Empleo de proteínas multiepitópicas recombinantes, candidatas a vacuna, para

el diagnóstico del Adenovirus Aviar tipo I

* Francesca Falconi-Agapito.1

David Requena 1, 2

Manuel Ramirez1, 2

Hugo Valdivia1, 2

Luis E. Saravia1

Mirko Zimic1, 2

Manolo Fernandez1

1. FARVET S.A.C., Farmacológicos Veterinarios S.A.C. Chincha Alta, Chincha, Ica – Peru.

2. Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias y Filosofía. Universidad Peruana Cayetano Heredia. Av. Honorio Delgado 430, San Martin de Porres. Lima - Peru.

RESUMENLa hepatitis con cuerpos de inclusión es una enfermedad que tiene como agente causal al Adenovirus aviar tipo I (AVA) que afecta principalmente pollos de engorde y se caracteriza por presentar una elevada mortalidad. En el presente estudio se evaluó el valor diagnóstico de tres proteínas multiepitópicas recombinantes en una prueba de ELISA para inmunoinformático de genomas completos de NetMHCIIpan, prediciendo in silico epítopes T lineales conservados e inmunodominantes, potencialmente reactivos al MHC-I y MHC-II de pollo. Con estos epítopes, se construyercodificaron a proteínas multiepitópicas, designadas como ISB, IISB y IWB. Las proteínas fueron expresadas en E. coli, purificadas por resina de níquel y cuantificadas para su evaluación en una prueba de ELISA como antígenos de captura. Se emplearon sueros positivos de aves SPF Hyexperimentalmente con AVA-4; así como sueros negativos de aves SPF y sueros de aves de Charles River positivos a patógenos aviares distintos de AVA-4. Los resultados fueron comparados code ELISA. El valor diagnóstico de cada antígeno fue estimado en base a la curva ROC (Receiver Operating Curve). Las áreas bajo la curva fueron 0.8571, 0.9701, 0.9325 y 0.6089, para ISB, IISB, IWB y el kit comercial, respectivamente. Los valores de cut-off de 0.58, 0.381, 0.428 y 0.4028; con estimados de sensibilidad y especificidad para ISB, IISB, IWB y el kit comercial de 86.36 y 85.71%; 90.91 y 94.29%; 90.9% y 82.86%; y 62.50 y 62.86%, respectivamente. Según estos resultados, la proteíncandidata como una futura herramienta de diagnóstico; resultados consistentes con el hecho que IISB está constituida por los mejores epítopes MHC-II identificados y asociados a una respuesta de anticuerpos.

PALABRAS CLAVEAdenovirus aviar, epitopes inmunodominantes, proteína multiepitópica, curva ROC.

INTRODUCCIONLa hepatitis con cuerpos de inclusión (HCI)/síndrome de hidropericardio (SHP) tienen como agente causal al Adenovirus aviar tipo I, serotipo 4 (AVA-4) y han sido reportadas afectando tanto pollos de engorde y aves de postura, caracterizándose por presentar una elevada mortalidad. Parece ser que la inmunosupresión, previa o simultánea a una infección con AVA es necesaria para desarrollar la enfermedad (Hess, 2000; Hafez, 2011).Los kits de diagnóstico comerciales para AVA están basados en el uso del virus completo como antígeno y están normalmente asociados con falsos positivos debido a reactividad serológica cruzada y altos costos en la producción de antígeno. Esto ha requerido la necesidad de desarrollar antígenos alternativos para reemplazar el empleo del virus completo como antígeno en las pruebas de diagnóstico, que sean costo efectivas, sencillas y que combinen sensibilidad con especificidad (Kumar et al., 2008).Para lograr este fin empleamos una nueva aproximación que involucra la creación de proteínas multiepitópicas, el empleo de estas proteínas han sido reportadas en otra enfermedades (Houghton et al., 2000; Duthie et al., 2010; Lin et al., 2008). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el valor diagnóstico de 3 proteínas recombinantes multiepitópicas: ISB, IISB y IWB candidatas a vacuna contra Adenovirus aviar tipo I mediante la prueba de ELISA.

