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EPIGENÉTICA E EPIGENÉTICA E CÂNCER CÂNCER Roberta H. Lahude Roberta H. Lahude Thayse A. Crestani Thayse A. Crestani

EPIGENÉTICA E CÂNCER Roberta H. Lahude Thayse A. Crestani

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EPIGENÉTICA E EPIGENÉTICA E CÂNCERCÂNCER

Roberta H. LahudeRoberta H. Lahude

Thayse A. CrestaniThayse A. Crestani

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O QUE SÃO FENÔMENOS O QUE SÃO FENÔMENOS EPIGENÉTICOS?EPIGENÉTICOS?

• São alterações na mudança de expressão de um gene sem modificações na seqüência de bases do DNA.

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•DNA METILAÇÃOONDE OS PROCESSOS ONDE OS PROCESSOS EPIGENÉTICOS OCORREM?EPIGENÉTICOS OCORREM?

• DNA METILAÇÃO

ACETILAÇÃO

• HISTONAS

METILAÇÃO

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- Os dinucleotídeos CpGdinucleotídeos CpG são uma união

de uma citosina a uma guanina por uma ligação fosfodiéster na mesma fita de DNA.

- A metilação do DNA ocorre normalmente em cerca de 70 a 80% dos sítios CpG, sendo que essa porcentagem aumenta com o envelhecimento.

METILAÇÃO DO DNAMETILAÇÃO DO DNA

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• Como ocorre:

- Adição de grupo metil na posição 5´ da citosina na molécula de DNA

- Doador: S-adenosilmetionina

- Catalisador: DNA-metiltransferases (vários tipos e isoformas – ex:metiltransferase de manutenção)

METILAÇÃO DO DNAMETILAÇÃO DO DNA

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• O resultado da metilação do DNA: É o silenciamento dos genes através da inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição devido ao processo de metilação que estes sofreram.

METILAÇÃO DO DNAMETILAÇÃO DO DNA

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METILAÇÃO DO DNAMETILAÇÃO DO DNA

• Função:

- É essencial para o desenvolvimento normal

- Tem ação :

1. no controle da expressão gênica

2. na integridade cromossômica

3. nos eventos de recombinação.

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METILAÇÃO DO DNAMETILAÇÃO DO DNA

A metilação pode ocorrer em 2 regiões ricas em dinucleotídeos CpG distintas:

• Ilhas CpG

• Regiões intergênicas (regiões não codificadoras)

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METILAÇÃO DO DNAMETILAÇÃO DO DNA

• Ilhas CpG:

- são regiões com alta frequência do dinucleotídeo CpG.

- normalmente presentes nas regiões promotoras em 60% dos genes

- encontram-se protegidas da metilação

- podem se tornar suscetíveis

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A função normal da célula depende de um equilíbrio entre os dois eventos:

• Ilhas CpG: hipometiladas

• Regiões intergênicas: hipermetiladas

HIPOMETILAÇÃO X HIPERMETILAÇÃOHIPOMETILAÇÃO X HIPERMETILAÇÃO

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• Levam a uma variedade de cânceres por alterar a expressão de genes críticos.

• 2 padrões de metilação distintos:

- hipometilação generalizada do genoma

- hipermetilação que se apresenta a áreas localizadas dentro da região promotora de genes, as ilhas CpG.

METILAÇÃO DO DNA E METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESECARCINOGÊNESE

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METILAÇÃO DO DNA E METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESECARCINOGÊNESE

• Hipermetilação de ilhas CpG: silenciamento de genes supressores tumorais e genes de reparo

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• Causas da metilação aumentada (durante envelhecimento e carcinogênese):

- Processo casual que resulta de erros durante a duplicação do DNA.

- Erros de pareamento, reconhecidos pelas DNA metiltransferases que provem a hipermetilação.

- Exposição a agentes como: radiação, fumo, níquel e outros agentes químicos diversos.

HIPERMETILAÇÃO DAS HIPERMETILAÇÃO DAS ILHAS CpGs.ILHAS CpGs.

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METILAÇÃO DO DNA E METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESECARCINOGÊNESE

• Hipometilação global: instabilidade cromossômica e ativação de oncogenes

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INSTABILIDADE CROM OSSÔ M ICA ATIVAÇÃO DE ONCOG ENES

HIPOM ETILAÇÃO GLOBAL

INAT IVAÇÃO DE GENESSUPRESSORES TUM ORAIS

INAT IVAÇÃO DEGENES DE REPARO

HIPERM ETILAÇÃO DE ILHAS CpG

M ET ILAÇÃO NORM AL DO DNA

METILAÇÃO DO DNA E METILAÇÃO DO DNA E CÂNCERCÂNCER

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• É exemplo da metilação exagerada das ilhas CpGs do gene do RB.

• Ocasiona um silenciamento transcricional levando ao aparecimento do tumor.

RETINOBLASTOMARETINOBLASTOMA

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• Ocorre a desaminação da 5-metilcitosina em timina, originando mutação pontual, podendo alterar a função dos oncogenes e dos genes supressores tumorais.

• Podem ocorrer devido aos padrões de metilações alterados que afetam indiretamente a atividade gênica.

