fungo de grande importância, pois além de sobreviver em restos culturais

como saprofítico, ou através de estruturas como escleródios e micélios, que

permitem que o fungo sobreviva por longos períodos de tempos (Papavizas;

Davey, 1961), também pode causar grandes perdas econômicas em várias

famílias de culturas agrícolas de grande interesse agronômico (Ceresini; Souza,

1997).

Em sementes de S. latifolia Aubl, C. echinatus L. e T. procumbens, foram

encontrados fungos com estruturas semelhantes a Oomicetos, como micélio

hialino branco a cotonoso, presença de hifas asseptadas e formação de

esporângios contendo zoospóros (Agrios, 2005). Oomicetos podem provocar

damping off (tombamentos), podridão de sementes, podridão de plântulas e

podridões radiculares, tendo como doença de ocorrência histórica a requeima da

batata, causada pelo Oomiceto Phytophthora infestans (Amorim, et al 2011).

Page 28: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

28

Entre outros gêneros fúngicos, também foram identificados a Nigrospora,

Aspergillus, Rhizopus e Papularia. O Aspergillus pode ser considerado fungo de

armazenamento, o que pode influenciar na má qualidade ou conservação das

sementes ou grãos armazenados (Borém et al., 2006). Os gêneros Nigrospora,

Rhizopus e Papularia são fungos considerados contaminantes em sementes,

comumente encontrados em análises sanitárias de sementes (Figura 4).

Levando-se em consideração, as espécies de plantas daninhas avaliadas,

destacaram-se nas análises sanitárias as sementes de Pennisetum setosum,

Tridax procumbens e Sida rhombifolia, como sendo as espécies que mais

apresentaram contaminação nas sementes por fungos potencialmente

fitopatogênicos, (Tabela 02), tais como, Fusarium, Alternaria, Phoma,

Rhizoctonia, Bipolaris e Oomicetos. Devido aos poucos estudos encontrados, e

também, considerando-se que o presente trabalho busca apenas fazer um

levantamento inicial destes fungos presentes nas plantas daninhas comumente

adaptadas às áreas tropicais do cerrado, é de suma importância que outros

trabalhos sejam realizados, buscando-se relacionar a presença destes fungos

nas sementes, com incidência de doenças em plantas agrícolas do cerrado, bem

como medidas de manejo destas doenças, baseadas no manejo de plantas

invasoras presentes neste ecossistema.

Page 29: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

29

CONCLUSÕES

A análise sanitária de sementes de plantas daninhas revelou a presença

de diversos gêneros de fungos considerados fitopatogênicos, indicando que,

além das plantas daninhas competirem com a cultura por água, luz, nutrientes e

espaço, as mesmas apresentam potencial risco de veiculação de patógenos

importantes para cultivos agrícolas de importância econômica.

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30 Tabela 02: Incidência de Fungos em sementes de Plantas daninhas coletadas em áreas tropicais no sul do estado do Tocantins.

Espécie

Incidência de Fungos (%)

Cladosporium

spp.

Curvularia

spp.

Fusarium

spp.

Bipolaris

spp.

Phoma

spp.

Nigrospora

spp.

Aspergillus

niger

Rhizopus

spp.

Alternaria

spp.

Papularia

spp.

Aspergillus

spp.

Rhizoctonia

solani Oomicetos

Spermacoce

latifólia Aubl 71,1 0 10 0 12,2 22,2 0 0 0 0 0 0 3,3

Ipomea spp 92,2 26,6 0 0 0 2,2 0 0 3,3 0 3,3 0 0

Acanthospermum

australe 92,2 0 26,6 0 0 2,2 0 0 3,3 0 3,3 0 0

Cencrhus

echinatus L. 36,6 24,4 16,6 0 2,2 0 0 0 4,4 0 2,2 0 4,4

Eleusine indica 91,1 0 5,5 0 4,4 0 0 0 0 0 5,5 0 0

Sida rhombifolia 13,3 0 82,2 0 7,7 0 0 0 0 0 4 0 0

Pennisetum

setosum 82,2 30 17,7 7,7 6,6 4,4 3,3 2,2 2,2 1,1 0 0 0

Vernonia

polyanthes 8,9 0 5,6 0 7,8 3,3 3,3 18,9 0 0 0 0 0

Bidens pilosa 21,1 23,3 16,6 0 3,3 0 14,4 0 12,2 0 0 0 0

Tridax

procumbens 56,6 47,7 70 0 52,2 0 0 2 45,5 0 2 10 27,7

Echinochloa

crus-pavonis 60 6,7 11,1 4,4 10 0 0 0 12,2 0 0 0 0

Digitaria

horizotalis 70 13,3 6,7 0 0 0 5,6 3,3 13,3 0 21,1 0 0

Total 725,3 172 268,6 12,1 106,4 34,3 26,6 24,4 96,4 1,1 41,4 10 35,4

Page 31: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

31

Figura 2: A - Hifas de Fusarium spp, B - Conídios de Fusarium spp em Tridax procumbens

Figura 3: A – Curvularia spp em sementes de Tridax procumbes. B - conídios de Curvulária spp isolados de sementes de pennisetum sestosum.

Figura 4: A - Nigrospora spp, B - Papularia spp, ambos em Tridax procumbens .

Page 32: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

32

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Page 35: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

35

CAPÍTULO II

Fungos associados à Sementes de plantas

daninhas como patógenos de plantas cultivadas

Page 36: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

36

Fungos associados a sementes de plantas daninhas como patógenos de

plantas cultivadas

RESUMO

Os fungos são os principais causadores de doenças em plantas, porém sendo

em sua grande maioria são organismos saprofíticos. A dispersão via sementes

pode ser considerada um dos mecanismos mais eficientes, as quais os fungos

podem estar misturados às mesmas, aderido à superfície ou localizados no

interior das sementes. Plantas daninhas além de já serem conhecidas como

hospedeiras de diversos microrganismos produzem um diversificado banco de

sementes, que servem como fonte de inóculo para fungos patogênicos. Existem

poucos trabalhos relacionado a presença de fungos constatados nas sementes

de plantas daninhas com a sua capacidade de causar doenças na plantas

cultivadas. Desta forma este trabalho teve como objetivo avaliar a

patogenicidade de fungos isolados de sementes de 12 espécies de plantas

daninhas coletas em área tropicais as plantas daninhas hospedeiras e as plantas

cultivadas de arroz (Oryza sativa), milho (Zea mays), feijão (Phaseolus vulgaris),

feijão caupi (Vigna unguiculata) e soja (Glycine max). A maioria dos fungos

testados não apresentam patogenicidade as plantas cultivadas, porém sementes

de Pennisetum setosum e Tridax procumbens apresentaram fungos e oomicetos

com patogenicidade às plantas cultivadas. Apenas o gênero Fusarium isolado

de T. procumbes foi patogênico a sua hospedeira, provocando sintomas de

murcha. Os demais gêneros encontrados nas sementes e que foram

patogênicos as plantas cultivadas porem não patogênicos as suas respectivas

hospedeiras, podem ser considerados como endofíticos na sua relação com

essas plantas. Os resultados obtidos no trabalho demonstram que sementes de

plantas daninhas podem transportar fungos patogênicos à várias plantas de

interesse agrícola, sendo necessário maior atenção dos agricultores para

promover o manejo adequado destas plantas.

