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Epigenética

Epigenética. Fenómeno Epigenético Qualquer actividade reguladora de genes que não envolve mudanças na sequência do DNA (código genético) e que pode persistir

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Epigenética

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Fenómeno Epigenético

• Qualquer actividade reguladora de genes que não envolve mudanças na sequência do DNA (código genético) e que pode persistir por uma ou mais gerações

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Territórios cromossómicos

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Espaços intercromáticos

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Territórios cromossómicos eEspaços intercromáticos

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O início da epigenética

• 1990’s– Descobertas metilases de DNA em C – Metilação representada na maioria dos animais, vegetais e

fungos

• 1993– Stephen Baylin et al

• Metilação do Gene de Supressão Tumoral p16 numa variedade de tumores humanos

• Tratamento destas células com agentes desmetilantes repõe a actividade do gene

– Extensa metilação em promotores de outros genes de supressão tumoral

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Mecanismos conhecidos de regulação epigenética

• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

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Metilação

• A 5ª base 5-metil citosina

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A metilação inactiva os genes

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Papel da Metilação/desacetilação na repressão do genoma

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Mecanismos conhecidos de regulação epigenética• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

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Código das histonas (I)

• 1993 Alan Wolffe– Acetilação das histonas altera o acesso de outras

proteínas ao DNA (abre o cromossoma)• Acetilases/Desacetilases formam complexos com factores de

transcrição que ligam/desligam os genes

• 1998 Adrian Bird et al.– Mostrou que as desacetilases podem funcionar em

conjunto com metilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inactiva os genes

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Código das histonas (II)

• 2000 Thomas Jenuwein– Identificou uma metilase de histonas, mostrando que

actuam sobre o mesmo local das histonas que as acetilases

• 2001 Tony Kouzarias– Metilação de histonas desliga os genes

Metilação da H3

permite a ligação

da HP1, o que

silencia os genes

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Modelos de modificação eu/heterocromática por alteração de histonas

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Formation of heterochromatin silences gene expression at telomeres and other regions

Silent genes in mating-type control in yeast

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Several genes encode proteins that bind specifically to silent loci at yeast telomeres

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Schematic model of silencing at yeast telomeres

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Repressors and activators can direct histone deactylation at specific genes

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Mecanismos conhecidos de regulação epigenética• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

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Silenciamento do RNA

-RdDM = RNA directed DNA methylation

-PTGS = Post translational gene silencing

-RNAi = RNA interference

siRNA= small interfering RNA

RISC = RNA induced silencing complex

CMT = chromomethylase

DNMT= DNA methyltransferase

IR = inverted DNA repeats

SC = single copy genes

cRdRP= cellular RNA dependent RNA pol

DICER/CAF = RNAse III type enzimes

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Epigenética

• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

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Imprinting (I)

• Marcação permanente dos genes passados por cada um dos progenitores

• Fenómeno conhecido há pelo menos 3,000 anos– Égua+Burro Mula– Cavalo+Burra Machohá efeitos específicos do genero nos cruzamentos

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Imprinting (II)

• 1991– Igf2r– H19– Igf2 (activo só se herdado do pai)

• 2001– Mais de 40 genes com efeito de imprinting

• mecdin• UBE3A• p53 (gene de supressão tumoral envolvido no neuroblastoma)

• peg3• igf2• ... ...

Activos só se herdados da mãe

Prader-willi e Angelman syndromes

Afectam o desenvolvimento embrionário

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Imprinting (III)

• Metilação está habitualmente envolvida quer activando quer

inactivando os genes

• Genes imprinted estão presentes em clusters

– Ex:• H19/Igf2 (11p15.5)

• DKK1/GTL2 (14q32)

• Um dos genes origina 1 proteína o outro RNA não traduzido (cerca de 25% dos

genes imprinted não originam proteínas)

• Os genes são separados por ilhas CpG as quais são locais de ligação de CTCF,

formando uma fronteira cromossómica

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Imprinting (IV)