PONTOS QUENTES DE PONTOS QUENTES DE MUTAÇÃOMUTAÇÃO

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PONTOS QUENTES DE PONTOS QUENTES DE MUTAÇÃOMUTAÇÃO

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• O silenciamento dos genes através de fenômenos epigenéticos nem sempre acarreta problemas.Exemplos de eventos em que isso ocorre:

1. Regulação da expressão gênica: - Inativação do X - Imprinting genômico2.Proteção do genoma contra invasão de seqüências de fora

do organismo, por exemplo DNA viral

• Processos neoplásicos

CONSEQÜÊNCIAS DOS PROCESSOS CONSEQÜÊNCIAS DOS PROCESSOS EPIGENÉTICOSEPIGENÉTICOS

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IMPRINTING

• Somente um dos 2 alelos parentais herdados é normalmente expresso • Expressão monoalélica devido a padrão de metilação

• Processo natural

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Genes IGF2 e H19

• Cromossomo 11p15.5• Domínio genômico regulado por metilação• IGF2-cadeia de 67 aminoácidos com homologia à

insulina - alterações metabólicas e promoção do

crescimento - normal-somente alelo paterno é expresso• H19-ligado ao IGF2; RNA com ação supressora

tumoral(provável)- alelo materno

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METILAÇÃO NORMAL

D M R

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Genes IGF2 e H19

•Ativação anormal do alelo normalmente inativo em IGF2 e /ou•Silenciamento do alelo normalmente expresso em H19

•Interligados

Alterações do padrão normal

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CONSEQUÊNCIAS

•Perda da heterozigose de um dos genes (geralmente IGF2) que leva a sua expressão modificada pode levarao mesmo resultado no outro gene.•Ativação de um fator de crescimento + silenciamentode um supressor tumoral

PROLIFERAÇÃO DESCONTROLADA

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HISTONAS

•Determinam grau de condensação da cromatina•Interação entre elas grupamentos adicionados•Eventos epigenéticos:

-Acetilação -Metilação -Fosforilação -Ubiquitinação -Ribosilação

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Processos Epigenéticos

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ACETILAÇÃO DAS HISTONAS

•Controlada pelas acetiltransferases (HATs) e desacetilases (HDACs)

•Desacetilação:condensa a cromatina , impede a transcrição

•Acetilação:abre a cromatina,ativa transcrição. Ativação de vários genes inibitórios do crescimento tumoral

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METILAÇÃO DAS HISTONAS

•Efeito depende da histona e do aminoácido metilados:

-metilação da histona 3 na lisina 9 facilitam a metilação do DNA e o silenciamento do gene.

-metilação da histona 3 na lisina 4 abre a cromatina,ativando a transcrição.

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DNA + HISTONAS

• Interação entre efeitos epigenéticos dos dois níveis

• Modificação da expressão gênica

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Inibidores de HDACs•Usados para o aumento da expressão de genes aberrantemente silenciados

•Provocam acúmulo de histonas acetiladas

•Diminuem proliferação celular maligna(parada do ciclo em G1 ou G2),e/ou

•Aumentam grau de diferenciação,e/ou

•Aumentam apoptose de células malignas

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Métodos de análise dos Processos Epigenéticos

•Enzimas de restrição sensíveis à metilação + PCR

•PCR-metilação específica (MS-PCR)

•Seqüenciamento

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Métodos de análise dos Processos Epigenéticos

•Materias utilizados: urina, saliva, sangue, escovados, fragmentos de biópsias

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Enzimas de restrição sensíveis à metilação Metilação diferencial

•Endonuclease HpaII- cliva o DNA no sítio CCGG quando a citosina interna não está metilada

•Endonuclease MspI- cliva o DNA no sítio CCGG na presença ou ausência de metilação

•PCR: amplificação de uma banda específica no DNA digerido com HpaII e ausência de amplificação no DNA digerido com MspI.

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MS - PCR

•Detecção do padrão de metilação das ilhas CpG

•Tratamento do DNA com bissulfito de sódio

•Conversão de citosinas não metiladas em uracil

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MS - PCR

• DNA isolado de carcinoma prostático (C) e hiperplasia benigna prostática (B)• Gene GSTP1-hipermetilação em mais de 90% dos CA prostáticos• Ausência de metilação em tumores benignos

-Azul:metilado-Verde:desmetilado

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SEQÜENCIAMENTO

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IMPLICAÇÕES CLÍNICAS•Todo processo epigenético tem potencial de ser revertido•Marcador molecular para diagnóstico precoce do câncer -não-invasivo•Desenvolvimento de novos agentes terapêuticos-inibir metilação -5-azacitidina e 2’-desoxi-5azacitidina(uso experimental) :inibidores da DNA-metiltransferase -menos tóxicos em modelos pré-clínicos -sinérgicos aos desacetilantes de histonas -porém não específicos -efeitos colaterais:trombo e neutropenia•Combinação de drogas novas com as convencionais

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IMPLICAÇÕES CLÍNICAS

• Drogas já utilizadas para outros fins revertem metilação

• Ácido valpróico(anticonvulsivante)

• Vitamina B3

• Inibem algumas HDACs

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IMPLICAÇÕES CLÍNICAS

Dieta •Deficiência de folato e vitamina B12: induz metilação

•Dieta pode causar acúmulo de fênomenos epigenéticos

•Importante na terapêutica,quando associada a drogas

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“A estratégica epigenética, acordando genes silenciados, é umadas maneiras existentes que proporciona a chance das células

malignas se regenerarem, se diferenciarem, se tornarem maduras e pertencerem novamente à comunidade do organismo

saudável”

CONCLUSÃO