Palavras – chave: Fusarium, plantas invasoras, patógenos

Page 37: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

37

Fungi associated with the seeds of weeds as pathogens of plants grown

ABSTRACT

Fungi are the main causative agents of plant diseases, and for the most part they

are saprophyte bodies, however about 10% can cause disease in plants it is

therefore necessary for the survival and spread, these being in the form of spores,

mycelium, hyphae, sclerotia and chlamydospores, but one of the most effective

mechanisms for such dispersion are seeds, which can be mixed fungi adhered to

the same surface located inside or seeds. Weeds and are known as host

pathogens produce a diversified stock seed filling, which provides a source for

inoculum and pathogenic fungi. This study aimed to evaluate the pathogenicity of

fungi isolated from 12 weed species collected in tropical area, which were isolated

from inoculated, Fusarium, Curvularia, Alternaria, Bipolaris and isolated from

Oomycetes, which were inoculated in rice seedlings (Oryza sativa), corn (Zea

mays), bean (Phaseolus vulgaris), cowpea (Vigna unguiculata) and soybean

(Glycine max), and the pathogenic fungi present in inoculated plants own source.

Most fungi showed no pathogenicity cultivated plants, but seeds of Pennisetum

setosum and Tridax procumbens showed fungi and oomycetes with pathogenic

isolates cultivated plants, with 4 isolated pathogens of Fusarium spp, 1

pathogenic isolate of Curvularia spp and 2 isolates of pathogenic Oomycetes I

was only an isolated pathogenic caused wilt in the origin of plant. The results

show that weed seed can carry fungi with high pathogenic potential for crops,

requiring great attention and proper management.

Keywords: Fusarium, invasive plants, transportation

Page 38: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

38

INTRODUÇÃO

De acordo com Agrios (2005) existem mais de 10.000 espécies de fungos

que podem causar doenças em plantas. Todas as plantas são atacadas por

algum tipo de fungo e cada tipo de fungo parasita pode causar doenças em um

ou mais tipos de plantas.

Para dispersão e sobrevivência os fungos utilizam-se de diferente

estratégias, como estruturas de resistência (escleródios), hifas, micélio e

esporos, bem como diferentes hábitos de sobrevivência, como organismos

saprofíticos (sobrevivem em matéria orgânica e restos culturas) até parasitas

biotróficos ou obrigatórios que sobrevivem somente no tecido vivo (Trigiano, et

al., 2010), e outros podem ser endofiticos, permanecendo no interior de folhas,

ramos e raízes sem causar prejuízos no hospedeiro (Peixoto Neto, et al., 2002)

Neergaard (1977) atribui as sementes o meio mais eficiente de

transmissão e disseminação de patógenos, devido as facilidades de locomoção

e transporte, não existindo assim barreiras geografias capazes de impedir a

disseminação dos mesmos, visto que os patógenos podem transporta-se

misturado ou aderido à superfície, ou localizado no interior das sementes.

As plantas daninhas apresentam capacidade de produzir grande

quantidade de sementes que podem hospedar patógenos de plantas cultivadas.

Além das mesmas competirem com as culturas agrícolas por agua, luz,

nutrientes e espaço (Vasconcelos, et al., 2012), possuem um banco de sementes

com alta produção, além de disporem de mecanismos como facilidades de

dispersão, como vento, solo, preparo do solo, água, animais, além de

mecanismos como dormência e efeito alopáticos (Carmona, 1995).

De acordo com a literatura consultada foi verificado que existem poucos

trabalhos relacionados a fungos presentes nas sementes de plantas daninhas

com sua capacidade de causar doenças nas plantas cultivadas e também na

planta daninhas a qual foi produzida a semente. Assim, o presente trabalho teve

como objetivo verificar a patogenicidade de fungos associados as sementes de

plantas daninhas com capacidade patogênica as plantas cultivadas.

Page 39: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

39

MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no laboratório de manejo integrado de

doenças de plantas e em casa de vegetação da Universidade Federal do

Tocantins campus universitário de Gurupi. A análise sanitária das sementes de

12 espécies de plantas daninhas, foi realizado pela método do papel filtro ou

“blotter test” adaptados de Neergaard (1977) para 90 sementes. Foram utilizadas

3 sub amostras colocadas em placas de petri, contendo 30 sementes

previamente desinfestadas em álcool a 70% (45seg) e hipoclorito de sódio a 1%

(45seg), e em seguidas foram lavadas por 3 vezes com agua destilada para

retirar o excesso de hipoclorito. Posteriormente, as placas foram levadas a

câmara de incubação e mantidas em temperatura constante de 25ºC ± 1ºC, e

fotoperíodo de 12 horas. Após o período de incubação as sementes foram

analisadas individualmente com auxílio de microscópio estereoscópio, para

visualização das características morfológicas das estruturas dos fungos, e

quando necessário foram preparadas lâminas para visualização ao microscópio

óptico trinocular Physis modelo exp 100. Após a identificação os fungos foram

repicados para placas de petri contendo meio de cultura BDA, e incubados por

7 dias a uma temperatura de constante de 25ºC ± 1ºC, para nova identificação e

armazenamento para posteriores estudos com os gêneros. Em seguida cada

isolado transferido para tubos de ensaio contendo meio de cultura BDA, de onde

foram levados para conservação em freezer á baixa temperatura.

A patogenicidade dos fungos oriundos das sementes das plantas

daninhas foi avaliada por meio de inoculações na parte aérea de plântulas de

Arroz (Oryza sativa), Feijão (Phaseolus vulgaris), Feijão caupi (Vigna

unguiculata), Soja (Glycine max) e Milho (Zea mays), onde inoculou-se no tecido

foliar, nos pecíolos e no colmo das plântulas. Para as inoculações foram

utilizadas 10 plantas de cada espécie aos 20 dias de emergência. O substrato

das bandejas onde as plantas cresceram apresentavam mistura de 50% de

substrato comercial Plantimax ® e 50 % de areia auto clavada.

Foram utilizadas três metodologias para as inoculações, sendo:

suspensão de conídios pulverizados na parte aérea das plantas (Nechet &

Halfeld - Vieira, 2005), e a utilização de palitos de dente contaminados com

Page 40: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

40

micélio fungico (Damincone, et. al, 1988) e introduzidos diretamente no tecido do

pecíolo e colmo das plantas, e a utilização de discos de micélio. Para

metodologia da inoculação de conídios foi utilizada a suspensão de 1 x 106

conídios/mL, pulverizado com borrifador manual sobre os tecidos da parte aérea

(folhas, pecíolos, etc.). A metodologia do palito de pente foi feita a partir da

repicagem do fungo em meio BDA, juntamente com os palitos de dentes

esterilizados colocados na mesma placa, após 10 dias os palitos foram retirados

das placas e introduzidos no pecíolo e colmo das plântulas. A terceira

metodologia utilizada foi a do disco de micélio, recortados com diâmetro de 0,5

cm, os quais foram introduzidos e fixados em pequenos ferimentos com auxílio

de alfinete estéril.

Após as inoculações as plantas permanecerem em câmara úmida por 48

horas, e em seguida foram levadas para casa de vegetação, onde após 10 dias

foram realizadas as avaliações da patogenicidade. Quando foram visualizados

os sintomas no tecido inoculado, o fungo foi reísolado e cultivado em meio BDA.

Depois o mesmo foi novamente inoculado e reísolado em meio BDA, visando o

cumprimento de todas as etapas dos postulados de “Koch”.

Apenas os fungos que foram patogênicos às plantas cultivadas tiveram a

sua patogenicidade testada na própria planta de origem, com a finalidade de

saber se o mesmo era patogênico também à planta daninha de onde a semente

foi coletada. Foram utilizadas as mesmas metodologias descritas anteriormente

para inoculação, câmara úmida, e cumprimento dos postulados de Koch.

