Emprego de marcadores moleculares (RAPD) no estudo genético de Ilex paraguariensis St. Hil.

Wendt, S. N.; Mazza, M. C.; Quoirin, M. G.; Sousa, V. A.; Sturion, J. A.

Introdução

Pertence a família Aquifoliaceae

Brasil, Paraguai, Argentina e Uruguai

Arbórea, 12-30 m, perene (100 anos)

Diplóide (2n=40) e dióica (dioicia críptica)

Produção de bebidas, corante natural, conservante alimentar, medicamentos diversos, produtos de higiene e cosméticos.

Estudos genéticos e programas de melhoramento são escassos conhecimento da diversidade genética:

• planejamento dos programas de melhoramento

• conservação de recursos genéticos

Ilex paraguariensis

Detectam variabilidade genética ao nível de DNA.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Amplificação de segmentos de DNA ao acaso, utilizando um único primer, com 10 pb, cuja sequência nucleotídica é arbitrária

O primer dirige a síntese de vários segmentos de DNA em diversos pontos do genoma várias bandas no gel

O polimorfismo tem natureza binária

Marcadores genéticos dominantes

Marcadores moleculares

AA Aa aa

Objetivo

Determinar a variabilidade genética de diferentes procedências de erva-mate, utilizando marcadores RAPD.

Materiais e métodos

Material vegetal

Folhas jovens de três procedências: Ivaí, Pinhão e Cascavel, do teste de procedências e progênies, localizado na Fazenda Vila Nova, Município de Ivaí.

28 indivíduos/procedência.

Extração do DNA

150 mg folhas

Protocolo modificado de Doyle & Doyle (1987)DOYLE, J.J., DOYLE, J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leal tissue. Phytochem. Bull., v. 9, p. 11-15, 1987.

Etapas da extração do DNA

Quantificação e diluição do DNA

Amplificação do DNA

Volume final de 13 l.

Componentes: DNA, H2O, tampão, MgCl2, dNTPs, primer, Taq polimerase

Etapas:

- 15 s a 94 ºC- 30 s a 35 - 60 s a 72 ºC- 5 min a 72 ºC

40 ciclos

15 primers

Primer Sequência (5’ 3’)OPA-01 CAGGCCCTTCOPA-02 TGCCGAGCTGOPF-01 ACGCATCCTGOPF-03 CCTGATCACCOPF-05 CCGAATTCCCOPF-14 TGCTGCAGGTOPH-03 AGACGTCCACOPH-04 GGAAGTCGCC

Primer Sequência (5’ 3’)OPH-05 AGTCGTCCCCOPH-08 GAAACACCCCOPH-12 ACGCGCATGTOPH-13 GACGCCACACOPH-15 AATGGCGCAGOPH-18 GAATCGGCCAOPH-19 CTGACCAGCC

Eletroforese em gel de agarose 1,6%, corado com brometo de etídeo.

Os géis foram visualizados em

transiluminador de luz UV e fotografados.

Etapas da técnica RAPD

Análise dos dados

Os fragmentos foram tabulados como 1 para presença e 0 para ausência de banda no gel de eletroforese.

Resultados

Os 15 primers produziram 159 fragmentos, com o número de bandas produzidas por primer variando de 6 (OPH-19) até 13 (OPH-05), em média 10,6 bandas/primer.

71,40% fragmentos polimórficos.

O tamanho dos fragmentos variaram de 110 a 1830 pb.

Perfil RAPD

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 M

Produtos da amplificação por RAPD de amostras da procedência Pinhão, usando o primer OPH-12. M = DNA Ladder 100 pb, 1-28 = Indivíduos da procedência Pinhão, Colombo-PR, 2001.