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Implicações do imprintig

• Necessidade de:– Remover as marcas de imprinting cedo na

gametogénese– Criar novas marcas de imprinting durante a

gametogénese

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A epigenética em análises clínicas(I)• Bibliografia crescente implicando epigenética em patologias (ex: tumores)

– Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation Eric Lander, Rudolf Jaenisch Nature Genetics, vol 27, January 2001

– Cancer epigenetics comes of age. Jones PA, Laird PW. Nat Genet. 1999 Feb;21(2):163-7.PMID: 9988266; UI: 99140765

– DNA methylation in health and disease.Robertson KD, Wolffe AP Nature Reviews Genetics. 2000 October, Vol.1:11-19

– DNA methylation. Singal R, Ginder GD. Blood. 1999 Jun 15;93(12):4059-70. PMID: 10361102; UI: 99290759

– DNA methylation: past, present and future directions. Robertson KD, Jones PA. Carcinogenesis. 2000 Mar;21(3):461-7. PMID: 10688866; UI: 20156136

– Current Topics in Microbiology and Immunology. Vol. 249: DNA Methylation and Cancer edited P. A. Jones, P. K. Vogt Springer-Verlag (2000) pp. 170.

– Behind the Scenes of Gene Expression Elizabeth Pennisi, Science Aug 10 2001: 1064-1067

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A epigenética em análises clínicas(II)

• Patologias com envolvimento da Epigenética– Sindroma do X frágil– Sindroma de Rett– Sindroma ICF (Imunodeficiencias,Instabilidade centromérica

e Anomalias Faciais) (Mutações na DNA metiltransferase 3B (DNMT3B))

– Genes de supressão tumoral em tumores– Deficiencias de imprinting genético– Envelhecimento– Doenças cardiacas

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Métodos para o Estudo Epigenético

1 -Alteração de Histonas

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Analysis of the acetylation state of histones in chromatin associated with a specific region of the genome

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Métodos para o Estudo Epigenético

2 –Metilação do DNA

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Diagrama geral dos Métodos para estudo de mCpG

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Determinação de conteudo global de mCpG

• Hidrólise– Química

– Enzimática

• Marcação fluorescente c/ cloroacetaldeído

• Metilação in vitro com SssI e Leitura por southern Blot

Leitura por HPLC / HPCE

*=ethenocytosine / ethenoadenine (Fluorescentes)

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In Situ DNA methylation

• Metilação in vitro seguida de imunoprecipitação• Utilização de anticorpos anti-mCpG

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Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos

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Métodos enzimáticos

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Southern Blot and PCR

• Utilizar uma enzima de restrição que distingue a sequencia metilada da não metilada

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Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos

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Tratamento com bissulfito

• C U• mC mC

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Methylation specific PCR

• Tratamento com bissulfito

• Duas reacções de PCR– 1 primer terminando na sequencia complementar de C– 1 primer terminando na sequencia complementar de U

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Sequenciação / Pyrosequenciação

• Tratamento com bissulfito Sequenciação

• Tratamento sem bissulfito Sequenciação

• As diferenças (CT) correspondem a C

• As semelhanças (CC) correspondem a mC

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pirosequenciação

• Razão entre altura dos picos C/T é proporcional á metilação

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Detecção de mudança na Tm

• Tratamento com Bissulfito

• Leitura por:– DGGE– TTGE

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Detecção de Alterações de conformação

• Tratamento com bissulfito

• Desnaturação

• Leitura por:– HA– DGGE– SSCP– DHPLC

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Primer extension (PE)

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Real-Time-PCR followed By Tm analysis

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Methylight

• Tratamento com bissulfito– Ex: CpG genome DNA modification kit (QBiogene)

• Real-Time-PCR

• Uso de sondas FRET ou Taqman:– 1 específica para a sequencia terminada em C

• Se produz sinal há metilação

– 1 específica para a sequência terminada em U• Se produz sinal não há metilação

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PE-DHPLC ou PE-CE (Electroforese Capilar)