Page 41: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

41

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise sanitária das sementes de plantas daninhas identificou os

seguintes gêneros de fungos: Cladosporium, Curvularia, Fusarium, Bipolaris,

Phoma, Nigrospora, Aspergillus, Rhizopus, Alternaria, Papularia, Rhizoctonia,

além de microrganismos com características de Oomicetos (Hifas cenocíticas,

esporângios e zoospóros). No presente trabalho fungos dos gêneros Aspergillus,

Rhizopus, Papularia, Phoma, Nigrospora e Cladosporium, não foram utilizados

para testes de patogenicidade, devido ao fato de que geralmente estes gêneros

estarem relacionados na sua grande maioria à condições inadequadas de

armazenamento, ou são contaminantes em sementes (Machado, 1988).

De acordo com os resultados obtidos (tabela 01), verifica-se que das 12

espécies de plantas daninhas, somente as sementes de Pennisetum setosum e

Tridax procumbens apresentaram fungos patogênicos, apesar das outras

espécies apresentarem os mesmos gêneros de fungos que podem apenas

estarem associados as sementes, sendo portanto, considerados não

patogênicas ou contaminantes, ou ainda serem endofiticos. Deve-se considerar

que os testes de patogenicidade foram realizados em apenas cinco culturas de

interesse agronômico, mas porém alguns gêneros mesmo não tendo sido

patogênico, sabe-se que apresentam espécies que podem ser patogênicas em

condições favoráveis, como e o caso de Bipolaris que possui espécies

importantes para agricultura, causando manchas foliares desde grandes culturas

como arroz (Celmer et al., 2007; Ludwig et al., 2009; Ottoni et al., 2007), milho

e gramíneas forrageiras (Martinez; Franzener; Stangarlin, 2010; Ottoni et al.,

2007; Santos et al., 2014). O gênero Alternaria, também apresenta espécies

patogênicas à diversas plantas, como milho, girassol, tomate, cebola e alho

(Ariosa; Herrera, 1988; Leite, G. L. et al., 2003; Leite, R. M.; Amorim, 2002) .

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42

Tabela 01:Testes de patogenicidade de fungos isolados de sementes de plantas daninhas em Arroz (Ar), Feijão (Fe), Feijão caupi (Fc), Soja (So) e Milho (Mi).

Origem Fungos

Patogenicidade

Ar Fe Fc So Mi

Spermacoce

latifólia Aubl

Fusarium sp. (1)* - - - - -

Fusarium sp. (2)* - - - - -

Fusarium sp. (3)* - - - - -

Oomiceto** - - - - -

Ipomea sp

Curvulária sp.*** - - - - -

Alternaria sp.*** - - - - -

Acanthospermum

australe

Fusarium sp. (1)* - - - - -

Fusarium sp. (2)* - - - - -

Alternaria sp.*** - - - - -

Cencrhus

echinatus L.

Fusarium sp. * - - - - -

Curvulária sp.*** - - - - -

Oomiceto** - - - - -

Pennisetum

setosum

Fusarium sp.(1)* + - - - +

Fusarium sp. (2)* - - - - -

Fusarium sp. (3)* - - - - -

Fusarium sp. (4)* - - - - +

Curvulária sp. (1)*** - - - - +

Curvulária sp. (2)*** - - - - -

Bipolaris sp.*** - - - - -

Alternaria sp.*** - - - - -

Page 43: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

43

(Continuação)

Origem Fungos

Patogenicidade

Ar Fe Fc So Mi

Vernonia

polyanthes

Fusarium sp. (1)* - - - - -

Fusarium sp. (2)* - - - - -

Tridax

procumbens

Curvularia sp.*** - - - - -

Fusarium sp. (1)* - + + + -

Fusarium sp. (2)* - - - + -

Fusarium sp. (3)* - - - - -

Bipolaris sp.*** - - - - -

Alternaria sp.*** - - - - -

Oomiceto (1)** + - - - +

Oomiceto (2)** - + + - -

Echinochloa crus-

pavonis

Curvularia sp.*** - - - - -

Fusarium sp (1)* - - - - -

Fusarium sp (2)* - - - - -

Bipolaris sp*** - - - - -

Alternaria sp*** - - - - -

Digitaria

horizontalis

Curvulária sp.*** - - - - -

Fusarium sp. * - - - - -

Bipolaris sp.*** - - - - -

Alternaria sp.*** - - - - -

Page 44: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

44

(Conclusão)

Origem Fungos

Patogenicidade

Ar Fe Fc So Mi

Eleusine indica

Fusarium sp.(1)* - - - - -

Fusarium sp. (2)* - - - - -

Sida rhombifolia

Fusarium sp. (1)* - - - - -

Fusarium sp. (2)* - - - - -

Fusarium sp. (3)* - - - - -

Fusarium sp. (4)* - - - - -

Bidens pilosa

Fusarium sp. (1)* - - - - -

Fusarium sp.(2)* - - - - -

Alternaria sp. *** - - - - -

Curvulária sp. *** - - - - -

- Não patogênico, + patogênico, (1) código isolado, * inoculação via palito de dente, **

inoculação via disco de micélio, *** inoculação via suspensão concentrada de esporos.

Foi verificado no presente trabalho que sementes de Pennisetum setosum

apresentaram três isolados de fungos patogênicos. Entre estes Curvularia spp.,

provocou manchas no limbo foliar de plantas de milho e causou a perda de área

fotossintética (figura 01). Outras espécies deste gênero, podem causar manchas

foliares em outras plantas, incluindo as forrageiras, e são transmitidas via

sementes (Santos et al., 2014). No milho, Curvulária causa a doença conhecida

como mancha de curvulária (Fernandes; De Oliveira, 1997), sendo a mesma já

conhecida e relatada em outros trabalhos (Carvalho et al., 2011; Vaz-De-Melo

et al., 2010) realizados no estado do Tocantins. Outros dois isolados

fitpatogênicos foram classificados como Fusarium spp., sendo que um deles

apresentou patogenicidade às plântulas de Arroz e Milho, o outro somente ao

Milho. O gênero Fusarium, apresenta diversas espécies com potencial

fitopatogênico, mas em geral ataca mais as gramíneas. Como patógenos desde

Page 45: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

45

grupo encontra-se espécies do complexo Fusarium fujikuroi, onde destacam-se

as espécies de F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans (Leslie;

Summerell, 2008), responsáveis pelas podridões em colmo, e tombamento de

plântulas, podridões das radículas e grãos (Souza; Araújo; Nascimento, 2007).

Foi verificado que Fusarium spp. causou lesões em colmo de plântulas de milho

(figura 02), após 15 dias da inoculação, onde as lesões evoluíram para podridão

de todo o colmo, levando a morte de todas as plântulas inoculadas. Este

resultado demonstra a alta agressividade deste fungo, que uma vez seja

introduzido em uma área, pode comprometer seriamente o stand e o crescimento

das plantas nos cultivos comercias. Trigiano , et al. (2010), citam que fungos

deste gênero classificam-se também como patógenos habitantes de solo , onde

quando na ausência da planta hospedeira possuem hábito saprofítico, que

podem levar os mesmos a sobreviverem por longo período de tempo, dificultando

ainda mais a adoção de medidas de manejo, tornando-as poucos eficazes e com

custos elevados.

Figura 1: A e B - Mancha - de - curvularia em folhas de milho; C - Curvularia spp em sementes de Pennisetum setosum., D - Conidios de Curvulária spp.