MATERIALES Y METODOSAnálisis inmunoinformáticoA partir de 6 genomas de AVA-4 se seleccionaron genes que codificaban para proteínas expuestas empleando los servidores online SignalP-4 y TMHMM. Posteriormente se emplearon los servidores NetMHCcons y NetMHCIIpan, para la predicción in silico de epítopes T lineales conservados e inmunodominantes potencialmente reactivos al MHC-I y MHC-II de pollo. Luego aquellos epitopes que mostraban una elevada promiscuidad y conservación con epítopes presentes en el genoma del pollo fueron descartados. Finalmente se realizó el ordenamiento de los epitopes seleccionados y las secuencias de las proteínas candidatas fueron optimizadas para su expresión en Escherichia coli. Seis residuos de histidina (his-tag) fueron introducidos en la porción N-terminal de la proteína. Con estos epítopes, se construyeron 3genes sintéticos que codificaron a proteínas multiepitópicas, designadas como ISB, IISB y IWB (Tabla 1).Expresión y purificación de proteínasLas secuencias de las 3 proteínas candidatas fueron insertadas independientemente en el plásmido pET28. E. coli rosetta fueron transformadas con el plásmido y las colonias transformantes fueron seleccionadas por su resistencia a antibiótico. La expresión de las proteínas fue producida en caldo Luria, cuando la absorbancia alcanzó un valor de 0.6 a una longitud de 600 nm se agregó el IPTG (1mM) y se cultivó por 4 horas en agitación. Las bacterias fueron peleteadas, lisadas por shock calor frio seguido por sonicación, el lisado fue clarificado por centrifugación. El sobrenadante fue usado para purificar las proteínas por cromatografía de afinidad empleando columnas de níquel. Las fracciones conteniendo las proteínas fueron cuantificadas por el método de Bradford.Muestras: Se emplearon 21 sueros positivos de aves SPF Hy-line infectadas experimentalmente con AVA-4, y una muestra de suero de Charles River positiva a AVA tipo I. Además 25 sueros negativos de aves SPF y 10 muestras de sueros de pollo de Charles River negativos a AVA-4, pero positivos a distintos patógenos aviares: Viruela aviar, Virus de la enfermedad de Newcastle, Avibacterium paragallinarum, Virus de Gumboro, Virus de Bronquitis infecciosa, Influenza aviar, Virus de laringotraqueitis infecciosa. ELISAPlacas de poliestireno de 96 pozos fueron cubiertas con 100 μl de la proteína multiepitópica a una concentración de 500 ng/ml, diluida en buffer carbonato-bicarbonato pH 9.6 e incubadas overnight a 4ºC. Posteriormente las placas fueron lavadas 6 veces con PBS + 0.05% Tween 20 (PBST). Continuó un paso de bloqueo con 200 μl de PBST + 3% leche descremada por 1 hora a 37ºC, para luego ser lavados 6 veces con PBST. Subsecuentemente se colocaron 100 μl de las muestras de suero diluidas 1:500 en PBST e incubadas por 1 hora a 37ºC; transcurrido el tiempo se lavaron las placas 6 veces con PBST. Los

