Engenharia genética e biossegurança: perspectivas e aspectos importantes para sua

aplicação em mandioca

Francisco J. L. AragãoEmbrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

aragao@cenargen.embrapa.br

Soja tolerante a imidazolinona – Embrapa/BASF

BASF

TransgênicoTransgênicoGenômica Bioquímica

Genética clássica Bi

olog

ia M

olec

ular

Bios

segu

ranç

a Melhoramento

Maior complexidade = maior necessidade de capacitação

Investimento

Legislação

multibrotação

FEC &

Suspenção

SistemasSistemas de de regeneraregeneraççãoão de de mandiocamandioca

Embrigênesissomática

Transformação genética AgrobacteriumGene gun (PIG)

SeleSeleççãoão

Seleção direta

Marcadores

antibióticosHig, kan, geneticina etc.

Seleção positivamanose (MPI)

Marcadores visuaisGus etc, res. herbicidas

Screening

University of Bath, UK

TS

LS

xilemaparênquima

tiloses

PAL-gus

Estudo funcional de promotores

Resposta a estresse (ferimento)

DNA A~2.7 kb

LIR

Rep/AC1

TrAP/AC2

Ren/AC3

CP/AV1

AV2

TA

T

T

G

T

T

TA

AA

AA

A

CCC

C

CC

G

G

G

G

GG

GG

CCC

C

T

CAGAACACCCAAGGGGCCAA GCCCCCTTTAATGTGGTCCCCGCGC

Conserved sequence

hairpin

(+) DNA

Bidirectional promoter

DNA B~2.7 kb

LIR

MPB/BC1

NSP/BV1

Single stranded circularDNA viruses

Transmitido por moscabranca e mecanicamente

WhiteflyWhitefly

DNA-A DNA-Brep

CP

ren

trapBC1 BV1

RCRC

barnase

Local plant cell deathVirus infection

Virus spreadX

Without virus infection No functional Barnase

Barstar

35S!

Barnase 35S!ACp/AVp

Hm35Sp AC1 35S!

Hm35Sp AC2 35S!

Hm35Sp AC3 35S!

RNA antisense

Inst. Tec. Zurich

Componente B defectivoretardamento no aparecimento dossintomas

Replicase mutada e gene defectivo

#1#44 Controle

Simtomas 7 dpi

Plant Molecular Biology 56: 601–611, 2004.

African cassava mosaic virus (ACMV)East African cassava mosaic Cameroon virus (EACMCV) Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV)

Estável (3 anos). Funcional no campo? ACMV e EACMV?Nigéria, Quênia e Uganda.

Valine

N-hydroxyvaline

2-Methyl proponol oxime

Acetone cyanohydrin

Linamarin

UDP-Glucose + Acetone cyanohydrin

Acetone +HCN

CYP79D1CYP79D2

Linamarase

Hydroxynitrile lyase(or spontaneously)

UDPG-glucosyltransferase

PutativeCYP71E

Mandioca acianogênica pela redução da expressão de CYP79D1 e CYP79D2

The Ohio State University

Antisense de CYP79D1 e CYP79D2 isolados de mandioca

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

20

40

60

80

100

4

15.3

5966.6

25.5

6.2

41.729.4

40.5

23.5

11.3

% L

inam

arin

2215 (WT) vs Cab1 transformants

0

1

2

96

98

100

0.44

0.73

0.290.330.26

0.98

% L

inam

arin

2215(WT) vs Cab1 transformants

Inst. Tec. Zurich

K

W

M

L

M

F

V

K

L

K

T

I

K

M

E

E

T

E

E

I

Tetramer (11.2KD)

ß-Turn

Hydrophobic

monomer

MLEELFKKMTEWIEKVIKTMG GMTKIVKEIWETMKKFLEELMR

RMLEELFKKMTEWIEKVIKTMG

MTKIVKEIWETMKKFLEELMR

PG

PG

PG

Monomer

Dimer

Trimer

Tetramer

ß-Turns

Hydrophilic

HydrophilicHydrophobic

Proteína de reserva artificial (ASP1)DEMEGEN INC., U.S. Patent # 5811654, 1998

Ile10% Leu

10%

Lys20%

Met15%

Phe5%

Thr10%

Trp5%

Val5%

Others20%

P WT S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16

1 kb

500 bp

Análises de Southern and northern analysis

11.2 KD

WT P77 Q7 Q12 S5 S11 S13 S16

Folhas

Raízes primárias

11.2 KD

WT P77 Q7 Q12 S5 S11 S13 S16

Westhern blots

Hernán Ceballos, 16/07

Genes CryMelhoramento nutricionalTolerância a herbicidas

Aragão, 2006

Processo regulatório?