Page 46: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

46

Figura 2: Podridão causada por Fusarium spp em colmo de plântulas de milho, inoculadas a partir de sementes de Penissetum setosum.

A espécie T. procumbens apresentou nas sementes quatro isolados

fúngicos considerados patogênicos, sendo que dois deles foram identificados

como Fusarium spp, e os demais com características semelhantes a Oomicetos

(Hifa cenocítica, formação de esporângios com zoósporos). Os isolados

identificados como pertencentes ao gênero Fusarium apresentaram

patogenicidade as plantas leguminosas, causando sintomas de murcha e

podridão do colmo e pecíolos, sendo um isolado patogênico à soja e outro

isolado patogênico ao feijoeiro comum, feijão caupi e soja. Zhang et al. (2006)

descreveram o complexo F. solani como importante causador de lesões em

leguminosas, provocando podridões em raízes, folhas e colmos, destacando-se

a espécie de F. solani f.sp. glycines, causador da podridão vermelha da raiz em

soja ou PVR, F. solani s.sp. phaseoli, causador da podridão radicular em feijão,

embora a espécie F. solani f.sp glycines também pode causar podridão radicular

em feijão (Roy, 1997; Roy et al., 1997).

Os isolados com características de Oomicetos apresentaram

patogenicidades à plantas de famílias distintas, provocando sintomas de

Page 47: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

47

podridões no colmo e pecíolos, levando a morte das plântulas inoculadas,

demonstrando deste forma uma alta agressividade. Entre eles um isolado foi

patogênico ao feijão (P. vulgaris) e feijão caupi (V. unguiculata) e um isolado

patogênico as gramíneas, no caso plântulas de arroz e milho (Figura 03).

Figura 3: A - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão, B - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão caupi, C e D - Inoculação de Oomiceto spp. em Arroz, E - Inoculação de Oomiceto spp em milho e F - Podridão de Oomiceto spp em colmo de milho.

Dentre os principais gêneros de Oomicetos causadores de podridões em

colmo e raízes, destacam-se os gêneros Pythium e Phytophtora, os quais

possuem características especificas como hifas cenocíticas e formação de

esporângio com zoósporos (Amorim, et al. 2011). No presente trabalho a

identificação não chegou ao nível especifico de gênero ou espécie, e desta

Page 48: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

48

forma, de acordo com estas características pode-se apenas afirmar que

pertencem classe dos Oomicetos.

De acordo com Kimati et al., (2004) estes microrganismos pertencem ao

reino Chromista, tendo como representantes patógenos que podem causar

podridão em Milho (Pythium aphanidermatum, Pythium spp), Arroz (P.

arrhenomames), Feijão Caupi (P. aphanidermatum) e Feijão comum (P. spp, P.

ultimum, P. irregulare, P. paroecandrum, P. myriotylum e P. aphanidermatum)

(Kimati et al., 2004).

Os fungos que tiveram sua patogenicidade confirmada também foram

inoculadas no própria planta daninha, que produziu as sementes. De acordo com

os resultados obtidos verificou-se que apenas um isolado de Fusarium spp

provocou sintomas de murcha quando inoculado em Tridax procumbens (tabela

02). Este mesmo também causou murcha e podridão quando inoculado em

plântulas de soja.

Tabela 02:Patogenicidade de fungos encontrados associados à sementes de

plantas daninhas presentes no cerrado do Tocantins.

Planta daninha Fungo Patogenicidade

Pennisetum setosum

Fusarium spp (1)* -

Fusarium spp (4)* -

Curvularia sp (1)*** -

Tridax procumbens

Fusarium spp (1)* -

Fusarium spp (2)* +

Oomiceto (1)** -

Oomiceto (2)** -

- não patogênico + patogênico;

O fato de que o gênero Fusarium ter sido patogênico à própria planta

daninha, de onde o mesmo foi isolado demonstra que além de ser hospedeira, a

mesma pode ser afetada pelo microrganismo que foi transmitido por meio de

suas sementes. Com relação aos outros isolados, estes não apresentaram

patogenicidade às plantas daninhas, o que demonstra que os fungos podem

permanecer como endofíticos às mesmas, ou seja podem permanecer no interior

dos tecidos dos vegetais sem causar danos ou formar estruturas externas

Page 49: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

49

visíveis (Azevedo et al., 2000), podendo colonizar folhas, ramos e raízes (Peixoto

Neto et al. 2002), ou sementes. Vale salientar que mesmo não desenvolvendo

os sintomas da doença, podem manter-se como fonte de inóculo para plantas

cultivadas. Rodrigues e Menezes (2002) em trabalhos de detecção de fungos

endofíticos em sementes de feijão caupi encontraram espécies endofiticas de

Fusarium solani, F. oxysprorum e F. moniliforme, espécies já conhecidas pela

patogenicidade à plantas (Leslie; Summerell, 2008). O gênero Fusarium também

foi relatado por (Mussi-Dias et al., 2012) como sendo endofítico à sementes de

plantas medicinais da espécie Cymbopogon citratus.

Page 50: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

50

CONCLUSÕES

Sementes de Plantas daninhas das espécies de Tridax procumbens e

Pennisetum setosum apresentam-se potencialmente como fonte de inóculo de

fungos fitopatogênicos para culturas de interesses comercias.

O gênero Fusarium apresentou isolados patogênicos ao arroz, milho, soja,

feijão e feijão caupi, causando nas plântulas podridões do colmo e pecíolos.

Microrganismos Oomicetos encontrados em sementes de Tridax

procumbes desenvolveram podridão em colmo de plântulas de arroz, milho,

feijão e feijão caupi, demonstrando alta agressividade.

Sementes das plantas daninhas transportam fungos fitopatogênicos, o

que pode comprometer a sanidade de plantas cultivadas caso as mesmas não

forem corretamente manejadas, levando a grande prejuízos.

Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que as sementes

de plantas daninhas abrigam microrganismos, principalmente fungos que são

capazes de provocar doenças em plantas daninhas ou em plantas cultivadas ou

podem abrigar fungos endofíticos à planta hospedeira, mas que podem

representar fonte de inóculo para outras plantas de diferentes famílias.

Page 51: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

51

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Page 56: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

56

CAPÍTULO III

Análise morfológica e molecular de Fusarium spp.

isolados de sementes de Tridax procumbes L. e

Pennisetum setosum (SW. Rich.)

Page 57: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

57

Análise morfologia e molecular de Fusarium spp. isolados de sementes

de Tridax procumbes L. e Pennisetum setosum (SW. Rich)

RESUMO

Fungos do gênero Fusarium são amplamente distribuídos ao redor do mundo,

podendo estar ou não associados a espécies vegetais, na forma saprofítica,

endofìtica ou como parasita. Espécies do referido gênero são responsáveis por

diversos por diversas doenças em plantas cultivadas, causando principalmente

podridões radicular e murchamento. A correta identificação das espécies e de

suma importância para conhecimento e manejo da doença, sendo essas

identificações baseiam-se principalmente em características morfológicas como

formas e tamanho dos esporos assexuais, morfologia das hifas, formação de

clamidósporos e características das celular conidiogênicas. Técnicas

moleculares como sequenciamento de nucleotídeos de DNA amplificados pela

PCR (Reação de polimerase em cadeia), partindo de genes específicos como

calmodulina e β-tubulina, além de analises de restrição através de enzimas

especificas tem contribuído nas identificações de diferenciações genéticas entre

as espécies. No presente trabalho foi realizado a caracterização morfológico e

molecular de isolados de Fusarium spp, oriundo das sementes de Pennisetum

setosum e Tridax procumbens, através caracteres morfológicos e moleculares

os quais foram patogênicos a culturas agrícolas. Dos fungos isolados todos

tiveram seu padrão de amplificação em torno de 600 pb com pequena variação

amplificando as regiões ITS1 e ITS4. Com o intuito de correlacionar a

caracterização molecular, através da digestão e a classificação morfológica, os

isolados foram agrupados de acordo com a identificação morfológica. As

técnicas morfológicas e moleculares possibilitaram a caracterização das

espécies Fusarium.verticilioides, F. proliferatum e F. semitectum, associadas à

sementes de Pennisetum setosum e F. semitectum e F. solani associadas a

sementes de Tridax procumbens.