anticuerpos específicos contra AVA fueron detectados posteriormente agregando 100 μl de anti-inmunoglobulina Y total conjugada a peroxidasa de rábano, diluida 1:5000 en PBST y se incubaron las placas por 30 min a 37ºC, para luego ser lavados 6 veces con PBST. Se adicionó luego la solución de revelado que consistió en TMB (tetrametilbenzidina), en este paso final las placas fueron incubadas por 15 min, para luego detener la reacción con 50 μl de una solución de H2SO4 al 2N. La absorbancia fue determinada empleando un lector de microplacas (EON, Biotek) a 450 nm. Los resultados fueron comparados con un kit comercial de ELISA.Análisis estadístico.Los datos fueron procesados con GraphPad Prism 5.0. El test Mann-Whitney U no paramétrico fue empleado para la comparación estadística de los resultados de ELISA entre los grupos infectados y sueros de animales control. La curva de características operativas del receptor (ROC) fue empleada para evaluar la habilidad de las tres proteínas y el kit comercial para distinguir el mejor marcador. El punto de corte fue definido como la mayor suma de los estimados de sensibilidad y especificidad. El área bajo la curva fue usada como una medida de la precisión de la técnica. (Swets, 1988).

RESULTADOS Y DISCUSIÓNLas curvas ROC fueron usadas para comparar el valor diagnóstico de las 3 proteínas (Figura 1). Las áreas bajo la curva fueron 0.8571, 0.9701, 0.9325 y 0.6089, para ISB, IISB, IWB y el kit comercial, respectivamente. Los valores de punto de corte fueron 0.58, 0.381, 0.428 y 0.4028; con estimados de sensibilidad y especificidad para ISB, IISB, IWB y el kit comercial de 86.36 y 85.71%; 90.91 y 94.29%; 90.9% y 82.86%; y 62.50 y 62.86%, respectivamente.

Tabla 1: Características de las proteínas multiepitópicas evaluadasProteína Epitope Peso molecular

ISB MHC-I 16 kDa

IISB MHC-II 18 kDa

IWB MHC-I 15.7 kDa

Figura 1. Curvas ROC (características operativas del receptor). A: Curva ROC de ISB. B: Curva ROC de IWB, C: Curva ROC de IISB, D: Curva ROC de Kit comercial. a: área bajo la curva ROC, b: sensibilidad; c:

especificidad.

Figura 2. Niveles de IgY específicos contra las proteínas multiepitópicas (A: ISB; B: IWB; C: IISB; D: Kit comercial) evaluadas en individuos control negativos (n=35) e individuos infectados (n=22) con AVA. Cada punto representa un sujeto. Líneas negras horizontales representan la mediana y las líneas punteadas rojas el punto de corte. Prueba no parámetrica Mann- Whitney U; se asignó un p<0.05 para la significancia estadística; ***: p<0.0001.

CONCLUSIONESLa proteína IISB, dados los altos valores de sensibilidad y especificidad, al mayor área bajo la curva ROC y a que el punto de corte establecido fue menor, constituye la mejor candidata como una futura herramienta de diagnóstico para SHP/HCI.

BIBLIOGRAFÍA1. Duthie MS, et al. 2010. Rational Design and Evaluation of a Multiepitope Chimeric Fusion Protein

with the Potential for Leprosy Diagnosis. Clin Vaccine Immunol. 17(2):298-303.2. Hafez, M. H. 2011. Avian Adenoviruses Infections with Special Attention to Inclusion Body

Hepatitis/Hydropericardium Syndrome and Egg Drop Syndrome. Pak Vet J. 31(2): 85-92.3. Hess, M. 2000. Detection and differentiation of avian adenoviruses: a review. Avian Pathology. 29,

195– 206.4. Houghton RL, et al. 2000. Multiepitope synthetic peptide and recombinant protein for the detection of

antibodies to Trypanosoma cruzi in patients with treated or untreated Chagas' disease. J Infect Dis.181(1):325-30.

5. Kumar, R., Chandra, R. 2004. Studies on structural and immunogenic polypeptides of hydropericardium syndrome virus by SDS-PAGE and western blotting. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 27: 155–161.

6. Lin X, et al. 2008. Recombinant multiepitope protein for diagnosis of leptospirosis. Clin Vaccine Immunol. 15(11):1711-4.

7. Swets, J. A. 1988. Measuring the accuracy of diagnostic systems. Science. 240: 1285-1293.