Biossegurança: tão ou mais seguro

Resolução Normativa Nº 5 da CTNBio, de 12 de março de 2008

Dispõe sobre normas para liberação comercial de Organismos Geneticamente Modificados e seus derivados

- informações relativas ao OGM- avaliação de risco à saúde humana e animal- avaliação de risco ao meio ambiente- plano de monitoramento (mínimo de 5 anos)

BASF

Biossegurança: tão ou mais seguro

Recursos Genéticos e Biotecnologia

Arroz e Feijão

Soybean

Milho e Sorgo

Agrobiologia

Agroinsdústria

UNESP-Botucatu

O que fizemos ?

X

Como fizemos ?

Caracterização Molecular

• Número de insertos, estabilidade• Número de cópias dos elementos genéticos • Integridade dos cassetes de expressão• Presença de DNA adicional (backbone)• Seqüência flanqueadoras no DNA genômico• Seqüência dos elementos inseridos• Marcadores de DNA (eventos específicos)

ahas cds

AC1 seq

AC1 seq

pdk intron

ahas5´

35SCaMV

ahas3´

ocs3´

Nco I (3963)

Xho I (7812)

Xba I (6444)

Xba I (9440)

ahas cds

AC1 seq

AC1 seq

pdk intron

ahas5´

35SCaMV

ahas3´

ocs3´

Nco I (3963)

Fsp I (480)

Xho I (669)

Xho I (7812)

Xba I (732)

Xba I (6444)

Xba I (9440)

E4

...tcagtggaacgaaacgaaagggggatgtgct...

StableGenerations x after crosses

Presence of transgenes, no antibiotic resistance genes

haploid genome

Caracterização da Proteína,Alimento / segurança para alimentação

•Caracterização da proteína e equivalente•Concentração da proteína dos tecidos da planta•Caracterização da proteína purificada como alimento•Alergenicidade? •Toxicidade?

BASF

BASF

Equivalencia agronômica, Segurança ambiental

• Caracterização agronômica / variações fenotípicas? •Adaptabilidade•Segurança ambiental•Cadeia no meio ambiente

Equivalência de Composição,Equivalência Nutricional

•Amostras de multi-locais, multi-anos, com réplicas de campos•Metabólicos secundários•Processamento em escala piloto, análises de nutrien tes/ antinutrientes (métodos validados)•Confirmação da segurança como alimento•Estudos de alimentação em animais

Protein, Zn, Cu, Ca, Fe, Mg, Phytate, Folates, lipids, etc.

Crop Trait Developer Regulatory status

Cassava Viral resistance Donald Danforth Plant Sciences Center

---

Cotton Insect resistance Monsanto ---

Maize Drought tolerance Monsanto ---

Crop Trait Developer Regulatory status

Cassava Bio-fortification Gates Foundation ---

Cassava Viral resistance Donald Danforth Plant Sciences Center

---

Cowpea Insect resistance African Agricultural Technology Foundation (AATF)

---

Sorghum Bio-fortification* Africa Harvest ---* Increased levels of pro-vitamin A, vitamin E, iron, zinc, amino acids, and protein

Malawi

Nigeria

Quênia e UgandaCrop Trait Developer Regulatory Status Year

Sorghum Bio-fortification* Africa Harvest--- ---

Cassava Viral resistanceDonald Danforth Plant Sciences Center

Confined field trial 2006

Cotton Insect resistance MonsantoConfined field trial 2007

Corn Insect resistanceKenya Agricultural Research Institute, Syngenta, CIMMYT

Confined field trial 2006

Não é realistico esperar encontrar um ambiente que seja arroz “GM-free” (USA). Pode ser negativo para “Arroz GM, masnão zero-GM”

Estudos para co-existência

Obrigado !