Palavras – chave: Patógenos, DNA, morfologia, perfil de restrição.

Page 58: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

58

Morphological and molecular analysis of Fusarium spp. isolated from

seeds of Tridax procumbes L. and Pennisetum setosum (SW. Rich)

ABSTRACT

Fusarium fungi are widely distributed around the world, and may or may not be

associated with plant species, the saprophytic form, or as parasitic endophytic.

Species of this genus are responsible for many diseases in several cultivated

plants, especially root rot and causing wilting. The correct identification of the

species and of paramount importance to knowledge and management of the

disease, and these identifications are based mainly on morphological features

like shapes and size of asexual spores, hyphal morphology, chlamydospores

formation and characteristics of cell Conidiogenous. Molecular techniques such

as DNA sequencing nucleotides amplified by PCR (polymerase chain reaction),

starting from specific genes such as β-tubulin and calmodulin, and by restriction

analysis of specific enzymes has contributed in the identification of genetic

differences between species. In the present work was carried out morphological

and molecular characterization of Fusarium spp isolates, oriund seeds of

Pennisetum setosum and Tridax procumbens, through morphological and

molecular characters, which were pathogenic to crops. The isolated fungi all had

their standard of amplification around 600 bp with little variation amplifying ITS1

and ITS4 regions. In order to correlate the molecular characterization by digestion

and the morphological classification, the isolates were grouped according to the

morphological. The morphological and molecular techniques enabled the

characterization of Fusarium.verticillioides species, F. proliferatum and F.

semitectum associated with the seeds of Pennisetum setosum and F. solani and

F. semitectum associated with seeds Tridax procumbens.

Keywords: Pathogens, DNA, morphology, Profile of restriction.

Page 59: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

59

INTRODUÇÃO

Fungos do gênero Fusarium são amplamente distribuídos ao redor do

mundo, habitando todo o tipo de substrato, associado ou não às plantas ,

podendo sobreviver por longos períodos de tempo na forma saprofítica, como

restos culturais e matéria orgânica, mas também causando doenças em

diferentes espécies de vegetais, causando grandes prejuízos econômicos em

cultivos agrícolas (Leslie & Summerell., 2006).

Espécies de Fusarium foram responsáveis por causar fenômenos sociais

importantes como o surto do mal da Panamá nas extensas lavouras na América

Central, sendo que o fungo F. oxysporum f.sp. cubense devastou vários plantios

(Ploetz, 1960). Em relação ao trigo ocorreu outra importante epidemia, sendo F.

graminearum responsável pela epidemia no meio oeste americano,

conseqüentemente, registrando grandes perdas (Wildels, 2000). Na Argentina,

foi constatado surto da podridão vermelha da raiz associada à soja (Scandiani et

al., 2004).

Para identificação das espécies do gênero tradicionalmente realiza-se a

análise morfológica, com base em características como formas dos esporos,

microconidios e macroconidios, Presença ou não de hifas estéreis, coloração da

colônia, micélio aéreo ou difuso, formação ou não de clamidósporos, número de

septos por conídio, disposição dos conídios sobre as células conidiogênicas

mono ou polifiálide entre outras (Leslie; Summerell, 2008; Nelson; Toussoun;

Marasas, 1983). Porém, a identificação baseada em caracteres morfológicos

constitui-se de uma tarefa muito complexa que também pode gerar controvérsias

devido à grande variabilidade de características fenotípicas analisadas, sendo

que essas características não são concordantes com agrupamentos obtidos

através de análises moleculares (Martins, 2005).

O gênero Fusarium é o terceiro mais estudado dos fungos fitopatogênicos.

O gênero está agrupado em complexo de espécies, sendo que este agrupado é

baseado em características morfológica, filogenética e biológica (Kvas et al.,

2009). O complexo de espécies do Fusarium fujikuroi apresenta importantes

espécies fitopatogênicas associadas principalmente à plantas pertencentes ao

gênero Poaceae, causando doença ou como endófito (Leslie & Summerell,.

Page 60: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

60

2006). No complexo de espécies de F. solani, existem várias linhagens

filogenéticas. No entanto, baseado apenas nos marcadores morfológicos estas

linhagens ou espécies não são distinguidas. O complexo de espécies do F. solani

compreende diversas espécies de patógenos associadas a um grande número

de plantas cultivadas, além de patógenos em humanos e animais. Além de existir

espécies com habilidade de produção de toxinas, endofiticas e saprófitos (Zhang

et a., 2006). Este complexo apresenta poucos marcadores morfológicos e são

escassos, para a fase anamórfica e teleomórfica (O’ Donnell & Gray, 1995).

Várias espécies de alguns complexos estão associadas às plantas

causando diversos tipos de doenças, no entanto, também estão associadas com

humanos imunodepresivos. Recententemente, F. musae agente etiológico de

podridão da coroa em frutos de banana, foi isolado associado a sangue e

biopsias (Triest et al., 2015). F. guttiforme, outra espécie do complexo Fusarium

fujikuroi, agente etiológico da fusariose em abacaxizeiro, também foi registrado

causando micoses em humanos no norte da Itália (Migheli et al., 2010).

Aproximadamente 50 espécies de Fusarium estão associadas a algum tipo de

doença em clínicas. Já foram constatados alguns membros do FFSC como: F.

verticillioides, F. napiforme, F. nygamai, F.sacchari, F. proliferatum e antophilum

associado a algum tipo de doença ou lesões em pacientes imunodepressivos

(Nussi & Anaissie., 2007).

As espécies de Fusarium além de causar doenças em plantas também

podem prejudicar a saúde humana e animal, principalmente devido à produção

de toxinas. As espécies do complexo F. verticillioides e F. thapsinum são

produtoras de fumonisinas. Estas toxinas são responsáveis por causar edema

pulmonar, abortos, alteração no crescimento de animais leucocefalamafia em

equineos (Marasas 2001). Além deste fato, acredita que fumonisinas podem ser

fator de patogenicidade. Isolados de F. verticillioides produtores de fumonisinas

causam sintomas de necrose em folhas de plântulas de milho, demonstrando

que a síntese de fumonisinas é importante na interação F. verticillioides x milho

(Glenn et al., 2008).

A identificação de Fusarium envolve três conceitos de espécies: o de

espécie morfológica baseada na similaridade dos caracteres morfológicos

observáveis, denominados de marcadores morfológicos; o de espécies

biológicas, baseado na compatibilidade sexual entre membros das mesmas

Page 61: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

61

espécies; e o conceito de espécie filogenética baseada na análise de seqüências

gênicas.

O conceito de espécies morfológicas tem muita importância para uma

classificação inicial de biodiversidade. Caracteres estruturais e fisiológicos têm

sido usados como marcadores morfológicos para diferenciar espécies do gênero

Fusarium, mas o problema é que as espécies pertencentes ao F. fujikuroi

consiste de sete espécies biológicas designadas por letras de A a M (Leslie &

Summerell., 2006; Scalflaire et al., 2012; Van houve et al., 2011; Lima et al.,

2012). A seqüência gênica é usada para auxiliar a classificação de espécie de

Fusarium. Alguns dos mais comumente utilizados são os genes que codificam

para a beta-tubulina e fator de elongação (O`Donnel et al, 2000). A adoção de

novos modelos de classificação afeta a taxonomia do gênero já que por décadas

foi baseada simplesmente em caracteres morfológicos.

Diversas técnicas moleculares como sequenciamento de nucleotídeos de

DNA amplificados pela PCR (Reação de polimerase em cadeia), partindo de

genes específicos como calmodulina e β-tubulina (Martins, 2005), contribuíram

para correta identificação de espécies patogênicas, proporcionado melhores

ferramentas para estudo da interação planta hospedeiro, bem como tomadas de

decisões envolvendo técnicas de manejo das doenças. Para determinação de

espécies de Fusarium existem primers específicos. Para F. verticillioides, F.

proliferatum e F. subglutinans foram descritos primers específicos (Mulè et al

2004). Além disso, análise de sequenciamento e restrição da região ITS (Internal

Transcribed Spacer) tem sido amplamente utilizadas (Oliveira & Costa 2002;

Brasileiro et al. 2004; Chehri et al. 2011), esta região separa os genes 18S e

28S do rDNA e que pode ser amplificada com primers específicos ancorados

nessas duas regiões, sendo altamente conservada intra-especificamente, mas

variável entre diferentes espécies, o que possibilita a distinção ao nível

específico (Fungaro,2000). Em geral todas estas técnicas tem auxiliado na

identificação de espécies de Fusarium atuando como uma ferramenta

complementar ao processo de caracterização morfológica, minimizando os erros

de identificação.

De acordo com a literatura consultada foi constatado que existem poucos

trabalhos caracterizando espécies de Fusarium associadas a sementes de

plantas daninhas no Brasil e na literatura mundial. Desta forma, o objetivo deste

Page 62: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

62

trabalho foi caracterizar Fusarium spp. isolados de sementes de Tridax

procumbes L. e Pennisetum setosum (SW. Rich.) através de caracteres

morfológicos e moleculares.

Page 63: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

63

MATERIAL E MÉTODOS

Caracterização Morfológica

As análises morfológicas dos fungos foram realizadas no laboratório de

Sistemática e Ecologia de Fungos da Universidade Federal de Lavras – MG,

onde foram identificadas as espécies, Fusarium verticillioides, Fusarium

proliferatum, Fusarium solani e Fusarium semitectum, conforme tabelas 1 e 2.

A caracterização morfológica dos isolados foi realizada seguindo as

especificações descritas em Nirenberg & O’Donnell (1998) e Leslie & Summerell

(2006). Os isolados foram crescidos em placas plásticas de Petri de 6 cm de

diâmetro, nos meios batata dextrose ágar (BDA) e em synthetic poor nutrient

agar (SNA) com folha de cravo e foram incubados em BOD a 25ºC no escuro e

a 20ºC com fotoperíodo de 12 horas, respectivamente. A morfologia,

pigmentação, odor e taxa de crescimento das colônias foram avaliadas em BDA

após quatro dias da inoculação. As características micromorfológicas foram

avaliadas em SNA com folha de cravo 14 dias após a inoculação.

Caracterização Molecular

As análises moleculares dos fungos foram realizadas no laboratório de

Controle Biológico de Doenças do Casadinho, na Universidade Federal do

Tocantins – TO, onde foram feitas as análises de digestão. Já o sequenciamento

foi feito na Universidade Federal de Lavras.

Sequenciamento

A extração do DNA foi feita a partir de um isolado (F. verticilioides)

crescidos em Meio líquido de Extrato de Malte 4% por três dias a 100 rpm em

temperatura ambiente em um agitador orbital, para a produção de biomassa. A

biomassa foi filtrada e a extração do DNA foi feita utilizando-se o tampão CTAB

seguindo o protocolo descrito por Leslie e Summerell (2006).

A amplificação do fragmento do gene fator de elongação 1-α foi realizada

utilizando os primers Ef-1 (forward; 5’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’) e Ef-2

Page 64: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

64

(reverse; 5’-GGAAGTAC CAGTGATCATGTT-3’) gerando um fragmento de

aproximadamente 691 pb (O’ O’Donnell et al., 1998). A sequência obtida no

sequenciamento foi comparada com outras sequências de bancos públicos no

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Essa comparação com o banco de

dados foi realizada utilizando-se o programa BlastX (Altschul et al., 1997).

Extração de DNA para Perfil de Restrição

Para a extração de DNA, primeiramente os isolados foram cultivados em

meio de cultura BDA e incubados por sete dias. Discos de BDA contendo o

micélio do fungo foram excisados e inoculados em 60 mL de meio líquido extrato

de levedura (10 g de extrato de levedura, 10 g de dextrose, 1 L de água destilada)

contendo antibiótico Cloranfenicol na concentração de 200mg/L . Posteriormente

foram mantidos em agitação (120 rpm) durante sete dias a 27 ºC, para o

crescimento do micélio. Após este período de crescimento, o micélio foi separado

do meio líquido por filtração a vácuo, após a lavagem com água destilada estéril

foi coletado e imediatamente colocado em nitrogênio líquido e macerado com o

auxílio de graal e pistilo. A extração do DNA foi efetuada pelo método CTAB

descrito por Zolan & Pukilla, 1986, com algumas modificações conforme segue.

Cerca de 0,5 g do micélio foi suspenso em 1 mL de tampão de extração CTAB

pré-aquecido a 65 °C (2% p/v de CTAB; 2,5% p/v de PVP; 2M de NaCl; 100 mM

Tris-HCl (pH 8,0), 25mM EDTA pH 8,0) e adicionado de 2% (v/v) de beta-

mercaptoetanol . Após homogeneização, as amostras foram incubadas por 40

minutos a 65 °C. Em seguida, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos

a 11.000 rpm. Após a separação do tecido da fase aquosa procedeu-se a

extração com clorofórmio / álcool isoamílico (24:1). O RNA foi degradado por

tratamento com RNase A (50 mg / ml) durante 30 min a 37 °C. O DNA foi então

precipitado pela adição de 2,5 volumes de etanol absoluto e sedimentadas por

centrifugação durante 15 min a 12.000 rpm. O sedimento foi lavado com etanol

a 70%, e re-suspenso em agua ultra pura. A concentração de DNA e a pureza

foram medidas usando um espectrofotómetro (Biowave DNA) a 260 e 280 nm. A

integridade das amostras foram verificadas em gel de agarose a 1% corado com

Blue Green ( LGC Biotecnologia) e visualizado sob uma luz UV, através de um

foto documentador (Gel Logic 112).

Page 65: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

65

Condição PCR

Para a amplificação da região ITS dos isolados, foram utilizados os

primers ITS1 (5' -TCCGTTGGTGAACCAGCG G-3') e ITS4 (5'-

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al, 1990). A reação de amplificação

foi realizada com um volume final de 20uL, sendo 4uL do Tampão, 2uL de

Cloreto de Magnésio, 1uL de dNTP (100mM), 1 uL de cada primer (F/R) com

0,3uL da enzima Gotaq (Promega) e 1 uL de DNA molde (50ng). A mistura foi

submetida a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em um termociclador

Techne TC-5000. O ciclo de amplificação se deu com uma desnaturação inicial

por 2 min a 95 ° C, seguido de 38 ciclos sendo desnaturação a 95°C por 30

segundos, anelamento por 1 minuto a 51° C , extensão por 1 minuto a 72° C

antes da extensão final de 5 minutos a 72 ° C. O produto da PCR foi visualizado

em gel de agarose a 1,4% e corado com BlueGreen ( LGC Biotecnologia),

através de um fotodocumentador (Gel Logic 112).

Análise de Restrição

Alíquotas de 10 uL dos produtos de PCR foram digeridos com 10 unidades de

enzimas de restrição HpaII, HaeIII e EcoRI, de acordo com as instruções do

fabricante (Jena Bioscience). Os fragmentos de restrição foram separados em

gel de agarose a 2,5%, por 45 minutos a 110V e 400 mA . As amostras foram

coradas com Blue Green (LGC Biotecnologia). Os fragmentos de restrição foram

visualizados sob UV e foi utilizado para estimar o tamanho dos fragmentos de

restrição. A análise de restrição foi repetido duas vezes.

Page 66: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

66

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização Morfológica

Os isolados obtidos de Penissetum setosum e Tridax procumbes foram:

F. verticillioides, F. proliferatum e F. semitectum. F. verticillioides, a forma de

identificação destes isolados pode ser observada nas tabelas 01 e 02.

Tabela 01: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Pennisetum setosum.

Isolado Espécie

Método de identificação da espécie

Morfológico Restrição Sequenciamento

Fusarium

spp(1)

Fusarium

verticillioides + + +

Fusarium

spp (2)

Fusarium

semitectum + + -

Fusarium

spp (3)

Fusarium

semitectum + + -

Fusarium

spp (4)

Fusarium

proliferatum + + -

Tabela 02: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Tridax procumbes.

Isolado Espécie

Método de identificação da espécie

Morfológico Restrição Sequenciamento

Fusarium

spp(1)

Fusarium

solani + +

Fusarium

spp (2)

Fusarium

solani + + -

Fusarium

spp (3)

Fusarium

semitectum + + -

Fusarium

spp (4)

Não

identificado - - -

+ Identificado,- Não identificado, (1) Número do isolado;

Page 67: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

67

Em relação aos caracteres morfológicos, os isolados obtidos de

Penissetum setosum (F. verticillioides, F. proliferatum e F. semitectum. F.

verticillioides), apresentam microconidios produzidos em longas cadeias e em

monofiálides, cor da colônia salmão a violeta e produção de poucos

esporodoquios. A coloração das culturas desta espécie é variável, a coloração

pode ser mais evidente com a idade da cultura. sendo este marcador pouco

informativo (Leslie & Summerell., 2006). Em relação a pigmentação em BDA,

observou-se a produção de pigmentos vermelho a róseo. Em uma única exceção

foi possível distinguir espécies de Fusarium do complexo Fusarium fujikuroi.

Isolados de F. thapsinum, produtores de pigmentos amarelos são distinguidos

de F. verticillioides, no entanto para aqueles isolados de F. thapsinum não

produtores de pigmentos são facilmente confundido com F. verticillioides ( Klittich

et al 1997). Anteriormente, os isolados que produziam microconidios em longas

cadeias e em falsa cabeça, recebia o nome de “F. moniliforme”. No entanto, este

nome esta em desuso, devido ao desmembrado em várias linhagens

filogenéticas e biológicas (Seirfeit 1996). Em diversos trabalhos, considera-se

que a espécie predominante associado ao milho causando podridão de colmo e

espigas, nas regiões tropicais é F. verticillioides. Além disso, algumas espécies

utilizam estratégias de sobrevivência colonizando plantas da família Poaceae e

atuando como endófito (Leslie et al 2004; Leslie & Summerell., 2006; Lanza et al

2014).

Na coleção de Fusarium obtido de Penisetum, 4 isolados foram

identificados como sendo F. proliferatum. Estes isolados apresentaram

microconidios produzidos em cadeias curtas, presença de polifiálides, coloração

violeta a salmão e ausência de clamidósporos. Morfologicamente, F. proliferatum

e F. fujikuroi apresentam os mesmos marcadores morfológicos. F. nygamai,

apresenta microconidios em cadeias curtas e em polifiálides, no entanto esta

espécie apresenta clamidósporos, neste caso sendo possível serem separadas

pelos marcadores morfológicos (Leslie & Summerell). F. proliferatum é agente

etiológico de podridão de colmo e espiga em milho, eventualmente esta espécie

causa podridão de colmo em outras culturas como sorgo e cana de açúcar

(Kimati et ao.,1997) F. proliferatum foi à espécie predominante em levantamento

realizado nos Estados Unidos em gramíneas selvagem do gênero Andropogon.

Page 68: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

68

Conseqüentemente, estes isolados apresentaram produção de altos níveis de

fumonisinas, ou toxinas produzidas pelo fungos (Leslie et al., 2004). Os autores

acredita que estas plantas se comporta como fonte de inoculo para varias

espécies de Fusarium de plantas cultivadas. No Brasil, F. proliferatum, F.

verticillioides, F. thapsinum, F. andiyazi e duas novas espécies foram obtidas de

plantas assintomáticas de Brachiaria spp. Ao inocular estes isolados, todos

causaram sintomas de podridão de colmo em milho, sorgo e milheto (Melo,

2014).

Outra morfoespécie encontrada em Penisettum foi F. semitectum. Os

isolados apresentaram crescimento rápido em BDA, com coloração creme,

aspecto cotonoso, produção de macroconidios e mesoconidios em polifiálides e

produção de abundantes clamidósporos (Leslie & Summerrel., 2006). Esta

espécie não é considerada um fitopatogeno, geralmente é encontrada associada

a podridões de frutos de banana na America central (Jimenez et al., 1997). A

taxonomia de F. semitectum variou ao longo do tempo. Foi descrita pela primeira

vez em 1875 e reconhecida por Wollenweber & Reinking, Booth, Gerlach &

Nirenberg e Nelson et al. Gerlach & Nirenberg descreveram três variedades, F.

semitectum var. semitectum, F. semitectum var. majus e F.

semitectum var.violaceum. Trabalhos recentes utilizando técnicas moleculares

indicam que F. semitectum provavelmente se trata de um complexo de espécie.

Para os isolados obtidos de T. procumbes foram obtidos isolados com

morfologia de F. solani. Estes isolados apresentaram crescimento rápido em

meio de cultura de coloração creme a bege, microconidios produzidos em falcas

cabeça e em fialídes longas. Os macroconidios apresentaram 3-5 septos e

clamidosporos verrugosos. Apenas baseado nas caracteristicas morfológicas

não é possível identificar as espécies de Fusarium pertencente ao complexo

Fusarium solani-FSSC. O que se chamava Fusarium solani f.sp. glycines foi

desmembrado em espécies filogenéticas e biológicas (Aoki et al., 2003).

Page 69: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

69

Caracterização Molecular

Através da análise do sequenciamento podemos observar que o isolado

obteve 100% de identidade com Fusarium verticillioides (Figura 1)

Figura 1: Padrão de alinhamento gerado pelo algoritmo Blastx.

A análise da sequencia do DNA, através do sequenciamento, é uma das

ferramentas moleculares mais seguras para se caracterizar um organismos a

nível molecular (Barra et al. 2011), contudo o elevado custo e difícil acesso a

plataformas de sequenciamento torna o processo oneroso, o que gera a

necessidade de utilizar técnicas alternativas rápidas e mais acessíveis, como a

análise de restrição.

A figura 2 mostra que a região ITS (utilizada posteriormente para a análise

de restrição) foi amplificada em todos os isolados, mostrando um fragmento de

aproximadamente 600 pb, sendo que esta região é variável de 400 a 900 pb para

todas as espécies de fungos (Brasileiro, et al. 2004).

Figura 2: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região ITS 1

e 4. M: Marcador Molecular 1Kb; C+: controle positivo da reação, C-: controle negativo;

1 a 20: isolados de Fusarium

Page 70: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

70

Todos os isolados mantiveram o mesmo padrão de amplificação,

(aproximadamente 600 pb) com uma pequena variação. De acordo com Chehri

et al. 2011, espécies de Fusarium amplificadas usando o ITS1 e ITS4 produziram

um padrão de bandas para F.semitectum de 550pb e F.solani 600pb. Com o

intuito de correlacionar a caracterização molecular, através da digestão e a

classificação morfológica, os isolados foram agrupados de acordo com a

identificação morfologica (Figura 3).

Como observado na figura 3 há uma grande semelhança entre a

morfologia das colônias, especialmente entre Fusarium verticilioides e Fusarium

proliferatum. Para a analise de restrição, foram separados ao total 20 isolados,

sendo inicialmente classificados em: F. verticilioides (amostras 14,8,1, 2,13); F.

semitectum (amostras16,3,4,7,12,26); F. proliferatum (amostras 9,11,21); F.

solani (24,25,28) as amostras 5 e 17 não foram classificadas morfologicamente,

e as amostras 8 e 11 funcionaram como um controle, pois estas amostras vieram

de isolados cedidos pela EMPRAPA Milho e Sorgo. Os padrões de todos os

isolados de Fusarium spp. após a digestão estão apresentados na Figura 4.

Page 71: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

71

Figura 3: Morfologia da colônia em meio BDA - (A) Fusarium proliferatum;

(B) Fusarium solani; (C) Fusarium verticilioides; (D) Fusarium semitectum.

Page 72: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

72

Figura 4: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região

ITS com o perfil de restrição para: (A) HpaII; (B) HaeIII; (C) EcoRI; com (M)

marcador molecular de 1Kb.

Através da análise de restrição dos produtos amplificados da região ITS 1

e 4 com as enzimas HpaII (A) e HaeIII (B) foi possível verificar a formação de 4

grupos, no entanto para a enzima EcoRI (C) não houve padrão diferencial entre

os isolados, (Figura 3 C), produzindo os mesmos padrões para os isolados de F.

oxysporum , F. semitectum, F. equiseti , F. solani. Além disso, houve uma

diferença na análise de restrição, onde os isolados 2 e 11 não apareceram em 2

repetições. Para a digestão com EcoRI foi gerado duas bandas de

aproximadamente 300 pb e 1 banda de aproximadamente 600pb. Há relatos de

Page 73: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

73

outros trabalhos que não identificaram padrão de restrição utilizando a mesma

Enzima EcoRI, para a identificação de espécies de Fusarium. (Brasileiro et al.,

2004; Chehri et al., 2012).

A restrição com a enzima HaeIII e HpaII produziram padrões semelhantes

de dois fragmentos para F. verticilioides (amostras 8 e 1) sendo a amostra 8 um

padrão para F. verticilioides cedido pela EMBRAPA, as amostras 13 e 3

morfologicamente haviam sido classificadas como F. verticilioides, porém não

apresentaram o mesmo padrão de digestão e portanto, não agruparam com as

demais. Para os grupos F.proliferatum (amostras 26,11,21 e 2) e F.solani

(24,2728) não houve separação através da digestão. As demais amostras foram

agrupadas em F. semitectum, que aparentemente não apresentou nenhum sítio

de restrição (Tabela 3). De acordo com estes resultados podemos observar que

foi possível a separação dos isolados de Fusarium estudados, pois a restrição

com pelo menos 2 enzimas (HaeIII e HpaII) mostrando o mesmo padrão de

digestão já suporta a hipótese da existência de diversidade genética entre as

espécies (Brasileiro et al. 2004), permitindo assim os agrupamentos. Outros

trabalhos mostram que a digestão da região ITS com HaeIII foi eficiente para a

identificação em diferentes espécies de Fusarim (Bateman et al. 1996; O'Donnel

et al., 2000). Por outro lado, o uso de maior número de enzimas, reações com

primers específicos ou até mesmo o sequenciamento faz- se necessário para a

confirmação dos agrupamentos aqui propostos.

Page 74: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

74

Tabela 03: Agrupamento das espécies de Fusarium de acordo com o padrão dos fragmentos de restrição da região ITS 1 e 4.

Espécie Isolado

Enzimas de Restrição

HpaII HaeIII EcoRI

F.semitectum 14 600 600 280+300+600

F.verticilioides 8 500+100 500+100 280+300+600

F.verticilioides 1 500+100 500+100 280+300+600

F.proliferatum 2 300+200+100 300+200+100 280+300+600

não agrupado 13 340+260 340+260 280+300+600

F.semitectum 16 600 600 280+300+600

não agrupado 3 340+260 340+260 280+300+600

F.semitectum 4 600 600 280+300+600

F.semitectum 7 600 600 280+300+600

F.semitectum 12 600 600 280+300+600

F.proliferatum 26 300+200+100 300+200+100 280+300+600

F.semitectum 9 600 600 280+300+600

F.proliferatum 11 300+200+100 300+200+100 280+300+600

F.proliferatum 21 300+200+100 300+200+100 280+300+600

F. semitectum 5 600 600 280+300+600

F. semitectum 17 600 600 280+300+600

F.solani 24 300+200+100 300+200+100 280+300+600

F.semitectum 25 600 600 280+300+600

F.solani 27 300+200+100 300+200+100 280+300+600

F.solani 28 300+200+100 300+200+100 280+300+600

* tamanho aproximado dos fragmentos gerados (pb)

Page 75: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

75

CONCLUSÃO

Conclui-se que as técnicas moleculares aqui utilizadas são uma

alternativa eficiente para a separação de espécies de Fusarium, especialmente

F. verticilioides sendo ambas as técnicas de classificação (moleculares e

morfológicas) complementares.

De acordo com as análises moleculares utilizadas no presente trabalho

foi possível a caracterização das espécies Fusarium.verticilioides, F. proliferatum

e F. semitectum ,associadas à sementes de Pennisetum setosum e F.

semitectum e F. solani associadas a sementes de Tridax procumbens.

Page 76: emerson flores de oliveira etiologia, patogenicidade, caracterização

76

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente trabalho demonstrou a importância das sementes das plantas

daninhas como hospedeiras de microrganismos (Fungos) com capacidade de

provocar doenças em plantas, visto que já e descrito na literatura que as mesmas

podem ser hospedeiras de pragas e doenças, porém no presente trabalho ficou

comprovado que as sementes podem transportar fungos causadores de

importantes doenças para os cultivos agrícolas.

Ferramentas de análises moleculares utilizadas no presente trabalho

identificaram as espécies Fusarium.verticilioides, F. proliferatum e F.

semitectum, associadas à sementes de Pennisetum setosum e F. semitectum e

F. solani associadas a sementes de Tridax procumbens.

Os resultados do trabalho mostram que as sementes das plantas

daninhas transportam fungos fitopatogênicos, o que pode comprometer a

sanidade de plantas cultivadas caso as mesmas não forem corretamente

manejadas, levando a grande prejuízos.